JPH08512292A - 化学療法剤をｉｎｖｉｖｏで評価する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、化学療法剤をin vivoでスクリーニングする方法に関する。この方法は、実験動物内に標的細胞系を含有する生体適合性の半透過性カプセル封入装置を移植し、該実験動物を試験物質で処理してから、該試験物質への反応について該標的細胞を評価することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 化学療法剤をin vivoで評価する方法 発明の分野 本発明は、生体適合性の選択的透過性マクロカプセル内で増殖した標的細胞を 用いて、化学療法剤をin vivoでスクリーニングする方法に関する。 より特定的には、本発明は、選択的透過性中空ファイバー又は透析チュービン グ内で増殖した細胞又は細胞系を用いて、同系、同種異系又は異種の細胞の取り 出し可能なサンプルを実験動物内に入れる方法に関する。化学療法剤で処理する か又はしないでin vivo培養した後、細胞生存性、細胞密度、細胞増殖能力、ウ ィルス負荷量又はこの試験システムに適切な他のパラメーターをin vitro評価す るためにそれら細胞を取り出す。 発明の背景 腫瘍増殖及びウィルス感染に対する効果的な治療法が切望されているため、研 究的及び医学的コミュニティでは潜在的な化学療法剤の迅速で信頼性あるスクリ ーニング法が必要となっている。異なる型の腫瘍細胞系（例えば、腎臓、結腸、 膵臓細胞系等）は種々の化学療法剤に対して反応の度合いが異なるので、通常は 別々に実験を行って標的細胞又は細胞系の１つの型に対して可能性ある１種の物 質をスクリーニングしなければならない。 ここ数年の間、この型のスクリーニング実験はin vitroで行われた。例えば、 ヒト腫瘍細胞を半固体培地で増殖させ、その培地に潜在的な化学療法剤を導入し 、そして曝した後に細胞生存性を測定する（Roper，P.R．とDrewinko，B.，“Co mparison of in vitro methods to determine drug-induced cell lethality"， Cancer Res.，vol.36，pp.2182-88（1976）を参照のこと）。しかしながら、in vitroで薬剤に細胞を曝すのは高度に人為的であるので代謝性活性化を必要とす る薬剤の用途を制限する。かかるin vitro薬剤曝露は、in vivo薬物動力学を正 確に反映しているかどうか疑わしい。 このことでかなりの数の研究者達は可能性ある化学療法剤をin vivoで試験す る方法を開発しようとしたのである。これらモデルは、実験動物に腫瘍細胞を 移植し、可能性ある化学療法剤でその動物を処理し、次いでその動物を追跡して 腫瘍増殖へのその処理の効果を確認することからなる。幾つかのモデルが試みら れた。例えば、(1)腫瘍生細胞を実験動物の皮膚の下に外科的に配置することか らなる皮下腫瘍モデル；(2)実験動物の腎被膜の下に外科的に移植した腫瘍細胞 の増殖を測定する腎下腫瘍モデル；(3)腫瘍細胞を腹膜腔の中に直接注射する腹 膜モデル；及び(4)一次腫瘍細胞を実験動物の足に注射する転移モデルがある。 しかしながら、これらモデルは１実験当たり（動物１匹当たり）１つの型の腫 瘍細胞又は細胞系をスクリーニングできるに過ぎないので限界があり、数種の腫 瘍系をスクリーニングするにはより多量の試験物質が必要となる。更には、腫瘍 細胞を回収するのに動物を殺す必要があり、また腫瘍細胞と宿主実験動物間の相 互作用の効果を制御する方法がない。 これら障害を克服するために試みられた他のモデルは寒天拡散室（Selby，P.J .ら“Use of the Agar Diffusion Chamber for the Exposure of Human Tumor C ells to Drugs”，Cancer Res.，Vol.42，pp.4758-4762(1982)）である。この方 法は、腫瘍細胞を寒天中に懸濁させ、次いでその懸濁細胞を拡散室内に導入する ことを含む。次いで、拡散室を実験動物の腹膜腔の中に移植して、試験物質で処 理する。しかしながら、この方法は“労力を要しかつ費用がかかる”（Selby，p .4761）という欠点があるだけでなく、拡散室の大きさ及びその拡散室内に寒天 が存在するためにただ１種の細胞型又は細胞系の移植ができるに過ぎない。 上のin vivoモデルにおけるこれら欠点のために、迅速で費用がかからずかつ １実験当たり２以上の細胞系をスクリーニングするのに用いることができるin v ivoで化学療法剤をスクリーニングする方法についての必要性が依然として存在 している。本発明は、in vivoで試験物質をスクリーニングする方法であって、 生体適合性の半透過性膜から構成される装置内に標的細胞をカプセル封入するこ と及び該装置を実験動物に（皮下、腹腔内、又は臓器内に）移植してから該動物 を該試験物質で処理することを含む方法を提供することにより、この必要性を満 たすものである。 種々の目的で細胞をカプセル封入することが当該技術分野で記載されている。 例えば、Lacy，P.E.ら“Maintenance of Normoglycemia in Diabetic Mice by S ubcutaneous Xenografts of Encapsulated Islets”，Science，vol．254，pp.1 782-1784（1991）は、アクリル系コポリマーから加工された中空ファイバーを用 いて少数のラット膵島細胞をカプセル封入してからマウスに移植することを記載 している。そのカプセル封入装置は、ラット膵島細胞に対する免疫反応を防ぎ、 そして生物活性化合物インシュリンが拡散できるようにしてマウスにおける正常 血糖を維持した。（Colton，C.K.ら“Bioengineering in Development of the H ybrid Artificial Pancreas”，J．Biomech．Eng.，vol.113，pp.152-170（1991 ）を参照のこと）。 加えて、Franklin Limへの米国特許第４,３２４,６８３号及び第４,３５２,８ ８３号はいずれも、球状マイクロカプセル中に生体物質を封入することを教示及 び記載している。しかしながら、これら特許により教示されたマイクロカプセル 封入技術には幾つかの限界がある。第１に、彼らのマイクロカプセル封入技術は エアロゾルを発生するが、封入されたその物質がエアロゾル送達により健康を脅 かす場合には、生体に危険な状態をもたらす。第２に、彼らのマイクロカプセル を宿主動物からin totoで回収するのが極端に難しい。第３に、移植片の回収を 望む場合には腹腔内移植部位が可能であるに過ぎない。そして最後に、宿主細胞 による汚染なしにカプセル封入細胞を回収するのは難しい。これら限界は本発明 では回避されている。 Shockley，T.R.ら“Penetration of Tumor Tissue by Antibodies and OtherI mmunoproteins”，Ann．N.Y．Acad．Sci.，pp.367-382（1991）は、in vivo実験 に中空ファイバーモデルを用いる可能性を調べるための予備実験を論じている。 しかしながら、Shockleyは、中空ファイバーシステムを用いて抗ウィルス薬、抗 菌薬、及び駆虫薬をin vivoで試験することを教示も示唆もしていない。更には 、Shockleyは、中空ファイバーシステムを用いて単一の薬剤を複数の腫瘍又は細 胞系に対して試験できることを教示も示唆もしていない。中空ファイバーシステ ムを用いて単一の薬剤を複数の細胞系に対して１匹の哺乳動物で試験できること はこれまで示されていない。 最後に、Allenら“Novel Method for Evaluating Antiviral Drugs againstH uman Cytomegalovirus in Mice”，Antimicrobial Agents and Chemother.，vol .36，pp.206-208（1992）は、ヒトサイトメガロウィルス感染ヒト細胞をアガロ ース充填物内に取り込んでin vitroで培養するか又は通常のマウスに移植するウ ィルス−宿主細胞系を教示している。しかしながら、この系はマウス内への腫瘍 細胞又はＨＩＶの如きレトロウィルスを発現する細胞のカプセル封入及び移植に 効果的ではない。というのは、それら細胞はAllenにより教示された１〜１.５％ のアガロース濃度で複製しないだろうからである。 上で引用又は議論した全ての文献は、参照によりここに組み入れられるものと する。 上で引用した文献に記載の通りマイクロカプセル封入及び中空ファイバーシス テムが公知であるという事実にも拘らず、当該技術分野には、生体適合性の半透 過性マクロカプセル内に封入されそして１匹の哺乳動物に移植された１又は２以 上の細胞系に対して化学療法剤をスクリーニングする方法が依然として存在しな い。 従って、この発明の目的は、細胞、細胞系又は病原菌を生体適合性の半透過性 装置内にカプセル封入して１匹の哺乳動物に移植し、次いで該封入細胞又は病原 菌に作用させようとする化学療法剤で該動物を処理する方法を提供することであ る。 この発明の追加の目的は、複数の型の細胞又は病原菌を１匹の哺乳動物内で同 時に培養できる結果、実験用化学療法剤を評価するのに歴史的に必要とされてき たほど多くの前記療法剤を必要としない方法を提供することである。 この発明の更なる目的は、１匹の実験動物が複数の部位において移植片を保有 するため、種々の生理学的区画（即ち、皮下、腹腔内及び臓器内）と反応する化 学療法剤の能力を同時に評価することができる方法を提供することである。 発明の要旨 本発明のこれら及び他の目的に従い、生体適合性の半透過性装置内でin vivo で増殖した細胞を用いて化学療法剤を評価する方法が提供される。本法は、標的 細胞又はその細胞系に適する培地内でin vitroで培養された細胞を提供すること を含む。一般に、血清含有培地中で定型的に培養される細胞系について１０ 〜２０％血清濃度が推奨される。細胞を集め、生存性を測定し、そしてカプセル 封入装置に充填するのに必要とされる細胞密度に調節する。 調製後、細胞をカプセル封入装置に注入する。本発明の実施には、このカプセ ル封入装置は、好ましくは生体適合性の半透過性材料で構成された中空ファイバ ー又は透析チュービングである。充填後、そのカプセル封入装置を実験動物にそ のまま移植するか、又はそれらサンプルを細胞増殖が安定化する時間だけインキ ュベートした後で移植する。各受容動物の単一部位に単一の移植片を埋め込んで も、複数部位に複数の移植片を埋め込んでもよい。 次いで、その実験動物を試験化学療法剤で、評価されるその物質にとって適切 な投与量及びスケジュールで処理する。移植したサンプルを、その試験物質が標 的細胞に作用するのに十分である適切な期間だけその宿主動物内に維持する。こ の期間は試験物質ごとに変動するものであり、好ましくは１〜１０日間である。 次いで、移植したサンプルをその化学療法剤の作用の評価のために採取する（終 点と呼ぶ）。 この方法は、１又は２以上の移植部位における１又は２以上の標的細胞に対す る化学療法剤の効力を、その試験物質で処理した動物で得られた終点結果をプラ シーボ（例えば、希釈剤コントロール）で処理した動物で得られた終点結果と比 較することにより、評価する迅速で効果的な方法を提供する。 発明の詳細な説明 本発明の１態様を実施するためには、まず、標的細胞、細胞系又は病原菌を選 ばなければならない。そのような標的細胞には、ヒト腫瘍細胞系（例えば、黒色 腫、肺腫瘍系、腎臓腫瘍系、結腸腫瘍系、前立腺腫瘍系、卵巣腫瘍系、乳房腫瘍 系、中枢神経系腫瘍系、白血病細胞系等）；ヒト線維芽細胞；ヒト白血球；マウ ス腫瘍細胞系（例えば、Ｐ３８８マウス白血病）；ヒト腫瘍異種移植片；新鮮な 患者由来腫瘍組織；ヒトリンパ球様細胞系；培養一次細胞系；細菌；ウィルス感 染細胞系（例えば、ヒト免疫不全ウィルスを産生するヒト細胞系）；酵母及び真 菌；並びに他の細胞系、株又は哺乳動物種の腫瘍を含めることができる。 カプセル封入装置内での培養用に選んだこれら標的細胞をその細胞系にとって 適切な培地中でin vitroで培養する。当該技術分野で知られている適切な培地 には、ＲＰＭＩ１６４０；イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）；ダルベッコ修飾Ｍ ＥＭ、又は他の培地が含まれるがこれらに限定されない。殆どの細胞系について 、培地は１０％ウシ胎児血清を含む。選んだ細胞株が培養に無血清培地又は他の 血清規定培地を必要としてもよい。新鮮な腫瘍組織を標的として用いる場合には 、培養前にそれら細胞を機械的又は（コラゲナーゼの如きタンパク質分解酵素を 用いて）酵素的に分散させる。これら細胞を培養してそれらを各細胞系にとって 適切な対数増殖に維持する。中空ファイバー内で培養するために採取する２４時 間前にそれら細胞に新鮮な培地を供給する。 次いで、それら標的細胞をin vivoで培養するカプセル封入装置を選ばなけれ ばならない。このカプセル封入装置は、成体適合性で半透過性の移植可能な如何 なる装置であってもよい。好ましい形態のマクロカプセル封入装置には、選択的 透過性中空ファイバー又は透析チュービングが含まれる。適する中空ファイバー （ＨＦ）には、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢 酸セルロース（ＣＡ−Ｅ）、ケン化セルロースエステル（ＳＣＥ）又はポリプロ ピレン（ＰＰ）から構成されるものが含まれるがこれらに限定されない。適する 透析チュービング（ＤＴ）には、再生セルロース（ＲＣ）又はセルロースエステ ル（ＣＥ）から構成されるものが含まれるがこれらに限定されない。細胞増殖を 支持するそれらの能力に依っては、他の生体適合性の半透過性材料を同じ形式で 用いることができる。以下は、数例のマクロカプセル封入装置の物理的寸法であ るが、本発明の１態様を実施するのに可能な装置の範囲を限定しようとするもの ではない。 試験物質を装置内に拡散できるあらゆる半透過性マクロカプセルを用いること ができるが、本発明の好ましい態様では５０,０００ダルトン又はそれより高い 分子量カットオフを有する装置を用いる。 適切なマクロカプセル封入装置を選んだら、その装置を標的細胞の装填のため に調製しなければならない。ＰＶＤＦ、ＰＳ及びＣＡ−Ｅ中空ファイバーは、オ ートクレーブに２０分間入れて滅菌し、７０％エタノール溶液をさっとかけ、そ して７０％エタノール中室温で約２４時間又はそれより長い時間インキュベート することにより調製する。アルコールを滅菌水で濯いで除去してからそれらファ イバーを（ウシ胎児血清に耐性のある細胞系については）２０％ウシ胎児血清を 含有する組織培養培地で又は存在し得るタンパク質結合部位をブロックできる他 のタンパク質（コラーゲン、フィブリノーゲン等）で満たす。約１２時間又はそ れより長い時間３７℃でインキュベートした後は、それらファイバーは細胞又は 他の生存性のある培養物質で簡単に装填されるようになる。 ＳＣＥ又はＣＡ中空ファイバーをエポキシ、メタクリレート接着剤、又は他の 適切な生体適合性接着剤でまとめて束にする。それらファイバー束を脱イオン水 をさっとかけてから７０％エタノールで化学的に滅菌することにより調製する。 細胞を装填する前に、それらファイバー束に滅菌水をさっとかけてアルコールを 除去し、２０％ウシ胎児血清又は他の適切なタンパク質を含有する組織培養培地 中で約１２時間又はそれより長い時間３７℃でインキュベートする。 ＲＣ及びＣＥ透析チュービングは、脱イオン水をさっとかけ脱イオン水中で煮 沸して保存剤を除去する。このチュービングを３〜４ｃｍの長さに切って一端を 結ぶか又はメタクリレート手術用接着剤若しくは他の生体適合性接着剤で封止し 、それによって“袋”を形成する。細胞を装填する前に、このチュービングを７ ０％エタノールで化学的に滅菌し、滅菌水をさっとかけ、そして組織培養培地中 で約１２時間又はそれより長い時間３７℃でインキュベートする。 適切に調製した後は、これら中空ファイバー又は透析チュービング“袋”は標 的細胞を容易に受け入れる。まず、標的細胞又は細胞系を集めてそれらの生存性 を確認する。それら細胞を中空ファイバー内での細胞増殖を維持するのに適切な 細胞密度に調製する。この密度は、細胞系ごとに変動するので各々について個別 に定めなければならない。一般的に、殆どの細胞は１〜１０×１０⁶細胞／ｍｌ 培養培地で培養することができるが、より高い範囲及びより低い範囲を用いるこ とができる。 ウィルス感染細胞については、それら細胞を中空ファイバー内に移す直前に急 性感染を行うことができる。代わりに慢性感染細胞を培養してもよい。ウィルス 感染細胞及び未感染標的細胞を中空ファイバー内に装填する前に混合することに よって共存培養物を調製することも可能である。悪性腫瘍細胞については、感染 を行わず、単にそれらを採取して適切な細胞密度に調製する。 調製後、標的細胞をカプセル封入装置に注入する。カプセル封入装置内に装填 する前に細胞をアガロース、細胞外マトリックス又は他の支持性材料内に取り込 ませてもよい。細胞を中空ファイバー内に装填する前にカプセル封入装置をポリ −１−リシン、コラーゲン、フィブリノーゲン及び／又は他の付着剤／前処理剤 で前処理して、細胞付着若しくは増殖を促進するか又は特別な試験のためのサン プル（例えば、アガロース中でのコロニー形成）を調製することもできる。 接種材料（細胞、細菌等）を滅菌シリンジ内に移し、中空ファイバーに合う適 切なゲージのニードルを用いるか又はファイバー束の場合には滅菌管片を用いて シリンジをその束に繋いで、その中空ファイバーに充填する。シリンジプランジ ャーを軽く押して中空ファイバー内に細胞を流し込む。ＰＶＤＦ、ＰＳ及びＣＡ − Ｅファイバーの端部を２５０°Ｆ（１２１℃）又はそれより高温に加熱した平滑 顎ニードルホルダー（smooth jawed needle holder）又は他の適切な装置で溶封 する。充填した中空ファイバーを基準間隔を置いてその管に沿って溶封すること によりそれらファイバーからＰＶＤＦ、ＰＳ及びＣＡ−Ｅの個々の移植用サンプ ルを調製する。一般に、１.０ｍｍ直径の中空ファイバーについては２ｃｍの長 さの間隔を用い、０.５ｍｍ直径の中空ファイバーは３ｃｍの長さに調製する。 これら長さが実際に使えるものであるが、in vivoでの移植が可能であることを 条件としてあらゆる長さを用いることができる（例えば、イヌに移植するために 調製されるサンプルは１０〜１２ｃｍの長さである）。ＳＣＡ及びＣＡ中空ファ イバー束は、その端部をメタクリレート手術用接着剤で封止する。 透析チュービング“袋”については、接種材料をそのチュービングの中にマイ クロピペット又はニードル／シリンジで移すことにより充填を行う。この透析チ ュービング“袋”をメタクリレート手術用接着剤又は他の生体適合性封止剤で閉 じる。これら袋の長さは用いるチュービングの直径に依存するが、マウスでは２ 〜４ｃｍの長さが効果的であることが証明されている。 充填後、それらマクロカプセルを実験動物（マウス、ラット、イヌ等）にその まま移植しても、それらをin vitroでインキュベートして培養の安定化と細胞操 作（例えば、トリプシン処理、遠心分離、冷ショック等）の影響からの回復を行 ってから移植してもよい。 好ましくは、マクロカプセルを腹腔内若しくは皮下に又は両方に移植する。マ ウスをメトキシフルラン（他の麻酔薬を用いることもできよう）で麻酔し、そし て腹側腹部の皮膚を切開するか又は第２のアプローチでは側腹壁の皮膚を切開す ることによりサンプルを腹膜腔内に移植する。腹部の筋系を切開（１／２ｃｍ又 はより小さく切開）し、そして中空ファイバーをその切開部に通して腹膜腔内に 入れる。腹側切開については、筋系を滅菌縫合糸（絹、カットグット、ポリグリ コール酸等）で閉じ、そして第２層において皮膚を縫合糸、創傷クリップ又は手 術用接着剤で閉じる。背側切開については、この部位でのヘルニア形成の危険性 が腹側の場合よりも少ないので皮膚だけを閉じる（縫合糸、創傷クリップ又は接 着剤）。それらマウスを麻酔から回復させる。回復が遅い場合には熱源を与える 。 皮下移植については、背側胸部（頸の項部）の皮膚を切開して中空ファイバー を皮下組織に尾に向かって通す。腫瘍移植トロカール（１１〜１６ゲージ）を用 いると容易に通せる。それらファイバーをそのトロカールの遠位末端に装填して から皮膚切開部に尾に向かって通す。トロカールを引き抜く間に、トロカールス タイレットを用いてファイバーをトロカールから押し出すとファイバーが皮下域 に取り残される。その皮膚切開部を縫合糸、創傷クリップ又は手術用接着剤で閉 じる。 一般に、最初に腹腔内にファイバーを１つ移植してから実験動物をぐるりと回 転させて皮下に移植する。しかしながら、これらファイバーをどのような順序で 移植してもよい。 各受容動物に単一移植片（即ち、単一マクロカプセル）を単一部位（皮下、腹 腔内又は特定の臓器内）に移植しても、複数移植片を複数部位（即ち、３〜６（ 又はそれ以上）のマクロカプセルを各動物に皮下又は腹腔内）に移植してもよい 。各マクロカプセルは同じ標的細胞を含有しても、異なる細胞若しくは細胞系、 病原菌又は細菌を含有してもよい。このようにして中空ファイバー内の１又は２ 以上の細胞系をカプセル封入し、各ファイバーを同じ動物の腹腔内、皮下、又は 臓器内に移植し、そしてその動物をある物質で処理して異なる生理学的区画内に おいて培養された細胞へのその作用を測定することができる。 移植後は、実験動物を試験化学療法剤で、評価される該物質に適切な投与量及 びスケジュールで処理する。処理の間に単一の化学療法剤を用いても、２又は３ 以上を組み合わせるか又は同時にその動物に与えてそれら化合物の組み合わせの 標的細胞への作用を試験してもよい。化学療法剤は、幾つものスケジュールで静 脈内、腹腔内、皮下、経口及び／又は経皮経路により投与される。 移植したサンプルを宿主動物内に適切な期間、通常は約６日間維持する。より 長いか又はより短いin vivoインキュベーション期間の別のスケジュールを用い て終点に到達し標的細胞へのその物質の活性を測定することが可能である。 次いで、化学療法剤の作用のin vitro評価に適切な時点で移植したサンプルを 採取する。抗悪性腫瘍化合物については、この終点をマクロカプセル内に存在 する生存可能細胞の量により定め、それは当該技術分野で知られている試験、例 えば、ＭＴＴ色素変換アッセイ、ニュートラルレッド色素取り込み、トリパンブ ルー染色、生存可能細胞計数、軟寒天中で形成されるコロニー数、試験物質にin vivoで曝した後にin vitroで回復及び複製する細胞の能力、及びその他の試験 により定めることができる。 抗ウィルス剤の評価については、終点は、そのマクロカプセル内に存在する生 存可能細胞の数、細胞の複製する能力、特に病原菌に関連するタンパク質、糖タ ンパク質、核酸又は他の産物（例えば、逆転写酵素、核タンパク質(ＨＩＶｐ２ ４)）、及び／又はそのマクロカプセルから回収される感染性物質のレベルによ り定められる。 上記の方法を用いて幾つかの実験を行って種々の化学療法剤を腫瘍細胞系に対 する有効性についてスクリーニングした。以下の実施例は本発明の１態様を説明 するものであって、その範囲を限定するために用いられてはならない。 実施例１ １.０ｍｍの内径及び５００,０００ダルトンの分子量カットオフを有するSpec trumから入手したＰＶＤＦ中空ファイバーを上記のように調製した。次いで、こ れらファイバーに次の腫瘍細胞系の１種を注入して、２０％ウシ胎児血清を有す るＲＰＭＩ１６４０中で培養した：白血病細胞系ＨＬ６０；中枢神経系腫瘍細胞 系Ｕ２５１；卵巣腫瘍細胞系Ovcar３；肺腫瘍細胞系Ｈ５２２若しくはＨ２３； 結腸腫瘍細胞系ＳＷ６２０若しくはColo ２０５；黒色腫細胞系ＬＯＸ若しくは ＳＫ−ＭＥＬ−２８；又は腎臓腫瘍細胞系ＳＮ１２Ｋ１若しくはＳＮ１２Ｃ。次 いで、それらファイバーを加熱平滑顎ニードルホルダーで２ｃｍの間隔を置いて 溶封した。 次いで、これらマクロカプセルをマウスの腹腔内に移植してから、次の化学療 法剤の１種で腹腔内処理した：メトトレキセート（ＮＣＩ＃７４０）；ビンブラ スチン（ＮＣＩ＃４９８４２）；アドリアマイシン（ＮＣＩ＃１２３１２７）； Ｌ−ＰＡＭ（ＮＣＩ＃２４１２８６）；エリプチシニウム（ellipticinium）（ ＮＣＩ＃１５５６９３）；マイトマイシンＣ（ＮＣＩ＃２６９８０）；シクロホ スファミド（ＮＣＩ＃２６２７１）；ＤＴＩＣ（ＮＣＩ＃４５３８８）；クロラ ム ブシル（chlorambucil）（ＮＣＩ＃３０８８）；ＢＣＮＵ（ＮＣＩ＃４０９９６ ２）；シスプラチン（ＮＣＩ＃１１９８７５）；ＶＰ−１６（ＮＣＩ＃１４１５ ４０）；アクチノマイシンＤ（ＮＣＩ＃３０５３）；フルオロウラシル（ＮＣＩ ＃１９８９３）；又はブレオマイシン（ＮＣＩ＃１２５０６６）又はコントロー ル。このコントロールは化学療法剤を溶かすのに用いた希釈剤からなるものであ った。 表２に明示した特定の投与量及びスケジュールで処理した後、それらマウスを 殺してＭＴＴ（３−〔４,５−ジメチルチアゾール−２−イル〕−２,５−ジフェ ニルテトラゾリウム・ブロミド）アッセイ(Cancer Res.，51:1247(1991))により 腫瘍細胞生存性を測定した。このアッセイを行うには、集めた細胞のサンプルに 少量のＭＴＴを添加する。ＭＴＴは明るい黄色／金色であるが、生存可能細胞に よりＭＴＴ−ホルマザン（暗紫色）に変換する。存在する生存可能細胞の量が多 ければ多いほど、変色はより顕著となる。次いで、空の中空ファイバーをブラン クとして用いて、その変色を分光光度計で５４０ｎｍで測定する。コントロール マクロカプセルの細胞生存性も測定し、そしてこれら測定値から処理腫瘍増殖量 のコントロール増殖量と比較したパーセンテージを次の式を用いて出す：コント ロール動物と比較した処理動物における腫瘍増殖率（％）＝１００×（処理細胞 についてのＭＴＴ測定値−ブランク）／（コントロール細胞についてのＭＴＴ測 定値−ブランク）。 本実験については、中空ファイバーアッセイにおける正の応答をコントロール マウスと比較した薬剤処理マウスにおける２５％又はそれを超える生存可能細胞 の減少として定義した。従って、上の式を用いて処理動物における腫瘍細胞増殖 のパーセンテージをコントロール動物と比較して定める場合は、７５又はそれ未 満の値が、中空ファイバー内に含有されそして動物に移植されて化学療法剤で処 理された腫瘍細胞系が負に作用を受けた（細胞増殖がコントロールに比較して阻 害された）ことを示すことになる。７６又はそれより大きな値は、腫瘍細胞が試 験物質に十分に応答しなかったことを示す。 ＰＶＤＦ中空ファイバーに封入して腹腔内に移植した腫瘍細胞系を用いて行っ た数実験の結果を表１に示す。これら実験に用いた投与量及び投与スケジュール を表２に列挙する。Ｑ２Ｄ×３スケジュールは、示した薬剤で２日毎（１日置き ）に全部で３回注入する処理を示し；ＱＤ×５は、１日毎に５日間注入すること を示し；Ｑ８Ｈ×２は、８時間毎に１日で２回注入することを示す。 表１は、本発明の方法を用いることにより腫瘍細胞増殖に対する有効性につい て潜在的化学療法剤を簡単にスクリーニングできることを示している。表１の第 １列ではスクリーニングした物質を列挙し；第２列は各物質に付与された国立癌 研究所の番号（ＮＣＩ＃）を示し；第３列は実験番号を示すがこれらは表２の実 験番号に対応しており；そして第４列は注射１回当たりの投与量をｍｇ／ｋｇで 示している。 実施例２ 実施例１と同じ実験動物に上の実施例１と同じ腫瘍細胞系を含有するＰＶＤＦ 中空ファイバーを同時に皮下移植した。これら動物を実施例１と同じ化学療法剤 及び投与スケジュールを用いて試験し、また希釈剤（コントロール）でも試験し た。処理動物のコントロール動物に比較した皮下移植腫瘍細胞の増殖率（％）を 出した。結果を表３に示す。 実施例３ 他の実験では、実施例１に記載した腫瘍細胞系をＰＳ中空ファイバー内にカプ セル封入した。ＰＳ中空ファイバーをSpectrumから入手した。これは０.５ｍｍ の内径と５０,０００ダルトンの分子量カットオフを有した。これらファイバー を溶封して３ｃｍの長さのマクロカプセルに分断した。これらＰＳカプセル封入 腫瘍細胞をマウスに腹腔内移植してから、実施例１に列挙した化学療法剤の１種 で腹腔内処理するか又は希釈剤（コントロール）で処理するかした。これら実験 での投与スケジュールは表２に示されている。処理動物のコントロール動物に比 較した腫瘍細胞の増殖率（％）を出した。結果を表４に示す。 化学療法剤で処理した動物で得られた終点結果をプラシーボ（例えば、希釈剤 コントロール）で処理した動物で得られた結果と比較することにより、１又は２ 以上の標的（即ち、腫瘍型、ウィルス、細菌株等）に対する該試験物質の効力を １又は２以上の移植部位（皮下、腹腔内）で評価するのに、本発明の方法が有用 であることが分かった。古典的な抗腫瘍動物モデルに比べてこのシステムには次 の１又は２以上の利点がある：(1)予備的にin vivo効力を評価するのにより少な い量の試験物質が必要なだけである、例えば、１００ｍｇ／ｋｇで投与されるあ る薬剤をスクリーニングするのに、古典的モデルは全部で１６０ｍｇの試験物質 を必要とするが、本発明の方法を用いれば３５ｍｇの試験物質を必要とするだけ である、(2)迅速な回転時間（turn-around time）（１０日間アッセイ）、(3)同 じ実験動物内で同時に複数の腫瘍型に対して潜在的活性を試験できる、例えば、 それぞれ異なる細胞系を含有する６種のマクロカプセルを移植できる、(4)効力 を評価するのに必要な実験動物の数を減らせる（古典的モデルは３０匹を必要と するが本法は６匹を用いるだけである）、(5)短時間枠内で複数の処理スケジュ ールを評価することが可能である、(6)全移植片を回収できる、(7)宿主細胞によ り移植細胞が汚染されることがない、そして(8)同じ実験動物内の種々の生理学 的区画内で培養した標的細胞に対して試験物質をスクリーニングできる、例えば 、標的細胞を含有するマクロカプセルを同じ動物の腹腔内、皮下及び臓器内に移 植してその動物を試験物質に曝すことができる。これら同じ利点が抗ウィルス剤 の評価についても存在し、そして普通にはウィルスの複製を支援しない宿主（即 ち、マウス、ラット、イヌ等）内の易感染性細胞系内でのウィルスの短期間複製 が可能になるという追加の利点を有する。 更に、本法を遺伝子導入動物に用いて標的細胞系への導入遺伝子又はそのタン パク質産物の作用を確認することができる。また、カプセル封入標的細胞を試験 物質のスクリーニングのためにヒトに移植することができる。更には、標的細胞 をカプセル封入してそれらを試験物質に対してin vivoでスクリーニングし、次 いでそれら細胞を採取し、そして本法を繰り返すことによりそれらを再培養及び 再スクリーニングすることによって、処理しても生き残っている細胞の再増殖潜 在力を評価してから同じか又は別の抗癌剤での第２回目の処理に対するそれらの 感受性を確認することが可能である。 本発明を特にその好ましい態様に関して詳細に説明してきたが、本発明に他の 態様及び異なる態様の余地があることが理解されるであろう。当業者に容易に分 かるように、本発明の精神及び範囲内で変更及び修飾を行うことができる。従っ て、これまでの開示及び記載は説明を目的としたものに過ぎず、本発明を限定す るものでは決してない。本発明は請求の範囲によってのみ規定されるものである 。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．化学療法剤をin vivoでスクリーニングする方法であって、 一群の標的細胞を含有する少なくとも１種の生体適合性の半透過性カプセル 封入装置を哺乳動物に移植し、前記装置を予め選ばれた期間だけin vivoで維持 する工程； 前記装置を取り出す工程；及び 前記標的細胞を評価する工程 を含む方法。 ２．前記哺乳動物を化学療法剤で処理して前記生体適合性の半透過性カプセル封 入装置を前記療法剤に曝す、請求項１の方法。 ３．複数のカプセル封入装置を移植する、請求項１の方法。 ４．少なくとも１のカプセル封入装置を皮下移植し、そして少なくとも１のカプ セル封入装置を腹腔内移植する、請求項３の方法。 ５．前記カプセル封入装置に各々同じ標的細胞を注入する、請求項４の方法。 ６．前記カプセル封入装置に各々異なる標的細胞を注入する、請求項４の方法。 ７．前記標的細胞が、腫瘍細胞、線維芽細胞、白血球、リンパ球様細胞、培養一 次細胞、細菌、ウィルス感染細胞、酵母及び真菌からなる群から選ばれる、請求 項１の方法。 ８．前記腫瘍細胞が、黒色腫、肺腫瘍系、前立腺腫瘍系、卵巣腫瘍系、乳房腫瘍 系、腎臓腫瘍系、結腸腫瘍系、中枢神経系腫瘍系、白血病若しくはリンパ腫細胞 系、腫瘍異種移植片及び新鮮な患者由来腫瘍組織からなる群から選ばれる、請求 項７の方法。 ９．前記生体適合性の半透過性カプセル封入装置が、中空ファイバー及び透析チ ュービングからなる群から選ばれる、請求項１の方法。 10．前記中空ファイバーが、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、酢酸セルロ ース、ケン化セルロースエステル、ポリプロピレン、ポリアミド及びポリ塩化ビ ニル−アクリルコポリマーからなる群から選ばれる材料から構成される、請求項 ９の方法。 11．前記透析チュービングが、再生セルロース及びセルロースエステルからなる 群から選ばれる材料から構成される、請求項９の方法。 12．前記哺乳動物が、マウス、ラット、ハムスター、ミニブタ、ウサギ、ネコ及 びイヌからなる群から選ばれる、請求項１の方法。 13．前記移植工程が、皮下、腹腔内又は臓器内移植を含む、請求項１の方法。 14．前記生体適合性の半透過性カプセル封入装置が、約５０,０００ダルトン〜 約５００,０００ダルトンの分子量を有する化合物に対して透過性の材料から構 成される、請求項１の方法。 15．前記生体適合性の半透過性カプセル封入装置が、約５０,０００ダルトン〜 約５００,０００ダルトンの分子量を有する化合物に対して透過性の材料から構 成される、請求項９の方法。 16．前記評価工程がin vitroで行われる、請求項１の方法。 17．前記評価工程がin vivoで行われる、請求項１の方法。 18．前記標的細胞がレトロウィルス感染細胞である、請求項７の方法。 19．前記レトロウィルス感染細胞がヒト免疫不全ウィルスを含有する、請求項18 の方法。 20．前記標的細胞が前記哺乳動物内で複製できないウィルスで感染されている、 請求項１の方法。