JPH0856674A - ウイルス耐性を有するトランスジェニック植物の作出方法 - Google Patents
ウイルス耐性を有するトランスジェニック植物の作出方法Info
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- JPH0856674A JPH0856674A JP7039837A JP3983795A JPH0856674A JP H0856674 A JPH0856674 A JP H0856674A JP 7039837 A JP7039837 A JP 7039837A JP 3983795 A JP3983795 A JP 3983795A JP H0856674 A JPH0856674 A JP H0856674A
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- pip
- dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 フイトラカ・インシュラリス・ナカイ由来の
抗ウイルス性蛋白質を発現する組換えベクターを用い
て、トランスジェニック植物を作出する方法。 【効果】 広範な植物にウイルス耐性を付与することが
できる。
抗ウイルス性蛋白質を発現する組換えベクターを用い
て、トランスジェニック植物を作出する方法。 【効果】 広範な植物にウイルス耐性を付与することが
できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トランスジェニック植
物の作出方法に関し、さらに詳しくは、フィトラカ・イ
ンシュラリス・ナカイ由来の抗ウイルス性蛋白質を発現
するベクターで、形質転換したウイルス耐性を有するト
ランスジェニック植物を作出する方法に関する。
物の作出方法に関し、さらに詳しくは、フィトラカ・イ
ンシュラリス・ナカイ由来の抗ウイルス性蛋白質を発現
するベクターで、形質転換したウイルス耐性を有するト
ランスジェニック植物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物は運動性がないので、侵入する病原
体を避けることができない。このため、病原体に対する
直接或いは間接の防御メカニズムで自身を保護しなけれ
ばならない。大部分の植物は病原体、例えばかび、細菌
及びウイルスに対して自身を保護する一般的な防御メカ
ニズムを持っている。
体を避けることができない。このため、病原体に対する
直接或いは間接の防御メカニズムで自身を保護しなけれ
ばならない。大部分の植物は病原体、例えばかび、細菌
及びウイルスに対して自身を保護する一般的な防御メカ
ニズムを持っている。
【０００３】このような防御メカニズムに関して、フィ
トラカ・アメリカナ・エル（Phytolacca americana L.)
から分離された粗抽出液が、生体内でポリペプチドの合
成を阻害することが知られている（参照：Owens, R.A.
et al., Virology 56：390-393(1973))。この報告以
後、フィトラカ・アメリカナ・エルから単離されたフィ
トラカ・アメリカナ・エルの抗ウイルス性蛋白質（Phyt
olacca americana antiviral protein, pokeweed antiv
iral protein：以下、「ＰＡＰ」という）に関する研究
が盛んに行われている。このような状況のもと、ＰＡＰ
は春に主に発現されるＰＡＰ−Ｉ、夏に多く生成される
ＰＡＰ−II、及び種子でのみ発現されるＰＡＰ−Ｓに分
けられる蛋白質であることが明らかにされた（参照：Ir
vin, J.D.et al., Arch. Biochem. Biophys., 169: 522
-528(1975) ; Irvin, J.D. et al., Arch. Biochem. Bi
ophys., 200: 418-425(1980)； Barbieri, L. et al.,
Biochem. J., 203: 55-59(1982))。
トラカ・アメリカナ・エル（Phytolacca americana L.)
から分離された粗抽出液が、生体内でポリペプチドの合
成を阻害することが知られている（参照：Owens, R.A.
et al., Virology 56：390-393(1973))。この報告以
後、フィトラカ・アメリカナ・エルから単離されたフィ
トラカ・アメリカナ・エルの抗ウイルス性蛋白質（Phyt
olacca americana antiviral protein, pokeweed antiv
iral protein：以下、「ＰＡＰ」という）に関する研究
が盛んに行われている。このような状況のもと、ＰＡＰ
は春に主に発現されるＰＡＰ−Ｉ、夏に多く生成される
ＰＡＰ−II、及び種子でのみ発現されるＰＡＰ−Ｓに分
けられる蛋白質であることが明らかにされた（参照：Ir
vin, J.D.et al., Arch. Biochem. Biophys., 169: 522
-528(1975) ; Irvin, J.D. et al., Arch. Biochem. Bi
ophys., 200: 418-425(1980)； Barbieri, L. et al.,
Biochem. J., 203: 55-59(1982))。
【０００４】ＰＡＰを単離してＰＡＰの細胞内のメカニ
ズムに対する研究が行われた結果、ＰＡＰは、他のリボ
ソーム不活性化蛋白質（ribosome-inactivating protei
ns：RIPs) のように真核生物の60Sリボソームのサブユ
ニット（ribosomal subunit)を不活性化させる作用を有
することが明らかにされた。また、ＰＡＰをコードする
遺伝子の塩基配列も明らかにされ（参照：Lin, Q. et a
l., Plant Mol. Biol., 17: 609-614(1991))、ＰＡＰ遺
伝子が多重遺伝子族（multigene family) の形態で存在
することも明らかにされた。更に、ＰＡＰは、細胞内で
合成されて細胞の外に分泌され、ウイルスの抑制に関与
することも明らかにされた（参照：Ready, M.P. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 83: 5053-5056(198
6))。しかしながら、これらの細胞内における正確なメ
カニズムとウイルスの阻害作用に対する正確な情報はま
だ知られていない。
ズムに対する研究が行われた結果、ＰＡＰは、他のリボ
ソーム不活性化蛋白質（ribosome-inactivating protei
ns：RIPs) のように真核生物の60Sリボソームのサブユ
ニット（ribosomal subunit)を不活性化させる作用を有
することが明らかにされた。また、ＰＡＰをコードする
遺伝子の塩基配列も明らかにされ（参照：Lin, Q. et a
l., Plant Mol. Biol., 17: 609-614(1991))、ＰＡＰ遺
伝子が多重遺伝子族（multigene family) の形態で存在
することも明らかにされた。更に、ＰＡＰは、細胞内で
合成されて細胞の外に分泌され、ウイルスの抑制に関与
することも明らかにされた（参照：Ready, M.P. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 83: 5053-5056(198
6))。しかしながら、これらの細胞内における正確なメ
カニズムとウイルスの阻害作用に対する正確な情報はま
だ知られていない。
【０００５】一方、ウイルスによる作物の被害は全世界
に及び、その被害状況は深刻なものとなっている。様々
な手段により、ウイルス耐性を有するトランスジェニッ
ク植物の作出に関する研究が活発に行われている。一例
として、ウイルスの外皮蛋白質をコードする遺伝子をタ
バコ植物で発現させる方法（参照：Nejidat, A. et a
l., Physiol. Plant, 80: 662-668(1990))やキュウリモ
ザイクウイルスの外皮蛋白質をコードする遺伝子をタバ
コ植物で発現させる方法（参照：Cuzzo M. et al., Bi
o/Technology, 6: 549-557(1988)) 等が試みられてき
た。しかし、これらの方法により付与されるウイルス抵
抗性の程度は低く、また、これらの方法により作出され
るトランスジェニック植物はウイルスに対し特異性を示
すので、多様なウイルスに対し抵抗性を付与することは
困難であった。従って、原核及び真核生物由来の抗ウイ
ルス性蛋白質を安定的に発現し、多様なウイルスに耐性
を有するトランスジェニック植物の開発が求められてい
た。
に及び、その被害状況は深刻なものとなっている。様々
な手段により、ウイルス耐性を有するトランスジェニッ
ク植物の作出に関する研究が活発に行われている。一例
として、ウイルスの外皮蛋白質をコードする遺伝子をタ
バコ植物で発現させる方法（参照：Nejidat, A. et a
l., Physiol. Plant, 80: 662-668(1990))やキュウリモ
ザイクウイルスの外皮蛋白質をコードする遺伝子をタバ
コ植物で発現させる方法（参照：Cuzzo M. et al., Bi
o/Technology, 6: 549-557(1988)) 等が試みられてき
た。しかし、これらの方法により付与されるウイルス抵
抗性の程度は低く、また、これらの方法により作出され
るトランスジェニック植物はウイルスに対し特異性を示
すので、多様なウイルスに対し抵抗性を付与することは
困難であった。従って、原核及び真核生物由来の抗ウイ
ルス性蛋白質を安定的に発現し、多様なウイルスに耐性
を有するトランスジェニック植物の開発が求められてい
た。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の目的
は、フイトラカ・インシュラリス・ナカイの cＤＮＡラ
イブラリーから単離したＰＩＰ遺伝子を含む組換えベク
ターを提供することにある。
は、フイトラカ・インシュラリス・ナカイの cＤＮＡラ
イブラリーから単離したＰＩＰ遺伝子を含む組換えベク
ターを提供することにある。
【０００７】本発明の第二の目的は、前記組換えベクタ
ーにより形質転換された細胞で抗ウイルス性の蛋白質で
あるＰＩＰを生成させて、ウイルスに耐性を有するトラ
ンスジェニック植物を作出する方法を提供することにあ
る。
ーにより形質転換された細胞で抗ウイルス性の蛋白質で
あるＰＩＰを生成させて、ウイルスに耐性を有するトラ
ンスジェニック植物を作出する方法を提供することにあ
る。
【０００８】本発明の第三の目的は、ウイルスに対する
耐性を植物に付与する方法を提供することにある。
耐性を植物に付与する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、フイトラ
カ・インシュラリス・ナカイの抗ウイルス性の蛋白質
（以下、「ＰＩＰ」という）がウイルスの増殖を抑制す
ることを見出した。本発明に関連して、ＰＩＰ遺伝子を
他の植物に導入するためにフイトラカ・インシュラリス
・ナカイの cＤＮＡライブラリーからＰＩＰ遺伝子を単
離した（参照：USP 5,348,865)。さらに、単離したＰＩ
Ｐ遺伝子をCaMV 35Sプロモーター（promoter) の下流で
発現するように発現ベクターを構築し、これを用いてバ
レイショを形質転換させた結果、形質転換されたバレイ
ショは多種のウイルスに抵抗性を示すことが分かった。
カ・インシュラリス・ナカイの抗ウイルス性の蛋白質
（以下、「ＰＩＰ」という）がウイルスの増殖を抑制す
ることを見出した。本発明に関連して、ＰＩＰ遺伝子を
他の植物に導入するためにフイトラカ・インシュラリス
・ナカイの cＤＮＡライブラリーからＰＩＰ遺伝子を単
離した（参照：USP 5,348,865)。さらに、単離したＰＩ
Ｐ遺伝子をCaMV 35Sプロモーター（promoter) の下流で
発現するように発現ベクターを構築し、これを用いてバ
レイショを形質転換させた結果、形質転換されたバレイ
ショは多種のウイルスに抵抗性を示すことが分かった。
【００１０】以下、本発明をより詳細に説明する。フイ
トラカ・インシュラリス・ナカイの葉からｍＲＮＡを単
離して精製し、これにより cＤＮＡライブラリーを作成
した後、フィトラカ・アメリカナ・エルの葉から単離し
たＰＡＰ遺伝子をプローブとして用いてＰＩＰ遺伝子を
単離した。
トラカ・インシュラリス・ナカイの葉からｍＲＮＡを単
離して精製し、これにより cＤＮＡライブラリーを作成
した後、フィトラカ・アメリカナ・エルの葉から単離し
たＰＡＰ遺伝子をプローブとして用いてＰＩＰ遺伝子を
単離した。
【００１１】ＰＩＰ遺伝子の塩基配列をジデオキシ法
（dideoxy chain tarmination)で決定した。単離したＰ
ＩＰ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chai
n reaction：以下「ＰＣＲ」という）で増幅し、バイナ
リーベクターであるpBI121にクローニングして組換え発
現ベクターpJMC201 を構築した。ＰＩＰ遺伝子を植物で
発現させるために、 pJMC201をアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス LBA 4404 に導入し、このアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスと植物のチューブデイスク
（tube disc)を共助培養して植物細胞を形質転換させ
た。トランスジェニック植物の細胞は、 100mg/lカナマ
イシン（kanamycin)と 500mg/lカベニシリン（carbenic
illin)を含有するシュート誘導ＭＳ選択培地でシュート
を誘導した。誘導されたシュートを根の誘導ＭＳ選択培
地に置床して根を誘導し、根が誘導された植物をポット
に移して馴化させ、引き続き生育させた。
（dideoxy chain tarmination)で決定した。単離したＰ
ＩＰ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chai
n reaction：以下「ＰＣＲ」という）で増幅し、バイナ
リーベクターであるpBI121にクローニングして組換え発
現ベクターpJMC201 を構築した。ＰＩＰ遺伝子を植物で
発現させるために、 pJMC201をアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス LBA 4404 に導入し、このアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスと植物のチューブデイスク
（tube disc)を共助培養して植物細胞を形質転換させ
た。トランスジェニック植物の細胞は、 100mg/lカナマ
イシン（kanamycin)と 500mg/lカベニシリン（carbenic
illin)を含有するシュート誘導ＭＳ選択培地でシュート
を誘導した。誘導されたシュートを根の誘導ＭＳ選択培
地に置床して根を誘導し、根が誘導された植物をポット
に移して馴化させ、引き続き生育させた。
【００１２】トランスジェニックバイレイショにＰＩＰ
遺伝子が導入されているかどうかは、サザンブロット
（Southern blot)法で検定し、その転写についても確認
した。種々のウイルス感染に対する抵抗性は、ＥＬＩＳ
Ａ法により検定した。その結果、トランスジェニックバ
レイショは組換えベクターにより、形質転換されてお
り、ＰＩＰは、トランスジェニック植物で適当に発現し
ており、また、ウイルスの増殖はトランスジェニックバ
レイショの中で発現した組換えＰＩＰによって効果的に
阻害されていることがわかった。以下、実施例により本
発明をより詳細に説明する。本発明の範囲は、これらの
実施例に限定されない。
遺伝子が導入されているかどうかは、サザンブロット
（Southern blot)法で検定し、その転写についても確認
した。種々のウイルス感染に対する抵抗性は、ＥＬＩＳ
Ａ法により検定した。その結果、トランスジェニックバ
レイショは組換えベクターにより、形質転換されてお
り、ＰＩＰは、トランスジェニック植物で適当に発現し
ており、また、ウイルスの増殖はトランスジェニックバ
レイショの中で発現した組換えＰＩＰによって効果的に
阻害されていることがわかった。以下、実施例により本
発明をより詳細に説明する。本発明の範囲は、これらの
実施例に限定されない。
【００１３】実施例１：ＰＩＰ遺伝子の単離 韓国の鬱陵島で自生しているフイトラカ・インシュラリ
ス・ナカイの葉を磨砕した後、ＲＮＡ抽出用緩衝液（0.
18M Tris, 0.09M LiCl, 4.5 mM EDTA, 1% SDS)を添加し
て10,000rpm で20分遠心分離し、上澄液を取ってフェノ
ール／クロロホルムで抽出（phenol/chloroform extrac
tion) を行って蛋白質及び種々の不純物を除去した。こ
の後、クロロホルムで抽出（chloroform extraction)を
１回行い、上澄液を取ってLiClを用いて沈澱させて全Ｒ
ＮＡを単離した。単離した全細胞ＲＮＡからオリゴ(dT)
セルロースカラムを用いてｍＲＮＡを単離し、単離した
ｍＲＮＡからＺＡＰ-cＤＮＡ合成キット（Stratagene,
USA)を用いて cＤＮＡを合成した。合成された cＤＮＡ
に EcoRIアダプター（adapter)をつけた後、セファクリ
ル（Sephacryl) S-400スパンカラムで、この cＤＮＡを
分子量によって分画した。分画された cＤＮＡをUni-Za
p XRベクター（Stratagene, USA)と結合させた後、パッ
ケージング抽出物（packaging extract)を使用してイン
ビトロパッケージング（in vitro packaging) を行っ
た。
ス・ナカイの葉を磨砕した後、ＲＮＡ抽出用緩衝液（0.
18M Tris, 0.09M LiCl, 4.5 mM EDTA, 1% SDS)を添加し
て10,000rpm で20分遠心分離し、上澄液を取ってフェノ
ール／クロロホルムで抽出（phenol/chloroform extrac
tion) を行って蛋白質及び種々の不純物を除去した。こ
の後、クロロホルムで抽出（chloroform extraction)を
１回行い、上澄液を取ってLiClを用いて沈澱させて全Ｒ
ＮＡを単離した。単離した全細胞ＲＮＡからオリゴ(dT)
セルロースカラムを用いてｍＲＮＡを単離し、単離した
ｍＲＮＡからＺＡＰ-cＤＮＡ合成キット（Stratagene,
USA)を用いて cＤＮＡを合成した。合成された cＤＮＡ
に EcoRIアダプター（adapter)をつけた後、セファクリ
ル（Sephacryl) S-400スパンカラムで、この cＤＮＡを
分子量によって分画した。分画された cＤＮＡをUni-Za
p XRベクター（Stratagene, USA)と結合させた後、パッ
ケージング抽出物（packaging extract)を使用してイン
ビトロパッケージング（in vitro packaging) を行っ
た。
【００１４】作成された cＤＮＡライブラリーからＰＩ
Ｐ遺伝子を単離するために、フィトラカ・アメリカナ・
エルの cＤＮＡライブラリー（参照：Moon, Y.H. et a
l., Mol. Cells, 3: 189-194(1993))からＰＡＰ遺伝子
の0.５kb EcoRI断片を単離し、これをDIG-Labeling & D
etectionキット（Boehringer Mannheim, Germany) を用
いて標識し、プローブとして使用した。先ず、 82-mmペ
トリ皿（petri dish) に約２×104pfu のプラークが形
成されるように大腸菌（E.coli) XLl-Blueにファージ
（phage)を感染させて、37℃で12時間培養してスクリー
ニングを行った。１次スクリーニングから得たクローン
のうちで五つのクローンを２次スクリーニングに使用し
た。２次スクリーニングは前記と同一方法で行ったが、
プラーク数を５×102pfu に調整して行った。２次スク
リーニングから得たクローンのうち四つの組換えUni-ZA
P XRファージがもっているファージミド（phagemid) を
大腸菌であるE.coli XLl-Blue に移すために、R408ヘル
パーファージ（helper phage)を用いてインビボでの切
り出し（in vivo excision) を行った。その後、生成さ
れたコロニーを各々三つずつ選別してアルカリ溶菌（al
kaline detergent) 法によりプラスミドを分離し、 Eco
RIとXhoIで二重切断してプローブであるＰＡＰ遺伝子の
0.５kb EcoRI切片とのハイブリダイゼーションによりＰ
ＩＰ遺伝子を有するクローンを選別した。
Ｐ遺伝子を単離するために、フィトラカ・アメリカナ・
エルの cＤＮＡライブラリー（参照：Moon, Y.H. et a
l., Mol. Cells, 3: 189-194(1993))からＰＡＰ遺伝子
の0.５kb EcoRI断片を単離し、これをDIG-Labeling & D
etectionキット（Boehringer Mannheim, Germany) を用
いて標識し、プローブとして使用した。先ず、 82-mmペ
トリ皿（petri dish) に約２×104pfu のプラークが形
成されるように大腸菌（E.coli) XLl-Blueにファージ
（phage)を感染させて、37℃で12時間培養してスクリー
ニングを行った。１次スクリーニングから得たクローン
のうちで五つのクローンを２次スクリーニングに使用し
た。２次スクリーニングは前記と同一方法で行ったが、
プラーク数を５×102pfu に調整して行った。２次スク
リーニングから得たクローンのうち四つの組換えUni-ZA
P XRファージがもっているファージミド（phagemid) を
大腸菌であるE.coli XLl-Blue に移すために、R408ヘル
パーファージ（helper phage)を用いてインビボでの切
り出し（in vivo excision) を行った。その後、生成さ
れたコロニーを各々三つずつ選別してアルカリ溶菌（al
kaline detergent) 法によりプラスミドを分離し、 Eco
RIとXhoIで二重切断してプローブであるＰＡＰ遺伝子の
0.５kb EcoRI切片とのハイブリダイゼーションによりＰ
ＩＰ遺伝子を有するクローンを選別した。
【００１５】塩基配列を決定するために単離したクロー
ンのうち、ハイブリダイゼーションによるスポットが一
番大きいクローンを選択して、pBluescript SK(-) ベク
ターでサーブクローニング(subcloning)させた。このク
ローンのＤＮＡをEcoRI とXhoIで二重切断し、自己連結
（self-ligation)を行ってコンピテント E.coli XLl-Bl
ue (competent E.coli XLl-Blue)に導入した。その後、
50μg/mlアンピシリンを含有するＬＢ培地（10g/l Bact
otrypton, 5g/l Yeast extract, 5g/l NaCl, pH 7.5)で
生成されたコロニーを選別し、アルカリ溶菌法によりプ
ラスミドを単離して、0.７kb及び0.５kbのEcoRI/XhoI切
片をもっているコロニーを選別した。これらコロニーか
らＤＮＡを単離し、ジデオキシ法によりＰＩＰ cＤＮＡ
の塩基配列を決定し（参照：Sanger, F., Science, 21
4: 1205-1210(1981))、それから翻訳されるアミノ酸配
列を推定した（参照：図１) 。図１から分かるように、
開始コドン及び終結コドン（＊) を含んで918bp からな
る一つのオープンリードフレーム（open reading fram
e) で構成されていることを確認した。
ンのうち、ハイブリダイゼーションによるスポットが一
番大きいクローンを選択して、pBluescript SK(-) ベク
ターでサーブクローニング(subcloning)させた。このク
ローンのＤＮＡをEcoRI とXhoIで二重切断し、自己連結
（self-ligation)を行ってコンピテント E.coli XLl-Bl
ue (competent E.coli XLl-Blue)に導入した。その後、
50μg/mlアンピシリンを含有するＬＢ培地（10g/l Bact
otrypton, 5g/l Yeast extract, 5g/l NaCl, pH 7.5)で
生成されたコロニーを選別し、アルカリ溶菌法によりプ
ラスミドを単離して、0.７kb及び0.５kbのEcoRI/XhoI切
片をもっているコロニーを選別した。これらコロニーか
らＤＮＡを単離し、ジデオキシ法によりＰＩＰ cＤＮＡ
の塩基配列を決定し（参照：Sanger, F., Science, 21
4: 1205-1210(1981))、それから翻訳されるアミノ酸配
列を推定した（参照：図１) 。図１から分かるように、
開始コドン及び終結コドン（＊) を含んで918bp からな
る一つのオープンリードフレーム（open reading fram
e) で構成されていることを確認した。
【００１６】実施例２：発現ベクターpJMC201の構築 実施例１で単離したＰＩＰ cＤＮＡをCaMV 35Sプロモー
ターの下流で発現させるために、Ｎ−末端プライマー
（N-terminal primer)及びＣ−末端プライマー（C-term
inal primer)として 5'-CGGGATCCAGCTAGTAGGAAGGGAAGAT
G-3'及び 5'-CGGGATCCAAACTAATCACCAAGATTAGC-3'をＤＮ
Ａ合成機（DNA synthesizer, Applied Biosystems In
c., USA)を用いて合成した。その後、VentTM ＤＮＡポ
リメラーゼ（NEB, USA) 及びＤＮＡサーマルサイクラー
（Thermal Cycler, Cetus/Perkin-Elmer, USA)を使用し
て、変性（denaturation) (95℃、30秒) 、結合（annea
ling) (95℃、30秒) 、延長（extension) (72℃、30秒)
を 300回行ってＰＩＰ遺伝子を増幅した。増幅したＤ
ＮＡを電気泳動溶出 (electroelution) し BamHIで切断
した後、アガロースゲルで単離し単方向電気泳動溶出
（unidirectional electroelution)を行ってＰＩＰ遺伝
子の1.０kb BamHI断片を単離した。
ターの下流で発現させるために、Ｎ−末端プライマー
（N-terminal primer)及びＣ−末端プライマー（C-term
inal primer)として 5'-CGGGATCCAGCTAGTAGGAAGGGAAGAT
G-3'及び 5'-CGGGATCCAAACTAATCACCAAGATTAGC-3'をＤＮ
Ａ合成機（DNA synthesizer, Applied Biosystems In
c., USA)を用いて合成した。その後、VentTM ＤＮＡポ
リメラーゼ（NEB, USA) 及びＤＮＡサーマルサイクラー
（Thermal Cycler, Cetus/Perkin-Elmer, USA)を使用し
て、変性（denaturation) (95℃、30秒) 、結合（annea
ling) (95℃、30秒) 、延長（extension) (72℃、30秒)
を 300回行ってＰＩＰ遺伝子を増幅した。増幅したＤ
ＮＡを電気泳動溶出 (electroelution) し BamHIで切断
した後、アガロースゲルで単離し単方向電気泳動溶出
（unidirectional electroelution)を行ってＰＩＰ遺伝
子の1.０kb BamHI断片を単離した。
【００１７】バイナリーベクターpBI121 (Clonetech.,
USA)に前記単離した1.０kbのＤＮＡ断片をクローニング
するためにpBI121の Nosターミネーター（terminator)
部位にあるSstI制限酵素の切断部位を BamHIに置換し
た。これは、pBI121をSstIで切断し、クレノウ断片（Kl
enow's fragment)で処理した後、 BamHIリンカーを連結
して行った。このＤＮＡを BamHIで切断した後、アガロ
ースゲルで単離し単方向電気泳動溶出を行ってpBI121の
11.06kb BamHI断片を単離した。前記単離したＰＩＰ遺
伝子の1.０kb BamHI断片及びpBI121の11.06kb BamHI 断
片をＴ4 ＤＮＡリガーゼで連結して発現ベクターpJMC20
1 を構築した。CaCl2 溶液を処理して誘導されたコンピ
テント大腸菌（E.coli) XLl-Blue菌株に前記構築された
pJMC201 を導入した。前記発現ベクターpJMC201 を構築
する一連の過程を図２に示した。図２において、ＮＯＳ
は Nosターミネーター；ＲＢ（right border) は植物体
における発現部分を限定するライトボーダー；ＬＢ（le
ft border)は植物体における発現部分を限定するレフト
ボーダー；CaMV 35SはCaMV 35Sプロモーター；ＧＵＳは
gus遺伝子を各々示す。一方、図３はこのように構築さ
れた植物体形質転換用のベクターであるpJMC201 をBamH
I で切断した後、0.８％アガロースゲル上で電気泳動し
た結果を示す図であり、第Ｍレーンは分子量マーカとし
てλＤＮＡをHindIIIで切断したものであり、第pJMC201
レーンは本発明の完成されたpJMC201をBamHI で切断し
たものである。図３の第pJMC201 レーンから分かるよう
に、 1.0kb ＤＮＡ断片及び11.0kb ＤＮＡを示す二つ
のバンドを確認することができた。
USA)に前記単離した1.０kbのＤＮＡ断片をクローニング
するためにpBI121の Nosターミネーター（terminator)
部位にあるSstI制限酵素の切断部位を BamHIに置換し
た。これは、pBI121をSstIで切断し、クレノウ断片（Kl
enow's fragment)で処理した後、 BamHIリンカーを連結
して行った。このＤＮＡを BamHIで切断した後、アガロ
ースゲルで単離し単方向電気泳動溶出を行ってpBI121の
11.06kb BamHI断片を単離した。前記単離したＰＩＰ遺
伝子の1.０kb BamHI断片及びpBI121の11.06kb BamHI 断
片をＴ4 ＤＮＡリガーゼで連結して発現ベクターpJMC20
1 を構築した。CaCl2 溶液を処理して誘導されたコンピ
テント大腸菌（E.coli) XLl-Blue菌株に前記構築された
pJMC201 を導入した。前記発現ベクターpJMC201 を構築
する一連の過程を図２に示した。図２において、ＮＯＳ
は Nosターミネーター；ＲＢ（right border) は植物体
における発現部分を限定するライトボーダー；ＬＢ（le
ft border)は植物体における発現部分を限定するレフト
ボーダー；CaMV 35SはCaMV 35Sプロモーター；ＧＵＳは
gus遺伝子を各々示す。一方、図３はこのように構築さ
れた植物体形質転換用のベクターであるpJMC201 をBamH
I で切断した後、0.８％アガロースゲル上で電気泳動し
た結果を示す図であり、第Ｍレーンは分子量マーカとし
てλＤＮＡをHindIIIで切断したものであり、第pJMC201
レーンは本発明の完成されたpJMC201をBamHI で切断し
たものである。図３の第pJMC201 レーンから分かるよう
に、 1.0kb ＤＮＡ断片及び11.0kb ＤＮＡを示す二つ
のバンドを確認することができた。
【００１８】実施例３：アグロバクテリウム・ツメファ
シエンスを媒体としたバレイショ細胞の形質転換 実施例２で構築した植物形質転換用の発現ベクターpJMC
201 でアグロバクテリウム・ツメファシエンス LBA 440
4 を形質転換するために、凍結−融解（freeze-thawin
g) 法を使用した（参照：An, G. et al.,Plant Molecul
ar Biology Manual, Kluwer Academic Pubishers, A3:
1-19(1988))。pJMC201 が導入されたアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス LBA 4404 を選別するために、ア
グロバクテリウムプラスミド急速スクリーン（Agrobact
erium plasmid quick-screen) 法により各々ＤＮＡを単
離し、 BamHIで切断して形質転換されたかどうかを確認
した。このように形質転換されたアグロバクテリウム・
ツメファシエンス LBA 4404は1994年７月13日付けに国
際寄託機関である社団法人韓国腫菌協会の付設の韓国微
生物保存センター（ＫＣＣＭ) に寄託番号KCCM-10056で
寄託された。
シエンスを媒体としたバレイショ細胞の形質転換 実施例２で構築した植物形質転換用の発現ベクターpJMC
201 でアグロバクテリウム・ツメファシエンス LBA 440
4 を形質転換するために、凍結−融解（freeze-thawin
g) 法を使用した（参照：An, G. et al.,Plant Molecul
ar Biology Manual, Kluwer Academic Pubishers, A3:
1-19(1988))。pJMC201 が導入されたアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス LBA 4404 を選別するために、ア
グロバクテリウムプラスミド急速スクリーン（Agrobact
erium plasmid quick-screen) 法により各々ＤＮＡを単
離し、 BamHIで切断して形質転換されたかどうかを確認
した。このように形質転換されたアグロバクテリウム・
ツメファシエンス LBA 4404は1994年７月13日付けに国
際寄託機関である社団法人韓国腫菌協会の付設の韓国微
生物保存センター（ＫＣＣＭ) に寄託番号KCCM-10056で
寄託された。
【００１９】前記pJMC201 で形質転換されたアグロバク
テリウム・ツメファシエンス LBA 4404 (KCCM-10056)を
28℃、200rpmの条件で18時間振盪培養した。培養後、細
胞を得てＭＳ培地で１乃至２×103 細胞／mlになるよう
に希釈した後、植物細胞の形質転換に利用した。バレイ
ショの塊茎（potato tuber) の表面を70％のエタノール
で１分、50％過塩素酸で２分間洗浄した後、滅菌された
蒸留水で３回洗浄した。バレイショの塊茎を長さ１cmと
切ってチューブデイスクを作製した。
テリウム・ツメファシエンス LBA 4404 (KCCM-10056)を
28℃、200rpmの条件で18時間振盪培養した。培養後、細
胞を得てＭＳ培地で１乃至２×103 細胞／mlになるよう
に希釈した後、植物細胞の形質転換に利用した。バレイ
ショの塊茎（potato tuber) の表面を70％のエタノール
で１分、50％過塩素酸で２分間洗浄した後、滅菌された
蒸留水で３回洗浄した。バレイショの塊茎を長さ１cmと
切ってチューブデイスクを作製した。
【００２０】バレイショのチューブデイスクを、pJMC20
1 を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス LBA
4404懸濁液に30分間処理して接種した後、1.0mg/l ゼ
アチン（zeatin) と0.5mg/l ＩＡＡ (3-β-indoleacr
ylic acid)を添加したＭＳ固形培地に置床して20℃、暗
所で48時間共助培養した。共助培養後、1.0mg/l ゼアチ
ン、0.5mg/l ＩＡＡ、500mg/l カベニシリンと100mg/l
カナマイシンを添加したＭＳ固形培地に置床して、20
℃、3000Lux 、16時間明／８時間暗の周期で培養してシ
ュートを誘導した。誘導されたシュートは250mg/l カベ
ニシリンと100mg/l カナマイシンが添加されたＭＳ基本
培地に移植して根の形成を誘導し、根が形成されたトラ
ンスジェニックバレイショはポットに移植して馴化さ
せ、遺伝子の分析及びウイルス抵抗性の検定に利用し
た。
1 を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス LBA
4404懸濁液に30分間処理して接種した後、1.0mg/l ゼ
アチン（zeatin) と0.5mg/l ＩＡＡ (3-β-indoleacr
ylic acid)を添加したＭＳ固形培地に置床して20℃、暗
所で48時間共助培養した。共助培養後、1.0mg/l ゼアチ
ン、0.5mg/l ＩＡＡ、500mg/l カベニシリンと100mg/l
カナマイシンを添加したＭＳ固形培地に置床して、20
℃、3000Lux 、16時間明／８時間暗の周期で培養してシ
ュートを誘導した。誘導されたシュートは250mg/l カベ
ニシリンと100mg/l カナマイシンが添加されたＭＳ基本
培地に移植して根の形成を誘導し、根が形成されたトラ
ンスジェニックバレイショはポットに移植して馴化さ
せ、遺伝子の分析及びウイルス抵抗性の検定に利用し
た。
【００２１】前記共助培養の25日後にシュートが誘導さ
れ（参照：図４（Ａ))、大部分のシュートから正常な根
が形成された（参照：図４（Ｂ))。根が形成された二つ
のトランスジェニックバレイショを各々「line 2011」、
「line 2012」と命名し、これらをポットに各々移植して
馴化させ、植物体の草丈が15cmに達した時、下記の実施
例４、５及び６におけるＰＩＰ遺伝子分析に供し、ウイ
ルスに対する抵抗性を検定した。
れ（参照：図４（Ａ))、大部分のシュートから正常な根
が形成された（参照：図４（Ｂ))。根が形成された二つ
のトランスジェニックバレイショを各々「line 2011」、
「line 2012」と命名し、これらをポットに各々移植して
馴化させ、植物体の草丈が15cmに達した時、下記の実施
例４、５及び６におけるＰＩＰ遺伝子分析に供し、ウイ
ルスに対する抵抗性を検定した。
【００２２】実施例４：トランスジェニックバレイショ
におけるＰＩＰ遺伝子の分析 トランスジェニックバレイショから全細胞ＤＮＡを抽出
しＰＣＲ方法によりＰＩＰ遺伝子を増幅した後、バレイ
ショのゲノム内にＰＩＰ遺伝子が導入されたかどうかを
確認した。前記実施例２と同一の方法により変性（95
℃、１分) 、結合（60℃、２分) 、延長（72℃、２分)
を40回行ってＰＩＰ遺伝子を増幅した。増幅したＰＩＰ
遺伝子を0.８％アガロースゲルで電気泳動した結果を図
５（Ａ）に示した。図５（Ａ）において、第１レーンは
分子量マーカであり、λＤＮＡをHindIII で切断したも
の；第２レーンはトランスジェニックバレイショ line
2011から全細胞ＤＮＡを抽出し、前記のＰＣＲ方法によ
り増幅したもの；第３レーンはトランスジェニックバレ
イショ line 2012 から全細胞ＤＮＡを抽出し、前記の
ＰＣＲ方法により増幅したもの；第４レーンは非トラン
スジェニックバレイショから全細胞ＤＮＡを抽出し、前
記のＰＣＲ方法により増幅したもの；、第５レーンはフ
イトラカ・インシュラリス・ナカイ cＤＮＡライブラリ
ーからＰＩＰ遺伝子を単離し増幅したものを各々示す。
図５（Ａ）の第２、３及び５レーンでは1.０kbのＤＮＡ
断片が見られるが、第４レーンではこの断片が見えない
ので、ＰＩＰ遺伝子がバレイショのゲノム内に挿入され
たことが分かる。
におけるＰＩＰ遺伝子の分析 トランスジェニックバレイショから全細胞ＤＮＡを抽出
しＰＣＲ方法によりＰＩＰ遺伝子を増幅した後、バレイ
ショのゲノム内にＰＩＰ遺伝子が導入されたかどうかを
確認した。前記実施例２と同一の方法により変性（95
℃、１分) 、結合（60℃、２分) 、延長（72℃、２分)
を40回行ってＰＩＰ遺伝子を増幅した。増幅したＰＩＰ
遺伝子を0.８％アガロースゲルで電気泳動した結果を図
５（Ａ）に示した。図５（Ａ）において、第１レーンは
分子量マーカであり、λＤＮＡをHindIII で切断したも
の；第２レーンはトランスジェニックバレイショ line
2011から全細胞ＤＮＡを抽出し、前記のＰＣＲ方法によ
り増幅したもの；第３レーンはトランスジェニックバレ
イショ line 2012 から全細胞ＤＮＡを抽出し、前記の
ＰＣＲ方法により増幅したもの；第４レーンは非トラン
スジェニックバレイショから全細胞ＤＮＡを抽出し、前
記のＰＣＲ方法により増幅したもの；、第５レーンはフ
イトラカ・インシュラリス・ナカイ cＤＮＡライブラリ
ーからＰＩＰ遺伝子を単離し増幅したものを各々示す。
図５（Ａ）の第２、３及び５レーンでは1.０kbのＤＮＡ
断片が見られるが、第４レーンではこの断片が見えない
ので、ＰＩＰ遺伝子がバレイショのゲノム内に挿入され
たことが分かる。
【００２３】一方、ＰＣＲで増幅した1.0kb ＤＮＡ断片
がＰＩＰ遺伝子であるかどうかを検定するために、ＰＡ
Ｐ cＤＮＡの0.５kb EcoRI断片をDIG-Labelling & Dete
ction キットを用いて標識し、これをプローブとしてサ
ザンブロット分析し、この結果を図５（Ｂ）に示した。
図５（Ｂ）において、第１レーンはトランスジェニック
バレイショ line 2011からＰＣＲで増幅したＰＩＰ遺伝
子；第２レーンはトランスジェニックバレイショ line
2012からＰＣＲで増幅したＰＩＰ遺伝子；第３レーンは
非トランスジェニックバレイショから全細胞ＤＮＡを抽
出し、前記ＰＣＲ方法で増幅したもの；第４レーンはフ
イトラカ・インシュラリス・ナカイ cＤＮＡライブラリ
ーから単離・増幅されたＰＩＰ遺伝子を各々示す。図５
（Ｂ）の第１、２及び４レーンではプローブとハイブリ
ダイゼーションされたＰＩＰ遺伝子のバンドが現われる
が、第３レーンではこのバンドが現れないことからみ
て、増幅されたＤＮＡがＰＩＰ遺伝子であることが確認
できた。
がＰＩＰ遺伝子であるかどうかを検定するために、ＰＡ
Ｐ cＤＮＡの0.５kb EcoRI断片をDIG-Labelling & Dete
ction キットを用いて標識し、これをプローブとしてサ
ザンブロット分析し、この結果を図５（Ｂ）に示した。
図５（Ｂ）において、第１レーンはトランスジェニック
バレイショ line 2011からＰＣＲで増幅したＰＩＰ遺伝
子；第２レーンはトランスジェニックバレイショ line
2012からＰＣＲで増幅したＰＩＰ遺伝子；第３レーンは
非トランスジェニックバレイショから全細胞ＤＮＡを抽
出し、前記ＰＣＲ方法で増幅したもの；第４レーンはフ
イトラカ・インシュラリス・ナカイ cＤＮＡライブラリ
ーから単離・増幅されたＰＩＰ遺伝子を各々示す。図５
（Ｂ）の第１、２及び４レーンではプローブとハイブリ
ダイゼーションされたＰＩＰ遺伝子のバンドが現われる
が、第３レーンではこのバンドが現れないことからみ
て、増幅されたＤＮＡがＰＩＰ遺伝子であることが確認
できた。
【００２４】実施例５：トランスジェニックバレイショ
におけるＰＩＰ遺伝子の発現確認 トランスジェニックバレイショからpolyA Ttract Syste
m 1000 (Promega, USA) を用いて全細胞ｍＲＮＡを単離
し、単離したｍＲＮＡから GeneAmp RNA PCR Core Kit
（Perkin-Elmer, USA)を用いて cＤＮＡを合成した。そ
の後、前記実施例２と同一方法により変性（95℃、１
分) 、結合（60℃、１分) 、延長（60℃、１分) を35回
行ってＰＩＰ cＤＮＡを増幅した。増幅したＰＩＰ cＤ
ＮＡを0.８％アガロースゲルで電気泳動した結果を図６
に示した。図６において、Ｍレーンは分子量マーカであ
り、λＤＮＡをHindIII で切断したもの；第１レーンは
トランスジェニックバレイショ line 2011から全細胞ｍ
ＲＮＡを抽出し、これから合成したｃＤＮＡを前記のＰ
ＣＲ方法で増幅したもの；第２レーンはトランスジェニ
ックバレイショ line 2012から全細胞ｍＲＮＡを抽出
し、これから合成したｃＤＮＡを前記のＰＣＲ方法で増
幅したもの；第３レーンは非トランスジェニックバレイ
ショから全細胞ｍＲＮＡを抽出し、これから合成したｃ
ＤＮＡを前記のＰＣＲ方法で増幅したもの；及び、第４
レーンはフイトラカ・インシュラリス・ナカイ cＤＮＡ
ライブラリーからＰＩＰ遺伝子を単離・増幅したものを
各々示す。図６の第１、２及び４レーンではＰＩＰ遺伝
子に相当する0.95kbのＤＮＡ断片が見られるが、第３レ
ーンではこの断片が見えないので、ＰＩＰ遺伝子がバレ
イショのゲノム内に挿入されてトランスジェニックバレ
イショで良く発現されることが分かる。
におけるＰＩＰ遺伝子の発現確認 トランスジェニックバレイショからpolyA Ttract Syste
m 1000 (Promega, USA) を用いて全細胞ｍＲＮＡを単離
し、単離したｍＲＮＡから GeneAmp RNA PCR Core Kit
（Perkin-Elmer, USA)を用いて cＤＮＡを合成した。そ
の後、前記実施例２と同一方法により変性（95℃、１
分) 、結合（60℃、１分) 、延長（60℃、１分) を35回
行ってＰＩＰ cＤＮＡを増幅した。増幅したＰＩＰ cＤ
ＮＡを0.８％アガロースゲルで電気泳動した結果を図６
に示した。図６において、Ｍレーンは分子量マーカであ
り、λＤＮＡをHindIII で切断したもの；第１レーンは
トランスジェニックバレイショ line 2011から全細胞ｍ
ＲＮＡを抽出し、これから合成したｃＤＮＡを前記のＰ
ＣＲ方法で増幅したもの；第２レーンはトランスジェニ
ックバレイショ line 2012から全細胞ｍＲＮＡを抽出
し、これから合成したｃＤＮＡを前記のＰＣＲ方法で増
幅したもの；第３レーンは非トランスジェニックバレイ
ショから全細胞ｍＲＮＡを抽出し、これから合成したｃ
ＤＮＡを前記のＰＣＲ方法で増幅したもの；及び、第４
レーンはフイトラカ・インシュラリス・ナカイ cＤＮＡ
ライブラリーからＰＩＰ遺伝子を単離・増幅したものを
各々示す。図６の第１、２及び４レーンではＰＩＰ遺伝
子に相当する0.95kbのＤＮＡ断片が見られるが、第３レ
ーンではこの断片が見えないので、ＰＩＰ遺伝子がバレ
イショのゲノム内に挿入されてトランスジェニックバレ
イショで良く発現されることが分かる。
【００２５】実施例６：トランスジェニックバレイショ
のウイルス抵抗性の検定 トランスジェニックバレイショにポテトウイルスＸ（po
tato virus X：以下、「ＰＶＸ」という) 、ポテトウイ
ルスＹ（potato virus Y：以下、「ＰＶＹ」という) 、
及びポテトリーフロウイルス（potato leafroll virus
：以下、「ＰＬＲＶ」という) を各々接種した。即
ち、カーボランダム（carborundom)を葉面に撒布した
後、各々のＰＶＸ及びＰＶＹウイルス液を脱脂綿につけ
て葉面を擦ることによりバレイショの表面に微細な傷を
つけてＰＶＸとＰＶＹを接種し、ＲＬＲＶの場合は、Ｒ
ＬＲＶに感染したバレイショの葉を２乃至３日間餌とし
て与えたモモアカアブラムシ（Myzus persicae) を媒体
として接種し、その後殺虫剤を使用してモモアカアブラ
ムシを除去した。接種後、15日、30日、45日の間隔で接
種部位の上位の葉を取って、クラーク（Clark)等の方法
を多少修正した ELISA法でウイルスの濃度を測定した
（参照：Clark, M.F. et al., J. Gen. Virol., 34:475
-483(1977))。先ず、コーテイング緩衝液（0.２g/l ア
ゼ化ナトリウム、2.93g/l NaHCO3 及び1.5g/l Na2CO3
からなる緩衝液（pH 9.6) ）でＰＶＸ、ＰＶＹ及びＰＬ
ＲＶ各々に対するポリクローナル抗体（polyclonal ant
ibody: BIOREBAAG, Germany) を１／１０００に希釈
し、この希釈抗体を98ウェルプレートの各ウェル当たり
200μl ずつ接種して、37℃で４時間各ウェルをコーテ
ィングした。その後、洗浄用緩衝液（washing buffer,
0.05％ Tween 20 が含有されたＰＢＳ緩衝液）で３回洗
浄し、トランスジェニックバレイショ line 2011および
line 2012各々の葉から汁液を抽出し、ＰＢＳ緩衝液
（phosphate buffered salinesolution) で１／２０に
希釈し、各ウェル当たり 200μl ずつ接種して６℃で16
時間静置して反応させた。３回の洗浄後、ＰＶＸ、ＰＶ
Ｙ及びＰＬＲＶ各々に対するポリクローナルアルカリホ
スファターゼが連結されたＩgＧ（polyclonal alkaline
phosphatase-conjugated IgG:BIOREBA AG, Garmany)
を１／１０００に希釈して処理し、１mg/ml リン酸ｐ−
ニトロフェニル（p-nitrophenyl phosphate)を各ウェル
当たり 200μl ずつ処理して発色させ、30分後に405nm
で吸光度を測定してウイルスに感染したかどうかを確認
した。
のウイルス抵抗性の検定 トランスジェニックバレイショにポテトウイルスＸ（po
tato virus X：以下、「ＰＶＸ」という) 、ポテトウイ
ルスＹ（potato virus Y：以下、「ＰＶＹ」という) 、
及びポテトリーフロウイルス（potato leafroll virus
：以下、「ＰＬＲＶ」という) を各々接種した。即
ち、カーボランダム（carborundom)を葉面に撒布した
後、各々のＰＶＸ及びＰＶＹウイルス液を脱脂綿につけ
て葉面を擦ることによりバレイショの表面に微細な傷を
つけてＰＶＸとＰＶＹを接種し、ＲＬＲＶの場合は、Ｒ
ＬＲＶに感染したバレイショの葉を２乃至３日間餌とし
て与えたモモアカアブラムシ（Myzus persicae) を媒体
として接種し、その後殺虫剤を使用してモモアカアブラ
ムシを除去した。接種後、15日、30日、45日の間隔で接
種部位の上位の葉を取って、クラーク（Clark)等の方法
を多少修正した ELISA法でウイルスの濃度を測定した
（参照：Clark, M.F. et al., J. Gen. Virol., 34:475
-483(1977))。先ず、コーテイング緩衝液（0.２g/l ア
ゼ化ナトリウム、2.93g/l NaHCO3 及び1.5g/l Na2CO3
からなる緩衝液（pH 9.6) ）でＰＶＸ、ＰＶＹ及びＰＬ
ＲＶ各々に対するポリクローナル抗体（polyclonal ant
ibody: BIOREBAAG, Germany) を１／１０００に希釈
し、この希釈抗体を98ウェルプレートの各ウェル当たり
200μl ずつ接種して、37℃で４時間各ウェルをコーテ
ィングした。その後、洗浄用緩衝液（washing buffer,
0.05％ Tween 20 が含有されたＰＢＳ緩衝液）で３回洗
浄し、トランスジェニックバレイショ line 2011および
line 2012各々の葉から汁液を抽出し、ＰＢＳ緩衝液
（phosphate buffered salinesolution) で１／２０に
希釈し、各ウェル当たり 200μl ずつ接種して６℃で16
時間静置して反応させた。３回の洗浄後、ＰＶＸ、ＰＶ
Ｙ及びＰＬＲＶ各々に対するポリクローナルアルカリホ
スファターゼが連結されたＩgＧ（polyclonal alkaline
phosphatase-conjugated IgG:BIOREBA AG, Garmany)
を１／１０００に希釈して処理し、１mg/ml リン酸ｐ−
ニトロフェニル（p-nitrophenyl phosphate)を各ウェル
当たり 200μl ずつ処理して発色させ、30分後に405nm
で吸光度を測定してウイルスに感染したかどうかを確認
した。
【００２６】図７は、ウイルスを接種したから45日後に
ELISA法で罹病対照区、健全対照区、 line 2011及び l
ine 2012の各ウイルスの濃度を測定した結果を示す。図
７から分かるように、トランスジェニックバレイショ l
ine 2011及び line 2012に存在するＰＶＸ及びＰＶＹの
濃度は罹病対照区に比べてかなり低く、特に line 2012
の場合には健全対照区よりもウイルスの濃度が低いこと
が分かった。また、ＰＬＲＶについても、トランスジェ
ニックバレイショは罹病対照区より低いウイルスの濃度
を示した。
ELISA法で罹病対照区、健全対照区、 line 2011及び l
ine 2012の各ウイルスの濃度を測定した結果を示す。図
７から分かるように、トランスジェニックバレイショ l
ine 2011及び line 2012に存在するＰＶＸ及びＰＶＹの
濃度は罹病対照区に比べてかなり低く、特に line 2012
の場合には健全対照区よりもウイルスの濃度が低いこと
が分かった。また、ＰＬＲＶについても、トランスジェ
ニックバレイショは罹病対照区より低いウイルスの濃度
を示した。
【００２７】一方、トランスジェニックバレイショ及び
非トランスジェニックバレイショにＰＶＹを機械的に感
染させた時、トランスジェニックバレイショはウイルス
に対する抵抗性を示したが（参照：図８（Ａ))、罹病対
照区（参照：図８（Ｂ))では葉脈に沿ってスポットが現
れ、壊死したり、葉の周りが上方に巻かれる等の病徴が
観察された。この結果、ＰＩＰはトランスジェニックバ
レイショでＰＶＸ、ＰＶＹウイルス増殖を効果的に抑制
し、これらウイルスに対する抵抗性を付与することが明
らかになった。これに対してＰＬＲＶでは必ずしも高い
抵抗性を付与するものではないと確認された。
非トランスジェニックバレイショにＰＶＹを機械的に感
染させた時、トランスジェニックバレイショはウイルス
に対する抵抗性を示したが（参照：図８（Ａ))、罹病対
照区（参照：図８（Ｂ))では葉脈に沿ってスポットが現
れ、壊死したり、葉の周りが上方に巻かれる等の病徴が
観察された。この結果、ＰＩＰはトランスジェニックバ
レイショでＰＶＸ、ＰＶＹウイルス増殖を効果的に抑制
し、これらウイルスに対する抵抗性を付与することが明
らかになった。これに対してＰＬＲＶでは必ずしも高い
抵抗性を付与するものではないと確認された。
【００２８】
【発明の効果】以上説明したように、本発明は、抗ウイ
ルス蛋白質を産生するトランスジェニック植物を作出す
る方法を提供する。この植物は、フイトラカ・インシュ
ラリス・ナカイの抗ウイルス蛋白質を発現する組換えベ
クターにより形質転換される。また、本発明のトランス
ジェニックバレイショは、前記組換えベクターにより適
当に形質転換されていた。即ち、ＰＩＰが、トランスジ
ェニック植物で適当に発現しており、植物内のＰＩＰが
ウイルスの増殖を効果的に抑制した。
ルス蛋白質を産生するトランスジェニック植物を作出す
る方法を提供する。この植物は、フイトラカ・インシュ
ラリス・ナカイの抗ウイルス蛋白質を発現する組換えベ
クターにより形質転換される。また、本発明のトランス
ジェニックバレイショは、前記組換えベクターにより適
当に形質転換されていた。即ち、ＰＩＰが、トランスジ
ェニック植物で適当に発現しており、植物内のＰＩＰが
ウイルスの増殖を効果的に抑制した。
【図１】フイトラカ・インシュラリス・ナカイの葉の c
ＤＮＡライブラリーから単離したＰＩＰの塩基配列及び
それから翻訳されるアミノ酸配列を示す。
ＤＮＡライブラリーから単離したＰＩＰの塩基配列及び
それから翻訳されるアミノ酸配列を示す。
【図２】本発明の組換え植物発現ベクター pJMC201を構
築する一連の過程を示す図である。
築する一連の過程を示す図である。
【図３】本発明の組換え植物発現ベクター pJMC201を B
amHIで切断してアガロースゲルで電気泳動した結果を示
す図である。
amHIで切断してアガロースゲルで電気泳動した結果を示
す図である。
【図４】（Ａ）は本発明の組換え植物発現ベクター pJM
C201を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLB
A 4404で形質転換されたバレイショ細胞から誘導された
シュートを示す図であり、（Ｂ）はトランスジェニック
バレイショの細胞から誘導されたシュートからの根の形
成を示す図である。
C201を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLB
A 4404で形質転換されたバレイショ細胞から誘導された
シュートを示す図であり、（Ｂ）はトランスジェニック
バレイショの細胞から誘導されたシュートからの根の形
成を示す図である。
【図５】（Ａ）はトランスジェニックバレイショから全
細胞ＤＮＡを単離し、ＰＣＲで増幅したＰＩＰ遺伝子を
電気泳動した図であり、（Ｂ）はトランスジェニックバ
レイショから全ＤＮＡを単離し、ＰＣＲでＰＩＰ遺伝子
を増幅してサザンブロット分析した結果を示す図であ
る。
細胞ＤＮＡを単離し、ＰＣＲで増幅したＰＩＰ遺伝子を
電気泳動した図であり、（Ｂ）はトランスジェニックバ
レイショから全ＤＮＡを単離し、ＰＣＲでＰＩＰ遺伝子
を増幅してサザンブロット分析した結果を示す図であ
る。
【図６】トランスジェニックバレイショの cＤＮＡから
ＰＣＲで増幅したＰＩＰ遺伝子を電気泳動した図を示
す。
ＰＣＲで増幅したＰＩＰ遺伝子を電気泳動した図を示
す。
【図７】トランスジェニックバレイショの葉から抽出し
た汁液を ELISA法により分析した結果を示すグラフであ
る。
た汁液を ELISA法により分析した結果を示すグラフであ
る。
【図８】（Ａ）はトランスジェニックバレイショをＰＶ
Ｙで感染させた際の植物の外観を示す図である、（Ｂ）
は非トランスジェニックバレイショをＰＶＹで感染させ
た際の植物の外観を示す図である。
Ｙで感染させた際の植物の外観を示す図である、（Ｂ）
は非トランスジェニックバレイショをＰＶＹで感染させ
た際の植物の外観を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 全 弘燮 大韓民国ソウル特別市松坡区蚕室１洞118 番地 505号 (72)発明者 金 哲煥 大韓民国ソウル特別市瑞草区盤浦本洞盤浦 エイピーティー 98棟110号 (72)発明者 金 萬根 大韓民国ソウル特別市永登浦区文來洞菊花 エイピーティー ２棟1007号
Claims (4)
- 【請求項１】 フイトラカ・インシュラリス・ナカイ
（Phytolacca insularis Nakai）の抗ウイルス性蛋白質
を発現する組換えＤＮＡ pJMC201。 - 【請求項２】 請求項１記載の組換えＤＮＡ pJMC201で
形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens) LBA 4404 (KCCM-1005
6)。 - 【請求項３】 請求項１記載の組換えＤＮＡ pJMC201で
バレイショの細胞を形質転換させ、これを培養する工程
を含むフイトラカ・インシュラリス・ナカイの抗ウイル
ス性蛋白質の生産方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の組換えＤＮＡ pJMC201で
形質転換させる工程を含むウイルス耐性を有するトラン
スジェニック植物の作出方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019940017696A KR970007864B1 (ko) | 1994-07-21 | 1994-07-21 | 섬자리공의 항바이러스성 단백질(pip)을 발현하는 식물체의 제조방법 |
| KR94-17696 | 1994-07-21 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856674A true JPH0856674A (ja) | 1996-03-05 |
| JP2644207B2 JP2644207B2 (ja) | 1997-08-25 |
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| JP7039837A Expired - Lifetime JP2644207B2 (ja) | 1994-07-21 | 1995-02-28 | ウイルス耐性を有するトランスジェニック植物の作出方法 |
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| JP (1) | JP2644207B2 (ja) |
| KR (1) | KR970007864B1 (ja) |
| AU (1) | AU663031B1 (ja) |
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| WO2001027150A2 (en) | 1999-10-14 | 2001-04-19 | Clontech Laboratories Inc. | Anthozoa derived chromo/fluoroproteins and methods for using the same |
| CA2467383C (en) * | 2001-12-19 | 2012-08-28 | The University Of Chicago | Rapidly maturing fluorescent proteins and methods for using the same |
| ATE509946T1 (de) | 2002-11-12 | 2011-06-15 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo S Evrogens | Fluoreszenzproteine und chromoproteine aus nicht- aequorea-hydrozoa-spezies sowie verfahren zur verwendung davon |
| WO2005100387A1 (en) * | 2004-04-07 | 2005-10-27 | The University Of Chicago | Monomeric red fluorescent proteins |
| CN101283090A (zh) * | 2005-08-19 | 2008-10-08 | 联邦科学及工业研究组织 | 菌蚋荧光素酶 |
| US7417131B2 (en) * | 2005-11-04 | 2008-08-26 | Evrogen Joint Stock Company | Modified green fluorescent proteins and methods for using same |
| ATE483018T1 (de) * | 2006-01-25 | 2010-10-15 | Evrogen Ip | Neue fluoreszenzproteine und verfahren zur verwendung davon |
| US8563703B2 (en) | 2006-01-25 | 2013-10-22 | Evrogen IP Joint Stock Company | Fluorescent proteins and methods for using same |
| WO2008094316A2 (en) * | 2006-09-22 | 2008-08-07 | Stowers Institute Of Medical Research | Novel branchiostoma derived fluorescent proteins |
| US8679749B2 (en) * | 2007-11-01 | 2014-03-25 | The University Of Chicago | Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation |
| WO2010046423A2 (en) | 2008-10-22 | 2010-04-29 | Basf Se | Use of sulfonylurea herbicides on cultivated plants |
| AR075466A1 (es) | 2008-10-22 | 2011-04-06 | Basf Se | Uso de herbicidas tipo auxina en plantas cultivadas |
| CN104768378A (zh) | 2012-10-01 | 2015-07-08 | 巴斯夫欧洲公司 | N-硫代-邻氨基苯甲酰胺化合物在栽培植物上的用途 |
| WO2014079820A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections |
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| WO2016091674A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Basf Se | Use of cyclaniliprole on cultivated plants |
| CA2980505A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Basf Agrochemical Products B.V. | Use of an insecticidal carboxamide compound against pests on cultivated plants |
| EP3338552A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-27 | Basf Se | Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants |
| RU2730038C2 (ru) | 2018-06-28 | 2020-08-14 | Общество с ограниченной ответственностью "ПЛАНТА" | Ферменты биосинтеза люциферина и их применение |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0678775A (ja) * | 1992-08-19 | 1994-03-22 | Jinro Ltd | 抗ウィルス性タンパク質発現ベクターおよびそれにより形質転換された植物体の製造方法 |
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|---|---|---|---|---|
| KR960015747B1 (ko) * | 1993-07-02 | 1996-11-20 | 주식회사 진로 | 양자리공의 항바이러스성 단백질(pap)을 발현하는 미생물 |
| KR970001565B1 (ko) * | 1993-08-28 | 1997-02-11 | 장기하 | 섬자리공 항바이러스성 단백질(pip) 유전자 및 이를 발현하는 미생물 |
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1994
- 1994-07-21 KR KR1019940017696A patent/KR970007864B1/ko not_active IP Right Cessation
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- 1994-10-05 CA CA002133850A patent/CA2133850C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-06 US US08/319,622 patent/US5656466A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-14 EP EP94307573A patent/EP0707069A2/en not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-02-28 JP JP7039837A patent/JP2644207B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0678775A (ja) * | 1992-08-19 | 1994-03-22 | Jinro Ltd | 抗ウィルス性タンパク質発現ベクターおよびそれにより形質転換された植物体の製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0707069A2 (en) | 1996-04-17 |
| AU663031B1 (en) | 1995-09-21 |
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