JPH0853363A - 細胞増殖剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ＭＩＰ前駆体を有効成分として含有する細胞増
殖剤。 【効果】本発明のＭＩＰ前駆体は，ＲＰＥ細胞増殖活性
を有するため，網膜色素変性，網膜症，黄斑疾患，網膜
剥離などの眼疾患に治療剤として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は医薬あるいは試薬とし
て、臨床上あるいは研究上有用である新規な細胞増殖因
子および該増殖因子を有効成分とする細胞増殖剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】視覚は感覚機能の中でも最も重要であ
り，外界の情報の８０％は視覚系を通って入力される。
したがって，視力低下や失明などの視機能の障害は重大
な身体的障害のひとつに挙げられている。特に情報化社
会において高齢化が進んでいる現状を考えると、視機能
障害を防止することは現在の医療の重要な課題の一つと
言えよう。実際、日常生活に支障をきたす疾患の治療に
際して患者のＱＯＬ(quality of life) を向上させるこ
との重要性が最近提唱されているが，眼疾患において
は，特に視機能の改善と維持を含めたＱＯＬＶ(quality
of life and vision)の向上に必須の要件であり，これ
を達成させる治療法の確立が急務である。

【０００３】重度の視力低下や失明は種々の原因によっ
て起こり得るが，最も直接的な原因となり易いのは，網
膜新生血管病と呼ばれている糖尿病網膜症や新生血管黄
斑症，網膜剥離，脈絡膜炎、また遺伝疾患である網膜色
素変性症，黄斑ジストロフィーなどの網膜脈絡膜疾患で
ある。これらの疾患に対してはある種の薬物療法，レー
ザーによる光凝固術，硝子体手術等が治療法として施行
されているが，それらの成績は未だ十分に満足され得る
レベルにはなく，確実に奏効する薬物療法の開発が待ち
望まれている。侵襲を伴う光凝固術や硝子体手術に比
べ，薬物療法は侵襲が少なく，簡便であるという大きな
利点があるため、増加しつつある種々の眼疾患の治療へ
の期待が大きいが，有用性の高い薬剤が少ないのが現状
である。

【０００４】一方，近年の基礎的，臨床的研究の進展
で，網膜脈絡膜疾患における病態の解明も進んでいる。
すなわち，視力障害は，狭義の感覚器である網膜の視細
胞の病変だけではなく，視細胞の代謝に大きく関与して
いる網膜色素上皮の病変，神経線維の障害や網膜の循環
障害，さらには脈絡膜の循環障害によっても起こってく
ることが明らかになり出した。

【０００５】このうち，特に網膜色素上皮（ＲＰＥ：re
tinal pigment epithelial）細胞の視細胞維持における
重要な役割が判明してきた。すなわち、細胞は網膜最下
位層でブルッフ膜上に一層に配列しており，網膜に到達
した光を吸収して反射を防ぐほか，ブルッフ膜と共に視
細胞と脈絡膜血管板を仕切る血液網膜関門（blood-reti
nal barrier ）を構築し，各種のサイトカインの産生に
も関与しているなど，視細胞の維持や再生などの物理的
にも生理的に重要な機能を持つ。

【０００６】また，ＲＰＥ細胞の関与するサイトカイン
には血管新生に対する促進因子と抑制因子も含まれてお
り，脈絡膜新生血管の発生，進展，抑制，退縮を制御し
ていることが最近の研究で解明されている（総説とし
て，田中靖彦，眼科，31, 1233-1238, 1989 あるいは宇
山昌延，日本眼科学会雑誌，95, 1145-1180, 1991 ）。
このような機能を持つＲＰＥ細胞を培養して生理学的お
よび病理学研究を行うことは，眼の生理的機能や病態の
解明、さらには治療法の開発に大いに役立つことが期待
される。しかし，ＲＰＥ細胞の機能を修飾する因子の研
究は始まったばかりであり，インターロイキン（ＩＬ）
−１β，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＴＮＦ（tumor necrosis
factor)，ＧＭ−ＣＳＦ（granulocyte-macropharge co
lony stimulating factor），ＭＣＰ（monocyte chemo
tactic protein),ｂＦＧＦ（basic Fibroblast growth
factor) などが増殖刺激を，ＴＧＦβ（transforming g
rowth factor- β）が増殖抑制をもたらすことが明らか
にされた程度にすぎず（玉井信，日本眼科学会雑誌,97,
1-2，1993），しかも，これらの修飾因子は多様な作用
を持つことが知られ，ＲＰＥ細胞に対する選択的な薬理
作用は期待できそうにない。

【０００７】以上のように，重大な視機能低下や失明を
来たす網膜脈絡膜疾患は今後増加が予想されながらも，
まだ十分な治療法は確立しておらず，この疾患の病態を
左右すると考えられるＲＰＥ細胞の組織学的および機能
的研究もようやく着手され出したにすぎない。また，Ｒ
ＰＥ細胞の増殖や活性化による網膜脈絡膜疾患の治療や
予防に関する研究も緒についたばかりである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、有力
な薬物療法がない網膜脈絡膜疾患に対して、ＲＰＥ細胞
を増殖活性化させる因子を治療薬として開発すべきこと
が課題として挙げられる。 重大な視力障害をもたらす
網膜脈絡膜疾患につながるＲＰＥ細胞の変性にかかわる
疾患のうち、例えば網膜色素変性症は遺伝性疾患であ
り、血管拡張剤やビタミンＡなどの対症治療法がなされ
ているにすぎず、根本的治療法はない。このような疾患
には、ＲＰＥ細胞を増殖、活性化させる因子が有用な薬
剤になると考えられる。

【０００９】一方、新生血管を伴う網膜症、黄斑疾患や
ジストロフィーなどに対しては、レーザーによる光凝固
が奏効する場合もあるが、薬物療法においては現状では
根治療法に属するものはない。レーザーによる光凝固は
血管閉塞による止血効果を有するものの、網膜内層にも
熱凝固が及び、網膜の機能が広範囲に失われるため、中
心視力を司どる黄斑部中心窩に発症した病型には適用で
きない。また、脈絡膜新生血管が中心窩付近に存在する
場合には光凝固の治療は不可能である。さらに光凝固で
は新生血管の再発する場合が多いことも問題である。こ
のような光凝固の難点をカバーするためにも有用な薬物
療法が望まれている。ＲＰＥ細胞は増殖期には血管新生
抑制因子を産生することが知られているので（前出の宇
山の総説による）、ＲＰＥ細胞増殖因子は血管新生抑制
剤として光凝固の代替あるいは併用療法に応用すること
が期待できる。

【００１０】また、原発性および続発性網膜剥離に対し
て治療を施す場合、網膜の接着効果を高める薬剤が求め
られている。網膜の裂孔を瘢痕形成によって閉鎖させる
熱凝固（ジアテルミー）や冷凍凝固、光凝固を施す場
合、瘢痕形成を促す薬剤も望まれる。これらの場合、瘢
痕形成の主役となるＲＰＥ細胞を増殖させる薬剤は網膜
剥離治療促進剤として応用できると考えられる。

【００１１】このように、網膜症、黄斑疾患、網膜変
性、ジストルフィー、網膜剥離などの難治性疾患に簡便
に適用し得る新規なＲＰＥ細胞増殖剤の開発は大いに期
待されているところである。

【００１２】本発明はこの課題を解決すべく、産業上お
よび医療上有用なＲＰＥ細胞増殖因子およびこの増殖因
子を有効成分として含有する細胞増殖剤を提供すること
にある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは強力にＲＰ
Ｅ細胞の増殖を促進する作用を有する細胞増殖剤を見出
すべく鋭意研究の結果，本発明を完成した。

【００１４】すなわち本発明は，マクロファージ炎症性
タンパク質（macropharge inflammatory protein：ＭＩ
Ｐ）前駆体を有効成分とする細胞増殖剤である。

【００１５】ＭＩＰはＭＩＰ−１とＭＩＰ−２に分類さ
れ，炎症時に誘導される低分子のタンパク質群でケモカ
インとも呼ばれている（Wolop とCerami, FASEB J., 3,
2565-2573, 1989）。ＭＩＰ−１ファミリーにはＭＩＰ
−１α（ＬＤ７８），ＭＩＰ−１β（Ａｃｔ２），ＭＣ
ＡＦ，ＲＡＮＴＥＳなどが含まれ，一方，ＭＩ−２ファ
ミリーにはＭＩＰ−２α（ＧＲＯ−β），ＭＩＰ−２β
（ＧＲＯ−α），ＰＦ４，ＩＬ−８，ＮＡＰ−１，ＮＡ
Ｐ−２などが含まれる。いずれも炎症時の白血球遊走や
造血系細胞の分化増殖に関与することが知られている
（Broxmeyer ら, J. Immunol., 150, 3448-3458, 1993
）。しかしながら，従来ＭＩＰあるいはＭＩＰ前駆体
にＲＰＥ細胞増殖促進活性があることは知られていなか
った。

【００１６】ＭＩＰ前駆体は、ヒト培養細胞培養上清か
らの精製分離、あるいはＭＩＰ前駆体に対するｃＤＮＡ
を用いて，いわゆる遺伝子組換え技術によって作成され
た細胞の抽出液あるいは細胞培養上清からの精製分離，
さらには胎児胚にＭＩＰ前駆体に対するｃＤＮＡを適当
なベクター系に注入して得られた，いわゆるトランスジ
ェニック動物の乳などの体液成分からの精製分離するこ
とによって得られる。ヒト培養細胞は，ＭＩＰ前駆体を
産生する能力を有する各種の正常組織由来細胞あるいは
株化細胞のいずれでも対象となるが，好ましくは上皮系
細胞，ストローマ細胞や繊維芽細胞である。

【００１７】遺伝子組換え型技術を利用してＭＩＰ前駆
体を調製する場合には、宿主細胞として、ＣＨＯ（チャ
イニーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞な
どの哺乳動物細胞、カイコ、夜盗蛾などの昆虫細胞、大
腸菌、枯草菌、酵母などの微生物などを用いることがで
きる。さらに、トランスジェニック動物を宿主とする場
合は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシなどを用いることができる。

【００１８】このようにして調製されたＭＩＰ前駆体
は、原料となる細胞培養上清、虫体抽出液、菌抽出液、
生体抽出液から種々のクロマトグラフィーにより、精製
分離することができる。用いるクロマトグラフィーは本
増殖因子に親和性を有するものであればいずれでも良い
が、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）やリン酸カルシウ
ムを吸着素材とするカラム、ヘパリンや色素や疎水基を
リガンドとするカラム、金属キレートカラム、イオン交
換カラム、ゲル瀘過カラムなどである。

【００１９】精製されたＭＩＰ前駆体は，広く網膜色素
変性や網膜脈絡膜萎縮症に治療に応用できる。具体的に
は，網膜色素変性，小口症，斑状網膜，網膜色素線上，
網膜色素上皮症（急性後極部多発性網膜色素上皮症，多
発性後極部網膜色素上皮症），加齢性黄斑変性症，老人
性円板状黄斑変性症，眼ヒストプラスマ症，中心性漿液
性網脈絡膜症，中心性滲出性網脈絡膜症，黄斑円孔，近
視性黄斑萎縮，Stargard病，卵黄状黄斑変性症などであ
る。さらにまた，特発性および続発性網膜剥離の光凝固
治療時の治療促進剤としても用いることができる。

【００２０】本発明のＭＩＰ前駆体は、そのままもしく
は自体公知の薬理学に許容される担体、賦形剤などと混
合した医薬組成物として、経口または非経口的に投与す
ることができる。

【００２１】経口投与のための剤型としては、具体的に
は局所注射剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロ
ップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる剤形
は、自体公知の方法によって製造され、製剤分野におい
て通常用いられる担体もしくは賦形剤を含有するもので
ある。例えば錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトー
ス、マルトース、サッカロース、澱粉、ステアリン酸マ
グネシウム等が挙げられる。

【００２２】非経口投与のための剤形としては、例え
ば、軟膏剤、クリーム剤、注射剤、湿布剤、塗布剤、坐
剤、点眼剤、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤など
が挙げられる。溶液製剤は自体公知の方法、例えば、Ｍ
ＩＰ前駆体を通常、注射剤に用いられた無菌の水溶液に
溶解、あるいは抽出液に懸濁、さらには乳化してリポソ
ームに包埋させた状態で調製され得る。固体製剤として
は、自体公知の方法、例えば、ＭＩＰ前駆体にマンニト
ール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース、グル
コースなどを賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製
され得る。さらにこれを粉体化して用いることもでき
る。ゲル化剤としては、自体公知の方法、例えば、ＭＩ
Ｐ前駆体をグリセリン、ポリエチレングリコール、メチ
ルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒアル
ロン酸、コンドロイチン硫酸などの増粘剤や多糖に溶解
した状態で調製され得る。 いずれの製剤においても、
安定化剤としてヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリ
ン、α２マクロクブリン、アミノ酸などを添加すること
ができ、また分散剤あるいは吸収促進剤としてＭＩＰ前
駆体の生理活性を損なわない範囲でアルコール、糖アル
コール、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤な
どを添加することができる。また、微量金属や有機酸塩
も必要に応じて加えることができる。

【００２３】本発明のＭＩＰ前駆体の投与は全身投与あ
るいは局所投与で行われ，有効投与量および投与回数
は，投与剤形，投与ルート，患者の年齢，体重，治療対
象疾患，症状もしくは重篤度によっても異なるが，通
常，成人一人あたり０．０１〜１００mgを，好ましくは
０．１〜１０mgを一回または数回に分けて投与すること
ができる。

【００２４】

【実施例】以下，本発明をより詳細に説明するために実
施例を示すが，本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ 細胞増殖因子の分離精製法および活性の測定 １．細胞増殖因子の分離精製法：ヒト線維芽細胞を１×
１０⁶ cell／mlで５％新生仔ウシ血清を含むイーグルＭ
ＥＭ１リットルに播種し，１６リットルのガラス培養槽
で，０．３％マイクロキャリー（“Cytodex l ”，Phar
macia-Biotech 社）に接着させて攪拌しながら，３７
℃，５日間培養した。その後，無血清イーグルＭＥＭ培
地１４リットルに交換し，１００国際単位／mlでヒト・
インターフェロンβを加えた。２４時間後，さらにポリ
（Ｉ）：ポリ（Ｃ）を１０μg／mlで加え，その２時間
後，少量のメチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地
に置換し，その後，６日間培養を続けた。培養終了後，
マイクロキャリヤーを沈降させた後，上清を別の容器に
移し，精製原液とした。フィルターで瀘過して不純物を
除去した精製原液１００リットルをS-Sepharose カラム
（５００ml，Pharmacia-Biotech 社）に流し，１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７）５リットルで洗浄した
後，０．５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ
７）で溶出を行った。タンパク質のピ−ク画分２００ml
を１Ｍ硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ７）として、Polypr
opyl Aカラム（０．８×２５cm，PolyＬＣ社）吸着させ
た後，硫酸アンモニウムの濃度勾配（１−０Ｍ）溶離法
によりタンパク質の溶出を行った。

【００２５】後述したＲＰＥ細胞増殖活性の測定法によ
り検出された活性画分４mlを，Ｃ４逆相カラム（１×２
５cm，Vydac 社）に注入し，０．１％トリフルオロ酢酸
（ｐＨ２）を含む水／アセトニトリルの濃度勾配（０−
７０％）溶離法により溶出した。活性画分２mlをSpeed
Vac 濃縮機で１００μlまで減圧濃縮した。

【００２６】次に，この濃縮活性画分をLaemmli の方法
（Nature, 227, 680-685, 1970）に準じて，非還元条件
下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い，さらに精
製した。泳動後，ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２mm幅でスラ
イスし，スライス片（１×２×４mm）あたり０．５mlの
蒸留水で４℃，一晩浸漬し，ゲル中のタンパク質を溶出
した。活性画分の溶出液中のＲＰＥ細胞増殖活性は，１
００単位／mlであった。

【００２７】ＲＰＥ細胞増殖活性を有する画分を，再
度，非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥし，銀染色したと
ころ，分子量22,000±2,000 の位置に単一のバンドが検
出された。この画分の精製タンパク質５μgを，プロテ
イン・シーケンサー（Applied Biosystams社４７０型）
でアミノ酸配列を分析したところ，Ｎ末端のアミノ酸配
列からＭＩＰ−２β前駆体およびＭＩＰ−１α前駆体で
あることを確認した。

【００２８】２．ＲＰＥ細胞増殖因子活性の測定：ＲＰ
Ｅ細胞樹立株であるＫ−１０３４細胞（Kigasawaら，Ja
p. J. Ophthalmol., 38, 10-151994）を１×１０⁴ ce
ll／０．５ml medium／wellで２４ウェルプラスチック
プレートに播種した。培養液は５％新生仔ウシ血清（Ｆ
ＣＳ）を含むダルベッコＭＥＭ培地を用いた。これに被
験サンプル２μlを加え，３７℃，５日間培養した。培
養後，細胞数を細胞計数機（コールター・カウンターＺ
Ｍ型）で計測し，対象群に対する被験群の存在率をＲＰ
Ｅ細胞増殖活性比率として算出した。細胞数を２倍に増
加させる力価を１単位とし，希釈倍率を乗じて単位数と
した。

【００２９】

【発明の効果】本発明のＭＩＰ前駆体は、ＲＰＥ細胞増
殖活性を有するため，網膜色素変性，網膜症，黄斑疾
患，網膜剥離などの眼疾患に治療剤として用いることが
できる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マクロファージ炎症性タンパク質前駆体を
   有効成分として含有する細胞増殖剤。
2. 【請求項２】マクロファージ炎症性タンパク質前駆体が
   繊維芽細胞由来であることを特徴とする請求項１記載の
   細胞増殖剤。
3. 【請求項３】請求項１もしくは２記載のマクロファージ
   炎症性タンパク質前駆体を有効成分とする眼科疾患治療
   剤。
4. 【請求項４】眼科疾患が網膜色素変性、網膜症、黄斑疾
   患、網膜剥離である請求項３記載の眼科疾患治療剤。