JPH0912472A - 分子単一性の超高分子ヘモグロビンの製法 - Google Patents
分子単一性の超高分子ヘモグロビンの製法Info
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- JPH0912472A JPH0912472A JP7159664A JP15966495A JPH0912472A JP H0912472 A JPH0912472 A JP H0912472A JP 7159664 A JP7159664 A JP 7159664A JP 15966495 A JP15966495 A JP 15966495A JP H0912472 A JPH0912472 A JP H0912472A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 分子単一性の超高分子ヘモグロビンの製法
【構成】 種々異なる分子量を有する超高分子ヘモグロ
ビンの公知溶液に、少なくとも一つの限外濾過工程及び
／又は少なくとも一つの分別沈殿工程及び／又は少なく
とも一つのクロマトグラフィ工程及び／又は少なくとも
一つの部分溶解工程を施す。
ビンの公知溶液に、少なくとも一つの限外濾過工程及び
／又は少なくとも一つの分別沈殿工程及び／又は少なく
とも一つのクロマトグラフィ工程及び／又は少なくとも
一つの部分溶解工程を施す。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子単一性の超高分子
ヘモグロビンの製法に関する。
ヘモグロビンの製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】人における酸素伝達機能を支持すること
のできる、いわゆる血液代用媒体を提供するために、ヘ
モグロビンの化学的変性、例えば、酸素親和性の変更又
は分子の重合が行われる。
のできる、いわゆる血液代用媒体を提供するために、ヘ
モグロビンの化学的変性、例えば、酸素親和性の変更又
は分子の重合が行われる。
【０００３】この血液代用媒体は、例えば、制御困難な
出血を伴う交通事故、血液消失下での事故の際、又は注
射の危険の場合（肝炎、ＡＩＤＳ）に、瞬時に供給不可
能な適切な保存血液の代用品として注入され；このこと
は、例えば、前記の場合に、人が血液量不足−ショック
に陥る際にもあてはまる。酸素伝達性血液代用溶液が保
存血液よりも早く血液量不足ショックを中断することが
できる、それというのも、保存品中の赤血球は硬化し、
それにより減少された毛細血管貫通性を示すことは公知
であるからである。酸素伝達性血液代用品は、保存血液
に比べて、免疫学的過剰反応の危険性が存在する場合に
も好適である。動物実験で酸素伝達性血液代用液を用い
ると、簡単な血漿増量剤（Ｐｌａｓｍａｅｘｐａｎｄｅ
ｒ）を用いる場合よりも血液量不足−ショックを有効に
克服できることが明らかである（これに関する文献：
Ｒ．Ｐａｂｓｔ、Ｍｅｄ．Ｋｌｉｎ．７２（１９７
７）、１５５５−１５６２）。
出血を伴う交通事故、血液消失下での事故の際、又は注
射の危険の場合（肝炎、ＡＩＤＳ）に、瞬時に供給不可
能な適切な保存血液の代用品として注入され；このこと
は、例えば、前記の場合に、人が血液量不足−ショック
に陥る際にもあてはまる。酸素伝達性血液代用溶液が保
存血液よりも早く血液量不足ショックを中断することが
できる、それというのも、保存品中の赤血球は硬化し、
それにより減少された毛細血管貫通性を示すことは公知
であるからである。酸素伝達性血液代用品は、保存血液
に比べて、免疫学的過剰反応の危険性が存在する場合に
も好適である。動物実験で酸素伝達性血液代用液を用い
ると、簡単な血漿増量剤（Ｐｌａｓｍａｅｘｐａｎｄｅ
ｒ）を用いる場合よりも血液量不足−ショックを有効に
克服できることが明らかである（これに関する文献：
Ｒ．Ｐａｂｓｔ、Ｍｅｄ．Ｋｌｉｎ．７２（１９７
７）、１５５５−１５６２）。
【０００４】更に、慢性血流障害（例えば、冠、脳及び
末梢）も、適当なポリヘモグロビン溶液を用いて有効に
克服できることが期待できる。血流減少することなしの
酸素不足状態、例えば、慢性貧血は、このような溶液で
克服することができる。この適応は、概算で、むしろ１
０倍もの大きな用途範囲を有する。
末梢）も、適当なポリヘモグロビン溶液を用いて有効に
克服できることが期待できる。血流減少することなしの
酸素不足状態、例えば、慢性貧血は、このような溶液で
克服することができる。この適応は、概算で、むしろ１
０倍もの大きな用途範囲を有する。
【０００５】酸素伝達性血液代用媒体の製造のために、
従来は、種々の方法が行われており、即ち、 １．酸素を非常に良好に溶かすフッ素化炭化水素のエマ
ルジヨンの使用（これに関する文献：Ｈｉｒｌｉｎｇｅ
ｒ 等、Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｓｔ ３１（１９８
２）、６６０ー６６６）。しかしながら、この方法は、
フッ素化炭化水素の使用時に組織的反応が表れる欠点を
有する。
従来は、種々の方法が行われており、即ち、 １．酸素を非常に良好に溶かすフッ素化炭化水素のエマ
ルジヨンの使用（これに関する文献：Ｈｉｒｌｉｎｇｅ
ｒ 等、Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｓｔ ３１（１９８
２）、６６０ー６６６）。しかしながら、この方法は、
フッ素化炭化水素の使用時に組織的反応が表れる欠点を
有する。
【０００６】２．燐脂質−小胞中での濃ヘモグロビン溶
液のマイクロカプセル化により、いわゆる「人工赤血
球」にする（これに関する文献：Ｇａｂｅｒ 等の Ｅ
ｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉ
ｎ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅ
ｓ；Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ ｏｆ ａ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｒｏｇａ
ｔｅ ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｉｘｔｈ
Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ”、Ｇ．
Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ（Ｈｅｒａｕｓｇｅｂｅｒ）、Ａｌａ
ｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ．、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１
９８４）、１７９−１９０）。しかしながら、この方法
は、現時点では、なおテスト実験の開発段階にある。更
に、ここでは、小胞形成性の脂質による組織の脂質−過
負荷の危険が存在する。
液のマイクロカプセル化により、いわゆる「人工赤血
球」にする（これに関する文献：Ｇａｂｅｒ 等の Ｅ
ｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉ
ｎ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅ
ｓ；Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ ｏｆ ａ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｒｏｇａ
ｔｅ ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｉｘｔｈ
Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ”、Ｇ．
Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ（Ｈｅｒａｕｓｇｅｂｅｒ）、Ａｌａ
ｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ．、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１
９８４）、１７９−１９０）。しかしながら、この方法
は、現時点では、なおテスト実験の開発段階にある。更
に、ここでは、小胞形成性の脂質による組織の脂質−過
負荷の危険が存在する。
【０００７】３．適当なヘモグロビン溶液の製造。この
方法は、最良の結果を提供する見込みがある。
方法は、最良の結果を提供する見込みがある。
【０００８】ドイツ特許（ＤＥ−ＯＳ）第２４１７６１
９号明細書には、例えば、血漿タンパク質代用品として
の、重合され、結合されたヘモグロビンが記載されてい
る（ここでは、ジカルボキシリデート−結合されたヘモ
グロビンが製造される）。
９号明細書には、例えば、血漿タンパク質代用品として
の、重合され、結合されたヘモグロビンが記載されてい
る（ここでは、ジカルボキシリデート−結合されたヘモ
グロビンが製造される）。
【０００９】ドイツ特許第２７１４２５２号明細書中に
は、ピリドキサルホスフェート−結合されたヘモグロビ
ンが記載されている。
は、ピリドキサルホスフェート−結合されたヘモグロビ
ンが記載されている。
【００１０】ドイツ特許第３０２９３０７号は、多糖
類、例えば、デキストランと細胞不含のヘモグロビンと
の共有結合により製造される血液代用品に関する。
類、例えば、デキストランと細胞不含のヘモグロビンと
の共有結合により製造される血液代用品に関する。
【００１１】ベルギー特許（ＢＥ−ＰＳ）第８３８９３
３号明細書には、遊離ヘモグロビンと多官能結合する試
薬との反応、及び引き続く、失活化剤を用いるこの反応
の停止による、結合され、重合された、水溶性のヘモグ
ロビンの製造が記載されている。６４０００〜１０００
０００ダルトンの分子量を有する高分子ヘモグロビンが
得られる。
３号明細書には、遊離ヘモグロビンと多官能結合する試
薬との反応、及び引き続く、失活化剤を用いるこの反応
の停止による、結合され、重合された、水溶性のヘモグ
ロビンの製造が記載されている。６４０００〜１０００
０００ダルトンの分子量を有する高分子ヘモグロビンが
得られる。
【００１２】米国特許（ＵＳ−ＰＳ）第４００１４０１
号は、結合性試薬グルタールアルデヒド、ヘキサメチレ
ンジイソシアネート又はブタジエンジエポキシドを用い
て得られる、６４０００〜１００００００ダルトンの分
子量を有する、血液代用品及び血漿増量剤としての、結
合され、重合されたヘモグロビンに関する。
号は、結合性試薬グルタールアルデヒド、ヘキサメチレ
ンジイソシアネート又はブタジエンジエポキシドを用い
て得られる、６４０００〜１００００００ダルトンの分
子量を有する、血液代用品及び血漿増量剤としての、結
合され、重合されたヘモグロビンに関する。
【００１３】欧州特許（ＥＰ−ＰＳ）第０２０１６１８
号は、モノマーヘモグロビンの高濃度溶液から、このヘ
モグロビンの極めて高分子量の、コンパクトで、可溶性
のポリマー、いわゆる超ポリマー（Ｈｙｐｅｒｐｏｌｙ
ｍｅｒ）を製造する方法に関する。
号は、モノマーヘモグロビンの高濃度溶液から、このヘ
モグロビンの極めて高分子量の、コンパクトで、可溶性
のポリマー、いわゆる超ポリマー（Ｈｙｐｅｒｐｏｌｙ
ｍｅｒ）を製造する方法に関する。
【００１４】ドイツ特許第３７１４３５１号明細書中で
は、この方法が、直接赤血球として使用でき、この脂質
−相中に網状化剤を添加する必要はない限り、簡略化さ
れている。
は、この方法が、直接赤血球として使用でき、この脂質
−相中に網状化剤を添加する必要はない限り、簡略化さ
れている。
【００１５】通常臨床で使用するための適当に変性され
たヘモグロビン−溶液の製造時には、特に、溶液の粘度
をできるだけ小さく保つ必要がある。血液の粘度は、組
織のいわゆる全身末梢的抵抗に決定的に寄与し；それ
は、循環系がこれを認容しないので、決して大きすぎて
はならない。
たヘモグロビン−溶液の製造時には、特に、溶液の粘度
をできるだけ小さく保つ必要がある。血液の粘度は、組
織のいわゆる全身末梢的抵抗に決定的に寄与し；それ
は、循環系がこれを認容しないので、決して大きすぎて
はならない。
【００１６】ポリマー溶液の場合（殊にヘモグロビンポ
リマーにも当てはまる）に、特に、重合して連鎖分子を
生じる場合に、このような問題が起こる。溶液の粘度を
小さくするためには、このポリマーは、できるだけコン
パクトであり、血漿のできるだけ小さい粘度で、できる
だけ大きい酸素キャリアの濃度を適用できるために、液
体流通性の繊維分子であってはならない。
リマーにも当てはまる）に、特に、重合して連鎖分子を
生じる場合に、このような問題が起こる。溶液の粘度を
小さくするためには、このポリマーは、できるだけコン
パクトであり、血漿のできるだけ小さい粘度で、できる
だけ大きい酸素キャリアの濃度を適用できるために、液
体流通性の繊維分子であってはならない。
【００１７】アインシュタインの粘度法則は、単位の大
きい球は、液体中で、しかもその半径とは無関係に、最
小の粘度を有すると言及している。
きい球は、液体中で、しかもその半径とは無関係に、最
小の粘度を有すると言及している。
【００１８】従って、この粘度を低めるためには、例え
ば、更に自然界（ミミズ）でも見られるような、できる
だけ単一の酸素担持性の分子を製造できることがきわめ
て重要である。
ば、更に自然界（ミミズ）でも見られるような、できる
だけ単一の酸素担持性の分子を製造できることがきわめ
て重要である。
【００１９】この酸素キャリアの分子量を非常に高くす
ることができれば、これに伴い、他方で、無視しうるコ
ロイド浸透圧に関する要求が満足される。
ることができれば、これに伴い、他方で、無視しうるコ
ロイド浸透圧に関する要求が満足される。
【００２０】ヘモグロビン溶液に基づくいわゆる低膨張
性（ｈｙｐｏｎｋｏｔｉｓｃｈ）の血液添加物の場合に
は、更に、超ポリマーの特別な低分子量分を必ず除くこ
とが必要である。
性（ｈｙｐｏｎｋｏｔｉｓｃｈ）の血液添加物の場合に
は、更に、超ポリマーの特別な低分子量分を必ず除くこ
とが必要である。
【００２１】欧州特許第０２０１６１８号及びドイツ特
許第３７１４３５１号によれば、ヘモグロビンを結合し
てコンパクトであるが可溶性の巨大分子にする問題は、
解決されたとみなすことができる。しかしながら、そこ
に記載の方法は、広い分子量分布を有し、濃度の上昇の
際に粘度の著しく過剰比例する増加をもたらす（Ｂａｒ
ｎｉｋｏｌ Ａｎｄ Ｂｕｒｋｈａｒｄ、Ａｄｖ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｍｅｄ．２４８（１９８９）３３５ー３４０）。
許第３７１４３５１号によれば、ヘモグロビンを結合し
てコンパクトであるが可溶性の巨大分子にする問題は、
解決されたとみなすことができる。しかしながら、そこ
に記載の方法は、広い分子量分布を有し、濃度の上昇の
際に粘度の著しく過剰比例する増加をもたらす（Ｂａｒ
ｎｉｋｏｌ Ａｎｄ Ｂｕｒｋｈａｒｄ、Ａｄｖ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｍｅｄ．２４８（１９８９）３３５ー３４０）。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、種々異なる分子量の超ポリマーを有する公知のヘモ
グロビン−超ポリマー−溶液から分子単一性のヘモグロ
ビン−超ポリマーを分離することのできる方法を提供す
ることである。
は、種々異なる分子量の超ポリマーを有する公知のヘモ
グロビン−超ポリマー−溶液から分子単一性のヘモグロ
ビン−超ポリマーを分離することのできる方法を提供す
ることである。
【００２３】
【課題を解決するための手段】この課題の解決は、種々
異なる分子量の超高分子ヘモグロビンの公知溶液に、少
なくとも一つの限外濾過工程及び／又は少なくとも一つ
の分別沈殿工程及び／又は少なくとも一つのクロマトグ
ラフィ工程及び／又は少なくとも一つの部分的溶解工程
を施すことよりなる。
異なる分子量の超高分子ヘモグロビンの公知溶液に、少
なくとも一つの限外濾過工程及び／又は少なくとも一つ
の分別沈殿工程及び／又は少なくとも一つのクロマトグ
ラフィ工程及び／又は少なくとも一つの部分的溶解工程
を施すことよりなる。
【００２４】前記の方法は、技術水準では、その大きさ
又は重量が、最大で、四次元構造により決まるようなタ
ンパク質の分子量依存性の分離法として公知である。分
子量範囲上限は、従来の経験では約５０００００であ
る。これは、比較すべき分子量測定のための市場で得ら
れるマーカータンパク質の上限でもある。特別大きいタ
ンパク質では、周知のように、これらが屡々完全体とし
て分離されず、従来の大部分はなお未知の理由から、全
て又は部分的に分解し、その結果、下位単位のみを分離
取得している問題がある。
又は重量が、最大で、四次元構造により決まるようなタ
ンパク質の分子量依存性の分離法として公知である。分
子量範囲上限は、従来の経験では約５０００００であ
る。これは、比較すべき分子量測定のための市場で得ら
れるマーカータンパク質の上限でもある。特別大きいタ
ンパク質では、周知のように、これらが屡々完全体とし
て分離されず、従来の大部分はなお未知の理由から、全
て又は部分的に分解し、その結果、下位単位のみを分離
取得している問題がある。
【００２５】本発明の基礎になっているヘモグロビン−
超ポリマーは、通常存在するタンパク質とは異なり、最
近になって初めて合成され、その大きさ又は重量が−重
合度に応じて−既に比較的大きく、重い、四次元構造の
ヘモグロビン−分子の１００〜数１００倍である巨大分
子である。
超ポリマーは、通常存在するタンパク質とは異なり、最
近になって初めて合成され、その大きさ又は重量が−重
合度に応じて−既に比較的大きく、重い、四次元構造の
ヘモグロビン−分子の１００〜数１００倍である巨大分
子である。
【００２６】ところで、以外にも、限外濾過、分別沈
殿、クロマトグラフィ及び部分的溶解の自体公知の方法
を用いて、このような超高分子量のヘモグロビン−巨大
分子の混合物から、単一分子量を有するフラクシヨンを
分離することができることを発見した。このヘモグロビ
ン−巨大分子は、最初のかつ一時的な、粘度、光分散及
び限外濾過に関するポリマー分析研究（Ｐｏｅｔｓｃｈ
ｋｅ、Ｂａｒｎｉｋｏｌ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐ
ｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３７３（１９９２）８１１；及び
Ｍａｓｓｅｎｋｅｉｌ、Ｋｉｒｓｔｅ、Ｐｏｅｓｃｈｋ
ｅ，Ｂａｒｋｎｉｋｏｌ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐ
ｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７３（１９９２）７９８）によ
れば、連鎖分子である。
殿、クロマトグラフィ及び部分的溶解の自体公知の方法
を用いて、このような超高分子量のヘモグロビン−巨大
分子の混合物から、単一分子量を有するフラクシヨンを
分離することができることを発見した。このヘモグロビ
ン−巨大分子は、最初のかつ一時的な、粘度、光分散及
び限外濾過に関するポリマー分析研究（Ｐｏｅｔｓｃｈ
ｋｅ、Ｂａｒｎｉｋｏｌ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐ
ｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３７３（１９９２）８１１；及び
Ｍａｓｓｅｎｋｅｉｌ、Ｋｉｒｓｔｅ、Ｐｏｅｓｃｈｋ
ｅ，Ｂａｒｋｎｉｋｏｌ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐ
ｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７３（１９９２）７９８）によ
れば、連鎖分子である。
【００２７】限外濾過に関しては、このような巨大分子
では、一般的知識に基づき、限外フィルターの実質的に
環状の孔の通路はヘモグロビン−超ポリマーの連鎖特性
に基づくだけでも、分子量特異的な分離をもたらさない
と予想されていた。その代わりに、濾液中の高分子量分
を除去することは、従来成功しなかったともいわれた。
しかしながら、予期に反して、意外にも、限外濾過を用
いて、広い分子量範囲を有する粗製ポリマーから、保留
物中の低分子量分を除去することが可能であることが判
明した。これと共に、このポリマーのコロイド浸透圧が
決定的に低下されるもう一つの利点が判明した。
では、一般的知識に基づき、限外フィルターの実質的に
環状の孔の通路はヘモグロビン−超ポリマーの連鎖特性
に基づくだけでも、分子量特異的な分離をもたらさない
と予想されていた。その代わりに、濾液中の高分子量分
を除去することは、従来成功しなかったともいわれた。
しかしながら、予期に反して、意外にも、限外濾過を用
いて、広い分子量範囲を有する粗製ポリマーから、保留
物中の低分子量分を除去することが可能であることが判
明した。これと共に、このポリマーのコロイド浸透圧が
決定的に低下されるもう一つの利点が判明した。
【００２８】ヘモグロビン−超ポリマーの提供は、最近
になって初めて成功したので、この巨大分子の物理的及
び化学的特性に関する知識は、基本的になお僅かであ
る。その結果、沈殿工程でのその挙動も予想不能であ
り、この方法の適格性の発見は、意想外な結果であっ
た。分別沈殿を用いると、広い分子量範囲を有するヘモ
グロビン−超ポリマーから例えば高分子量分を除去する
ことができる。
になって初めて成功したので、この巨大分子の物理的及
び化学的特性に関する知識は、基本的になお僅かであ
る。その結果、沈殿工程でのその挙動も予想不能であ
り、この方法の適格性の発見は、意想外な結果であっ
た。分別沈殿を用いると、広い分子量範囲を有するヘモ
グロビン−超ポリマーから例えば高分子量分を除去する
ことができる。
【００２９】クロマトグラフィの分野でも、従来は、ヘ
モグロビン−超ポリマーのような巨大分子を有する範囲
での経験は存在しない。その大きさ及びその連鎖特性に
基づき、この方法での有効で分子量特異的な分離は、決
して予想できるものではなかった。しかしながら、意外
にも、クロマトグラフィ法を用いて種々の分子量の単一
性の超高分子ヘモグロビンを取得できることを発見し
た。
モグロビン−超ポリマーのような巨大分子を有する範囲
での経験は存在しない。その大きさ及びその連鎖特性に
基づき、この方法での有効で分子量特異的な分離は、決
して予想できるものではなかった。しかしながら、意外
にも、クロマトグラフィ法を用いて種々の分子量の単一
性の超高分子ヘモグロビンを取得できることを発見し
た。
【００３０】新製の架橋され、差し当たりなお不溶性の
ヘモグロビン−超ポリマーのスムースな洗浄により、過
剰の反応成分並びにモノマー及びオリゴマーのヘモグロ
ビン−分子を除去する公知方法は、他の前記の方法と問
題なく組み合わせることができる。従って、予想外に簡
単な方法で、分子量に関するその要素が極めて単一性を
示すヘモグロビン−超ポリマーを取得することができ
る。
ヘモグロビン−超ポリマーのスムースな洗浄により、過
剰の反応成分並びにモノマー及びオリゴマーのヘモグロ
ビン−分子を除去する公知方法は、他の前記の方法と問
題なく組み合わせることができる。従って、予想外に簡
単な方法で、分子量に関するその要素が極めて単一性を
示すヘモグロビン−超ポリマーを取得することができ
る。
【００３１】本発明の方法の有利な１実施態様は、限外
濾過工程で種々のタイプのフィルターを使用し、及び／
又は数回濾過を行い、及び／又はｐＨ−値を変え、及び
／又は種々の濃度で限外濾過を行い、及び／又は溶剤の
組成を変え、及び／又は温度を変え、及び／又は膜浸透
圧及び／又は正接（溢−）流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｅ
Ｕｅｂｅｒ−ｆｌｕｓｓ）を変えることを意図してい
る。
濾過工程で種々のタイプのフィルターを使用し、及び／
又は数回濾過を行い、及び／又はｐＨ−値を変え、及び
／又は種々の濃度で限外濾過を行い、及び／又は溶剤の
組成を変え、及び／又は温度を変え、及び／又は膜浸透
圧及び／又は正接（溢−）流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｅ
Ｕｅｂｅｒ−ｆｌｕｓｓ）を変えることを意図してい
る。
【００３２】分別沈殿工程では、有利に種々の試薬を使
用し、及び／又は沈殿を種々の温度で行い、及び／又は
ｐＨー値を変え、及び／又は沈殿すべきポリマーのヘモ
グロビンに対する種々異なる溶剤を使用し、及び／又は
反応時間を変え、及び／又は種々異なるる飽和沈殿剤を
使用することができる。
用し、及び／又は沈殿を種々の温度で行い、及び／又は
ｐＨー値を変え、及び／又は沈殿すべきポリマーのヘモ
グロビンに対する種々異なる溶剤を使用し、及び／又は
反応時間を変え、及び／又は種々異なるる飽和沈殿剤を
使用することができる。
【００３３】有利な１実施形では、クロマトグラフィ工
程で、種々のクロマトグラフィ法、殊に、イオン交換−
及びゲル濾過クロマトグラフィを組み合わせて、又は連
続的に使用し、及び／又はｐＨ値を変え、及び／又は展
開剤の組成を種々に選択し、及び／又はクロマトグラフ
ィ条件、殊に流量及び負荷量（Ｂｅｌａｓｔｕｎｇ）を
変え、及び／又は種々のクロマトグラフィ材料を使用す
る。
程で、種々のクロマトグラフィ法、殊に、イオン交換−
及びゲル濾過クロマトグラフィを組み合わせて、又は連
続的に使用し、及び／又はｐＨ値を変え、及び／又は展
開剤の組成を種々に選択し、及び／又はクロマトグラフ
ィ条件、殊に流量及び負荷量（Ｂｅｌａｓｔｕｎｇ）を
変え、及び／又は種々のクロマトグラフィ材料を使用す
る。
【００３４】部分的溶解工程では、溶解時間を変更し、
及び／又は少なくとも一回の洗浄を行い、及び／又は溶
解するポリマーを安定化剤（これはポリマーの、殊に酸
化による分解を阻止する）で処理し、及び／又は溶解条
件、殊に、温度及び／又は溶剤の量を変え、及び／又は
溶剤の組成を変えることが有利の意図されている。
及び／又は少なくとも一回の洗浄を行い、及び／又は溶
解するポリマーを安定化剤（これはポリマーの、殊に酸
化による分解を阻止する）で処理し、及び／又は溶解条
件、殊に、温度及び／又は溶剤の量を変え、及び／又は
溶剤の組成を変えることが有利の意図されている。
【００３５】種々のパラメータを変えることにより、前
記の方法を、その都度に存在する分離すべきヘモグロビ
ン−超ポリマー−混合物の種類（種々異なる架橋剤及び
／又は種々異なるヘモグロビン、例えば、牛−、豚−、
人−ヘモグロビン）に適合させ、こうして、非常に狭い
範囲内の一つの分子量を有するヘモグロビンに関する有
利に高い分離効果を得ることができる。
記の方法を、その都度に存在する分離すべきヘモグロビ
ン−超ポリマー−混合物の種類（種々異なる架橋剤及び
／又は種々異なるヘモグロビン、例えば、牛−、豚−、
人−ヘモグロビン）に適合させ、こうして、非常に狭い
範囲内の一つの分子量を有するヘモグロビンに関する有
利に高い分離効果を得ることができる。
【００３６】種々の分離法の相互の組合せは、−種々の
超高分子ヘモグロビンの異なる安定性を考慮しても−そ
の分子量が高度に単一性を有するヘモグロビン−超ポリ
マーの製造を可能とする。
超高分子ヘモグロビンの異なる安定性を考慮しても−そ
の分子量が高度に単一性を有するヘモグロビン−超ポリ
マーの製造を可能とする。
【００３７】
【実施例】次の実施例につき、本発明を詳述する例１（限外濾過） 人ヘモグロビンを、公知処方（Ｐｏｅｔｚｓｃｈｋｅ、
Ｂａｒｎｉｋｏｌ、Ｂｉｏｍａｔｅｒ、Ａｒｔ Ｃｅｌ
ｌｓ ａｎｄ Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．２０
（１９９２）２８７ー２９１）により、グルタールジア
ルデヒドを用いて、架橋させて超ポリマーにした。この
超ポリマーの約２０％溶液を電解質溶液ＢＩＫＵ（Ｎａ
Ｃｌ １２５；ＫＣｌ ４．５；ＮａＨＣＯ3 ２０
（ミリモル／ｌ）： ＮａＮ3 ０．２ｇ／ｌ）中で限
外濾過した。この際、通常分離限界１０6ｇ／モルのフ
ィルターを使用した。この濾過工程は、当初溶液の約２
０倍の液体量を用いて行った。
Ｂａｒｎｉｋｏｌ、Ｂｉｏｍａｔｅｒ、Ａｒｔ Ｃｅｌ
ｌｓ ａｎｄ Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．２０
（１９９２）２８７ー２９１）により、グルタールジア
ルデヒドを用いて、架橋させて超ポリマーにした。この
超ポリマーの約２０％溶液を電解質溶液ＢＩＫＵ（Ｎａ
Ｃｌ １２５；ＫＣｌ ４．５；ＮａＨＣＯ3 ２０
（ミリモル／ｌ）： ＮａＮ3 ０．２ｇ／ｌ）中で限
外濾過した。この際、通常分離限界１０6ｇ／モルのフ
ィルターを使用した。この濾過工程は、当初溶液の約２
０倍の液体量を用いて行った。
【００３８】セファクリルＳ−４００Ｒ（Ｄｅｕｔｓｃ
ｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｄ）を
用いて、超高分子ヘモグロビンをその高分子性に関して
分析することができる。濾過されなかった生成物の限界
分子量は、６５０００（下限）及び１５×１０6ｇ／モ
ル （上限）であり、この限外濾過の後の、保留物のそ
れは、５０００００もしくは１５×１０6ｇ／モルであ
った。この限外濾過を用いて、その成分が広い分子量範
囲をカバーする粗製ポリマーから低分子量分を除去し、
これにより、このポリマーのコロイド浸透圧を決定的に
低下させることが成功する。
ｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｄ）を
用いて、超高分子ヘモグロビンをその高分子性に関して
分析することができる。濾過されなかった生成物の限界
分子量は、６５０００（下限）及び１５×１０6ｇ／モ
ル （上限）であり、この限外濾過の後の、保留物のそ
れは、５０００００もしくは１５×１０6ｇ／モルであ
った。この限外濾過を用いて、その成分が広い分子量範
囲をカバーする粗製ポリマーから低分子量分を除去し、
これにより、このポリマーのコロイド浸透圧を決定的に
低下させることが成功する。
【００３９】例２（分別沈殿） 牛ヘモグロビンを２官能性架橋剤２，５−ジイソチオシ
アネートベンゼンスルホネート（ＤＩＢＳ）を用いて、
公知方法（Ｗ．Ｋ．Ｒ．Ｂａｒｎｉｋｏｌ、Ａｄｖ．Ｅ
ｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９９３、印刷物中）で重合
させて、非常に広い分子量分布を有する超ポリマーにし
た。
アネートベンゼンスルホネート（ＤＩＢＳ）を用いて、
公知方法（Ｗ．Ｋ．Ｒ．Ｂａｒｎｉｋｏｌ、Ａｄｖ．Ｅ
ｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９９３、印刷物中）で重合
させて、非常に広い分子量分布を有する超ポリマーにし
た。
【００４０】沈殿のために４−モルの（飽和）硫酸アン
モニウム−溶液を製造し、そのｐＨ値を２５％アンモニ
ア溶液でｐＨ＝７．３に調節した。前記ヘモグロビン−
超ポリマーの３．５％溶液０．８ｍｌ及び４−モル硫酸
アンモニウム溶液０．５ｍｌを混合し、室温で４．５時
間放置した。次いで、強く遠心し、上澄みをピペット除
去した。
モニウム−溶液を製造し、そのｐＨ値を２５％アンモニ
ア溶液でｐＨ＝７．３に調節した。前記ヘモグロビン−
超ポリマーの３．５％溶液０．８ｍｌ及び４−モル硫酸
アンモニウム溶液０．５ｍｌを混合し、室温で４．５時
間放置した。次いで、強く遠心し、上澄みをピペット除
去した。
【００４１】セファクリルＳ−４００ＨＲでの比較ゲル
クロマトグラフィは、未分別試料で、６５０００の下限
分子量及び１５×１０6ｇ／モルの上限を示した。これ
に反して、上澄み中の試料では、６５０００もしくは９
４００００ｇ／モルの値が認められた。従って、この沈
殿法では、広い分子量範囲のヘモグロビン−超ポリマー
から高分子量分を除去することが成功した。
クロマトグラフィは、未分別試料で、６５０００の下限
分子量及び１５×１０6ｇ／モルの上限を示した。これ
に反して、上澄み中の試料では、６５０００もしくは９
４００００ｇ／モルの値が認められた。従って、この沈
殿法では、広い分子量範囲のヘモグロビン−超ポリマー
から高分子量分を除去することが成功した。
【００４２】例３（クロマトグラフィ） 出発物質は、例２により製造されたＤＩＢＳ−ポリマー
である。
である。
【００４３】調製用分別（ｐｒａｅｐａｒａｔｉｖｅ
Ｆｒａｋｔｉｏｎｉｅｒｕｎｇ）は、セファクリルＳ−
４００ＨＲ、展開剤ＨｅＮａ（ＮａＣｌ １４４ｍモル
／ｌ；ＨＥＰＥＳ−緩衝液１０ｍモル／ｌ、ＮａＮ3
０．２ｇ／ｌ）、カラム：直径２．６ｃｍ、充填容量５
１０ｍｌ，流量２７ｍｌ／ｌで行った。２．５％超ポリ
マーヘモグロビン溶液１０ｍｌを装入し、フラクシヨン
をゲルクロマトグラフィで、例２におけるように分析し
た。
Ｆｒａｋｔｉｏｎｉｅｒｕｎｇ）は、セファクリルＳ−
４００ＨＲ、展開剤ＨｅＮａ（ＮａＣｌ １４４ｍモル
／ｌ；ＨＥＰＥＳ−緩衝液１０ｍモル／ｌ、ＮａＮ3
０．２ｇ／ｌ）、カラム：直径２．６ｃｍ、充填容量５
１０ｍｌ，流量２７ｍｌ／ｌで行った。２．５％超ポリ
マーヘモグロビン溶液１０ｍｌを装入し、フラクシヨン
をゲルクロマトグラフィで、例２におけるように分析し
た。
【００４４】出発試料の分子量の範囲は、６５０００と
１５×１０6ｇ／モルとの間、得られたそれぞれのフラ
クシヨンのそれは、例えば、２１５０００と１．０５×
１０6ｇ／モルとの間、並びに６５０００と０．３２×
１０6ｇ／モル との間であった。この例は、種々の分子
量のクロマトグラフィ的に単一の超高分子ヘモグロビン
を得ることができたことを示している。
１５×１０6ｇ／モルとの間、得られたそれぞれのフラ
クシヨンのそれは、例えば、２１５０００と１．０５×
１０6ｇ／モルとの間、並びに６５０００と０．３２×
１０6ｇ／モル との間であった。この例は、種々の分子
量のクロマトグラフィ的に単一の超高分子ヘモグロビン
を得ることができたことを示している。
【００４５】例４（部分的溶解） 人ヘモグロビンを、例１に記載のようにグルタールジア
ルデヒドで架橋させた。試料を分けた後に、（ａ）２４
時間の沈殿物の溶解及び（ｂ）３０分のみの溶解を行っ
た。双方の場合に、上澄みを取得し、例１の記載のよう
に、ゲルクロマトグラフィで分析した。
ルデヒドで架橋させた。試料を分けた後に、（ａ）２４
時間の沈殿物の溶解及び（ｂ）３０分のみの溶解を行っ
た。双方の場合に、上澄みを取得し、例１の記載のよう
に、ゲルクロマトグラフィで分析した。
【００４６】（ａ）の場合には、分子量は、６５０００
から約１５×１０6ｇ／モルに渡り、（ｂ）の場合に
は、６５０００から３．６×１０６ｇ／モルであった。
から約１５×１０6ｇ／モルに渡り、（ｂ）の場合に
は、６５０００から３．６×１０６ｇ／モルであった。
【００４７】この例は、この溶解の時間により、特に、
低分子量のヘモグロビン−超ポリマーが得られる可能性
を示している。
低分子量のヘモグロビン−超ポリマーが得られる可能性
を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/34 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/805 14/805 Ａ６１Ｋ 37/14 ＡＢＺ
Claims (5)
- 【請求項１】 分子単一性の超高分子ヘモグロビンを製
造する場合に、種々異なる分子量の超高分子ヘモグロビ
ンの公知溶液に、少なくとも一つの限外濾過工程及び／
又は少なくとも一つの分別沈殿工程及び／又は少なくと
も一つのクロマトグラフィ工程及び／又は少なくとも一
つの部分的溶解工程を施すことを特徴とする、分子単一
性の超高分子ヘモグロビンの製法。 - 【請求項２】 限外濾過工程で、種々のタイプのフィル
ターを用い、及び／又は多数回濾過を行い、及び／又は
ｐＨ値を変え、及び／又は種々の濃度で限外濾過を行
い、及び／又は溶剤の組成を変え、及び／又は温度を変
え、及び／又は膜浸透圧及び／又は正接（溢−）流を変
える、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 分別沈殿工程で、種々の試薬を使用し、
及び／又はこの沈殿を種々の温度で行い、及び／又はｐ
Ｈ値を変え、及び／又は沈殿すべき高分子ヘモグロビン
に対する種々異なる溶剤を使用し、及び／又は反応時間
を変え、及び／又は種々異なる飽和沈殿剤を使用する、
請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 クロマトグラフィ工程で、種々のクロマ
トグラフィ法、殊に、イオン交換−及びゲル濾過クロマ
トグラフィを組み合わせるか又は連続して使用し、及び
／又はｐＨ値を変え、及び／又は溶離液の組成を変え、
及び／又はクロマトグラフィ条件、殊に、流量及び負荷
量を変え、及び／又は種々のクロマトグラフィ材料を使
用する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 部分的溶解工程で、溶解時間を変え、及
び／又は少なくとの１回の洗浄を実施し、及び／又は溶
解するポリマーを、殊に、酸化によるポリマーの分解を
阻止する安定化剤で処理し、及び／又は溶解条件、殊
に、溶剤の温度及び／又は量を変え、及び／又は溶剤の
組成を変える、請求項１から４のいずれかに記載の方
法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4418973A DE4418973A1 (de) | 1994-05-31 | 1994-05-31 | Verfahren zur Herstellung molekular-einheitlicher hyperpolymerer Hämoglobine |
| EP95107280A EP0685492B1 (de) | 1994-05-31 | 1995-05-13 | Verfahren zur Herstellung molekulareinheitlicher hyperpolymerer Hämoglobine |
| AT95107280T ATE209217T1 (de) | 1994-05-31 | 1995-05-13 | Verfahren zur herstellung molekulareinheitlicher hyperpolymerer hämoglobine |
| EP01101484A EP1097943A1 (de) | 1994-05-31 | 1995-05-13 | Verfahren zum Herstellung molekular - einheitlicher hyperpolymer Hämoglobine |
| DK95107280T DK0685492T3 (da) | 1994-05-31 | 1995-05-13 | Fremgangsmåde til fremstilling af molekylært ensartede hyperpolymere hæmoglobiner |
| ES95107280T ES2168319T3 (es) | 1994-05-31 | 1995-05-13 | Procedimiento para la fabricacion de hemoglobinas hiperpolimericas molecularmente uniformes. |
| DE59509857T DE59509857D1 (de) | 1994-05-31 | 1995-05-13 | Verfahren zur Herstellung molekulareinheitlicher hyperpolymerer Hämoglobine |
| JP7159664A JPH0912472A (ja) | 1994-05-31 | 1995-06-26 | 分子単一性の超高分子ヘモグロビンの製法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4418973A DE4418973A1 (de) | 1994-05-31 | 1994-05-31 | Verfahren zur Herstellung molekular-einheitlicher hyperpolymerer Hämoglobine |
| JP7159664A JPH0912472A (ja) | 1994-05-31 | 1995-06-26 | 分子単一性の超高分子ヘモグロビンの製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0912472A true JPH0912472A (ja) | 1997-01-14 |
Family
ID=25937042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7159664A Pending JPH0912472A (ja) | 1994-05-31 | 1995-06-26 | 分子単一性の超高分子ヘモグロビンの製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1097943A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0912472A (ja) |
| AT (1) | ATE209217T1 (ja) |
| DE (2) | DE4418973A1 (ja) |
| DK (1) | DK0685492T3 (ja) |
| ES (1) | ES2168319T3 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0854151A1 (de) | 1997-01-20 | 1998-07-22 | SanguiBioTech AG | Verfahren zur Gewinnung einheitlicher Fraktionen hyperpolymerer Hämoglobine |
| US5994509A (en) * | 1998-04-08 | 1999-11-30 | Sanguibiotech Ag | Method for obtaining uniform fractions of hyperpolymeric hemoglobins |
| DE10031744A1 (de) | 2000-06-29 | 2002-01-17 | Sanguibio Tech Ag | Mit Blutplasma verträgliche, vernetzte und mit Polyalkylenoxiden konjugierte Säugetierhämoglobine als künstliche medizinische Sauerstoffträger, ihre Herstellung und ihre Verwendung |
| DE10352692A1 (de) | 2003-11-12 | 2005-06-23 | Sanguibiotech Gmbh | Verwendung hypo-onkotischer Lösungen in das Blut addierbarer, hyperpolymerer Hämoglobine zur Behandlung eines Lungenödems |
| EP2614833A1 (en) | 2012-01-13 | 2013-07-17 | SastoMed GmbH | Scarring reducing wound treatment |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3925344A (en) * | 1973-04-11 | 1975-12-09 | Community Blood Council | Plasma protein substitute |
| DE2714252C2 (de) * | 1977-03-31 | 1983-08-18 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparates mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten |
| DE3144705C2 (de) * | 1981-11-11 | 1983-12-08 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen, vernetzten Hämoglobinpräparates mit hoher Sauerstoff-Transportkapazität, sowie das nach diesem Verfahren hergestellte Hämoglobinpräparat |
| DE3320752A1 (de) * | 1983-06-09 | 1984-12-13 | Wolfgang Prof. Dr.Dr. 6500 Mainz Barnikol | Lumineszierende schichten zur verwendung in vorrichtungen zur bestimmung der sauerstoffkonzentration in gasen und dergleichen durch messung der lumineszensverringerung |
| US4826811A (en) * | 1986-06-20 | 1989-05-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| EP0277289B8 (en) * | 1986-11-10 | 2003-05-21 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| DE3714351A1 (de) * | 1987-04-29 | 1988-11-17 | Barnikol Wolfgang | Verfahren zur modifikation, insbesondere zur polymerisation von haemoglobin in vitro |
| DE3841105C2 (de) * | 1988-12-07 | 1994-09-01 | Wolfgang Karl Richard Barnikol | Verfahren zur Aufreinigung und Modifikation von polymerisiertem Hämoglobin |
| NL8901174A (nl) * | 1989-05-10 | 1990-12-03 | Het Hoofd Van De Afdeling Mili | Hemoglobine-preparaat en gebruik daarvan. |
| SK54993A3 (en) * | 1990-11-29 | 1993-10-06 | Upjohn Co | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions |
| US5250665A (en) * | 1991-05-31 | 1993-10-05 | The University Of Toronto Innovations Foundation | Specifically β-β cross-linked hemoglobins and method of preparation |
-
1994
- 1994-05-31 DE DE4418973A patent/DE4418973A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-05-13 AT AT95107280T patent/ATE209217T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-05-13 DE DE59509857T patent/DE59509857D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-05-13 ES ES95107280T patent/ES2168319T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-13 DK DK95107280T patent/DK0685492T3/da active
- 1995-05-13 EP EP01101484A patent/EP1097943A1/de not_active Withdrawn
- 1995-05-13 EP EP95107280A patent/EP0685492B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-26 JP JP7159664A patent/JPH0912472A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DK0685492T3 (da) | 2002-05-21 |
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| DE4418973A1 (de) | 1995-12-14 |
| EP0685492A2 (de) | 1995-12-06 |
| ATE209217T1 (de) | 2001-12-15 |
| ES2168319T3 (es) | 2002-06-16 |
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