JPH0912460A - 抗人免疫不全症ウイルス剤 - Google Patents
抗人免疫不全症ウイルス剤Info
- Publication number
- JPH0912460A JPH0912460A JP18627195A JP18627195A JPH0912460A JP H0912460 A JPH0912460 A JP H0912460A JP 18627195 A JP18627195 A JP 18627195A JP 18627195 A JP18627195 A JP 18627195A JP H0912460 A JPH0912460 A JP H0912460A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polysaccharide
- virus agent
- rhamnose
- glucose
- deficiency virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 構成糖が、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｌ−ラムノ
ースおよびＤ−グルコースの３種からなり、その構成モ
ル比が、Ｄ−ガラクツロン酸：Ｌ−ラムノース：Ｄ−グ
ルコース＝０．６〜１．０：０．８〜１．２：０．８〜
１．２である多糖類を成分とする抗人免疫不全症ウイル
ス剤。 【効果】 抗人免疫不全症ウイルス活性を有し、しか
も、血液抗凝固性を示さない、微生物生産酸性ヘテロ多
糖類を成分とした抗人免疫不全症ウイルス剤を提供す
る。
ースおよびＤ−グルコースの３種からなり、その構成モ
ル比が、Ｄ−ガラクツロン酸：Ｌ−ラムノース：Ｄ−グ
ルコース＝０．６〜１．０：０．８〜１．２：０．８〜
１．２である多糖類を成分とする抗人免疫不全症ウイル
ス剤。 【効果】 抗人免疫不全症ウイルス活性を有し、しか
も、血液抗凝固性を示さない、微生物生産酸性ヘテロ多
糖類を成分とした抗人免疫不全症ウイルス剤を提供す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物生産多糖類を有
効成分とする抗人免疫不全症ウイルス（以下「抗ＨＩ
Ｖ」と略称する。）剤に関する。
効成分とする抗人免疫不全症ウイルス（以下「抗ＨＩ
Ｖ」と略称する。）剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】デキストラン硫酸などの多糖類のエステ
ル化物が、抗ＨＩＶ剤として開発・検討されている（特
開昭６３−４５２２３号公報など）。デキストラン硫酸
は、抗ＨＩＶ活性を示すものの血液抗凝固性が高過ぎ、
副作用が強いといった問題を抱えている。
ル化物が、抗ＨＩＶ剤として開発・検討されている（特
開昭６３−４５２２３号公報など）。デキストラン硫酸
は、抗ＨＩＶ活性を示すものの血液抗凝固性が高過ぎ、
副作用が強いといった問題を抱えている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、微生物が生
産する多糖類を有効成分とした、血液抗凝固性を有しな
い抗ＨＩＶ剤を提供する。
産する多糖類を有効成分とした、血液抗凝固性を有しな
い抗ＨＩＶ剤を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
した結果、アゾトバクター属細菌が生産する多糖類が、
優れた抗ＨＩＶ活性を有し、かつ、血液抗凝固性を示さ
ないことを見いだし、本発明に到達したものである。す
なわち本発明は、構成糖が、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｌ−
ラムノースおよびＤ−グルコースの３種からなり、その
構成モル比が、Ｄ−ガラクツロン酸：Ｌ−ラムノース：
Ｄ−グルコース＝０．６〜１．０：０．８〜１．２：
０．８〜１．２である多糖類を有効成分とすることを特
徴とする抗ＨＩＶ剤である。
した結果、アゾトバクター属細菌が生産する多糖類が、
優れた抗ＨＩＶ活性を有し、かつ、血液抗凝固性を示さ
ないことを見いだし、本発明に到達したものである。す
なわち本発明は、構成糖が、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｌ−
ラムノースおよびＤ−グルコースの３種からなり、その
構成モル比が、Ｄ−ガラクツロン酸：Ｌ−ラムノース：
Ｄ−グルコース＝０．６〜１．０：０．８〜１．２：
０．８〜１．２である多糖類を有効成分とすることを特
徴とする抗ＨＩＶ剤である。
【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
抗ＨＩＶ剤に使用される多糖類は、上述の特徴の他に、
以下のような特性を有しているのが好ましい。 分子量：ゲルろ過クロマトグラフイーにて測定した分子
量が、約１×１０3 〜１０×１０6 である。 結合様式：各構成糖の結合様式が、実質的に１，３結合
である。 結合配置：Ｄ−ガラクツロン酸の結合配置がα、Ｌ−ラ
ムノースの結合配置がβ、Ｄ−グルコースの結合配置が
αである。 Ｏ−アセチル基含有量：各構成糖の一部の水酸基がＯ−
アセチル基で置換されており、その数は、平均して通常
構成糖１残基に対して１以下である。
抗ＨＩＶ剤に使用される多糖類は、上述の特徴の他に、
以下のような特性を有しているのが好ましい。 分子量：ゲルろ過クロマトグラフイーにて測定した分子
量が、約１×１０3 〜１０×１０6 である。 結合様式：各構成糖の結合様式が、実質的に１，３結合
である。 結合配置：Ｄ−ガラクツロン酸の結合配置がα、Ｌ−ラ
ムノースの結合配置がβ、Ｄ−グルコースの結合配置が
αである。 Ｏ−アセチル基含有量：各構成糖の一部の水酸基がＯ−
アセチル基で置換されており、その数は、平均して通常
構成糖１残基に対して１以下である。
【０００６】また、更に上記多糖類は、以下の物性を有
している。 性状：白色繊維状（凍結乾燥物）。 溶解性：水、希酸、希アルカリ、ＤＭＳＯ（ジメチルス
ルホキシド）に対して可溶、メタノール、エタノール、
アセトンに対しては不溶。 紫外吸収スペクトル：蛋白質（ペプチド）に特有な２８
０ｎｍ、および核酸に特有な２６０ｎｍに、吸収が認め
られない。 赤外吸収スペクトル：３４００ｃｍ-1付近、１６２０ｃ
ｍ-1付近、１１１０ｃｍ-1付近、１２５０ｃｍ-1付近、
２９５０ｃｍ-1付近のそれぞれに赤外吸収のピークが認
められる。 呈色反応：フェノール硫酸法に陽性、ｍ−フェニルフェ
ノール法に陽性、エルソン−モルガン法に陰性。
している。 性状：白色繊維状（凍結乾燥物）。 溶解性：水、希酸、希アルカリ、ＤＭＳＯ（ジメチルス
ルホキシド）に対して可溶、メタノール、エタノール、
アセトンに対しては不溶。 紫外吸収スペクトル：蛋白質（ペプチド）に特有な２８
０ｎｍ、および核酸に特有な２６０ｎｍに、吸収が認め
られない。 赤外吸収スペクトル：３４００ｃｍ-1付近、１６２０ｃ
ｍ-1付近、１１１０ｃｍ-1付近、１２５０ｃｍ-1付近、
２９５０ｃｍ-1付近のそれぞれに赤外吸収のピークが認
められる。 呈色反応：フェノール硫酸法に陽性、ｍ−フェニルフェ
ノール法に陽性、エルソン−モルガン法に陰性。
【０００７】なお、本発明の抗ＨＩＶ剤に使用される多
糖類の分子量や構成糖、結合様式、結合配置は、液体ク
ロマトグラフィー分析や酸加水分解後のクロマトグラフ
ィー分析、メチル化分析、スミス分解や比旋光度の測定
などにより特定が可能である。
糖類の分子量や構成糖、結合様式、結合配置は、液体ク
ロマトグラフィー分析や酸加水分解後のクロマトグラフ
ィー分析、メチル化分析、スミス分解や比旋光度の測定
などにより特定が可能である。
【０００８】上記多糖類の特定方法の具体例を、一例と
して下記に示す。 分子量の測定：旭化成社製「Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦＡ
−７ＭＦ」をカラムとするＧＰＣモードの高速液体クロ
マトグラフィーを使用し、０．１Ｍ硝酸ナトリウム水溶
液を移動相とし、分子量既知のプルランを標準サンプル
として作成した分子量−保持時間標準曲線を使用して測
定する。 構成糖及びその構成比：上記多糖類およびガラクツロン
酸残基のカルボキシル基を還元した多糖類について、２
Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用し、１００℃、６
時間の条件下に酸加水分解を行った後、アルジトールア
セテートに誘導する。得られた各誘導体について、ＥＣ
ＮＳＳ−Ｍコートカラム（和光純薬社製、「Ｇａｓｃｈ
ｒｏｍ Ｑ」）を使用してガスクロマトグラフィー分析
を行った結果、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコースおよ
びＬ−ラムノースによって得られる化合物と同一の化合
物が検出され、ガラクツロン酸残基のカルボキシル基を
還元した多糖類とそうでない多糖類に結果の比較から、
本発明で使用する多糖類の構成糖は、Ｄ−ガラクツロン
酸、Ｄ−グルコースおよびＬ−ラムノースであると判定
でき、その構成モル比も決定することができる。
して下記に示す。 分子量の測定：旭化成社製「Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦＡ
−７ＭＦ」をカラムとするＧＰＣモードの高速液体クロ
マトグラフィーを使用し、０．１Ｍ硝酸ナトリウム水溶
液を移動相とし、分子量既知のプルランを標準サンプル
として作成した分子量−保持時間標準曲線を使用して測
定する。 構成糖及びその構成比：上記多糖類およびガラクツロン
酸残基のカルボキシル基を還元した多糖類について、２
Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用し、１００℃、６
時間の条件下に酸加水分解を行った後、アルジトールア
セテートに誘導する。得られた各誘導体について、ＥＣ
ＮＳＳ−Ｍコートカラム（和光純薬社製、「Ｇａｓｃｈ
ｒｏｍ Ｑ」）を使用してガスクロマトグラフィー分析
を行った結果、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコースおよ
びＬ−ラムノースによって得られる化合物と同一の化合
物が検出され、ガラクツロン酸残基のカルボキシル基を
還元した多糖類とそうでない多糖類に結果の比較から、
本発明で使用する多糖類の構成糖は、Ｄ−ガラクツロン
酸、Ｄ−グルコースおよびＬ−ラムノースであると判定
でき、その構成モル比も決定することができる。
【０００９】次に、本発明の抗ＨＩＶ剤に使用される多
糖類の製造方法について説明する。通常、上記多糖類
は、特開平７−９０００３号公報記載のアゾトバクター
・ベイジェリンキィーＴＮＭ１株（通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所において、受託番号「ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４１９４」として、平成５年２月１８日から
国際寄託され保管されている。）またはその変異株によ
る微生物培養により、その培養物から採取される。上記
変異株は、紫外線、Ｘ線等の放射線、または、エチルメ
タンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）等の化学的突然
変異誘発物質の様な公知の突然変異誘発手段により発生
させることができる。
糖類の製造方法について説明する。通常、上記多糖類
は、特開平７−９０００３号公報記載のアゾトバクター
・ベイジェリンキィーＴＮＭ１株（通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所において、受託番号「ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４１９４」として、平成５年２月１８日から
国際寄託され保管されている。）またはその変異株によ
る微生物培養により、その培養物から採取される。上記
変異株は、紫外線、Ｘ線等の放射線、または、エチルメ
タンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）等の化学的突然
変異誘発物質の様な公知の突然変異誘発手段により発生
させることができる。
【００１０】上記菌株を用いた微生物培養について、さ
らに詳細に説明する。本発明で用いる多糖類を産生する
微生物を培養するための培地としては、アゾトバクター
（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が生育で
き、上記多糖類を生産する炭素源、窒素源、無機塩類及
び微量栄養源を適量含有するものであれば特に制限され
ない。炭素源としては、グルコース、ラクトース、マル
トース、キシロース、マンニット、サッカロース、ラム
ノース、アラビノース、トレハロース、ラフィノースな
どが使用される。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウ
ム塩、尿素などの合成化合物、ポリペプトン、コーンス
ティープリカー、酵母エキス、肉エキス、脱脂大豆抽出
物、ペプチド、アミノ酸などの天然有機物が使用され
る。無機塩類としては、リン酸塩、カリウム塩、硫酸
塩、マグネシウム塩などが使用される。微量栄養源とし
ては、酵母エキス、各種ビタミン類などが使用される。
またさらに、培地には、必要に応じ、鉄塩、カルシウム
塩、マンガン塩などを添加することができる。
らに詳細に説明する。本発明で用いる多糖類を産生する
微生物を培養するための培地としては、アゾトバクター
（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が生育で
き、上記多糖類を生産する炭素源、窒素源、無機塩類及
び微量栄養源を適量含有するものであれば特に制限され
ない。炭素源としては、グルコース、ラクトース、マル
トース、キシロース、マンニット、サッカロース、ラム
ノース、アラビノース、トレハロース、ラフィノースな
どが使用される。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウ
ム塩、尿素などの合成化合物、ポリペプトン、コーンス
ティープリカー、酵母エキス、肉エキス、脱脂大豆抽出
物、ペプチド、アミノ酸などの天然有機物が使用され
る。無機塩類としては、リン酸塩、カリウム塩、硫酸
塩、マグネシウム塩などが使用される。微量栄養源とし
ては、酵母エキス、各種ビタミン類などが使用される。
またさらに、培地には、必要に応じ、鉄塩、カルシウム
塩、マンガン塩などを添加することができる。
【００１１】培地の状態は、固体でも液体でも構わな
い。液体培地を使用する場合には、静置培養でもよい
が、振盪培養、通気撹拌培養の方がより高収量に多糖類
を得ることができる。培養時のｐＨは、微生物が生育で
きて、本発明で用いる多糖類を生産し得るｐＨ、であれ
ば特に制限されないが、通常は４〜８のｐＨが適切であ
る。培養温度についても特に制限されないが、通常は２
０〜３５℃が適切である。培養時間は、本発明で用いる
多糖類の生産量が最大に達する期間が選ばれるが、通常
は１〜７日が適切である。
い。液体培地を使用する場合には、静置培養でもよい
が、振盪培養、通気撹拌培養の方がより高収量に多糖類
を得ることができる。培養時のｐＨは、微生物が生育で
きて、本発明で用いる多糖類を生産し得るｐＨ、であれ
ば特に制限されないが、通常は４〜８のｐＨが適切であ
る。培養温度についても特に制限されないが、通常は２
０〜３５℃が適切である。培養時間は、本発明で用いる
多糖類の生産量が最大に達する期間が選ばれるが、通常
は１〜７日が適切である。
【００１２】上記の培養方法で得られた培養物から、多
糖類を採取する方法としては、従来公知の方法を採用す
ることができる。たとえば、まず、遠心分離やろ過など
により、培養物から菌体を除去した後、得られた培養液
にメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセト
ンなどの有機溶媒を加えて沈殿を生じさせる。次いで、
沈殿物を水に溶解させた後、水に対して透析を行ない、
通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、減圧乾
燥、凍結乾燥などの方法により、透析内液を乾燥して多
糖類を回収する。上記の採取方法の他に、多糖類以外の
成分を、限外ろ過により培養液から除去し、得られた濃
縮液を上述の乾燥工程に供する方法を採用してもよい。
さらに、必要に応じ、通常の多糖類の精製法に従って精
製することにより、高純度精製品を得ることもできる。
精製法としては、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティ
ーなどの各種のカラムクロマトグラフィー、４級アンモ
ニウム塩による沈殿や塩析、有機溶媒による沈殿などが
採用される。
糖類を採取する方法としては、従来公知の方法を採用す
ることができる。たとえば、まず、遠心分離やろ過など
により、培養物から菌体を除去した後、得られた培養液
にメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセト
ンなどの有機溶媒を加えて沈殿を生じさせる。次いで、
沈殿物を水に溶解させた後、水に対して透析を行ない、
通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、減圧乾
燥、凍結乾燥などの方法により、透析内液を乾燥して多
糖類を回収する。上記の採取方法の他に、多糖類以外の
成分を、限外ろ過により培養液から除去し、得られた濃
縮液を上述の乾燥工程に供する方法を採用してもよい。
さらに、必要に応じ、通常の多糖類の精製法に従って精
製することにより、高純度精製品を得ることもできる。
精製法としては、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティ
ーなどの各種のカラムクロマトグラフィー、４級アンモ
ニウム塩による沈殿や塩析、有機溶媒による沈殿などが
採用される。
【００１３】本発明で用いる多糖類の重合度は、製造時
の培地組成、採取法などの条件を調節することによって
変化させることができる。また、ＴＦＡ、ギ酸、塩酸な
どを使用しかつ条件を調節することにより、採取品や精
製品を加水分解することもできる。さらに、具体的な方
法として、加圧下での加温や、超音波処理などを行って
重合度を変化させても、好適な結果が得られる。したが
って、上記多糖類の分子量は、約１×１０3 〜１０×１
０6 の範囲で自由に設定することが可能である。
の培地組成、採取法などの条件を調節することによって
変化させることができる。また、ＴＦＡ、ギ酸、塩酸な
どを使用しかつ条件を調節することにより、採取品や精
製品を加水分解することもできる。さらに、具体的な方
法として、加圧下での加温や、超音波処理などを行って
重合度を変化させても、好適な結果が得られる。したが
って、上記多糖類の分子量は、約１×１０3 〜１０×１
０6 の範囲で自由に設定することが可能である。
【００１４】このようにして得られる、本発明で用いる
多糖類は、高い抗ＨＩＶ活性を有しており、しかも、血
液抗凝固性をもたない。なお、たとえば、デキストラン
硫酸、レンチナン硫酸、カードラン硫酸などのように、
本発明で用いる多糖類も硫酸エステル化を行なうことは
可能であるが、この場合、抗ＨＩＶ活性を有してはいて
も、血液抗凝固性が生じてしまうので、好ましくない。
また、ラットにおける経口急性毒性については、５ｇ／
ｋｇ投与しても死亡例がなく、体重増加も対照群と同じ
であり、しかも、外観や剖検上も全く異常が認められな
かったので、安全性が高いといえる。
多糖類は、高い抗ＨＩＶ活性を有しており、しかも、血
液抗凝固性をもたない。なお、たとえば、デキストラン
硫酸、レンチナン硫酸、カードラン硫酸などのように、
本発明で用いる多糖類も硫酸エステル化を行なうことは
可能であるが、この場合、抗ＨＩＶ活性を有してはいて
も、血液抗凝固性が生じてしまうので、好ましくない。
また、ラットにおける経口急性毒性については、５ｇ／
ｋｇ投与しても死亡例がなく、体重増加も対照群と同じ
であり、しかも、外観や剖検上も全く異常が認められな
かったので、安全性が高いといえる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明は、その要旨を越えない限り、以下の実
施例に限定されるものではない。
するが、本発明は、その要旨を越えない限り、以下の実
施例に限定されるものではない。
【００１６】多糖類の製造例１ ５００ｍｌ容の坂口フラスコに表１に示す組成の培地を
１００ｍｌ入れ、１２１℃で２０分間湿熱滅菌後、表１
に示す組成の培地で試験管にて３日間液体振盪培養して
いたアゾトバクター・ベイジェリンキィー（Ａｚｏｔｏ
ｂａｃｔｅｒｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＴＮＭ１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１９４）を、一白金耳分植菌し、
振盪数毎分１１０ストローク、２８℃で１日間レシプロ
振盪培養を行った。
１００ｍｌ入れ、１２１℃で２０分間湿熱滅菌後、表１
に示す組成の培地で試験管にて３日間液体振盪培養して
いたアゾトバクター・ベイジェリンキィー（Ａｚｏｔｏ
ｂａｃｔｅｒｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＴＮＭ１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１９４）を、一白金耳分植菌し、
振盪数毎分１１０ストローク、２８℃で１日間レシプロ
振盪培養を行った。
【００１７】
【表１】 培地組成（重量％） スクロース ３ ％ 硝酸ナトリウム ０．３ ％ リン酸一水素カリウム ０．１５ ％ 硫酸マグネシウム・七水和物 ０．０５ ％ 硫酸鉄・七水和物 ０．００１ ％ 塩化カルシウム・二水和物 ０．１ ％ ｐＨ ６．５
【００１８】上記表１と同様の組成培地６リットルを入
れて前記と同様の滅菌を行った１０リットル容のジャー
ファーメンターに、上記で得られた培養液３００ｍｌを
接種し、温度２８℃、通気量６リットル／ｍｉｎの条件
下で、５Ｍ水酸化ナトリウムを用いて系中のｐＨを７に
保ちながら、７０時間通気撹拌培養を行った。なお、回
転数は、培養２４時間目までは４００ｒｐｍ、それ以降
７０時間までは７００ｒｐｍとした。
れて前記と同様の滅菌を行った１０リットル容のジャー
ファーメンターに、上記で得られた培養液３００ｍｌを
接種し、温度２８℃、通気量６リットル／ｍｉｎの条件
下で、５Ｍ水酸化ナトリウムを用いて系中のｐＨを７に
保ちながら、７０時間通気撹拌培養を行った。なお、回
転数は、培養２４時間目までは４００ｒｐｍ、それ以降
７０時間までは７００ｒｐｍとした。
【００１９】得られた培養物を水で１０倍に希釈し、９
０℃まで加温した後、遠心分離により菌体を除去した。
得られた培養上清分について、残留培地成分などの多糖
類以外の成分が除去されるまで、クロスフロー方式の限
外ろ過を繰り返した。限外ろ過には、東ソー社製、限外
ろ過システム「ＵＦ−ＬＭＳII」（分画分子量：３×１
０6 ）を使用した。限外ろ過膜を透過しなかった濃縮液
を凍結乾燥し、培地１リットル当たり、約１２ｇ（原料
スクロースに対し約４割の収率）の単一な多糖類を得
た。なお、多糖類の単一性の確認は、ＧＰＣモードの高
速液体クロマトグラフィーを使用して行った。
０℃まで加温した後、遠心分離により菌体を除去した。
得られた培養上清分について、残留培地成分などの多糖
類以外の成分が除去されるまで、クロスフロー方式の限
外ろ過を繰り返した。限外ろ過には、東ソー社製、限外
ろ過システム「ＵＦ−ＬＭＳII」（分画分子量：３×１
０6 ）を使用した。限外ろ過膜を透過しなかった濃縮液
を凍結乾燥し、培地１リットル当たり、約１２ｇ（原料
スクロースに対し約４割の収率）の単一な多糖類を得
た。なお、多糖類の単一性の確認は、ＧＰＣモードの高
速液体クロマトグラフィーを使用して行った。
【００２０】旭化成社製「Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦＡ−
７ＭＦ」をカラムを用い、０．１Ｍ硝酸ナトリウム水溶
液を移動相とした高速液体クロマトグラフィーを使用し
て、上記多糖類の分子量を測定した結果、多糖類のクロ
マトグラフのピークトップの保持時間は、分子量既知の
プルランを標準サンプルとして作成した分子量−保持時
間標準曲線において、分子量約２×１０6 に相当する値
を示した。
７ＭＦ」をカラムを用い、０．１Ｍ硝酸ナトリウム水溶
液を移動相とした高速液体クロマトグラフィーを使用し
て、上記多糖類の分子量を測定した結果、多糖類のクロ
マトグラフのピークトップの保持時間は、分子量既知の
プルランを標準サンプルとして作成した分子量−保持時
間標準曲線において、分子量約２×１０6 に相当する値
を示した。
【００２１】また、上記の多糖類について、各構成糖ま
で加水分解を行い、アルジトールアセテートに誘導した
後、ガスクロマトグラフィー分析を行った。予め作成し
た検量線と各構成糖のピーク面積から求めた構成糖のモ
ル比、ならびに、ｍ−フェニルフェノール法により求め
たガラクツロン酸含有量から、各構成糖のモル比は、Ｄ
−ガラクツロン酸：Ｌ−ラムノース：Ｄ−グルコ−ス＝
０．９：１：１であった。
で加水分解を行い、アルジトールアセテートに誘導した
後、ガスクロマトグラフィー分析を行った。予め作成し
た検量線と各構成糖のピーク面積から求めた構成糖のモ
ル比、ならびに、ｍ−フェニルフェノール法により求め
たガラクツロン酸含有量から、各構成糖のモル比は、Ｄ
−ガラクツロン酸：Ｌ−ラムノース：Ｄ−グルコ−ス＝
０．９：１：１であった。
【００２２】またさらに、多糖類の水酸基の修飾につい
て分析するため、０．０１Ｍ水酸化カリウムおよび０．
１３Ｍ塩化カリウムの水溶液中、室温で５時間の条件下
で、上記で得られた多糖類を脱アシル化処理した。処理
試料について、高速液体クロマトグラフィー分析を行っ
た結果、酢酸カリウム水溶液を分析した場合のピークと
同じ保持時間を有するピークが検出された。予め作成し
た検量線とそのピーク高さとから、多糖類のＯ−アセチ
ル基含有量を求めた結果、多糖類全体に対して約１０重
量％であった。なお、脱アシル化処理した多糖類の赤外
吸収スペクトルを測定した結果では、１７３０ｃｍ-1付
近のピークが消失していた。
て分析するため、０．０１Ｍ水酸化カリウムおよび０．
１３Ｍ塩化カリウムの水溶液中、室温で５時間の条件下
で、上記で得られた多糖類を脱アシル化処理した。処理
試料について、高速液体クロマトグラフィー分析を行っ
た結果、酢酸カリウム水溶液を分析した場合のピークと
同じ保持時間を有するピークが検出された。予め作成し
た検量線とそのピーク高さとから、多糖類のＯ−アセチ
ル基含有量を求めた結果、多糖類全体に対して約１０重
量％であった。なお、脱アシル化処理した多糖類の赤外
吸収スペクトルを測定した結果では、１７３０ｃｍ-1付
近のピークが消失していた。
【００２３】多糖類の製造例２ 製造例１で得られた多糖類を、０．０１Ｍ水酸化カリウ
ムおよび０．１３Ｍ塩化カリウムの水溶液中、室温で５
時間の条件下で、脱アセチル化処理した後、中和し、限
外ろ過による脱塩を行い、凍結乾燥して脱アセチル化し
た多糖類を得た。
ムおよび０．１３Ｍ塩化カリウムの水溶液中、室温で５
時間の条件下で、脱アセチル化処理した後、中和し、限
外ろ過による脱塩を行い、凍結乾燥して脱アセチル化し
た多糖類を得た。
【００２４】多糖類の製造例３ 製造例１と同様な操作を行なって得られた通気撹拌培養
後の培養物を、１０％硫酸を用いてまずｐＨ４．５に調
整し、１２１℃で６０分間の湿熱滅菌した後、遠心分離
により菌体を除去した。以下、製造例１と同様な処理を
行って、培地１リットル当たり、約１１ｇの単一な多糖
類を得た。ただし、限外ろ過には、東ソー社製、限外ろ
過システム「ＵＦ−ＬＭＳII」（分画分子量：１×１０
5 ）を使用した。得られた多糖類について、製造例１と
同様にして構成糖のモル比を求めた結果、Ｄ−ガラクツ
ロン酸：Ｌ−ラムノース：Ｄ−グルコース＝１：１：１
であった。また、分子量は５×１０5 であった。
後の培養物を、１０％硫酸を用いてまずｐＨ４．５に調
整し、１２１℃で６０分間の湿熱滅菌した後、遠心分離
により菌体を除去した。以下、製造例１と同様な処理を
行って、培地１リットル当たり、約１１ｇの単一な多糖
類を得た。ただし、限外ろ過には、東ソー社製、限外ろ
過システム「ＵＦ−ＬＭＳII」（分画分子量：１×１０
5 ）を使用した。得られた多糖類について、製造例１と
同様にして構成糖のモル比を求めた結果、Ｄ−ガラクツ
ロン酸：Ｌ−ラムノース：Ｄ−グルコース＝１：１：１
であった。また、分子量は５×１０5 であった。
【００２５】多糖類の製造例４ 製造例３で得られた多糖類を製造例２と同様に処理して
脱アセチル化した多糖類を得た。
脱アセチル化した多糖類を得た。
【００２６】実施例１ （抗ＨＩＶ活性の測定） 多糖類の抗ＨＩＶ活性を、ＭＴ−４細胞のＨＩＶ感染に
よる細胞障害性の抑制を指標としたマイクロプレート法
によって調べた。製造例１〜４で得た多糖類を、それぞ
れ濃度が２０００μｇ／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ
含有ＲＰＭＩ１６４０培地に溶解し、一試料当たり一枚
の丸底９６ウェルマイクロプレートを使用して、マイク
ロプレートの左端８ウェルに２００μｌずつ加えた。残
ウェルには１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を１
００μｌずつ入れておいた。８連ピペットを用いて左端
のウェルから１００μｌを取り、右隣のウェルに移して
よくかきまぜた。この操作を繰り返して、試料の２倍段
階希釈液（１００μｌ／ウェル１２段階）を調製した。
対数増殖期のＭＴ−４細胞，６００万個を、極少量の１
０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そこに
ＨＩＶ（ＨＴＬＶ−III ）を１００ＴＣＩＤ50／ｍｌと
なるように加え、３７℃で１時間吸着させた。吸着後、
１０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加
えて均一に懸濁させ、所定の濃度に調製された試料液が
入っている各ウェルに対し、１００μｌ／ウェルずつ添
加し、５％ＣＯ2 の存在下、３７℃で培養した。感染６
日目に、ＭＴ−４細胞の生細胞数を調べ、試料無添加に
おける非感染ＭＴ−４細胞の生細胞数、に対する比率を
計算して、生細胞率（％）を求めたところ、いずれの製
造例で得た多糖類を用いた場合においても、試料濃度が
３．４０６２５μｇ／ｍｌ以上であると、生細胞率は１
００％を示した。また、試料無添加の場合の非感染ＭＴ
−４細胞の生細胞と試料添加の場合の非感染ＭＴ−４細
胞の生細胞との間には、試料濃度に関係なく差は殆ど認
められなかった。
よる細胞障害性の抑制を指標としたマイクロプレート法
によって調べた。製造例１〜４で得た多糖類を、それぞ
れ濃度が２０００μｇ／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ
含有ＲＰＭＩ１６４０培地に溶解し、一試料当たり一枚
の丸底９６ウェルマイクロプレートを使用して、マイク
ロプレートの左端８ウェルに２００μｌずつ加えた。残
ウェルには１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を１
００μｌずつ入れておいた。８連ピペットを用いて左端
のウェルから１００μｌを取り、右隣のウェルに移して
よくかきまぜた。この操作を繰り返して、試料の２倍段
階希釈液（１００μｌ／ウェル１２段階）を調製した。
対数増殖期のＭＴ−４細胞，６００万個を、極少量の１
０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そこに
ＨＩＶ（ＨＴＬＶ−III ）を１００ＴＣＩＤ50／ｍｌと
なるように加え、３７℃で１時間吸着させた。吸着後、
１０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加
えて均一に懸濁させ、所定の濃度に調製された試料液が
入っている各ウェルに対し、１００μｌ／ウェルずつ添
加し、５％ＣＯ2 の存在下、３７℃で培養した。感染６
日目に、ＭＴ−４細胞の生細胞数を調べ、試料無添加に
おける非感染ＭＴ−４細胞の生細胞数、に対する比率を
計算して、生細胞率（％）を求めたところ、いずれの製
造例で得た多糖類を用いた場合においても、試料濃度が
３．４０６２５μｇ／ｍｌ以上であると、生細胞率は１
００％を示した。また、試料無添加の場合の非感染ＭＴ
−４細胞の生細胞と試料添加の場合の非感染ＭＴ−４細
胞の生細胞との間には、試料濃度に関係なく差は殆ど認
められなかった。
【００２７】実施例２ （血液抗凝固性の有無） 多糖類の血液抗凝固性を、活性化部分トロンボプラスチ
ン時間（ＡＰＴＴ）を測定することにより調べた。３．
８％クエン酸ナトリウム液０．５ｍｌに、正常人より採
血した血液４．５ｍｌを加えた。この液を、３，３００
ｒｐｍにて１０分間遠心を行って、血漿を採取した。採
取した血漿０．１ｍｌに、セライト浮遊液（セライト
０．７ｇを生理食塩水１００ｍｌに浮遊させたもの）
０．１ｍｌを加え、１分間振り混ぜた。これにケファリ
ン浮遊液０．１ｍｌを加え、３７℃で６分間静置した
後、０．０２５Ｍ塩化カルシウム液０．１ｍｌを吹き込
み、凝固するまでの時間を測定したところ、約４５秒で
あった。次に製造例１〜４で得た多糖類０．５ｍｇを含
む３．８％クエン酸ナトリウム液０．５ｍｌを用いて、
上記と同じ操作を行なったところ、いずれの多糖類を用
いた場合であっても凝固時間は４０〜５０秒であった
が、デキストラン硫酸ナトリウム（Ｓ含量：約１７％、
分子量：約３０，０００）を用いて上記と同じ処理を行
なったところ、その凝固時間は約２００秒であった。以
上の結果から明らかな通り、デキストラン硫酸ナトリウ
ムでは血液抗凝固性が認められたが、本発明で用いる多
糖類については、血液抗凝固性は認められなかった。
ン時間（ＡＰＴＴ）を測定することにより調べた。３．
８％クエン酸ナトリウム液０．５ｍｌに、正常人より採
血した血液４．５ｍｌを加えた。この液を、３，３００
ｒｐｍにて１０分間遠心を行って、血漿を採取した。採
取した血漿０．１ｍｌに、セライト浮遊液（セライト
０．７ｇを生理食塩水１００ｍｌに浮遊させたもの）
０．１ｍｌを加え、１分間振り混ぜた。これにケファリ
ン浮遊液０．１ｍｌを加え、３７℃で６分間静置した
後、０．０２５Ｍ塩化カルシウム液０．１ｍｌを吹き込
み、凝固するまでの時間を測定したところ、約４５秒で
あった。次に製造例１〜４で得た多糖類０．５ｍｇを含
む３．８％クエン酸ナトリウム液０．５ｍｌを用いて、
上記と同じ操作を行なったところ、いずれの多糖類を用
いた場合であっても凝固時間は４０〜５０秒であった
が、デキストラン硫酸ナトリウム（Ｓ含量：約１７％、
分子量：約３０，０００）を用いて上記と同じ処理を行
なったところ、その凝固時間は約２００秒であった。以
上の結果から明らかな通り、デキストラン硫酸ナトリウ
ムでは血液抗凝固性が認められたが、本発明で用いる多
糖類については、血液抗凝固性は認められなかった。
【００２８】
【発明の効果】以上説明した本発明によれば、微生物生
産多糖類を有効成分とする、高い抗ＨＩＶ活性を有し、
しかも、血液抗凝固性を示さない抗ＨＩＶ剤を提供する
ことができる。
産多糖類を有効成分とする、高い抗ＨＩＶ活性を有し、
しかも、血液抗凝固性を示さない抗ＨＩＶ剤を提供する
ことができる。
Claims (3)
- 【請求項１】 構成糖が、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｌ−ラ
ムノースおよびＤ−グルコースの３種からなり、その構
成モル比が、Ｄ−ガラクツロン酸：Ｌ−ラムノース：Ｄ
−グルコース＝０．６〜１．０：０．８〜１．２：０．
８〜１．２である多糖類を有効成分とすることを特徴と
する抗人免疫不全症ウイルス剤。 - 【請求項２】 多糖類の各構成糖の結合様式が実質的に
１、３結合（または１→３）であることを特徴とする請
求項１に記載の抗人免疫不全症ウイルス剤。 - 【請求項３】 ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて測
定した多糖類の分子量が、約１×１０3 〜１０×１０6
である請求項２記載の抗人免疫不全症ウイルス剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18627195A JPH0912460A (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 抗人免疫不全症ウイルス剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18627195A JPH0912460A (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 抗人免疫不全症ウイルス剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0912460A true JPH0912460A (ja) | 1997-01-14 |
Family
ID=16185379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18627195A Pending JPH0912460A (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 抗人免疫不全症ウイルス剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0912460A (ja) |
-
1995
- 1995-06-28 JP JP18627195A patent/JPH0912460A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2056878A1 (en) | N,o-sulphated heparosans, process for preparing them and pharmaceutical compositions containing them | |
| JPH07501684A (ja) | 抗凝固剤およびその調製方法 | |
| WO2001002597A1 (en) | Process for the preparation of the polysaccharides k4 and k5 from escherichia coli | |
| JPH11124401A (ja) | オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法 | |
| JPH0568580A (ja) | 高級キトサンオリゴ糖乃び高級キチンオリゴ糖の製造方法 | |
| JPH0912460A (ja) | 抗人免疫不全症ウイルス剤 | |
| Manzoni et al. | Extracellular K5 polysaccharide of Escherichia coli: production and characterization | |
| US5760213A (en) | Immunoactivating agent | |
| JP2002293803A (ja) | 抗ウイルス剤 | |
| JPH08333213A (ja) | 抗ウイルス・菌剤 | |
| Blaschek et al. | In vitro production of specific polysaccharides: isolation and structure of an antitumor active β-glucan from Phytophthora parasitica | |
| JPH04239501A (ja) | 酸性ヘテロ多糖類、硫酸化多糖類、およびその製法 | |
| JPH0919634A (ja) | 分散剤 | |
| JPH08333214A (ja) | 抗ウイルス・菌剤 | |
| JPS61219394A (ja) | 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 | |
| JPH0823992A (ja) | ヒアルロン酸の製造方法 | |
| JPH0994452A (ja) | 分散剤 | |
| JPH0443637B2 (ja) | ||
| JPH08301904A (ja) | 多糖類を有効成分とする保湿剤およびそれを含有する化粧料 | |
| JPH08333261A (ja) | 抗ウイルス・菌剤 | |
| JPH046356B2 (ja) | ||
| JPH08109364A (ja) | ゲル化剤 | |
| JP2001240509A (ja) | 植物病原性糸状菌防除剤 | |
| JPS58121798A (ja) | 多糖類ｍｐ−６７物質およびその製造法 | |
| JPH044868B2 (ja) |