JPH0870889A

JPH0870889A - 臓器障害誘導因子の検出方法

Info

Publication number: JPH0870889A
Application number: JP23432194A
Authority: JP
Inventors: Toshimasa Yoshioka; 俊正吉岡; Katsumi Ito; 克己伊藤; Suguru Motojima; 英本島
Original assignee: TOKYO JIYOSHI IKA UNIV; Kureha Corp
Current assignee: TOKYO JIYOSHI IKA UNIV; Kureha Corp
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 1996-03-19
Also published as: EP0699904A1; CA2157345A1

Abstract

(57)【要約】【目的】臓器障害誘導因子の検出方法を提供する。【構成】（１）障害の有無を測定すべき臓器に相当す
る臓器の培養細胞を被検血清又は血漿の存在下で培養す
ることにより、培養液中に活性酸素代謝産物を放出せし
める工程、（２）前記工程（１）により得られた培養液
にスピントラップ剤を添加する工程、及び（３）前記工
程（２）で得られた培養液中のラジカル濃度を測定する
工程を含む。【効果】患者が臓器障害を起こす危険性を早期に判定
することが可能となる。臓器障害早期における潜在的臓
器障害の新しいスクリーニング法として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臓器障害の診断に利用す
ることができる臓器障害誘導因子の検出方法に関する。
更に詳しくは、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）などにより臓
器障害の指標を得る方法であって、更に臓器障害早期に
おける潜在的な臓器障害の診断も可能となる臓器障害誘
導因子の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、臓器機能障害の臨床診断は、実際
に臓器機能障害が明らかとなってから行われてきた。す
なわち、臓器不全病態において臓器機能を示すパラメー
ターが異常値を示すのは臓器機能障害が進行してからで
あり、臓器機能障害が発現された時点では病態の進行を
止めることができないことが多い。例えば、腎機能障害
の臨床診断は、実際に腎機能障害が明かとなってから、
血清クレアチニンの上昇、糸球体濾過値の低下、又は腎
組織学的変化等により診断されてきた。腎不全状態にお
いて腎機能のパラメーターが異常値（血清クレアチニン
の上昇など）を示すのは腎機能障害が進行してからであ
り、特に急性腎不全においては腎機能障害が明らかにな
った時点では病態の進行を止めることのできないことが
多い。

【０００３】一方、炎症及び外傷、アレルギー及び膠原
病、肝胆道疾患、循環器疾患、悪性腫瘍、又は妊娠等の
各種疾患又は病態の診断に血液のＥＳＲシグナルを利用
しようとする試みがなされている〔森重福美他，医学と
生物，９６（６）４５１−４５６（１９７８）〕。ま
た、フリーラジカル測定キット及びそれを用いたＥＳＲ
による測定も知られている（特開平３−２１１４６０号
公報）。しかし、血液のＥＳＲシグナルを各種疾患の診
断に利用する試みも、疾患が外部に現れた時点での研究
であった。

【０００４】更に、近年フリーラジカルを含む活性酸素
代謝産物（Reactive Oxygen Species ；ＲＯＳ）と病態
との関連が注目されている。酸素を利用してエネルギー
産生を行う細胞においては、酸素分子が一電子ずつ還元
された中間代謝産物としてスーパーオキシドアニオン
（Ｏ₂ ^-・）、過酸化水素（Ｈ₂ Ｏ₂ ）、ヒドロキシル
ラジカル（ＨＯ・）、ヒドロペルオキシルラジカル（Ｈ
ＯＯ・）、又は一重項酸素（ ¹Ｏ₂ ）等のＲＯＳが生成
されてくる。ＲＯＳは貪食細胞の殺菌過程では有益な役
割を担うことも知られているが、反面、老化、発癌、炎
症、虚血性臓器障害、動脈硬化、又は薬物障害等の種々
の臓器障害とも深い関わりを持つことが知られている
〔中村國衛他，活性酸素・フリーラジカル，３（１）；
６３−７０，１９９２〕。しかし、ＲＯＳと病態との関
連の研究は、病態の機序に関するものであり、これを診
断に応用することは知られていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、臓器機
能障害の早期段階においてその障害を検出するスクリー
ニング検査方法を開発すべく鋭意研究した。その結果、
血中には、例えば腎機能障害を起こす原因物質（例えば
エンドドキシン、腎毒性薬剤、免疫複合体等）、即ち腎
障害誘導因子が存在し、これらの因子により腎障害早期
に腎細胞からＲＯＳが放出されることを利用して、培養
腎細胞に血清又は血漿を作用させ、細胞からのＲＯＳの
放出をＥＳＲなどを用いて測定することにより、血中に
含まれる腎障害誘導因子を検出し得ることを見い出し
た。更に、培養腎細胞以外にも、特定の培養臓器細胞に
血清又は血漿を作用させて、細胞からのＲＯＳの放出を
ＥＳＲなどを用いて測定することにより、特定の臓器障
害誘導因子を検出し得ることを見い出した。本発明はこ
うした知見に基づくものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は次の工
程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、被検血清又
は血漿中の臓器障害誘導因子の新規な検出方法に関す
る。（１）障害の有無を測定すべき臓器に相当する臓器の培
養細胞を被検血清又は血漿の存在下で培養することによ
り、培養液中に活性酸素代謝産物を放出せしめる工程、
（２）前記工程（１）により得られた培養液にスピント
ラップ剤を添加する工程、及び（３）前記工程（２）で
得られた培養液中のラジカル濃度を測定する工程。

【０００７】本明細書において、臓器障害誘導因子と
は、血中に存在して臓器障害を起こす原因物質である。
臓器は特に限定されず、腎臓、肝臓、心臓、肺、消化器
系（胃や腸）又は神経系（脳など）などを挙げることが
でき、障害の種類も特に限定されない。従って、例え
ば、腎機能障害誘導因子とは、血中に存在して腎障害を
起こす原因物質、例えばエンドトキシン、腎毒性薬剤、
免疫複合体等である。更にその他各種臓器障害に対応し
て肝機能障害誘導因子、心臓機能障害誘導因子、肺機能
障害誘導因子、胃腸機能障害誘導因子、脳機能障害誘導
因子等があり得る。本発明方法は、血中に存在して臓器
障害を起こす原因物質についてはいずれの物質について
も適用が可能であり、従って、本発明の臓器障害誘導因
子には、現在のところその存在が知られていない物質も
当然に含まれる。

【０００８】本発明方法の各工程について以下に説明す
る。工程（１）：被検血清又は血漿の存在下で培養臓器細胞
を培養する工程本工程（１）は、例えば、培養細胞に被検試料である血
清又は血漿を添加して培養することにより培養液中に活
性酸素代謝産物（Reactive Oxygen Species ；ＲＯＳ）
を放出せしめる工程である。被検試料としては血清又は
血漿のいずれも用いることができる。被検試料として添
加する血清又は血漿は、測定対象となる臓器障害誘導因
子を含む可能性のある試料であれば特に限定されず、例
えばヒト又は動物から通常の方法により採血した血液か
ら血清又は血漿を分離して得られる。添加する血清又は
血漿量は、通常の検査に用いる細胞数（１×１０⁶ 〜１
０×１０⁶ 個）に対し、１回あたり０．１〜１．０ｍｌ
であり、０．４〜０．６ｍｌが好ましい。添加血清又は
血漿量が０．１ｍｌ未満になると、反応が弱くなり、検
出感度が低下し、添加血清又は血漿量が１．０ｍｌを越
えると、トラップ剤の使用量を増加する必要があるのに
対して感度は上昇しないので実用的ではない。

【０００９】培養臓器細胞としては、測定対象となる臓
器障害誘導因子によって障害を引き起こされる臓器と同
じ種類の臓器の培養細胞、すなわち、障害の有無を測定
すべき臓器に相当する臓器の培養細胞を用いる。培養臓
器細胞は、通常の組織培養法に従い、動物の臓器組織細
胞を採取し、これを継代培養して樹立した細胞株を用い
る。初代細胞の有する活発な増殖能を永久的に保持し、
しかもその細胞固有の形態・機能を継代培養によっても
喪失することのない、いわゆる不死化細胞株を用いるの
が好ましい。

【００１０】不死化細胞株を得る方法には、（１）ｒａ
ｓやｃ−ｍｙｃ等の発癌遺伝子、あるいはアデノウイル
スＥＬＡ、ＳＶ４０ウイルス、ヒトパピローマウイルス
（ＨＰＶ１６）等のＤＮＡ型腫瘍ウイルスの癌遺伝子又
はその腫瘍抗原（Ｔ抗原）遺伝子などを動物細胞に導入
し、その形質転換体を継代させて得る方法、（２）癌遺
伝子又はそのＴ抗原遺伝子を染色体の一部に安定的に組
み込んだ遺伝子導入動物（トランスジェニックアニマ
ル）を作成し、個体の発生時点において既に癌遺伝子の
一部を体細胞及び生殖細胞内に保有する動物の細胞を初
代細胞とし、これを継代することにより得る方法、
（３）温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子
を哺乳動物の全能性細胞に導入し、この動物の正常な産
出によって得る遺伝子導入動物の各種臓器の組織細胞を
採取しこれを継代培養して得る方法等がある。

【００１１】培養腎細胞としては、例えば、血管内皮細
胞、不死化ウシ糸球体血管内皮細胞、糸球体メサンギウ
ム細胞、ＬＬＣＰＫ１細胞（急性腎不全のターゲットで
ある尿細管由来の細胞系列）等を用いるのが好ましい。
不死化ウシ血管内皮細胞は、培養法が簡単であり、半永
久的継代が可能であるので特に好ましい。

【００１２】本発明方法の工程（１）における細胞培養
は、通常の細胞培養施設（例えばクリーンベンチ；日立
製作所ＳＣＶ１３０３ＥＣ２Ａ，東京等）において、通
常の方法で行うことができる。継代用の細胞は培養フラ
スコ（例えば７５ｃｍ² ；コーニング又はファルコン社
製）で維持される。培養液及び培養条件は臓器組織に応
じて適宜選択することができる。例えば、腎糸球体細胞
を培養する場合には、培養液としてＲＰＭＩ１６４０又
はＦ１２等を用いるのが好ましい。

【００１３】培養細胞を、好ましくはゼラチン（例えば
シグマ社製）でコーティングされた培養プレート（例え
ば６穴，ウェル直径３５ｍｍ；コーニング又はファルコ
ン社製）上に継代して用いることができる。例えば、前
記培養フラスコ内の継代用細胞を酵素（例えば、トリプ
シン）を用いて剥離し、培養液に浮遊させ、培養プレー
トに分割し、２４〜７２時間後に細胞密度が一定（６
穴，ウェル直径３５ｍｍの培養プレートにおいては約１
０〜５０万個／ウェル）となったら、さらに維持用培地
（例えば、０．５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０）で１２〜７２時間培養する。

【００１４】被検血清又は血漿による培養細胞の刺激は
例えば以下の方法で行うことができる。まず、培養プレ
ート上の本発明方法の工程（１）における培養細胞をダ
ルベッコのリン酸緩衝食塩水（カルシウム及びマグネシ
ウムを含有するＤ−ＰＢＳ：Dulbecco's Phosphate Buf
fered Saline, ギブコ社製）等の培養液で洗浄する。つ
いで、被検血清又は血漿を加え、さらにＤ−ＰＢＳを加
える。ここで、被検血清又は血漿とＤ−ＰＢＳの使用量
は培養プレートのウェル面積によって変わるが、例え
ば、６穴のウェル直径３５ｍｍの培養プレートを用いる
場合は、被検血清又は血漿０．１〜０．６ｍｌ，Ｄ−Ｐ
ＢＳ０〜０．５ｍｌを使用し、全体で０．６ｍｌとなる
ようにする。その後、ＣＯ₂ 培養器（通常の細胞培養用
恒温器；例えば平沢製作所ＷＪ−３Ｃ、東京等）などの
培養器内で培養する。好ましい培養時間は０．５〜５時
間、より好ましくは１〜２時間、特に好ましくは約１時
間である。培養時間が０．５時間よりも短いと反応がお
こらず、５時間よりも長いと細胞が死滅することがあ
る。

【００１５】被検血清又は血漿中に、培養臓器細胞の臓
器に障害をもたらす臓器障害誘導因子が存在すると、前
記の培養により培養液中に活性酸素代謝産物（ＲＯＳ）
が放出される。ここで、活性酸素代謝産物（ＲＯＳ）と
は、酸素分子の不完全還元によって生成するスーパーオ
キシドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、
ヒドロペルオキシルラジカル、又は一重項酸素等の総称
である。

【００１６】工程（２）：スピントラップ剤を添加する
工程工程（２）は、前記工程（１）により得られた培養液に
スピントラップ剤を添加する工程である。この工程
（２）により、不安定なフリーラジカル、すなわち、活
性酸素代謝産物（ＲＯＳ）をスピントラップ剤と反応さ
せ、安定で測定し易いスピンアダクトに変換させる。ス
ピントラップ剤としては、ＲＯＳをスピンアダクトに変
換させることのできる化合物であれば特に限定されない
が、例えば、５，５−ジメチル−１−ピロリン−ｎ−オ
キシド（ＤＭＰＯ）、２−メチル−２−ニトロソプロパ
ン二量体（ＭＮＰ）、α−フェニル−Ｎ−ｔ−ブチルニ
トロン（ＰＢＮ）等を用いるのが好ましい。これらのス
ピントラップ剤のうちＤＭＰＯは細胞毒性が低いので、
最も好ましい。スピントラップ剤は、培養液中の全ＲＯ
Ｓをスピンアダクトに変換させることのできる過剰量で
添加する。スピントラップ剤を添加してから１〜６０分
間反応させるが、通常は、１０〜３０分間反応させる。
反応時間が１分未満だとスピンアダクトへの変換が不充
分になり、６０分を越えるとトラップ剤による細胞障害
をおこす。

【００１７】工程（３）：ラジカル濃度を測定する工程本工程（３）は、前記工程（２）で得られた培養液中の
ラジカル濃度を、例えばＥＳＲ装置を用いて測定する工
程である。通常のＥＳＲ装置を用いて、測定するラジカ
ルに応じて、適宜条件を設定して測定することができ
る。周波数は１．２ＧＨｚ（Ｌバンド）、９．４ＧＨｚ
（Ｘバンド）、２４ＧＨｚ（Ｋバンド）、３６ＧＨｚ
（Ｑバンド）等のいずれをも使用することができるが、
Ｘバンドが好ましい。スピン測定用スタンダードには、
例えば、４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＥＭＰＯを用いる。得
られたスペクトルの２回積分した高さがラジカル濃度で
ある。ラジカル種はスペクトルの形状により決定するこ
とができる。

【００１８】本発明方法では、得られたラジカル濃度の
測定値から自動的に、臓器障害をおこす可能性の有無を
判定することができる。本発明方法は、臓器障害を予知
することができる。すなわち、血中の因子によって臓器
障害が起きる場合は、その因子が、実際の障害に先立っ
て出現してくると考えられる。正常の血清や血漿にはそ
のような因子が含まれておらず、そのため培養臓器細胞
に血清又は血漿を作用させてもフリーラジカル産生はお
こらない。臓器障害因子を含む血清又は血漿を作用させ
た場合にのみ、培養細胞からフリーラジカルが産生され
る。このため、被験者が臓器障害をおこす可能性（すな
わち、血中に臓器障害因子が含まれること）を、自動的
に検出することができる。本発明方法により、臓器障害
のリスクを有する患者群から、実際に障害をおこす可能
性の高いハイリスク群をスクリーニングすることができ
る。

【００１９】本発明の臓器障害誘導因子の検出方法は、
少量の血清又は血漿を試料として実施することができる
ので、小児にも応用でき、また小動物による実験にも応
用することができる。また、短時間で結果が判明するの
で、病態が急速に変わる急性腎不全のような急性疾患で
も有用である。簡単な操作で短時間に測定することがで
きるので大量の検体処理が可能である。

【００２０】本発明方法が臨床医学上最も有用と考えら
れるのは、臓器障害が予想される患者において臓器機能
不全が明らかになる前にそれを診断することができる場
合である。心臓、肝臓、そして腎臓などの臓器移植は、
国際的に臓器不全の治療法として確立しており、日本に
おいても今後認められていくものと考えられる。臓器移
植において最も重要な合併症に拒絶反応があり、特に急
性拒絶反応は移植直後に多い合併症で、発症が急激であ
ること、また臓器不全が進行してから治療を開始しても
機能不全が完全に回復する可能性が低いため、早期診断
が必要である。日本では、現在のところ腎臓移植以外は
一般的に行われていないが、この腎移植後に起こる急性
拒絶反応に際して、従来は、腎機能の指標である血清ク
レアチニン値が上昇してから診断が行われ、治療が開始
されていた。血清クレアチニン値の上昇は腎機能の低下
がある程度進行してからしか起こらないこと、正常でも
値の変動があり、拒絶反応初期の僅かなクレアチニン値
の上昇がこの正常の変動であるのか拒絶反応の初期変化
であるかの診断が困難であることから、他の方法による
診断が望まれていた。本発明はこうした課題についても
解決法を提供するものである。

【００２１】例えば、急性拒絶反応においては、血中の
リンパ球が賦活化されて、サイトカインと呼ばれる生理
活性物質が放出され、これらの生理活性物質は血管内皮
細胞からのフリーラジカル放出を促す。このため、例え
ば、本発明方法による被検血清又は血漿を用いた培養糸
球体血管内皮細胞のフリーラジカル放出反応により、急
性拒絶反応を早期に診断することができる。

【００２２】このような特徴を有する本発明の臓器障害
誘導因子の検出方法は、ＥＳＲを用いた臓器障害、好ま
しくは腎障害の新しいスクリーニング法として有用であ
り、更に臓器障害早期における潜在的臓器障害、好まし
くは腎障害早期における潜在的腎障害の新しいスクリー
ニング法として有用である。例えば、本発明のスクリー
ニング法を集団検診に応用して、腎障害早期発見が可能
となる。更に、培養細胞として種々の臓器の細胞を用い
て、本発明の臓器障害誘導因子の検出方法を応用すれ
ば、どの臓器に臓器障害が起きているかの診断も可能で
ある。

【００２３】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：腎障害誘導因子で処理した不死化ウシ糸球体
血管内皮細胞におけるＥＳＲパターン腎障害誘導因子として大腸菌トキシンであるリポポリサ
ッカライド（ＬＰＳ）（Ｅ．Ｃｏｌｉ．０１１１；シグ
マ社製）を用いた。

【００２４】不死化ウシ糸球体血管内皮細胞は、Nitta
K. et al., Jpn. J. Nephrol., 1994; 36: 883-889に記
載の方法で調製した。ウシ糸球体血管内皮細胞（ＧＥ
Ｎ）は、Nitta K. et al, J. Am. Soc. Nephrol., 199
1; 2: 156-163に従い、Nitta K. et al, Acta Pathol.
Japonica, 1993;43: 367-371による修正法により、成熟
ウシ腎臓から分離し、クローン化し、増殖させた。分離
したＧＥＮをメディウムＡに維持した。メディウムＡは
ＲＰＭＩ１６４０メディウム（GIBCO Oriental Co.；東
京）に１５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５Ｕ／
ｍｌヘパリン、２ｎｇ／ｍｌ酸性線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ；R & D System；米国ミネアポリス）及び抗生
物質を加えて調製した。

【００２５】ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現させるプラス
ミドＤＮＡ（Brash DE et al., Mol. Cell Biol., 198
7; 7: 2031-2034）を、大腸菌に導入して増殖させた。
そのプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎカラムで分離し
た。溶出したＤＮＡをエタノールで沈澱させ、無菌ＴＥ
緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０）に再懸濁した後、２６０ｎｍにおける
吸光度を測定してＤＮＡ量を定量した。

【００２６】ウシＧＥＮ中へのＤＮＡ導入はPonder KP
et al., Human Gene Therapy, 1991; 2: 41-52及びGIBC
O BRL （米国ギャザースブルグ）のプロトコールの方法
を修正したリポソーム媒体法により行った。即ち、ＧＥ
Ｎをゼラチンコート６穴プラスチック培養プレートに２
×１０⁴cells/well になるように入れた。メディウムＡ
中で１２時間後に単層が形成された。リポソーム／ＤＮ
Ａ混合物は、リポフェクチン（GIBCO BRL ）１５μｇと
前記で調製したＤＮＡの所定量とを蒸留水５０μｌ中で
混合して調製した。この混合物を室温で１５分間インキ
ュベートした後、培養ＧＥＮに添加して５％ＣＯ₂ 中に
て３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。次いで
培養液を新しいメディウムＡに入れ換え、更にＧＥＮを
４８時間培養した。

【００２７】更に、培養液を選択培地に換えた。選択培
地はＲＰＭＩ１６４０メディウムに１０％ＦＣＳ、ＩＴ
ＳＰｒｅｍｉｘ（５μｇ／ｍｌインシュリン、５μｇ
／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン）及び抗
生物質を加えて調製した。通常のクローン化法を用いて
活発に増殖する細胞を選択した。１つのクローンを増殖
用クローンとして選択し、７５ｃｍ² 培養フラスコ（Co
rning Glass Works ；米国コーニング）に移し、１０％
ＦＣＳと抗生物質とを含むＲＰＭＩ１６４０メディウム
（メディウムＢ）中で培養し、０．１２５％トリプシン
で継代培養した。

【００２８】こうして得られた不死化ウシ糸球体血管内
皮細胞を、ゼラチン（シグマ社製）でコーティングされ
た６穴培養プレート（ウェル直径３５ｍｍ；コーニング
又はファルコン社製）上に継代した。即ち、前記７５ｃ
ｍ² 培養フラスコ内の不死化ＧＥＮをトリプシンで剥離
して培養液に浮遊させ、培養プレートに分割し、２４〜
７２時間後に細胞密度が一定（約２０万個／ウェル）と
なった後、さらに０．５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ
１６４０で４８時間培養した。このときの培養液はＲＰ
ＭＩ１６４０（例えばギブコ社製、ＩＣＮ社製又はシグ
マ社製）であり、ウシ胎児血清（１５％）、ペニシリン
（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μ
ｇ／ｍｌ）及びフャンギゾン（０．２５μｇ／ｍｌ）を
含むものである（Yoshioka他：Kidney International 3
5:211-219,1994参照）。

【００２９】６穴プレートに培養した不死化ウシ糸球体
血管内皮細胞を、まず、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水
（カルシウム及びマグネシウムを含有するＤ−ＰＢＳ：
ギブコ社製）で洗浄した。ついで、大腸菌感染症時に血
中に出現して急性腎不全を起こすリポポリサッカライド
（ＬＰＳ；１０μｇ／ｍｌ）をＤ−ＰＢＳ（０．６ｍ
ｌ）中に溶解した溶液を加えて、ＣＯ₂ 培養器（細胞培
養恒温器；平沢製作所ＷＪ−３Ｃ；東京）内で、１時間
培養した。その後、スピントラップ剤である５，５−ジ
メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ，Labo
tec ，東京；０．４５Ｍ、３０μｌ）を添加し、２０分
間反応させた。コントロール試験として、リポポリサッ
カライドを含まないＤ−ＰＢＳのみを培養細胞に加え
て、同様にＤＭＰＯを添加し、２０分間反応させた。

【００３０】反応終了後、培養液を１３×７５ｍｍガラ
ス試験管（マルエム，大阪）に回収し、直ちにＥＳＲ測
定装置（ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ，日本電子株式会社）により
各被検試料のＥＳＲパターン（微分形）を測定した。測
定条件は、ゲイン５×１００、時定数０．１ｓｅｃ、掃
引幅５ｍＴ、磁場変調幅０．６３×１０^-1ｍＴであっ
た。さらに、フリーラジカル濃度を定量するためにスピ
ン測定用スタンダードとして４−ヒドロキシ−２，２，
６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル
（４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ，シグマ社製）の標準液
（１０^-6Ｍ）を調製し、試料と同じ条件でＥＳＲパター
ンを測定し波形から得られる信号強度（波形の積分値）
の比較からヒューレットパッカード社製パーソナルコン
ピューター（９１４５，米国ストーンハム）及びＥＳＲ
解析用ソフトウェア（日本電子，ＥＳＲＯＵＴ４７０デ
ータシステム）を用いてスピン数を測定した。得られた
波形はヒューレットパッカード社製プロッター（７４７
５Ａ）でプリントアウトした。

【００３１】前記の実験により得られた２種のＥＳＲパ
ターンを図１に示す。図１の上段（コントロール）はコ
ントロール実験の結果であり、下段（ＬＰＳ）は大腸菌
由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加した実験
の結果である。両端の波は機械に組み込まれているスタ
ンダードの波（Ｍｎ⁺の波形）であり、この波の高さと
検体より得られた波の高さが相対的なラジカル濃度の指
標となる。濃度の定量は最終的には４−ヒドロキシ−Ｔ
ＥＭＰＯによるスタンダード直線から算出する。図１に
おいて、大腸菌由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）
を添加した場合のパターンに認められる４つの波形はヒ
ドロキシルラジカルに特徴的な波形である。従って、図
１の２つのパターンから明らかなように、急性腎不全の
起因物質の一つであるＬＰＳを加えた不死化ウシ糸球体
血管内皮細胞培養液中にヒドロキシルラジカルが検出さ
れた。コントロールでは僅かな波を認めた。コントロー
ルとＬＰＳによるフリーラジカル濃度は、それぞれ０．
２１と４．６ｎｍｏｌ／１０⁷ ｃｅｌｌｓであった。

【００３２】実施例２：急性腎不全患者血清で処理した
不死化ウシ糸球体血管内皮細胞におけるＥＳＲパターン大腸菌Ｏ１５７型により、溶血性尿毒症性症候群（ＨＵ
Ｓ）を起こした急性腎不全に陥った患者（３歳男児）の
急性期（腎不全初期）及び回復期（腎不全が治癒した時
期）の血清を用いて培養細胞からのフリーラジカル産生
を検討した。本実施例の実験では被検血清試料０．４ｍ
ｌとＤ−ＰＢＳ０．２ｍｌとを混和し、不死化ウシ糸球
体血管内皮細胞に作用させ、その後実施例１と同様にＥ
ＳＲパターンの測定を行った。図２に示すように、急性
期血清により、不死化ウシ糸球体血管内皮細胞からヒド
ロキシルラジカルが放出されることが認められ〔図２の
上段（急性期）〕、一方、回復期の血清ではフリーラジ
カルは検出されなかった〔図２の下段（回復期）〕。急
性期血清により産生されたフリーラジカル量は２．４ｎ
ｍｏｌ／１０⁷ ｃｅｌｌと定量された。また、細胞に作
用させていない急性期血清のみではフリーラジカルは検
出されず、このことより血清中に細胞に作用し内皮細胞
からのフリーラジカルを放出を促す因子（腎障害因子）
が存在することが明らかである。この実験結果から、本
発明方法が腎障害因子を検出するのに有用であることが
明らかとなった。

【００３３】実施例３：腎移植後の急性拒絶反応患者血
清で処理した不死化ウシ糸球体血管内皮細胞及びＬＬＣ
ＰＫ１細胞におけるＥＳＲパターン本実施例では、拒絶反応の初期病変部位である内皮細胞
及び２次病変部位である尿細管上皮細胞の血清に対する
反応を、不死化ウシ糸球体血管内皮細胞と不死化腎尿細
管上皮細胞であるＬＬＣＰＫ１細胞を用いて比較した。
ＬＬＣＰＫ１細胞（大日本製薬）は、その仕様書に記載
されているとおり、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０
培地で継代維持し、実験に供される細胞は不死化ウシ糸
球体血管内皮細胞と同様に６穴培養プレートに継代し
た。

【００３４】本実施例では、実施例２と同様の方法で、
急性拒絶反応患者（１６歳男性）の、腎移植後の急性拒
絶反応初期血清、すなわち急性期（Ａｃｔｉｖｅ）血清
及び拒絶反応治療後の血清、すなわち回復期（Ｉｎａｃ
ｔｉｖｅ）血清を不死化ウシ血管内皮細胞に作用させ、
フリーラジカル産生をＥＳＲで測定した。図３に示すよ
うに、図３の上段〔腎移植後急性拒絶反応急性期（治療
前）〕と下段〔腎移植後急性拒絶反応治療後〕とを比較
すれば、拒絶反応初期に既に内皮細胞からのヒドロキシ
ルラジカル産生を起こす因子が血清中に含まれることが
明らかである。すなわち、急性期血清で処置した細胞で
は明らかなヒドロキシルラジカル産生を認めたが（定量
にて１．２８ｎｍｏｌ／１０⁷ ｃｅｌｌｓ）、回復期血
清では全くフリーラジカルの産生を認めなかったことよ
り、不死化ウシ糸球体内皮細胞を用いて急性拒絶反応と
いう臓器不全を検出することができることが明らかとな
った。また、血漿を用いた場合も同様の所見を得た。一
方、ＬＬＣＰＫ１細胞においては、急性期血清により僅
かなフリーラジカル産生（０．０１８ｎｍｏｌ／１０⁷
ｃｅｌｌ）を認めたのみであった（回復期血清を用いた
場合にはフリーラジカルは検出されなかった）。急性拒
絶反応の初期病変は血管内皮細胞とされるが、ＥＳＲパ
ターンにおいても血管内皮細胞からのフリーラジカルが
尿細管上皮細胞と比較して約１００倍強く検出された。
従って、臓器内で障害のリスクが高い部位を推定するこ
とが可能であり、各臓器の培養細胞を用いることによ
り、血中の多臓器障害因子がどの臓器又はどの部位にお
いて障害を起こす危険が高いのかを推定することも可能
であることが示された。

【００３５】実施例４：横紋筋融解症による急性腎不全
症例の血清によるウシ不死化糸球体血管内皮細胞からの
フリーラジカル産生の検出急性腎不全の原因の一つに横紋筋融解症がある。横紋筋
融解症は、それまで健康であった人間が身体的負荷（ト
レーニング等）により筋細胞の融解を起こす疾患であ
る。本実施例では、１２歳男児が野球のトレーニング後
に発熱等の症状で発症した横紋筋融解症において、腎機
能の指標と患者血清による培養細胞からのフリーラジカ
ル放出を経時的に観察した。結果を示す図４から明らか
なように、第１病日から第２病日においては透析が必要
になる強い腎不全を予期させるような顕著な血清尿素窒
素（○）及びクレアチニン（□）の上昇は認められな
い。しかも、横紋筋融解症では筋肉の融解に伴い尿素窒
素及びクレアチニン値が上昇することが考えられ（尿素
窒素及びクレアチニンは筋肉のタンパク質に含まれるた
め、腎機能低下がなくても、筋肉の崩壊とともに血清濃
度が上昇する）、初期段階においては、これらの値が、
正確な腎機能を表すことができない。特に、クレアチニ
ン値の変動は腎機能障害を示唆しない。また、図４には
示されていないが尿量も保たれていたため、初期段階の
腎障害診断が困難であった。その後、尿素窒素及びクレ
アチニン値がともに上昇し、急性腎不全が明らかとな
り、第４病日〜第５病日にかけて血液透析が行われた。

【００３６】更に、本実施例では、実施例２と同様に患
者血清０．１ｍｌをＤ−ＰＢＳ０．５ｍｌとともに不死
化ウシ糸球体血管内皮細胞に作用させ、１時間後にＤＭ
ＰＯ３０μｌを加えてからフリーラジカル濃度を測定し
た。結果を図５に示す。図５から明らかなように、コン
トロール血清（○）では全くラジカルは検出されなかっ
たが、患者血清（□）では第１病日から第２病日の腎機
能障害がまだ明らかではない時期の血清で既に１ｎｍｏ
ｌ／１０⁷ ｃｅｌｌ以上のフリーラジカル産生を認め
た。本症例においては、第４病日から第５病日にかけて
血液透析が行われたが、尿素窒素及びクレアチニン値の
下降と共に、血清によるフリーラジカル産生量の減少が
認められた。従って、本実施例は、臓器障害が明らかで
ない時期、又は腎機能障害を通常の指標で評価すること
ができない場合でも、本発明方法が有用な診断法である
ことを示している。

【００３７】

【発明の効果】本発明の検出方法は、従来の測定法では
測定対象とされていなかった臓器障害誘導因子を測定す
る、全く新しい方法である。本発明の検出方法を用いる
ことにより、採血時点において、患者が臓器障害を起こ
す危険性を早期に判定することが可能となる。本発明の
検出方法は、ＥＳＲを用いた臓器障害、好ましくは腎障
害の新しいスクリーニング法として有用であり、更に臓
器障害早期における潜在的臓器障害、好ましくは腎障害
早期における潜在的腎障害の新しいスクリーニング法と
して有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】不死化ウシ糸球体血管内皮細胞にＤ−ＰＢＳ
（コントロール）、又は大腸菌由来のリポポリサッカラ
イド（エンドトキシン：Ｏ１１１型、１０μｇ／ｍｌ）
を作用させた場合のＥＳＲパターンである。

【図２】溶血性尿毒症性症候群（ＨＵＳ）患者（３歳男
児）の急性期及び回復期血清を不死化ウシ糸球体血管内
皮細胞に添加してから１時間後のＥＳＲパターンであ
る。

【図３】腎移植後の急性拒絶反応を認めた患者（１６歳
男性）の拒絶反応初期段階の血清及び拒絶反応治療後の
血清による不死化糸球体血管内皮細胞からのフリーラジ
カル産生のＥＳＲパターンである。

【図４】横紋筋融解症患者における、入院０日目より５
日目までの血清尿素窒素及び血清クレアチニン値の変動
を示すグラフである。

【図５】横紋筋融解症患者血清によるウシ不死化糸球体
血管内皮細胞からのフリーラジカル産生量の変化を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者本島英東京都新宿区百人町３−26−２呉羽化学工業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）障害の有無を測定すべき臓器に相
当する臓器の培養細胞を被検血清又は血漿の存在下で培
養することにより、培養液中に活性酸素代謝産物を放出
せしめる工程、（２）前記工程（１）により得られた培
養液にスピントラップ剤を添加する工程、及び（３）前
記工程（２）で得られた培養液中のラジカル濃度を測定
する工程を含むことを特徴とする臓器障害誘導因子の検
出方法。
【請求項２】培養臓器細胞が培養腎細胞である請求項
１に記載の方法。
【請求項３】培養腎細胞が糸球体血管内皮細胞、糸球
体メサンギウム細胞又はＬＬＣＰＫ１細胞である請求項
２に記載の方法。
【請求項４】糸球体血管内皮細胞が不死化糸球体血管
内皮細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項５】臓器障害誘導因子が腎障害誘導因子であ
る請求項１に記載の方法。
【請求項６】臓器障害が潜在的臓器障害である請求項
１に記載の方法。
【請求項７】潜在的臓器障害が潜在的腎障害である請
求項６に記載の方法。
【請求項８】スピントラップ剤が５，５−ジメチル−
１−ピロリン−ｎ−オキシドである請求項１に記載の方
法。
【請求項９】工程（１）の培養時間が０．５〜５時間
である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】工程（２）において、スピントラップ
剤の添加後、１〜３０分間培養を継続する請求項１に記
載の方法。
【請求項１１】１種又は２種以上の培養細胞に対し
て、請求項１に記載の方法を用いる臓器障害の検査方
法。
【請求項１２】請求項１に記載の方法を用いる臓器障
害早期のスクリーニング検査方法。