JPH08508402A

JPH08508402A - 腫瘍拒絶抗原先駆体ｍａｇｅ‐３をコード化する分離された核酸分子とその利用

Info

Publication number: JPH08508402A
Application number: JP6522114A
Authority: JP
Inventors: ゴーグラー，ベアトリーチェ; ファン・デン・エインデ，ベノイト; ブーン‐ファラー，ティエリー; ファン・デア・ブルッゲン，ピエール
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1993-03-26
Filing date: 1994-03-17
Publication date: 1996-09-10
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: NZ263693A; NO953699D0; CN1110556C; KR100288749B1; NO953699L; AU6447594A; US6946289B1; EP0690915A1; FI954536A; JP3594307B2; DE69431834D1; WO1994023031A1; AU685790B2; DE69431834T2; US6552180B1; US6235525B1; ZA941644B; EP0690915B1; US6599699B1; EP0690915A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３をコード化する核酸分子に関する。前記核酸分子を利用したベクター、細胞系、等、及び、オプションとしてヒト白血球抗原ＨＬＡ−Ａ１をコード化する分子も開示される。これらの物質の治療及び診断に於ける利用方法も本発明の一部である。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３をコード化する分離された核酸分子とその利用関連出願本出願は、既に放棄された１９９１年５月２３日出願の一部継続出願第７０５，７０２号の、１９９１年７月９日出願の一部継続出願第７２８，８３８号の、１９９１年９月２３日出願の一部継続出願第７６４，３６４号の、１９９１年１２月１２日出願の一部継続出願第８０７，０４３号である米国を指定国とする１９９２年５月２２日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、概して腫瘍学の研究に適用された免疫遺伝学の分野に関する。より具体的には、本発明は、いわゆる腫瘍拒絶抗原の提示や、後にここで「腫瘍拒絶抗原先駆体」又は、「ＴＲＡＰｓ」と称するものの発現等を通じて、腫瘍が生体組織の免疫システムによって認識されるメカニズムの研究及び分析に関する。最も具体的には、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原、即ち”ＴＲＡ”にプロセッシングされるそのようなＴＲＡＰの一つ、即ち、ＭＡＧＥ−３、をコード化する核酸分子に関する。背景と従来技術宿主細胞による癌細胞の認識又は認識の欠如の研究は、数多くの方向で行われてきた。この分野の理解には、基礎免疫学と腫瘍学との両方についてのいくらか理解していることが前提となる。マウス腫瘍に関する初期の研究によって、これらの腫瘍が同系の動物に移植された時に腫瘍細胞の拒絶に導く分子を示すことが判った。これらの分子は、受容側の動物のＴ細胞によって「認識」され、移植された細胞の溶解を伴う細胞溶解Ｔ細胞応答を誘発する。その最初の証拠は、メチルコラントレン等の化学的発癌物質によって誘発された腫瘍によって得られた。腫瘍によって発現されＴ細胞応答を導出する抗原は、腫瘍によって異なることが判った。化学的発癌物質による腫瘍の誘発と細胞表面抗原の相違に関する一般的教示内容に関してはプレーン（Ｐｒｅｈｎ）他，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．１８：７６９〜７７８（１９５７）；クライン（Ｋｌｅｉｎ）他，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２０：１５６１〜１５７２（１９６０）；グロス（Ｇｒｏｓｓ），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３：３２６〜３３３（１９４３），ベイソンブリオ（Ｂａｓｏｍｂｒｉｏ），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３０：２４５８〜２４６２（１９７０）を参照。この種の抗原は、「腫瘍特異性移植抗原」即ち”ＴＳＴＡｓ”として知られるようになった。化学的発癌物質によって誘発された時におけるそのような抗原の発現が観察された後、腫瘍が生体外で紫外線照射によつて誘発された場合にも類似の結果が得られた。クリプケ（Ｋｒｉｐｋｅ），Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．５３：３３３〜１３３６（１９７４）参照。上述のタイプの腫瘍に関してはＴ細胞を介した免疫応答が観察されたが、一方、自然発生性腫瘍は一般的に非−免疫原性であると教示された。従って、これらは、腫瘍を有する対象体の腫瘍に対する反応を誘発する抗原を提示するものではないと考えられた。ヒューイット（Ｈｅｗｉｔｔ）他，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３３：２４１−２５９（１９７６）参照。ここに参考文献としてその開示内容を添付するブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４〜１１９３（１９８０）に記載されているように、ｔｕｍ^-抗原提示細胞系のファミリは、マウス腫瘍細胞又は細胞系の突然変異によって得られる免疫原性変異体である。詳述すると、ｔｕｍ^-抗原は、同系のマウス中において免疫応答を起こさず腫瘍を形成する腫瘍細胞（即ち、”ｔｕｍ⁺”細胞）を突然変異させることによって得られる。これらのｔｕｍ⁺細胞が突然変異された時、これらは同系マウスによって拒絶され、腫瘍を形成することが出来ない（従って、”ｔｕｍ^-”）。ここにその開示内容を参考文献として添付するブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：２７２（１９７７）参照。これまで多くのタイプの腫瘍がこの現象を示すことが証明されている。例えば、フロスト（Ｆｒｏｓｔ）他，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４３：１２５（１９８３）参照。ｔｕｍ^-変異体は、免疫拒絶システムを導出させるので進行性腫瘍を形成することが出来ないと考えらる。この仮説を支持する証拠として、ファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：５２８２〜５２８５（１９７９）による、通常は腫瘍を形成することがない”ｔｕｍ^-”変異体が、致死下の照射によってその免疫システムを抑制した場合に、マウス内において腫瘍を形成することが出来るという観察、および肥満細胞腫Ｐ８１５の腹膜注入ｔｕｍ^-細胞が１２〜１５日間指数関数的に増殖し、その後、リンパ球とマクロファージの導入によって僅か数日中に除去されるという観察（ウィッテンホーヴ（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１７５〜１１８３（１９８０））等がある。更に別の証拠として、マウスが、後に免疫抑制的な量の照射を受けて細胞が攻撃されても、その後の同じｔｕｍ^-変異体に対する攻撃に耐えることが出来る免疫記憶を得るという観察がある（ブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：２７２〜２７５（１９７７）；前述のファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他，；前述のウィッテンホーヴ（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅ）他）。その後の研究によって、自然発生性腫瘍が突然変異を受けた時に、免疫原性変異体を産生し、これが反応を起こすことが判った。事実、これらの変異体は、元の腫瘍に対する免疫防御反応を導出することが出来た。ファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：１９９２〜２００１（１９８３）参照。従って、同系拒絶反応の標的である腫瘍において、いわゆる「腫瘍拒絶抗原」の提示を導出することが可能であることが示された。異質の遺伝子が自然発生性腫瘍にトランスフェクションされた場合にも類似の結果が得られた。この点に関しては、フィアソン（Ｆｅａｒｓｏｎ）他，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：２９７５〜１９８０（１９８８）を参照。腫瘍細胞の表面に提示され、細胞障害Ｔ細胞に認識され溶解を起こす一つのクラスの抗原が認識された。この類の抗原を、以下、「腫瘍拒絶抗原」即ち”ＴＲＡ（ｓ）”という。ＴＲＡｓには、抗原反応を導出するものもあるし導出しないものもある。これらの抗原は、これまで、生体外での細胞溶解Ｔ細胞特性研究、即ち、特定の細胞溶解Ｔ細胞（以下、ＣＴＬ）サブセットによる抗原の同定の研究、を通じて行われてきた。このサブセットは、提示された腫瘍拒絶抗原の認識後に増殖し、そしてその抗原を発現している細胞が溶解される。特性研究によって、前記抗原を発現する細胞を特異的に溶解するＣＴＬクローンが同定された。この研究の具体例としては、レヴィ（Ｌｅｖｙ）他，Ａｄｖ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２４：１〜５９（１９７７）；ブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４〜１１９３（１９８０）；ブルナー（Ｂｒｕｎｎｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：１６２７〜１６３４（１９８０）；マリャンスキー（Ｍａｒｙａｎｓｋｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：１６２７〜１６３４（１９８０）：マリャンスキー（Ｍａｒｙａｎｓｋｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４０６〜４１２（１９８２）；パラディーノ（Ｐａｌｌａｄｉｎｏ）他，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：５０７４〜５０７９（１９８７）が挙げられる。このタイプの分析は、マイナー組織適合性抗原、雄特異的Ｈ−Ｙ抗原、”ｔｕｍ^-”抗原と称さるここに記載のクラスの抗原等の、ＣＴＬｓによって認識される他のタイプの抗原に必要である。上述の課題の一例である腫瘍は、Ｐ８１５として知られている。ここにその開示内容を参考文献として添付するデプレーン（ＤｅＰｌａｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７４〜２２７８（１９８８）；スジコーラ（Ｓｚｉｋｏｒａ）他，ＥＭＢＯＪ９：１０４１〜１０５０（１９９０）及びシビル（Ｓｉｂｉｌｌｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：３５〜４５（１９９０）参照。このＰ８１５腫瘍は、メチルコラントレンによってＤＢＡ／２マウス内で誘発され、生体外腫瘍と細胞系の両方として培養される肥満細胞腫である。Ｐ８１５系は、突然変異後において、Ｐ９１Ａ（前記デプレーン（ＤｅＰｌａｅｎ））、３５Ｂ（前記スジコーラ（Ｓｚｉｋｏｒａ））及びＰ１９８（前記シビル（Ｓｉｂｉｌｌｅ））と呼ばれる変異体等、これまで数多くのｔｕｍ^-変異体を産生してきた。腫瘍拒絶抗原とは異なり、そしてこれが重要な相違点であるが、ｔｕｍ^-抗原は、腫瘍細胞が突然変異した後でしか存在しない。腫瘍拒絶抗原は、突然変異が無くても、特定の腫瘍の細胞上に存在する。従って、上記参考文献によれば、ある細胞系が、”Ｐ１”と呼ばれる系等のｔｕｍ^-であり、これを刺激してｔｕｍ^-変異体を産生することが出来る。ｔｕｍ^-表現体はその親細胞系の表現体と異なっているので、ｔｕｍ^-細胞系とそのｔｕｍ⁺の親の系のＤＮＡの相違が予想でき、そしてその相違はｔｕｍ^-細胞中に於ける目的の遺伝子の位置を特定することに利用できる。その結果、Ｐ９１Ａ，３５Ｂ及びＰ１９８等のｔｕｍ^-変異体の遺伝子が、遺伝子の遺伝コード化領域に於ける点突然変異によってその正常な対立遺伝子と異なっていることが発見された。前述のスジコーラ（Ｓｚｉｋｏｒａ）及びシビル（Ｓｉｂｉｌｌｅ）及びラークウィン（Ｌｕｒｑｕｉｎ）他，Ｃｅｌｌ５８：２９３〜３０３（１９８９）参照。しかし、これは本発明のＴＲＡｓには当てはまらないことが判った。これらの参考文献は、更に、前記ｔｕｍ^-抗原から誘導されたペプチドが、ＣＴＬｓによって認識されるＬ^d分子によって提示されるものであることを示した。Ｐ９１Ａは、Ｌ^dによって提示され、Ｐ３５はＤ^d によって、そしてＰ１９８はＫ^dによって、それぞれ提示される。ここに参考文献として全部添付される先行特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４，米国特許出願第８０７，０４３；７６４，３６４；７２８，８３８；及び７０７，７０２は、腫瘍拒絶抗原又は”ＴＲＡｓ”にプロセッシングされる様々なＴＲＡＰｓをコード化する遺伝子及び他の核酸分子に関係する発明が記載されている。前記遺伝子は、分離、精製された腫瘍拒絶抗原のソース又はＴＲＡ自身として有用であり、後述するように、これらはいずれも、前記抗原がその「マーカー」となる癌を治療する薬剤として、あるいは、腫瘍学に於ける様々な診断及び調査方法に利用できる。例えば、ｔｕｍ^-細胞を使用して、様々なｔｕｍ⁺抗原やｔｕｍ^-細胞を提示する細胞を溶解するＣＴＬｓを発生させることができることが知られている。例えば、ここに参考文献として添付する、マリャンスキー（Ｍａｒｙａｎｓｋｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏl １２：４０１（１９８２）；及びファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，ＭｏｄｅｒｎＴｒｅｎｄｓｉｎＬｕｅｋｅｍｉａＩＸ（１９９０年６月）を参照。前記腫瘍拒絶抗原先駆体を、前記遺伝子によってトランスフェクションされた細胞中で発現させ、目的の腫瘍に対する免疫応答を発生させることができる。ヒト新生生物（腫瘍）のパラレルな例において、自己由来混合リンパ球−腫瘍細胞培養（以下”ＭＬＴＣ”）が、しばしば、自己由来腫瘍細胞を溶解し、かつ、天然キラー標的、自己由来ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞や自己由来線維芽細胞は溶解しない応答（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）リンパ球を生産することが観察されている（アニキーニ（Ａｎｉｃｈｉｎｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ８：３８５〜３８９（１９８７）参照）。この応答は、メラノーマに関して特によく研究されており、ＭＬＴＣは、末梢血液細胞又は腫瘍浸潤リンパ球のいずれかによって行われてきた。この分野に関する文献としては、クナス（Ｋｎｕｔｈ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２８０４〜２８０２（１９８４）；ムカールジ（Ｍｕｋｈｅｒｊｉ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２４０（１９８３）；ヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．３９：３９０〜３９６（１９８７）；トパリアン（Ｔｏｐａｌｉａｎ）他，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ６：８３９〜８５３（１９８８）等がある。安定な細胞障害Ｔ細胞クローン（以後、ＣＴＬｓ）がＭＬＴＣ応答細胞から誘導され、これらのクローンは、腫瘍細胞に対する特異性を有する。前記ムカールジ（Ｍｕｋｈｅｒｊｉ）他、前記ヘリン（Ｈｅｒｉｎ），前記クナス（Ｋｎｕｔｈ）他，参照。腫瘍細胞上においてこれらの自己由来ＣＴＬｓによって認識される抗原は、人為構造を表すものではないと考えられる。というのは、これらは新生の腫瘍細胞に観察されるからである。前記トパリアン（Ｔｏｐａｌｉａｎ）他，デジョヴアンニ（Ｄｅｇｉｏｖａｎｎｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１８６５〜１８６８（１９９０）。これらの観察と、本出願において特定のハツカネズミ腫瘍拒絶抗原先駆体の遺伝子の分離に使用された技術との組合せによって、ヒトの腫瘍において提示されたＴＲＡｓの腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸配列が分離された。従って、いま、以下に記載のその派生効果ともに、特定の腫瘍に最も特徴的なものを非限定的に含む、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する前記核酸配列の分離が可能となった。更に、ヒト白血球抗原即ち”ＨＬＡｓ”として知られている分子のクラスによるＴＲＡｓの提示に関して集中的に研究が行われた。この研究によって、該分野に関していくつかの意外な発見が成された。特に、ここにその開示を参考文献として添付の米国特許出願第９３８，３３４号において、前記ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドが教示されている。この参考文献は、特定のＨＬＡ分子にたいして特定のペプチドが特異性を有することが既知であれば、ある特定のペプチドが一つのＨＬＡ分子に結合し、他とは結合しないということが予測される、ということを教示している。これは重要である。というのは、ひとそれぞれによって保有するＨＬＡ表現型は異なるからである。その結果、ある特定のペプチドがある特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであることが同定されることによってそれから診断的及び治療的な派生効果が得られるとしても、これらはその特定のＨＬＡ表現型を有する個人だけににしか関係しない。細胞異常は一つの特定ＨＬＡ表現型に限られないのでこの分野において更に研究する必要があり、標的治療には、対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が必要である。ここに参考文献として添付する１９９３年１月２２日出願の米国特許出願第００８，４４６号には、前記ＭＡＧＥ−１発現産生物が第２ＴＲＡにプロセッシングされるという事実が開示されている。この第２ＴＲＡは、ＨＬＡ−Ｃ１０−分子によって提示されるものである。この開示には、あるＴＲＡＰが複数のＴＲＡｓを産生することができることが示されている。ここに参考文献として添付する１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第９９４，９２８号には、チロシナーゼが腫瘍拒絶抗原先駆体として記載されている。この参考文献は、いくつかの正常細胞（例えば、メラニン細胞）によって生産される分子が腫瘍細胞中でプロセッシングされてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原を産生する、と記載されている。前述したように、ひとそれぞれによってＨＬＡのタイプは異なる。又、特定のＭＡＧＥ遺伝子の発現が、必ずしも、特定の障害、あるいは特定のＨＬＡタイプの個体に関連するものではないことも判っている。従って、例えば、すべてのメラノーマ患者がＭＡＧＥ−１ＴＲＡＰを発現すると言うことは出来ないし、又、ＭＡＧＥ−１発現がＨＬＡ−Ａ１タイプのメラノーマ患者に限られている、と断言することもできない。更に、一つのタイプのＴＲＡＰのみが、ある特定のＨＬＡタイプの個体において発現するということも出来ない。どれがこれらのどの因子に相関しているかに関する規則やガイドラインを指摘することはできない。従って、第２ＴＲＡＰが、ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるＴＲＡＰにプロセッシングされるとは期待されない。いま、ＭＡＧＥ−１の他に、ＭＡＧＥ− ３ＴＲＡＰから誘導されるＴＲＡがＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されることが判った。これは、この発見の派生効果の記載とともに、後述の例３７〜４０に示されている。本発明のこれら、及びその他の態様を、以下の記載において詳述する。図面の簡単な説明図１は、抗原Ｐ８１５Ａを発現するトランスフェクション体（transfectant）の検出を示す。図２は、クロム放出アッセイによって測定された、種々のＣＴＬによる溶解に対するクローンＰ１．ＨＴＲ，ＰＯ．ＨＴＲ，ゲノムトランスフェクタントＰ１Ａ．Ｔ２及びコスミドトランスフェクタントＰ１Ａ．ＴＣ３．１の感度を示す。図３は、コスミドＣ１Ａ．３．１の制限地図である。図４は、遺伝子Ｐ１Ａの発現のノザン・ブロッティング分析を示す。図５は、遺伝子Ｐ１Ａの構造をその制限サイトとともに示す。図６は、Ｐ８１５又は正常細胞のいずれかから分離された細胞をＰ１Ａからの遺伝子でトランスフェクションし、その後、ＣＴＬ溶解によってテストした結果を示す。図７は、肥満細胞系Ｌ１３８を使用した溶解研究を示す。図８は、抗原も発現する２．４ｋｂの抗原Ｅフラグメント配列のサブフラグメントの地図である。図９は、遺伝子ｍａｇｅ１，２及び３からのエクソン３部分のホモロジーを示す。図１０は、種々の組織上のＭＡＧＥ遺伝子のノザン・ブロッティングの結果を示す。図１１は、図１３のデータを表にして表す。図１２は、本出願において使用された種々のヒトメラノーマ細胞系を使用したサザン・ブロッティング実験を示す。図１３は、腫瘍及び正常組織によるＭＡＧＥ１，２及び３の発現の一般化した略図。図１４は、種々の細胞系上でＣＴＬクローン２０／３８を使用したクロム放出アッセイの結果を示す。図１５は、ＣＴＬクローン２０／３８の抗原特異性を調べるために行ったアッセイの結果を示す。図１６は、様々なトランスフェクションされた細胞にＴＮＦ放出アッセイを行った時に得られた結果を示す。配列の簡単な説明配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１は、遺伝子Ｐ１Ａの一部のｃＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２は、遺伝子Ｐ１ＡのｃＤＮＡのコード化領域を表す。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３は、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３の前記コード化領域であるＰ１ＡｃＤＮＡの非コード化ＤＮＡを示す。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４は、Ｐ１ＡのｃＤＮＡの全配列である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５は、Ｐ１ＡのゲノムＤＮＡ配列である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：６は、Ｐ１ＡＴＲＡの抗原性ペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、Ａ⁺とＢ⁺、即ち、Ａ抗原とＢ抗原の両方を発現する細胞に対するものである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：７は、抗原Ｅをコード化する核酸配列である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８は、ＭＡＧＥ−１をコード化する核酸配列である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：９は、ＭＡＧＥ−２の遺伝子である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０は、ＭＡＧＥ−２１の遺伝子である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１１は、ＭＡＧＥ−３のｃＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１２は、ＭＡＧＥ−３１の遺伝子である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１３は、ＭＡＧＥ−４の遺伝子である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１４は、ＭＡＧＥ−４１の遺伝子である。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１５は、ＭＡＧＥ−４のｃＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１６は、ＭＡＧＥ−５のｃＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１７は、ＭＡＧＥ−５１のゲノムＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１８は、ＭＡＧＥ−６のｃＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１９は、ＭＡＧＥ−７のゲノムＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２０は、ＭＡＧＥ−８のゲノムＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２１は、ＭＡＧＥ−９のゲノムＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２２は、ＭＡＧＥ−１０のゲノムＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２３は、ＭＡＧＥ−１１のゲノムＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２４は、ｓｍａｇｅ−ＩのゲノムＤＮＡである。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２５は、ｓｍａｇｅ−ＩＩのゲノムＤＮＡである。好適実施例の詳細説明本出願の最後に添付した配列から理解されるように、多種の”ＭＡＧＥ”遺伝子が同定された。これらの遺伝子及びｃＤＮＡ配列の分離には以下の例に記載のプロトコルを使用した。ここで”ＭＡＧＥ”とは、ヒト細胞から分離された核酸配列をいう。頭文字” ｓｍａｇｅ”は、マウス由来の配列を記載するのに使用される。 ”ＴＲＡＰ”又は”ＴＲＡｓ”がある腫瘍タイプに特異性を有するものと記載される時、これは、そこで考慮されている分子が、そのタイプの腫瘍に関連していることを意味するが、必ずしも他のタイプの腫瘍を除外するものではない。例１抗原Ｐ８１５Ａをコード化する前記遺伝子を同定し分離するために、遺伝子トランスフェクションを使用した。この方法は、該遺伝子のソースと、受容細胞系との両方を必要とする。トランスフェクション可能性の高い細胞系Ｐ１．ＨＴＲが受容体の開始物質であったが、これは４つの認識されるＰ８１５腫瘍抗原の一つである「抗原Ａ」を提示することから、使用するには更に処理が必要であった。ファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ１１：４６７〜４７５（１９８５）参照。従って、前記抗原を発現せず、しかも、所望量のＰ１．ＨＴＲを有する細胞系を分離するためにスクリーニング実験を行った。これを行うために、Ｐ１．ＨＴＲを、腫瘍抗原Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤのそれぞれに対する特異性を有するＣＴＬｓによってスクリーニングした。このようなＣＴＬｓは、ウィッテンホーヴ（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：１０４０〜１０５２（１９８３）に記載されている。前記選択を行うために、Ｐ１．ＨＴＲの１０⁶個の細胞を、前記ＣＴＬクローンの２〜４×１０⁶個の細胞と、２ｍｌの培地中で丸底試験管内で混合し、１５０ｘｇで３分間遠心分離した。３７℃で４時間後、マリャンスキー（Ｍａｒｙａｎｓｋｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４０６〜４１２（１９８２）に従い、前記細胞を洗浄し、１０ｍｌの培地中で再懸濁させた。ＣＴＬアッセイとスクリーニングプロトコル一般に関する更なる情報は、ここにその開示内容を参考文献として添付する、ブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４〜１１９３（１９８０）、及びマリャンスキー（Ｍａｒｙａｎｓｋ１）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４０６〜４１２（１９８２）に見られる。これらの選択を行った時、抗原Ａと抗原Ｂのいずれも発現しない細胞系変異体が発見された。さらに、抗原Ｃに対して特異的なＣＴＬｓにより選択を行うと、抗原Ｃの欠如した変異体が得られた。これらのスクリーニングの結果の要約については図２を参照されたい。前記変異体ＰＯ．ＨＴＲは抗原Ａ，Ｂ及びＣに対して陰性であり、従って、前記トランスフェクション実験用に選ばれた。前記細胞系ＰＯ．ＨＴＲは、ブタペスト条約に従ってフランス国７５７２４パリリュ・ド・ドクトエール・ル２８のインスティテュート・パスツール・コレクション・ナショナル・デ・キュルテュール（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＰａｓｔｅｕｒＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅＤｅＣｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託され、受託番号Ｉ−１１１７を有している。この方法は、前記四種類の認識されるＰ８１５腫瘍抗原、即ち、抗原Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤの内の少なくとも一つを正常に提示する細胞タイプの変異体である他の細胞系を得るのに利用できる。但し、前記変異体は前記抗原Ａ，Ｂ及びＣのいずれも提示しない。Ｐ１．ＨＴＲは、肥満細胞系であって、したがって、前記プロトコルがＰ８１５抗原Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤのいずれをも発現しないが、きわめてトランスフェクション可能性の高い生物学的に純粋な肥満細胞系の分離を可能にすることが理解されるであろう。他の腫瘍タイプも、この方法でスクリーニングして、所望の生物学的に純粋な細胞系を得るのに使用可能である。その結果得られる細胞系は、Ｐ１．ＨＴＲと同じ程度に、異種ＤＮＡに対するトランスフェクション性があり、特定の抗原を発現しないために選択されるであろう。例２ここに参考文献としてその開示内容を添付するデプレーン（ＤｅＰｌａｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７４〜２２７８（１９８８）の過去の研究によって、ｔｕｍ^-抗原をコード化する遺伝子の回収にコスミドライブラリのトランスフェクションの使用が有効であることが示された。Ｗｏｅｌｆｅｌ（ヴォルフェル）他，Ｉｍｍｕｎｏ−ｇｅｎｅｔｉｃｓ２６：１７８〜１８７（１９８７）に従い、Ｐ１．ＨＴＲの選択的プラスミド及びゲノムＤＮＡを調製した。トランスフェクションは、コルサロ（Ｃｏｒｓａｒｏ）他，ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ７：６０３〜６１６（１９８１）に従い、これをいくらか変更して行った。簡単に述べると、バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ）他，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：２３７〜２４３（１９８５）に記載されているように、６０μｇの細胞ＤＮＡと３μｇのプラスミドｐＨＭＲ２７２のＤＮＡとを混合した。このプラスミドは、受容細胞に、ヒグロマイシン（hygromycin）抵抗性を与え、従って、トランスフェクション体をスクリーニングするための便利な方法を提供するものである。前記混合ＤＮＡを、９４０μｌの１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭＥＤＴＡ及び３１０μ ｌの１ＭＣａＣｌ₂と混合した。前記溶液を、常時撹はんしながら、ＮａＯＨによってｐＨ７．１に調整した１．２５ｍｌの５０ｍＭＨｅｐｅｓ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄にゆっくりと添加した。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱を室温で３０〜４５分間で形成させた。この後、それぞれがＰＯ．ＨＴＲ細胞（５×１０⁶）から成る１５のグループを４００ｇで１０分間遠心分離にかけた。上清を除去し、ペレットを、前記ＤＮＡ沈澱を含む培地中に直接的に再懸濁した。この混合物を３７℃で２０分間培養し、その後、これを１０％の胎児ウシ血清を補った２２．５ｍｌＤＭＥＭを含む８０ｃｍ³の組織培養フラスコに添加した。２４時間後、培地を取り替えた。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集して計数した。トランスフェクションされた細胞は、ヒグロマイシンＢ（３５０ｕｇ／ｍｌ）を添加した培地を使用して大量培養して選択した。この処理によってヒグロマイシン抵抗性の細胞が選択された。各グループに対して、それぞれが４０ｍｌの培地中に８×１０⁶の細胞を有する二つのフラスコを準備した。トランスフェクタントの数を推定するために、各グループからの１×１０⁶の細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、０．４％のバクトアガー（bactoagar）、及び３００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを有する５ｍｌのＤＭＥＭ中で培養した。次に１２日間後にコロニーを計数した。二つの別々の測定を行い、その平均をとった。この平均値を５倍し、対応グループ中のトランスフェクタントの数を推定した。これまで約０．３であるとされてきたＰ８１５のクローン化効率を修正する必要があった。例３前記例２に記載したトランスフェクションの８日間後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅによる密度遠心分離を使用して、死亡細胞から抗生物質耐性トランスフェクタントを分離した。これらの細胞を非選択的培地中にて１ないし２日間保持した。これらの細胞を、２００μｌの培地中で３０細胞／マイクロウェルの割合にて９６のウェルミクロプレート（丸底）中に塗布した。調製したトランスフェクタントの数に依り、１００〜４００の範囲のマイクロウェルを準備した。寒天コロニーテストによって５００〜３０００の数が推定された。５日間後、前記ウェルは約６×１０⁴の細胞を含んでおり、前記ウェルの１／１０をミクロプレートに移し、次に３０℃で培養することによって、複製プレートを調製した。１日後、マスタプレートを遠心分離にかけ、培地を除去し、各ウェルに、Ｐ−８１５抗原Ａ（ＣＴＬ−Ｐ１：５）に対する７５０ＣＴＬｓを、４０Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２を含むＣＴＬ培地中の１０⁶個の照射済み同系フィーダー脾臓細胞と、刺激細胞を殺すためのＨＡＴ培地とともに添加した。６日間後、プレートを視覚によって調べて、ＣＴＬｓが増殖したウェルを同定した。プレートが増殖するミクロ培養を示した所で、１００μｌの前記ウェルのアリコットを⁵¹Ｃｒ標識化Ｐ１．ＨＴＲ標的細胞（１ウェル当り２×１０³〜４ｘ１０³）を含む別のプレートに移し、４時間後にクロム放出を測定した。高ＣＴＬ活性を示したミクロ培養に対応する複製ミクロ培養を拡張し、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中での限界希釈によってクローン化した。５日間後、約２００のクローンを収集し、前述したようにして、視覚的溶解アッセイで前記ＣＴＬ．Ｐ１：５細胞系によってスクリーニングした。これらの結果については図１Ａ参照。これらの実験において、１５のグループのトランスフェクション体の内、３つが少数の陽性ミクロ培養を産生した。前述した方法により、これらのミクロ培養のＰ１．ＨＴＲに対する細胞溶解活性をテストした。増殖が観察されたミクロ培養の大半が細胞溶解活性を示した。この活性は、図１Ｂに示されるように、背景を十分に越えるものであった。この図は、二つの細胞グループ（グループ”５”及び”１４”）、４００及び３００ミクロウェルが、３０のヒグロマイシン抵抗性トランスフェクション細胞によって接種されたデータの要旨を示している。その後、抗−ＡＣＴＬＰ１：５の添加によってこれらのミクロ培養の増幅と複製化とを行った。６日間後、Ｐ．ＨＴＲに対する細胞溶解活性をテストした。図において、各点は、一つのミクロ培養の細胞溶解活性を表している。複数の陽性ウェルに対応する複製ミクロ培養をサブクローン化したところ、このらのサブクローンの１％以上が、抗−ＡＣＴＬによって溶解されていることが判った。従って、３３，０００のヒグロマイシン抵抗性トランスフェクション体から、三つの独立したＰ８１５ａ発現トランスフェクション体が得られた。以後Ｐ１Ａ．Ｔ２と称するこれららの系の一つを更にテストした。Ｐ１Ａ．Ｔ２の関連抗原プロフィールが図２に示されている。これは、前述したタイプの抗−ＣＴＬアッセイによって得られたものである。例４Ｐ１Ａ．Ｔ２について行ったＣＴＬアッセイは、それが抗原Ａ（”Ｐ８１５Ａ ”）を提示するものであること、従って、Ｐ１．ＨＴＲからこの遺伝子を受けたことを示した。この目的のために、この細胞系を、以下の実験において、前記抗原先駆体の遺伝子ソースとして使用した。これまでの研究によって、ｔｕｍ^-抗原をコード化する遺伝子は、コスミドライブラリによって得られたトランスフェクション体から直接的に回収出来ることが判っている。デプレーン（ＤｅＰｌａｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７４〜２２７８（１９８８）参照。この手法に従って、Ｐ８１５遺伝子の回収を行った。グロスヴェルド（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）他，Ｇｅｎｅ１０：６７１５〜６７３２（１９８２）に従い、Ｐ１Ａ．Ｔ２の全ゲノムＤＮＡを部分的に制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ１で消化し、塩化ナトリウム密度勾配超遠心にかけて、３５〜５０ｋｂのＤＮＡ断片について濃縮した。ここにその開示内容を参考文献として添付するベイツ（Ｂａｔｅｓ）他，Ｇｅｎｅ２６：１３７〜１４６（１９８３）に記載されているように、これらの断片を、Ｃ２ＲＢのコスミドアームに結合した。これらのコスミドアームは、ＳｍａＩによる切断、子ウシ腸ホスファターゼによる処理、その後のＢａｍＨＩでの消化によって得たものであった。結合ＤＮＡをラムダファージ成分にパッケージ化し、前記グロスヴェルド（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）他，に従って、Ｅ．ｃｏｌｉＥＤ８７６７上で滴定した。１マイクログラムのＤＮＡ挿入体当り、約９×１０⁵のアンピシリン抵抗性コロニーが得られた。３０，０００の独立したコスミドを１０ｍＭのＭｇＣｌ₂中で、２ｍｌのＥＤ８７６７と混合し、３７℃で２０分間培養し、２０ｍｌのＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（”ＬＢ”）培地で希釈し、その後、１時間培養することによって、前記コスミドグループを増幅した。この懸濁質は滴定され、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で１リットルのＬＢ培地の接種に使用された。２×１０⁸細胞／ｍｌのバクテリア濃度（ＯＤ６₀₀＝０．８）にて、１０ｍｌのアリコットを凍結し、培養に２００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加して一晩培養した。全コスミドＤＮＡをアルカリ溶解法によって分離し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。これらの実験において、６５０，０００コスミドのライブラリが調製された。前記増幅プロトコルにおいて、約３０，０００のコスミドの２１のグループが使用された。例５前述の２１のグループのコスミド（６０μｇ）と前述の４μｇのｐＨＭＲ２７２とを使用して、５×１０⁶ＰＯ．ＨＴＲ細胞をトランスフェクション体宿主として使用した。トランスフェクションは、前の例において記載したのと同様の方法で行った。前述のＣＴＬアッセイを再び使用して、各グループ当り平均３０００のトランスフェクション体の抗原提示をテストした。一つのコスミドグループは、耐薬剤トランスフェクション体の約１／５，０００の頻度で繰り返し陽性トランスフェクション体を産出した。Ｐ１Ａ．Ｔ２についてと同様、これらのトランスフェクション体も、抗原ＡとＢとの両方の発現を示した。トランスフェクション体Ｐ１Ａ．ＴＣ３．１の発現のパターンを図２に示す。例６前述の例５に示したようにして、Ｐ８１５Ａ抗原を提示する三つの独立したコスミドトランスフェクション細胞を分離した。デプレーン（ＤｅＰｌａｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７４〜２２７８（１９８８）に従って、これらのトランスフェクション体のＤＮＡを分離し、ラムダファージ抽出物と直接にパッケージ化した。その結果得られた生成物を、例５と同様にして、アンピシリン選択によりＥ．ｃｏｌｉＥＤ８７６７上で滴定した。同様に、例５に従い、再びＰＯ．ＨＴＲを使用してコスミドの増幅とトランスフェクションとを行った。下記の表１に示すように、高頻度でトランスフェクションが観察された。前記コスミドを制限酵素で分析したところ、直接パッケージ化トランスフェクション体Ｐ１Ａ．ＴＣ３．１が３２のコスミドを有し、これらの内の７つが異なっていることが判った。これらの７つのコスミドのそれぞれを、前述した方法で、ここでも再び上述のプロトコルに従って、ＰＯ．ＨＴＲにトランスフェクションし、これらのトランスフェクション体のＰ８１５Ａ提示を調べた。これらのコスミドトランスフェクション体の内の４つが、Ｐ８１５Ａ提示を示し、更に、前述したすべての実験と同様に、Ｐ８１５Ｂも発現された。前記ニつの抗原の提示を示す前述の４つのコスミドの内、コスミドＣ１Ａ．３．１は、僅かに１６．７キロ塩基長であり、これを選択して下記のように更に分析した。前記コスミドＣ１Ａ．３．１を制限エンドヌクレアーゼ分析し、図３に示す地図を得た。上述のプロトコルを再び使用して、すべてのＥｃｏＲＩ断片をトランスフェクションしたところ、７．４キロ塩基長の断片のみが抗ＡＣＴＬｓが溶解できるトランスフェクション体を産生した。ＰｓｔＩ断片にも類似の実験を行ったが、７．４ｋｂＥｃｏＲＩ断片中に完全に含まれている４．１ｋｂ断片のみが、溶解可能なトランスフェクション体を産生した。この断片（即ち、前記４．１ｋｂＰｓｔＩ断片）を、ＳｍａＩで消化し、トランスフェクションすると、抗原Ａ及びＢを提示する宿主細胞を産生する２．３ｋｂの断片を得た。最後に、ＳｍａＩ／ＸｂａＩで得た９００塩基長の断片も、これら二つの抗原の先駆体の発現を転移した。即ち、このトランスフェクションされた宿主細胞は、抗原ＡとＢの両方を提示した。例７上述の９００塩基長の断片を、親細胞系中でのＰ８１５Ａ遺伝子の発現を検出するプローブとして使用した。これを達成するために、デーヴィス（Ｄａｖｉｓ）他，ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＥｌｅｓｅｖｉｅｗＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．ＮｅｗＹｏｒｋ）（１９８６）のグアニジン−イソチオシアネート法を使用して、先ず、全細胞ＲＮＡを分離した。オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィーを使用してポリＡ⁺ｍＲＮＡを分離精製する方法もこの同じ参考文献に依った。次に、サンプルをノザン・ブロッティング分析した。ＲＮＡサンプルを、０．６６Ｍのホルムアルデヒドを有する１％のアガロースゲル上でフラクション化した。これらのゲルを、ニトロセルロース膜上での一晩のブロッティングの前に、１０ｘＳＳＣ（ＳＳＣ：０．１５ＭＮａＣｌ：０．０１５Ｍクエン酸塩ナトリウム、ｐＨ７．０）で３０分間処理した。これらを、８０℃で２時間ベーキングし、その後、前記膜を、１０％の硫酸デキストラン、１％のＳＤＳ及び１ＭのＮａＣｌを含む溶液中において６０℃で１５分間、プレハイブリッド化した。次に、１００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡと共に、変性プローブ（前記９００塩基長断片）を使用してハイブリッド化を行った。Ｐ１．ＨＴＲｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを使用して、このプロトコルを実行した場合は、図４、レーン１（ＲＮＡの６μｇ）に示すように、１つの１．２ｋｂのバンドと２つのややぼんやりしたバンドが同定された。同じプローブを使用して、前記細胞系由来のｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリのスクリーニングを行った。これによって、１ｋｂの挿入部を有し、５’末端が欠失していることを示唆するクローンが得られた。このｃＤＮＡのノザン・ブロットは図示されていない。それぞれのケースに於いてハイブリッド化実験を、６０℃で一晩行った。これらのブロットを、室温にて２ｘＳＳＣによって二度洗浄し、更に、６０℃にて１％のＳＤＳを添加した２ｘＳＳＣによって二度洗浄した。以上の実験により、周知のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ鎖終止法を使用した配列決定を可能にするのに十分に、Ｐ８１５Ａ抗原先駆体を発現するＤＮＡが図形化された。これは、様々な制限エンドヌクレアーゼを使用し、合成オリゴフヌクレオチドプライマによる特異的開始によって発生したクローン上で行われた。該遺伝子のエクソンに関する結果は、認識配列番号（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩＤＮＯ）：４に示されている。例８上述のノザン分析によって、前記ｃＤＮＡの５’末端が欠失していることが示唆された。この配列を得るために、位置３２０〜３０３に対応するプライマを使用してＰ１．ＨＴＲＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。次に、位置２８６〜２６６に対応する３’プライマと、フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８〜９００２（１９８８）に記載の５’プライマとを使用したポリメラーゼ連鎖反応により、該配列を増幅した。予想された大きさ（２７０塩基）のバンドが見つかり、これをサザン・ブロットにおいて、前述の９００ｂｐＳｍａＩ／ＸｂａＩ断片にハイブリッド化した。ｍ１３ｔｇ１３０λ ｔｇ１３１へのクローン化後、小さな２７０ｂｐの断片が配列決定された。この配列は配列認識番号（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩＤＮＯ）：１に図示されている。例９例７及び８に記載され配列認識番号（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ）：４に図示された前記配列を得た後、コスミドＣＩＡ．３．１の５．７ｋｂ領域を配列決定した。この断片は、トランスフェクション体中にＰ８１５Ａを発現する前記９００塩基長の断片を含んでいることが知られていた。前記コスミドはゲノム由来であるため、この実験によりイントロンとエクソンとの図形化が可能になった。前記遺伝子の図形化された構造が図５に示されている。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４と共に、これらのデータは、前記抗原先駆体に対する遺伝子、以後”Ｐ１Ａ”という、は約５キロ塩基長であり、３つのエクソンを有していることを示している。２２４のアミノ酸のタンパク質に対するＯＲＦは、エクソン１にて開始し、エクソン２で終止している。抗原Ａ及びＢの先駆体の発現を転写する前記９００塩基対断片は、エクソン１のみを有している。前記プロモータ領域は、配列認識番号（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ）：１に示されているように、ＣＡＡＴボックスと、エンハンサ配列とを有している。この後者の特徴は、ゲラハティ（Ｇｅｒａｇｈｔｙ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１７１：１〜１８（１９９０）；キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）他，Ｃｅｌｌ４４：２６１〜２７２（１９８６）によって観察されたように、大半のＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモータに観察されている。リップマン（Ｌｉｐｍａｎ）他ｓｃｅｉｎｃｅ２２７：１４３５〜１４４１（１９８５）に示唆されているように３と６のＫ−トリプルパラメータを有するプログラムＦＡＳＴＡを使用し、又、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースリリース６５（１９９０年１０月）を使用して、コンピュータホモロジー検索を行った。ブルボン（Ｂｏｕｒｂｏｎ）他，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００：６２７〜６３８（１９８８）や、シュミットーザッハマン（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｚａｃｈｍａｎｎ）他，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ９６：４１７〜４２６（１９８８）に記載されているように、マウスの核様タンパク質ＮＯ３８／Ｂ２３において酸領域をコード化する配列に類似した、エクソン１によってコード化される酸領域（位置５２４〜６１８）の一部に対応する９５の塩基以外、ホモロジーは見られなかった。９５の塩基の内、５６が同じであった。これらのホモロジーがクロスハイブッド化の理由であるか否かを調べるために、前記９００塩基断片でスクリーニングしたマウスの脾臓ｃＤＮＡライブラリを使用して実験を行った。前記クロスハイブリッド化バンドの大きさに近似のｃＤＮＡクローンが得られた。これらを部分的に配列決定したところ、２．６ｋｂのｃＤＮＡがマウス核様体について報告されているｃＤＮＡ配列に正確に一致し、他方、１．５ｋｂのｃＤＮＡがマウス核様タンパク質ＮＯ３８／Ｂ２３に一致することが判った。以後”Ｐ１Ａ”という、前記遺伝子のヌクレオチド配列の分析結果は、そのコード化された生成物が２５ｋｄの分子量を有していることを示唆している。配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４の分析結果は、潜在的核標的化信号が残基５〜９（ディングウォール（Ｄｉｎｇｗａｌｌ）他，ＡｎｎＲｅｖ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２：３６７〜３９０（１９８６））にあり、大きな酸性ドメインが位置８３〜１１８にあることを示している。上述のように、これはＰ１Ａと２つの核タンパク質の間のホモロジーの領域を含んでいる。推定リン酸化サイトは位置１２５（セリン）に見いだすことが出来る。更に、前記Ｃ−末端の近くに、第２の酸のドメインが、１４のグルタミン酸残基の連続したストレッチとして見られる。類似のＣ末端構造が、ケッセル（Ｋｅｓｓｅｌ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：５３０６〜５３１０（１９８７）によって、核局在化を有するハツカネズミのホメオドメインタンパク質に見出されている。遺伝子Ｐ１Ａの配列の、Ｐ９１Ａ，３５Ｂ及びＰ１９８の配列との比較研究において、類似性は発見されず、これは、Ｐ１Ａが別の系の遺伝子と抗原とを示すものであることを示している。例１０前記Ｐ１Ａプローブと配列とが入手されたところで、正常な細胞に存在する前記遺伝子が腫瘍によって発現される遺伝子と同じものであるかどうかを調べた。そのために、ラムダｚａｐＩＩ１０とＤＢＡ２ハツカネズミ腎細胞のゲノムＤＮＡとを使用してファージライブラリを調製した。Ｐ１Ａをプローブとして使用した。ハイブリッド化条件は、前述したものであり、ハイブリッド化クローンが見つかった。このクローンは、前記Ｐ１Ａ遺伝子のエクソン１及び２を有しており、図５の位置０．７〜３．８に対応していた。この配列の局在化の後、ＰＣＲ増幅を行い図５の３．８〜４．５に対応する配列を得た。配列分析を行ったが、正常な腎臓から得た前記遺伝子と、Ｐ８１５腫瘍細胞から得たＰ１Ａ遺伝子との間に相違は見られなかった。更に行った実験において、前述したような方法で、ＤＢＡ／２腎細胞に見つかった遺伝子を、ＰＯ．ＨＴＲにトランスフェクションした。図７に示すこれらの実験は、抗原Ａ及びＢが、正常な腎細胞から分離されたＰ１Ａ遺伝子によってと同じくらい効率的に、正常な腎細胞から分離された腎臓遺伝子によっても発現されることを示した。これらの実験によって、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する遺伝子は、突然変異から発生する遺伝子ではなく、むしろ、この遺伝子は、正常な細胞中に存在するがその内部で発現されないものである、という結論が導かれる。以下に記載するように、この発見の派生効果は重要である。ここに詳述しなかった研究に於て、前記遺伝子の変異体を入手できることが判った。いくらかの細胞は、正常な”Ｐ１Ａ”ではなく、”Ｐ１Ａ^-Ｂ⁺”であった。これらの間の唯一の相違は、１８番目のトリプレットが変異体においてはＶａｌではなくＡｌａをコード化するというエクソン１の点突然変異である。例１１他の細胞タイプについて更に実験を行った。前述のノザン・ブロットハイブリッド化について記載されたプロトコルに従い、正常肝臓及び脾臓細胞のＲＮＡを、前記Ｐ１Ａ遺伝子の転写体が見つかるか否かを調べるためにテストした。このノザン・ブロットデータは図４に示され、ここに見られるように、発現の証拠は無い。Ｐ１Ａが分離された前記ハツカネズミＰ８１５細胞系は、肥満細胞腫である。従って、肥満細胞系を研究してこれらの細胞が前記遺伝子を発現するか否かを調べた。ネイベル（Ｎａｂｅｌ）他，Ｃｅｌｌ２３：１９〜２８（１９８１）に記載の肥満細胞系ＭＣ／９，と骨髄由来肥満細胞の短期培養とを、前述した方法（ノザン・ブロッティング）でテストしたが、転写は見つからなかった。これに対して、Ｂａｌｂ／Ｃ由来ＩＬ−３依存細胞系Ｌ１３８．８Ａ（ヒュールトナー（Ｈｕｅｌｔｎｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３４４０〜３４４６（１９８９））をテストした時には、強い信号が見られた。この肥満細胞の作用は図４に示されている。ＢＡＬＢ／ＣとＤＢＡ／２マウスの両方が共通してＨ−２^d単模式種を有していることが知られているので、前述のＣＴＬｓを使用して溶解に対する感度をテストすることが出来た。図８は、これらの結果を示し、抗Ａおよび抗ＢＣＴＬｓが前記細胞を強力に溶解し、これに対して抗Ｃと抗Ｄ種は溶解しなかったことを実質的に証明している。他のマウス腫瘍細胞系、即ち、奇形癌細胞系ＰＣＣ４（ブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：２７２〜２７５（１９７７）、と白血病ＬＥＣ及びＷＥＨ１−３Ｂ、について更にテストを行った。これらのサンプルのいずれにおいても、発現は検出できなかった。例１２ＭＨＣ分子によるＰ１Ａ抗原の実際の提示は注目される。これをテストするために、コスミドＣ１Ａ．３．１を、表現型Ｈ−２^kを示す線維芽細胞系ＤＡＰにトランスフェクションした。これらの細胞系を、Ｋ^d，Ｄ^d，及びＬ^d抗原のいずれか一つを発現する遺伝子でトランスフェクションした。前記コスミドとＭＨＣ遺伝子との両方でのトランスフェクションの後、再び前述した方法で、ＣＴＬｓによる溶解を調べた。表２に要約されたこれらの研究は、Ｐ１Ａ抗原Ａ及びＢの提示にはＬ^dが必要であることを示している。腫瘍拒絶抗原の提示が、特定のＭＨＣ分子と関係があるのではないかという観察は、以下に詳述するヒト細胞とＨＬＡ分子とを使用した実験で確認された。例１３前記Ｐ１Ａ遺伝子の配列と、それから誘導可能なアミノ酸配列とを使用して、Ａ⁺Ｂ⁺である（即ち、抗原Ａ及びＢの両方を発現する細胞の特徴）抗原的ペプチドと、Ａ^-Ｂ⁺であるペプチドとが同定された。このペプチドは図１０に示されている。このペプチドを、これを提示する細胞に対する特異性を有するＣＴＬ細胞系の存在下においてＰＯ．ＨＴＲ細胞のサンプルに投与した時、このＰＯ．ＨＴＲ細胞が溶解され、これは、前記遺伝子によって発現される生成物に基づくペプチドをワクチンとして使用可能であるという考えを支持するものである。例１４以下にＭＺ２−ＭＥＬと称するヒトメラノーマ細胞系は、クローン細胞系ではない。これは、抗原”Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＡ”として知られている、自己由来ＣＴＬｓによって認識される４つの安定した抗原を発現する。更に、二つの他の抗原” Ｂ”及び”Ｃ”が、前記腫瘍のいくつかのサブ系（サブライン）によって発現される。これらの６つの抗原に対して特異的なＣＴＬクローンが、ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．４４：６３４〜６４０（１９８９）によって記載されている。ＭＺ２−ＭＥＬの認識されるサブクローンとして、ＭＥＬ３．０とＭＥＬ３．１とがある（前記ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他）。細胞系ＭＥＬ３．１は、前述したＰ８１５変異体について記載したＣＴＬ研究によって測定された時、抗原Ｅを発現する。従って、これを、前記抗原先駆体を発現する核酸配列のソースとして選択した。腫瘍拒絶抗原先駆体に対する関連核酸配列の分離において、前記のこれまでに開発された技術は、受容細胞が次の二つの要件を満たさなければならないことを示す。即ち、（ｉ）その受容細胞は、正常な条件下においては問題のＴＲＡＰを発現してはならない、そして、（ｉｉ）それは関連クラスＩＨＬＡ分子を発現しなければならない。更に、受容細胞は、高いトランスフェクション頻度を有さなければならない。即ち、それは「好適な」受容体でなければならない。そのような細胞系を得るために、前記クローンサブ系ＭＥ３．１に対して、前述のファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）に従って、抗ＥＣＴＬ８２／３０による選択を繰り返し行った。選択を反復することにより、サブクローンＭＺ２−ＭＥＬ−２．２ｉｓｃＥ−が分離された。このサブクローンはＨＰＲＴ^-でもあった（即ち、ＨＡＴ培地：１０^-4Ｍヒポキサンチン、３．８ｘ１０^-7アミノプテリン，Ｍ２−デオキシチミジン、に対して反応する）。前記サブクローンを、以下、”ＭＥＬ−２．２”と略称する。例１５ここに参考文献としてその開示内容を添付するヴォルフェル（Ｗｏｅｒｆｅｌ）他，Ｉｍｍｏｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ２６：１７８〜１８７（１９８７）に従って、ＭＥＬ３．０のゲノムＤＮＡを調製した。ニコラス（Ｎｉｃｏｌａｓ）他，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．，Ｃｏｎｆ．ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆ．１０：４６９〜４８５（１９８３）に記載されているように、前記プラスミドｐＳＶｔｋｎｅｏβは、ジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）抵抗性を付与するので、これは、この実験で行われたように、コトランスフェクションのマーカとして使用することができる。コルサオ（Ｃｏｒｓａｏ）他，ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ７：６０３〜６１６（１９８１）の手順に類似してはいるが同じではない手順によって、全ゲノムＤＮＡと前記プラスミドとをコトランスフェクションした。前記ゲノムＤＮＡ（６０μｇ）とプラスミドＤＮＡ（６μｇ）とを９４０μｌの１ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；０．１ｍＭＥＤＴＡ中で混合し、その後、３１０μｌの１ＭＣａＣｌ₂を添加した。この溶液を、定常撹はんしながら、１．２５ｍｌの２ｘＨＢＳ（５０ｍＭＨＥＰＥＳ）２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ＮａＯＨによってｐＨ７．１に調節）にゆっくりと添加した。室温で３０〜４５分間でリン酸カルシウムＤＮＡ沈澱物を形成させ、その後、これらを、１０％の胎児ウシ血清を添加した２２．５ｍｌのメラノーマ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）中にあらかじめ２４時間３×１０⁶ＭＥＬ２．２細胞を接種しておいた８０ｃｍ²の組織培養フラスコに添加した。２４時間後、前記培地を置換した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収穫して２ｍｇ／ｍｌのジェネチシンを添加したメラノーマ培地中に４ ×１０⁶細胞／８０ｃｍフラスコの割合で接種した。前記ジェネチシンは選択マーカとして作用する。例１６トランスフェクションの１３日間後、ジェネチシン抵抗性コロニーを計数し、２ないし３日間非選択性培地中にて培養した。次に、トランスフェクションされた細胞を、１ウェル当り約３０の成長コロニーを得るために、２０％の胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を有する２００μｌの培養基中において、２００細胞／ウェルの割合で９６−ウェルミクロプレートに塗布した。それぞれ独立したトランスフェクション体が少なくとも４回現れるように、ミクロ培養の数を過剰にした。１０日間後、ウェルは約６×１０⁴の細胞を有していた。これらの細胞を分離し、各ミクロ培養の１／３を複製プレートに移した。６時間後、即ち、再付着後、培地を除去し、３５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を有する１００μｌのＣＴＬ培地中で各ウェルに１５００の抗−ＥＣＴＬ（ＣＴＬ８２／３０）を添加した。１日間後、下記の例において説明する理由により、上清（５０μｌ）を収穫し、ＴＮＦ濃度を調べた。例１７ほ乳類のゲノムの大きさは６×１０⁶ｋｂである。各耐薬剤トランスフェクション体に組み込まれたＤＮＡの平均量は約２００ｋｂであると予想されたので、抗原Ｅがトランスフエクションされたかどうかを確かめるためには最低３０，０００のトランスフェクション体が試験される必要があるだろう。ハツカネズミ細胞についての以前の研究によって、ＣＴＬ刺激アッセイが使用された時は、問題の抗原を発現する細胞をわずか３％を含むグループが同定することが出来たことが示された。これはアッセイの数をファクタで３０減らすはずである。前述したように、混合Ｅ⁺／Ｅ^-細胞中の抗−ＥＣＴＬアッセイは有用ではあるが、これは一貫した結果が得られないという点において十分なものではない。従って、別のテストが考案された。ＣＴＬの刺激を、ここで繰り返す必要のない周知の方法を使用して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出によって調べた。例１５に記載したように、トランスフェククション体の各ウェルに対して、１５００ＣＴＬ８２／３０の細胞を添加した。これらのＣＴＬｓを刺激の６日間後に収集した。前述したように、各ウェルの１／３の細胞が除去され、残りの２／３（４× １０⁴）が再付着された後、ＣＴＬｓとＩＬ−２がそれに添加された。２４時間後に５０μｌの上清を除去し、２μｇのアクチノマイシンＤを添加した１０％のＦＣＳを３７％の割合で添加したＷ１３培地（Ｌ−アルギニン（１１６ｍｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（３６ｍｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（２１６ｍｇ／ｌ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０）５０μｌ中に３×１０⁴ のＷ１３（ＷＥＨＩ−１６４クローン１３；エスペヴィック（Ｅｓｐｅｖｉｋ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９５：９９〜１０５（１９８６））細胞を含むミクロプレート、８％のＣＯ₂雰囲気中にて移した。前記細胞系Ｗ１３は、ＴＮＦに対する感応性を有するマウス線維肉腫細胞系である。ＲＰＭＩ１６４０中の組換えＴＮＦ−βの希釈物を標的細胞コントロールに添加した。２０時間の培養後、Ｗ１３培養を評価し、ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１９：２０３〜２１０（１９８９）の比色定量アッセイの応用を使用して死滅細胞の百分率を測定した。この測定において、ＰＢＳに５０ｍｌの（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙ１）−２，５−ジフェニールテトラゾリウムブロマイド２．５ｍｇ／ｍｌにて添加し、その後、３７℃で２時間培養した。１００μｌの溶解溶液（１容量のＮ，Ｎジメチルフォルムアミドを３７℃にて１．６％の酢酸及び２．５％の１ＮＨＣｌによりｐＨ４．７として、３０％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムを含有する２容量の水と混合させたもの）を添加することによって紺青ホルマザン結晶を溶解した。プレートを３７℃で一晩培養し、ＯＤｓを、６５０ｎｍをコントロールとして５７０ｎｍで測定した。死滅細胞の百分率は、エスペヴィック（Ｅｓｐｅｖｉｋ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９５：９９〜１０５（１９８６）に従い、下記の式によって算出した。その結果は、Ｅ⁺／Ｅ^-細胞の率が僅かに１／４５である時でもかなりのＴＮＦの産生が観察され、従って活性ＣＴＬｓを示すものであることを示した。これによって、３０のグループの耐薬剤トランスフェクション体をテストすることを決定した。例１８上述の例１７に記載したように、細胞のＴＮＦ産生をテストした。トランスフェクション後、全部で１００のグループのＥ^-細胞（４×１０⁶細胞／グループ）をテストしたところ、各グループにつき平均７００の割合で７×１０⁴の独立した耐ジェネクチントランスフェクション体を得た。トランスフェクション細胞の一つのグループのみが、抗Ｅ抗原ＣＴＬクローン８２／３０にＴＮＦを産生させるミクロ培養となった。テストした３００のクローンの内、８が陽性であった。次に、標準式⁵¹Ｃｒ放出アッセイを使用してこれらのクローンの抗−ＥＣＴＬによる溶解をテストしたところ、これらが元のＥ⁺細胞系と同じ程度に効率的に溶解されることがわかった。ここに記載のトランスフェクション体Ｅ．Ｔ１は、ＣＴＬｓのＭＥＬ２．２の抗原Ｂ，Ｃ，Ｄ及びＦに対するのと同じ溶解パターンを有していた。７０，０００の耐ジェネチシントランスフェクション体の内から一つのトランスフェクション体のみが前記抗原を提示したという事実は、一見すると非常に低いように思われるかもしれないが、実際にはそうではない。Ｐ８１５に関して前述した研究は、１／１３，０００の平均頻度を示した。ヒトＤＮＡ受容ＭＥＬ２．２は、Ｐ１．ＨＴＲに対して１／５のＤＮＡを組み込むようである。例１９トランスフェクタントＥ．Ｔ１が見つかったところで、前記細胞集団のＥ⁺の汚染がその原因であるか否かという疑問を含むいくつかの疑問に関する分析が必要となった。前述の抗原提示の分析は、Ｅ．Ｔ１が、丁度受容細胞ＭＥＬ２．２と同様に、Ｂ^-及びＣ^-であることを示している。更に、標準選択手法の使用により、これがＨＰＲＴ^-であることもわかった。しかし、ここに記載する研究において使用されたすべてのＥ⁺細胞はＨＲＰＴ⁺であった。更に、ＭＥＬ２．２のＥ⁺復帰突然変異体がＥ．Ｔ１の源であることも可能であった。これをテストするために、コトランスフェクション配列は、通常、受容ゲノムの単一の位置で組み込まれるというペルーチョ（Ｐｅｒｕｃｈｏ）他，Ｃｅｌｌ２２：３０９〜３１７（１９８８）の観察を利用した。もしもトランスフェクション体の抗原ＥがｐＳＶｔｋｎｅｏβとのコトランスフェクションから生じるとすれば、配列が結合されるはずであり、該抗原の欠失によって隣接のｐＳＶｔｋｎｅｏβ配列も欠失するかもしれない。前述のヴォルフェル（Ｗｏｅｌｆｅｌ）他は、これが事実であることを示した。もしも正常なＥ^-細胞がｐＳＶｔｋｎｅｏβによりトランスフェクションされるのであれば、配列が結合され、抗原の欠失によって隣接のｐＳＶｔｋｎｅｏβ配列も欠失するかもしれない。しかし、もしもｐＳＶｔｋｎｅｏβによって正常にトランスフェクションされたＥ⁺細胞がＥ．Ｔ１であるならば、「共欠失」は起こらないはずである。これをテストするために、前記トランスフェクション体Ｅ．Ｔ１を、前述したように、８２／３０で免疫選択した。二つの抗原欠失変異体が得られたが、これらは、このＣＴＬによる溶解に対して抵抗性があった。これらはいずれも、ジェネチシン抵抗性を失わなかったが、サザン・ブロッティング分析は、これらの変異体においていくつかのｎｅｏ^r 配列の欠失を示し、これはＥ．Ｔ１におけるＥ遺伝子とｎｅｏ^r遺伝子との間の密接な関係を示した。これによって、Ｅ．Ｔ１がトランスフェクション体であるという結論が導かれた。例２０前記Ｅ⁺サブクローンＭＺ２−ＭＥＬ４Ｂを、コスミドライブラリを調製するためのＤＮＡソースとして使用した。この約７００，０００のコスミドから成るライブラリを、前述のコスミドトランスフェクションプロトコルに従って、ＭＺ２−ＭＥＬ２．２細胞にトランスフェクションした。前記コスミドトランスフェクタントのＤＮＡをラムダ相成分に直接的にパッケージ化することによって、問題の配列を有するコスミドを取り出すことが可能な場合がある。しかし、この方法はここでは成功しなかった、そこで、我々は、前記トランスフェクションされたＤＮＡをコスミドベクターｐＴＬ６の適当な制限断片に結合することによって、前記トランスフェクション配列を奪回（ｒｅｓｃｕｅ）した。これを二つのトランスフェクション体について行い、そのうちの一つで成功した。Ｂ３と称する一つのコスミドがこの実験から回収された、これに、ＸｍａＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化、又は、大きな１２ｋｂのＸｍａＩトランスフェクション断片のＢａｍＨＩ消化、を行った。前記断片はベクターｐＴＺ１８Ｒにクローン化され、次いでＭＥＬ２．２にトランスフェクションされた。ここでも再び、ＴＮＦの産生を、トランスフェクションの成功の指標とした。これらの実験によって、抗原Ｅを１２ｋｂＸｍａＩ断片、次いで、１２ｋｂセグメントのＢａｍＨＩ消化による２．４ｋｂ断片にトランスフェクション可能な遺伝子配列が決定さた。サザン・ブロット（ＢａｍＨＩ／ＳｍａＩで消化したＤＮＡ）によって測定されたように、前記２．４ｋｂの断片は、ＭＺ２−ＭＥＬからの２．４ｋｂ断片と患者ＭＺ−２のＴ細胞クローンとハイブリッドする。前記バンドは、図１２に示されているように、ＭＺ２−ＭＥＬのＥ^-抗原欠失変異体には存在しない。前記Ｅ抗原先駆体遺伝子の配列が決定され、これをここに提示される。例２１前記２．４ｋｂのゲノム断片が同定された後、”Ｅ⁺”サブ系がなんらかの相同ＤＮＡを発現したかどうかを調べた。細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ３．０をソースとして使用し、ｃＤＮＡライブラリを、公知の技術を使用して、そのｍＲＮＡから調製した。前記２．４ｋｂ断片をプローブとして使用し、ノザン・ブロッティング分析によって、約１．８ｋｂのｍＲＮＡが相同であると同定された。ｃＤＮＡをスクリーニングした時、前記２．４ｋｂ断片の部分に対するほとんど完全な同一性を示すクローンが得られた。このようにして、二つのエクソンが同定された。前記２．４ｋｂのＢａｍＨＩ断片の前に位置するコスミドＢ３の断片の配列決定によって、更にこれらの上流に位置する別のエクソンが見つかった。この遺伝子は、図８に示すように、約４．５ｋｂに及んでいる。前記転写領域の開始点が、前記ｃＤＮＡの５’末端に対してＰＣＲを使用して確認された。これらの三つのエクソンは、６５，７３及び１５５１塩基対より構成される。エクソン３の位置６６にはＡＴＧが位置し、その後には８２８塩基対の解読枠がある。例２２前記２．４ｋｂ断片のより小さなセグメントが抗原Ｅの発現を転移することが出来るか否かを調べるために、公知の技術を使用して、前述の比較的大きな遺伝子に対応する小さなピースをつくり、Ｅ⁺細胞に転移した。図８は、その３つの断片の境界を示している。このような抗原発現の転移によって、前記遺伝子は、前記抗原を活性化させるタンパク質のをコード化するのではなく、むしろ、前記抗原先駆体をコード化することを示している。例２３前述のｃＤＮＡの調査によって、驚くべきことに、二つの互いに異なってはいるが互いに密接に関連したｃＤＮＡｓが明らかになった。テストした時、これらのｃＤＮＡｓは、抗原Ｅの発現を転移しなかったものの、前記第１ｃＤＮＡセグメントに対する実質的な相同性を示している。前記三つのセグメントは、「メラノーマ抗原」の”ＭＡＧＥ”と称する新たに認識された遺伝子のファミリを示すものと思われる。図９において、”ＭＡＧＥ−１”は、ＭＺ２細胞からの前記抗原の発現を指示する。各遺伝子の第３エクソンの部分が図９に示されている。前記第２及び第３配列は、第１のものよりも、互いに密接に関連している（第１に対してそれぞれ１８．１％と１８．９％の違い；互いに対して１２％の違い）。得られた９のｃＤＮＡクローンの内、各タイプにつき三つが得られ、これは発現が同じであることを示唆している。ここで”ＭＡＧＥ”とは、分子のファミリと、これらの分子をコード化する核酸のことをいう。これらの核酸は、共通の程度の相同性を有し、いくつかの種類のヒト腫瘍細胞を含む腫瘍細胞と、ヒトの腫瘍とにおいて発現される。前記ファミリは、その第１のメンバがヒトのメラノーマ細胞において同定されたという理由により、”ＭＡＧＥ”と呼ばれる。しかし、以下の実験が示すように、ＭＡＧＥのメンバは決してメラノーマ腫瘍に限られたものではなく、むしろ、ＭＡＧＥは腫瘍拒絶抗原先駆体のファミリとそれらをコード化する核酸配列とを指す。これらから得られる抗原を、ここでは、”ＭＡＧＥＴＲＡｓ”即ち「メラノーマ抗原腫瘍拒絶抗原」という。例２４マウス腫瘍による実験は、Ｔ細胞によって認識される新しい抗原が、新規な抗原ペプチドをコード化する領域において活性遺伝子を修飾する点突然変異から生じる可能性があることを示した。大半の正常細胞においては発現されない遺伝子の活性化からも新たな抗原が発生する可能性がある。抗原ＭＺ２−Ｅに関してこの問題を明らかにするために、メラノーマ細胞中に存在する前記ｍａｇｅ−１を、患者ＭＺ２の正常細胞中に存在するものと比較した。前記２．４ｋｂの断片の最初の半分をカバーしている１３００ｂｐのストレッチを包囲するプライマを使用したフィトヘマグルチニン活性化血液リンパ球のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行った。予想された通り、ＰＣＲ生成物が得られたが、これに対して、前記Ｅ^-変異体のＤＮＡではなにも得られなかった。このＰＣＲ生成物の配列は、前記Ｅ⁺メラノーマ細胞が有する前記遺伝子の対応配列と同じであることが判った。更に、抗原ＭＺ２−Ｅは、クローン化ＰＣＲ生成物によってトランスフェクションされた細胞によって発現されることが判った。この結果は、正常時においては不活性な遺伝子の活性化が、腫瘍拒絶抗原ＭＺ２−Ｅの出現の原因であることを示唆するものである。例２５種々の正常及び腫瘍細胞による遺伝子ｍａｇｅ−１の発現を評価するために、ノザン・ブロットを、前記第３エクソンの大部分をカバーするプローブとハイブリッドした。ヒト腫瘍細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ３．０において観察された結果とは異なり、患者ＭＺ２のＣＴＬクローンから分離されたＲＮＡと同じ患者のフィトヘマグルチニン活性化血液リンパ球とにおいてはバンドは観察されなかった。他の個体のいくつかの正常組織も同様に陰性であった（図１０及び図１１参照）。他の患者の１４のメラノーマ細胞系をテストした。その内の１１が陽性で、様々な強度のバンドを有していた。これらの培養細胞系に加えて、メラノーマ腫瘍組織の４つのサンプルを分析した。患者ＭＺ２の転移を含む二つのサンプルは陽性であり、これによって、前記遺伝子の発現が組織培養の人為構造を表すものであるという可能性が除外された。肺腫瘍を含む他の２〜３の組織構造タイプの腫瘍をテストした。これらの腫瘍の大部分は陽性であった（図１０及び図１１）。これらの結果はＭＡＧＥ遺伝子ファミリが多くのメラノーマおよび他の腫瘍により発現されることを示している。しかし、これらは、遺伝子ｍａｇｅ−１，２又は３のどれが、これらの細胞によって発現されたのかについてはっきりと示すものではなかった。というのは、これらの三つの遺伝子に対応するＤＮＡプローブはかなりの程度、クロス・ハイブリッドしたからである。この分析をより具体的にするために、ＰＣＲ増幅と、特異性の高いオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリッド化を使用した。ｃＤＮＡが得られ、これらを、ここに記載の三つのＭＡＧＥ遺伝子に関して同一のエクソン３の配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマを使用したＰＣＲによって増幅された。次に、そのＰＣＲ生成物が、前記三つの遺伝子の一つに対する完全な特異性を示した三つの他のオリゴヌクレオチドとハイブリッドする能力を有するかどうかについてテストした（図９）。陰性の細胞からのＲＮＡ中でメラノーマＭＺ２−ＭＥＬ３．０のＲＮＡを希釈するコントロール実験によって、ここに使用した条件下においては、前記信号の強度が希釈度に対して比例的に減少することと、１／３００の希釈においてもまだ陽性の信号が検出可能であることが判った。ＰＣＲによってテストした正常細胞（リンパ球）は、前記三つのＭＡＧＥ遺伝子の発現に関して陰性であることが確認され、従って、これはＭＺ２メラノーマ細胞種の発現レベルの１／３００^th以下の発現レベルを示唆するものである（図１１）。メラノーマ細胞系のパネルに関して、その結果は、メラノーマにおいてはＭＡＧＥ遺伝子ｍａｇｅ１，２及び３を発現するものと、ｍａｇｅ− ２とｍａｇｅ−３のみを発現するものとがあることを明示している（図１１及び１０）。他の腫瘍の内には三つの遺伝子のすべてを発現したものと、ｍａｇｅ− ２又はｍａｇｅ−３のみ、またはｍａｇｅ−３のみを発現したものとがあった。いくつかの陽性ＰＣＲの結果が、前記三つの特徴付けられたＭＡＧＥ遺伝子の一つを発現を反映するものではなく、前記プライム化及びハイブリッド化オリゴヌクレオチドを共有する別の密接に関連した遺伝子の発現を反映するものであるという可能性をはっきりと除外することは不可能である。前記ＭＡＧＥ遺伝子ファミリは、多様な腫瘍によって発現されるものであり、これらの遺伝子はこれまでテストされた正常細胞中においては不活性である、と結論付けることができる。例２６高い効率でトランスフェクションし、効率的にＴＲＡＰを発現する配列が入手されたことによって、関連の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の探索が可能となった。患者ＭＺ２のクラスＩ特異性は、ＨＬＡ−Ａ１，Ａ２９，Ｂ３７，Ｂ４４及びＣ６である。ＭＺ２と同様にＡ１を有する患者の他の４つのメラノーマを、前記２．４ｋｂ断片とｐＳＶｔｋｎｅｏβとにコトランスフェクションさせた。これらの内の三つが、ＣＤ８＋である抗−ＥＣＴＬクローン８２／３０によるＴＮＦ放出を刺激するｎｅｏ^rトランスフェクション体を産出した（図１０）。ＭＺ２と共にＡ２９，Ｂ４４又はＣ６を共有する他の４つのメラノーマではＥ^-トランスフェクション体は得られなかった。これは、抗原ＭＺ２−Ｅの提示分子がＨＬＡ−Ａ１であることを示唆している。確認として、ＨＬＡ−Ａ１患者の腫瘍からの６つのメラノーマ細胞系の内、二つが患者ＭＺ２の抗−ＥＣＴＬクローン８２／３０によるＴＮＦ放出を刺激することが判った。これらの腫瘍細胞系の内の一つ、ＭＩ１３４４３−ＭＥＬも、これらの抗−ＥＣＴＬによる溶解に対する高い感度を示した。これら二つのメラノーマは、ｍａｇｅ−１遺伝子を発現したメラノーマであった（図１３）。Ａ１を有さないＨＬＡ単模式種を有する患者の８つのメラノーマについて、その溶解に対する感度と、前記ＣＴＬによるＴＮＦ放出を刺激する能力について調べた。これはいずれも陽性ではなかった。いくつかのヒト抗腫瘍ＣＴＬが、元の腫瘍と適当なＨＬＡ特異性を共有する同種腫瘍を溶解する能力があることが報告されている（ダロウ（Ｄａｒｒｏｗ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３３２９（１９８９））。特に前に詳述したハツカネズミ腫瘍に関する類似の結果に鑑みて、遺伝子ｍａｇｅ２及び３によってコード化される抗原ペプチドも、ＨＬＡ−Ａ１又は他のクラス１分子によって同系ＣＴＬに提示されうるという可能性が高い。例２７前述したように、メラノーマＭＺ２は、抗原Ｅの他に、抗原Ｆ，Ｄ及びＡ’を発現した。抗原Ｅをコード化する核酸配列の分離後、抗原Ｆをコード化する核酸配列を分離するために類似の実験を行った。これを行うために、細胞種ＭＺ２−ＭＥＬ２．２の培養を、前述したＥ^-細胞系、抗−ＥＣＴＬクローンに対する処理に関して記載したものと同じ方法で、抗−ＦＣＴＬクローン７６／６によって処理した。これによって、Ｆ抗原欠失変異体が分離され、これに対して複数回の選択を行った。その結果得られた細胞系、”ＭＺ２−ＭＥＬ２．２．５”、は抗−ＦＣＴＬｓによる溶解に対しては完全な抵抗性を有するが、抗−ＤＣＴＬｓによっては溶解されることが判った。再び、抗原−Ｅ先駆体ＤＮＡの分離に関して述べたプロトコルに従って、前記Ｆ^-変異体を、Ｆ⁺細胞系ＦＺ２−ＭＥＬ３．０からのゲノムＤＮＡとトランスフェクションした。これらの実験によって、９０，０００の耐薬剤トランスフェクション体が産生された。これらについて、前に詳述したＴＮＦ検出アッセイで３０の細胞のプールを使用してそのＭＺ２−Ｆ発現をテストした。一つのプールが抗−ＦＣＴＬｓによるＴＮＦ放出を刺激し、これはクローン化された。１４５のクローンの内の５つが、抗−ＦＣＴＬｓを刺激することが判った。これも前述のプロトコルに従った溶解アッセイによって、（ｉ）抗原Ｆをコード化する遺伝子の発現、及び（ｉｉ）抗原Ｆ自身の提示、を確認した。例２８Ｆ⁺細胞系の同定後、そこからのＤＮＡを使用して細胞をトランスフェクションした。これを行うために、再び前述のプロトコルを使用して、Ｆ⁺細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ．４３のコスミドライブラリを調製した。このライブラリを約５０，０００のコスミドからなる１４のグループに分割し、各グループからのＤＮＡをＭＺ２−ＭＥＬ２．２．５にトランスフェクションした。次に、トランスフェクション体の、抗−ＦＣＴＬクローン７６／６からのＴＮＦ放出を刺激する能力をテストした。１４のコスミドグループの内、一つが抗原Ｆを発現する二つの独立したトランスフェクシヨン体を産生し、これは、１７，５０００の耐ジェネチシントランスフェクション体から２つの陽性が産生されたことになる。例２９サザン・ブロット（図１２）上に観察されたパターンから一つの遺伝子ファミリの存在が示唆された。これを行うために、抗原Ｍ２２−Ｅの発現を転移した前記２．４ｋｂのＢａｍＨＩ断片を３２ｐ（³²Ｐ）でラベルし、Ｅ⁺クローン化サブクローンＭ２２−ＭＥＬ２．２のＢａｍＨＩ消化ＤＮＡのサザン・ブロット上でプローブとして使用した。ハイブリッド化条件は、５０μｌ／ｃｍ²の３．５ｘＳＳＣ、ｌｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、２５ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ，２ｍＭＥＤＴＡ、を含み、前記２．４ｋｂプローブは、予め、［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ（２〜３０００Ｃｉ／ｍｏｌｅ）で３×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌにラベルしておいた。ハイブリダイッド化は、６５℃において１８時間行った。この後、膜の洗浄を、６５℃にて、２ｘＳＳＣ中と０．１％ＳＤＳ中でそれぞれ１時間づつと、最後に０．１ｘＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中でそれぞれ３０分間の計４回行った。ハイブリダイッド化を同定するために、ＫｏｄａｋＸ−ＡＲフィルムとＫｏｄａｋＸ−Ｏｍａｔｉｃ微細強化スクリーンとを使用して膜のオートラジオグラフを行った。以下の例において、「ハイブリダイゼーション」が言及される時、使用された厳密性条件は、上述したものと類似のものであった。ここで「厳密性条件」とは、前述した条件をいい、これらは当該技術において周知の変更が可能である。例３０ヒト肉腫細胞系ＬＢ２３−ＳＡＲのサンプルから、ｍａｇｅ４をコード化する前記ｃＤＮＡを同定した。この細胞系は、ｍａｇｅ１，２又は３は発現しないことが判ったが、この細胞系のｍＲＮＡは、ｍａｇｅ１の前記２．４ｋｂ配列にハイブリッド化する。これを更に調ベるために、全ＬＢ２３−ＳＡＲｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを調製し、次に、これを前記２．４ｋｂ断片にハイブリッド化した。このプローブにハイブリッド化する一つのｃＤＮＡ配列が同定された。以後、これをｍａｇｅ４という。例３１前述の”ＭＺ”細胞のソースである患者”ＭＺ２”からのＰＨＡ−活性化リンパ球を使用して実験を行った。ｍａｇｅ２又は３に対してではなくｍａｇｅ１に対して相同性を示すオリゴヌクレオチドプローブを、前記ＰＨＡ活性化細胞由来のコスミドライブラリとハイブリッドした。しかし、ハイブリッド化ＢａｍＨＩコスミド断片の大きさは、４．５ｋｂであり、これは前記物質がｍａｇｅ１ではないことを示した。しかし、ｍａｇｅ１〜４に対する相同性に基づき、前記断片は”ｍａｇｅ５”と呼ぶことができる。ＭＡＧＥ５の配列は、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１６に示されている。例３２メラノーマ細胞系ＬＢ−３３−ＭＥＬをテストした。該細胞系からの全ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡを作成し、次に、これをオリゴＣＨＯ９：（ＡＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＴ）とＣＨＯ１０：（ＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＡＧ）とで増幅した。これらのオリゴは、前述したｍａｇｅ１，２及び３と共通のエクソン３の領域に対応するものである。これを行うために、１μｇのＲＮＡを、前述した、２μｌの１０ｘＰＣＲバッファと、２μｌの１０ｍＭｄＮＴＰと、１．２μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂と、１μｌの８０ｍＭのＣＨＯ９の溶液とからなる全部で２０μｌと、２０単位のＲＮＡｓｉｎと、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素とに希釈した。この後、４２℃で４０分間培養を行った。その後、８μｌの１０ｘＰＣＲバッファと、４．８μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂と、１μｌのＣＨＯ１０と、２．５単位のサーマス．アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｃｑｕａｔｉｃｕｓ）（”Ｔａｑ”）ポリメラーゼと、全容量１００μｌとなる水とを使用して、ＰＣＲ増幅を行った。次に、増幅を３０回行った（９４℃で１分間、５９℃ で２分間、７２℃で３分間）。各反応物の１０μｌを、アガロースゲル上でサイズフラクション化し、その後、ニトロセルロースでブロッティングを行った。その生成物は、オリゴヌクレオチドプローブＣＨＯ１８（ＴＣＴＴＧＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＣ）とハイブリッド化することが判った。このプローブはｍａｇｅ１を同定したが、ｍａｇｅ２や３は同定しなかった。しかしながら、前記生成物はプローブＳＥＱ４（ＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡ）とはハイブリッド化しなかなった。このプローブも、ｍａｇｅ１には結合したがｍａｇｅ２と３には結合しなかった。これは、前記ＰＣＲ生成物がｍａｇｅ１，２及び３とは異なった配列を有していることを示すものであった。この断片の配列決定は、更に、ｍａｇｅ４及び５との相違も示した。これらの結果は、前に同定されたｍａｇｅ１，２，３，４及び５とは異なる配列を示すものであり、これをｍａｇｅ６と命名した。例３３ＭＺ２のＰＨＡ−活性化リンパ球からのコスミドライブラリを使用した追加実験において、前記２．４ｋｂのｍａｇｅ１断片を、プローブとして使用し、相同断片を分離した。しかし、このクローンは、ｍａｇｅ１，２，３又は４に対する特異性を有するオリゴヌクレオチドには結合しなかった。得られた配列は、ｍａｇｅ１のエクソン３に対するいくらかの相同性を示し、これはｍａｇｅ１〜６とは異なっている。更なるスクリーニングによって、ｍａｇｅ８〜１１が産生された。例３４前記ＴＲＡＰｓ及びこれらから誘導されたＴＲＡｓの有用性は、以下によって例証された。ｍａｇｅ１のエクソン３は、抗原Ｅの発現を転移するとが示された。結果として、このエクソン３より誘導される合成ペプチドが抗−ＥＣＴＬに対する感度を与えるのに使用されうるかが決定された。これを行うために、標準的プロトコルを使用し、正常には抗−Ｅ／ＣＴＬｓには感応しない細胞をエクソン３．１より誘導された合成ペプチドにより培養した。Ｐ８１５Ａに関して前述したＣＴＬ溶解アッセイと、３ｍＭのペプチド濃度を使用して、前記ペプチドＧｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒが最善であることが示された。前記アッセイは、３０％の溶解を示し、これは前記抗−ＥＣＴＬに対する感応性の付与を示すものである。例３５ ”ｓｍａｇｅ”と称される核酸配列をハツカネズミ細胞から分離した。前述したプロトコルに従い、コスミドベクターＣ２ＲＢを使用して、正常ＤＢＡ／２腎臓細胞のＤＮＡからコスミドライブラリを調製した。プローブとして、ＭＡＧＥ −１の前記２．４ｋｂＢａｍＨＩ断片を使用した。前記ＤＮＡをナイロンフィルタにブロッティングし、これらを６５℃において２ｘＳＳＣ中で洗浄して、前記ｓｍａｇｅ物質を同定した。例３６更に別の組織サンプルについて、前述したプロトコルを使用して、ＭＡＧＥの存在をテストした。以下はこれらの結果の内のいくつかである。脳又は腎臓腫瘍組織にはＭＡＧＥ遺伝子の発現はなかった。結腸腫瘍組織は、ＭＡＧＥ１，２，３及び４の発現を示したが、但しテストしたすべての組織がすべてのＭＡＧＥ遺伝子を発現したわけではなかった。このことは、膵臓腫瘍（ＭＡＧＥ１）、非−小細胞肺（ＭＡＧＥ１，２，３及び４）、前立腺（ＭＡＧＥ１）、肉腫（ＭＡＧＥ１，２，３及び４）、胸（ＭＡＧＥ１，２及び３）、及び喉頭（ＭＡＧＥ１及び４）にも当てはまる。例３７細胞溶解ＣＴＬクローン”２０／３８”を、メラノーマ患者ＭＺ２の末梢血液リンパ球から得た。このクローンは、ここにその開示内容を参考文献として添付するファン．デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４４：６３４〜６４０（１９８９）に記載されている。前記クローンは、ここにその開示内容を参考文献として添付するヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３９：３９０〜３９６（１９８７）に従って、分離された。しかし、ここにこのアッセイを説明しておく。自己由来メラノーマ細胞を、試験管内で成育し、次に、１０％のＨＥＰＥＳと３０％のＦＣＳとを添加したＤＭＥＭ中で１０⁷細胞／ｍｌで再懸濁し、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄とともに３７℃で４５分間培養した。ラベルした細胞を１０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＤＭＥＭで３回洗浄した。次に、これらを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１０％のＦＣＳとを添加したＤＭＥＭ中で再懸濁し、その後、１０³の細胞を有する１００μｌのアリコットを９６のウェルミクロプレートに分配した。前記ＣＴＬのサンプルを１００μｌの同じ培地に添加し、アッセイを繰り返した。プレートを１００ｇで４分間遠心分離に掛け、５．５％のＣＯ₂雰囲気中で３７℃にて４時間培養した。プレートを再び遠心分離に掛け、上清の１００μｌのアリコットを収集し、計数した。⁵¹Ｃｒ放出率を以下によって算出した。ここで、ＥＲは、観察された実験上の⁵¹Ｃｒ放出値、ＳＲは１０³ラベル化細胞を２００μｌの培地のみで培養することによって測定された自然放出値、そして、ＭＲは、１００μｌの０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を標的細胞に対して添加することによって得られた最大放出値、である。高いＣＴＬ活性を示した前記単核血液サンプルを拡張し、制限希釈によってクローン化し、同じ方法を使用して再度スクリーニングした。同じ方法を使用して、Ｋ５６２細胞をテストした。ＥＢＶ−Ｂ細胞を使用した時の、唯一の相違点は、ＤＭＥＭ培地を、５％のＦＣＳを添加したＨａｎｋ’ｓ培地によって置き換えたことだけであった。これらの実験によって、ＣＴＬクローン２０／３８が分離された。図１は、これらのアッセイの結果を示す。特に、前記ＣＴＬクローンが自己由来メラノーマ細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ．３．０は溶解したが、ＥＢＶ−Ｂ細胞系、線維芽細胞、Ｋ５６２や非自己由来メラノーマ細胞系ＳＫ− ＭＥＬ−２９は溶解しなかったことが判る。例３８前記ＣＴＬクローンが前記自己由来細胞系に対して特異的であることが認識された後、その抗原特異性をテストした。これを行うために、患者ＭＺ２由来の抗原欠失変異体を、上述したものと同じタイプのクロム放出アッセイにおいてテストした。これらの標的系は、Ｄ⁺，Ｅ⁺，Ｆ⁺，Ａ⁺であるＭＺ２−ＭＥＬ３．０と、Ｄ^-であるＭＺ２−ＭＥＬ．６１と、Ｅ^-であるＭＺ２−ＭＥＬ２．２と、Ｆ^- であるＭＺ２−ＭＥＬ．４とであった。ＣＴＬクローン２０／３８の他に、抗− Ａ（ＣＴＬ２８／３３６）、抗−Ｆ（ＣＴＬ７６／６）及び抗−Ｅ（ＣＴＬ２２／１３）であることが知られているクローンもテストした。これらの結果は図１５に示されている。ＣＴＬクローン２０／３８が前述のすべての細胞系を溶解し、これらよってＤ^-細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ．６１を除いてクロム放出を起こさせ、従って、該ＣＴＬクローンが抗−Ｄであること示すものであることが理解されるであろう。この結果は、ここには記載しないが、前記ＣＴＬクローンによるＴＮＦ放出がメラノーマ系提示抗原Ｄの存在下においてのみ観察された実験において確認された。例３９抗原Ｄが標的分子として同定された後、これを提示するＨＬＡタイプを検出する研究を行った。例Ａに記載の実験は、抗原ＤがＭＺ２−ＭＥＬによって提示されることを示したが、この細胞系のＨＬＡ特異性は知られている（即ち、Ａ１，Ａ２９，Ｂ３７，Ｂ４４，Ｃｗ６，Ｃ．ｃｌ．１０）。しかしながら、ＨＬＡ分子を欠失しているＭＺ２−ＭＥＬの変異体Ａ２９，Ｂ４４及びＣ．ｃｌ．１０がそれでもまだ抗原Ｄを発現することも知られていたので、これらを考慮対象から除外することができた。Ｂ３７を発現する系については発見されなかったので研究しなかった。全部で１３の同種系をテストし、これらはＨＬＡ−Ａ１（１３中１０）か、又はＣｗ６（１３中３）のいずれかを発現した。これらの細胞系の、ＣＴＬクローン２０／３８によってＴＮＦの放出を刺激する能力を、ここにその開示内容を参考文献として添付するトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５〜１５２（１９９２）の方法を使用してテストした。このアッセイは、ＷＥＨＩ１６４−１３細胞に対する上清の毒性のテストを通じてＴＮＦ放出を測定するものである。前記アッセイにおいて、前記同種系からの細胞サンプル（３０００、１０，０００又は３０，０００細胞）を前記ＣＴＬクローン１５００細胞と２５ｕ／ｍｌのＩＬ−２との存在下で培養した。２４時間後。培養より得られた上清はＷＥＨＩ細胞に対する毒性についてテストされた。その結果は下記の表３に示されている。８つの細胞系が前記ＣＴＬクローン２０／３８からＴＮＦ放出を刺激することが判った。これらの種のすベてがＨＬＡ−Ａ１であった。前記Ｃｗ６提示系はいずれも刺激しなかった。前記細胞系を、更に、ＭＡＧＥ発現を検出するためにアッセイした。ＴＮＦ放出を刺激した８つの種のすべてがＭＡＧＥ−３を発現したが、陰性であった二つのＨＬＡ−Ａ１種はこれを発現しなかった。例４０例Ｃに記載した結果に鑑みて、抗原Ｄが実際に、ＭＡＧＥ−３から誘導された腫瘍拒絶抗原であるのか否かを調べるために実験を行った。これを行うために、受容ＣＯＳ７細胞を、１００ｎｇのｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン化したＨＬＡ−Ａ１に対する遺伝子、および、（ａ）ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン化したＭＡＧＥ−１に対するｃＤＮＡ、（ｂ）ｐｃＤＳＲαにクローン化したＭＡＧＥ−２に対するｃＤＮＡ、または（ｃ）ｐｃＤＳＲにクローン化したＭＡＧＥ−３に対するｃＤＮＡ、のいずれか一つ１００ｎｇとトランスフェクションした。トランスフェクション配列を、製造業者の指示に従ってプラスミドに結合した。ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、１０％の胎児ウシ血清を添加したＤｕｌｂｅｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓＭｅｄｉｕｍ（”ＤＭＥＭ”）中にて、１５，０００細胞／ウェルの割合で組織培養平底ミクロウェルに接種した。これらの細胞を３７℃で一晩培養し、培地を除去し、これを１０％のＮｕ血清、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン、１００μＭのクロロキン、そして上述したプラスミドを有する３０μｌ／ウェルのＤＭＥＭ培地と置換した。３７℃での４時間の培養後、前記培地を除去し、これを１０％のＤＭＳＯを有する５０μｌＰＢＳと置換した。この培地を２分後に除去し、これを１０％のＦＣＳを添加した２００μｌＤＭＥＭと置換した。この培地の交換後、ＣＯＳ細胞を３７℃にて２４時間培養した。その後、培地を廃棄し、１０％のプールされたヒト血清を含み、２５μ／ｍｌのＩＬ−２を添加した１００μｌのＩｓｃｏｖｅ培地中に、１５００の細胞のＣＴＬクローン２０／３８を添加した。２４時間後、上清を除去し、ここにその開示内容を参考文献として添付するトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５〜１５２（１９９２）に記載されているように、ＷＥＨＩ細胞上のアッセイにてＴＮＦ含有量を測定した。これらの結果を図１６に示す。前記ＣＴＬクローンが、ＨＬＡ−Ａ１とＭＡＧＥ−３とによってトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞によっては強力に刺激されたが、他のｍａｇｅ遺伝子によってトランスフェクションされた細胞には刺激されなかったことが理解されるであろう。これによって、抗原Ｄは、遺伝子ＭＡＧＥ−３によってコード化された腫瘍拒絶抗原先駆体から誘導された腫瘍拒絶抗原であり、このＴＲＡがＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるという結論が導かれる。前記例を含む以上の開示は、極端な値となる多くのツールを当業者の手に委ねている。先ず、前記諸例は、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子及びこれに対して相補的な核酸分子を分離する方法を明らかにし、これを提供するものである。ＤＮＡは二重鎖形態で存在し、かつ、二つの鎖のそれぞれが他方に対して相補的であることが知られている。ＤＮＡの鎖が与えられれば、当業者はその相補体を分離したり、あるいはこれを合成することが出来るまで核酸ハイブリッド化技術は発達している。ここで「核酸分子」とは、前述した特性を有するすベての種のＤＮＡ及びＲＮＡを指す。ゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ)即ち”ｃＤＮＡ”は、共に特定のタンパク質をコード化し、ＭＡＧＥコード化配列の分離のための例が示すように、本開示は、当業者にこれらの両方をいかに得るかを教示するものである。同様に、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ分子も得ることができる。繰り返すと、当業者に参照することによって、一旦、コード化配列が入手できれば、ｍＲＮＡを分離又は合成することができる。「アンチセンスＤＮＡ」又はｍＲＮＡ等のＴＲＡＰをコード化しない相補的配列は、例えば、コード化配列をプローブすること、およびその発現を阻止する手法に有用である。前記例は、ＴＲＡＰ分子をコード化するか、又はこれらの分子を発現する核酸配列によってトランスフェクションされた細胞系の生物学的に純粋な培養の製造を示すものであることが明白に理解されるであろう。このような培養は、例えば、腫瘍拒絶抗原のソースとして、あるいは治療に利用可能である。本発明のこの側面について次に記載する。前記ＴＲＡＰコード化配列によってトランスフェクションした細胞を、更に他のコード化配列とトランスフェクションすることも可能である。他のコード化配列の具体例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）等のサイトカイン遺伝子、または、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）やヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子等がある。サイトカイン遺伝子トランスフェクションは、これらの発現が前記細胞の生体内における生物学的純粋培養の治療的効力を高めることが期待されているので有用である。インターロイキントランスフェクション体が癌病状の治療のために患者に投与された治療についてはよく知られている。特に好適な実施例において、細胞は、（ｉ）ＴＲＡＰ分子、（ｉｉ）ＨＬＡ／ＭＨＣ分子、及び（ｉｉｉ）サイトカイン、のいずれか一つをコード化する配列とトランスフェクションされる。ＭＬＡ／ＭＨＣコード化配列とのトランスフェクションが望ましいのは、或る種のＴＲＡは、特定のＭＨＣ／ＭＬＡ分子によってのみ優先的又は特異的に提示されるかも知れないからである。従って、受容細胞が既にＴＲＡの提示に関連するＭＨＣ／ＨＬＡ分子を発現する場合には、該抗原の過剰発現を起こさせるために更に形質転換することも可能ではあるが、追加のトランスフェクションは必要でないかもしれない。他方、受容細胞が正常には関連ＭＨＣ／ＨＬＡ分子を発現することがない時には、第２の配列にてトランスフェクションすることが望ましい。又、もう一つの配列とのトランスフェクションということは更にそれ以上の他の配列とのトランスフェクションの可能性を排除するものでないことは言うまでもない。ここで記載される細胞系との関連で使用される「生物学的に純粋」とは、単に、これらが実質的に他の細胞を有さない、ということを意味する。厳密には、「細胞系」は、その定義により、「生物学的に純粋」であるが、このような表現を使用することによってこれをより完全に表現するものである。細胞のトランスフェクションには、適当なベクターが使用されることが必要である。従って、本発明は、問題とするＴＲＡＰのコード化配列がプロモータに作動可能に連結されている発現ベクターを含む。該プロモータは、当該技術において知られているもののような強力なプロモータ、又は、分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）プロモータ、即ち、特定の細胞タイプにおいてのみ作動するプロモータであってよい。前記発現ベクターは、更に、ワクシニアウィルスやＢＣＧ等のウィルス又はバクテリアのゲノムの全部又は一部を含むことができる。このようなベクターは、ワクチンの製造において特に有用である。前記発現ベクターは、ＴＲＡＰ配列がそこに含まれる限り、複数のコード化配列を含むことが可能である。発現ベクターは、ＴＲＡＰ配列がそこに含まれているかぎりは、幾つかのコード化配列を含んでいる。前述したサイトカイン及び／又はＭＨＣ／ＨＬＡ遺伝子は、ＴＲＡＰ配列とともに一つのベクターに含ませてもよい。これが望ましくない場合には、各コード化配列がプロモータに作動可能に連結された２つ又はそれ以上の別々のベクターが使用される発現システムを提供することができる。ここでも、前記プロモータは、強力又は分化プロモータであってよい。コトランスフェクションは周知の技術であり、この分野の当業者はこの技術の利用を期待できる。前記ベクターは、これらが、ＴＲＡＰ分子ではなく直接的にＴＲＡをコード化するように構成できる。これによって、翻訳後の処理が不要となる。以上から明らかなように、前記配列は、「腫瘍拒絶抗原先駆体」（ＴＲＡＰｓ）をコード化し、これらの腫瘍拒絶抗原先駆体か腫瘍拒絶抗原（”ＴＲＡｓ”）にプロセッシングされる。それぞれの特異例を含めてこれらのカテゴリーの両方の分離された形態がここに記載されている。恐らく、これらの最も有益な側面は、種々の癌状態を治療するためのワクチンとしてのものである。証拠によれば、ＴＲＡｓが腫瘍細胞上で提示され、その後、免疫応答が展開し、細胞が除去される。前記例は、種々のＴＲＡｓが細胞に投与された時、ＣＴＬ応答が起こって提示細胞が除去されることを示している。これはワクチンに特有の作用であり、従って、ＴＲＡｓにプロセッシングされるＴＲＡＰｓ、およびＴＲＡｓ自身を、単独又は、薬剤的に適当な組成物とともにワクチンとして使用することが可能である。同様に、提示細胞も、同じ様に、単独又は他の成分と組み合わせて使用して薬剤組成物を作るのに使用することができる。ワクチンとして使用可能な更に別の物質としては、その表面にＴＲＡ分子を提示する分離細胞や、ＴＲＡＰ断片、特に分離された状態の突然変異ウィルス、そしてトランスフェクションされたバクテリアなどがある。ここでいう「断片」とは、ＴＲＡよりは小さいが、前述したようにワクチンとして要求される特性を有するペプチドのことをいう。ＴＲＡとＨＬＡ分子の複合体を含むか、又は、該複合体から成る他のワクチンもある。ここに記載したタイプのワクチンは、予防的に、即ち、癌状態の発生を予防するのに十分な量を対象体へ投与することによって使用可能である。免疫応答の発生は、それがＴ−細胞に関連している場合とＢ−細胞に関連している場合とのいずれの場合においても、提示された腫瘍拒絶抗原に特徴的な効果である。Ｂ−細胞応答については、特に、ＴＲＡに対する、即ち、ＴＲＡに特異的に結合する抗体の発生に関係している。これに加えて、ＴＲＡＰ分子はそれらを免疫原に変えるのに十分なサイズを有しており、そしてこれらに特異的に結合する抗体は本発明の一部である。これらの抗体はポリクローナル又はモノクローナルのいずれであってもよく、後者はここで繰り返す必要のない周知の方法のいずれかを使用して作成される。例えば、ｍＡｂｓは、Ｂａｌｂ／Ｃマウス等の動物モデルを使用して、あるいは、例えばＥＢＶ形質転換体を使用して試験管内で作ることができる。更に、抗血清は、ある種の細胞がＴＲＡを提示する癌状態を有する対象体から分離することができる。このような抗体は、ＴＲＡとＨＬＡ／ＭＨＣ分子との相互反応によって規定されるエピトープに対して発生させることも可能である。上記開示内容を概観することによって、「腫瘍拒絶抗原の提示及び認識」と呼ぶことが可能なシステムには多数の側面が存在することが理解されるであろう。これらの現象の認識によりいくつかの診断上の効果が生まれる。例えば、特異的なＣＴＬクローンまたはＴＲＡに対する抗体の存在によって、対象体からのサンプル中に於けるＣＴＬ、ＴＲＡｓに対する抗体の結合、又は対象体サンプルとの関連に於ける抗−ＴＲＡＣＴＬｓの活動をモニタして癌状態（後に説明する）を診断したりモニタすることが可能になる。同様に、ＴＲＡＰｓに対する核酸分子の発現を、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）、アンチセンスハイブリッド化、プローブ技術、等によってモニタすることができる。体液（血液、血清、その他の滲出液等）、組織及び腫瘍を含む種々の対象体サンプルをアッセイすることができる。診断方法の一具体例は、結核の診断に現在使用されている標準的「ツベルクリンテスト」の応用である。この標準的皮膚テストは、診断補助として、安定状態の「精製タンパク質誘導物」即ち”ＰＰＤ”を投与するものである。同様に、本発明によりＴＲＡｓは、診断補助物質としてのそのような皮膚テストやモニタ一法にも使用可能である。「癌状態」という用語は、ここでは、癌の発生とともに始まる最終的な臨床上の顕在化に到るすべての病理的事象を含むものとして使用されている。腫瘍は「最初から」目に見える腫瘍として発生するのではなく、むしろ、正常な細胞の悪性への形質転換、その後の腫瘍、突然変異等のバイオマスの発育の成長等に関連する様々な事象が存在する。更に、腫瘍が自然に消滅することはめったにないので緩解とは「癌状態」の一部に関するものと理解される。本発明の診断的側面は、一つの細胞の悪性への形質転換から、腫瘍の発達及び突然変異を経る癌発生に関するすべての事象と、緩解とを含むものである。これらのもののすべてがここに含まれている。「対象体」が使用される時、この用語は癌状態にある全ての種を包含する。これは、ヒトと家畜動物、飼育用動物等のヒト以外の動物を含む。本発明には治療的側面も存在する。ワクチンとしてＴＲＡＰｓ及びＴＲＡｓの有効量を投与することの効力については既に上述した。同様に、生体外で特異的ＣＴＬｓを開発し、これらを対象体に投与することが出来る。問題のＴＲＡを提示する細胞に特異的に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体を投与することができる。これらの抗体は、メトトレキセート放射性ヨー素化化合物、リシン等の毒素、他の細胞増殖抑制又は細胞溶解薬等を非限定的に含む特定の抗腫瘍剤に結合させることができる。従って、本発明は「標的化」抗体療法を含み、更に、ＣＴＬｓの使用による癌細胞の除去への応用も含まれる。例３７〜４０からのデータは、ＭＡＧＥ−３から誘導される腫瘍拒絶抗原がＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されることを示している。従って、このＴＲＡＰをコード化する前記核酸分子、この核酸分子を組み込んだ、前記配列によってコード化されるＴＲＡＰ自体、ベクター、細胞系等の他に、本発明は、更に、ＭＡＧＥ−３ＴＲＡＰとＨＬＡ−Ａ１をコード化する分子の組合せもその範囲に含むものである。従って、コトランスフェクション体、両方のコード化配列を含むベクター、キット等の発現システム、又は分離ベクター等のすべてが本発明に含まれる。同様に、前述したワクチンを、ＭＡＧＥ−３からのＴＲＡＰとアジュバントとを組み込むことによって作ることができる。尚、或る種のＴＲＡＰは一つ以上のＴＲＡを産生することがある。ＭＡＧＥ− ３の場合、ここで使用されている意味に於ける抗原Ｄがそこから誘導されることが示され、本発明の一側面は、この分離腫瘍拒絶抗原に関するものである。更に別の側面は、前記ＴＲＡの分離された複合体とその提示分子、即ち、ＨＬＡ−Ａ１である。ＨＬＡ−Ａ１１よって提示されるＭＡＧＥ−３由来ＴＲＡｓの同定によって、様々な治療的及び診断的方法が示唆される。治療的側面、例えば、ＭＡＧＥ−３発現によって特徴付けられる障害の治療を、多種類の方法で行うことが出来る。尚、ここで「障害」とは、ＭＡＧＥ−３が発現される癌（例えばメラノーマ）等のすべての病理状態を指す。本開示に基づく治療方法は、ＨＬＡ−Ａ１細胞等のＴＲＡ提示細胞の溶解に到る、対象体の免疫システムの応答を前提としている。このような方法の一つは、問題の表現型の異常細胞を有する対象体に対して、前記複合体に特異的なＣＴＬｓを投与するものである。当業者は、このようなＣＴＬｓを生体外（試験管内）で開発することが可能であろう。具体的には、血液細胞等の細胞のサンプルを、前記複合体を提示し、かつ特定のＣＴＬの増殖を誘発しうる細胞に接触させる。前記標的細胞は、前述したタイプのＣＯＳ細胞等のトランスフェクション体であってよい。これらのトランスフェクション体は、その表面に所望の複合体を提示し、問題のＣＴＬと結合された時、その増殖を刺激する。ここに使用されているようなＣＯＳ細胞は、容易に入手可能であり、他の適当な宿主細胞も容易に入手可能である。養子移入称される前記治療方法（グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７（１９８６）；レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：２３８（７−１０−９２）；リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３〜１４１０（１９９１）；カスト（Ｋａｓｔ）他，Ｃｅｌｌ５９：６０３〜６１４（１１−１７−８９）について詳述すると、前記所望複合体を提示する細胞を、ＣＴＬｓと結合させ、それに対する特異性を有するＣＴＬｓを増殖させる。次に、増殖されたＣＴＬｓを、前記特定の複合体を提示する異常細胞によって特徴付けられる細胞異常を有する対象体に投与する。すると、ＣＴＬｓが異常細胞を溶解し、所望の治療目的を達成する。上記治療は、対象体の異常細胞の内の少なくともいくつかが前記ＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示するということを前提としている。これは、非常に容易に検出できる。というのは、特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定する方法や、示された配列を含むＤＮＡを発現する細胞を同定する方法はともに当該技術においては周知だからである。このような細胞が一旦分離されると、これらを対象体の異常細胞のサンプルに対して使用し、生体外で溶解を検出することができる。もしも溶解が観察されれば、特異的ＣＴＬｓをこのような治療法に使用することによって、異常細胞に関連する状態を軽減することができる。やや関連性の低い方法としては、標準的アッセイを使用して異常細胞のＨＬＡ表現型を調べ、例えばＰＣＲを使用した増幅によって発現を検出するものがある。本発明によって可能な治療方法は養子移入に限られない。多数の方法を使用して、ＣＴＬｓを生体内で刺激することも可能である。その一つの方法、即ち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用、については既に上に詳述した。この方法において使用される細胞は、照射メラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な遺伝子の片方又は両方によってトランスフェクションした細胞等の、正常に前記複合体を発現するものであってよい。チェン（Ｃｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１１０〜１１４（１９９１年１月）はこの方法を例示しており、これはＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクション細胞の治療方法における利用を示している。様々な細胞タイプを使用できる。同様に、問題の遺伝子の片方又は両方を有するベクターを使用できる。ウィルス性又はバクテリア性のベクターが特に好ましい。これらのシステムにおいては、問題の遺伝子は、例えばワクシニアウィルス又はバクテリア性ＢＣＧによって担持され、これらの物質は実質的に宿主細胞に「感染」する。その結果得られる細胞が目的の複合体を提示し、これらが自己由来ＣＴＬｓによって認識され、次にこれらが増殖する。前記腫瘍拒絶抗原又はその先駆体自身を、問題の前記ＨＬＡ分子を提示するＨＬＡ−Ａ１提示細胞への組み込みを容易にするためにアジュバントと結合させることによっても類似の効果が達成できる。ＴＲＡＰがプロセッシングされて前記ＨＬＡ分子のペプチドパートナーを産生し、一方、それ以上のプロセッシングを必要とせずにＴＲＡが提示される。従って、ＭＡＧＥ−３由来ＴＲＡがＨＬＡ−Ａ１分子、又はなんらかのＨＬＡ分子によって提示される障害を治療することが出来るのである。診断の側面においては、ＴＲＡＰの発現のアッセイによって、ここで使用している意味においての障害を検出することが出来る。これは直接的（例えば、ＴＲＡＰ配列のＰＣＲアッセイによって）又は、ＴＲＡの存在はＴＲＡＰが発現されている、又は、発現されたということを意味するので、ＭＡＧＥ−３由来ＴＲＡのアッセイを通じて間接的に行うことができる。尚、ここには二つの核酸分子、即ち、それぞれがＴＲＡＰＭＡＧＥ−３コード化するＭＡＧＥ−３とＭＡＧＥ−３１とが示されていることが理解されるであろう。又、「ＭＡＧＥ−３ＴＲＡＰコード化する核酸分子」という表現が使用される場合、発現においてこの分子を産生するすべての分子が含まれるものと理解される。そのコード化領域内部においてコドン縮重を示す等の変異、あるいはそのイントロン内の変異等のすべての変異が本発明に含まれる。これまで使用した用語及び表現は記載のための用語であって限定のための用語ではなく、これらの用語及び表現の使用にあたっては図示され記載された特徴構成の均等物を除外する意図は無く、本発明の範囲内においてその他の種々の改変が可能であると理解される。（1）一般情報：（i）出願人：ゴーグラー，ベアトリーチェ；ファン・デン・エインデ，ベノイト；ファン・デア・ブルッゲン，ピエール；ブーン‐ファラー，ティエリー（ii）発明の名称：腫瘍拒絶抗原先駆体MAGE-3をコード化する分離された核酸分子とその利用（iii）配列の数：２６（iv）連絡先：（A）宛名：フェルフェ・アンド・リンチ（B）通り名：サード・アベニュー 805 （C）都市名：ニューヨーク・シティ（D）州名：ニューヨーク（F）郵便番号： 10022 （v）コンピュータ読み取り可能フォーム（A）媒体型式： 5.25 インチフロッピーディスク， 360kb メモリ（B）コンピュータ： IBM （C）オペレーティング・システム： PC-DOS （D）ソフトウェア：ワードパーフェクト（Wordperfect）（vi）現在の出願データ：（A）出願番号： 08/037,230 （B）出願日： 1993年３月26日（vii）先の出願データ：（A）出願番号： PCT/US92/04354 （B）出願日： 1992年５月22日（viii）先の出願データ：（A）出願番号： 07/807,043 （B）出願日： 1991年12月12日（ix）先の出願データ：（A）出願番号： 07/764,364 （B）出願日： 1991年９月23日（x）先の出願データ：（A）出願番号： 07/728,838 （B）出願日： 1991年７月９日（xi）先の出願データ：（A）出願番号： 07/705,702 （B）出願日： 1991年５月23日（xii）弁理士／代理人情報：（A）氏名：ハンソン，ノーマン，ディ（B）登録番号： 30,946 （C）参照／書類番号： LUD253.5 （xiii）通信情報：（A）電話：（212）688-9200 （B）ファックス：（212）838-3884 （2）配列認識番号１の情報：（i）配列特徴：（A）長さ： 462基本ペア（B）タイプ：核酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：ゲノムDNA （xi）配列の記述：配列認識番号１：（2）配列認識番号２の情報：（i）配列特徴：（A）長さ： 675基本ペア（B）タイプ：核酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：ゲノムDNA （xi）配列の記述：配列認識番号２：（2）配列認識番号３の情報（i）配列特徴：（A）長さ： 228基本ペア（B）タイプ：核酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：ゲノムDNA （xi）配列の記述：配列認識番号３：（2）配列認識番号４の情報：（i）配列特徴：（A）長さ： 1365基本ペア（B）タイプ：核酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：ゲノムDNA 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【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年２月１０日【補正内容】特許請求の範囲：１．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３をコード化する分離された核酸分子、およびＨＬＡ−Ａ１をコード化し、プロモーターと作動可能に連結される、分離された核酸分子を含む発現ベクター。２．（ｉ）腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３をコード化する分離された核酸分子、および（ｉｉ）ＨＬＡ−Ａ１をコード化する分離された核酸分子、でトランスフェクションされた細胞系。３．請求項１記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞系。４．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３をコード化する分離された核酸分子でトランスフェクションされた、ＨＬＡ−１を発現する細胞系。５．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３より誘導される腫瘍拒絶抗原ＤとＨＬＡ −Ａ１の分離された複合体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ファン・デン・エインデ，ベノイトベルギー国ビー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ブーン‐ファラー，ティエリーベルギー国ビー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ファン・デア・ブルッゲン，ピエールベルギー国ビー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459

Claims

【特許請求の範囲】１．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３をコード化する核酸分子をコード化する、又は、該核酸分子に対して相補的な、分離された核酸分子。２．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３をコード化する請求項１の分離された核酸分子。３．請求項２の核酸分子であって、前記分子はｃＤＮＡである。４．請求項３の核酸分子であって、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１（ＭＡＧＥ−３）又は配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２（ＭＡＧＥ−３１）に示されるヌクレオチド配列を有する前記核酸分子。５．プロモータに作動可能に結合された請求項２の核酸分子を有する発現ベクター。６．請求項５の発現ベクターであって、更に、ＨＬＡ−Ａ１をコード化する核酸分子を有する。７．請求項２の核酸分子でトランスフェクションされた細胞系。８．請求項７の細胞系であって、前記核酸分子はＨＬＡ−Ａ１を発現する。９．請求項７の細胞系であって、更に、ＨＬＡ−Ａ１コード化する核酸分子でトランスフェクションされている前記細胞系。１０．請求項２の核酸分子によってコード化される分離された腫瘍拒絶抗原先駆体。１１．請求項１０の分離腫瘍拒絶抗原先駆体とアジュバントとを含むワクチン。１２．請求項１０の腫瘍拒絶抗原先駆体から誘導された分離された腫瘍拒絶抗原であって、前記腫瘍拒絶抗原は抗原Ｄである。１３．請求項１２の腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ１との分離された複合体。１４．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３の発現によって特徴付けられる障害の治療方法であって、ＭＡＧＥ−３から誘導された腫瘍拒絶抗原とヒト白血球抗原分子との複合体に対する特異性を有する細胞溶解Ｔ細胞を、前記複合体に対する免疫反応を発生させるのに十分な量だけ、対象体に対して投与することを含む方法。１５．請求項１４の方法であって、前記ヒト白血球抗原はＨＬＡ−Ａ１である。１６．請求項１５の方法であって、前記腫瘍拒絶抗原は抗原Ｄである。１７．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３の発現によって特徴付けられる障害の治療方法であって、ＭＡＧＥ−３から誘導された腫瘍拒絶抗原とヒト白血球抗原との複合体に対する免疫応答を引き起こすのに十分な薬剤を、それを必要とする対象体に投与することを含む方法。１８．請求項１７の方法であって、前記ヒト白血球抗原はＨＬＡ−Ａ１である。１９．請求項１８の方法であって、前記腫瘍拒絶抗原は抗原Ｄである。２０．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３の発現によって特徴付けられる障害の検出方法であって、対象体から採取されたサンプルを、前記腫瘍拒絶抗原先駆体を同定する薬剤と接触させて、前記腫瘍拒絶抗原先駆体の発現を、前記障害の判定として検出することを含む方法。２１．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−３の発現とそれから細胞により誘導された腫瘍拒絶抗原の提示によって特徴付けられる障害の検出方法であって、対象体から採取されたサンプルを、前記腫瘍拒絶抗原を同定する薬剤と接触させて、前記腫瘍拒絶抗原の発現を、前記障害の判定として検出することを含む方法。