JPH09187643A - 重合リポソーム懸濁液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 浸透圧変化、特に使用時の浸透圧調整におけ
る浸透圧変化に対しても凝集することなく、安定となる
性質を付与した重合リポソーム懸濁液を提供する。 【解決手段】 全膜構成脂質中、重合性脂質を２５〜１
００モル％及びステロール類を０〜２５モル％含有する
重合性脂質混合物から重合性リポソームを調製し、次い
で、該重合性リポソームを重合させて重合リポソーム懸
濁液とする。該重合リポソーム懸濁液は、外水相の浸透
圧を内水相の浸透圧に対し１００ｍＯｓｍ以上変化させ
ても安定である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫凝集反応試薬
などの臨床診断試薬用担体、クロマトグラフィー用担
体、酵素固定化用担体、化粧品、センサー、バイオ素
子、注射薬剤用リポソーム懸濁液、経口経腸薬用リポソ
ーム懸濁液、輸液用リポソーム懸濁液、ワクチン用担
体、人工酸素運搬体、貧食機能テストマーカー、細胞標
識マーカーなどに利用可能である。

【０００２】

【従来の技術】リポソーム懸濁液は高い生体適合性や内
水相に薬品などの溶液を内包できるといった特徴を持つ
ことから、医薬品や化粧品を始めとした種々の用途への
展開が試みられている。

【０００３】リポソーム懸濁液は、その使用される環境
条件に適応した浸透圧に調整される必要がある。例え
ば、人体に投与する場合には生理的食塩水程度の浸透圧
になるように調整することがリポソーム懸濁液を安定に
保つために必要である。

【０００４】リポソーム懸濁液の浸透圧を使用環境に最
適なものとするために、例えば、透析等の手法を用い
て、リポソーム懸濁液の外液を所望の浸透圧の溶液に置
換することが考えられるが、一般に、リポソーム懸濁液
に対して浸透圧変化を与えると、収縮、膨張、破裂や凝
集が生じやすくなり、粒径の変化や内包物質が漏洩した
り、沈澱を生ずるなどの不安定な挙動を示すことが問題
となっていた（Biochimica et Biophisica Acta 735,39
7-406(1983）等）。

【０００５】一方、重合性リン脂質を使用したリポソー
ム懸濁液を調製し、これを重合してなる重合リポソーム
懸濁液は、生体内での分解時間が延長したり、凍結融解
した場合にも物理的安定性があるという利点が知られて
いる(Art., Cells & Immob.,Biotec., 20(2-4) ，641(1
992）等）。

【０００６】このような重合リポソーム懸濁液の例を挙
げれば、特開昭６３−２７４８７０号公報では重合性リ
ン脂質を用いて抗体感作重合リポソーム懸濁液あるいは
抗体感作ミセルを形成し、被検試料中の抗原濃度を測定
することができる免疫センサーが、特開昭６３−８３９
１号公報では重合性β−グリセロリン脂質を用いた重合
リポソーム懸濁液が、特開平３−２９１２１６号公報で
はヘモグロビンを内包した重合リポソーム懸濁液が、特
開昭６１−１５５３３６号公報や特開昭６１−１５５３
９２号公報では血液代替物あるいは医薬用担体などに用
いる重合性リン脂質からなるリポソーム懸濁液が、それ
ぞれ提案されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記従
来の重合リポソーム懸濁液は、浸透圧変化に対して敏感
であり、例えば、リポソーム懸濁液の使用に際して、使
用環境に最適な浸透圧となるように浸透圧変化を与える
と凝集して沈澱を生じることが多く、問題となってい
た。

【０００８】そこで本発明の目的は、浸透圧変化、特に
使用時の浸透圧調整における浸透圧変化に対して凝集す
ることなく、安定となる性質を付与した重合リポソーム
懸濁液を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、重合リポソ
ームの全膜構成脂質中の重合性脂質とステロール類の配
合比に着目し、浸透圧変化に対する安定性を備えた重合
リポソーム懸濁液を得るに至った。即ち、本発明は、全
膜構成脂質中、重合性脂質を２５〜１００モル％及びス
テロール類を０〜２５モル％含有する重合性リポソーム
懸濁液を重合させてなる重合リポソーム懸濁液である。
また、本発明は、重合リポソーム懸濁液の外水相の浸透
圧を、内水相の浸透圧に対し１００ｍＯｓｍ以上変化さ
せて使用環境に最適な浸透圧に調整してなる重合リポソ
ーム懸濁液である。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明において用語「重合性」と
は、重合できる能力を持つ性質をいう。本発明における
重合性脂質には、重合性リン脂質、重合性脂肪酸、重合
性脂肪酸コレステロールエステルなどが挙げられる。

【００１１】本発明の重合リポソーム懸濁液に用いるこ
とができる重合性リン脂質としては、次の式（１）に示
される化合物が挙げられる。

【００１２】

【化１】 （ただし、Ｘ¹ は重合性あるいは非重合性のリン酸極性
基、Ｒ¹ 及びＲ² は炭素数６から２４の重合性あるいは
非重合性の脂肪酸残基または炭化水素基であって、
Ｒ¹ 、Ｒ² またはＸ¹ 基の何れか１つ以上の基に重合性
基が含まれていれば良い。） 前記Ｘ¹ で示されるリン酸極性基としては、例えば、ホ
スホコリン基、ホスホエタノールアミン基、ホスホ−Ｎ
−メチルエタノールアミン基、ホスホ−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルエタノールアミン基、ホスホセリン基、ホスホイノシ
トール基、ホスホイノシトール二リン酸基、ホスホグリ
セロール基、ホスホ−ｏ−アミノアシルグリセロール
基、ホスホグリセロリン酸基またはリン酸基などが挙げ
られる。

【００１３】これらのリン酸極性基のうち重合性を有す
る基の具体例として、例えば、ホスホ−Ｎ−重合性アル
ケニルエタノールアミン基、ホスホ−Ｎ−重合性アルケ
ノイルエタノールアミン基、ホスホ−Ｎ−重合性アルケ
ニルセリン基、ホスホ−Ｎ−重合性アルケノイルセリン
基、ホスホ−重合性アルケノイルエステルセリン基など
が挙げられる。また、特開平６−１５７５６１号公報等
に開示されているような重合性のリン酸極性基を有する
化合物も本発明に利用可能である。

【００１４】前記Ｒ¹ またはＲ² で示される、炭素数６
から２４の重合性あるいは非重合性の脂肪酸残基または
炭化水素基において、Ｒ¹ またはＲ² に含有される重合
性基の具体例として、例えば、ビニルアルキル基、スチ
リルアルキル基、（メタ）アクリロイルオキシアルキル
基、共役ジエンアルキル基、共役ジインアルキル基が挙
げられる。これらの重合性基を含む脂肪酸残基として、
具体的には、２，４−オクタデカジエン酸、２，４−ヘ
キサデカジエン酸、８，１０，１２−オクタデカトリエ
ン酸、９−（ｐ−ビニルベンゾイル）ノナニル酸、１，
２−メタクリロイルオキシドデカン酸、１０−ウンデシ
ン酸、１６−ヘプタデシン酸、２２−トリコシン酸、ト
リコサ−１０，１２−ジイン酸、トリコサ−２，４−ジ
イン酸、ノナデカ−２，４−ジイン酸などの各々の残基
が挙げられる。

【００１５】本発明の重合リポソーム懸濁液の原料物質
となる前記式（１）で示される重合性リン脂質の具体的
な化合物名を列挙すると、１，２−ビス（２，４−オク
タデカジエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリ
ン（略語：ＤＯＤＰＣ）、１，２−ビス（２，４−ヘキ
サデカジエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリ
ン（略語：ＤＨＤＰＣ）、１−（オクタデカノイル）−
２−（２，４−オクタデカジエノイル）−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホコリン（略語：ＳＯＤＰＣ）、１−（ヘ
キサデカノイル）−２−（２，４−オクタデカジエノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（オク
タデカノイル）−２−（２，４−ヘキサデカジエノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（ヘキ
サデカノイル）−２−（２，４−ヘキサデカジエノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（２，
４−オクタデカジエノイル）−２−（オクタデカノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−（２，
４−ヘキサデカジエノイル）−２−（ヘキサデカノイ
ル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ビ
ス−（８，１０，１２−オクタデカトリエノイル）−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ビス（１２
−メタクリロイルオキシドデカノイル）−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホコリン、１，２−ビス（９−（ｐ−ビニ
ルベンゾイル）ノナノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホコリン、１−（２，４−オクタデカジエノイル）−
２−（オクタデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホス
ホコリン、１−（２，４−ヘキサデカジエノイル）−２
−（ヘキサデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
コリンなどが挙げられる。

【００１６】また、別の重合性リン脂質の具体例は、
１，２−ビス（２，４−オクタデカジエノイル）−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ビ
ス（２，４−ヘキサデカジエノイル）−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホエタノールアミン、１−（オクタデカノイ
ル）−２−（２，４−オクタデカジエノイル）−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−（ヘキサ
デカノイル）−２−（２，４−オクタデカジエノイル）
−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−
（オクタデカノイル）−２−（２，４−ヘキサデカジエ
ノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミ
ン、１−（ヘキサデカノイル）−２−（２，４−ヘキサ
デカジエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ
ールアミン、１−（２，４−オクタデカジエノイル）−
２−（オクタデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホス
ホエタノールアミン、１−（２，４−ヘキサデカジエノ
イル）−２−（ヘキサデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホエタノールアミン、１，２−ビス−（８，１
０，１２−オクタデカトリエノイル）−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ビス（１２−
メタクリロイルオキシドデカノイル）−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ビス（９−
（ｐ−ビニルベンゾイル）ノナノイル）−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホエタノールアミンなどが挙げられる。

【００１７】さらに、別の重合性リン脂質の具体例は、
１，２−ビス（２，４−オクタデカジエノイル）−ｓｎ
−グリセロ−３−リン酸、１，２−ビス（２，４−ヘキ
サデカジエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、１
−（オクタデカノイル）−２−（２，４−オクタデカジ
エノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホン酸、１−
（ヘキサデカノイル）−２−（２，４−オクタデカジエ
ノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、１−（オクタ
デカノイル）−２−（２，４−ヘキサデカジエノイル）
−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、１−（ヘキサデカノイ
ル）−２−（２，４−ヘキサデカジエノイル）−ｓｎ−
グリセロ−３−リン酸、１−（２，４−オクタデカジエ
ノイル）−２−（オクタデカノイル）−ｓｎ−グリセロ
−３−リン酸、１−（２，４−ヘキサデカジエノイル）
−２−（ヘキサデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−リ
ン酸、１，２−ビス−（８，１０，１２−オクタデカト
リエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、１，２−
ビス（１２−メタクリロイルオキシドデカノイル）−ｓ
ｎ−グリセロ−３−リン酸、１，２−ビス（９−（ｐ−
ビニルベンゾイル）ノナノイル）−ｓｎ−グリセロ−３
−リン酸などのリン酸誘導体あるいはその塩などが挙げ
られる。

【００１８】重合性リン脂質には、炭素数６から２４の
直鎖あるいは分岐鎖の非重合性基が含有されても良い。

【００１９】本発明の重合リポソーム懸濁液の原料物質
となる重合性脂肪酸としては、例えば、ビニルアルキル
基、スチリルアルキル基、（メタ）アクリロイルオキシ
アルキル基、共役ジエンアルキル基、共役ジインアルキ
ル基を有するものであり、具体的には２，４−オクタデ
カジエン酸、２，４−ヘキサデカジエン酸、８，１０，
１２−オクタデカトリエン酸、９−（ｐ−ビニルベンゾ
イル）ノナニル酸、１，２−メタクリロイルオキシドデ
カン酸、１０−ウンデシン酸、１６−ヘプタデシン酸、
２２−トリコシン酸、トリコサ−１０，１２−ジイン
酸、トリコサ−２，４−ジイン酸、ノナデカ−２，４−
ジイン酸などが挙げられる。

【００２０】本発明に用いる重合性脂肪酸コレステロー
ルエステルは、コレステロールと前記重合性脂肪酸との
エステルなどが利用可能である。

【００２１】本発明の重合リポソーム懸濁液に使用され
る重合性脂質は、以上に述べた重合性脂質の１種類であ
る必要はなく、複数種類組み合わせることもできる。

【００２２】重合性脂質の全脂質に占める割合が２５モ
ル％未満の製造原料により製造された重合リポソーム懸
濁液は、浸透圧の変化に対して粒径が大きく変化し、不
安定であることが見出されたので、本発明の重合リポソ
ーム懸濁液では、製造原料における重合性脂質の全脂質
に占める割合は、２５モル％以上が好ましい。更に好ま
しくは５０モル％以上であり、また、最も浸透圧に対す
る安定性を高めるには７５モル％以上が好ましい。

【００２３】重合性脂質としては重合性リン脂質を用い
ることが好ましい。重合性リン脂質としては、脂肪酸残
基あるいは炭化水素基の炭素数が６から２４のものが好
ましく、炭素数が１４から２０のものが更に好ましい。
重合性リン脂質の脂肪酸残基の重合性基は、ジエン、ト
リエンが好ましく、更に好ましくは共役ジエン基を重合
性基とする場合である。また、最も好ましい重合性リン
脂質はＤＯＤＰＣである。

【００２４】本発明で使用されるステロール類とはコレ
ステロール、コレスタノール等の非重合性のものを指
す。ステロール類は、膜安定化剤、膜表面の親水性調整
剤あるいはリポソーム膜の曲率調整剤などとして加えら
れるが、全脂質に対する割合が２５モル％を超えた場
合、浸透圧変化に対する粒径の安定性が損なわれるので
好ましくない。そのため、コレステロールが全脂質中に
占める割合は２５モル％が上限であり、好ましくは１８
モル％以下であり、さらに好ましくは１５モル％以下、
最も好ましくは１０モル％以下（ゼロモル％を含む）で
ある。

【００２５】本発明の重合リポソーム懸濁液の原料物質
として用いられるその他の成分としては、非重合性リン
脂質、トコフェロール類、非重合性脂肪酸および非重合
性脂肪族アミンなどが挙げられる。

【００２６】前記非重合性リン脂質を具体的に列挙すれ
ば、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、
水添大豆レシチンなどの天然系リン脂質およびその誘導
体、また、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパ
ルミトイルホスファチジルコリン（以下ＤＰＰＣと略
す）、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオ
イルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチ
ジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタ
ノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノール
アミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミト
イルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン
酸、ジオレイルホスファチジン酸、ジミリストイルホス
ファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジ
ルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセ
ロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロールなど
のアシル基組成を操作した合成系のリン脂質、更に、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールなど
が挙げられるが、本発明はこれらに特に限定されるもの
ではない。

【００２７】トコフェロール類は、本発明の重合リポソ
ーム懸濁液において、膜安定化剤あるいは抗酸化剤など
として使用可能である。非重合性脂肪酸および非重合性
脂肪族アミンはリポソーム膜に電荷を与えるためなどに
用い、炭素数６から２４の直鎖あるいは分岐鎖のものが
利用可能である。

【００２８】リポソーム化する際の水和液としては、本
発明の重合リポソーム懸濁液の浸透圧安定性に影響を与
えない範囲に於いて、診断薬用担体、医薬用リポソーム
などの利用目的に応じた、必要とされる水溶性の薬物な
どの物質を溶解させて使用することができ、リポソーム
に内包させることができる。

【００２９】以上に述べた重合リポソーム懸濁液の原料
物質から本発明の重合リポソーム懸濁液を作製する方法
は、特に限定されるものではないが、例えば「リポソー
ム」（株）南光堂（１９８８年発行）に記載されている
ような、薄膜法、超音波処理法、エタノール注入法、フ
レンチブレス法、押し出し法、透析法、凍結融解法、逆
相蒸発法あるいは高圧吐出式乳化機等による方法が可能
である。

【００３０】要求される粒径あるいは多重膜性（ラメラ
リティー）等の品質に応じて、上記の方法を選択してリ
ポソームの作製を行うことが可能で、リポソームの平均
粒径は、５から４００ｎｍが用いられ、好ましくは１０
から３００ｎｍである。

【００３１】本発明における重合性リポソーム懸濁液の
重合には、開始剤重合、紫外線重合、γ線重合、Ｘ線重
合、電子線重合などの公知の方法を選択することにより
行うことができる。これら重合方法は特に限定されるも
のではないが、例えば、開始剤重合では開始剤としてア
ゾ系化合物、有機系過酸化物、無機系過酸化物などを用
いることができる。アゾ系開始剤としては、疎水性の
２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、アゾビス
シクロヘキサンニトリル、フェニルアゾトリフェニルメ
タン、親水性の２，２’−アゾビス（２−アミジノプロ
パン）二塩酸塩（以下ＡＡＰＤと略す）、有機系過酸化
物系としては、ｔ−ブチルパーオキサイド、ｐ−メンタ
ンヒドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシマレイ
ックアシッド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジ
ヒドロパーオキサイドあるいはサクシニックアシッドパ
ーオキサイド、無機系過酸化物の過硫酸カリウム、過硫
酸アンモニウムなどが挙げられる。

【００３２】γ線重合の例としては、⁶⁰Ｃｏを線源とす
るγ線照射で重合反応を進めることが可能で、線量率は
０．５ｋＧｙ／時間から１５ｋＧｙ／時間が、照射時間
は１５分から６時間等が可能である。

【００３３】電子線重合の例としては、電子加速器から
発生する電子線を用い、５００〜１０，０００ｋＧｙ／
時間の線量率により照射することが可能である。反応温
度も特に制限を受けないが０から８０℃等、好ましくは
０から６０℃等で行われる。本発明で得られた重合リポ
ソーム懸濁液の重合解析の方法は、特に限定されるもの
ではないが、例えば、重合性基に由来する特有のＵＶ吸
収、或いはＩＲ吸収を利用する方法、重合性基に隣接す
る ¹Ｈの核磁気共鳴を追跡する方法、及び重合リン脂質
を加水分解しポリカルボン酸を得、ゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィーで分子量を測定する方法等が挙げ
られる。

【００３４】重合性リン脂質の重合解析を更に詳しく述
べると、ＤＯＤＰＣを原料とした重合リポソーム分散液
に２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加し、８０℃で４８時
間加水分解した後に、塩酸で中和する。ポリオクタジエ
ン酸は沈澱物として得られるので、メンブランフィルタ
ーで濾過することにより、残さとして重合物が得られ
る。これを洗浄・乾燥後、テトラヒドロキシフランに溶
解してゲルパーミエーションクロマトグラフィーにて分
子量測定を行う。ポリオクタデカジエン酸の数平均分子
量は５×１０³ から１×１０⁷ の範囲である。

【００３５】内水相の浸透圧とは水和時に用いる水和溶
液の浸透圧をさす。水和溶液の浸透圧は特に限定されな
いが、例えば、リポソーム懸濁液を免疫凝集反応試薬の
担体に使用する場合は、ｐＨを安定化させるための緩衝
剤などの配合により、１〜３００ｍＯｓｍ程度となるこ
とが一般的である。

【００３６】本発明で外水相の浸透圧を変化させる方法
は、特に限定されないが、透析、およびゲル濾過によっ
て外水相を置換する方法や、高浸透圧溶液や塩などを外
水相に直接添加して外水相の浸透圧を変化させる方法な
どが使用できる。

【００３７】調整される外水相の浸透圧は、特に限定さ
れないが、例えば、免疫凝集反応試薬に用いる場合は、
免疫反応に関与するタンパク質の安定性の問題から１０
０ｍＯｓｍ〜７５０ｍＯｓｍ程度が一般的である。

【００３８】ところで、重合していないリポソーム懸濁
液は５０ｍＯｓｍの浸透圧変化に対しても著しい粒径の
変化がみられる。また、従来の一般的な重合リポソーム
懸濁液は、５０ｍＯｓｍ程度までの浸透圧の変化であれ
ば比較的安定であるが、内外相の浸透圧差が１００ｍＯ
ｓｍ以上になると大きな粒径変化や凝集が生じ、２００
ｍＯｓｍの浸透圧変化ではその傾向がさらに顕著であ
る。これに対して、本発明の重合リポソーム懸濁液は、
１００ｍＯｓｍ、或いは２００ｍＯｓｍ以上の浸透圧差
でも沈澱や大きな粒径変化を生じず安定が保たれる。

【００３９】水溶液の浸透圧を調整する化合物として
は、以下に列挙する各種塩類が挙げられる。即ち、塩化
カリウム、塩化ナトリウムなどの各アルカリ金属塩酸
塩、ホウ酸、リン酸、硫酸、フェニル酢酸、フェノール
スルホン酸、クエン酸、フタル酸、ペンタン酸、ブタン
酸、プロピオン酸、乳酸、ピルビン酸、アセト酢酸、ア
コニチン酸、エチレンジアミン四酢酸、カコジル酸、コ
ハク酸、酒石酸、テトラシュウ酸、ｐ−トルエンスルホ
ン酸、ピロリン酸、マレイン酸、アスパラギン酸、グル
タミン酸、チロシンおよびシステインなどの各酸性化合
物のアルカリ金属塩、アンモニア、コリン、アミノピリ
ジン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオ
ール、イミダゾール、エタノールアミン、Ｎ−エチルモ
ルホリン、エチレンジアミン、ジエタノールアミン、ヒ
ドロキシルアミン、ピペラジン、リジン、アルギニンお
よびヒスチジンなどの各塩基性化合物の無機酸塩、並び
にグリシン、グリシルグリシン、Ｎ−２−（アセトアミ
ド）−２−アミノエタノールスルホン酸、Ｎ−２−（ア
セトアミド）イミノジ酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロ
キシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、〔ビス−
（２−ヒドロキシエチル）イミノ〕−トリス−（ヒドロ
キシメチル）−メタン、ジエチレントリアミンペンタ酢
酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸、２−ヒドロキシエチルイミノ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メタン、ニトロトリ酢酸、ピペラジン−
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタン）スルホン酸、Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホ
ン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン
およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどの
各両性化合物のアルカリ金属塩あるいは無機酸塩などが
挙げられる。

【００４０】以上の浸透圧調整化合物の１種以上を単独
あるいは複数で用いることが可能で、その他の水溶性化
合物を本発明の重合リポソーム懸濁液の性能に悪影響を
与えない範囲において用いることも何ら制限されるもの
ではない。

【００４１】浸透圧を測定する方法は、特に限定される
ものではないが、凝固点降下または沸点上昇等を測定す
ることなどより求められる。

【００４２】

【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明す
る。しかしながら、本発明は以下の実施例のみに限定さ
れるものではない。

【００４３】〔参考例１−１〕 重合性脂質混合物の調製（１） 重合性脂質としてＤＯＤＰＣ９５６ｍｇ（１２１６μｍ
ｏｌ；全脂質に占める割合９５ｍｏｌ％、以下同様）、
非重合性脂質としてジミリストイルフォスファチジルグ
リセロールアンモニウム塩（以後ＤＭＰＧと略す）４４
ｍｇ（６４μｍｏｌ）をナス型フラスコ中でクロロホル
ム５０ｍｌに溶解し、エバポレーターで２５℃に維持し
つつ溶剤を留去した。次にナス型フラスコを２５℃の真
空乾燥機内に移し、８時間減圧乾燥して重合性脂質混合
物を得た。

【００４４】〔参考例１−２〕 重合性脂質混合物の調製（２） 重合性脂質としてＤＯＤＰＣ７１５ｍｇ（９１５μｍｏ
ｌ；７０ｍｏｌ％）および非重合性脂質としてＤＰＰＣ
２４０ｍｇ（３２７μｍｏｌ）およびＤＭＰＧ４４．７
ｍｇ（６６μｍｏｌ）を原料とし、前記参考例１−１と
同様の方法で重合性脂質混合物を調製した。

【００４５】〔参考例１−３〕 重合性脂質混合物の調製（３） 重合性脂質としてＤＯＤＰＣ４９３ｍｇ（６３０μｍｏ
ｌ；４７．５ｍｏｌ％）、非重合性脂質としてＤＰＰＣ
４６２ｍｇ（６３０μｍｏｌ）およびＤＭＰＧ４５．３
ｍｇ（６６μｍｏｌ）を原料とし、前記参考例１−１と
同様の方法で重合性脂質混合物を調製した。

【００４６】〔参考例１−４〕 重合性脂質混合物の調製（４） 重合性脂質としてＤＯＤＰＣ２６３ｍｇ（３３６μｍｏ
ｌ；２５ｍｏｌ％）、非重合性脂質としてＤＰＰＣ６９
１ｍｇ（９４１μｍｏｌ）およびＤＭＰＧ４６．０ｍｇ
（６７μｍｏｌ）を原料とし、前記参考例１−１と同様
の方法で重合性脂質混合物を調製した。

【００４７】〔参考例１−５〕 重合性脂質混合物の調製（５） 重合性脂質としてＤＯＤＰＣ８０７ｍｇ（１，０３２μ
ｍｏｌ；７０ｍｏｌ％）、非重合性脂質としてコレステ
ロール１４３ｍｇ（３６９μｍｏｌ；２５ｍｏｌ％）お
よびＤＭＰＧ５０．０ｍｇ（７４μｍｏｌ）を原料と
し、前記参考例１−１と同様の方法で重合性脂質混合物
を調製した。

【００４８】〔参考例１−６〕 重合性脂質混合物の調製（６） 重合性脂質としてＤＨＤＰＣ７９５ｍｇ（１，０９５μ
ｍｏｌ；７０ｍｏｌ％）、非重合性脂質としてコレステ
ロール１５１ｍｇ（３９１μｍｏｌ；２５ｍｏｌ％）お
よびＤＭＰＧ５３．５ｍｇ（７８μｍｏｌ）を原料と
し、前記参考例１−１と同様の方法で重合性脂質混合物
を調製した。

【００４９】〔参考例１−７〕 重合性脂質混合物の調製（７） 重合性脂質としてＳＯＤＰＣ９５６ｍｇ（１，２１６μ
ｍｏｌ；９５ｍｏｌ％）および非重合性脂質としてＤＭ
ＰＧ４３．８ｍｇ（６４μｍｏｌ）を原料とし、前記参
考例１−１と同様の方法で重合性脂質混合物を調製し
た。

【００５０】〔参考例２−１〕 重合性脂質混合物の調製（８） 重合性脂質としてＤＯＤＰＣ６３０ｍｇ（８０６μｍｏ
ｌ；４７．５ｍｏｌ％）、非重合性脂質としてコレステ
ロール３１２ｍｇ（８０６μｍｏｌ；４７．５ｍｏｌ
％）およびＤＭＰＧ５８．０ｍｇ（８５μｍｏｌ）を原
料とし、前記参考例１−１と同様の方法で重合性脂質混
合物を調製した。

【００５１】〔参考例２−２〕 非重合性脂質混合物の調製 非重合性脂質としてＤＰＰＣ６１６ｍｇ（８３８μｍｏ
ｌ；４７．５ｍｏｌ％）、コレステロール３２４ｍｇ
（８３８μｍｏｌ；４７．５ｍｏｌ％）およびＤＭＰＧ
６０．４ｍｇ（８８μｍｏｌ）を原料とし、前記参考例
１−１と同様の方法で非重合性脂質混合物を調製した。

【００５２】〔実施例１−１〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−１で調製した重合性脂質混合物の入った
ナス型フラスコに、１ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
５；浸透圧１ｍＯｓｍ）からなる水和溶液２０ｍｌを添
加し、２５℃で穏やかに攪拌・振とうして脂質を分散さ
せた。この分散液を４０℃で、エクストルーダー（日油
リポソーム（株）、最大圧力３０ｋｇ／ｃｍ² ）を用い
て、厚さ０．２μｍのポリカーボネート製メンブランフ
ィルターを５回通過させた。リン濃度を測定し２０ｍＭ
に濃度調整してリポソーム懸濁液を得た。

【００５３】即ち、このリポソーム懸濁液の内水相の浸
透圧は１ｍＯｓｍである。水和溶液の浸透圧は、浸透圧
計（オズモメーター ＯＮＥ−ＴＥＮ、ＦＩＳＫＥ社
製）で測定した。また、以後浸透圧が記してある溶液は
同様に測定を行った。

【００５４】（２）リポソーム懸濁液の重合 得られたリポソーム懸濁液をガラス製試料瓶に入れ、窒
素ガスでバブリングして溶存酸素を除去した後、５ｋＧ
ｙ／時間のγ線を２５℃で１時間照射して重合反応を行
った。

【００５５】（３）浸透圧差を与える透析 得られた重合リポソーム懸濁液の一部を分画分子量が６
０００から８０００の透析膜に入れ、１００倍容量の、
食塩を加えて３０４ｍＯｓｍに調整した１０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行い外水相を置換
した。透析後の外水相の浸透圧の測定は、透析後のリポ
ソーム懸濁液を限外濾過し、リポソームを除いた液につ
いて浸透圧計（オズモメーター ＯＮＥ−ＴＥＮ、ＦＩ
ＳＫＥ社製）を用いて行った。また、透析を行う前後の
重合リポソームの平均粒径を、動的光散乱法粒度分布計
（ＮＩＣＯＭＰモデル３７０ＨＰＬ、日油リポソーム
（株）製）で測定した。

【００５６】〔実施例１−２〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−１で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００５７】（２）リポソーム懸濁液の重合 得られたリポソーム懸濁液をガラス製試料瓶に入れ、窒
素ガスでバブリングして溶存酸素を除去した。この試料
瓶を横に倒し、溶液の深さが１０ｍｍ以下とし、５Ｍｅ
Ｖの電子線照射装置を用いて５ｋＧｙの線量を照射して
重合反応を行った。０．８μｍのメンブランフィルター
で、共雑物を取り除き重合リポソーム懸濁液を得た。

【００５８】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００５９】〔実施例１−３〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−１で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００６０】（２）リポソーム懸濁液の重合 アゾ系開始剤としてＡＡＰＤ１６．５ｍｇ（６１μＭ）
をリポソーム懸濁液に加え、６０℃に加温して１２時間
維持しアゾ系開始剤による重合を行った。０．８μｍの
メンブランフィルターで、共雑物を取り除き重合リポソ
ーム懸濁液を得た。

【００６１】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００６２】〔実施例１−４〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−１で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００６３】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００６４】（３）浸透圧差を与える透析 得られた重合リポソーム懸濁液の一部を透析膜に入れ、
１００倍容量の、食塩で浸透圧を１５１６ｍＯｓｍに調
整した１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で透
析を行い外水相を置換した。次いで前記実施例１−１−
（３）と同様に外水相浸透圧測定及び粒径測定を行っ
た。

【００６５】〔実施例１−５〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−１で調製した重合性脂質混合物の入った
ナス型フラスコに、食塩で３００ｍＯｓｍに調整した１
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる水和
溶液１０ｍｌを添加し、２５℃で穏やかに攪拌・振とう
して脂質を分散させた。この分散液を４０℃で、エクス
トルーダー（日油リポソーム（株）製）を用いて厚さ
０．２μｍのポリカーボネート製メンブランフィルター
を５回通過させた。次に、リン濃度を測定し２０ｍＭに
濃度調整してリポソーム懸濁液を得た。

【００６６】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００６７】（３）浸透圧差を与える透析 得られた重合リポソーム懸濁液の一部を透析膜に入れ、
１００倍容量の、食塩で６０３ｍＯｓｍに調整した１０
ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し、外水相
の置換を行った。次いで前記実施例１−１−（３）と同
様に、外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００６８】〔実施例２−１〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−２で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００６９】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００７０】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００７１】〔実施例２−２〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−３で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００７２】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００７３】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００７４】〔実施例２−３〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−４で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００７５】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００７６】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００７７】〔実施例２−４〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−５で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００７８】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００７９】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００８０】〔実施例２−５〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−６で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００８１】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００８２】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００８３】〔実施例２−６〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例１−７で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００８４】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００８５】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００８６】〔比較例１−１〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例２−１で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００８７】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００８８】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００８９】〔比較例１−２〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例２−１で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００９０】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００９１】（３）浸透圧差を与える透析 得られた重合リポソームの一部を透析膜に入れ、１００
倍容量の、食塩で１０２Ｏｓｍに調整した１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し、外水相の置換
を行った。

【００９２】透析後は、前記実施例１−１−（３）と同
様の条件で外水相の浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００９３】〔比較例１−３〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例２−１で調製した重合性脂質混合物を用い、
前記実施例１−５−（１）と同様の方法でリポソーム懸
濁液の調製を行った。

【００９４】（２）リポソーム懸濁液の重合 前記実施例１−１−（２）と同様の条件でγ線照射を行
い重合リポソーム懸濁液を調製した。

【００９５】（３）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−５−（３）と同様の条件で透析した後、
外水相の浸透圧測定及び粒径測定を行った。

【００９６】〔比較例２〕 （１）リポソーム懸濁液の調製 前記参考例２−２で調製した非重合性脂質混合物を用
い、前記実施例１−１−（１）と同様の方法でリポソー
ム懸濁液の調製を行った。

【００９７】（２）浸透圧差を与える透析 前記実施例１−１−（３）と同様の条件で透析、及び粒
径測定を行った。

【００９８】前記各実施例及び前記各比較例とについて
安定性評価結果を下記の表１に示した。

【００９９】評価法は、まず浸透圧差を負荷した透析を
行う前の平均粒径（Ａ）、および浸透圧を負荷した透析
を行った後の平均粒径（Ｂ）より、下記の式（２）で示
される粒径変化率を求めた。

【０１００】 粒径変化率（％）＝〔（Ｂ−Ａ）／Ａ〕×１００ … 式（２） 粒径変化率の値のうち±１０％以下は安定性が高いもの
として◎、±１１〜±２０％は実用上問題ないものとし
て○、それ以上の変化率を示したものや沈澱を生じたも
のは安定性不良のものとして×で示した。

【０１０１】

【表１】

【０１０２】

【発明の効果】本発明の重合リポソーム懸濁液は、ステ
ロール類の含有量を少なくした特別な配合割合の重合性
脂質混合物を重合させたものとすることにより、浸透圧
変化、特に使用時の浸透圧調整における浸透圧変化に対
しても凝集することなく、安定となる性質を有する。

【０１０３】本発明の重合リポソーム懸濁液は、その外
水相の浸透圧を、内水相の浸透圧に対し１００ｍＯｓｍ
以上変化させても安定である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 全膜構成脂質中、重合性脂質を２５〜１
   ００モル％及びステロール類を０〜２５モル％含有する
   重合性リポソーム懸濁液を重合させてなる重合リポソー
   ム懸濁液。
2. 【請求項２】 請求項１記載の、重合リポソーム懸濁液
   の外水相の浸透圧を、内水相の浸透圧に対し１００ｍＯ
   ｓｍ以上変化させて使用環境に最適な浸透圧に調整して
   なる重合リポソーム懸濁液。