JPH08507365A

JPH08507365A - Ｄｎａフラグメントのヌクレオチドのサイズの測定方法

Info

Publication number: JPH08507365A
Application number: JP6503021A
Authority: JP
Inventors: パヌチエ，クリストフ
Original assignee: アンスティチュナショナルドラサンテエドラルシェルシュメディカル（アンセルム）; アンスティチュパスツール
Priority date: 1992-07-03
Filing date: 1993-07-02
Publication date: 1996-08-06
Anticipated expiration: 2017-03-04
Also published as: WO1994001581A1; JP3261426B2; ATE161588T1; DE69316028T2; DE69316028D1; CA2139306A1; FR2693209A1; EP0672184A1; US5795455A; FR2693209B1; CA2139306C; EP0672184B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ｉ）各検知ＤＮＡフラグメントの移入時間を測定し、そして、ii）各検知されたＤＮＡフラグメントのサイズを、その移入時間で補間する工程により特徴づけられる；ゲル電気泳動法により分離されたＤＮＡフラグメントのヌクレオチドサイズの測定方法である。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡフラグメントのヌクレオチドのサイズの測定方法発明の技術分野本発明は、ＤＮＡフラグメントのヌクレオチドサイズを測定することを可能にする方法に関する。本発明による方法は、ゲル電気泳動法によりＤＮＡフラグメントを分離する方法を利用するものである。発明の背景分野ラベルされたＤＮＡフラグメント、例えば、螢光マーカーでラベルされたものを、ゲル電気泳動法で分離し検知することは、当業者にとり周知のものである。これらの機能を果たすことができる種々の装置は、市場に知られている。これらの既知の装置のなかで、アプライドバイオシステム社からの３７３Ａとして市販されている自動化ＤＮＡ連鎖決定のための自動化ゲル電気泳動装置が記述されている。この装置は、米国特許第４,８１１,２１８号に記載されている。ゲル電気泳動法によるＤＮＡフラグメントの分離のための既知装置は、一般的に次のようなものを備える。 −例えば、予めラベルされたＤＮＡサンプルを受け入れることができるポリアクリルアミド或いはアガローズにより作成されたゲルよりなる移入のための平らな支持体 −電気泳動法によるＤＮＡフラグメント分離を行なうための支持体ゲルの端部の間を接続する、典型的には、１０００〜１５００Ｖの高電圧連続電力源 −後者の基礎に置かれた、支持体ゲル上に次々に移入されるＤＮＡフラグメントの検知器具 −検知器具から出力されたデータを記録し及び処理するための器具。ＤＮＡサンプルは、当業者に周知の種々の技術により作成される。これらの作成技術は、一般的には、単一ストランドの、或いは二重ストランドのＤＮＡ核酸配列を、試験管内で、酵素を利用する方法で、即ち、特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、或いは、ＳＤＡ（ストランドディスプレイスメントアンプリフィケイション：Strand Displacement Amplification）技術により、行なわれる。試験管内での増幅反応技術は、特に、ＰＣＲ或いはＳＤＡによるものは、文献に説明されている。特に、ヨーロッパ特許公報２０１１８４及び２００３６２に、ＰＣＲの基礎技術について説明されている。所謂、ＳＤＡ増幅技術は、１９９１年１１月２０〜２２日に開催された核酸についてのサンチャゴ大会中に、説明された。これらの酵素ＤＮＡ増幅方法において、配列の増幅は、連鎖サイクルにより行なわれる。各サイクルは、数段階を有する： −それらを補間するＤＮＡフラグメントの５’末端に、特定のオリゴヌクレオチドプライマをハイブリッド化する段階、そして、 −プライマの３’末端から、ＤＮＡポリメラーゼの助けにより拡張させる段階。ＤＮＡフラグメントのための掛算因子は、各サイクルでの理論上２である。ＰＣＲ−タイプ酵素ＤＮＡ増幅技術において、サンプルは、各サイクルの終わりに熱変成される。熱安定性のポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼを使用すると、種々の段階は、その操作温度のみ異なる自動化サイクル機（熱変成／アニール／酵素重合化）を操作することが可能になる。変成条件は、一般的に、９０℃以上に反応媒体の温度を上昇させること、そして、アニールは、５０〜７０℃の間で行なわれ、ＤＮＡポリメラーゼによる拡張は、比較的に高温で行なわれ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、７０℃のオーダーである。他方、他の酵素的ＤＮＡ増幅技術、例えば、ＳＤＡ技術のようなものでは、各サイクルの終端で得られた生成物は、熱変成されない。それらは、等熱的な方法である。ＳＤＡ増幅方法は、制限酵素、例えば、酵素Hinc IIにより認識されたＤＮＡ配列の添加により、５’位で変成されたオリゴヌクレオチドプライマの使用に基づく。この方法は、硫黄−含有のデオキシアデノシン三燐酸塩を結合されることによりチオ化された制限位を形成する必要があり、部分的に水和させる（単一ストランド上で）、該Hinc II酵素の反応を必要として、更に、新規なストランドを、水和点から合成するＤＮＡポリメラーゼを必要とし、従来カットする核酸配列の同時配置変えを伴い、そして、変成は必要でない。変更されたプライマを、目的点まで、アニールすることは、ＤＮＡの変成の第１段階のみを必要とする。従って、反応は、３７℃で生じる。フラグメントのラベル化は、一般的に、少しの更なる増幅サイクルを助けで、放射線元素でラベルを示すプライマオリゴヌクレオチドの存在下で、行ない、或いは、酵素ラベル化或いは好適には、発螢光体に基づく螢光ラベルするものである。移入−支持体ゲルは、一般的に、数個のパラレルレーン、例えば、２４個のレーンを有する。発螢光体に基づいた螢光ラベルの好適な場合には、検知器具は、励起のためのシステム（例えば、レーザ或いはハロゲンランプ）及び励起されたサンプルにより生成された螢光放射線に敏感なセンサを有する。ある装置では、ミラー具を、ゲルのベースの反対側に往復運動し伝送運動が得られる担体上に置き、励起放射線を、サンプル上に反射させ、螢光放射線を、センサに反転させる。他の装置においては、励起放射線は、ゲル厚に直接に送られ、電気泳動の方向に直角に、そして、ゲル平面に平行に送られる、一方、センサ列は、螢光信号を収集している。センサは、この振幅が、特定閾値より小さくするという条件において、その振幅が検知された螢光色素の濃度に比例する信号を配分する。更に、特定の装置に対して、異なる”色素”の４つの発螢光体を同時に使用することは、周知であり、それは、各レーンで、４つの異なるラベルされたサンプルを置くことを可能にする。そのために、モニターされたフィルター組、例えば、センサの上流で、連続的に運動する４つのフィルターを有する車輪を有することが単に必要であり、それにより、各、放射線を連続的に検出し、そして、各サンプルを検出する。本発明は、例えば、フランスに、１９９１年９月１日に出願した特許出願第９１００１８９号に記載されている免疫システムのレパートリを説明する方法を利用するものである。この方法は、基本的に次のものを特徴とする。 −生物学的なサンプルで開始し、含有するｍＲＮＡｓの逆転転写を行なう。 −転写生成物上に（サンプルから抽出したＤＮＡ上に直接に）、問題のレパートリ及び間題のレパートリの一定のセグメントでアニールするＣの種々のセグメントに相当する各プライマ対Ｖ、Ｃ、Ｖに対して、増幅物を分離する。 −各々のこれらの増幅生成物に対して、各、レパートリのセグメントＪに、ラベルされ、このセグメントＪとテンプレイトとして増幅生成物に特定されるオリゴヌクレオチドを、プライマとして使用する拡張工程。 −得られたトリプレットＶ、Ｃ、Ｊに相当する各拡張生成物に対して、種々の生成物のサイズ及び量が示される。 −レパートリの説明は、トリプレットＶ、Ｃ、Ｊに相当するレパートリの各々の要素のために、行なわれ、該レパートリ中のこの要素の量の測定により、要素のサイズに相当するレパートリの各々のために行なわれる。免疫システムのレパートリを説明するこの方法を適切に理解するに有利な方法は、フランス特許出願第９１００１８９号に記載されている。本発明は、関心のＤＮＡフラグメントを、１９９１年１１月１５日にフランスに出願した第９１１４０８９号特許出願の明細書に記載される定量的な増幅法により、測定する方法を参照する。この方法は、本質的に、次のことを特徴とする。１）関心のＤＮＡフラグメントを含有する分析すべきサンプルに、関心のＤＮＡフラグメントとは異なるが、同じプライマオリゴヌクレオチドにより増幅される標準的ＤＮＡフラグメントを添加する。標準的ＤＮＡフラグメント及び関心のＤＮＡフラグメントは、配列が異なり、そして／或いは、サイズは、約１０％以内で、好適には、１ストランド当り５以下のヌクレオチド、異なる。２）関心のＤＮＡフラグメント及び標準的ＤＮＡフラグメントは、同じプライマオリゴヌクレオチドと、共増幅され、好適には、これらのＤＮＡフラグメントの混合物を増幅し、飽和まで行なう。３）段階２）で得られた反応媒体に、関心のＤＮＡフラグメントと標準的ＤＮＡフラグメントに特定され、そして、段階２）の該プライマオリゴヌクレオチドとは異なる１以上のラベルされたプライマオリゴヌクレオチドを添加し、そして、１以上の更なる増幅サイクルを、該ラベルされたプライマオリゴヌクレオチドで行なわれ、サイクル中で、ＤＮＡの変成後、該ラベルされたプライマオリゴヌクレオチドは、適当な位置で、該フラグメントで、アニールされ、それにより、ＤＮＡポリメラーゼによる拡張が、異なるサイズ及び／或いは配列のラベルされたＤＮＡフラグメントを生成し、或いは、関心のＤＮＡフラグメントから、或いは標準的ＤＮＡフラグメントから、各々、得られるか否かに依存する異なるマーカーにより、行なわれる。次いで、４）関心のＤＮＡフラグメントを最初に量的に測定し、それは、初期の標準的なＤＮＡフラグメントの生成物として、関心の増幅されたＤＮＡフラグメントの量と、増幅された標準的なＤＮＡフラグメント量との間の比率として測定され、そして、各々、関心の増幅されたＤＮＡフラグメントと段階３）で得られた標準的なＤＮＡフラグメントから得られた、ラベルされたＤＮＡフラグメントの量のものと等しい比率を測定する。特別の具体例によると、上記の方法の最後の段階を決めることは、次のように行なう。 −関心のＤＮＡフラグメント及び標準的なＤＮＡフラグメントを増幅してから、得られたラベルされたＤＮＡフラグメントを、ゲル電気泳動法により、そのサイズに従って、分離し、次いで、 −関心のＤＮＡフラグメント及び標準的なＤＮＡフラグメントから各々得られたラベルされたＤＮＡフラグメントのための各々のプライマに対するマーカーに相当する信号の強度を検知する。このフランス特許出願第９１１４０８９号での記載からは、関心のＤＮＡフラグメントの量を測定する方法を、適切に理解することができ、そして、それを参照できる。既知の技術においては、ＤＮＡフラグメントのヌクレオチドサイズが、本当に基本的な方法で評価され、検知サンプルの位置を、ラベルされたサイズ標準値の位置と関連させて、そのラベルされたサイズ標準値の位置は、支持体ゲル上にコード配置され、測定されるべきサンプルと同じ電気泳動にかけるものである。発明の概要本発明の目的は、ＤＮＡフラグメントのサイズを、より詳細に測定できる新規な手段を提供することにより、従来技術を改良することである。この目的は、本発明により、以下のものよりなる段階を有する方法により、達成される：ｉ）各、検知されたＤＮＡフラグメントに対して、予め決めた定数長に、移入時間を測定し、そして、 ii）各々、検知したＤＮＡフラグメントのサイズを、その移入時間で較正する。発明の詳細な説明本発明の長所によると、各、検知ＤＮＡフラグメントのサイズとその移入時間との間で較正（コレレイション）は、次の法則に基づいて確立される。Ｌ（t）＝Aexp［−Ｂ／（t＋t₀）］＋Ｃ（但し、Ａ、Ｂ、Ｃは、定数であり、ｔは、移入時間を示し、時間定数を表示する。Ｌ（t）は、検知されたＤＮＡのヌクレオチドの長さを示す）本発明の他の特徴、目的及び長所は、詳細な下記の説明から、分かり、そして、その添付図に関連している。図面の簡単な説明図１は、本発明により方法での一般的な概略流れ図を示す。図２〜７は、本方法での流れ図の特定な段階の形で示すものである。図８は、以下の明細書に記載されるすべての段階での較正する一般的な流れ図を示す。上記に示されるように、本発明による方法は、ＤＮＡフラグメントのヌクレオチドサイズを測定するようになっており、ゲル電気泳動法によるＤＮＡフラグメント分離方法を利用する。この分離方法は、既知であるが、従って、上記のように、その本質的な特性は、以下の明細書に詳細に説明される必要はない。上記に述べるように、本発明は、既知のサイズの標準値が支持体ゲル上にコード配置される方法を利用する。好適には、既知サイズの標準値は、３つのコントロールレーン上に、即ち、支持体ゲルの２つの側面端及びその中心に、配置される。特に、本発明は、既知のサイズの標準値が、支持体ゲル上にコード位置されたものである方法を利用する。好適には、既知サイズの標準値が、３つのコントロールレーン上に、即ち、支持体ゲルの２つの側面端上と、その中心に、析出される。支持体ゲルの各コントロールレーン上にコード配置されたサイズ標準値の数ｎは、使用者により選択できる。然し乍ら、好適には、５つのサイズ標準値が、各コントロールレーン上に配置される。限定的でない実施例により、これらの５つの既知サイズの標準値は、各々、９６、１１４、１４０、１５７及び１７６のヌクレオチドである。図１に概略されるように、本発明の方法は、好適には、ａ）ラベルされたＤＮＡサンプル及びゲル上にコード配置されたラベルされたサイズ標準値をゲル電気泳動を行なう（図１の段階１００）：ｂ）検知器具のセンサから出力された信号を検出し、記録し（図１の段階２００）：ｃ）測定したデータをフィルタリングし（図１の段階３００）：ｄ）検出されたＤＮＡフラグメントのサイズを測定し（図１の段階４００）；ｅ）得られた結果を可視化する（図１の段階５００）。好適な場合、フィルタリング段階３００は、記録段階２００の前に、行なうことができる。好適には、段階２００で、センサからの出力の曲線が、各、測定レーン当りの１ファイルの率で、各々の特定のファイル中に記録される。フィルタリング相３００は、好適には、図２に概略されるように、ランクゾス（Lanczos）の重畳により変成された低−パスフィルタリングの最初の段階２１０を有し、好適には、調整できるカットオフ周波数及び調整できるウィンド幅を有するフィルターの助けにより、高周波数雑音を除去する。ランクゾスのウィンドの幅も調整できる。最後に、フィルタリング相３００は、どの点でも得られたベースラインを、フィルタされた曲線の最小値として、測定されたウィンド値で、減算するための最終段階３２０を有する。このウィンド幅は、勿論、ピーク幅より相当に大きいものであり、好適には、このウィンド幅は調整できるものである。検知されたＤＮＡフラグメントのサイズを測定するための段階４００が、以下説明される。上記のように、本発明によると、ＤＮＡフラグメントのサイズの測定のための原理的な段階は、各、検知されたＤＮＡフラグメントの移入時間を測定した後、各、検知されたＤＮＡフラグメントのサイズＬを、次の式を助けで、その移入時間と比較するものである。Ｌ（t）＝Aexp［−Ｂ／（t＋t₀）］＋Ｃ（但し、Ａ、Ｂ、Ｃは定数であり、ｔは、移入時間を示し、時間定数を表示している）。より精密には、図３に概略するように、段階４００は、次のものよりなる。ａ）その移入時間ｔ_iを測定したサイズ標準値（図３の段階４１０）を含有する各コントロールレーンに対して、係数Ａ、Ｂ、Ｃを測定し；ｂ）測定レーンに対して、コントロールレーン中測定した移入時間ｔ_iを内挿し（図３の段階４２０）；ｃ）この内挿から、パラメータＡ、Ｂ、Ｃの値を、各測定レーンに対して、測定し（図３の段階４３０）；ｄ）各、ゲルレーンについて確立した上記の法則（図３の段階４４０）に基づいて、ＤＮＡフラグメントのサイズを測定する。段階４１０は、図４の流れ図の形に示される。この段階４１０は、相当するファイルでのｉサイズ標準値の取得のための段階４１１から開始される。この段階４１１は、その詳細は、図５に示されるが、次のように行なわれる。第１の相４１１０では、装置は、欠陥により固定されるが、使用者により変更できる測定ウィンド中で、ｉ放射線ピークを自動的に調査する。この調査は、測定された強度ピークを、ｉピークが得られるまで徐々に低減される（段階４１１２）閾値と比較する（段階４１１１）ことにより行なわれる（段階４１１３）。上記の第１の相４１１０が、所望のｉピークを得ることを可能にする場合、装置は、第２相４１１４まで、通過せしめ、そこでは、使用者が、段階４１１５でウィンド幅を変更し、上記の自動的調査相４１１０を再スタートさせるか、或いは、既知の手段（例えば、スクリーン上を動くポインターの助けで）で、所望のピークを、スクリーン上に可視化した測定曲線の再表示する上で、同定することにより、マニュアルでサーチを行なう（段階４１１６）ことができるというものである。図４に示されるように、サイズ標準値が、自動的に、或いはマニュアルで、段階４１１で、標準値の取得のために、同定すると、この段階は、既知長さＬ_iの標準値の移入ｔ_iを測定するための段階４１２に後続され、そして、この測定に基づいてそれらの標準値に対して係数Ａ、Ｂ，Ｃを計算する段階４１３になる。段階４１２で測定されたサイズ標準値の移入時間ｔ_iは、時間原点からの、支持体ゲルのベースで置かれた検知器具のセンサに届くに必要な時間に相当する。この時間原点は、時間定数が零である場合の、電気泳動の開始点に相当する。時間原点は、電気泳動の開始後に、その場合、その時間定数は、電気泳動の開始と考慮される時間原点との間の間隔に等しいものである。従って、使用者は、一度、そして、すべてに、このパラメータの値を導入する。従って、ｔ₀＝０を、表示モードを単純化するに使用する。段階４１３は、図６に示される。段階４１３では、係数Ａ、Ｂ、Ｃを、次の最小平方誤差関数により、先ず計算する。（但し、ｎは、標準ＤＮＡフラグメントの数である）この関数ｆ（Ａ,Ｂ,Ｃ）ののＡ、Ｂ、Ｃに対する部分偏差半数が、零である；係数Ａ、Ｂ、Ｃの値を調査することにより、計算される。Ｂのみの関数としての１つが、このようにして得られた３つの式のシステムは：（但し、は、Ｘ（1）、．．．．Ｘ（n）の平均値である。）第１の上記の式は、定数Ｂの値を測定することを可能にする。そして、定数Ｂを得るとき、定数ＡとＣは、最後の２つの上記の式に基づいて得られる。係数Ａ、Ｂ、Ｃが、種々の標準レーンに対して段階４１３０で得られたときに、Ａ、Ｂ、Ｃ値は、関数ｆ（Ａ,Ｂ,Ｃ）或いはＬ（t）＝Aexp［−Ｂ／（t＋t₀）］＋Ｃの関数の段階４１３１に適用され、このように測定された理論的サイズと既知の固定値Ｌｉの間の差は、ベースの予め決めた数に等しい所定の閾値よりも小さいものである標準値の各々の既知固定の値Ｌｉに対してチエックすることができる（段階４１３２）。このような場合では、本発明による方法は補完段階４２０により続けられる。また、このような場合ではないとき、係数Ａ、Ｂ、Ｃの計算は、ベースの予め決めた数により決められた閾値を変更した後に、段階４１３３での使用者により、最適化のために、繰り返す。補完段階４２０の目的は、標準レーンのために測定された各レーンに基づいてサンプルを測定するための各レーンに対する標準でないマーカーのための移入時間ｔ_iの値を決めるためである。補完段階４２０の目的は、支持ゲル幅に沿った移入パラメータの分散による測定誤差を低減させるためである。これは、リニア補完法である。然し乍ら、本発明の枠組内で、放物線タイプ補完法を行なうことができ、例えば、シンプソン補完法を行なうことができる。放物線タイプ補完法では、リニア補完よりも、より精密な結果を得る。最後に、段階４２０において、係数Ａ、Ｂ、Ｃの値は、補完法から得られたｔ_i 値から各測定レーンで、測定され、上記の式の助けにより、これを決める。実際上、すべてのサンプルは、ゲル上に同時に測定できないという要件がある。ほとんど、支持ゲルは、共通の時間原点を有する偶数のレーンと、共通の時間原点を有する非偶数のレーンを有するが、偶数のレーンに対応する時間で分割される。この場合、サイズ標準値は、種々の測定レーンと同じ原点での各々の支持ゲル上にコード位置される。従って、各々、偶数及び非偶数のレーンに相当する異なる原点を有するサイズ標準値に対して、係数Ａ、Ｂ、Ｃを計算することが必要であり、更に、各々、偶数及び非偶数の測定レーンに対して、各補完を行なうことが必要である。即ち、段階４１０及び４１２は、各測定レーン原点に対して、繰り返す。係数Ａ、Ｂ、Ｃが既知であり、各測定レーンに対して、好適には、メモリしてある場合、段階４４０を行なう。図７に示されるように、この段階４４０は、３つのサブ段階に、次のように、分割される：ａ）ＤＮＡフラグメントに相当する測定信号のピークの取得。この取得は、測定信号の振幅を、閾値と比較することにより、自動的に行なうことができる。この閾値は、この閾値は、考慮されるウィンド幅と同様に、調整することができる。有用なピークの取得は、マニュアルで行なうことができる。従って、操作者は、上記のように、ＤＮＡフラグメントに相当する信号のピークをマニュアルで探し、図５に示されるように、標準値の取得のために、行なわれる。ｂ）標準値のための段階４１２で上記のように、ＤＮＡフラグメントの移入時間の段階４４２で測定する。ｃ）次の式に基づいて種々のＤＮＡフラグメントのサイズの段階４４３で計算する：Ｌ（t）＝Aexp［−Ｂ／（t＋t₀）］＋Ｃ結果を完全に計算するとき、その表示は、段階５００で適当な形で、可視化できる。例えば、フランス特許出願第９１００１８９号に示される免疫システムのレパートリを記述する方法の枠組内で、結果は、２つの軸が、プライマーＶとＪに相当し、一方、第３の軸が、検知したＤＮＡセグメントのサイズ値に相当している３デイメンジョンマトリックスの形に示される。マトリックスの区割Ｊ／サイズの種々のラインに相当している種々の分折サンプルは、１つのラインから他のラインで異なる各々のＪプライマに相当する。これらの種々のＪプライマは、異なる収率を有する。従って、１つのラインより他のラインに表示される値を比較することを可能にするために、Ｊプライマの収率の関数として、測定された値は、可視化を行なう前に、標準化される。同様に、Ｖプライマは、異なる収率を有する。従って、種々の区割Ｊ／サイズに表示される値を直接比較できるために、１つの区割から他の区割で測定される値は、好適には、表示を行なう前に、関心のあるＤＮＡフラグメントの量を決めるについての、フランス特許出願第９１１４０８９号に基板される方法により行なわれる定量測定法に基づいて、標準化される。本発明は、ＤＮＡフラグメントのサイズの精密測定を、非常に改良することを、可能にする。特に、電気泳動法で移入されたＤＮＡフラグメントを、既知のコード位置された標準値と、当業界技術により、粗く比較すると、精度１〜２％でＤＮＡフラグメントの長さを知ることができるが、一方、本発明によると、測定精度は、０．３％のオーダーである。勿論、本発明は、上記に記述した特定の具体例に限定されるものでなく、その精神に従う種々の例にできるものである。特に、上記のように、異なる波長を発するいくつかの発螢光体を同時に使用する場合、色素の積層を解消する最初の方法により記述された方法を行なうことは、好適である。まったく、多重の発螢光体の場合、検知された螢光信号は、副色素チャンネルになるものであるが、センサの正面に位置するフィルターの不完全性により、そのものが、他の３つのチャンネルで、より基本的でない。これらの望ましくない信号をなくすために、記録されたデータは、ｐライン（ｐは、使用された発螢光体の数を示す）とｎ点（ｎは、電気泳動中に行なわれた測定点の数である）のマトリックスを、装置の平方マトリックス（ｐ×ｐ）特性で乗じることによる操作を行なうことができる。このリニア変換を行なうと、色素に対して、信号に望まないものが、実際上、完全に除くものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ 7363−2ＪＧ０１Ｎ 27/26 ３０１Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．ｉ）各検知ＤＮＡフラグメントに対して、予め決めた一定の長さで、移入時間を測定し、そして、 ii）各検知されたＤＮＡフラグメントのサイズを、その移入時間で補間することによる段階を有することにより特徴づけられるゲル電気泳動法により分離されたＤＮＡフラグメントのヌクレオチドサイズの測定方法。２．各検知ＤＮＡフラグメントのサイズ（Ｌ）と移入時間との間の補間法は、以下の法則に：Ｌ（t）＝Aexp［−Ｂ／(t＋t₀)］＋Ｃ（但し、Ａ、Ｂ、Ｃは定数であり、ｔは移入時間を示し、時間定数を表わしている）基づいて決められることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。３．各検知されたＤＮＡフラグメントのサイズ（Ｌ）とその移入サイズとの間の補間法は、次の法則；Ｌ（t）＝Aexp［−Ｂ／t］＋Ｃ（但し、Ａ、Ｂ、Ｃは定数であり、ｔは移入時間を示す）に基づいて決められることを特徴とする請求項１或いは２に記載の測定方法。４．既知のサイズの標準値は、ゲル上でのコード位置決めされ、次の関数（但し、Ｌ_iは、析出されたサイズ標準値の既知の長さを示し、ｔ_iは、各これらの既知の標準値の移入時間を示す）のＡ、Ｂ、Ｃに対するフラクション偏差値は、零である場合、係数Ａ、Ｂ、Ｃの値は、既知サイズの標準値に対して計算されることを特徴とする請求項２或いは３に記載の測定方法。５．既知サイズの標準値は、所望のｉピークが得られるまで、徐々に低減される閾値を有する調整できる測定ウィンド中で検知された測定曲線を比較することにより、自動的に得られることを特徴とする請求項４に記載の測定方法。６．既知のサイズの標準値は、マニュアルで取得されることを特徴とする請求項４に記載の測定方法。７．係数Ａ、Ｂ、Ｃは、次の式にである）に基づいて決めることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の測定方法。８．係数Ａ、Ｂ、Ｃは、各考えられるサイズ標準値に対して適用され、式Ｌ（t）＝Aexp［−Ｂ／（t＋t₀）］＋Ｃにし、このようにして得られたサイズ値は、既知のサイズ値と比較され、係数Ａ、Ｂ、Ｃの計算の処理を続け、測定サイズと標準値の既知サイズとの間の誤差は、所定の閾値を超える場合に、最適化するために、既知サイズ値と比較されることを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の測定方法。９．更に、各測定レーンに対して、既知サイズの標準値の測定されるｔ_i位置を補間することにより、係数Ａ、Ｂ、Ｃを測定し、そして、該補間から得られるｔ_i 値から、係数Ａ、Ｂ、Ｃを計算することを特徴とする請求項４〜８のいずれかに記載の測定方法。１０．該補間法は、リニア補間であることを特徴とする請求項９に記載の測定方法。１１．該補間法は、放物補間タイプであることを特徴とする請求項９に記載の測定方法。１２．該補間法はシンプソン補間法であることを特徴とする請求項１１に記載の測定方法。１３．電気泳動法に使用される支持ゲルは、各々、分離される時間原点を有する測定レーンの連続であり、その方法は、サイズ標準値のための係数Ａ、Ｂ、Ｃを計算し、その後、サイズ標準値により得られたｔ_i位置の補間を行ない、次に、各々の移入の時間原点の対して、測定レーンの上で、各々の相当する係数Ａ、Ｂ、Ｃを計算する工程よりなることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の測定方法。１４．センサから導かれた曲線は、好適には、１ファイル／１測定レーンの割合で、貯蔵されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の測定方法。１５．センサから導かれた曲線は、フィルタリングにかけられることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の測定方法。１６．フィルタリング段階は、低−パスフィルタリングであることを特徴とする請求項１５に記載の測定方法。１７．フィルタリング段階は、ランクゾスフィルタリングであることを特徴とする請求項１５或いは１６に記載の測定方法。１８．更に、ベースラインを、測定曲線から減算する段階を有することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の測定方法。１９．免疫システムのレパートリを記述する方法のフレーム枠内で行なわれ、２つの軸は、Ｖ及びＪプライマーに相当しており、一方、第３の軸は、検知したＤＮＡフラグメントのサイズ値に相当している３デイメンジョンマトリックスの形でのレパートリを可視化し、そして、更に、マトリックスの各区域Ｊ／サイズ上に可視化する前に、Ｊプライマーの収率の関数として測定された値を標準化する段階を有することを特徴とする請求項１〜１８のいずれかに記載の測定方法。２０．マトリックスの表示を行なう前に、測定された値を、１つの区域Ｊ／サイズから他の区域Ｊ／サイズへ、標準化することを特徴とする請求項１９に記載の測定方法。２１．ＤＮＡフラグメントに相当する信号のピークが、マニュアルで取得されることを特徴とする請求項１〜２０のいずれかに記載の測定方法。２２．ＤＮＡフラグメントに相当する信号のピークが、自動的に取得されることを特徴とする請求項１〜２０のいずれかに記載の測定方法。