JPH08509872A - 表面が活性化された、有機高分子を用いる生体高分子の合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生体高分子合成のための表面が活性化された、有機高分子を開示した。さらに好適には、アミン化二軸配向ポリプロピレンが、それに対してオリゴヌクレオチドの合成に使用され、そしてこれらのデバイスは、最も好適には患者試料の遺伝分析に利用される。

Description

【発明の詳細な説明】 表面が活性化された、有機高分子を用いる生体高分子の合成 発明の分野 本出願は、１９９２年１０月２９日出願の出願番号第０７／９７１，１００号 の一部継続出願である。 本発明は、表面が活性化された有機高分子上への生体高分子もしくは生体モノ マーの合成、並びに前記高分子上への前もって合成した生体高分子の結合に関す る。本発明は、核酸、ペプチド類、タンパク質類の合成、ならびに、ハイブリッ ド形成による配列決定、ペプチド／タンパク質配列決定、および遺伝レベルにお ける診断評価において、特に有用性がある。 発明の背景 本特許開示に記載の論文および刊行物は、それに含まれる情報の故に示した； この情報のいずれも、法的”先行技術”とはみなされず、我々は、上記情報のす べてに関して先行発明の要件を設定する権利を保有する。 デオキシリボ核酸（”ＤＮＡ”）およびリボ核酸（”ＲＮＡ”）は、長い、糸 状巨大分子であり、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドの鎖を含み、ＲＮＡは 、リボヌクレオチドの鎖を含む。ヌクレオチドは、１個のヌクレオシドおよび１ 個以上のホスフェート基からなり；ヌクレオシドは、五炭糖に結合した窒素性塩 基からなる。通常、前記ホスフェート基は、五炭糖の５番目の炭素（”Ｃ−５” ）ヒドロキシル基（”ＯＨ”）に結合している；しかし、それはまた、３番目の 炭素ヒドロキシル基（”Ｃ−３ ＯＨ”）に結合する こともできる。ＤＮＡ分子中において、五炭糖は、デオキシリボースであるのに 対して、ＲＮＡ分子中においては、五炭糖はリボースである。ＤＮＡ中における 窒素性塩基は、アデニン（”Ａ”）、シトシン（”Ｃ”）、グアニン（”Ｇ”） およびチミン（”Ｔ”）である。これらの塩基は、ウラシル（”Ｕ”）がチミン に置き換わっている以外は、ＲＮＡについても同様である。したがって、ＤＮＡ の主要ヌクレオシドは総称して”デオキシヌクレオシド”と称され、下記のよう である；デオキシアデニン（”ｄＡ”）、デオキシシトシン（”ｄＣ”）、デオ キシグアニン（”ｄＧ”）およびチミジン（”Ｔ”）である。対応するリボヌク レオチドは、”Ａ”、”Ｃ”、”Ｇ”および”Ｕ”と定義される。（都合上、お よび対応するチミジンリボヌクレオシドがないので、デオキシチミジンは、通常 、”Ｔ”と定義される；しかし、一貫したものとする目的のためには、この開示 全文において、チミジンを”ｄＴ”と定義するであろう）。 ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の窒素性塩基の配列が前記分子中に含まれる遺伝情報 をコードする。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の糖およびホスフェート基は、前記分子 の骨格を形成し、構造的役割を担っている。具体的には、あるヌクレオチドの五 炭糖の３’ヒドロキシルが隣接するヌクレオチドの五炭糖の５’ヒドロキシルに 結合するように、各ヌクレオチドの糖部分が隣接するヌクレオチドの糖部分に結 合している。前記２個の五炭糖の結合は通常ホスホジエステル結合によっている 。この結合プロトコールに基づいて、ヌクレオチド鎖の一端（”末端”）は５’ 末端（例ヒドロキシル、ホスフェート、ホスフェート類等）を有しており、他端 は例えば３’ヒドロキシ ルまたはホスフェート基を有している。都合上、ヌクレオチド鎖の塩基配列は５ ’から３’方向に、すなわち、５’−ＡＴＣＧ−３’、または、単にＡＴＣＧと 記載される。 ＤＮＡおよびＲＮＡは、生きている動物によって内部で産生される；しかし、 ＤＮＡおよびＲＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成鎖が迅速かつ効率的に産生で きるように化学的に合成することもできる。これらの鎖は、通常、”合成オリゴ ヌクレオチド”または”オリゴヌクレオチド”と称されている。オリゴヌクレオ チド合成のために広く利用されている化学操作は、”ホスホルアミダイト法”と 称されている。たとえば、米国特許第４，４１５，７３２号；ＭｃＢｒｉｄｅ、 Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ 、２４：２４５−２４８（１９８３）；およびＳｉｎｈａ、Ｎ．ら、Ｎｕｃ．Ａ ｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２ ：４５３９−４５５７（１９８４）を参照；これらはす べて、本文中に参考として取り込まれた。ホスホルアミダイト法に基づいた市販 のオリゴヌクレオチドシンセサイザーとして、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ ＯＬＩＧＯ １０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ８７５０^TM； およびＡＢＩ ３８０^TM、３９２^TMおよび３９４^TM ＤＮＡシンセサイザーが挙 げられる。プロトコールまたは機器にかかわらず、ほとんどの通常の合成オリゴ ヌクレオチドは、通常”固体支持体”と称されている支持材料上で”成長”する 。固体支持体は、さまざまであり周知である；固体支持体に関する詳細は、下記 に詳しく記載される。 化学合成オリゴヌクレオチドの重要性は、主に、オリゴヌクレオチド類が関連 しうる極めてさまざまな用途に由来する。たとえば、 オリゴヌクレオチドは、遺伝子工学、組み換えＤＮＡ法、アンチセンスＤＮＡ、 ゲノムＤＮＡの検出、種々の系からのＤＮＡおよびＲＮＡのプローブ、タンパク 質−ＤＮＡ複合体の検出、部位特異的変異の検出、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成のプ ライマー、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応等のような増幅法のプライ マー、テンプレート、リンカー、および分子相互作用研究を必要とする生物研究 で利用可能である。オリゴヌクレオチド合成領域において最近注目されているの は、Ｅｄｗｉｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（欧州特許出願ＷＯ８９／１０９７７、”Ａ ｎａｌｙｚｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”参照 ）によって最初に開示されたハイブリッド形成による配列決定（”ＳＢＨ”）と 一般に称される操作である。 ＤＮＡおよびＲＮＡの主要構造は、下記のヌクレオシドとして図示できる； 核酸合成において鍵となる段階は、１個のヌクレオチドの５’水酸基と別のヌク レオチドの３’水酸基との間のヌクレオチド間ホスフェート結合の特異的かつ順 次の形成である。したがって、オリゴヌクレオチドの典型的合成において、”入 ってくる”ヌクレオチドの ホスファイト基が別のヌクレオチドの５’水酸基と結合する（すなわち、この５ ’水酸基が”リン酸化される”かまたは”亜リン酸化”される）。これらの基は 、オリゴヌクレオチドの合成に積極的に関与可能でなければならない。したがっ て、５’水酸基は、研究者が上記２個のヌクレオチドを反応チェンバー中に導入 しその中の条件を前記２個のヌクレオチドが適切に結合できるように調整できる ように、修飾されている（通常、ジメチルトリチル（”ＤＭＴ”）によって）； 上記添加を連続させることによって、所定の配列を有する成長するオリゴヌクレ オチドが正確に産生できる。 タンパク質およびペプチドは、すべての生細胞にとって必須の要素である。そ れらは、細胞壁および細胞膜、酵素、免疫グロブリン、抗体、輸送分子並びにほ とんどのホルモンの構成要素である。タンパク質およびペプチドの構築単位は、 ２０種の天然のアミノ酸である。各アミノ酸は、”コドン”と称される３個のヌ クレオチドの連続的グループによって”コード”される。４種の異なるヌクレオ チドがありかつアミノ酸１個のコードに３個のヌクレオチドが必要であるので、 可能なコドンが６４個（４³）ある。したがって、数種のコドンが同一のアミノ 酸をコードできる；たとえば、コドンＧＣＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴおよびＧＣＣはす べてアミノ酸、アラニンをコードする。 アミド結合によって正確に結合されたアミノ酸群がタンパク質鎖を形成し、こ のようなタンパク質鎖（”一次構造”）のアミノ酸配列がタンパク質の生物学的 機能に関与する極めて複雑な二次およびテリトリ（ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ）構造を 決定する。 各アミノ酸は、タンパク質およびペプチドがアミノ（”Ｎ−”） およびカルボキシル（”Ｃ−”）末端を有するように、アミノおよびカルボキシ ル末端を有している。アミノ酸の一般的構造は、下記のように図示できる； 式中、Ｒは、少なくとも２０種の異なる側鎖（例えば、アラニンの側鎖は、ＣＨ₃ 基である）である。”ＮＨ₂”基は、アミノ基であり、”ＣＯＯＨ”基は、カル ボキシル基である。 核酸の場合と同様に、合成直鎖または分枝鎖アミノ酸は、化学的に合成できる 。直鎖アミノ酸の合成で特に周知の操作は”固相ペプチド合成”と称されており 、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄによって１９６３年に紹介された。一般に、Ｂａｒａｎｙ 、Ｇ．およびＭｅｒｒｉｆｉｅｄ、Ｒ．Ｂ．（１９８０）、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉ ｄｅｓ 、２：１−２８４、Ｇｒｏｓｓ、Ｅ．およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｊ． 編著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。固相ペプチド 合成プロトコールを利用する自動ペプチド合成機として、例えば、ＡＢＩ ４３ ０^TMおよび４３１^TM、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ９０５０ Ｐｌｕｓ ＰｅｐＳｙｎ ｔｈｅｓｉｚｅｒ^TM、およびＭｉｌｌｉｇｅｎ ９５００^TMおよび９６００^TMが 挙げられる。通常、第１番目のアミノ酸のＣ末端が反応基を含む固体支持体（す なわち、結合部位）に結合され、一方、第１番目のアミノ酸のＮ末端は化学変化 を起こしやすい保護基（すなわち、容易に除去可能 な基）によって保護されている。アミノ酸上の側鎖官能基は、”一時的”保護基 によって保護されていなければならない。適切な条件下において、同様に保護さ れたアミノ酸が、化学変化を起こしやすい保護基が既に除去されている不溶化さ れた第１のアミノ酸に付加される。連続的添加を繰り返すことによって、アミノ 酸鎖が合成でき、最終段階は、通常、固体支持体からの前記鎖の開裂と各アミノ 酸側鎖からの一時的保護基の除去となる。これによって、生物学的に活性なタン パク質またはペプチドが生じる。 オリゴ糖は、糖ペプチドおよび糖脂質の構築単位である；糖ペプチドおよび糖 脂質は、細胞膜表面との相互作用によって、生物学的活性の重要な媒介者となる ことができる。したがって、合成オリゴ糖は、特に、特定の細胞膜を標的にする ためにまたは糖ペプチドおよび糖脂質の細胞膜表面に対する天然の結合を妨害す るために、利用できる。合成オリゴ糖は、最近、特定の薬物に特定の組織を標的 とさせるそれらの能力の故に不評である。オリゴ糖の固相合成は、固体支持体と してポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルを用いて報告されている。 Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｓ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５０９５ −５０９７（１９９１）参照。また、Ｒｕｄｅｍａｃｈｅｒ、Ｔ．Ｗ．ら、”Ｇ ｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ”、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：７８５− ８３８（１９８８）参照。 特に核酸、タンパク質／ペプチド、およびオリゴ糖合成に利用される固体支持 体は、さまざまである。核酸合成に関して、広く利用されている固体支持体は、 制御多孔性ガラス（”ＣＰＧ”）である。たとえば、米国特許第４，４５８，０ ６６号を参照。他の材料 として、ナイロン、ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよびセルロースが挙げ られる。テフロン^TMファイバー支持体は、オリゴヌクレオチド合成の基質として 記載されている。Ｌｏｈｒｍａｎｎ、Ｒ．Ａ．およびＲｕｔｈ、Ｊ．（１９８４ ）ＤＮＡ ３：１２２；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８５／０１０５１（１９８５年３月 １４日公開）；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｏｘｉｄ ｉｚａｂｌｅ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（酸化可能固体支持体）（Ｃａｔ ．Ｎｏ．ＯＳＳ−０１およびＯＳＳ−０２）参照。タンパク質／ペプチド合成に 関して、上記材料として、例えば、架橋ポリスチレン、セルロースおよびポリア ミド樹脂が挙げられる。米国特許第４，９２３，９０１号は、それにオリゴヌク レオチドおよびペプチドを結合させた修飾膜を記載している。記載してあるよう に、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルは、オリゴ糖合成のための 支持体として使用されてきた。 これらの種類の材料の合成に有用な固体支持体に対する需要が引き続き存在し ている。これは、これまで利用されてきた材料が関連する欠点を有していること による。たとえば、ある支持体は、実際にアミノ酸またはタンパク質／ペプチド を固体支持体に結合させるために”スペーサーアーム”すなわちリンカーの使用 を必要としている；通常、上記リンカーが利用されると、生体モノマーおよび生 体高分子が支持体上の”非リンカー”部位に非特異的に結合するのを減少させる かまたは防止するために、リンカーが存在していない膜上の部位をブロックする ことがしばしば必要となる。たとえば、Ｚｈｕｎｇ、Ｙ．ら、”Ｓｉｎｇｌｅ− ｂａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｇｅｎｅｔ ｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ ｍｏｄ ｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ ｓ．１９（１４） ：３９２７−３９３３（１９９１）（ナイロン）を参照。他の 材料は、支持体表面上に適当な材料をグラフトさせるために表面修飾の使用を必 要とし、それは、次に生体モノマーおよび生体高分子を結合できる。たとえば、 米国特許第４，９２３，９０１号（ポリプロピレン）参照。さらにその他の材料 は、例えば、支持体の化学修飾を必要とし、支持体と生体モノマーおよび生体高 分子の間の必要な結合を提供する。たとえば、米国特許第４，４５８，０６６号 （無機高分子）参照。明らかなように、これらの付加工程はエラーの可能性を付 与し、それゆえに、正の分析結果に否定的影響を及ぼし、ならびに、支持体コス トを著しく上昇させる。 必要とされているものおよび従って当技術水準に寄与するものは、材料が迅速 、効率的および経済的に調製できるために上記の付加的プロトコールを必要とせ ずオリゴヌクレオチドおよびタンパク質／ペプチドの合成に利用できる材料であ る。適切な固体支持体法によって、オリゴヌクレオチドは、それの上に合成でき 、特異的遺伝的変異の存在または不在を決定するために患者試料ＤＮＡの分析に 生成した産物を利用できる。 発明の要約 本発明は、生体高分子合成に有用な有機高分子を提供することによってこれら の需要を満たし、前記有機高分子は、外部化学種（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｈｅｍ ｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）によっ て修飾され、前記修飾は、マイクロウェーブまたはラジオ周波数域のエネルギー を外部化学種存在下において有機高分子に適用することによって達成される。特 に好適な態様において、関心の遺伝子領域に相補性のオリゴヌクレオチドは、上 記高分子上に合成され、これらは、次に、特定の遺伝的変異（類）の存在または 不在のための患者試料の分析のために利用される。 好適には、前記高分子は、生体高分子合成に適した条件下において化学的に不 活性であり、限定されはしないが水素、炭素、酸素、フッ素、塩素、臭素、硫黄 および窒素を含む種々の化学元素の置換基を含む炭素骨格を含んでいる。限定さ れはしないが、代表的高分子として、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチ レン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリ ドン、ポリテトラフルオロエチレン、二フッ化ポリビニリデン、ポリフルオロエ チレンプロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリ クロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、およびそれらの共重合体の混合物 が挙げられる。ポリプロピレンは、特に好適な高分子である。特定の最終目的の ため、最適であるのは、二軸配向ポリプロピレンフィルムである。 好適には、外部化学種は、（１）高分子表面に先に吸着されていない化学種で あり；そして（２）高分子表面に吸着されると、好適にはエネルギー上昇状態に よって求核試薬となる。最も好適には、前記エネルギー上昇状態はラジオ周波数 プラズマ放電、マイクロウェーブ周波数プラズマ放電またはコロナ放電である。 好適には、限定されはしないが、生体高分子として、核酸、タンパク質、ペプ チド、ホルモン、オリゴ糖、脂質または逆方向ヌクレ オチド（Ｏｒｔｉｇａｏ）Ｊ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２： １２９（１９９２））、ペプチド核酸（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ ｅｍ．Ｓｏｃ．１１４ ：１８９５（１９９２））およびＭｅｔａ−ＤＮＡ（Ｈａ ｓｈｉｍｏｔｏ、Ｈ．＆Ｓｗｉｔｚｅｒ、Ｃ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１４ ：６２５５（１９９２））のようなこれらの合成類似体、および上記の組 み合わせが挙げられる。生体高分子合成は、好適には、有機、無機または生化学 的手段、およびその組み合わせによって達成される。最も好適には、前記高分子 上にオリゴヌクレオチドが合成され、記載のように、これらを用いてＤＮＡを含 む患者試料を分析する。 本発明の特に好適な態様において、有機高分子はポリプロピレンであり、外部 化学種は窒素および水素（アンモニアガスの形態で）であり、求核試薬はアミン であり、前記エネルギー上昇状態はラジオ周波数プラズマ放電によって達成され る。したがって、特に好適な表面活性化有機高分子は、ラジオ周波数プラズマ放 電によってアミン化されたポリプロピレン材料である；このような材料は、スペ ーサーアームまたはリンカーを要せずして、それに対してヌクレオチドおよび／ またはアミノ酸を”インプレース（ｉｎ−ｐｌａｃｅ）”または”インサイチュ ー（ｉｎ−ｓｉｔｕ）”結合させるために利用され、従って、オリゴヌクレオチ ドおよび／またはペプチドの合成に特に極めて適している。活性化有機高分子上 のアミン基は、それに導入されたヌクレオチドおよび／またはアミノ酸が高分子 表面上に共有結合的に付着するように、ヌクレオチドと反応性である。いくつか の用途では、ポリプロピレンは、二軸配向フィルムの形態で最も好適である。 上記の表面活性化有機高分子は、例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、オ リゴ糖、および脂質合成の領域で、特定の用途を見いだす。たとえば、上記高分 子上に合成されたオリゴヌクレオチドに関して、これらの材料はたとえばハイブ リッド形成による配列決定（”ＳＢＨ”）および医学および診断評価目的のため の遺伝分析領域で特定の用途を見いだす。ポリプロピレンは”化学的に不活性” であるので、非特異的結合に関係した問題は、検出感度が極めて改善されるよう に、実質的に回避される。 図面の簡単な説明 第１図は、アミン化ポリプロピレン上に先に直接合成された開裂１７−ｍｅｒ オリゴヌクレオチド（５’−ＤＭＴ保護基を有する）の高速液体クロマトグラフ ィ分析の結果である。 第２図は、分析に先立ちＤＭＴ保護基を除去した第１図の１７−ｍｅｒオリゴ ヌクレオチドの毛細管ゲル電気泳動分析の結果である。 第３図は、アミン化ポリプロピレン上に直接合成された所定のターゲットオリ ゴヌクレオチドからの、３個のオリゴヌクレオチドプローブの脱ハイブリッド形 成分析の集積であり、前記プローブのそれぞれは、前記ターゲットに相補性であ るかまたは非相補性の種々の配列を有している。 第４図は、ＣＴＦＲ Ｅｘｏｎ １０、Ｎｏｒｍａｌに相補性のターゲットオ リゴヌクレオチドに対するＣＴＦＲ Ｅｘｏｎ １０、ＮｏｒｍａｌおよびＣＴ ＦＲ Ｅｘｏｎ １０、△Ｆ５０８由来のアンプリコンの脱ハイブリッド形成分 析の集積であり、前記ター ゲットオリゴヌクレオチドは、アミン化ポリプロピレン上に直接合成されている 。そして 第５図は、蛍光標識プローブとアミン化ポリプロピレンに直接合成されたター ゲットとの間のハイブリッド形成のレーザープリンター複製であり、ＣＣＤカメ ラによって前記標識を検出したものである。 好適な態様の詳細な説明 生体高分子（オリゴヌクレオチド、ペプチド、オリゴ糖、脂質等）の固相合成 は、定義上、固体支持体を必要とし、最初の出発原料を結合させかつ生体高分子 合成を開始させる。先にも述べたように、”固相合成の独自の特徴として固体支 持体自体が挙げられ、本合成法の将来の改良はおそらく、より優れた支持体が見 つけられることによるであろう”。Ｗａｌｌａｃｅ、Ｒ．Ｂ．およびＩｔａｋｕ ｒａ、Ｋ．”Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”Ｃｈｐｔ．１３，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｗ．Ｈ．編著、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓ ｏｎｓ（１９８３）。当業者には明らかであろうが、この意見が正しいことが証 明された。生体高分子合成に関連する化学の進歩に伴い；上記生体高分子、特に オリゴヌクレオチドおよびペプチドの必要性が高まるに伴い；そして上記生体高 分子の適用領域が拡大されるに伴い、”より優れた支持体”に対する必要性が現 実に高まっている。 基本的に、これまでの固体支持体手段に関連していた利点はまた、通常、その 使用によって生ずる問題の種類および数に直接関連している。これは、上記材料 が支持体材料それ自体と生体高分子の化学的相互作用を伝達する程度に応じて、 それと同程度に材料がその他の材料と非特異的に相互作用できることに起因して いる。たとえば、ナイロン基材のフィルター類はＤＮＡ分析領域で広範囲の適用 を見いだしており、それによって、オリゴヌクレオチドは前記ナイロンに直接架 橋される。しかし、必須ではないにしても研究者がそ れに”非特異的”材料を結合させることを望まないナイロン上のすべての部位を 化学的にブロックする必要があるほど、ナイロンは他の材料と極めて反応性であ る。上記参考のＺｈｕｎｇ論文で記載されているように、アミノリンカー結合オ リゴヌクレオチドプローブが存在していないナイロン膜上の部位に試料ＤＮＡを 非特異的に結合することを防止しようとする試みにおいて、これらの極めて反応 性の部位をブロックしてそれに対する非特異的結合を回避することが必要であっ た。このプロトコールは、固体支持体とオリゴヌクレオチドの間にリンカーとし てポリ−Ｔテイルを用いる過去の操作を改良する努力において検討された。Ｓａ ｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら（１９８９）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：６２３０−６２３ ４参照。これらの操作において、前記オリゴヌクレオチドは、”オフライン”合 成されその後支持体にアミノリンカーまたはポリＴテイルによって結合されると して記載されている。 ”オンライン”（インサイチュ）合成の場合、利用可能な固体支持体とともに 利用することが必要な化学操作の種類は、驚くほどである。たとえば、ＣＰＧ、 シリカ、ガラス等のような無機固体支持体の場合、これらの材料の化学構造が、 生体高分子合成を制約すると考えられる”剛性”を生ずる。したがって、特にＣ ＰＧの場合、通常、化学リンカーをそれと関連させて利用することが必要である 。基本的に、これらのリンカーは、それらの化学的組成または長さにかかわらず 、支持体の一端に結合されかつ成長する生体高分子に結合可能な化学的に”可撓 性”の部分を供することによって合成における”自由”度を提供することを意図 している。リンカーなしでも理論的には生体高分子を合成可能であるが、総収率 、合成の迅速 性等が乱される。リンカーを利用する無機材料の使用例としてさらに、欧州特許 出願ＷＯ８９／１０９７７は、その上でのオリゴヌクレオチドのインサイチュ合 成における用途のために、脂肪族リンカーを結合させたガラス板の使用を開示し ている。 当業者には明らかでであろうが、リンカーは極めて予測不可能である。再度述 べるが、ある一定の支持体材料に対して、リンカーのどのタイプおよびどの長さ が最適であるかは必ずしも明らかではない。したがって、通常、リンカーを必要 とする特定のすべての固体支持体について、一定のリンカーの条件、組成および 長さを最適化する必要がある。 他の支持体は、実際には、生体高分子合成の目的のためには支持体として利用 されていない。むしろ、これらの材料は、他の材料と化学的に反応し、次に、上 記合成を伝達する能力の故に利用されている。たとえば、Ｋｈｒａｐｋｏ、Ｋ． Ｒ．ら、”Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙ ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘ ｔｕｒｅ”ＤＮＡ Ｓｅｕｅｎｃｅ−Ｊ．ＤＮＡ Ｓｅｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｐｐｉｎｇ １：３７５−３８８（１９９１）は、先に合成されたオリゴ ヌクレオチドが無機材料上ではなくポリアクリルアミドゲル層に共有結合で連結 できるように、それにポリアクリルアミドゲルを重層させた無機材料（ガラス） の使用を記載している。したがって、前記ガラスは、明らかに、主に実際の合成 支持体のための形態支持体として機能する。同様に、米国特許第４，９２３，９ ０１号において、ポリプロピレンおよびポリエチレンのような化学的不活性のポ リマーは、適用可能な官能基を有す る高分子単量体がその表面上にグラフト重合されると、核酸およびペプチド合成 に有用であると記載されている。 基本的に、当技術の現在の状況は、極めて反応性の（ナイロンのような）材料 から、基本的に単なるリンカーの単体として作用する材料（すなわちガラス板） までの全範囲に及んでいる。 生体高分子合成の全体としての目的という観点から、有意量のエネルギーおよ び資源が、ある材料を別の材料に結合させるより効率的リンカーまたはメカニズ ムの開発に向けられてきた。たとえば、Ｍａｓｋｏｓ、Ｕ．＆Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 、Ｅ．Ｍ．”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｇｌａｓｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ；ａ ｎｏｖｅｌ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏ ｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｙｂｒｉ ｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ”、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．２０（７） ：１０７９−１６８４（１９９２）参照。 ＷａｌｌａｃｅおよびＩｔａｋｕｒａが”より優れた支持体”へ注目したこと の正当性を認識し、我々は、全く異なる手法に着手し、全体に（ｉｎ ｔｏｔｏ ）支持体材料に注目した。我々は、そうする際に、生体高分子および生化学合成 における用途に真に優れた固体支持体は、下記のような、リンカーが利用できる が支持体と関連させて使用する必要がないように無機材料の化学構造的な剛性を 有しておらず；活性化されると支持体表面がそれに対して共有結合的に生体高分 子を結合可能であるように表面活性化を受け、かつ第１の基準と関連して生体高 分子のインサイチュ合成を受け；生体高 分子合成の結論において、生体高分子が占有していない支持体上の領域が非特異 的結合を受けず、または上記非特異的結合が実際に起こると生体高分子を排除す ることなくこれらの材料が容易に表面から除去されるように化学的に不活性であ り；そして、材料を種々の異なる範疇で利用可能であるように取り扱いおよび操 作が容易である、材料が最も好適であることを確認した。 これらの基準は、生体高分子合成を受ける条件下で好適には化学的に不活性で ある表面活性化、有機高分子を用いることによって達成される。 本文で使用したように、用語”有機高分子”および”高分子”は、生体高分子 合成に適した条件下で最も好適には化学的に不活性であり、限定されはしないが 水素、炭素、酸素、フッ素、塩素、臭素、硫黄および窒素を含む種々の化学元素 の置換基を含む炭素骨格を含む支持体材料を意味する。限定されはしないが、代 表的高分子として、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブ チレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリドン、ポリテトラ フルオロエチレン、二フッ化ポリビニリデン、ポリフルオロエチレンプロピレン 、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオ ロエチレン、ポリスルオン、およびその共重合体の混合物類が挙げられる。ポリ プロピレンは、特に好適な高分子である。 本文で使用したように、用語”表面活性化”を高分子と関連させて使用した際 には、外部化学種が高分子表面に吸着されそれによって化学種が高分子表面に生 体高分子および生体モノマーを化学的に連結可能となるように高分子を修飾する プロセスを意味している。 本文で使用したように、用語”媒体”を用語”高分子”と連関させて使用した 際には、高分子の物理的、構造的形態を意味する；従って、”媒体”は、一般的 に、高分子フィルム（すなわち、実質的に非多孔性の表面を有する高分子）；高 分子膜（例 多孔性表面を有する高分子）；高分子フィラメント（例 メッシュ および布）；ポリマービーズ；ポリマーフォーム；ポリマーフリット；およびポ リマー糸として定義できる。最も好適には、高分子媒体は、糸または膜またはフ ィルムである。 本文で使用したように、用語”デバイス−媒体”を用語”高分子”と連関させ て使用する際には、マイクロタイタープレート、試験管、無機シート、ディップ スティック等のような高分子媒体を結合できるすべてのデバイスを意味する。た とえば、高分子媒体がポリプロピレン糸であると、１本以上のポリプロピレン糸 がプラスティックディップスティックタイプデバイスに結合できるか、または、 ポリプロピレン膜がガラススライドに結合できる。特定のデバイスは、それ自体 、重要でない−−−必要であるのは、高分子媒体が高分子またはそれに吸着され たあらゆる生体高分子の機能的挙動に影響を及ぼすことなくそれに対して結合で きることおよびデバイスインテントがデバイスを導入したあらゆる材料（例 臨 床試料等）内部で安定であることである。 本文で使用したように、用語”吸着された”とは、化学および生化学技術で通 常それに帰属する意味を有する。再度述べると、別の材料に吸着された第１の材 料は実際に、第１の材料が他の材料表面から容易には除去できないようにその材 料の”一部”となる。たとえば、表面活性化高分子は、その表面に求核試薬を含 む；適切な条 件下では、たとえば、前記求核試薬と反応する生体モノマーはこのような求核試 薬によって生体高分子表面に共有結合で結合されそれによって吸着される。 本文で使用したように、用語”表面”とは、好適には約１０〜約１０００オン グストロームである約５０００オングストローム以下の深さを意味する。 本文で使用したように、用語”求核試薬”とは、電子欠失種と結合可能な１対 の電子を含む化学種である。好適には、外部化学種は、高分子表面に吸着される と求核試薬となる。”外部化学種”とは、高分子表面に先に吸着されていない化 学種である。再度述べると、外部化学種は、高分子表面に吸着されると、求核試 薬となる。好適には、外部化学種は、プラズマ放電を受ける。通常、プラズマプ ロセスは、外部化学種のイオン化された形態及びラジカル形態を生み出すであろ う。好適には、外部化学種は、窒素；酸素；硫黄；炭素；水素；アルゴン；ヘリ ウム；および前記の少なくとも１つを含む組み合わせからなる群から選択される 。これらの外部化学種の求核形態として、例えば、アミン；ヒドロキシル；チオ ール；カルボキシレート；および少なくとも前記１つを含む置換基が挙げられる 。外部化学種が適切な条件下でプラズマに供されると、この外部化学種のイオン 化され及びラジカルの形態（群）が生ずる。当業者には明らかであるように、適 切な条件下で前記イオン化され及びラジカルの形態（群）は、高分子と”化学的 に”相互作用し、一方、その非イオン化及び非ラジカルの形態（群）は、高分子 と化学結合を形成する傾向を有していない。 本文で使用したように、用語”生体高分子”とは、生物または化 学部分の単位を意味する。限定されはしないが、代表的生体高分子として、核酸 、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴ糖 、脂質、糖脂質、リポ多糖、リン脂質、限定されないが逆方向ヌクレオチド、ペ プチド核酸、Ｍｅｔａ−ＤＮＡ、および上記の組み合わせを含む前記の合成類似 体が挙げられる。”生体高分子合成”とは、生体高分子の有機および無機の両者 の合成方法を包含する。生体高分子の単一単位または生体高分子の部分でない単 一単位を意味する”生体モノマー”は、生体高分子に関連している。したがって 、例えば、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド生体高分子内で生体モノマーで あり、アミノ酸は、タンパク質およびペプチド生体高分子内で生体モノマーであ る；例えば、アビジン、ビオチン、抗体、抗体断片等は、同様に生体モノマーで ある。さらに、本文で使用したように、用語”開始生体モノマー”または”イニ シエーター生体モノマー”とは、反応性求核試薬によって高分子表面に共有結合 で結合された第１の生体モノマー、または、生体高分子に結合されたリンカーま たはスペーサーアームに結合される第１の生体モノマーであり、前記リンカーま たはスペーサーアームは、反応性求核試薬を介して高分子に結合されている。 本文で使用したように、”類似体”または”合成類似体”が生体モノマーまた は生体高分子と関連させて使用されると、特定生体モノマーまたは生体高分子の 天然または非天然変種を称する。たとえば、”抗体類似体”として、キメラ抗体 、モノクローナル抗体、および抗体断片が挙げられる；”アミノ酸類似体”とし て、ベータ・アラニンが挙げられる；ヌクレオチド類似体として、イノシンおよ びデオキシヌクレオチドが挙げられる。上述は、排他的なものでは なくむしろ代表的なものである。 本文で使用したように、用語”逆方向ドットブロット”とは、生体高分子を固 体支持体に結合させるプロトコールを意味し、試料材料中の成分の存在（または 不在）をその適用によって、およびその後の試料の生体高分子との相互作用（ま たは非相互作用）によって検出する。本文で使用したように、用語”ドットブロ ット”とは、試料材料中または由来の成分を固体支持体に結合させ生体高分子ま たは生体モノマープローブをそれに適用するプロトコールを意味する。 本文で使用したように、用語”マスク”または”マスキング”とは、生物、化 学または物理的反応の起こることを選択的に阻害する材料またはプロセスを意味 する。例示の手段として、高分子を表面活性化技術に供した後にスクリーニング メカニズムによってマスクされまたは被覆された高分子領域が実質的に表面非活 性であり、それによってマスクされなかった領域のみが実質的に例えば生体高分 子合成に参画できるような、表面活性化以前に有機高分子の最上部で行われるス クリーニングメカニズムがマスクとして挙げられる。用語”マスク”または”マ スキング”は排他的に静的なものを意味しておらず、ダイナミックマスキング、 すなわち、１連のマスキング段階を用いて同一の活性化された有機高分子上に種 々の異なる生体高分子を選択的に合成することも、同様に、本定義の範囲に属す るとみなされる。 本文で使用したように、用語”認識ドメイン（領域）”とは、細胞表面上でレ セプターによって認識されるアミノ酸の配列を意味する。 本文で使用したように、用語”生体反応性ペプチド”とは、細胞から反応を惹 起可能なペプチドを意味しており；たとえば、細胞表面の認識部位に結合するペ プチドは生体反応性ペプチドである。 本文で使用したように用語”シード”は、生体反応性ペプチドに結合しかつそ れに他の同様の細胞が結合する細胞を意味する。 本開示の残りは、都合上、高分子ポリプロピレン、化学種アンモニア、プラズ マプロトコールおよびオリゴヌクレオチドおよびペプチド合成に用途に焦点を絞 る。他の高分子類、化学種、エネルギー励起方法、および生体高分子も本文に開 示の発明を受けることを理解されたい。 ポリプロピレンは、化学的に極めて不活性でかつ疎水性である；したがって、 ポリプロピレンは、極めて腐食性の環境においても利用できる。たとえば、ポリ プロピレンは、種々の鉱酸（例 塩酸）、有機酸（例 ギ酸、酢酸）、塩基類（ 例 塩化アンモニウム、水酸化カリウム）、塩類（例 塩化ナトリウム）、酸化 剤（例 過酢酸、ヨウ素溶液）、および有機溶媒（例 アセトン、エチルアルコ ール、アセトニトリル）に対して良好な化学耐性を有している。さらに、ポリプ ロピレンは、低蛍光バックグランドを供する。ポリプロピレンは、下記の化学構 造を有している： この構造は、生体高分子合成に対して機能的ではない；すなわち、それ自体とし て、支持体材料としてポリプロピレンを用いてオリゴ ヌクレオチドを合成することはできない。したがって、ポリプロピレンが生体高 分子合成に有用となるためには、その表面を例えばアミノ基を表面に導入するこ とによって修飾しなければならない。効率的、迅速かつ経済的なポリプロピレン 媒体表面上への上記アミノ基の導入方法は、アンモニアまたは有機アミン含有ガ ス中でプラズマ放電を使用することによる。 ”プラズマ”は、最も好適には電磁場から十分なイオン化エネルギーを得るイ オン化ガスである。それは、長飛程の電磁力を示し電気の伝導体となる。プラズ マは、電子、原子、陽および陰イオンおよび中性フリーラジカルの混合物からな る。プラズマの総電荷は、中性である。限定されはしないが、プラズマエネルギ ー源として、直流、交流、ラジオ周波数、マイクロウェーブ、ショックウェーブ およびレーザーが挙げられる。低温プラズマ処理として、ラジオ周波数プラズマ 放電（”ＲＦＰＤ”）、マイクロウェーブプラズマ放電（”ＭＦＰＤ”）および コロナ放電（”ＣＤ”）が挙げられる；上記処理はすべて、通常、約１０００オ ングストローム以下の深さまで固体材料表面のみに影響を及ぼし、材料の残りは 未修飾のまま残す。 プラズマによる表面相互作用は、通常、３種の一般的な反応可能性の群に分類 される；（１）高分子表面の化学種が表面から除去できる；（２）外部化学種が 高分子表面に付加できる；または（３）結合再配置が高分子自体の表面内部で起 こりうる。これらの反応の１種を越えるものが同時に起こることもあり得る。プ ラズマ放電と熱の表面修飾法（イオン化、または、通常高分子全体に深く浸透し てその全体としての特徴に大きく影響を及ぼすアルファまたはベータ照射）の主 な違いは、反応ガスまたは反応種を産生して種々の表面状態をつくりうる混合物 の選択および望ましくない副次的影響を起こしうる第２の反応種の欠如という観 点から、実現可能な高い化学可撓性である。 ポリプロピレンは、アンモニアガス中または限定されはしないが１級、２級ま たは３級であってよいＣ₁−Ｃ₁₂脂肪族または環状アミン類を含むその他の適切 なアミンを導入したものの中で、ＲＦＰＤ、ＭＦＰＤまたはＣＤを用いて、それ に対してアミノ基を導入することによって、表面活性化される。炭化水素鎖は、 直鎖、分枝鎖、飽和または非飽和であることができ、１個以上のアミノ基が炭化 水素鎖に結合できる。メチルアミン、アルキルアミン、エチレンジアミン、ジア ミノシクロヘキサンは、上記アミン類の例である。アンモニアは、最も好適であ る。 ＲＦＰＤ、ＭＦＰＤまたはＣＤの存在下において、最も好適なアミノ基の媒体 への結合メカニズムは、下記のようである： 酸素ラジカル存在下において、生成した表面活性化ポリプロピレンは、下記の活 性化表面を含む： 硫黄ラジカル存在下において、生成した表面活性化ポリプロピレンは、下記の活 性化表面を含む： したがって、例えば、周知の核酸合成法を用いて、下記の吸着開始ヌクレオチド 類をうることができる： ホスホルアミデート ホスフェート 式中、Ａは、保護基であり、および、Ｂは、前記４個の塩基の１つ を示す。化学リンカーは高分子への生体モノマーの結合を必要としないので、開 始生体モノマーが吸着され、すなわち、実際に高分子自体の”一部”となる。 ＭＦＰＤ、ＲＦＰＤおよびＣＤは、高分子媒体の必要とする部分のみが活性化 されるように、効率的に制御できるのは有益である。したがって、表面の一部の みを活性化することによって、その残りは化学的に不活性であり続け、その中に 本発明の利点が存在する。高分子媒体の表面の（好適には）１部位の部分のみを 活性化することによって、例えばインサイチュオリゴヌクレオチド合成の結論と して、実質的に表面の残部のすべてが化学的に不活性であるように、活性化され た領域のみが生体高分子合成を受けるようになるであろう。したがって、もしこ のようなオリゴヌクレオチドを遺伝的追跡のためにプローブとして用いるならば 、核酸巨大分子の表面への非特異的結合に関連した問題が回避される。 好適には、高分子媒体表面の１平方センチメーターあたり約５０ナノモル（” ナノモル／ｃｍ²”）未満、さらに好適には約５〜１５ナノモル／ｃｍ²の活性化 化学種を含む。これらの値は高分子材料の高さ×幅表面面積に関している；した がって、高分子材料が多孔性表面を含む状況では、先の値は、孔に属する表面積 が示されると、高さ×幅表面積よりも極めて大きい総表面積には適用されない。 これとは別に、高分子媒体約１５％未満、さらに好適には約１０％未満および最 も好適には約５％が活性化学種を含む。この面積は”小さい”ように見えまたは 前記百分率は”低い”ように思われるが、これらは相対的値である。たとえば、 １００％活性化化学種表面を有する高分子媒体を使用することもできるであろう 。しかし、こ れは、活性化種のすべてが開始生体モノマーによって占有されないかもしれない ことしたがって非特異的結合の可能性が高まるという点において、問題が生ずる であろう。しかし、表面活性化百分率が低下するに伴い、表面の各活性化部分が 開始生体モノマーによって確実に占有される可能性が実質的に増加する（特に、 周辺領域が化学的に不活性であるので）。 プラズマ発生装置は市販されており、本発明に適用可能である。特に好適なプ ラズマジェネレーターは、Ｐｌａｓｍａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ ｉｔｙ、ＣＡ（Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．ＰＳ０１５０Ｅラジオ周波数）から入手可能 である。このようなデバイスは、ガス導入条件、出力、プラズマ放電時間等が容 易に選択され、変化させられ、最適化できかつ制御できるので、好適である。こ れらのパラメーターは、ほとんど実験せずに最適化できるが、それは主に、高分 子媒体の物理的条件が、もし例えば出力（通常ワット単位）が高すぎるかまたは プラズマ放電時間が長すぎると、悪影響を受けることによる−−−−このような 悪影響は、通常”もろい”高分子媒体を生成することによって現れる。したがっ て、必要度に応じて、および本文に開示したパラメーターと矛盾しないように、 当業者は、高分子媒体の効率的表面活性化の条件を最適化する能力を付与されて いる。 ポリプロピレンのアミン化に関して、前記ガスが下記の範囲の下記の成分を含 むことが好適である：アンモニア（約９９％〜約１００％）および酸素（約０〜 約１％）。好適には、出力電源のワットは、約１０〜約５００ワット、さらに好 適には約１００〜約４００ワット、およびさらに好適には約２００ワットである 。好適には、 ポリプロピレンおよびガスは、約１０分未満、さらに好適には約１〜約５分の間 、最も好適には約２分のプラズマ放電に供される。プラズマ放電の種類に関して は、ラジオ周波数波が利用されるのが好適である；好適には、これらは、約１Ｍ Ｈｚから約２０ＭＨｚの範囲、および最も好適には約１３ＭＨｚである。マイク ロウェーブプラズマ放電に関して、前記マイクロウェーブが約１，０００ＭＨｚ 〜約３，０００ＭＨｚの範囲、および最も好適には約２，０００ＭＨｚである。 コロナ放電に関して、適用処理出力は、約１０〜約２５０ワット、さらに好適に は約１０，０００〜２０，０００ボルトの電極にある。 高分子媒体は、研究者の要請に従い変化させることができる。高分子媒体が生 体高分子合成の後に切除を受けることが望ましい；しかし、これが望ましいのは 、主に、その上に合成された生体高分子の目的とした用途に基づいている。たと えば、遺伝レベルにおける核酸分析の領域では、試験機器が品質管理操作に容易 に供されることが絶対的に必要であると考えれている。例として、薬物製造領域 では、いったん製造されると、薬物の大規模ロットの一部分（または部分類）を 分離することが実質的に容易である；もしこの部分が必要な品質保証および品質 管理（ＱＡ／ＱＣ）パラメータに適合するならば、その際には、統計的見地から 、全ロットが同一品質となる；一方、もしこの部分（類）が必要なＱＡ／ＱＣコ ントロールパラメータに適合しないならば、全ロットが疑わしい。この手法にあ る主な想定は、このロット製造に関連した全パラメータが、１試料のいかなる部 分も全ロットを代表するとして同一であるとしている。遺伝分析の領域が拡大し かつ利用が増加するに伴い、同様の保証 が要求され必要とされるであろう。 生体高分子合成後に開裂を受ける高分子媒体が望まれていることを上述に関し て記憶されたい。 このような特徴が、高分子媒体上に合成された生体高分子のＱＡ／ＱＣを可能 とする。たとえば、膜の場合、その一部分または部分類を、詳細かつ厳密な分析 手法がそれに対して容易に適用できるように、切除可能である−もし、このよう な分析がたとえば特定のオリゴヌクレオチド配列が存在していることを示したな らば、その際には、統計的見地から、全膜がその配列を有している。 高分子媒体の切除によって、同様に、それぞれが所定の生体高分子を含む複数 の媒体の産生が可能となる。これらを次に切除して、各媒体からの１切片を単一 のデバイス−媒体に結合できる。したがって、たとえば、多数の（ｐｌｅｔｈｏ ｒａ）ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）が容易に産生でき、各ディップ スティックは特定の生体高分子を含む数種の異なる高分子媒体部分を含んでいる ；したがって、あらゆる特定の生体高分子合成条件は、同一でありかつこのよう な生体高分子はＱＡ／ＱＣプロトコールを受ける。 研究者の必要が切除能力に関連する特定のパラメータを決定するであろうが、 膜の場合、厚さ約８０〜約１００μｍの厚さを有するポリプロピレンを利用する ことが好ましく、糸の場合、直径約０．００１インチを有するポリプロピレンを 利用することが好ましい。膜の場合、切除は、いかなる開裂機器（例はさみ）に よっても容易に達成できる。糸の場合、開裂部位で末端を”密封”できる機器で 開裂するのが望ましく、すなわち、これらは、レーザー、超音波機冊、またはホ ットナイフである；これが望ましいのは、実用的見 地から予測され、糸を開裂すると線維が互いにほどくことができるようにからみ あったファイバーで構成されていることでわかる。（前記ファイバー自体は、も ちろん、直接利用できるが、しかし、糸は、操作がやや容易であることから望ま しい；しかし、これは、同様に、研究者の希望に応じている。） 本発明の特に好適な態様によれば、二軸配向ポリプロピレンフィルム（ＢＯＰ Ｐ）は、オリゴヌクレオチド合成を支持するための固相活性化基質として使用さ れる。前記基質は、適切には、アレイすなわち配列グリッドを含み、そのうえに オリゴヌクレオチド合成に必要な試薬が手動でまたは機械のいずれかで適用され る。試薬の自動化機械的適用のため、試薬運搬のために低デッドボリューム、非 交差夾雑構造を達成する単離弁を含む試薬分配手段を使用することが現在望まし い。上記試薬分配手段は、例えば、本発明の譲受人に共通して譲受された同時係 属米国特許出願番号第０７／９３６，９７６号および第０７／９０９，２３２号 に開示されている。これとは別に、その他の自動化合成機器を改造して、本文に 記載したようにポリプロピレンフィルム基質の試薬分配を達成することもできる 。 ラジオ周波数プラズマアミン化ポリプロピレン膜およびフィルムは、アレイ形 態のオリゴヌクレオチド合成に機械的試薬分配手段を用いるための適切な基質で あると提案された。しかし、微多孔性の膜基質を用いて上記配列を合成しようと する試みの結果、試薬分配チャンネル間の化学的漏出、物理的耐性の欠如および 蛍光バックグランドの上昇の故に、不満足な結果となった。微多孔性膜基質は、 また、極めて脆弱すぎることも証明された；それらは、それらを機 械的試薬分配手段から除去しようとして簡単に壊れ、繰り返し使用の後にはばら ばらになった。化学合成の後、膜は、同様に、蛍光バックグランド増強を示した ようだった。 この特に好適な本発明の態様によれば、ＢＯＰＰフィルムは、例えば、機械的 試薬分配手段を用いたオリゴヌクレオチド合成における使用において膜に置き換 わった。ＢＯＰＰフィルムは耐久性でかつ使用した後でも破壊の兆候は全く見ら れず機械的試薬分配手段から容易に除去される。ＢＯＰＰフィルムは、また、低 蛍光基質材料の必要性を満たす。最後になるが、ＢＯＰＰフィルムは、機械的試 薬分配手段のチャンネル壁の間のシールを形成する非多孔性基質に対する必要性 を満たし、従って、化学物質の隣接するチャンネルからの漏出を防止する。 例えばオリゴヌクレオチド合成における用途のための二軸配向ポリプロピレン フィルム基質は、市販されている；さらに、適切なフィルムは、当技術で周知の ように容易に調製できる。適切なフィルムとして、Ｃａｔａｌｉｎａ Ｐｌａｓ ｔｉｃｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ、またはＭｏｂｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｉｌｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｐｉｔｔｓｆｏｒｄ、ＮＹ から、登録商標Ｂｉｃｏｒ ＢおよびＢｉｃｏｒ １００ＬＢＷとして入手可能 なものが挙げられる。これらのフィルムは、一般に、高透明性、半透明性の公式 の厚さが約０．６５から約２ミルズのフィルムとして特徴づけられる。典型的フ ィルムは、ＡＳＴＭ Ｄ８８２によって下記の特性を有するものとして報告され ている：引っ張り強度約１９，０００〜約２１，３００ １ｂ／ｓｑ（ＭＤ）お よび約２９，０００〜約３８，７００ １ｂ／ｓｑ（ＴＤ）；およ び破断伸び約１５０〜約１６２％（ＭＤ）および約４５〜約６０（ＴＤ）。フィ ルムは、また、ＡＳＴＭ Ｄ２４５７によって約９０のオーダーのＧａｒｄｎｅ ｒ ＧｌｏｓｓおよびＡＳＴＭ Ｄ１００３によって、約１．３〜約２．５のオ ーダーのＧａｒｄｎｅｒ Ｈａｚｅを有している。例示的フィルムの特性分析に 関するさらに詳細は、例えば、Ｍｏｂｉｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な小冊 子”Ｂｉｃｏｒ １００ＬＢＷ配向ポリプロピレンフィルム、開発典型値（１２ ／１／９１）”および”Ｂｉｃｏｒ Ｂ二軸配向ポリプロピレンフィルム、典型 値（１９８７年８月１日）”に見られ、両者ともに本文に参考として取り込んだ 。当然、これらの値は、適切なフィルムの特徴の例示を意味しており、本発明に とって重大であるとみなすべきではない；当業者は、本発明による用途に適した その他のフィルムを容易に確認できるであろう。 全てのポリプロピレンフィルムは、本発明のプロセスによって有意にアミン化 される。鋳造、溶融吹出しおよびＢＯＰＰフィルムについて機械的試薬分配手段 を用いるオリゴヌクレオチド合成の基質として役立つそれらの能力を比較すると 、しかしながら、ＢＯＰＰフィルムのみがハイブリッド形成可能なオリゴヌクレ オチド合成のための完全に適切な支持体であることが見いだされた。鋳造および 吹出しフィルムがこの適用において作用できない原因として、この時点で完全に 評価されていないことがある。すべての鋳造および吹出しフィルムが乳白色とな りまたはアンモニア（２８％）中で７０℃において加熱するかまたは蒸留水中で 加熱すると曇ったので、溶媒浸透は１つの重大な要因である疑いがある。ＢＯＰ Ｐフィルム以外のフィルムと室温で迅速脱保護試薬を使用することも同様に成功 しなかった。 二軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）フィルムは、微多孔性膜よりもより耐久 性に優れており、低蛍光バックグランドを供する。ＢＯＰＰフィルムはまた、優 れた溶媒耐性を供し、鋳造または溶融吹出しポリプロピレンフィルムよりも工学 的に透明である。結果として、ＢＯＰＰフィルムは、特に機械的試薬分配手段を 用いる際に、オリゴヌクレオチド合成の支持体として特に最も望ましい。 オリゴヌクレオチド合成における用途可能性のためのフィルム持性を特性分析 するため、ナイロン、ＰＶＤＦおよびポリプロピレンから製造された数種のフィ ルムを試験した。最も優れた結果は、透明、非多孔性二軸配向ポリプロピレンフ ィルムによって得られた。多孔性ポリプロピレン膜ならびにその他の多孔性膜は 、高いバックグランド信号を示し、このバックグランドの少なくとも有意部分は ＤＮＡシークエンサー中の光学系では十分にろ過しきれない散乱効果によるらし い。 ドットブロットハイブリッド形成分析のためのバージンフィルムの評価は、低 蛍光検出のための適用においてその適切性を示唆した。バックグランドおよび検 出感度についての予備的研究において、赤外標識オリゴヌクレオチドの希釈系列 をフィルムにスポットし乾燥させた。赤外蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチ ド（ｌａｃＺ２００）の１：２希釈系列を透明、非多孔性二軸配向ポリプロピレ ンフィルムにスポットし風乾させた。通常、配列決定ゲルを固定するガラスプレ ートサンドイッチの間にこのシートを固定した。信号は、ＬＩ−ＣＯＲ Ｍｏｄ ｅｌ ４０００Ｌ ＤＮＡシークエンサーを用いて検出した。１６００ｆｍｏｌ から０．１ｆｍｏｌまでを 含有する１μｌスポット由来の信号は、明らかに可視化できた。シグナルゲイン は８００に設定し、シグナルオフセットは５０に設定した。アクリルアミドゲル に対する通常のオフセット設定は２００−２５０である；このことは明らかに、 基質と有意に低いバックグランド蛍光を示している。 プライマー１００アットモル（ａｔｔｏｍｏｌｅ）に対応するスポットは、上 記の配置で明確に見えた。異なる設定で、はるかに低い濃度のドットからのシグ ナルも同様に見ることができるが、ただし、その際には高濃度のいくつかのドッ トがアラインメントからはみ出す。１００アットモルが絶対的限度でないことは 明らかである。たとえば、２次元スキャンシステムは、全スポット領域における シグナル積分を可能とし、シグナル／ノイズ比の信頼できる決定を可能とする。 ターゲットとして一重鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡを用いるハイブリッド形成実験 において、ヌクレオチド２００から２１７のｌａｃＺ−遺伝子に対応する１８− ｍｅｒオリゴヌクレオチドをプローブとして用いた。一重鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮ Ａの１：２希釈系列を透明のポリプロピレンフィルムにスポットし、風乾させ、 ＵＶ架橋させた。赤外標識プローブによるＳＤＳ緩衝液中３７℃におけるハイブ リッド形成（Ｃｈｕｒｃｈ＆Ｋｉｅｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ 、２４０：１８５（１９８８））および洗浄の後、フィルムをＬＩ−ＣＯＲ Ｍ ｏｄｅｌ ４０００Ｌ ＤＮＡシークエンサーでスキャンした。１００ｆｍｏｌ 〜０．０５ｆｍｏｌのＭ１３ターゲットＤＮＡ由来の陽性ハイブリッドシグナル が明確に見られた。陰性コントロールは、１０ｆｍｏｌ ｐｌｅＸＢ６プ ラスミドＤＮＡを含有していた；それは、極めてかすかなシグナルを示し、ハイ ブリッド形成および洗浄手段が理想的ではなかったことを示唆している。シグナ ルゲインおよびオフセットは、それぞれ、８００および１５０であった。 ５０アットモルほどのわずかのターゲットＤＮＡが明確に検出された；これは 、ｌａｃＺ−ＤＮＡの（５×１０^-7モル×１０¹⁰ｇ／モル＝）０．５μｇに対応 している。この場合、プローブは、５’標識されており、従って、たった１個の フルオロクロームしか有していなかった。ｃＤＮＡマッピングのため、３００− １５００ｂｐのプローブが通常使用されるであろう；これらは、ＤＮＡ分子あた り１０−１０ｃ色素分子を有しており、従って、高感度が得られるであろう。 開示された高分子は、例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチドをその上に 直接合成するために特に極めて適している。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ ｎｔ ＯＬＩＧＯ １０００を含めて種々の市販の核酸シンセサイザーが利用可 能であるのは有益である。アミン化ポリプロピレン膜または糸に注目すると、ア ミン化プロセスの直後に（または保存から取り出した後に）、材料を直接核酸シ ンセサイザーの反応チェンバー中に入れることができる；上記材料の融通性の故 に、それらは、チェンバー内部で容易に操作でき、すなわち、膜の場合緩く”巻 き上げ”または糸の場合緩く挿入される。オリゴヌクレオチド合成がアミン化ポ リプロピレン上で直接進行させることができるのは有益であり、アミノ基の”活 性化”性質の故に、これらのオリゴヌクレオチドは、ポリプロピレンに直接共有 結合で結合できる（もちろん、”開裂可能”結合またはスペーサーアームは、オ リゴヌクレオチドが除去できるように利用できる；コハク酸ヌクレオシドの活性 エステルはこれらがアンモニアによる”開裂”を受けるので好適である）。 上記由来のオリゴヌクレオチドは、遺伝スクリーニング分析における利用に理 想的に適している。すなわち、オリゴヌクレオチドが関心の遺伝子の野生型また は変異（類）配列に相補性であるオリゴヌクレオチドを含むアミン化ポリプロピ レンを利用することによって、調製患者試料について、問題の配列の存在または 不在をスクリーニングできる。上記遺伝分析における用途のために化学的に合成 したオリゴヌクレオチドの長さは、長さ約２５０塩基まで、好適には約５〜約１ ００塩基；さらに好適には約８〜約３０塩基、および最も好適には約１６塩基と するのが望ましい。これらの長さは、遺 伝分析を実施する条件に相対して考えられるべきである。たとえば、室温では（ 我々はこの温度で分析を実施することを望む）、最も好適な長さが１６塩基であ り；より低温では、短い（すなわち、８−ｍｅｒ）のが利用できる。 当業者は、患者からゲノム試料を分析用に調製する方法を容易に理解できる。 試料ＤＮＡは、例えば、臨床試料（すなわち、涙、精液、膣分泌物、全血、血清 、血漿、皮膚かきとり物）から容易に得られ、当業者が利用可能な種々の方法に よって調製できる。通常、これらの方法の第１の目的は、問題の核酸の最終的増 幅（例 ポリメラーゼチェーンリアクションによって）をそうでなければ妨害す るような外来性物質が除去できる程度まで、核酸を精製することである。血清を 試料として用いて、核酸の調製は、通常、下記の段階を含む；血清を７０℃で１ 時間、２５ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ ％ＳＤＳ中２．５ｍｇ／ｍ１のプロテナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ）とともにインキュベーションする。この後に、下記の抽出を行う； フェノール抽出およびエーテル抽出である。この後にエタノール沈殿が続く。た とえば、Ａ．Ｌａｒｚｕｌら、Ｊ．Ｈｅｐｔｏｌ．５：１９９−２０４（１９８ ７）参照。述べたように、その他のプロトコールおよび方法もこのような精製の ために容易に使用可能である。 上記精製の後、（通常）問題の特定のゲノム領域を増幅する必要がある。これ は、ポリメラーゼチェーンリアクション（”ＰＣＲ”）のような方法および問題 の特定領域に対するプライマーを用いて容易に達成できる。当業者は、ゲノム試 料に対して上記増幅法を適 用することならびにそれに必要なパラメータ（遺伝子領域または遺伝子を含む核 酸配列領域の増幅を実質的に確実にするプライマーの選択）を把握しかつ理解す る能力を付与されている。 さらに当業者には明らかであるように、ＤＮＡ試料は定義上２個の相補性ＤＮ Ａ鎖を含んでいるので、ＰＣＲのような増幅方法は、何組かの相補性アンプリコ ン（”アンプリコン”とは、増幅産物の鎖の１組であり、すなわち、相補性”ア ンプリコン”は、ＰＣＲ増幅の生成産物である）を生成するであろう。アミン化 ポリプロピレンに共有結合で結合されたオリゴヌクレオチドに対する試料結合を 増強させる手法として提案されているのは、分析前にこれらの組の１つを反応混 合物から除去することである；これは、互いに相補性アンプリコンのハイブリッ ド形成のための競合を低下させる効果がある。この手法のため、唯一１組のアン プリコンセットのみをアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスに よるスクリーニングに供する。たとえば、プライマー１セットをビオチン化し、 他のセットを例えば検出のために標識する。したがって、増幅後、例えば、アビ ジン被覆ビーズを用いて試料からビオチン化アンブリコンを”除去”できる。こ れは、溶液中に実質的に標識されたアンプリコンのみを保持するという効果を有 している。当然、この標識は、標識アンプリコンをアミン化ポリプロピレン−オ リゴヌクレオチドデバイスによって”スクリーニング”した後に検出目的で利用 できる。 上記増幅の後、試料材料を、前記標識アンプリコンに相補性の配列を有するオ リゴヌクレオチドを含むアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイス に呈することができる。アミン化ポリプ ロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスの好適な適用が遺伝的変異のためのゲノ ム試料のスクリーニングであるので、緊縮条件（すなわち、限定されはしないが 温度、イオン強度、化学的条件、時間および配列の性質を含むハイブリッド形成 および脱ハイブリッド形成を可能とする条件）が重要である。すなわち、核酸配 列中１改変のみを含む変異のため（野生型に対して、または”正常”配列に対し て）、変異配列スクリーニングにおいて、正常配列すらも相補オリゴヌクレオチ ドに容易にハイブリッド形成することが大いにあり得るであろう。したがって、 このような”非特異的”ハイブリッド形成の除去が必須である。たとえば、これ は、塩濃度低下による１連の洗浄を用いて達成でき、それは、特異的にハイブリ ッド形成した材料の実質的にすべてを除去する前に、非特異的にハイブリッド形 成した実質的にすべての材料を必然的に除去する効果を有している。 相補配列のみを確実に検出することが重要であるので、経時的にかつ緊縮条件 下でアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスからの試料核酸配列 の脱ハイブリッド形成を”追跡”できるように、”歴史的”脱ハイブリッド形成 分析を実施することを現在我々は好適としている−−−それらがアミン化ポリプ ロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスから除去されるに伴い、非相補性および 相補性配列の脱ハイブリッド形成パターンを比較することによって、我々は、前 記パターンが実質的に異なり”正確な”ハイブリッド形成を正しく評価できるこ とを確認した。この歴史的分析を用いて、特定の遺伝分析のための”ｙｅｓ／ｎ ｏ”緊縮プロトコールを作ることができる。たとえば、もし特定の公知の変異が 特定の公知の ”歴史的”脱ハイブリッド形成パターンを供するならば、その後もしこのパター ンが非公知の試料についても得られるならば、その試料はこの特定の変異を含ん でいる。 基本的に、我々は、経時的にシグナル消失（脱ハイブリッド形成を示唆する） を連続的にモニタリングしながら高速液体クロマトグラフィ（”ＨＰＬＣ”）法 を用いて塩低下勾配にハイブリッド形成した材料を供する。下記で詳細に述べる ように、我々は、実験的に、所定の配列の存在または不在に関する正確な決定が 行われるように上記脱ハイブリッド形成パターンにおける明白な差異が確認でき ることを決定した。例えばアミン化ポリプロピレン上に直接合成されたオリゴヌ クレオチドを用いたゲノムＤＮＡの分析のため、上記分析を上記に示したように 容易に実施できる。 通常、ゲノムＤＮＡは、遺伝子１個またはその部分を含む。本文で使用したよ うに、用語”遺伝子”は、当業者が通常使用する定義に従う。ゲノム試料は、限 定されはしないが植物、脊椎動物、無脊椎動物、ウイルス源等を含むすべての起 源に由来することができる。 異なる配列を有するオリゴヌクレオチドは、Ｍａｋｏｓ、Ｕ．およびＳｏｕｔ ｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、”Ｐａｒａｌｌｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇ ｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅ）ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）： １６７５−１６７８（１９９２）に記載されたもののような”種々の”マスキン グ”プロトコールを用いて、前記高分子媒体上に合成できる。たとえば、オリゴ ヌクレオチドの場合、高分子媒体の全表面に適用 される開始生体モノマーは、アデノシンであり、一方、媒体の４分の１のみにお いて、ヌクレオチドシトシンが添加され、残りの４分の３をマスキングし、その 後全媒体の半分にヌクレオチドチミジンを添加し、他の半分をマスキングし、全 高分子媒体に対してヌクレオチドグアノシンを添加する。したがって、最初の４ 分の１において、テトラマーＡＣＴＧが存在する；第１の４分の１を除く半分に トライマーＡＴＧが含まれる；他の半分がダイマーＡＧを含む。このような材料 を、種々の対立遺伝子を含む遺伝変異のゲノム分析または遺伝変異のスクリーニ ングのために利用できる。たとえば、疾患膿胞性線維症をコードする遺伝子を生 成できる核酸配列が少なくとも９５個、異なるものがある。したがって、単一の 高分子デバイス媒体は、そのうえに異なる配列を有する９５個の異なる生体高分 子によって生成でき、生体高分子のそれぞれは、上述のマスキングプロトコール に従って生成される。 これとは別に、異なる高分子媒体上に異なる生体高分子を合成でき、これらを 単一の高分子デバイス上で組み合わせることができる。たとえば、膜の場合、異 なるオリゴヌクレオチドを含む異なる高分子媒体からの種々の切片を単一のデバ イスに固定できる。この手法の利点は、この高分子媒体の一部を含むデバイスの 品質が保証されるように、前記生体高分子を含む高分子媒体の一部をより容易に 品質管理できることである。膿胞性線維症の場合、たとえば、９５個の異なるオ リゴヌクレオチドを含む９５の別々の高分子媒体（またはその小集団）を利用で き、ぞれぞれは、開裂され、それぞれからの部分は品質管理操作に供される。そ の後、これら９５種の媒体を１つの（または数種の）単一デバイス媒体上に組み 合わせること ができる。 開示された高分子は、また、オリゴヌクレオチドの平行分析すなわちハイブリ ッド形成による配列決定（”ＳＢＨ”）のために利用できる。ＳＢＨの最も初期 のかつ実用的手法の１つは、Ｅｄｗｉｎ Ｍ．ＳｏｕｔｈｅｒｎのＰＣＴ公報Ｗ Ｏ ８９−１０９７７、”Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”によって開示されている。同様に、Ｍａｓｋｏｓ＆Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ、同上（以後”Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＳＢＨ”）を参照。Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ ＳＢＨプロトコールによれば、多くの異なるオリゴヌクレオチドが固体 支持体の表面上に合成され、その後、試料核酸配列とのハイブリッド形成を実施 するために利用される；前記オリゴヌクレオチドは、インサイチュで合成され、 オリゴヌクレオチドの収率の単一性を確保する。単一分析実験で同一表面上です べての異なる配列に対するハイブリッド形成を実施することは、それぞれのオリ ゴヌクレオチドすべてに対する同一の実験条件を生むことになるのは有益である 。本文で開示された表面活性化高分子媒体は、ＳＢＨプロトコールに直接適用可 能である。表面活性化高分子媒体は同様に、光除去可能な保護基を用いる高分子 調製にも適用可能である。ＰＣＴ公報、ＷＯ ９０／１５０７０”Ｖｅｒｙ ｌ ａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈ ｅｓｉｓ”を参照。 開示された表面活性化高分子は、特に、”逆方向ドットブロット”プロトコー ルのためのインサイチュ生体高分子合成に適している。たとえば、上述のプロト コールのある部分で、異なる定義された配列を有する１連のオリゴヌクレオチド を表面活性化高分子上に 直接合成する（または、”オフライン”で合成され高分子に結合される）。その 後、前記オリゴヌクレオチドの１つに相補性の配列を有するポリヌクレオチドを 含有する疑いのある試料を、それに対して適用する。検出は、分析前（直接標識 ）またはハイブリッド形成後（間接標識）ポリヌクレオチドの標識を行う標識法 によって達成できる。研究者は高分子媒体上で異なるオリゴヌクレオチドの物理 的位置を知っているので、特定位置における標識の存在は、アミン化ポリプロピ レンオリゴヌクレオチドデバイスにハイブリッド形成した試料由来のいかなる物 質の存在および配列の両者に関する情報を提供する。 さらに、開示された表面活性化高分子材料は、また、生体高分子合成のために リンカーおよびスペーサーアームと連関させて使用することができる。これらは 、高分子支持体からの合成生体高分子の非除去または除去のための非開裂または 開裂プロトコールを受ける。生体高分子、特にオリゴヌクレオチドおよびペブチ ドの合成に適用されるリンカー類およびスペーサーアームは、周知でさまざまで あり、本文で詳細には検討しない。したがって、開示された高分子材料は、例え ば、オリゴヌクレオチドまたはペプチドの合成に使用でき、次に、それらは、支 持体から開裂され、上述の種々の内容のいかなるものにおいても利用できる。 開示された表面活性化、有機高分子は、また、タンパク質／ペプチド配列決定 に適用可能である。当業者には明らかであるように、タンパク質配列決定は、タ ンパク質合成と異なり、特定タンパク質のアミノ酸配列の決定に関している；特 定タンパク質のアミノ酸配列は次に例えば、そのタンパク質の化学合成または前 記タンパク質 のアミノ酸をコードするであろうコドンの一般的または最適核酸配列を決定する ために利用できる。タンパク質配列決定のための周知の操作は、”Ｅｄｍａｎ分 解”と称されている。Ｅｄｍａｎ，Ｐ．およびＨｅｎｓｃｈｅｎ、Ａ（１９７５ ）：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｎ ｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．編著）、２３２−２７９頁、Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒ ｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。簡単 に述べると、前記Ｅｄｍａｎ分解法は、一度に１個ずつアミノ酸残基をペプチド Ｎ末端から開裂すること、およびフェニルチオヒダントイン誘導体としてそれを 確認することを必要としている。この操作は、これまでに十分に述べられており 、本文で詳細には述べない。自動化タンパク質およびペプチドシークエンサーは 、市販されている；例示として、Ｐｏｒｔｏｎ ＬＦ ３０００プロテインシー クエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）が挙げられる。 配列決定されるタンパク質が、化学的に不活性の有機高分子に対して、例えば １，４フェニレンジイソチオシアナート（”ＰＤＩＴＣ”）を用いて、共有結合 で結合できるのは有益である；しかし、高分子およびタンパク質表面に結合可能 なすべての部分が利用可能である。結合反応は、下記のように進行させることが できる： 式中、”ＰＰ−Ｎｕ”は、その表面に吸着された求核試薬を含むポリプロピレン である。 前記高分子に共有結合で結合されたタンパク質はその後、例えばＥｄｍａｎ分 解プロトコールを用いて、効率的に配列決定できる。 開示された表面活性化、化学的不活性化有機高分子の別の適用は、アビジン、 アビジン誘導体、ビオチンおよびビオチン誘導体のような生体モノマーの共有結 合による結合に関連している。上記材料は、多数の適用を有している−−−−特 に望ましいのは、それぞれ、隔離するためにビオチン化したかまたはアビジンに 連結させた巨大分子である。当業者には明らかであろうが、アビジンは、ビオチ ンに特異的な４涸の結合部位を有する糖タンパク質である；ビオチンとアビジン の結合親和性は、極めて強固でありかつ非共有結合の両者である。たとえば、こ うした高分子に結合させたアビジンの用途は、さまざまであり−−−−例として 、上記材料を用いて、例えばＰＣＲを用いるポリヌクレオチド含有試料の増幅の 結果としての配列反応を規格化できる。たとえば、ビオチン化プライマー（ター ゲット配列の第１の領域に特異的）をそれに共有結合で結合したアビジンを有す る高分子デバイス媒体に添加する；その後、第２の標識プライマー（前記ターゲ ットの第２の領域に特異的）、ポリメラーゼ酵素、およびヌクレオチド三リン酸 エステルを結合プライマーに添加し、ＰＣＲ反応を開始させる。高分子に結合し たアビジン量を制御することによって、ＰＣＲ反応の結果生成した伸張した標識 鎖を規格化するようにビオチン化プライマーの量を”制御”し、これらはその後 例えば従来のスラブゲル電気泳動法を用いて分析できる。 表面活性化、有機高分子はまた、細胞接着及び細胞増殖／繁殖のために、例え ばほ乳類細胞培養のために使用される装置、人工皮膚移植片および組織および血 液適合性を示す補綴装置において利用できる。たとえば、特異的細胞認識領域に 関連する生体活性ペプチドは、開示された高分子上に合成でき、種々の細胞を含 む試料をそれに適用でき、それによって、前記認識領域を含む細胞をそれに選択 的に結合させることができる。Ｙａｍａｄａ、Ｋ．Ｍ．、”Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２ ６６：２０ １２８０９−１２８１２（１９９１）は、種々の生物学的活性ペプ チドおよび上記領域に特異的な認識領域を含む細胞について記載している。たと えば、接着性の糖タンパク質フィブロネクチンは、種々の生物学的プロセス、特 に細胞付着および細胞移動を媒介する点において関与している。フィブロネクチ ンは、数種の細胞表面受容体によって結合されている；上記受容体によって認識 されるフィブロネクチンのペプチド配列は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（”ＲＧＤ ”）およびＬｅｕ−Ａｓｐ −Ｖａｌ（”ＬＤＶ”）を含む。したがって、１個以上のＲＧＤペプチドを含む １連の生体高分子は、前記開示された生体高分子上に合成でき、例えば、それに 対する細胞付着を媒介する。たとえば、ＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｋｅｒおよびＲｕ ｏｓｌａｈｔｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：３０−３３、１９８４（および参考文 献）は、細胞付着領域を含むフィブロネクチンのペプチック消化断片を最初に単 離しかつ特性分析した。細胞付着促進活性を有する３０個のアミノ酸の合成ペプ チドを調製した。ＲＧＤＳテトラペプチドがタンパク質被覆プラスチックビーズ に結合された時ではなく前記領域をさらに６個の炭素原子スペーサーアームを介 してセファロースビーズに結合させた時に、ネズミ腎線維芽細胞の付着を促進す るテトラペプチド（ＲＧＤＳ）に描写された。著者は、活性のこうした欠如は付 着領域に対する細胞の接近低下によるかまたはタンパク質被覆プラスチック表面 へ対しての結合効率の不良によるのであろうと示唆していた。この問題を解決す るため、ＣａｐｐｅｌｌｏおよびＣｒｉｓｓｍａｎ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐ ｒｉｎｔｓ ３１ ：１９３−１９４、１９９０は、組み換え遺伝学を用いて、Ｒ ＧＤ領域を含むフィブロネクチンの１０個のアミノ酸配列をＢｏｍｂｙｘ ｍｏ ｒｉシルクフィブロインタンパク質の結晶領域をコードするアミノ酸配列の１領 域に入れた。ＲＧＤ組み換えペプチドの繰り返し配列を含む高分子量の共重合体 ＳＬＰ−Ｆがニトロセルロースフィルター上に固定化され、アフリカミドリザル 腎上皮細胞の付着を促進した。本文に開示された支持体は、これらの種類の最終 結果を達成するために効率的に利用できる。 好適には、生体反応性ペプチドは、高分子表面から生体反応性ペ プチドの空間的距離を保つためにスペーサーアームを用いて、合成できる。上記 スペーサーアームは、好適には長さが原子約５０個であり、さらに好適には長さ が原子約２０個であり、最も好適には原子約６個である。好適なスペーサーアー ムは親水性である。好適には、前記生体反応性ペプチド配列は、他の非生体反応 性ペプチド配列を含む生体高分子に沿って繰り返される；これは、生体反応性ペ プチド配列の数が増加すると、細胞の認識領域が生体反応性ペプチドに結合する 確率が高くなるので、望ましい。好適には、生体反応性ペプチド配列は、少なく とも約３０回、生体高分子内部で繰り返され、さらに好適には生体高分子に沿っ て約１５回、および最も好適には約１０回繰り返される。あらゆる２個の生体反 応性ペプチド配列の間の距離が少なくとも１涸のアミノ酸残基、さらに好適には 約３個および最も好適には約９個であるのが望ましい。 例 下記の例は限定することを全く意図しておらずまたは限定するものとしてみな されることを意図していないが、本発明の特に好適な態様に−−−−非適合配列 すなわち変異の存在の示唆のための核酸配列を含む試料の分析に用いられるポリ プロピレンのアミン化、その後のその上への直接オリゴヌクレオチド合成；およ びその上への直接ペプチド合成に関している。 Ｉ．材料、方法、機器類および特異オリゴヌクレオチド類 Ａ．試薬類 １）ＯＬＩＧＯ １０００ ＤＮＡ シンセサイザー オリゴヌクレオチドの合成は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、 ＢＩＮＡＲＹ−ＰＡＫ^TMホスホルアミダイド（ｄＡ（Ｂｚ）−パーツ番号第３３ ７７３７、ｄＣ（Ｂｚ）−パーツ番号第３３７７３８、ｄＧ（ｉＢｕ）−パーツ 番号第３３７７３９、Ｔ−パーツ番号第３３７７４６）；ＤＮＡ合成試薬キット （Ｏｘｉｄｉｚｅ−−パーツ番号第３３７７３２、ＤＥｂｌｏｃｋ−パーツ番号 第３３７７３３、Ｃａｐｌ−パーツ番号第３３７７３４、Ｃａｐ２−パーツ番号 第３３７７３５）；ＡＣｔｉｖａｔｅ試薬（パーツ番号第３３８２８４）および 開裂および脱保護キット（パーツ番号第３３７７４２）を用いて達成した。 ２）ハイブリッド形成緩衝液 すべての化学試薬は、少なくともＡＣＳ等級であった。ハイブリッド形成緩衝 液は、６ＸＳＳＰＥ／０．０１％ドデシル硫酸ナトリ ウムからなった。６ＸＳＳＰＥは、ＺＯＸＳＳＰＥ（１リットルあたり；３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄；１０Ｎ ＮａＯＨによってｐＨ７．４に調 整した０．０２Ｍ ＥＤＴＡ）を希釈し６Ｘを得て、その後、それに対して０． ０１％ＳＤＳ（ｖ／ｖ）を添加し調製した。 ３）Ｄ−ＨＡＳ^TM勾配緩衝液 Ｄ−ＨＡＳ^TM勾配緩衝液は、ＺＸＳＳＰＥ／０．０１％ＳＤＳ（すなわち、Ｚ ＯＸＳＳＰＥストックを利用し、ＺＸＳＳＰＥに希釈し、０．０１％（ｖ／ｖ） ＳＤＳを添加した）から構成された。 ４）ラジオ周波数プラズマ試薬 電子等級無水アンモニア（９９．９９５％純度）を、商標ＡＬＨＡＧＡＺ^TMと してＬＩＱＵＩＤ Ａｉｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｎｕｔ Ｃｒｅｅ ｋ，ＣＡ）から入手した。超高純度アルゴンガス（９９．９９９％）は、同様に 同じ商標でＬｉｑｕｉｄ Ａｉｒから入手した。 Ｂ．高分子デバイス媒体 ポリプロピレン膜フィルターシート（２１．５ｃｍ×２６．６ｃｍ，０．２μ ｍ孔径）は、商標ＭＥＴＲＩＣＥＬ^TMとしてＧｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａ ｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎから入手した。ポリプロピレン糸（０．０ １０インチ直径）は、Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂ ｌｕｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ａｌａｂａｍａ（製品番号ＭＰ６９）から入手 した。ポリプロピレンフィルム（１．２ミル）は、Ｃａｔａｌｉｎａ Ｐｌａｓ ｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｌａｂａｓ ａｓ，ＣＡ）から入手した。 Ｃ．市販のプロトコール １）ポリメラーゼチェーンリアクション（”ＰＣＲ”） 特定ＤＮＡ巨大分子の増幅は、ＡｍｐｌｉＴａｇ^TMを有するＰｅｒｋｉｎ−Ｅ ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＧｅｎｅＡｍｐ^TNＤＮＡ増幅試薬キット（パーツ番号第 Ｎ８０１−００５５）を用いて、達成した。製造業者の指示に従った。 ２）プライマービオチン化 ＰＣＲ増幅用５’−ビオチン化プライマーは、Ｂｉｏｔｉｎ−ＯＮ^TMホスホル アミダイト（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，Ｐａｌｏ Ａ ｌｔｏ、Ｃａ．パーツ番号第５１９１）を用いて、作製した。ビオチン化プライ マーは、使用に先立ち精製することはなかった。製造業者の指示に従った。 ３）プライマー標識 ＰＣＲ増幅のためのプライマーは、ＵＳＢ ＣＬｏｎｅｄ Ｔ４ポリヌクレオ チドキナーゼ試薬類を用いて、γＰ³²（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉ ｎｇｄｏｍ）によって５’標識された。製造業者の指示に従った。 ４）プローブ標識 ６１５フルオレセインプローブは、５’末端においてフルオレセイン−ＯＮホ スホルアミダイト（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５２３５−１）によっ て標識した。製造業者の指示に従った。 ５）スルホ−ＳＤＴＢ分析−アミン含量、定量的 ポリプロピレンデバイス媒体のアミン含量は、特に、Ｓｕｌｆｏ−ＳＤＴＢア ッセイ（Ｐｉｅｒｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；製品番号２８６１０Ｘ）を用いて、 決定した。定量は、酸性水性条件下でデバイス媒体からのＤＭＴカチオンの放出 を測定し、行った。生成したＤＭＴの量は、７０，０００ｃｍ^-1Ｍ^-1の４９８ｎ ｍにおける消滅係数からまたは標準曲線（△ＯＤ＝４９８ｎｍ対Ｓｕｌｆｏ−Ｓ ＴＤＢ標準）から推定した。６Ｎ ＨＣｌをＤＭＴカチオンを溶液中へ放出させ るために使用したことを除いて、製造業者の指示に従った。 Ｄ．その他分析プロトコール １）ニンヒドリン分析−アミン含量、定性的 アミン化ポリプロピレンの定性分析をニンヒドリン分析で実施した；ヘテロ環 化合物であるニンヒドリンはアミン基と錯化し、および錯化時において、黄色か ら深い青への色変化が起こる。約１−３滴の下記溶液をそれぞれ、順次、推定ア ミン化プロプロピレン材料に添加した；Ａ−シアン化カリウム／ピリジン（０． ０１Ｍ ＫＣＮ／９８ｍｌピリジン）；Ｂ−５００ｍｇニンヒドリン／１０ｍｌ ブタノール；Ｃ−８０ｍｇフェノール／２０ｍｌブタノール。この後、材料を１ １０℃で約２分間加熱し、その後、色を定 性的に観察した。 ２）ＤＭＴ分析−アミン含量、定量的 ポリプロピレンのアミン化の定量的決定は、Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｐ．ら、”Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｐ ｈａｓｅ ｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８／ １ ：２３−２６（１９８７）に記載の操作を改変し用いて、達成した。アミン基 は、ジクロロメタン中テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム過塩素酸塩／２，４，６ −コリジンの存在下においてジメトキシトリチル（ＤＭＴ）塩酸と反応させる； 酸処理後、ＤＭＴカチオンが放出され、５０１ｎｍにおいて分光光度計で測定で きる。結果は、アミン化ポリプロピレンのＯＤ単位／ｃｍ²として示すことがで きる。 プロトコールは下記のようであった：アミン化ポリプロピレンをジメトキシト リチル塩酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および２，４，６−コ リジン含有乾燥ジクロロメタン中テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム過塩素酸塩（ Ｆｌｕｋａ、Ｃｉｔｙ，Ｓｔａｔｅ）の等モル量の溶液（０．５Ｍ）中に懸濁し た。反応を、約１５〜３０分の間に完了させた。アミン化ポリプロピレンを除去 し、ジクロロメタンで完全に洗浄した。乾燥アミン化ポリプロピレンは、その後 、ジクロロメタン中２％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸１０ｍｌ中に懸濁した；橙色 の存在はＤＭＴカチオンの存在を示唆しており、これは、分光光度計で定量した （λｍａｘ−５０１ｎ ｍ、ε＝７６，０００）。 Ｅ．機器 １）ラジオ周波数ガスフロープラズマ放電 Ｐｌａｓｍａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｍｏｄｅｌ ０１５ ０Ｅを用いて、アンモニアガス存在下でラジオ周波数ガスフロー放電を生成させ た。 アミン化プロセスは下記の段階から構成されていた；連続的真空吸引操作下に おいて、各アミン化工程の開始およびその間にチェンバー内部において０．１ト ールの基準圧力を設定した。その後、無水アンモニアを４分間導入し、約０．２ ５トールのチェンバー圧力を得た。この後、無水アンモニアガス存在下において ２分間、２００ワットのＲＦ−出力を適用した。ＲＦ−出力の断続後、チェンバ ーをさらに２分間同一圧力でアンモニアガス中に保持した。この後、約０．２５ トールで１０分間、アルゴンガスをチェンバー中に導入した。最後に、チェンバ ーを、約１分間ゆっくりと排気しなから大気条件に戻した。 ２）自動化ＤＮＡシンセサイザー オリゴヌクレオチド合成は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｆ ｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）ＯＬＩＧＯ １０００自動化ＤＮＡシンセサイザーで 、ホルホルアミダイド基準化学プロトコールを用いて行った。アミン化ポリプロ ピレンは、固体支持体のために使用した。種々の長さのホモーおよびヘテロ−オ リゴヌクレオチドは、製造業者の指示に従って合成した。 ３）毛細管ゲル電気泳動 オリゴヌクレオチドの毛細管電気泳動分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕ ｍｅｎｔｓ社、Ｐ／ＡＣＥ^TM２０００高速毛細管電気泳動システムを用いて行っ た。Ａ２７ｃｍ、１００μｍ ｉ．ｄ．カラム（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈ ｎｏｌｌｏｇｉｅｓ社、Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）を利用した；重合ポリアクリル アミドゲルカラムは、１０％Ｔを用いて所内で調製した。試料は、電気動態注入 法（７．５ｋＶ；３．０秒）によってカラム上にのせた；分離は、オリゴヌクレ オチドの長さに応じて、３００Ｖ／ｃｍで１０−３０分間、実施した。トリス− ヒドロキシメチルアミノメタン（”ＴＲＩＳ”）−ほう酸（ｐＨ８．３）は、溶 出緩衝液として利用した。吸光度検出は、主にオリゴヌクレオチドの長さに応じ て０．０１〜１．０ ＯＤ_260nm/ｍｌの範囲であった。 ４）高速液体クロマトグラフィ（”ＨＰＬＣ”） オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析は、ダイオードアレイ検出器モジュール１ ６８およびオートサンプラー５０７（２０μｌインジェクターループ）付属Ｂｅ ｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ^TM ＨＰＬＣ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ １２６で行った 。Ｃ１８８８８ｔｒａｓｈｅｒｅ^TM ＨＰＬＣ カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ、パー ツ番号第２４４２５４号；３μ粒子ＯＤＳ、４．６ｍｍ×７．５ｃｍ）を利用し た。ボトルＡは、０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ＰＨ６．８を含有していた；ボト ルＢは、ＨＰＬＣ等級アセトニ トリルを含有していた。システムは、下記のような勾配モードで操作した（流速 ＝１ｍｌ／ｍｉｎ）；０−３分−１００％ボトルＡ、０％ボトルＢ；３−３３分 −１００％ボトルＡから３０％ボトルＡ／０％ボトルＢから７０％ボトルＢまで 。 ５）Ｂｒｅａｄｂｏａｒｄ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｏｎ Ａｎ ａｌｙｓｉｓ（Ｄ−ＨＡＳ^TM）Ｓｙｓｔｅｍ 経時的にプローブ−標的乖離の進行を分析するため、ブレッドボードＤｙｎａ ｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｄ−ＨＡＳ^TM）Ｓｙｓ ｔｅｍを構築した。ここで使用したＤ−ＨＡＳ^TMアナライザーのために、改良１ ７１放射性元素検出器付属Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｙｓ ｔｅｍ Ｇｏｌｄ^TM ＨＰＬＣ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ １２６を利用した；改良は、フローセルを１／８インチｏ．ｄ． ／１／１６インチｉ．ｄ．の蛍光化エチレンプロピレン共重合体チューブに置換 したことであった。このチューブは、それに対してハイブリッド形成させた問題 の標識配列を有するアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドのその中への 挿入を可能とし、この材料は、次に、２ポリプロピレンスクリーンの間に”サン ドイッチされた”。この並べ方は、改良フローセル中における乖離緩衝液の流動 を可能とした−−−−したがって、アミン化ポリプロピレンオリゴヌクレオチド からの標識配列の乖離が起こるに伴い、放射性カウント数が減少し、従って、標 的からのプローブの乖離を連続的に追跡できた。ボトルＡは、Ｄ−ＨＡＳ^TM勾配 緩衝液を含有し、およびボトルＢは、０．０１％ＳＤＳを含有していた。 Ｄ−ＨＡＳ^TMＳｙｓｔｅｍは、下記のような勾配モードで操作した；０−２分− １００％ボトルＡ（１ｍｌ／ｍｉｎ）；２−２２分−０％−１００％ボトルＢ（ ２ｍｌ／ｍｉｎ）；２２−２４分−１００％ボトルＢ（２ｍｌ／ｍｉｎ）；２４ −２６分−０％−１００％Ａ（２ｍｌ／ｍｉｎ）。 ６）電荷結合素子（”ＣＣＤ”）カメラ 蛍光標識プローブの検出のため、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｎｕ２００ Ｃ ａｍｅｒａ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｒｅｖ．２．０．を連 結したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｍｅｔａｃｈｒｏｍｅ ２ ＣＣＤ Ａｒｒ ａｙカメラ（Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ）を利用した。レーザー源は、アルゴンイオン レーザー、４５７−５１４ｎＭ（ＯｍｎｉＣａｍｅｒａ、Ｃｈｉｎｏ、ＣＡ．） であった。 Ｄ．オリゴヌクレオチド配列 例全体で利用したオリゴヌクレオチドは、下記の配列を有していた（表示を容 易とするため、例では、オリゴヌクレオチドを列挙した識別記号で示すであろう ）。 １．ターゲットＡ（配列番号１） ターゲットＡの３’末端は、アミン化ポリプロピレンに直接合成した（すなわち 、”リンカー”は全く利用しなかった）。 ２．Ｐ２３（配列番号２） Ｐ２３は、ターゲットＡ（配列番号１）に対する標識相補体である。 ３．Ｐ２４（配列番号３） Ｐ２４は、下線部塩基Ｇ（この塩基はＡであるはずである）を除いて、ターゲッ トＡに対する標識”相補”プローブである。 ４．Ｐ３７（配列番号４） Ｐ３７は、ＧＣであるはずの塩基２個の欠失（”．．”）を除いて、ターゲット Ａに対する標識”相補”プローブである。 ５．ターゲットＡ６１（配列番号５） ターゲットＡ６１の３’末端は、アミン化ポリプロピレンに直接合成した。 ６．ターゲットＡ７０（配列番号６） ターゲットＡ７０の３’末端は、アミン化ポリプロピレンに直接合成した。 ７．ＣＦＴＲ Ｅｘｏｎ １０、Ｎｏｒｍａｌ（配列番号７） ８．ＣＦＴＲ Ｅｘｏｎ １０、△Ｆ５０８（配列番号８） ９．ＣＦＴＲ Ｅｘｏｎ １０ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｓｅｎｓｅ（配列番号９） このプライマーは、５’末端においてビオチン化された。 １０．ＣＦＴＲ Ｅｘｏｎ １０ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ （配列番号１０） このプライマーは、５’末端において標識された。 １１．開裂可能ターゲット１７−ｍｅｒ／定量的（配列番号１１） １２．ＳＡＭ１２５（配列番号１４） ３’末端は、アミン化ポリプロピレンフィルムに直接合成された。 １３．６１５蛍光プローブ（配列番号１５） このプローブの５’末端は、フルオロセイン標識で標識された；このプローブの 下線部は、ＳＡＭ１２５に相補性である。 例Ｉ 高分子デバイス媒体のアミン化 ポリプロピレン膜フィルターシートおよびフィルムは、上述のようにしてＲＦ アミン化操作に供した。プラズマアミン化の後、前記シートおよびフィルムの約 １ｃｍ×１ｃｍ端切片をニンヒドリン反応でアミン含量を定量的に分析した：非 アミン化（”バージン”）ポリプロピレンコントロールシートおよびフィルムは 、全く色の変化を示さなかった（すなわち、色が黄色のままであった）；アミン 化ポリプロピレンシートは青色を呈し、ポリプロピレンシート上に存在するアミ ン基を示唆していた。シートおよびフィルムの残りを室温で（暗所に）電線イン パルスヒートシーラーを用いて熱密封したポリエチレンバッグ中に保存した。オ リゴヌクレオチド合成前に、シートおよびフィルムをＳｕｌｆｏ−ＳＤＴＢによ ってアミン含量を定量的に分析した：バージンポリプロピレンは約０〜１ナノモ ル／ｃｍ²を示した；ＲＦ処理に供したポリプロピレン膜は、約５〜３０ナノモ ル／ｃｍ²を含むと決定された。 ポリプロピレン糸を、上述のようにアミン化操作に供したが、２つ例外とした ；実質的に直線的な糸は、ガラス板上に起き、その末端を接着テープでその場所 に保持するか、または、糸をポリプロピレンオーブンメッシュ材料の円筒状中心 の回りにコイル状にし、その後この中心を接着テープを用いてガラス板に（その 末端を介して）結合させた。およそ長さ６−１８ｃｍの糸をアミン化決定のため に使用した。定量分析のため、バージンポリプロピレン糸は、ニンヒドリン試験 プロトコールに供しても青色を呈せず、一方、ＲＦ処理に供したポリプロピレン 糸は、所望の青色を呈した。定量試験（Ｓｕｌｆｏ−ＳＤＴＢによる）は、バー ジンポリプロピレン糸が約０〜２ナノモル／ｃｍ²のアミン表面含量を有してい た；ＲＦ処理 に供したポリプロピレン糸は、約５〜３０ナノモル／ｃｍ²のアミン表面含量を 示した。 ポリプロピレンシート（２１．５ｃｍ×２６．６ｃｍ）のマスキングは、ＲＦ 機器内部のガラス板状に上記シートを配置しこのシートに３０ｃｍ×３０ｃｍポ リプロピレンメッシュフィルタースクリーン（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｍｅｓｈ Ｌｏ ｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ，製品番号１４６４１０、１０００μｍ×１０００μ ｍ表示メッシュオープニング）を重層した。プラズマアミン化は、上述のように 実施した。アミン”パターニング”（すなわち、表示メッシュオープニングに対 応したアミン基の存在）の定性試験は、Ｓｕｌｆｏ−ＳＤＴＢ試薬を用いて実施 し、蒸留水で洗浄し、シートを濃塩酸煙上にかざした。マスクされていない領域 が橙色（アミン基の存在を示唆）を有し一方メッシュ部分（マスク領域）下の領 域は白色（アミン基の不在を示唆）である”チェッカー”パターンが生成した。 同一シートをその後蒸留水、メタノールおよびアセトンで洗浄し、風乾した。そ の後、このポリポロピレンシートに対して、３０ダイン−ｃｍ青色色素湿潤Ｔｅ ｎｓｉｏｎ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ キットＮｏ．５（Ｓｅｌｅｃｔ Ｉｎｄ ｕｓｔｒｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｋｕｓｈａ、ＷＩ）を適用し、この領域 が疎水性であること（すなわち、アミン基がないこと）が示唆され、一方、マス クされていない領域が外観が白色のままであることから、この領域が親水性であ ること（すなわち、アミン基が存在すること）が示唆された。 例ＩＩ アミン化ポリプロピレン上におけるオリゴヌクレオチド存在の決定 例Ｉのアミン化ポリプロピレン上へのオリゴヌクレオチド合成の効率決定は、 前記材料上に合成されそれから開裂されたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣおよび ＣＺＥ分析で予測した。 支持体材料がその表面上において実質的に同一の合成を可能とすることが重要 である−−−すなわち、もし支持体材料が合成の変化を可能とするならば、異な る長さを有するオリゴヌクレオチドがその上に合成できる。 合成原料の品質決定のための効率的手段は、合成された原料のＨＰＬＣおよび ／またＣＺＥ分析による。もし支持体材料が一貫した効率的合成を可能とするな らば、その際には、その上に合成され、除去されかつＨＰＬＣおよび／またはＣ ＧＥ分析に供された材料は単一ピークを生ずると予期される。すなわち、全くま たは実質的にわずかの”夾雑物”が存在しており、これらは、正確な配列長さお よび組成を有していないオリゴヌクレオチドを示唆している。 オリゴヌクレオチド合成前、および合成原料を分析する目的の故に、リンカー 基をアミン化ポリプロピレンに添加した。特に、アミン化ポリプロピレンは、コ ハク酸ヌクレオシドの活性エステルで濃縮した；この後、その他のヌクレオシド を添加した。明らかであるように、コハク酸エステルの部分はアンモニアを用い た”開裂”を受ける。 １７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（配列番号１１）を、手で巻き 上げかつＢｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＯＬＩＧＯ １０００ＤＮ Ａシンセサイザーのニードルチップ反応カラム中に緩く充填したアミン化ポリプ ロピレンシート（．５ｃｍ×１．５ｃｍ）上に直接合成した；アミン化ポリプロ ピレン糸（長さ約２０ｃｍ）を同様に利用した。１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチ ド合成後このオリゴヌクレオチドを支持体から室温で１時間ＮＨ₄ＯＨ（２８％ ）で開裂し、その後、８０℃で１時間、ＮＨ₄ＯＨ（２８％）で脱保護した。放 出されたオリゴヌクレオチドをその後ＨＰＬＣおよびＣＧＥ法で上述のパラメー ターで分析した。ポリプロピレンシート上に合成されたオリゴヌクレオチドにつ いての結果を第１図（ＨＰＬＣ）および第２図（ＣＧＥ）に示した（ポリプロピ レン糸の結果は実質的に同様の結果を示した；これらの結果は、本文で示してい ない）。 第１図及び第２図から明らかなように、単一の明確なピークが示され、特にア ミン化ポリプロピレンにおける合成効率が最適であることを示唆している（第１ 図の小さいピークは、合成ＤＮＡ鎖のベンゾイル保護基の除去によって形成され たベンズアミドに起因する）。 例ＩＩＩ 相補体および変異体の脱ハイブリッド形成の特徴 アミン化ポリプロピレンシ上に合成された標的配列に対するポリヌクレオチド のハイブリッド形成特徴を決定するため、完全な相補体（すなわち、”野生型” に類似する）である配列および完全な相 補体でない配列（すなわち、”変異体”に類似する）を有するオリゴヌクレオチ ドを用いて一連の実験を実施した。記載したように、遺伝分析では、野生型およ び変異配列を識別することが重要である；この目標は、欠失変異の能力が単一塩 基欠失／置換によるとみなされかつ上記変異配列が野生型相補プローブにハイブ リッド形成する頻度によるとみなされると、悪影響を受ける。これらの要因の故 に、標的からの脱ハイブリッド形成は、経時的にＤ−ＨＡＳ^TMシステムを用いて 分析した。 これまでターゲットＡと称されたものを、上述のＤＮＡシンセサイザーを用い てアミン化ポリプロピレン膜上に直接合成した。その後、Ｐ２３（ターゲットＡ に対する完全相補体）；Ｐ２４（単一塩基ミスマッチ）；およびＰ３７（２塩基 欠失）は、下記のようにして別々にターゲットＡに導入した：それに共有結合的 に結合させたターゲットＡを有するアミン化ポリプロピレンをハイブリッド形成 緩衝液中で平衡化させた；その後、前記３個のプローブ（０．５ピコモル／５０ μｌハイブリッド形成緩衝液）のそれぞれをこれらの膜に添加し、２５℃で１時 間インキュベーションした。ハイブリッド形成緩衝液をその後除去し、膜を２０ ０μｌのハイブリッド形成緩衝液で一度洗浄した；その後、膜を開示のようにＤ −ＨＡＳ^TMシステムに添加した。標識プローブの存在低下分析を実施し、その結 果をまとめて第３図に示した。 ターゲットＡに対する”完全”相補体と”不完全”相補体の間において、完全 相補体が不完全相補体よりも同一条件下で長くターゲットＡにハイブリッド形成 したままであることが予測されるであろう。第３図は、この予測の有効性を示し ている。Ｐ２３（相補体） およびＰ２４（単一塩基ミスマッチ）の脱ハイブリッド形成パターンの違いが極 めて明らかであることに注目されたい；Ｐ２３およびＰ３７（塩基２個欠失）の 脱ハイブリッド形成パターンの差異ははるかに大きい。 これらの結果は、特に、野生型標的および変異標的（類）がアミン化ポリプロ ピレンに直接合成可能であることおよびこれらを用いて遺伝スクリーニングが可 能であることを示しており−−−野生型相補体および変異（またはその他）の存 在の識別能力は明らかである。 例ＩＶ 膿胞性線維症 △Ｆ５０８ Ｅｘｏｎ １０の分析 ＣＲＴＲ Ｅｘｏｎ １０、△Ｆ５０８患者試料（配列番号８）およびＣＦＴ Ｒ Ｅｘｏｎ １０、正常患者試料（配列番号７）は、Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ Ｃａ ｓｋｅｙ教授（Ｂａｙｌｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｏｕｓｔｏ ｎ、ＴＸ）によって供与された。これらは、記載のセンスおよびアンチセンスプ ライマーを用いて増幅した；増幅後、実質的に標識アンプリコンのみが分析に利 用されるように、ビオチン化アンプリコンを（アビジン被覆ビーズを用いて）除 去した。 ＣＦＴＲ Ｅｘｏｎ １０に注目し、その配列（配列番号７）の下線部を、本 文では”領域変異”、すなわち、△Ｆ５０８中において、ＡＴＣ ＴＴＴがＡＴ Ｔとして示されるように塩基ＣＴＴが欠失しているとして本文で称する。我々は 、前記領域変異に対する標 的を前記表面活性化有機高分子上に合成し構築するに際し、変異が存在すると可 能なミスマッチ数を最大とするように、前記標的に沿った領域変異に対する相補 体を位置するべきであると決定した。たとえば、もし領域変異がアミン化ポリプ ロピレンの遠位で標的に沿って位置すると、その際に、この例ではＥｘｏｎ １ ０、△Ｆ５０８およびＥｘｏｎ １０、，Ｎｏｒｍａｌの対応するハイブリッド 形成が下記のようになる；（下線部は、領域変異に対する相補体である）： したがって、Ｅｘｏｎ １０、△Ｆ５０８がそれにハイブリッド形成した時の１ ６−ｍｅｒターゲットＡ７０に沿ったＥｘｏｎ １０、△Ｆ５０８に注目すると 、１３個の相補塩基とおよび３個のミスマッチがあるであろう（カッコに示した ）。領域変異に対する相補体を高分子の方に移動すると、ミスマッチの数は増加 する： この移動は、ターゲットＡ６１−Ｅｘｏｎ １０、△Ｆ５０８ハイブリッド形成 の相補塩基の数を１０まで減少させ、およびミスマッチの数を６まで増加させる 。すなわち、ミスマッチが１００％増加する。 意図は、ミスマッチの数を最大とすることにある。これは、当然、領域変異の 長さに依存するであろう。しかし、野生型相補標的と試料変異のミスマッチの好 適な百分率は、少なくとも約２０％、さらに好適には約４０％、および最も好適 には約５０％未満である（もしミスマッチ塩基の数が約５０％を越えると、緊縮 条件が変異の標的への十分なハイブリッド形成を可能としないであろう）。しか し、これらの百分率は、標的上のミスマッチ部分およびミスマッチ種類に相対的 である。たとえば、遠位（ｄｉｓｔａｌ）ミスマッチは、内部（ｉｎｔｅｒｎａ ｌ）ミスマッチほど望ましくないし、および相補ハイブリッド形成に関連するＧ −Ｃ含量は通常Ａ−Ｔ含量よりも”大きい”。 Ｅｘｏｎ １０、△Ｆ５０８およびＥｘｏｎ １０、Ｎｏｒｍａｌアンプリコ ンの分析のため、ターゲットＡ６１を利用した；ターゲットＡ６１は、上述のよ うにしてアミン化ポリプロピレン上に直接合成した。ハイブリッド形成および脱 ハイブリッド形成条件は、例ＩＩＩに記載の通りである。結果を第４図に示した 。 第４図の結果が示唆するように、ＣＦＴＲ Ｅｘｏｎ １０、Ｎｏｒｍａｌお よびＣＦＴＲ Ｅｘｏｎ １０、△Ｆ５０８の野生型相補ターゲットＡ６１との 脱ハイブリッド形成における差異は驚くべきものであった−−−Ｅｘｏｎ １０ 、△Ｆ５０８の脱ハイブリッド形成パターンは、バックグランドノイズのそれと ほとんど同一であった。したがって、遺伝的変異の存在のための試料分析が容易 に達成できる。 例Ｖ ニワトリ−タマゴリゾチーム（”ＨＥＬ”）ペプチドの分析 下記のペプチドは、別々のアミン化ポリプロピレン膜上に直接合成した。これ らのニワトリータマゴリゾチームペプチドは下記の配列を有していた： ＨＥＬ １１−２５（配列番号１２）： ＨＥＬ １０６−１１６（配列番号１３）： Ｌｅｕ（ＨＥＬ １１−２５）およびＬｙｓ（ＨＥＬ １０６−１１６）のカル ボキシル基をアミン化ポリプロピレンに直接結合させた（すなわち、Ｌｅｕおよ びＬｙｓはそれぞれ、開始生体モノマーである）。ペプチド合成は、Ｄ．Ｈｕｄ ｓｏｎ、Ｊ．Ｏｒ．Ｃｈｅｍ．５３：６１７（１９８８）；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ ４−３０（１９８７）に記載された一般的プロ トコールに従って実施した。Ｆｍｏｓ−保護アミノ酸は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎ ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社から入手した。（Ｐｒｏｄ．Ｎｏｓ（製品番号）．Ｆｍｏ ｃ Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）：２６６３６６；Ｆｍｏｃ Ｌｙｓ（ＴＢｏｃ）：２６６ ３８７；Ｆｍｏｃ Ａｓｎ：２６６３５１；Ｆｍｏｃ Ｔｒｐ：２６６４０８； Ｆｍｏｃ Ａｌａ：２６６３４２；Ｆｍｏｃ Ｖａｌ：２６６４１４；Ｆｍｏｃ Ｌｅｕ： ２６６３８４；Ｆｍｏｃ Ｓｅｒ（ＯＴＢｕ）：２６６４０２；Ｆｍｏｃ Ｔｙ ｒ（ＯＴＢｕ）：２６６４１０；Ｆｍｏｃ Ｇｌｙ：２６６３７５；Ｆｍｏｃ Ａｓｐ（ＯＴＢｕ）：２６６３５４；Ｆｍｏｃ Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）：２６６３７ ７；Ｆｍｏｃ Ｍｅｔ：２６６３９０；Ｆｍｏｃ Ａｒｇ（Ｍｔｒ）は、Ｍｉｌ ｌｉｇｅｎから入手した（製品番号９１１０１４）。結合剤（１，３−ジ−イソ プロピルカルボジイミド）は、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（製品番号Ｄ１２， ５４０−７）。結合剤（ハイドロキシベンゾトリアゾール）は、Ａｌｄｒｉｃｈ から入手した（製品番号１５，７２６−０）。Ｆｍｏｓ脱保護基（ピペリジン） は、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（製品番号１０，４０９−４）。側鎖基は、１ ９ｍｌのトリフルオロ酢酸（９５％）（Ａｌｄｒｉｃｈ）製品番号２９，９５３ −７）、０．５ｍｌアニソール（Ａｌｄｒｉｃｈ，製品番号１２，３２２−６） 、および０．５ｍｌのエチルメチルスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号２３ ，８３１−７）を用いて除去し、それらは、混合物に添加し室温に６時間放置し た後、エーテル洗浄した。 これらの特定ペプチド類の存在を証明するため、マウス抗ＨＥＬ−１１−２５ モノクローナル抗体およびマウス抗ＨＥＬ−１０６−１１６モノクローナル抗体 をＥＬＩＳＡフォーマットで用いた。抗体はＣｌｉｆｆｏｒｄ Ｏｌｓｏｎ博士 、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社から供与していただいた。これら の抗体はこれらのペプチドと交差反応しない。３つの条件を分析した：Ａ−その 上に直接合成されたＨＥＬ−１１−２５ペプチドを含むアミン化ポリプロピレン ；Ｂ−その上に直接合成されたＨＥＬ−１０６−１１６ペプチドを含むアミン化 ポリプロピレン；Ｃ−コントロール（アミン化ポリプロピレン膜）。ＥＬＩＳＡ 条件は下記のようであった；膜を９６穴タイタープレートの６個のそれぞれのウ ェルに入れた；２つのウェルは、膜／ＨＥＬ−１１−２５を含んでいた；２つの ウェルは、膜／ＨＥＬ−１０６−１１６を含んでいた；および２つのウェルは膜 を含んでいた。下記の条件を各ウェルについて用いた。１％ＢＳＡ溶液を各ウェ ルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。この後、２５０μｌのリン 酸塩で緩衝された生理食塩水（”ＰＢＳ”）による洗浄を３回行った。抗ＨＥＬ −１１−１６を各セットの１個のウェルに添加し、抗ＨＥＬ−１０６−１１６を 残りのセットの１個のウェルに添加した。その後、アルカリホスファターゼ連結 ヤギ抗マウス抗体（１：５０００希釈）（Ｈｉｇｈ Ｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ、Ｐ ａｒｔ♯ＥＡ１０５５−Ｘ）１００μｌを各ウェルに添加した。この後、室温で ３０分インキュベーションした；その後２５０μｌのＰＢＳによる洗浄を３回行 った。その後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（ニトロブルーテトラゾリウム−Ｓｉｇｍａ Ｎ６８７６；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォ スフェート−Ｓｉｇｍａ，Ｂ６１４９、下記のように調製した：ＮＢＴストック （ジメチルホルムアミド１０ｍｌ中ＮＢＴ０．５ｇ）６６μｌおよびＢＣＩＰス トック（７０％ジメチルホルムアミド１０ｍｌ中ＢＣＩＰ０．５ｇ）３３μｌを アルカリホスファターゼ緩衝液（１００ｍｍ ＮａＣｌ；５ｍｍ ＭｇＣｌ₂； １００ｍｍトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、ｐＨ９．５）溶液１０ｍｌ に添加した）溶液を各ウェルに添加した。発色（青）まで１０分、時間をとった 。その後、ウェルを脱イオン水で洗浄した。洗浄後の青色の存在は、モノクロー ナル抗体に結合したヤギ抗マウスの存在を示唆していた（結果を示さず）。 それぞれの抗体は、特異的にそれらのそれぞれのペプチドに結合した。たとえ ば、青色は、抗ＨＥＬ−１０６−１１６を添加した膜／ＨＥＬ−１１−１６およ びアミン化ポリプロピレンを含むウェルでは全く観察されなかった。アミン化ポ リプロピレン中において色がないことは、いずれかの抗体の非特異的結合が起こ らなかったことを示唆している。抗体の特定ペプチドへの特異的結合は、特に、 ＨＥＬ−１１−２５およびＨＥＬ−１０６−１１６ペプチドが実際に正確にアミ ン化ポリプロピレン上に合成されたことを示唆している。 例ＶＩ ディップスティクハイブリッド形成 それに共有結合で結合したＳＡＭ１２５を有するアミン化１．２ミル二軸配向 ポリプロピレンフィルムを、ハイブリッド形成緩衝液 中に１０分間、浸漬した。その後、９７μｌハイブリッド形成緩衝液中３μｌの ６１５蛍光プローブ（１０ピコモル／１００μｌ）をそれに添加し、その後、９ ０分間インキュベーションした。この後、ハイブリッド形成緩衝液２００μｌで ４回洗浄した。フィルムをその後除去し、ガラススライド上に置き、ＣＣＤカメ ラを用いて分析を行った；結果のレーザープリンター複製を第５図に示した。 第５図の結果は、ＳＡＭ１２５と６１５蛍光プローブとの間に強いハイブリッ ド形成が起きたことを示唆している。このディップスティック様式は、問題の遺 伝的変異が存在するかまたは存在しないかを迅速分析できる；非放射性標識の使 用は、放射性標識の使用によって起こる懸念を回避する。 前記にはかなり詳細にかつ好適な態様の観点から説明してきたが、これらは、 開示または下記の請求の範囲の限定として解釈されるべきではない。当業者の範 囲内の改良および変更は下記の請求の範囲の範囲内にあると意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０８Ｂ 37/00 7433−4Ｃ Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/53 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/545 8310−2Ｊ 33/545 Ａ 33/566 8310−2Ｊ 33/566 // Ａ６１Ｋ 38/00 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/44 39/44 9455−4Ｃ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 マトソン、ロバート エス アメリカ合衆国 92669 カリフォルニア 州 オレンジ キャンドルベリー サーク ル 8324 イー (72)発明者 ランパル、ジャン ビー アメリカ合衆国 92687 カリフォルニア 州 ヨーバ リンダ ビア カナリアス 20470

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．固体支持体上に生体高分子類または生体モノマー類を合成する方法において 、改良が有機高分子の表面に吸着された求核試薬を含む有機高分子の使用を含ん でなり、前記高分子がシートの形態の二軸配向ポリプロピレンである方法。 ２．前記求核試薬がアミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシレートおよび 少なくとも前記の１つを含む置換基からなる群から選択される請求項１記載の方 法。 ３．前記生体高分子または生体モノマーが、核酸類、オリゴヌクレオチド類、ア ミノ酸類、タンパク質類、ペプチド類、ホルモン類、オリゴ糖類、脂質類、糖脂 質類、リポ多糖類、リン脂質類、逆方向ヌクレオチド類、ペプチド核酸類、メタ −ＤＮＡ、アビジン、ビオチン、抗体類、前記の類似体、および前記の少なくと も２つの組み合わせからなる群から選択される請求項１記載の方法。 ４．前記高分子の表面がアミンを含む請求項１記載の方法。 ５．前記高分子の表面がヒドロキシルを含む請求項１記載の方法。 ６．前記高分子の表面がチオールを含む請求項１記載の方法。 ７．前記生体高分子がオリゴヌクレオチド類、ペプチド類およびオリゴ糖類から なる群から選択される請求項１記載の方法。 ８．固体支持体上に生体高分子類または生体モノマー類を合成する方法において 、改良がアミン化ポリプロピレン、ヒドロキシル化ポリプロピレンおよびチオー ル化ポリプロピレンからなる群から選択された固体支持体の使用を含んでなり、 前記固体支持体が二軸配向ポリプロピレンシートである方法。 ９．前記生体高分子がオリゴヌクレオチド類、ペプチド類およびオリゴ糖類から なる群から選択される請求項８記載の方法。 １０．タンパク質またはペプチドの連続的分析方法において、改良が有機高分子 表面に吸着された求核試薬に前記タンパク質またはペプチドを結合させることを 含んでなり、前記高分子が二軸配向ポリプロピレンである方法。 １１．前記求核試薬がアミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシレートおよ び前記の少なくとも１つを含む置換基からなる群から選択される請求項１０記載 の方法。 １２．その表面上に吸着された求核試薬を含んでなる有機高分子であって、所定 の配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが前記求核試薬を介して前 記高分子に共有結合的に付着されており、前記高分子が二軸配向ポリプロピレン である有機高分子。 １３．前記求核試薬が、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボ キシレートおよび前記の少なくとも１つを含む置換基からなる群から選択される 請求項１２記載のデバイス。 １４．前記高分子が、ヒドロキシル化ポリプロピレン、チオール化ポリプロピレ ンおよびアミン化ポリプロピレンからなる群から選択される請求項１２記載のデ バイス。 １５．前記オリゴヌクレオチドの長さがヌクレオチド約２５０個である請求項１ ２記載のデバイス。 １６．前記オリゴヌクレオチドが関心の遺伝子の配列に相補性である請求項１２ 記載のデバイス。 １７．関心の遺伝子を分析する方法であって、 ａ．関心の遺伝子を含む試料を得、 ｂ．前記試料を請求項１２記載のデバイスに導入し、そして ｃ．前記遺伝子が請求項１２記載のデバイスのオリゴヌクレオチドに相補的な方 法でハイブリッド形成しているかどうかを測定する各工程を含んでなる方法。