JPH09103298A - ４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法 - Google Patents
４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法Info
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- JPH09103298A JPH09103298A JP29028195A JP29028195A JPH09103298A JP H09103298 A JPH09103298 A JP H09103298A JP 29028195 A JP29028195 A JP 29028195A JP 29028195 A JP29028195 A JP 29028195A JP H09103298 A JPH09103298 A JP H09103298A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ４−ハロゲノグルタミン酸の光学活性体、特
にそのＬ体を効率よく製造する。 【構成】 ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシ
エステル体を基質に用いることを特徴とする、アミノア
シラ−ゼによる酵素反応を利用する４−ハロゲノグルタ
ミン酸のラセミ分割方法。
にそのＬ体を効率よく製造する。 【構成】 ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシ
エステル体を基質に用いることを特徴とする、アミノア
シラ−ゼによる酵素反応を利用する４−ハロゲノグルタ
ミン酸のラセミ分割方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品原料等として有
用な４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法及びそ
れを利用した光学活性体の製造方法に関する。４−ハロ
ゲノグルタミン酸、特に４−フルオロ−グルタミン酸
は、例えば特公平５−３３２３０号等で開示されている
ように抗ガン剤等の原料として有用であることから、そ
の光学活性体が注目されており、その効率のよい工業的
製造方法の開発が望まれている。
用な４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法及びそ
れを利用した光学活性体の製造方法に関する。４−ハロ
ゲノグルタミン酸、特に４−フルオロ−グルタミン酸
は、例えば特公平５−３３２３０号等で開示されている
ように抗ガン剤等の原料として有用であることから、そ
の光学活性体が注目されており、その効率のよい工業的
製造方法の開発が望まれている。
【０００２】
【従来技術】アミノ酸のラセミ分割方法の一手段とし
て、アミノアシラ−ゼによる酵素反応を利用する方法が
古くから知られている。また、ハロゲン化アミノ酸につ
いても例えば、３−フルオログルタミン酸のラセミ分割
方法が開示されている（J.Org.Chem.1985,50,3163-316
7）。しかし、４−ハロゲノグルタミン酸ついては、こ
れまで、アミノアシラ−ゼによるラセミ分割方法は全く
報告されていない。よって当然ながら、４−ハロゲノグ
ルタミン酸からそのＬ体を選択的に得る方法は知られて
いない。その替わりに例えばＬ−４−フルオログルタミ
ン酸の製法として、以下の方法が報告されている。 J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,475(1984) Ｄ，Ｌ−４−Ｆ−グルタミン酸とロイシンとのジペプタ
イドを、ロイシンアミノペプチダ−ゼで加水分解する方
法。 Tetrahedron Letters Vol.31,No.51,7403(1990) ４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを原料に用いて、化学修
飾を行なう方法。
て、アミノアシラ−ゼによる酵素反応を利用する方法が
古くから知られている。また、ハロゲン化アミノ酸につ
いても例えば、３−フルオログルタミン酸のラセミ分割
方法が開示されている（J.Org.Chem.1985,50,3163-316
7）。しかし、４−ハロゲノグルタミン酸ついては、こ
れまで、アミノアシラ−ゼによるラセミ分割方法は全く
報告されていない。よって当然ながら、４−ハロゲノグ
ルタミン酸からそのＬ体を選択的に得る方法は知られて
いない。その替わりに例えばＬ−４−フルオログルタミ
ン酸の製法として、以下の方法が報告されている。 J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,475(1984) Ｄ，Ｌ−４−Ｆ−グルタミン酸とロイシンとのジペプタ
イドを、ロイシンアミノペプチダ−ゼで加水分解する方
法。 Tetrahedron Letters Vol.31,No.51,7403(1990) ４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを原料に用いて、化学修
飾を行なう方法。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の方法
は、酵素反応の原料となるジペプタイドを合成するため
に、ペプチド結合部位以外のアミノ基、カルボキシ基を
保護・脱保護する必要がある等、その調製が厄介であ
る。更に、酵素反応後に遊離してくるＬ−４−Ｆ−グル
タミン酸及びＬ−ロイシン、並びに未反応のジペプチド
の分離が困難である。また、上記の方法は、多工程を
要し、操作の簡便性・安全性、収率等の面で問題があ
る。よって、いずれの方法も工業的製法としては満足の
いく方法ではなかった。
は、酵素反応の原料となるジペプタイドを合成するため
に、ペプチド結合部位以外のアミノ基、カルボキシ基を
保護・脱保護する必要がある等、その調製が厄介であ
る。更に、酵素反応後に遊離してくるＬ−４−Ｆ−グル
タミン酸及びＬ−ロイシン、並びに未反応のジペプチド
の分離が困難である。また、上記の方法は、多工程を
要し、操作の簡便性・安全性、収率等の面で問題があ
る。よって、いずれの方法も工業的製法としては満足の
いく方法ではなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み本発明者
は鋭意検討した結果、４−ハロゲノグルタミン酸をアミ
ノアシラ−ゼを用いてラセミ分割する際に、５位カルボ
キシル基が遊離カルボン酸のままでは酵素反応が全く進
行しないが、５位カルボキシル基をエステル化しておけ
ば、酵素反応がスム−ズに進行しラセミ分割が達成され
ることを見出し、本発明を完成した。その結果、４−ハ
ロゲノグルタミン酸のＬ体を効率よく製造することにも
成功した。
は鋭意検討した結果、４−ハロゲノグルタミン酸をアミ
ノアシラ−ゼを用いてラセミ分割する際に、５位カルボ
キシル基が遊離カルボン酸のままでは酵素反応が全く進
行しないが、５位カルボキシル基をエステル化しておけ
ば、酵素反応がスム−ズに進行しラセミ分割が達成され
ることを見出し、本発明を完成した。その結果、４−ハ
ロゲノグルタミン酸のＬ体を効率よく製造することにも
成功した。
【０００５】即ち、本発明は、代表的には以下の方法を
提供する。 (1) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステ
ル体を基質に用いることを特徴とする、アミノアシラ−
ゼによる酵素反応を利用する４−ハロゲノグルタミン酸
のラセミ分割方法。 (2) Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位カル
ボキシエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用させるこ
とにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択的に脱ア
シル化する、上記(1)の方法。 (3) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステ
ル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応さ
せることにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択的
にＮ−アシル化する、上記(1)の方法。 (4) ５位カルボキシエステル体が低級アルキルエステル
である、上記(1)〜(3)のいずれかの方法。
提供する。 (1) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステ
ル体を基質に用いることを特徴とする、アミノアシラ−
ゼによる酵素反応を利用する４−ハロゲノグルタミン酸
のラセミ分割方法。 (2) Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位カル
ボキシエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用させるこ
とにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択的に脱ア
シル化する、上記(1)の方法。 (3) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステ
ル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応さ
せることにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択的
にＮ−アシル化する、上記(1)の方法。 (4) ５位カルボキシエステル体が低級アルキルエステル
である、上記(1)〜(3)のいずれかの方法。
【０００６】(5) ｐＨ５〜７にて酵素反応を行なう、上
記(1)〜(4)のいずれかの方法。 (6) ４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオログルタミ
ン酸である、上記(1)〜(5)のいずれかの方法。 (7) 上記(1)〜(5)のいずれかの方法を用いる、Ｌ−４−
ハロゲノグルタミン酸の製造方法。 (8) Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位カル
ボキシエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用させるこ
とにより、Ｌ体を選択的に脱アシル化する、上記(7)の
製造方法。 (9) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステ
ル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応さ
せることにより、Ｌ体を選択的にＮ−アシル化する、上
記(7)の製造方法。 (10) ４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオログルタ
ミン酸である、上記(7)〜(9)のいずれかの製造方法。
記(1)〜(4)のいずれかの方法。 (6) ４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオログルタミ
ン酸である、上記(1)〜(5)のいずれかの方法。 (7) 上記(1)〜(5)のいずれかの方法を用いる、Ｌ−４−
ハロゲノグルタミン酸の製造方法。 (8) Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位カル
ボキシエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用させるこ
とにより、Ｌ体を選択的に脱アシル化する、上記(7)の
製造方法。 (9) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステ
ル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応さ
せることにより、Ｌ体を選択的にＮ−アシル化する、上
記(7)の製造方法。 (10) ４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオログルタ
ミン酸である、上記(7)〜(9)のいずれかの製造方法。
【０００７】以下、本発明について更に詳しく説明す
る。本発明において、４−ハロゲノグルタミン酸とは、
４位の水素原子１個がハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒま
たはＩ）で置換されたグルタミン酸のラセミ体（Ｄ・Ｌ
体）を意味する。４−ハロゲノグルタミン酸の５位カル
ボキシエステル体とは、４−ハロゲノグルタミン酸の５
位のカルボキシル基におけるエステル体を意味する（以
下、単に、５位カルボキシエステル体ということもあ
る）。この場合も、そのラセミ体（Ｄ・Ｌ体）を意味す
る。
る。本発明において、４−ハロゲノグルタミン酸とは、
４位の水素原子１個がハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒま
たはＩ）で置換されたグルタミン酸のラセミ体（Ｄ・Ｌ
体）を意味する。４−ハロゲノグルタミン酸の５位カル
ボキシエステル体とは、４−ハロゲノグルタミン酸の５
位のカルボキシル基におけるエステル体を意味する（以
下、単に、５位カルボキシエステル体ということもあ
る）。この場合も、そのラセミ体（Ｄ・Ｌ体）を意味す
る。
【０００８】本発明のラセミ分割方法は、具体的には以
下の２つの方法を包含するが、好ましくは方法１であ
る。 （方法１：脱アシル化）Ｎ−アシル−４−ハロゲノグル
タミン酸の５位カルボキシエステル体（以下、Ｎ−アシ
ル−５−カルボキシエステル体という）を基質原料に用
いて、アミノアシラ−ゼを作用させることにより、Ｄ
体、Ｌ体のいずれか一方を選択的に脱アシル化すれば、
両者が分離可能な状態になる。即ち、酵素反応終了後の
反応液には、脱アシル化により生成した５位カルボキシ
エステル体の一方の光学活性体、脱アシル化されなかっ
たＮ−アシル−５−カルボキシエステル体の他方の光学
活性体、及び場合により未反応のラセミ体が含まれる。
下の２つの方法を包含するが、好ましくは方法１であ
る。 （方法１：脱アシル化）Ｎ−アシル−４−ハロゲノグル
タミン酸の５位カルボキシエステル体（以下、Ｎ−アシ
ル−５−カルボキシエステル体という）を基質原料に用
いて、アミノアシラ−ゼを作用させることにより、Ｄ
体、Ｌ体のいずれか一方を選択的に脱アシル化すれば、
両者が分離可能な状態になる。即ち、酵素反応終了後の
反応液には、脱アシル化により生成した５位カルボキシ
エステル体の一方の光学活性体、脱アシル化されなかっ
たＮ−アシル−５−カルボキシエステル体の他方の光学
活性体、及び場合により未反応のラセミ体が含まれる。
【０００９】即ち、例えば、４−ハロゲノグルタミン酸
のＬ体（以下、Ｌ−４−ハロゲノグルタミン酸という）
を選択的に得たい場合には、好ましくは、基質原料のＬ
体に特異的に作用し、Ｌ体を選択的に脱アシル化するア
ミノアシラ−ゼを用いればよい。そうすることにより、
５位カルボキシエステル体のＬ体（以下、Ｌ−５−カル
ボキシエステル体という）及びＮ−アシル−５−カルボ
キシエステル体のＤ体を含む反応液が得られる。本方法
における酵素反応はアミドの加水分解であるので、溶媒
としては水が適当である。アシル基としては、使用する
アミノアシラ−ゼによりＤ体またはＬ体のいずれか一方
が選択的に脱アシル化されるものであれば公知のものを
幅広く使用でき、ホルミル、低級アルカノイル（アセチ
ル、クロロアセチル、プロピオニル、ブチリル等）、ア
ロイル（ベンゾイル、トルオイル等）等が例示される。
のＬ体（以下、Ｌ−４−ハロゲノグルタミン酸という）
を選択的に得たい場合には、好ましくは、基質原料のＬ
体に特異的に作用し、Ｌ体を選択的に脱アシル化するア
ミノアシラ−ゼを用いればよい。そうすることにより、
５位カルボキシエステル体のＬ体（以下、Ｌ−５−カル
ボキシエステル体という）及びＮ−アシル−５−カルボ
キシエステル体のＤ体を含む反応液が得られる。本方法
における酵素反応はアミドの加水分解であるので、溶媒
としては水が適当である。アシル基としては、使用する
アミノアシラ−ゼによりＤ体またはＬ体のいずれか一方
が選択的に脱アシル化されるものであれば公知のものを
幅広く使用でき、ホルミル、低級アルカノイル（アセチ
ル、クロロアセチル、プロピオニル、ブチリル等）、ア
ロイル（ベンゾイル、トルオイル等）等が例示される。
【００１０】（方法２：アシル化）５位カルボキシエス
テル体を基質原料に用いて、アミノアシラ−ゼ存在下で
アシル化剤と反応させることにより、Ｄ体、Ｌ体のいず
れか一方のアミノ基を選択的にアシル化すれば、両者が
分離可能な状態になる。即ち、酵素反応終了後の反応液
には、Ｎ−アシル−５−カルボキシエステル体のいずれ
か一方の光学活性体、アシル化されなかった５位カルボ
キシエステル体の他方の光学活性体、及び場合により未
反応のラセミ体が含まれる。
テル体を基質原料に用いて、アミノアシラ−ゼ存在下で
アシル化剤と反応させることにより、Ｄ体、Ｌ体のいず
れか一方のアミノ基を選択的にアシル化すれば、両者が
分離可能な状態になる。即ち、酵素反応終了後の反応液
には、Ｎ−アシル−５−カルボキシエステル体のいずれ
か一方の光学活性体、アシル化されなかった５位カルボ
キシエステル体の他方の光学活性体、及び場合により未
反応のラセミ体が含まれる。
【００１１】即ち、例えば、Ｌ−４−ハロゲノグルタミ
ン酸を選択的に得たい場合には、好ましくは、基質原料
のＬ体に特異的に作用し、Ｌ体を選択的にアシル化する
アミノアシラ−ゼを用いればよい。そうすることによ
り、Ｎ−アシル−５−カルボキシエステル体のＬ体、及
び５位カルボキシエステル体のＤ体を含む反応液が得ら
れる。本方法における酵素反応は脱水反応に相当するの
で、溶媒系中に水は本来不要であるが、例えば、ｐＨ調
節のための少量の水は含まれていてもよい。アシル化剤
としては、アミノアシラ−ゼをできるだけ失活させず
に、基質原料のアミノ基を選択的にアシル化できるもの
であれば特に制限されないが、好ましくは、酢酸エチ
ル、ハロゲン化酢酸エチル、ハロゲン化プロピオン酸エ
チル等のエステル型構造を有する試薬である。
ン酸を選択的に得たい場合には、好ましくは、基質原料
のＬ体に特異的に作用し、Ｌ体を選択的にアシル化する
アミノアシラ−ゼを用いればよい。そうすることによ
り、Ｎ−アシル−５−カルボキシエステル体のＬ体、及
び５位カルボキシエステル体のＤ体を含む反応液が得ら
れる。本方法における酵素反応は脱水反応に相当するの
で、溶媒系中に水は本来不要であるが、例えば、ｐＨ調
節のための少量の水は含まれていてもよい。アシル化剤
としては、アミノアシラ−ゼをできるだけ失活させず
に、基質原料のアミノ基を選択的にアシル化できるもの
であれば特に制限されないが、好ましくは、酢酸エチ
ル、ハロゲン化酢酸エチル、ハロゲン化プロピオン酸エ
チル等のエステル型構造を有する試薬である。
【００１２】上記いずれかの方法により酵素反応を行な
った反応液を、公知の物理化学的分離手段（例えば、カ
ラムクロマトグラフィ−、等電点晶析、分液操作等）で
後処理することにより単離される光学活性体を、所望に
より、公知のエステル加水分解反応及び／又は脱アシル
化反応を行なうことにより、目的の４−ハロゲノグルタ
ミン酸の光学活性体が得られる。尚、該酵素反応中また
は反応溶液の後処理中に、エステル体が加水分解される
こともある。
った反応液を、公知の物理化学的分離手段（例えば、カ
ラムクロマトグラフィ−、等電点晶析、分液操作等）で
後処理することにより単離される光学活性体を、所望に
より、公知のエステル加水分解反応及び／又は脱アシル
化反応を行なうことにより、目的の４−ハロゲノグルタ
ミン酸の光学活性体が得られる。尚、該酵素反応中また
は反応溶液の後処理中に、エステル体が加水分解される
こともある。
【００１３】尚、上記いずれの方法においても、５位カ
ルボキシエステル体のエステルとしては、好ましくは、
低級アルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチ
ルエステル、イソプロピルエステル、ｔ−ブチルエステ
ル、ｎ−ペンチルエステル、ｎ−ヘキシルエステル等の
Ｃ１〜Ｃ６アルキルエステルが例示されるが、より好ま
しくはＣ１〜Ｃ３アルキルエステル、特に好ましくはメ
チルエステルである。
ルボキシエステル体のエステルとしては、好ましくは、
低級アルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチ
ルエステル、イソプロピルエステル、ｔ−ブチルエステ
ル、ｎ−ペンチルエステル、ｎ−ヘキシルエステル等の
Ｃ１〜Ｃ６アルキルエステルが例示されるが、より好ま
しくはＣ１〜Ｃ３アルキルエステル、特に好ましくはメ
チルエステルである。
【００１４】アミノアシラ−ゼとしては、原料基質のラ
セミ体に対する反応の選択性があるものであれば特に制
限されない。例えば、４−ハロゲノグルタミン酸のＬ体
を選択的に得たい場合には、好ましくは、５位カルボキ
シエステル体またはそのＮ−アシル体のＬ体に対して特
異的に作用するアミノアシラ−ゼを使用すればよく、通
常、Acylase Iに分類されているものが好適である。そ
のようなものとしては、例えば、豚腎由来のアミノアシ
ラ−ゼ、Aspergillus oryzae由来のアミノアシラ−ゼ、
または特開昭６３−２２１８８号や特開平３−２２４４
８３号等に記載のものが使用できる。また、アミノアシ
ラ−ゼは固定化されたものを使用してもよい。
セミ体に対する反応の選択性があるものであれば特に制
限されない。例えば、４−ハロゲノグルタミン酸のＬ体
を選択的に得たい場合には、好ましくは、５位カルボキ
シエステル体またはそのＮ−アシル体のＬ体に対して特
異的に作用するアミノアシラ−ゼを使用すればよく、通
常、Acylase Iに分類されているものが好適である。そ
のようなものとしては、例えば、豚腎由来のアミノアシ
ラ−ゼ、Aspergillus oryzae由来のアミノアシラ−ゼ、
または特開昭６３−２２１８８号や特開平３−２２４４
８３号等に記載のものが使用できる。また、アミノアシ
ラ−ゼは固定化されたものを使用してもよい。
【００１５】（酵素反応条件）上記いずれの方法におい
ても、アミノアシラ−ゼによる酵素反応の条件は、基質
原料及びアミノアシラ−ゼの種類により若干異なり一概
には規定できないが、酵素の至適ｐＨ、至適温度、酵素
基質及び分離生成する光学活性体の安定性等を考慮する
ことにより、最適条件を設定することが可能である。例
えば、Ｌ体を収率よく得るためには、好ましくは、ｐＨ
約５〜７、温度約１０〜４０℃である。ｐＨ調節用のア
ルカリ試薬としては、NH4OH、LiOH、Ca(OH)2、KOH、NaO
H等が例示される。また、反応時間は通常数時間〜数十
時間である。但し、Ｌ−４−フルオログルタミン酸エス
テルは、アルカリ性条件下では極めて不安定なため、酵
素反応終了後は直ちに反応溶液のｐＨを下げ、好ましく
は、ｐＨ３〜４に調節するのが望ましい。また、通常、
基質原料の濃度は約０．５〜１０％、好ましくは約１〜
５％である。
ても、アミノアシラ−ゼによる酵素反応の条件は、基質
原料及びアミノアシラ−ゼの種類により若干異なり一概
には規定できないが、酵素の至適ｐＨ、至適温度、酵素
基質及び分離生成する光学活性体の安定性等を考慮する
ことにより、最適条件を設定することが可能である。例
えば、Ｌ体を収率よく得るためには、好ましくは、ｐＨ
約５〜７、温度約１０〜４０℃である。ｐＨ調節用のア
ルカリ試薬としては、NH4OH、LiOH、Ca(OH)2、KOH、NaO
H等が例示される。また、反応時間は通常数時間〜数十
時間である。但し、Ｌ−４−フルオログルタミン酸エス
テルは、アルカリ性条件下では極めて不安定なため、酵
素反応終了後は直ちに反応溶液のｐＨを下げ、好ましく
は、ｐＨ３〜４に調節するのが望ましい。また、通常、
基質原料の濃度は約０．５〜１０％、好ましくは約１〜
５％である。
【００１６】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。 （略号） D,L-FGlu：４-フルオログルタミン酸（ラセミ）， D,L-FGlu-Me：４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体（ラセミ）， L-FGlu：４-フルオログルタミン酸（Ｌ）， L-FGlu-Me：４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体（Ｌ）， Ac-L-FGlu：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸（Ｌ）， Ac-D,L-FGlu-Me：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル 体（ラセミ）， Ac-L-FGlu-Me：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体 （Ｌ）， ClAc-D,L-FGlu-Me：Ｎ-クロロアセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチル エステル体（ラセミ），
れらに限定されるものではない。 （略号） D,L-FGlu：４-フルオログルタミン酸（ラセミ）， D,L-FGlu-Me：４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体（ラセミ）， L-FGlu：４-フルオログルタミン酸（Ｌ）， L-FGlu-Me：４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体（Ｌ）， Ac-L-FGlu：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸（Ｌ）， Ac-D,L-FGlu-Me：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル 体（ラセミ）， Ac-L-FGlu-Me：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体 （Ｌ）， ClAc-D,L-FGlu-Me：Ｎ-クロロアセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチル エステル体（ラセミ），
【００１７】実施例１（方法１） ClAc-D,L-FGlu-Me（erythro:threo=16:1）３１ｇを蒸留
水に懸濁し、２Ｎ NH4OHにてｐＨを６．０に調整しつ
つ、蒸留水にて全量を２Ｌとした。この溶液に、豚腎臓
由来のアミノアシラ−ゼＩ（Sigma製）を０．３ｇ添加
し、２８℃にて緩やかな撹拌を行ない乍ら４時間反応し
た。反応中は、ｐＨを２Ｎ NH4OHにて６．０に維持し
た。酵素反応終了後、酢酸を５０ｍｌ添加してｐＨを約
３．５に下げ、陽イオン交換樹脂（DOWEX 50W-X8，室町
化学工業）８００ｍＬのカラムを通過（１００ｍＬ／
分）させ、酵素反応により生成したL-FGlu-Me及びL-FGl
uを吸着させた。蒸留水４Ｌにてカラムを洗浄後、１ＮN
H4OHにて溶出した。溶出液をＨＰＬＣで測定したとこ
ろ、L-FGluの含量は９．６ｇであった（L-FGlu-Meの形
で吸着されたものも、L-FGluとして溶出されていると考
えられる）。更に、陰イオン交換樹脂（AG1-X4, Bio-Ra
d製)４００ｍＬにL-FGluを１００ｍＬ／分の流速で吸着
させ、蒸留水４Ｌで洗浄後、１Ｎ ぎ酸にて溶出させ
た。ＴＬＣにより、L-FGlu溶出各分を確認した後、濃縮
乾固し、８．３ｇのL-FGluを得た。総収率７６％、光学
純度９９．２％であり、erythroとthreoの比率は原料と
同じであった。尚、用いたアミノアシラ−ゼＩ（Sigma
製）の至適ｐＨは約７、至適温度は約４０〜４５℃であ
った。
水に懸濁し、２Ｎ NH4OHにてｐＨを６．０に調整しつ
つ、蒸留水にて全量を２Ｌとした。この溶液に、豚腎臓
由来のアミノアシラ−ゼＩ（Sigma製）を０．３ｇ添加
し、２８℃にて緩やかな撹拌を行ない乍ら４時間反応し
た。反応中は、ｐＨを２Ｎ NH4OHにて６．０に維持し
た。酵素反応終了後、酢酸を５０ｍｌ添加してｐＨを約
３．５に下げ、陽イオン交換樹脂（DOWEX 50W-X8，室町
化学工業）８００ｍＬのカラムを通過（１００ｍＬ／
分）させ、酵素反応により生成したL-FGlu-Me及びL-FGl
uを吸着させた。蒸留水４Ｌにてカラムを洗浄後、１ＮN
H4OHにて溶出した。溶出液をＨＰＬＣで測定したとこ
ろ、L-FGluの含量は９．６ｇであった（L-FGlu-Meの形
で吸着されたものも、L-FGluとして溶出されていると考
えられる）。更に、陰イオン交換樹脂（AG1-X4, Bio-Ra
d製)４００ｍＬにL-FGluを１００ｍＬ／分の流速で吸着
させ、蒸留水４Ｌで洗浄後、１Ｎ ぎ酸にて溶出させ
た。ＴＬＣにより、L-FGlu溶出各分を確認した後、濃縮
乾固し、８．３ｇのL-FGluを得た。総収率７６％、光学
純度９９．２％であり、erythroとthreoの比率は原料と
同じであった。尚、用いたアミノアシラ−ゼＩ（Sigma
製）の至適ｐＨは約７、至適温度は約４０〜４５℃であ
った。
【００１８】実施例２（方法１） ClAc-D,L-FGlu-Me（erythro:threo=1:4）３６．６ｇを
蒸留水に懸濁し、実施例１と同様の方法で４．５時間反
応させた後、同様に分離精製を行ない、６．０ｇのL-FG
luを得た（収率６４％）。erythroとthreoの比率は原料
と同じであった。
蒸留水に懸濁し、実施例１と同様の方法で４．５時間反
応させた後、同様に分離精製を行ない、６．０ｇのL-FG
luを得た（収率６４％）。erythroとthreoの比率は原料
と同じであった。
【００１９】実施例３（方法２） D,L-FGlu-Me（erythro:threo=1:1）４０．３ｍｇを、４
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，０．１ｍＭ ＣｏＳ
Ｏ4及び３．３Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＮａ含有）０．３ｍＬと
酢酸エチル９．７ｍＬの混液中に懸濁し、実施例１で用
いたアシラ−ゼＩを４．９ｍｇ添加し、３０℃で１９時
間、緩やかに撹拌した。濃塩酸０．１５ｍＬを添加して
反応を停止した後、減圧濃縮により酢酸エチルを除去
し、水１０ｍＬ添加後、不溶性物質を遠心分離により除
去した。この反応溶液を、実施例１で用いた陽イオン交
換樹脂２ｍＬカラムで処理することにより、Ac-L-FGlu-
MeとAc-L-FGluを集めた。これらを塩酸で加水分解する
ことにより、最終的にL-FGluを６．２ｍｇ得た。
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，０．１ｍＭ ＣｏＳ
Ｏ4及び３．３Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＮａ含有）０．３ｍＬと
酢酸エチル９．７ｍＬの混液中に懸濁し、実施例１で用
いたアシラ−ゼＩを４．９ｍｇ添加し、３０℃で１９時
間、緩やかに撹拌した。濃塩酸０．１５ｍＬを添加して
反応を停止した後、減圧濃縮により酢酸エチルを除去
し、水１０ｍＬ添加後、不溶性物質を遠心分離により除
去した。この反応溶液を、実施例１で用いた陽イオン交
換樹脂２ｍＬカラムで処理することにより、Ac-L-FGlu-
MeとAc-L-FGluを集めた。これらを塩酸で加水分解する
ことにより、最終的にL-FGluを６．２ｍｇ得た。
【００２０】実施例４（方法１） Ac-D,L-FGlu-Me（erythro:threo=1:1）３ｇを、蒸留水
１５０ｍＬに添加し、２Ｎ ＮＨ4ＯＨにてｐＨを６．５
に調整した。この溶液に豚腎由来のアシラ−ゼＩ（Sigm
a社）を１４．２ｍｇ添加し、２８℃にて緩やかな撹拌
を行ないながら４時間反応した。反応中、ｐＨは２Ｎ
ＮＨ4ＯＨで６．５になるよう調節した。酵素反応終了
後、酢酸を５ｍＬ添加してｐＨを下げた後、反応液を陽
イオン交換樹脂（DOWEX 50W-X2，室町化学工業）８０ｍ
Ｌのカラムで処理した。最終的に得られたL-FGluは、
０．４１ｇ（収率６５％）であった。
１５０ｍＬに添加し、２Ｎ ＮＨ4ＯＨにてｐＨを６．５
に調整した。この溶液に豚腎由来のアシラ−ゼＩ（Sigm
a社）を１４．２ｍｇ添加し、２８℃にて緩やかな撹拌
を行ないながら４時間反応した。反応中、ｐＨは２Ｎ
ＮＨ4ＯＨで６．５になるよう調節した。酵素反応終了
後、酢酸を５ｍＬ添加してｐＨを下げた後、反応液を陽
イオン交換樹脂（DOWEX 50W-X2，室町化学工業）８０ｍ
Ｌのカラムで処理した。最終的に得られたL-FGluは、
０．４１ｇ（収率６５％）であった。
【００２１】実施例５（方法１） キトパ−ルBCW3001（富士紡績）２００ｇに１５％グル
タルアルデヒド５００ｍＬを添加し、室温で２時間反応
させた。反応終了後、蒸留水５００ｍＬによる洗浄を４
回繰り返すことにより、活性化したキトパ−ルBCW3001
を調製した。一方、アミノアシラ−ゼ「アマノ」（天野
製薬）４０ｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）６００
ｍＬに懸濁し遠沈上澄を調製した後、活性化したキトパ
−ルBCW3001と混合し、室温で２時間緩やかな撹拌を行
なった。カップリング反応終了後、蒸留水及び５０ｍＭ
リン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、更に５
０ｍＭのＮ−アセチルグルタミン酸で洗浄することによ
り、アシラ−ゼの固定化酵素を調製した。次に、この固
定化酵素１１．１ｇを使用して、実施例４と同様に酵素
反応を行なうことにより、最終的にL-FGluを０．４２ｇ
（収率６６％）得た。
タルアルデヒド５００ｍＬを添加し、室温で２時間反応
させた。反応終了後、蒸留水５００ｍＬによる洗浄を４
回繰り返すことにより、活性化したキトパ−ルBCW3001
を調製した。一方、アミノアシラ−ゼ「アマノ」（天野
製薬）４０ｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）６００
ｍＬに懸濁し遠沈上澄を調製した後、活性化したキトパ
−ルBCW3001と混合し、室温で２時間緩やかな撹拌を行
なった。カップリング反応終了後、蒸留水及び５０ｍＭ
リン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、更に５
０ｍＭのＮ−アセチルグルタミン酸で洗浄することによ
り、アシラ−ゼの固定化酵素を調製した。次に、この固
定化酵素１１．１ｇを使用して、実施例４と同様に酵素
反応を行なうことにより、最終的にL-FGluを０．４２ｇ
（収率６６％）得た。
【００２２】比較例１（遊離カルボン酸による検討） Ac-D,L-FGluを原料に用いて実施例１と同じ条件で酵素
反応を行なったが、反応の進行は認められなかった。更
に反応液をカラムクロマトで処理したが、光学活性体は
得られなかった。
反応を行なったが、反応の進行は認められなかった。更
に反応液をカラムクロマトで処理したが、光学活性体は
得られなかった。
【００２３】
【発明の効果】本発明方法により、４−ハロゲノグルタ
ミン酸をアミノアシラ−ゼを用いて効率よくラセミ分割
することができる。その結果、例えばそのＬ体を簡便に
収率よく高い光学純度で得ることができる。
ミン酸をアミノアシラ−ゼを用いて効率よくラセミ分割
することができる。その結果、例えばそのＬ体を簡便に
収率よく高い光学純度で得ることができる。
Claims (10)
- 【請求項１】４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキ
シエステル体を基質に用いることを特徴とする、アミノ
アシラ−ゼによる酵素反応を利用する４−ハロゲノグル
タミン酸のラセミ分割方法。 - 【請求項２】Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の
５位カルボキシエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用
させることにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択
的に脱アシル化することを特徴とする、請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキ
シエステル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤
と反応させることにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方
を選択的にＮ−アシル化することを特徴とする、請求項
１記載の方法。 - 【請求項４】５位カルボキシエステル体が低級アルキル
エステルである、請求項１〜３のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項５】ｐＨ５〜７にて酵素反応を行なう、請求項
１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオロ
グルタミン酸である、請求項１〜５のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項７】請求項１〜５のいずれかに記載の方法を用
いる、Ｌ−４−ハロゲノグルタミン酸の製造方法。 - 【請求項８】Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の
５位カルボキシエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用
させることにより、Ｌ体を選択的に脱アシル化すること
を特徴とする、請求項７記載の製造方法。 - 【請求項９】４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキ
シエステル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤
と反応させることにより、Ｌ体を選択的にＮ−アシル化
することを特徴とする、請求項７記載の製造方法。 - 【請求項１０】４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオ
ログルタミン酸である、請求項７〜９のいずれかに記載
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29028195A JP3720435B2 (ja) | 1995-10-11 | 1995-10-11 | ４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29028195A JP3720435B2 (ja) | 1995-10-11 | 1995-10-11 | ４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09103298A true JPH09103298A (ja) | 1997-04-22 |
| JP3720435B2 JP3720435B2 (ja) | 2005-11-30 |
Family
ID=17754123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29028195A Expired - Fee Related JP3720435B2 (ja) | 1995-10-11 | 1995-10-11 | ４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3720435B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110147313A1 (en) * | 2008-06-06 | 2011-06-23 | Eni S.P.A. | Process for the treatment of the aqueous stream coming from the fischer-tropsch reaction by means of ion exchange resins |
| CN106083635A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-09 | 山东诚汇双达药业有限公司 | 一种n‑（氯乙酰）‑l‑谷氨酸甲酯的制备方法 |
-
1995
- 1995-10-11 JP JP29028195A patent/JP3720435B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110147313A1 (en) * | 2008-06-06 | 2011-06-23 | Eni S.P.A. | Process for the treatment of the aqueous stream coming from the fischer-tropsch reaction by means of ion exchange resins |
| US8974671B2 (en) * | 2008-06-06 | 2015-03-10 | Eni S.P.A. | Process for the treatment of the aqueous stream coming from the fischer-tropsch reaction by means of ion exchange resins |
| CN106083635A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-09 | 山东诚汇双达药业有限公司 | 一种n‑（氯乙酰）‑l‑谷氨酸甲酯的制备方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3720435B2 (ja) | 2005-11-30 |
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