JPH08510132A

JPH08510132A - あらかじめｄｎａに結合させたｒｎａポリメラーゼを用いた遺伝子発現系

Info

Publication number: JPH08510132A
Application number: JP6525753A
Authority: JP
Inventors: イー．ワグナー，トーマス; チェン，シャオチュオ; リ，ユンシェン
Original assignee: オハイオユニバーシティーエディソンアニマルバイオテクノロジーインスティチュート
Priority date: 1993-05-14
Filing date: 1994-05-13
Publication date: 1996-10-29
Also published as: EP0751998A4; EP0751998A1; CA2162867A1; AU698174B2; AU6949894A; US5591601A; US5846949A; WO1994026911A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、真核生物細胞中における遺伝子発現系に関する。特に、複合体を細胞中に導入する前にDNA構築物に予め結合されたRNAポリメラーゼを利用した、自己開始及び自己維持性遺伝子発現系に関する。この系は宿主細胞のゲノム中に組み込まれることなく細胞の細胞質中で機能でき、遺伝子発現の開始と維持のために宿主細胞因子を必要としない。従って本発明は、休止細胞における遺伝子治療を含むin vitro及びin vivo遺伝子発現において広範な用途を有する。

Description

【発明の詳細な説明】あらかじめＤＮＡに結合させたＲＮＡポリメラーゼを用いた遺伝子発現系１．序本発明は真核細胞における遺伝子発現系に関する。特に、本発明は細胞へのＤＮＡ−ＲＮＡポリメラーゼ複合体の導入に先立ってＤＮＡ構築物にあらかじめ結合させたＲＮＡポリメラーゼを使用する、自己開始性および自己維持性の遺伝子発現系に関する。この系は、宿主細胞ゲノムへの組み込み無しに、細胞質において機能することができ、また遺伝子発現の開始および維持のために宿主細胞の因子を必要としない。それゆえ本発明は、休止細胞における遺伝子治療を含むin v itroおよびin vivo遺伝子発現において広範な用途を持つ。２．発明の背景２．１．外因性遺伝子発現組換えＤＮＡ技術の進歩は真核細胞における外因性外来遺伝子の発現を可能とした。外来遺伝子発現は遺伝子機能の研究および適切にプロセシングされた遺伝子産物の産生を容易にしたばかりではなく、遺伝子治療において機能的に活性な遺伝子を導入することによって遺伝子の欠陥を正す可能性をもたらした。多数の遺伝子デリバリー（delivery）および発現系が開発され、真核細胞において外来遺伝子を発現するのに成功裏に使用されてきた。だが、動物においてはそれほど満足すべき結果は出ていない。これらの系は根本的にはＤＮＡデリバリー方法およびＤＮＡ発現ベクターからなる。ＤＮＡデリバリー方法には、リン酸カルシウム沈降（Wiglerら，1979， Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.76:1373-1376）、DEAE-デキストラン（Sompagna cら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78:7575-7578）、リポフェクション（lipofection）（Felgnerら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.84:7413 -7417）、エレクトロポレーション（Neumannら，1982，EMBO J．7:841-845）、レトロウイルス（Schimotohonoら，1981，Cell 26:67-77）、直接ＤＮＡ注入（B envenstyら，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:9551-9555；Wolffら，1 990，Science 247:1465-1468）、特異的受容体を介するＤＮＡ取り込み（Wuら， 1988，J．Biol．Chem．263:14621-14624；Wuら，1989，J．Biol．Chem．264:169 85-16987）、および、より最近になってエアロゾルＤＮＡデリバリー（Striblin gら，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:11277-11281）が含まれる。発現ベクターは、一般的には、遺伝子が所与の細胞に導入されたときにその発現を制御する調節配列に連結された興味の対象の遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡである。これらの遺伝子発現系は、遺伝子の転写を引き出すために通常真核生物または哺乳動物のプロモーターを使用するので、発現のためには宿主細胞の核内への外因性遺伝子の導入と組み込みを必要とする。しかし、ＤＮＡを取り込んだ細胞のうちごくわずかのものが細胞核内に外来ＤＮＡを含有するにすぎない。この問題は、全動物が外来遺伝子発現の標的である場合に一層明らかになる。なぜなら、導入されたＤＮＡの核内への組み込みに必要な細胞分裂は、培養された細胞系において高頻度で起こるほど組織の細胞において常に起こるとは限らないからで、これは外因性遺伝子の非分裂細胞への組み込みを困難としている。他方、細胞および動物による外来ＤＮＡの細胞質への取り込みは有効であることを証拠が示した（Felgnerら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．84:7413 -7417）。また、ある状況下では、全動物組織の細胞に導入されたＤＮＡは数カ月まで細胞質に留まることが観察された（Wolffら，1990，Science 247:1465-14 68）。２．２．バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（RNAP）は、幾つかの独特な生化学的特徴のゆえにin vitroおよびin vivoでバクテリアおよび真核細胞において広範に研究されてきた。特に、Ｔ７ＲＮＡＰは他の細胞転写因子の関与無しに、高いプロモーター特異性および効率をもって転写を実施することのできる単一ポリペプチド酵素である（Davanlooら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A ．81:2035-2039；Dunnら，1983，J．Mol．Biol．166:477-535；Studierら，1990 ，Methods Enzymol．185:60-89）。例えば、Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルス、またはＴ７ＲＮＡＰを構造的に（constitutively）発現する細胞系が、Ｔ７プロモーターに連結された興味の対象の遺伝子の哺乳動物細胞細胞質における発現を促進するために使用されてきた（Fuerstら，1986， Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:8122-8126；Fuerstら，1989，J．Mol．Biol ．206:333-348；Elroy-Steinら，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．86:612 6-6130；Elroy-St einら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87:6743-6747）。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子がＴ７プロモーターを含有する哺乳動物ベクターに挿入され、Ｔ７ＲＮＡＰを発現する安定な細胞系にトランスフェクトされた時、トランスフェクトされた細胞においては細胞質タンパク質の30%もがCAT酵素であることが判明した（Elroy-Steinら，1990，Proc．Nat l．Acad．Sci．U.S.A．87:6743-6747）。しかし、このようなＴ７遺伝子発現系の主な制限は、遺伝子発現をそれ自体もＴ７ＲＮＡＰ遺伝子（これは真核細胞では外因性に発現させられない細菌遺伝子である）を発現する細胞系において実施しなければならないという点である。３．発明の概要本発明は、ＤＮＡ分子にあらかじめ結合させたＲＮＡポリメラーゼを使用した、自己開始性で自己維持性の遺伝子発現系、ならびにin vitro細胞系およびin v ivo組織での遺伝子発現（遺伝子治療を含む）におけるこの遺伝子発現系の使用に関する。この遺伝子発現系の独特な構成要素は、宿主細胞因子の関与を要請すること無く、また宿主細胞ゲノムへの組み込み無しで、遺伝子の転写を可能とする。本発明は、Ｔ７ＲＮＡＰと結合したあるＤＮＡ構築物由来の重要な遺伝子発現を出願人が見いだしたことに部分的に基づいている。このＤＮＡ構築物は、Ｔ７プロモーターによって制御されるＴ７ＲＮＡＰ遺伝子、および第２のＴ７プロモーターの制御下にある機能性またはレポーター遺伝子（すなわち、興味の対象である遺伝子）をコードする別のヌクレオチド配列を含有する（Ｔ７Ｔ７/Ｔ７- 遺伝子構築物）。この系を他の遺伝子発現系から区別する上記構築物の独特な特徴の１つは、遺伝子発現の開始および維持の両方が、構築物を宿主細胞に導入するに先立ち、Ｔ７ＲＮＡＰのＤＮＡへの結合に依存することである。プラスミドＤＮＡにあらかじめ結合したＲＮＡＰの複合体は、細胞への導入の間、分離すること無く安定している。ＤＮＡ−ＲＮＡＰ酵素複合体がいったん細胞の細胞質へ入ると、プラスミド内にあらかじめ結合されたＴ７プロモーターを介して、あらかじめ結合されたＴ７ＲＮＡＰによって直ちに転写が開始される。次に、これに続くＴ７ＲＮＡＰ酵素の産生が機能性／レポーター遺伝子の転写を開始させるとともに、さらなるＴ７ＲＮＡＰの合成が継続される。このように、この発現系は自己開始性であり、かつ自己維持性の系なのである。Ｔ７ＲＮＡＰおよび機能性／レポーター遺伝子の両方の転写は、これらの遺伝子を核内に組み込まずに、細胞質で新たに合成されたＴ７ＲＮＡＰによって繰り返し行なうことができる。分泌タンパク質をコードするヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子、両方とも細胞内酵素をコードするクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が、本発明の発現系を使用してマウスおよびヒトの細胞系において、および異なるマウス組織においてin vivoで発現された。ここに記述する発現系は、細胞質に導入された、タンパク質、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする遺伝子配列の広範な宿主細胞（有糸分裂的に休止している細胞を含む）における効率的な発現のための方法を提供する。４．図面の簡単な説明図１。Ｔ７Ｔ７/Ｔ７-遺伝子発現系における自己開始性および正のフィードバックループという特徴の図式的提示。Ａ．共にトランスフェクトされた、あらかじめ結合させたT7 RNAPが、T7T7およびT7hGH配列の両方についてＴ７プロモーター（Ｐ_T7）からの転写を開始する（１および１’）。ＥＭＣはＴ７およびｈＧＨ転写物の翻訳においてキャップ独立配列として働く；Ｂ．新規に合成されたT7 RNA Pはトランスフェクトされた細胞の細胞質のポリメラーゼプールを補充する（２および２’）；およびＣ．細胞におけるＴ７およびｈＧＨ遺伝子発現の維持（３および３’）。このプラスミドにおいて、ｈＧＨｃＤＮＡは別のｃＤＮＡを発現するために置換することができる。図２。pT7T7プラスミドの構築。出発プラスミドとしてｐＴＭ−１およびｐＡＲ１１７３を用いた。ｐＴＭ−１はバクテリオファージＴ７（Φ１０）プロモーター（Ｐ_T7）、キャップされていない転写物の翻訳を容易にするキャッピング独立（ＥＭＣ）配列、ならびにＴ７転写終止配列（Ｔ_T7）を含有していた。ｐＴＭ− １のポリクローニング部位（ＰＣＳ）はｃＤＮＡ挿入のための幾つかの制限部位を含有していた。ｐＡＲ１１７３はT7 RNAP遺伝子（Bam HI断片）を提供した。p TLO-1において、LacＩおよびOpはそれぞれLacＩ遺伝子およびオペレーター配列を表していた。図３。プラスミドpT7hGHおよびpT7CATの構造。Ａ．はpT7hGH、Ｂ．はpT7CATである。ｐT7hGHおよびpT7CATは類似の戦略を用いて構築された。両方の遺伝子をそれぞれ別個にｐＴＭ−Ｉに挿入した。両方のプラスミドにおけるNcoI部位（pT7C ATについては５’に近い方の部位）は、ＥＭＣ配列と挿入遺伝子（ｈＧＨまたはＣＡＴ）の結合を表していた。ＮｃｏＩ部位におけるＡＴＧコドンは、ｈＧＨおよびＣＡＴタンパク質の両方について最初のアミノ酸残基を表していた。内部制限部位（ｈＧＨｃＤＮＡについてはBgl II、ＣＡＴ遺伝子についてはNcoI）は挿入遺伝子を同定するための制限分析に使用された。pT7hGHおよびpT7CATはLac Ｉ配列もオペレーター配列も含有していなかった。図４。pT7T7/T7hGHの構築。pT7hGH由来の小さい方のClaI/EagI断片を単離し、平滑末端連結によりpT7T7のEagI部位へ挿入した。pT7T7/T7hGHにおけるT7hGH断片の向きは、T7T7配列のそれと同一であった。このプラスミドにおいて、T7hGH配列はT7T7と類似した構造的配置を有した。ただし、T7hGH配列にはオペレーターは存在しなかった。図５。T7hGH系によってトランスフェクトしたマウスＬ細胞におけるｈＧＨの発現。あらかじめ結合させたT7 RNAPを有するpT7T7 + pT7hGH（２個のプラスミド）またはpT7T7/T7hGH（単一プラスミド）によってマウスＬ細胞を以下のようにトランスフェクトした。すなわち、１μｇのプラスミドＤＮＡ（２個のプラスミドについては、0.5μｇ + 0.5μｇ）を125UのT7 RNAPと共に室温で10分間インキュベートし、 20μｌのリポフェクチン（lipofectin）を最終容量が100μｌになるようにＤＮＡ-酵素複合体と混合した。５分間室温でインキュベートした後、リポソーム-ＤＮＡ-酵素混合物を6-ウエル細胞培養皿に入れたマウスＬ細胞に加えた。pT7T7/T 7hGH単独、pT7hGH + T7 RNAP、またはpMThGH（１μｇＤＮＡ／ウエル）によってトランスフェクトされた細胞試料がそれぞれ陰性および陽性対照の役割を果たした。曲線上の各点は、最低３回行なった各測定の平均値を示していた。誤差の線（error bars）は測定の標準偏差を表す。 ■pT7T7/T7hGH単独、□pT7hGH + T7 RNAP、△pMThGH、 ○pT7T7 + pT7hGH + T7 RNAP、および●pT7T7/T7hGH + T7 RNAP。図６。あらかじめ結合させたT7 RNAPを有するpT7T7＋pT7CATによってトランスフェクトしたマウスＬ細胞におけるＣＡＴ遺伝子の発現。先に記述したのと同一の方法でトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収し、ＣＡＴ活性についてアッセイした。pT7CAT単独、またはあらかじめ結合させたT7 RNAPを有するpT7CATによってトランスフェクトした細胞試料が対照の役割を果たした。誤差の線（error bars）は測定の標準偏差を表す。図７Ａおよび７Ｂ。Ｔ７系によってトランスフェクトされたマウスＬ細胞によって発現されたＴ７およびhGH mRNAのノーザンブロット分析。細胞をＴ７系によってトランスフェクトし、全ＲＮＡを単離した。ゲル電気泳動にかけ、分画されたＲＮＡを膜に転写した後、膜をまず2.6kpbの³²Ｐ標識Ｔ７プローブとハイブリダイズさせ、次に最初のＴ７プローブをはぎ取った後0.9kbpのｈＧＨプローブとハイブリダイズさせた。各試料のアクチンｍＲＮＡはＲＮＡ濃度の基準として役立つた。７Ａ．Ｔ７プローブを用いたノーザンブロット。Ａ＝pT7T7/T7hGHによってトランスフェクトされた細胞、Ｂ＝pT7hGH + T7 RNAPによってトランスフェクトされた細胞、ＡおよびＢはトランスフェクションの24時間後に単離された。ＣおよびＤ＝pT7T7/T7hGH + T7 R NAPによってトランスフェクトされた細胞；試料Ｃはトランスフェクションの24 時間後に、またＤは48時間後に単離された。７Ｂ．ｈＧＨプローブとハイブリダイズさせた同一の膜。レーンの順番は７Ａと同一である。図８。pT7T7/T7LucプラスミドＤＮＡの注射によるマウス尾結合組織におけるルシフェラーゼ発現。異なる量のプラスミドＤＮＡ pT7T7/T7Lucを試験管内でT7 R NAPと結合させ、１〜２月齢のBALB/cマウスの尾結合組織に注射した。注射の24 時間後に、300μｌのルシフェラーゼ溶解緩衝液を用いて注射した尾組織をホモジナイズし、次に遠心にかけて細胞破砕物を沈降させた。各試料由来の細胞溶解物５μｌをルシフェラーゼアッセイに使用した。図９。pT7T7/T7LucプラスミドＤＮＡの注射によるマウス脚筋におけるルシフェラーゼ発現。ＰＢＳまたはT7 RNAPと結合したpT7T7/T7Luc（25μg）を含有する1 00μｌの溶液を25 Ｇ針を用いてマウスの後脚筋に注射した。注射の24時間後に、注射した脚筋を単離し、ホモジナイズし、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。図10。直接ＤＮＡ注射によるマウス肝臓におけるルシフェラーゼ発現。T7 RNAP と結合したpT7T7/T7LucＤＮＡを50または100μｇ含有する100μｌのDMEM溶液をB ALB/cマウス肝臓の一葉に注射した。注射の24時間後に、マウス肝臓を摘出し、ホモジナイズし、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。図11。pT7T7/T7LucプラスミドＤＮＡの注射によるマウス脳におけるルシフェラーゼ発現。ＰＢＳまたはpT7T7/T7LucＤＮＡ-T7 RNAP複合体を含有する50μｌの溶液を20日齢のBALB/cマウスの脳組織内に注射した。注射の16時間後に脳組織を摘出し、400μｌのルシフェラーゼ溶解緩衝液中で溶解させた。10μｌの細胞溶解物を上記のようにルシフェラーゼ活性についてアッセイした。図12。マウス脳組織および脳脊髄液におけるヒト成長ホルモンの発現。ＰＢＳ。 pT7T7/T7hGH + T7 RNAP、またはpT7T7/T7hGH + T7 RNAP + リポフェクチンを含有する50〜80μｌの溶液を、20日齢のマウスの頭の頂部から脳脊髄液内に注射した。注射の20時間後に、注射したマウス由来の脳脊髄液および脳組織を単離し、ホモジナイズし、hGH RIAによってｈＧＨ活性をアッセイした。ＣＳＦ＝脳脊髄液、ＢＴ＝脳組織。５．発明の詳細な説明本発明は、真核生物宿主細胞中における遺伝子発現系に関する。この系は、RN Aポリメラーゼの、その同起源の（cognate）プロモーターとRNAPコード配列を含むように構築されたDNA分子に対する結合に依るものであり、機能性／レポーター遺伝子も、細胞のトランスフェクションに先立って、同一の同起源のプロモーターにより駆動されることから、他の発現系とは異なっている（図１）。この構成により、RNAP遺伝子の発現のための強力な正のフィードバックループが形成される。このDNA-酵素複合体を真核生物細胞中に導入すると、RNAP及び機能性／レポーター遺伝子の転写が、予め結合された（prebound）RNAPにより開始される。予め結合したRNAPは、RNAP及び機能性／レポーター遺伝子の両者の発現に必要なものであり、新たに合成されたRNAPの翻訳により補充される。この発現系は、機能性／レポーター遺伝子の発現が細胞質で起こることができ、核の関与を何ら必要としないように設計されたものである。本発明を次項においてより詳細に説明するが、説明することのみを目的とするもので、限定を意図するものではない。記載を明確にするため、特定の遺伝子及び細胞系を使用して本明細書中に記載した手順及び方法を例示するが、これらは単に本発明を実施するための例示である。同様の手順及び方法をあらゆる遺伝子及び組織に使用することが可能である。 5.1 タンパク質コード配列の単離本発明の発現系は対象となる任意の遺伝子を真核生物細胞内で発現させるのに使用できる。下記6.1.3の項に記載するものと同様の方法により単離された遺伝子配列をプラスミド中に挿入することができる。対象となる遺伝子産物をコードする遺伝子配列を単離するためには、タンパク質を製造する細胞源からメッセンジャーRNA（mRNA）を得、そのゲノム配列は任意の細胞源から得ることができる。この目的のために、便利なDNA源として、タンパク質コード配列を含む遺伝子工学により製造された微生物あるいは細胞系を使用することができる。当分野で周知の方法を使用して、生成されたDNA断片からcDNAまたはゲノムライブラリーのいずれかを調製することができる。特定のタンパク質をコードする断片は、精製タンパク質から得られたアミノ酸配列の情報に基づく該タンパク質の一部分に相同なヌクレオチドプローブによりそのようなライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。あるいは、抗体プローブを使用して、発現クローニング法により生成されたライブラリー、例えばλgt11（Youn g and Davis，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80:1194-1198）をスクリーニングすることができる。対象となる遺伝子の部分配列が判っているときは、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、LCR（リガーゼ連鎖反応）等を使用してクローンを生成し同定することができる。（Innis et al.，1990，PCR Protocols，Academic Press Inc.，New York）。コード配列の一部をクローニング及び発現に使用することもできるが、完全長のクローン、即ち、タンパク質の全コード領域を含むものが発現のために好ましい。この目的のためには、DNAの単離、適当な制限断片の生成、クローン及びライブラリーの構築、及び組換え体のスクリーニングのために当業者に周知の技術を使用することができる。（例えば、Ma niatis et al.，1989，Molecular Cloning，A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.に記載された技術を参照）。特定のコード配列を同定しクローニングするために選択した方法にかかわらず、発現クローニング法を使用してスクリーニングに要する労力を実質的に軽減することができる。最近、抗体遺伝子のクローニング及び発現のための一段階法が報告されている（McCafferty et al.，1990，Nature 348:552-554；Winter and Milstein，1991，Nature 349:293-299）。この技術に基づいて、任意の遺伝子を、バクテリオファージ、例えばλあるいはfdのコートタンパク質遺伝子に隣接する部位においてベクターに同様に直接クローン化することができる。対象の遺伝子を有するファージは、その表面に融合タンパク質を発現し、特異的な抗体を含むカラムを使用して結合活性を有するファージ粒子を選択し単離することができる。λ-Zap-bluescriptを使用した市販の発現クローニング系をcDNAライブラリーのクローニング及び抗体スクリーニングに使用することもできる（Stratagene ，La Jolla，CA）。一時的な遺伝子発現系を使用して対象の正確な遺伝子を同定することができる。例えば、COS細胞系（例えば、Gerard & Gluzman，1986，Mol ．Cell．Biol．6(12) 4570-4577）を使用することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、任意の既知の遺伝子について類似のアミノ酸配列をコードするその他のDNA配列を、その遺伝子産物のクローニングと発現のために、本発明の実施において使用することができる。そのような変更としては、欠失、付加、あるいは異なるヌクレオチド残基の置換等があり、同一または機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列が得られる。遺伝子産物は配列内に欠失、付加、または異なるアミノ酸残基の置換を含んでいてもよく、これは影響のない変化を生じ、従って生物学的に活性な産物が生成される。そのようなアミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性等の類似性に基づいて行われる。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に帯電したアミノ酸としてはリシン及びアルギニンが挙げられ、同様な親水性値を有する非帯電極性頭部基を有するアミノ酸としては以下のもの、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。オリゴヌクレオチド配列を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により単一の遺伝子配列のコピー数を増加させることができる。この方法により、縮重オリゴヌクレオチドを使用して得られたものよりもより特異的なプローブが得られる。さらに、構造的な改変を有するが、コードするタンパク質の生物学的活性を実質的に変更しないその他のDNA配列を使用して本発明を実施することもできる。そのような改変としては、限定するものではないが、追加的なプロセシング部位及び／またはグリコシル化部位の削除を生成する、タンパク質中におけるアミノ酸残基の付加、欠失あるいは置換が挙げられる。例えば、ある種のタンパク質においてはN-結合グリコシル化部位を除去すると発現産物におけるグリコシル化が減少し、これは酵母発現系において特に有用である。 5.2. アンチセンスRNA及びリボザイム種々のmRNAの翻訳を阻害するように機能するアンチセンスRNA及びリボザイムを含む、オリゴリボヌクレオチド配列の発現も本発明の範囲に包含される。アンチセンスRNAは、標的となるmRNAに結合し、またリボソームの結合及び／またはトランスロケーションを阻害し、あるいはmRNA分子自身のヌクレアーゼ分解をもたらすことによりタンパク質翻訳を阻害し、mRNAの翻訳を直接ブロックする。リボザイムは、RNAの特異的な切断を触媒することができる酵素的なRNA分子である。リボザイムの作用のメカニズムには、リボザイム分子の相補的標的RNAに対する配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のヌクレオチド内切断（en donucleolytic cleavage）が関与する。mRNA配列のヌクレオチド内切断を特異的にかつ効率的に触媒する、操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が本発明の範囲に包含される。任意の可能性のあるRNA標的中の特異的リボザイム切断部位は、以下の配列、G UA、GUU及びGUCを含むリボザイム切断部位について標的分子を走査することにより最初に同定される。同定されたら、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適当なものにし得る、二次構造の如き予測される構造的特徴に関して評価することができる。候補標的の適性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのしやすさを試験することにより評価することもできる。アンチセンスRNA及びリボザイムの両者は、核酸分子の合成のために当分野で知られている任意の方法により製造することができる。これらには、当分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドの化学的合成のための方法、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成が含まれる。あるいは、RNA分子は、アンチセンスRNA 分子をコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によっても生成することができる。そのようなDNA配列を本発明の発現系に導入することができる。細胞内安定性及び半減期を増大させるための手段として種々の改変をDNA分子に導入することができる。可能な改変としては、限定するものではないが、分子の5'及び／または3'末端にリボまたはデオキシヌクレオチドの隣接配列を付加すること、あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチドバックボーン中でホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート又は2'0-メチルを使用すること等が挙げられる。 5.3. 自己開始及び自己持続遺伝子発現系本発明の一つの形態によれば、RNAポリメラーゼを、該RNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列に機能可能なように結合された該RNAポリメラーゼの同族のプロモーターを含むDNA構築物に結合することにより、自己開始（self-init iating）及び自己維持性（self-sustaining）遺伝子発現系を構築することができる。機能可能なように結合したとは、本明細書では、宿主細胞中においてRNAポリメラーゼによりプロモーターからの転写を行い、RNAポリメラーゼタンパク質に翻訳できる機能的なRNA転写物を生成することを記載するのに使用するものである。RNAポリメラーゼコード配列をプロモーター配列に機能可能なように結合する遺伝子構築物であって、同じRNAポリメラーゼにより認識されるものを以下、自己遺伝子（autogene）と指称する（Dubendroff and Studier， 1991，J．Mol．Biol．219:61-68、「自己遺伝子」の用語の起源、及びT7 RNAポリメラーゼ自己遺伝子の例について）。本発明のRNAポリメラーゼは、意図される真核生物宿主細胞中で転写を行うことができるものでなければならない。該RNAポリメラーゼは組成において複雑なものでなく、例えば複数のサブユニットからなり、その同起源のプロモーターに対して十分に高い親和性を有し、その複合体が宿主細胞中への導入の間維持されるものであることが好ましい。２個以下のサブユニットからなる機能的なRNAポリメラーゼが好ましい。より好ましいのは、ホモマーのみからなるRNAポリメラーゼである。最も好ましいのは、小さい単一単位の酵素であり、活性のために宿主細胞因子を必要とせず、高い特異度でその同起源のプロモーター配列を認識し、そして高い活性を有するRNAポリメラーゼである。本発明において使用するのに適したRNAポリメラーゼの例としては、限定するものではないが、T7、T3、SP6 またはK11バクテリオファージのRNAポリメラーゼ、あるいはミトコンドリアのRN Aポリメラーゼのものが挙げられる（Chamberlin and Ryan，1983，Dietz et al ，1990，Mol．Gen．Genet．221:283-286；Schinkel and Tabak，1989，Trend Ge net．5:149-54参照）。本発明の自己遺伝子構築物は、一般に、5'から3'の方向に結合された５つの成分、すなわちRNAポリメラーゼの同起源のプロモーター、5'非翻訳RNA（UTR）をコードする配列、RNAポリメラーゼをコードする配列、3'-UTRをコードする配列、RNAポリメラーゼの同起源の転写ターミネーターを含む。これらの部分は、同起源のプロモーターからのRNAポリメラーゼによる転写が5'-UTR配列の5'-末端において始まり、5'-UTR、RNAポリメラーゼ及び3'-UTR配列をコードする配列を通して進み、同起源の転写ターミネーターで終結するように結合される。真核生物宿主細胞中でこのような自己遺伝子構築物から生成された転写物は、その5'-末端に5'-UTR配列、中央にRNAポリメラーゼ配列、及び3'-末端に3'-UTR配列を有するRNAを含む。同起源のプロモーター配列は、RNAポリメラーゼをコードするゲノムからクローニングされたプロモーター配列とすることができる。プロモーターの位置は当分野で周知の技術及び方法により同定することができ、そのようなものにはRNAP 結合ゲノムDNAのDNaseフットプリンティング、変異分析等が含まれる。あるいは、同起源のプロモーターの配列が判っている場合は、プロモーター配列を合成することができる。同起源のプロモーターを、その3'-末端に細菌オペレーター配列、例えばlacオペレーターを結合することにより改変することが有利であり得る。そのようなオペレーター配列は、細菌宿主中で自己遺伝子を含む構築物の毒性を減じるように作用し得る。オペレーターは短い配列であることが有利であろう。好ましくはオペレーターは50塩基対以下である。最も好ましくはオペレーターは25塩基対以下である。改変されていないかまたは改変された同起源のプロモーターは、その3'-末端において5'-UTRコード配列の5'-末端に機能可能なように結合され、同起源のプロモーターからのRNAポリメラーゼによる転写が、5'-UTR配列の開始点（例えば5 '-末端）においてRNA合成を開始するようにされる。 5'-UTR配列は、その5'-末端で「キャップ」されるべきRNAを必要とすることなく、真核生物宿主細胞中で翻訳開始複合体の形成を可能とするRNAをコードする（Kozak，1983，Microbiol．Rev．47:1-45）。好ましくは5'-UTR配列は、ピコルナウィルス、例えば脳心筋炎（EMC）ウィルス、ポリオウィルス、メンゴウィルス等の5'非翻訳領域からのRNA配列をコードする。最も好ましくは、5'-UTR配列はEMCウィルスRNAの5'非翻訳領域をコードする（Elroy-Stein et al.，1989，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 86:6126-6130参照）。細菌宿主中における自己遺伝子構築物の毒性を低減するために、5'-UTR配列の3'-末端に存在する偶発的な「シャイン−ダルガルノ」配列を削除し又は変異させることが有利であり得る。本発明によれば、5'-UTR配列の3'-末端は、RNAポリメラーゼコード配列の5'- 末端に結合される。RNAポリメラーゼコード配列は適当なゲノムからのクローニングにより得ることができる。RNAポリメラーゼコード配列をクローニングする技術及び方法は当分野で周知である。それらには、RNAPの精製ペプチドから誘導されたヌクレオチドプローブ、又は関連RNAPからのヌクレオチドプローブを、ゲノムもしくはcDNAライブラリーを釣り上げるために、又はPCR、LCR等の技術を用いてクローンを生成するために使用することが含まれる。あるいは、所望のRNAポリメラーゼのアミノ酸又はヌクレオチド配列が判っている場合には、その自己遺伝子を発現する宿主細胞に最も好ましいコドン選択を使用して、遺伝コードに従ってRNAポリメラーゼコード配列を合成することができる。適当な場合には、RNAポリメラーゼコード配列の5'-末端を改変して、ポリメラーゼコード配列の5'-UTR配列の3'-末端への結合の結果としてフレーム外（RNAポリメラーゼコード配列に対して）AUGコドンが形成されないようにすることが有利であり得る。必要な改変は当分野で周知の方法を使用し得るものであり、部位特異的突然変異、短い配列の付加もしくは削除、及び／又はその他の任意の配列操作が含まれる。本発明によれば、3'-UTRコード配列の5'-末端はRNAポリメラーゼをコードする配列の3'-末端に結合される。3'-UTRコード配列は、真核生物宿主細胞中で自己遺伝子転写物を安定化するRNA配列をコードするものである。そのような機能を果たす配列としては、ヒストン遺伝子の3'非翻訳RNA配列をコードするもの、又はポリA領域としてよく知られている、ポリアデニレートヌクレオチド領域が挙げられる。ヒストン3'非翻訳RNA配列を自己遺伝子構築物の3'-UTRとして使用する場合は、ヒストン遺伝子配列源は、自己遺伝子を発現するその真核生物宿主細胞であることが好ましい。ポリAコード配列を自己遺伝子構築物内の3'-UTR配列として使用する場合は、該配列は合成することができる。3'-UTR配列によりコードされるポリA領域の長さは、好ましくは25ヌクレオチドより長く、250ヌクレオチドよりも短いものである。40〜 50ヌクレオチドの長さのポリA領域をコードする配列が最も好ましい。本発明によれば、同起源の転写ターミネーター配列は3'-UTRをコードする配列の3'に直接結合される。このターミネーター配列はRNAポリメラーゼをコードするゲノムからクローニングすることができる。そのようなターミネーター配列をクローニングする技術及び方法は当分野で周知のものであり、配列決定によるRN A転写物の3'末端の物理的マッピング、RNアーゼ保護等、又は突然変異誘発による遺伝子マッピング、欠失分析等が含まれる。あるいは、同起源のターミネーターの配列が判っている場合には、該配列は合成することができる。本発明の種々の態様において、RNAポリメラーゼはいくつかの異なるタンパク質からなるものであってもよい。そのような場合、ヘテロマータンパク質のそれぞれをコードする自己遺伝子を構築し、それぞれの自己遺伝子構築物にRNAポリメラーゼを予め結合させ、RNAポリメラーゼの全てのサブユニットについてのタンパク質−DNA複合体を同時に宿主細胞中に導入することにより本発明を実施することができる。RNAポリメラーゼが少ないサブユニットからなる場合は、全てのRNAポリメラーゼ自己遺伝子を含む単一のDNA構築物を使用するのが有利であり得る。本発明の別の形態においては、自己開始及び自己維持性遺伝子発現系を使用して、タンパク質、アンチセンス分子又はリボザイムを含む、その他の遺伝子産物を真核生物宿主細胞内で発現させることができる。そのような遺伝子産物は、真核生物宿主細胞中に、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子構築物を含むDNAを、 RNAポリメラーゼに予め結合されたRNAポリメラーゼ自己遺伝子をコードするDNA とともに導入することにより発現させることができ、ここで所望の遺伝子産物をコードする遺伝子構築物は、RNAポリメラーゼの同起源のプロモーターの制御下にあるものである。本発明においては、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子構築物の構築は、所望の遺伝子産物をコードする配列がRNAポリメラーゼをコードするものに置き代わっていることを除いて自己遺伝子のものと同一である。即ち、遺伝子構築物は、同じく5'から3'方向に結合した、同じく５つの部分：RNAポリメラーゼの同起源のプロモーター、5'-UTRをコードする配列、所望の遺伝子産物をコードする配列、3'-UTRをコードする配列、RNAポリメラーゼの同起源の転写ターミネーターを含む。所望の遺伝子産物がアンチセンスRNA又はリボザイムである場合は、5'- UTR及び3'-UTRをコードするDNA配列を遺伝子構築物から省略でき、有利である。さらに、同じ同起源のプロモーターの２つのコピーの制御下にある、自己遺伝子及び対象の遺伝子の両者を含む単一のDNA構築物も本発明の範囲に包含される。単一の単位発現系は、２つの別々のプラスミドからなる２元系よりも、宿主細胞中への導入についてより効率的であり得る。本発明の遺伝子構築物を含むプラスミドは、構築物を細菌中で増殖させるための選択可能マーカーを含んでもよい。そのような選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子を含んでもよく、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン又はクロラムフェニコール等に対する耐性を与えるものである。さらに、本発明の自己遺伝子構築物を含むプラスミドは、細菌の発現可能なリプレッサー遺伝子をコードしてもよく、この場合コードされたリプレッサーは、自己遺伝子のRNAポリメラーゼプロモーターを改変するオペレーター配列を認識するものである。利用できるリプレッサー遺伝子の例としては、ラクトース、ヒスチジン、トリプトファンオペロン等のものが挙げられる。本発明に独特な特徴は、トランスフェクションの前にRNAPをDNAに予め結合できることである。細胞に導入する際のその結合を可能とするのに十分なDNAに対する親和性を有するRNAPを、本発明を実施するのに使用することができる。実際に、そのような親和性を有するものであれば、いずれのDNA結合タンパク質をも本発明のこの形態に使用することができる。慣用の方法、例えば、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション、エレクトロポレーション、DEAE-トランスフェクション等を使用して複合体を宿主細胞中に導入することができる。 5.4. 自己開始及び自己維持性遺伝子発現系の使用本発明は、いくつかの独特な特徴を有する遺伝子発現系に関する。この系は、宿主細胞因子を使用することなく遺伝子を発現するのに必要な全ての成分を含んでおり、従って自己開始し、かつ自己維持するものである。その結果、この系は細胞の種類から独立した遺伝子発現を与えることができ、これはヒト及びマウス細胞の両方におけるいくつかの遺伝子の同等な発現効率により示されている（下記実施例６参照）。さらに、転写を開始するためにDNAを細胞の核に導入する必要がないので、遺伝子の発現が迅速である。その作用の部位が細胞質の位置であることにより、宿主細胞ゲノム中の癌遺伝子のような休眠遺伝子に近接した部位で組み込まれて、それを活性化させてしまうような可能性を減少させる安全な特徴も得られる。さらに、レトロウィルスベクターとは異なり、もしDNAの組み込みが起こっても、使用される外来のプロモーターは真核生物転写タンパク質により活性化されない。プロモーター配列を活性化して転写を開始することができるRN APのみが細胞の細胞質で合成され、それは核トランスロケーションシグナルを欠いていることから、その同起源のプロモーターに対して結合するために核に接近することができない。この発現系は種々の用途を有する。例えば、その細胞種について適当なプロモーターが入手できないような場合の、特異的な細胞種中での遺伝子の発現に特に適している。新たにクローニングされた遺伝子のコードする遺伝子産物の正体を確認するためにその遺伝子をin vitroで一時的に発現させること、並びに特異的な抗体の産生のために動物を免疫化するのに使用する際の大量のタンパク質の迅速な製造にも有用である。この点、本発明を使用して外来遺伝子をin vivoで細胞及び組織に導入して遺伝子産物を一時的に発現させ、抗原特異的な宿主免疫反応を生起することができる。遺伝子発現が短時間である特性は、抗原に対する宿主のin vivo免疫化のビヒクルとしての使用に理想的であり得る。遺伝子治療の現在の試みにおける主要な障害は、非分裂真核生物宿主細胞中に外来遺伝子を組み込むことである。本発明の系の細胞の細胞質中で遺伝子を発現することを可能とする能力によれば、静止期の細胞中で遺伝子発現を達成することが可能であることから、この重大な問題を回避することができる。しかし、DNA構築物は細胞質中で次第に分解され、時間の経過とともに細胞が分裂した場合にその数において希釈されるので、本発明は自己制限的なものでもある。この発現系の自己制限的な性質は、遺伝子発現が一時的又は暫定的なだけのものであることが望ましいセッティングにおいて特に適している。例えば、本発明は、in vivoでリンホカイン遺伝子を腫瘍部位に向かわせ、細胞障害性リンパ球をin situで活性化させ腫瘍細胞溶解を媒介するのに使用できる。外来遺伝子の発現が一時的であるため、かかるプロセスにおける溶解していない細胞によるDNAの取り込みにより、例えば自己免疫のような潜在的に身体に有害な結果を招く継続的で持続的なリンホカインの合成を結果として誘導してしまうことがない。本発明は、単一単位又は二元系として使用される発現系を包含する。単一単位系は、RNAP遺伝子と、RNAPに予め結合した同じDNA構築物内の対象の遺伝子とを含む。二元系は、RNAPにより予め結合されたRNAPを含む自己遺伝子と、やはりRN APにより予め結合された、同じ同起源のRNAPプロモーターにより駆動される対象の遺伝子を含む別のプラスミドとを含む。多くの場合において、単一のDNA構築物を宿主細胞中に導入するのが最も便利である。しかし、２つのプラスミド系は、異なる比率の２つのプラスミドを使用することによって、発現されたRNAPと対象の遺伝子産物との比を調整することが望ましいセッティングにおいて特に有用である。このようにして、この系により、特にRNAPが対象の遺伝子よりもずっと速い速度で合成される場合に、１つのタンパク質の他方に対する無制御な発現を防止する。発現系はRNAPと複合化させ、生理食塩水、PBS、無血清培地、又はin vivo投与に適した任意の水溶液中に中に懸濁することができる。該溶液はヒトを含む動物に、静脈内、筋肉内、頭蓋内もしくは皮下又は組織もしくは器官中に直接注射することができる。DNA-RNAP複合体は、単独で注射してもよく、リポソームに封入してもよく、あるいは血漿膜を横切って複合体を移動させることができる任意のキャリア分子に結合してもよい。in vivo投与については、前記発現系は0.01〜1 00mg/kgの投与量の範囲で注射することができる。対象の遺伝子産物が血流中に分泌されることが望まれる場合には、複合体を静脈内注射して内皮細胞取り込みを生起し、遺伝子産物を循環中に直接放出させることができる。６．実施例：ＤＮＡにあらかじめ結合させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼは培養された細胞系において遺伝子発現を引き出す６．１．材料および方法６．１．１．酵素バクテリオファージT7 RNAP（50U/ul）、制限エンドヌクレアーゼおよびクレノウ断片はNew England BioLabsより購入した。６．１．２．細胞およびプラスミドマウスＬ細胞およびヒトHepG2細胞は、10%Nu血清または10%ウシ血清を補充したDMEM（増殖培地）でそれぞれ維持した。大腸菌ＤＨ５αはBethesda Research Laboratoriesより入手した。pLysEを有する大腸菌ＨＭＳ１７４（Studierら，19 90，Methods Enzymol．185:60-89；Studier，1991，J．Mol．Biol．219:37-44）；T7 RNAPをコードする遺伝子を含有するプラスミドpAR1173（Davanlooら，1984 ，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．81:2035-2039）；およびLacＩ遺伝子を含有するpATUO-1（DubendorffおよびStudier，1991，J．Mol．Biol．219:61-68）はS tudier博士より提供された。プラスミドpTM-I（Mossら，1990，Nature 348:91-9 2）はMoss博士の研究室より入手した。プラスミドｐｈＧＨ（Martialら，1979， Science 205:602-607）はGoodman博士の研究室より入手した。ＣＡＴ遺伝子を含有するプラスミドpBLCAT（LuckowおよびSchutz，1987，Nucleic Acids Res．15: 5490）はT．Coleman博士より入手した。マウスメタロチオネインＩプロモーター（Brinsterら，1981，Cell 27:223-231）によって制御されるhGH cDNA（Martial ら，1979，Science 205:602-607）を含有するpM ThGHは発明者の研究室で構築した。細菌は適切な抗生物質を含むＬＢ培地で増殖させた。６．１．３．プラスミドの構築３’末端でＥＭＣキャッピング独立配列（Mossら，1990，Nature 348:91-92）に結合しているＴ７プロモーターを含有する細胞質発現ベクターであるpTM-Iを、制限酵素Bam HIを用いて直鎖状にした。Ｔ７遺伝子を含有するpAR1173の2.6kb p Bam HI断片を、連結によりpTM-Iベクターに挿入した。次に、連結産物を大腸菌株ＤＨ５αに導入した。しかし、組換えクローンの100%がプロモーターの向きと逆向きに挿入されたＴ７遺伝子（これはＴ７Ｔ７ではなくＴ７７Ｔ構築物を形成した）を持つことが判明し、このことはＴ７Ｔ７構築物が宿主細菌にとって致死的であることを示唆していた（Studier，1991，J．Mol．Biol．219:37-44；Du bendorffおよびStudier，1991，J．Mol．Biol．219:61-68；DubendorffおよびSt udier，1991，J．Mol．Biol．219:45-59）。その後、上記構築物の真核細胞において発現されるという能力を保持しながら、Ｔ７遺伝子の発現に起因する細菌宿主への毒性を減少させるために幾つかの工程を採用した。第１に、リプレッサーをコードする1.6kbpのEagI/EcoNI LacＩ遺伝子をpAUTO- 1より単離し、平滑末端連結によりpTM-IのClaIおよびXbaI部位に挿入した（図２参照）。さらに、LacＩリプレッサーのための結合部位を提供するオペレーター配列GGA ATT GTG AGC GGA TAA CAA TTCC（25量体）をＴ７プロモーター配列の３ ’に接して挿入した（図２のpTLO-1に示す）。その位置で上記オペレーターはＴ７プロモーター活性の最大抑制を有することが示された（ DubendorffおよびStudier，1991，J．Mol．Biol．219:45-59）。細胞毒性をさらに減少させるための第２工程として、完璧でないLacＩ抑制の結果生じるT7 mRNA の不必要な翻訳を減少させるため、Ｔ７遺伝子のシャイン−ダルガルノ（Shine- Dalgarno）配列（S-Dボックス）をこの遺伝子から除去した（図２参照）。ファージミド（phagemid）突然変異誘発法（Kunkel，1985，Proc．Natl．Acad．Sci ．U.S.A．82:488-492；Kunkelら，1987，Methods Enzymol．154:367-382）を用いたS-Dボックス配列除去のためのプライマーとして、オリゴヌクレオチドCCC G AT TTA CTA ACT CCA TGG ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG（41量体）を使用した。さらに、NcoI部位（CCATGG，上記オリゴヌクレオチドで下線を付してある）をＴ７遺伝子に加えた。2.6kbpのNcoI/BamHI修飾Ｔ７断片を、Ｔ７遺伝子の最適化された翻訳がNcoI部位のATGから開始されるように、pTM-IのNcoIおよびBamHI部位間の隙間に挿入した（Brinsterら，1981，Cell 27:223-231）（図２参照）。しかし、この修飾はT7 RNAPの第２のアミノ酸残基をAsn（AAC）からAsp（GAC）に変えた。最後に、構築したpT7T7を、Ｔ７リゾチーム（すなわちT7 RNAPインヒビター）をコードするプラスミドpLysEを有するＨＭＳ１７４細胞に導入し、形質転換細胞を調製した。ここに記述されたすべての突然変異体はＤＮＡ配列決定（ Sangerら，1977，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．76:4350-4354）によって確認した。ｈＧＨは細菌宿主に対して毒性ではないので、pT7hGHの構築はpT7T7の構築より単純であった。SmaIを用いてpTM-Iをポリクローニング部位で切断した。hGH cDNAの0.9kbp Hind III断片をプラスミドphGHから単離し、この断片の突き出した5'末端をクレノウ断片およびdNTPsで平滑化し、平滑末端連結によりpTM-Iに挿入した。欠失突然変異体については、NcoI部位のA TGがhGH cDNAの最初のコドンとして機能するように、PT7T7に対して行なったのと同様の方法でhGH配列の読み枠を調整した（図３参照）。 PT7CATの構築はpT7hGHの構築と同様の方法で実施した。ＣＡＴ遺伝子を含有する1.7kbpのＤＮＡ断片をpBLCAT3から単離し、クレノウ断片およびdNTPsで末端を平滑化し、連結によりpTM-IのSmaI部位に挿入した。CAT遺伝子のATGコドンのT7 プロモーターに対する相対的位置もまた、欠失突然変異により最適位置に調整した（図３Ｂ参照）。ｈＧＨおよびＣＡＴ両遺伝子のための調整は、それらのアミノ酸配列における突然変異をもたらさなかった。 pT7T7およびpT7hGHの構築に次いで、これらの配列から単一プラスミドpT7T7／ T7hGHを構築した。図４に示すように、pT7T7をEagI部位で切断し、次にこのEagI 部位をクレノウ断片によって平滑化した。2.1kbpのClaI/EagI T7hGH断片をpT7hG Hから単離し、一本鎖粘着末端をクレノウ断片によって平滑化した。これら２つの配列を連結することによりpT7T7/T7hGHを作製し、次いでHMS174 pLysE細胞を用いて形質転換を行なった。pT7T7/T7hG、およびこれらの実施例に使用された他のプラスミドＤＮＡの大規模な調製は、Qiagenカラム（Quiagen製）を用いて行なった。６．１．４．ポリ（dT）尾部の付加本明細書に記述するＴ７系は細胞質発現系として設計されており、それゆえこの系によって生成されたｈＧＨおよびCAT mRNAには天然のポリ（Ａ）尾部は付加されないであろう。ｈＧＨおよびCAT mRNAの翻訳効率の安定性および可能性を増大させるため、長さが40塩基対のポリdT尾部をｈＧＨおよびＣＡＴ両遺伝子の3'末端に付加した。６．１．５．トランスフェクションマウスＬ細胞およびヒトHepG2細胞を増殖培地を用いて6-ウエル細胞培養皿で集密度80%まで増殖させた。プラスミドＤＮＡを水とT7緩衝液（New England Bio labs）を用いて無菌ポリスチレン試験管中で全容量を75μｌとして種々の濃度に希釈した。あるいは、T7緩衝液を生理食塩水、PBS又はDMEMと置換してもよい。5 μｌのT7 RNAP（500U/μl）をＤＮＡ溶液に加え、混合物を室温で10分間インキュベートし、次に20μｌ（1μg/μl）のリポフェクチンを加えた（Felgnerら，1 987，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.84:7413-7417）。穏やかに混合した後、このリポフェクチン-ＤＮＡ-酵素溶液を室温でさらに5分間インキュベートした。その間に、Ｌ細胞より増殖培地を除去し、細胞をDMEMで2回洗浄した。1.5mlのDM EMを各ウエルに加え、次に100μlのリポフェクチン-ＤＮＡ-酵素溶液を加えた。穏やかに混合した後、細胞培養物インキュベーターで培養皿を37℃でインキュベートした。４時間インキュベートした後、培地を除去し、２mlの増殖培地を各ウエルに加え、培養皿を37℃で5%CO₂のもとでインキュベートした。最初の24時間は形質転換細胞由来の増殖培地を8時間ごとに回収し、その後は24時間ごとに回収し、細胞に新鮮な増殖培地を補充した。pT7T 7/T7hGH単独、pT7hGH + T7 RNAP、またはpMThGHを用いてトランスフェクトした細胞を発現対照として使用した。慣用の発現ベクターであるpMThGHは、発現プロフィール（profile）の比較基準としても役立った。pMThGHのトランスフェクションは標準的リポフェクションプロトコールを用いて、T7 RNAPを付加せずに実施した。同様な方法で、pT7CATおよびpT7CAT + T7 RNAPをそれぞれCATアッセイの対照として使用した。DEAE-デキストラントランスフェクションにおいては、リポフェクションについて記述したのと同一の方法でＤＮＡ-T7 RNAPを調製した。DEAE-デキストランを含有するDMEMをＤＮＡ-Ｔ７酵素溶液に加えた後、細胞を以前に記述された条件下（Chenら，（1992）Mol．Endocrinol．6:598-606）でトランスフェクトした。６．１．６．ラジオイムノアッセイおよびＣＡＴアッセイ市販のＲＩＡキット（Hybritech，San Diego）を用いてｈＧＨのＲＩＡを実施した。pT7T7、pT7CATおよびT7 RNAPを共にインキュベートし、上に記述したのと同じリポフェクションプロトコールにより一過性にＬ細胞またはｈｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、6-ウエル皿の各ウエルの細胞をそれぞれ1mlのPBS中に集め、遠心にかけ、100μｌの100 mM Tris （pH 7.8）に再懸濁した。凍結と融解を３回実施した後、細胞破砕物を遠心により除去した。上清を65℃で10分間インキュベートし、次いで遠心にかけてタンパク質沈殿物を除去した。このようにして得た上清を以前に記述されているように（Neumannら，1987，Biotechniques 5:444-447）CAT活性についてアッセイした。６．１．７．ノーザンブロット分析トランソフェクションの24または48時間後に、トランスフェクトした細胞をPB S洗浄の直後に１mlのRNAzol（Cinna/Biotecx Laboratories）により溶解した。全ＲＮＡを以前に記述されたように単離した（ChomczynskiおよびSacchi，1987 ，Anal．Biochem．162:156-159）。各細胞試料由来の全ＲＮＡの20μgを1%ホルムアルデヒドゲル電気泳動にかけた。その後、分画されたＲＮＡをゲルからナイロンに基づく膜（NEN製Geen Screen Plus）に移し、³²Ｐ標識2.6kbp T7断片とハイブリダイズさせ、次にオートラジオグラフィーにより可視化した（Raveら，19 79，Nucleic Acids Res．6:3559-3567）。T7プローブをはぎ取ったのち、同じ膜を0.9kbpのhGHプローブと再度ハイブリダイズさせた。アクチンｍＲＮＡを、試料のシグナル強度を標準化するための基準対照として役立てた。６．２．結果６．２．１．プラスミドの構築図２、３Ａ、３Ｂおよび４はプラスミドpT7T7、pT7hGH、pT7CATおよびpT7T7/T 7hGHの構築を図式的に示している。pT7T7およびpT7T7/T7hGHプラスミドは、Ｔ７酵素の大腸菌に対する毒性を減少させるため、pLysEプラスミドの存在下で培養した。したがって、これらのプラスミド調製物は常に若干のpLysEプラスミドが混入していた（≦10%）。pT7CATおよびpT7hGHはそれらの細菌宿主に対して毒性ではないので、これらの複製にはpLysEは必要でなかった。Ｔ７Ｔ７配列を構築するにあたって、真核発現研究にとって十分量のプラスミドが細菌細胞から調製されるのを可能とするレベルまで細胞毒性を減少させるための努力がなされた。遺伝子操作の殆どは、クローン化された遺伝子を細菌において発現させるためのＴ７ベクターの構築に使用されたものと類似していた（St udier，1991，J．Mol．Biol．219:37-44；Dubendorffら，1991，J．Mol．Biol． 219:61-68；Dubendorffら，1991，J．Mol．Biol．219:45-59）。しかし、発現系を細菌細胞ではなく真核細胞において機能させるという目標は、さらなる遺伝子的修飾を可能とした。たとえば、大腸菌宿主細胞への毒性をさらに最小限とするための、T7遺伝子からのS-Dボックスの除去である（図２参照）。これらの操作はプラスミドの収率を増加させ、また、発現されたT7 RNAPの毒性効果により宿主細胞に加えられた選択圧によりもたらされるＤＮＡ突然変異の危険を減少させる、という点で有利である。６．２．２．リポフェクチンおよびDEAE-デキストランによるトランスフェクションの比較Ｔ７系にとってどちらのＤＮＡデリバリー方法が有効に働くかを決定するため、同じ6-ウエル細胞培養プレートを用いてリポフェクチンまたはDEAE-デキストランによる両方のトランスフェクション法を比較した。表Ｉは、Ｔ７発現系を用いたリポフェクチンおよびDEAE-デキストランによる方法の相対的トランスフェクション効率を示す。ｈＧＨアッセイに比較して、ＣＡＴアッセイはより小さい標準偏差を示した。これは、主としてＣＡＴアッセイのより高い感受性によるものであるが、またｈＧＨアッセイがDEAE-デキストランによってトランスフェクトされた細胞からの低レベルのｈＧＨ発現をＣＡＴアッセイほど正確に検出できなかったためでもある。表Ｉによって示されるように、Ｔ７発現系にとってリポフェクションはDEAE-デキストラン法より約8〜10倍効率的である。真核細胞におけるＴ７系の発現を成功させる鍵は、トランスフェクションの間、T7 RNAPを未分解の形でしっかりとＤＮＡに結合させておくことである。リポソームがＤＮＡ−Ｔ７酵素複合体をより良く保護し、および／または該複合体の細胞質への到達をより容易にした可能性がある。６．２．３．機能性／レポーター遺伝子の一過性発現６．２．３．１．ｈＧＨ発現 pT7hGHおよびpMThGHと比較した、pT7T7 + pT7hGH（２個のプラスミド）または pT7T7/T7hGH（単一プラスミド）のＬ細胞における発現を図５に示す。一過性にトランスフェクトしたＬ細胞由来の細胞培養上清を回収し、ｈＧＨについて最初の24時間は8時間ごとに、その後は24時間ごとに5日間アッセイを行った。7日目までに細胞はウエル内でひどく過増殖し、死にはじめた。検出可能レベルのｈＧＨが、トランスフェクションの早くも8時間後にはpT7T7 + pT7hGH + T7 RNAPまたはpT7T7/T7hGH + T7 RNAPによってトランスフェクトされた細胞から回収した細胞培養液中に見いだされた。トランスフェクトされたＬ細胞の培養培地中のｈＧＨは、ラットＮｂ２細胞を刺激する点で生物学的に活性であった。しかし、pMThGH（この試験の陽性対照として、また発現プロフィールの基準として役立った）の発現はトランスフェクションの24時間後まで検出できなかった。pMTbGHによるｈＧＨの発現は、７２時間後以降までＴ７系による発現より低かった。pT 7hGH＋T7 RNAP（陰性対照Ｉ）によってトランスフェクトされた細胞試料については、トランスフェクションの８時間後に回収した培養培地のみが低レベルのhG Hを示した（図５参照）。更に長いインキュベーション期間後では、発現は消えた。これは、ｈＧＨ遺伝子の発現を維持したのはＴ７遺伝子のトランスフェクション後の発現であったことを示す。あらかじめ結合させたT7 RNAPを持たないpT7 T7/T7hGH単独によってトランスフェクトされた細胞から回収した培養液には、どの時点においてもｈＧＨは検出されなかった。Ｔ７系の発現はトランスフェクションの約24〜48時間後にピーク（約3ng/ml）に達し、他方、pMThGHの発現は約96 〜120時間後にピーク（約7ng/ml）に達した。したがってＴ７系によるｈＧＨ発現の速度論は、従来の発現ベクターのそれと全く異なるように思われた。Ｔ７系を用いたｈＧＨ発現の開始は、慣用の哺乳動物プロモーターを含有するプラスミドpMThGHの発現開始よりも速かった。この結果は、組換えワクシニアウイルスと結合させたＴ７ＣＡＴベクターを用いた試験結果と一致した。この試験は、トランスフェクションの48時間後に、Ｔ７系によってトランスフェクトされた細胞はRSVCATまたはSV40CATによって発現されたCAT活性より数百倍高いCAT活性を生じた（Fuerstら，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:8122-8126）。Ｔ７系によって示された速い発現および異なる速度論は、Ｔ７系がpMThGHに用いられているものと異なる発現メカニズムを採用していることを示す。プラスミドと結合したT7 RNAPは、プラスミドが細胞質に取り込まれた直後に転写を開始し、その後急速なタンパク質合成および分泌が行なわれ、これが発現が急上昇する変化をもたらしたように思われる。対照的に、pMTh GHはｈＧＨを発現するためにはトランスフェクトされた細胞の核に到達しなければならず、これがpMThGHによるｈＧＨ発現の大幅な遅れを説明するかもしれない。この結果は、レポーター遺伝子がT7 RNAPによって細胞質において活発に転写されることを示した他の試験の結果と一致する（Fuerstら，1986，Proc．Natl． Acad．Sci．U.S.A．83:8122-8126；Elroy-Steinら，1990，Proc．Natl．Acad．S ci．U.S.A．87:6743-6747）。これはＴ７親プラスミドpTM-Iの細胞質で発現する性質とも一致する（Mossら，1990，Nature 348:91-92）。他の慣用のプラスミド系と比較してトランスフェクション後の早い時期に急速で効率的に発現することを示すため、このＴ７発現系は、迅速なアッセイが望まれる状況下でｃＤＮＡを発現するのに有用であることが実証されるであろう。６．２．３．２．ＣＡＴ発現図６はＣＡＴアッセイの結果を示す。細胞を溶解し、トランスフェクションの 48時間後にアッセイを行なった。pT7T7 + pT7CAT + T7 RNAPによってトランスフェクトされた細胞におけるＣＡＴ活性は、pT7CAT＋T7 RNAPによってトランスフェクトされた試料（陰性対照Ｉ型）のそれよりも50倍以上大きく、またpT7CATによってトランスフェクトされた試料（陰性対照II型）のそれよりも100倍以上大きかった。絶対量に基づくと、PT7T7/T7hGH + T7 RNAPまたはpT7T7＋pT7hGH＋T7 RNAPのいずれかによって発現された細胞外ｈＧＨレベルと同一の規模範囲において、細胞内ＣＡＴ活性は約2〜3ng CATタンパク質／ウエル（または細胞10⁶個あたり）に相当することが判明した。６．２．４．Ｔ７ｍＲＮＡのノーザンブロット分析Ｔ７系における機能性／レポーター遺伝子の持続的発現は同じ系におけるＴ７遺伝子の持続的発現のためであることを証明するため、トランスフェクトされた細胞由来の全ＲＮＡを単離し、図７Ａおよび７Ｂに示すようにノーザンブロットにより分析した。pT7T7/T7hGH＋T7 RNAPによってトランスフェクトされた細胞にはT7 RNAPおよびｈＧＨｍＲＮＡの両方が見い出されたが、pT7T7/T7hGH単独またはpT7hGH＋T7 RNAPのいずれかによってトランスフェクトされた細胞には見い出されなかった（図７Ａおよび７Ｂ参照）。ブロット上の主要バンドの位置は、 T7 RNAPおよびｈＧＨｍＲＮＡの予想された大きさと一致していた。また、Ｔ７ｍＲＮＡおよびｈＧＨｍＲＮＡのレベルは相互に相関することが判明した。すなわち、Ｔ７ｍＲＮＡレベルが高くなると（24時間）、ｈＧＨｍＲＮＡレベルも高くなり、逆もまた同じである（48時間試料）。６．２．５．Ｌ細胞およびHepG２細胞の両方におけるｈＧＨおよびＣＡＴの発現 pT7T7＋pT7hGHまたはpT7T7＋pT7CATによってトランスフェクトされたマウスＬ細胞およびヒトHepG２細胞によるｈＧＨおよびＣＡＴの発現が表IIに要約されている。上記の２つの細胞型は非常に異なる様式で増殖したので（Ｌ細胞は単一の均一層をなして増殖し、他方HepG２細胞は複数の群（cluster）をなして増殖した）、ウエルあたりのｈＧＨおよびＣＡＴレベルは２つの細胞型について全く異なることが判明した。しかし、発現レベルを細胞タンパク質の各ミリグラムを基礎として調整すると、Ｌ細胞およびHepG２細胞は両遺伝子、特にＣＡＴ遺伝子を同等の効率で発現したことが判明した（表II参照）。７．実施例：あらかじめＤＮＡに結合させたT7 RNAポリメラーゼはin vivo組織において遺伝子発現を引き出す７．１．材料および方法７．１．１．プラスミドの構築 pT7T7／Ｔ７Ｌｕｃプラスミドを構築するため、ルシフェラーゼｃＤＮＡ（de Wetら，1987，Mol．Cell．Biol．7:725-737）をpTM-Iに挿入してまずpT7Lucプラスミドを構築し、次にpT7LucからClaI/EagI T7-ルシフェラーゼ断片を切り出し、平滑末端としたT7-ルシフェラーゼ断片をpT7T7の平滑末端化EagI部位に挿入した。７．１．２．In vivo投与種々の濃度のプラスミドpT7T7/T7LucおよびpT7T7/T7hGHを、リポフェクチンを含む、または含まない溶液中でT7 RNAPに結合させ、マウスの尾、肝臓、脚筋、脳脊髄液または静脈内に直接注入した。注入は、生理食塩水、PBSまたはDMEMに溶かしたＤＮＡ-T7 RNAP 70〜100μｌを25ゲージ注射針を用いて動物組織に注射することにより行なった。一定の期間後、動物を屠殺して特定組織の一部を摘出し、遺伝子発現をアッセイした。ルシフェラーゼ発現の場合、組織を200〜400μ ｌのルシフェラーゼ溶解緩衝液中でホモジナイズし、Promega社の市販キットを用いて10μｌの組織抽出物をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。成長ホルモン発現の場合、市販のラジオイムノアッセイキットを用いて、脳脊髄液、脳組織および血清をｈＧＨ活性についてアッセイした。７．２．結果 In vivo遺伝子発現の検出を容易にするため、ルシフェラーゼ遺伝子を選択し、本発明の発現系にpT7T7/T7Lucとして挿入した。プラスミドＤＮＡをin vitro でT7 RNAPと結合させ、リポフェクチンと共にマウス尾の結合組織に皮下注射した場合、高レベルのルシフェラーゼ活性がホモジナイズした尾組織において注射の24時間後に検出された（図８参照）。この応答は用量依存性で、また、ルシフェラーゼ遺伝子発現は少なくとも１週間の間検出可能であった。対照プラスミドは検出可能な活性を示さなかった。同じ材料をマウスの尾静脈に静注し、約24時間後に尾静脈を残りの尾組織から摘出した場合、これらの細胞において検出されたルシフェラーゼ活性は、組織重量に基づいて比較したとき尾組織において検出されたそれの百万倍以上であった。これは、ＤＮＡ-ＲＮＡＰ複合体の静脈注射は内皮細胞によって直ちに取り入れられ、（特に、注射部位の近くでは）遺伝子産物の迅速な発現をもたらすのではないかということを示している。同様に、あらかじめ結合させたT7 RNAPを有するpT7T7/T7Lucをマウス脚筋に筋肉内注射、マウス肝臓に肝臓内注射または20日齢マウスの脳脊髄液に頭蓋内注射した場合、有意なルシフェラーゼ活性が筋肉組織（図９参照）、肝臓（図10参照）および脳組織（図11参照）に観察された。分泌されるヒト成長ホルモンをコードするpT7T7/T7hGHプラスミドもまたin vi voにおいて試験した。ＤＮＡをT7 RNAPおよびリポソームと結合させ、20日齢マウスの脳脊髄液に注射した。成長ホルモン活性が、注射した動物の脳脊髄液および脳組織の両方において注射の20時間後に検出された（図12参照）。さらに、T7 RNAPと結合させたpT7T7/T7hGHプラスミド100μｇをリポフェクチンの不在下でマウス尾の結合組織に皮下注射した場合、翌日、末梢血に200〜300 pg/mlのヒト成長ホルモンが検出された。本発明は具体例を示した態様によって範囲を限定されるものではない。これらの態様は発明の個々の側面を説明するためのものである。実際、当業者には、これまでの記述および添付の図面より、本明細書に記載されたもののほかに種々の変法が明らかになるであろう。そのような変法は本発明の請求の範囲に含まれるものとする。本明細書に引用したすべての刊行物は、参照としてその全体を組み入れる。

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Claims

【特許請求の範囲】１．同起源のプロモーターに機能可能なように結合され、RNAポリメラーゼまたはその機能的な誘導体をコードする配列を含む組換え体DNA分子を含み、該DNA分子がその同起源のプロモーターからの転写を開始できるRNAポリメラーゼに予め結合されている、真核生物細胞中における遺伝子発現系。２．RNAポリメラーゼコード配列がバクテリオファージT7から誘導される請求項１の発現系。３．RNAポリメラーゼのための同起源のプロモーターに機能可能なように結合し、対象の遺伝子またはその機能的な誘導体の遺伝子を含む組換え体DNA分子を含み、該DNA分子がその結合したプロモーターからの転写を開始できるRNAポリメラーゼに予め結合されている、真核生物細胞中における遺伝子発現系。４．RNAポリメラーゼコード配列がバクテリオファージT7由来のものである請求項３の発現系。５．対象の遺伝子がタンパク質をコードする請求項４の発現系。６．対象の遺伝子がヒト成長ホルモンをコードする請求項５の発現系。７．対象の遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする請求項５の発現系。８．対象の遺伝子がルシフェラーゼをコードする請求項５の発現系。９．対象の遺伝子がアンチセンスRNAをコードする請求項４の発現系。 10．対象の遺伝子がリボザイム分子をコードする請求項４の発現系。 11．同起源のプロモーターに機能可能なように結合され、RNAポリメラーゼまたはその機能的な誘導体をコードする配列、及び前記同起源のプロモーターの第２のコピーに機能可能なように結合され、対象の遺伝子またはその機能的な誘導体の遺伝子を含む組換え体DNA分子を含み、該DNA分子がその同起源のプロモーターからの転写を開始できるRNAポリメラーゼに予め結合されている、真核生物細胞中における遺伝子発現系。 12．RNAポリメラーゼコード配列がバクテリオファージT7由来のものである請求項11の発現系。 13．対象の遺伝子がタンパク質をコードする請求項12の発現系。 14．対象の遺伝子がヒト成長ホルモンをコードする請求項13の発現系。 15．対象の遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする請求項13の発現系。 16．対象の遺伝子がルシフェラーゼをコードする請求項13の発現系。 17．対象の遺伝子がアンチセンスRNAをコードする請求項12の発現系。 18．対象の遺伝子がリボザイム分子をコードする請求項12の発現系。 19．真核生物細胞中で外来遺伝子を発現する方法であって、（a）同起源のプロモーターに機能可能なように結合され、RNAポリメラーゼまたはその機能的な誘導体をコードする配列を含む組換え体DNAであってその同起源のプロモーターからの転写を開始できるR NAポリメラーゼに予め結合されている前記組換え体DNA、及び（b）前記（a）の同起源のプロモーターの第２のコピーに機能可能なように結合され、対象の遺伝子またはその機能的な誘導体の遺伝子を含む第２の組換え体DNA分子を、宿主細胞中に同時に導入することを含む方法。 20．第２の組換え体DNA分子が、その同起源のプロモーターからの転写を開始できるRNAポリメラーゼに予め結合されている請求項19の方法。 21．RNAポリメラーゼコード配列がバクテリオファージT7由来のものである請求項20の方法。 22．対象の遺伝子がタンパク質をコードする請求項21の方法。 23．対象の遺伝子がヒト成長ホルモンをコードする請求項22の方法。 24．対象の遺伝子がヒトクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする請求項22の方法。 25．対象の遺伝子がルシフェラーゼをコードする請求項22の方法。 26．対象の遺伝子がアンチセンスRNAをコードする請求項21の方法。 27．対象の遺伝子がリボザイム分子をコードする請求項21の方法。 28．真核生物細胞中で外来遺伝子を発現する方法であって、同起源のプロモーターに機能可能なように結合され、RNAポリメラーゼまたはその機能的な誘導体をコードする配列、及び前記同起源のプロモーターの第２のコピーに機能可能なように結合され、対象の遺伝子またはその機能的な誘導体の遺伝子を含む組換え体DNAであってその同起源のプロモーターからの転写を開始できるRNAポリメラーゼに予め結合されている前記DNA分子を、宿主細胞中に導入することを含む方法。 29．RNAポリメラーゼコード配列がバクテリオファージT7由来のものである請求項28の方法。 30．対象の遺伝子がタンパク質をコードする請求項29の方法。 31．対象の遺伝子がヒト成長ホルモンをコードする請求項30の方法。 32．対象の遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする請求項30の方法。 33．対象の遺伝子がルシフェラーゼをコードする請求項30の方法。 34．対象の遺伝子がアンチセンスRNAをコードする請求項29の方法。 35．対象の遺伝子がリボザイム分子をコードする請求項29の方法。