JPH08510128A - ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の合成方法発明の背景 疎水性部分としてポリヒドロナフチル基を含むＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻 害剤は、ラクトン環上のヒドロキシル基をシリルオキシ保護基で予めブロックし たジオールラクトンから多段化学合成によって得てもよいし、又は場合によりこ れらの化合物は天然産物のメバスタチン及びロバスタチンの化学的改質によって 製造してもよい。メバスタチン及びロバスタチンは生合成の発酵法によって製造 する。 本発明はロバスタチンのようなＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を入手容易 なジオールラクトンから製造するのに使用し得る、非常に有利な、一段階の効率 のよい方法を提供する。発明の説明 本発明は式（Ｉ） （式中、 ＲはＣ１〜５アルキル、 Ｒ¹はＨ、ＣＨ₃又はＯＨ； Ｒ²はＨ又はＣ１〜５アルキル、及びａ は２重結合が任意に存在することを示す）のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害 剤を形成するためのエステル化法に関する。 更に具体的には、、該方法は非水性有機溶剤中の固定化リパーゼ酵素を使用す る。リパーゼ酵素源は表１に記載の群から選択してもよい；そこに記載された生 物はロバスタチンをトリオール酸に脱アシル化し得る酵素を製造するとされたも のである（１９９２年５月２０日公開のＥＰ ４８６，１５３号）。このリスト は網羅的なものではなく、ロバスタチン及びコンパクチンの側鎖除去を触媒する 酵素 をもたらすような他の生物も包含することを理解すべきである。本発明の方法は 好ましくは固定化酵素（リパーゼ又はエステラーゼ）を使用する；市販の酵素を 使用するための適切な固定化の手順の特定の例が実施例１に与えられており、更 に以下でも論じる。固定化酵素を得るための他の方法には、生産生物を適切な栄 養培地で生育させ、微生物細胞を収穫してそれらを凍結乾燥することを含む。こ れは最も簡単な形の固定化を例示している；しかし、このような方法では、酵素 が全く精製されず、より精製される製造法を使用する場合よりも低い比活性を有 し、及び微生物細胞壁が残っていて反応体（基質）及び生成物に対して透過障害 として働き得るという潜在的欠点を有する。より好ましい方法は（機械的又は酵 素的破壊によって）微生物細胞から解放され、ある程度まで精製されている酵素 を使用する。タンパク質（酵素）を複雑な生物混合物から精製し得る方法は当業 者には既知であり、遠心、限外ろ過、（例えば硫酸アンモニウムによる）塩析、 種々の型のカラムクロマトグラフィー（イオン交換、疎水性相互作用、ゲルろ過 及び親和性）及び電気泳動法が包含される。所望の酵素の精製は、種々の精製段 階にある酵素を含有すると見られる 画分が、ロバスタチン酸の側鎖を加水分解する能力を調べ、精製の進行を監視す るとよい（水溶液中で実施し、ＨＰＬＣ分析によってモニターし得る）。酵素を 結合すべき固定化支持体の選択は（以下の実施例で使用される）ナイロンに限定 されるものではなく、酵素固定化の熟練者が使用する他のどんな支持体でもよい 。例としては、ポリアクリルアミド、アガロース及びＥｍｐｈａｓｅ^TM（３Ｍ社 ）及び ような他の市販の活性支持体樹脂が包含される。生物によっては細胞外酵素の形 態でリパーゼ又はエステラーゼを製造することがあり得る；このような酵素の精 製も上記で論じた方法を使用して実施できるが、酵素を生産細胞から解放する工 程はこの場合必要なくなる。 このようなリパーゼ酵素の特定例は（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社からの ）Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ Ｃから誘導したリパーゼ タイプ VIIである。この酵素は市販されている。該リパーゼ酵素は実施例１の手順を使 用してナイロン６ペレット上に固定化するとよい。非水性有機溶剤は、酵素を失 活させずに該ジオールラクトンを溶解させ得る任意の有機溶剤から選択し得る。 このよ うな有機溶剤の特定例にはクロロホルム又は塩化メチレンのような塩素化炭化水 素とヘキサン又はトルエンのような炭化水素との混合物が包含される。このよう な混合物の具体例はクロロホルムとヘキサンの容量５０／５０の混合物である。 反応は化学量論量の酸もしくはエステルとジオールラクトンとの間で起こさせて もよいし又は過剰な酸もしくはエステルを使用してもよい。使用する温度は１５ 〜４０℃でよいが、好ましい範囲は２０〜３７℃である。 製造し得る式（Ｉ）の化合物にはＲがエチル、ｎ−プロピル、２−ブチル又は ２−メチル−２−ブチルであるものが包含される。出発ラクトンは以前に文献に 報告されたことがあり、その製造法は当業者に既知である。米国特許第５，２５ ０，４３５号には他のジオールラクトン源が提供されている。また特開昭６０− ７６５９５号に記載された酵素のあるものも、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害 剤の側鎖を除去して出発材料の酸を製造するのに使用し得る。米国特許第４，２ ９３，４９６号には塩基性加水分解を使用する側鎖除去が開示されている；米国 特許第５，２３３，４１５号では酵素Ｃｌｏｎｏｓｔａｃｈｙｓ ｃｏｍｐａｃ ｔｉｕｓｃｕｌａを使用するジオールラクトンの形成 が開示されている。コンパクチン（ＭＬ−２３６Ｂ）及びプラバスタチン（ＰＲ ＡＶＡＣＨＯＬ）の現行の製造法は、米国特許第４，３４６，２２７号に記載さ れている。簡単に言えば、この方法にはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎ ｕｍを発酵してコンパクチンを製造し、次いでＭｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、 Ｚｙｇｏｒｙｎｃｈｕｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ、Ｇ ｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｐｙ ｃｎｏｐｏｒｕｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｃｕｎｎｉｎｇ ｈａｍｅｌｌａ、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓ属の微生物又はこれらの微生物からの無細胞酵素含有抽出液を使用して、コン パクチンのＣ６部位を水酸化することが含まれる。Ｒ¹がヒドロキシル基である 化合物を製造する１つの方法は、コンパクチンジオールを製造するＰｅｎｉｃｉ ｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍのような、コンパクチン製造性微生物の変異株を 製造し、そのコンパクチンジオールを収穫することである。コンパクチンの８位 ヒドロキシル基の酵素エステル化を本発明の方法によって実施し、次いで微生物 又はその抽出液を使用して上記のと おり水酸化する。 出発カルボン酸及びその対応するエステルは全て市販されている。リパーゼ酵 素は市販品を使用するか又は、酵素生産性微生物がＡＴＣＣに寄託されていて入 手可能である。 実施例１ 酵素固定化の手順 前もって凍結し、４２５〜１１８０μｍに粉砕した、ナイロン６ペレットを約 １０ｇ秤量した。 Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏを脱イオン水に添加してｐＨ９．０±０．５にし、次 いで１ＮのＨＣｌを添加してｐＨを７にしてｐＨ７のリン酸塩緩衝液を製造した 。 ２５％のグルタルアルデヒド溶液１０ｍｌに、十分な量添加し、ｐＨ７のリン 酸緩衝液を１００ｍＬにするに十分な量添加して２．５％の溶液を製造した。 ６ＮのＨＣｌをビーカー中のナイロンペレットに添加し、１０〜１５秒間絶え ず撹拌した。酸をデカントし、透明になるまでペレットを脱イオン水ですすいだ ；ヘラを使用して加水分解されたナイロンの塊を崩した。 ナイロンをブフナー漏斗上でろ過し乾燥させた。 乾燥したナイロンの塊を乳鉢及び乳棒で崩し、ついで２．５％のグルタルアル デヒド溶液１００ｍｌの入ったフラスコに移した。混合物を少なくとも１時間撹 拌した。 Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａから誘導したリパーゼ タイプVII （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社） ４．８ｇを５０ｍｌ容の培養管中のｐＨ７のリン酸塩緩衝液３０ｍｌに混合し、 酵素結合溶液を製造した。混合物を震盪してできるだけ多くのリパーゼを溶液中 に得た。 前述の撹拌したナイロングルタルアルデヒド溶液をデカントし、ナイロンを脱 イオン水１００ｍｌ、次いで脱イオン水５００ｍｌで再び洗浄した。ナイロンを ろ過して乾燥した。 酵素結合溶液の一部（０．５ｍｌ）をタンパク分析のために抜き取り、ナイロ ンペレットを酵素結合溶液に添加した。ボトルを１８〜２４時間回転し、第二の アリコートをタンパク分析のために回収した。 結合溶液をデカントし、ナイロンを脱イオン水で洗浄した。ナイロンを広げ、 一晩乾燥させた。 実施例２ Ｒ¹がメチルであるジオールラクトンの単離及び抽出 ａ．トリオール製造 ジオールラクトンに対応するトリオール酸を１９９２年１２月１９日に公開さ れたＥＰＯ公開第５１７，４１３号の手順によって製造した。硫酸アンモニウム を発酵ブイヨンに濃度が０．２５Ｍになるように添加した。酢酸イソプ ロピルを発酵ブイヨンの０．８倍に等しい容量で添加し、次に酢酸イソプロピル 量の０．０５倍に等しい容量のイソプロピルアルコールを添加した。ブイヨンを ２Ｎの硫酸でｐＨ４．０に調整し、次いで３０分間撹拌し、遠心し、上部の酢酸 イソプロピル層を回収した。 ｂ．炭酸塩抽出 希薄炭酸塩溶液（２５ｇ／Ｌ Ｎａ₂ＣＯ₃）を酢酸イソプロピルの０．４倍に 等しい容量で酢酸イソプロピル溶液に添加した。生じた溶液を３０分間撹拌し、 遠心し、上部の酢酸イソプロピル層と下部の炭酸塩水性層とを分離した。 ｃ．第二の酢酸イソプロピルの抽出 等容量の酢酸イソプロピルを炭酸塩溶液に添加した。８５％のＨ₃ＰＯ₄でｐＨ を４．０に調節し、溶液を３０分間撹拌し、遠心し、酢酸イソプロピルの上層を 回収した。 ｄ．ラクトン化 回収した酢酸イソプロピル溶液に７０％のメタンスルホン酸を添加して最終濃 度を１０ｍＭにした。生じた混合物を３３〜３４℃の真空下で蒸発して原体積の ２０％にした。 ｅ．希薄炭酸塩洗浄 工程（ｄ）からのラクトン化した溶液を分液漏斗に添加し、冷たい希薄炭酸塩 を酢酸イソプロピルに等容量添加した。混合物を氷上で１〜２分間撹拌し、上部 の酢酸イソプロピル層を回収した。 ｆ．結晶化 工程（ｅ）からの蓋をした溶液を、結晶が形成されるまで冷凍庫に保存した。 結晶をろ過し、過剰な酢酸イソプロピルを収集した。冷たいトルエン／酢酸イソ プロピル（９：１）で、洗液が透明になるまで結晶を洗浄した。結晶を室温で真 空乾燥した。 実施例３ ロバスタチンを形成するためのロバスタチンジオールラクトンの酵素性アシル化 下表の成分を含む反応混合物を製造した。 ロバスタチンジオールラクトン ５０．５ｍｇ ２−メチル酪酸 ４５２μｌ クロロホルム ５．０ｍｌ ヘキサン ５．０ｍｌ （実施例１で製造した） １．０ｇ ナイロン固定化酵素 反応混合物１０ｍｌをねじ蓋付き試験管内で培養し、試験管ホルダーを含む円 板を装填した回転機上に置いた。反応を２５℃又は３７℃で実施し、その間定期 的な間隔をおいて試料を採取しながら試験管を約６０ｒｐｍで２〜２４時間回転 させた。ＨＰＬＣでロバスタチンを検出した。Ｈ₂Ｏ中の５０％のアセトニトリ ルと５０％のＨ₃ＰＯ₄とからなる移動相を流速３ｍｌ／分で使用するＣ₁₈逆相カ ラム上でロバスタチンを分離した。２３８ｎｍで検出した。 実施例４ コンパクチンジオールラクトンの酵素性アシル化 ａ．Ｒ¹がＨであるジオールラクトン（コンパクチンジオールラクトン）の製造 Ｒ¹がＨである出発ジオールラクトンをコンパクチンを加水分解することによ って製造する。 １ＮのＬｉＯＨ水溶液５ｍｌ中のコンパクチン２００ｍｇの混合物を３０ｍｌ 容のステンレス鋼製圧力容器中で１３５℃で１２時間震盪する。冷却した反応混 合物を１ＭのＨ₃ＰＯ₄で酸性化し、酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル 溶液を硫酸マグネシウム上で脱水し、ろ過して真空下で濃縮する。Ｄｅａｎ−Ｓ ｔａｒｋ装置で４時間還流加熱したトルエン２０ｍｌ中に残留物を溶解し、ラク トン化させる。トルエンを蒸発することによってＲ¹がＨであるジオールラクト ン（コンパクチンジオールラクトン）を得る。 ｂ．コンパクチンジオールラクトンの酵素性アシル化 下表の成分を含む反応混合物を製造する： コンパクチンジオールラクトン ５０ｍｇ ２−メチル酪酸 ４５０μｌ クロロホルム ５ｍｌ ヘキサン ５ｍｌ （実施例１で製造した） １．０ｇ ナイロン固定化酵素 反応混合物１０ｍｌを実施例３の手順によって培養する。逆相ＨＰＬＣによっ てコンパクチンを検出し、分離し、秤量する。 実施例５ プラバスタチンｎの酵素性アシル化 ジオールラクトン ａ．Ｒ¹がＯＨであるジオールラクトンの製造 プラバスタチンｎ、（３Ｒ、５Ｒ）３，５−ジヒドロキシ−７−［（１Ｓ，２ Ｓ，６Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ヒドロキシ−２−メチル−８−［（Ｓ）−２− メチルブチリルオキシ］−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−１−ナフ チル］ヘプタノエートから出発し、実施例４の工程ａの手順によってプラバスタ チンｎジオールラクトンを形成する（Ｒ¹がＯＨである）。 ｂ．プラバスタチンｎジオールラクトンの酵素性アシル化 下表の成分を含む反応混合物を製造する： プラバスタチンｎ ジオールラクトン（Ｒ¹がＯＨ） ５０ｍｇ プロピオン酸 ４２５μｌ クロロホルム ５ｍｌ ヘキサン ５ｍｌ （実施例１で製造した） １．０ｇ ナイロン固定化酵素 反応混合物１０ｍｌを実施例３の手順によって培養する 。逆相ＨＰＬＣによって生成物を検出し精製する。 実施例６ ３７℃でのロバスタチン製造の動力学データ 上記実施例３に記載のとおり、（Ｒ¹がＣＨ₃である）ロバスタチンジオールラ クトン出発材料を５０％のクロロホルム、５０％のヘキサン（ｖ：ｖ）に溶解し 、２−メチル酪酸を（実施例１の手順によって製造した）Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙ ｌｉｎｄｒａｃｅａから誘導されるナイロン固定化リパーゼとともに添加した。 ３時間の値からすると、上記のデータから反応速度定数３．１×１０^-5モル／ ［時間−ｇリパーゼ］が得られる。しかし、２４時間では速度定数は７．１×１ ０^-5モル／［時間−ｇリパーゼ］と計算される。 実施例７〜１２ 種々のエステルを製造するためのロバスタチンジオールラクトンの酵素性アシル 化 Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入し、明細書の実施例１の手順によっ て固定化したＣａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａからのリパーゼ酵素（タ イプVII）を使用して、室温（２０〜２５℃）でロバスタチンジオールラクトン を用いて反応を実施した。反応は５０％のクロロホルム、５０％のヘキサン（ｖ ：ｖ）中で実施した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年４月４日 【補正内容】 ３４条補正 請求の範囲 １．式（Ｉ）： の化合物の製造方法であり、該方法がジオールラクトン： を から選択される微生物から誘導されるリパーゼ酵素を含む非水有機溶剤中でＲ− ＣＯＯＲ²によって処理し（式中、ＲはＣ１〜５アルキル；Ｒ¹はＨ、ＣＨ₃又は ＯＨ；Ｒ²はＨ又はＣ１〜５アルキル、及びａは２重結合が任意に存在すること を示す）、構造式（Ｉ）の化合物を回収することを含む前記方法。 ２．前記リパーゼ酵素が固定化されている請求項１に記載の方法。 ３．前記Ｒが２−ブチル；Ｒ¹がＣＨ₃；Ｒ²がＨである請 求項２に記載の方法。 ４．前記ａが二重結合である請求項２に記載の方法。 ５．前記ａが単結合である請求項３に記載の方法。 ６．前記有機溶剤が塩素化炭化水素及び炭化水素の混合物である請求項３に記載 の方法。 ７．前記リパーゼ酵素がＣａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａから誘導され る請求項４に記載の方法。 ８．前記有機溶剤がクロロホルムとヘキサンの容量１：１の混合物である請求項 ５に記載の方法。 ９．前記Ｒが２−メチル−２−ブチル；Ｒ¹がＣＨ₃；Ｒ²がＨである請求項２に 記載の方法。 １０．前記ａが二重結合である請求項９に記載の方法。 １１．前記Ｒが２−ブチル；Ｒ¹がＯＨ；Ｒ²がＨである請求項２に記載の方法。 １２．前記ａが二重結合である請求項１１に記載の方法。 １３．前記リパーゼ酵素がＣａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａから誘導さ れる請求項１に記載の方法。 １４．前記リパーゼが固定化されている請求項１３に記載の方法。 １５．前記有機溶剤が塩素化炭化水素及び炭化水素の混合 物である請求項１４に記載の方法。 １６．前記有機溶剤がクロロホルムとヘキサンの容量１：混合物である請求項１ ５に記載の方法。 １７．前記Ｒ²がＨ、Ｒ及びＲ¹が （ａ）Ｒが２−ブチルでＲ¹がＣＨ₃； （ｂ）Ｒが２−メチル−２−ブチルでＲ¹がＣＨ₃； （ｃ）Ｒが２−ブチルでＲ¹がＯＨ の群から選択される請求項１５に記載の方法。 １８．前記有機溶剤がクロロホルムとヘキサンの容量１：１の混合物である請求 項１７に記載の方法。 １９．前記ａが二重結合である請求項１７に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者 カータ，ジオルジオ アメリカ合衆国、バージニア・22901、シ ヤーロツツビル、コブルストーン・レー ン・1870 (72)発明者 コンダー，マイケル・ジエイ アメリカ合衆国、バージニア・22801、ハ リソンバーグ、ノースフイールド・コー ト・767 (72)発明者 ゲイナー，ジヨン・ロイド アメリカ合衆国、バージニア・22901、シ ヤーロツツビル、キヤメロン・レーン・ 125 (72)発明者 ステイバーグ，ロバート・ダブリユ アメリカ合衆国、バージニア・22801、ハ リソンバーグ、マウンテン・ビユー・ドラ イブ・535 (72)発明者 ビンチ，ビクター・エー アメリカ合衆国、バージニア・22901、シ ヤーロツツビル、ロツキー・レーン・2041 (72)発明者 ウエーバー，テイモシー・ワラス アメリカ合衆国、ペンシルバニア・16838、 グランピアン、アール・デイー・１、ボツ クス・260（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式（Ｉ）： の化合物の製造方法であり、該方法がジオールラクトン： を非水有機溶剤中、リパーゼ酵素存在下でＲ−ＣＯＯＲ²によって処理し（式中 、ＲはＣ１〜５アルキル；Ｒ¹はＨ、ＣＨ₃又はＯＨ；Ｒ²はＨ又はＣ１〜５アル キル、及びａは２重結合が任意に存在することを示す）、構造式（Ｉ）の化合物 を回収することを含む前記方法。 ２．前記リパーゼ酵素が固定化されている請求項１に記載の方法。 ３．前記リパーゼ酵素が、 から成る群から選択される微生物から誘導される請求項２に記載の方法。 ４．前記Ｒが２−ブチル；Ｒ¹がＣＨ₃；Ｒ²がＨである請求項３に記載の方法。 ５．前記ａが二重結合である請求項３に記載の方法。 ６．前記ａが単結合である請求項４に記載の方法。 ７．前記有機溶剤が塩素化炭化水素及び炭化水素の混合物である請求項４に記載 の方法。 ８．前記リパーゼ酵素がＣａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａから誘導され る請求項５に記載の方法。 ９．前記有機溶剤がクロロホルムとヘキサンの容量１：１の混合物である請求項 ６に記載の方法。 １０．前記Ｒが２−メチル−２−ブチル；Ｒ¹がＣＨ₃；Ｒ²がＨである請求項３ に記載の方法。 １１．前記ａが二重結合である請求項１０に記載の方法。 １２．前記Ｒが２−ブチル；Ｒ¹がＯＨ；Ｒ²がＨである請求項３に記載の方法。 １３．前記ａが二重結合である請求項１２に記載の方法。