CN113539373A - 一种dna样品中不同长度dna的条数分布的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,其将DNA样品与已知长度和质量的DNA标记物通过电泳等实验进行长度筛分,利用DNA电泳荧光条带图等DNA长度筛分实验结果进行参数提取和拟合,推导出不同长度的DNA的条数分布;本发明提供的分析方法与现有技术相比,具有仪器便宜、操作简单、数据分析准确等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医学信息技术领域,具体是一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法。
背景技术
DNA片段的长度是一项重要的DNA样品信息。DNA样品中不同长度DNA的条数分布的研究对于诸多DNA生物技术和医学应用具有重要的意义。例如,在基因测序和基因杂交检测时,需要将DNA进行打断并选用特定长度的DNA片段;在人工质粒构建时,需要将DNA样品进行长度筛分,测量DNA长度并提取某一长度的DNA。在这些涉及到DNA长度信息的诸多生物和医学技术的使用过程中,针对DNA样品中不同长度DNA的条数分布分析具有重要的意义。
现有的DNA样品中不同长度DNA的条数分布的测量分析方法依然有很多不足。例如,分析DNA长度信息的通用的凝胶电泳方法(专利CN105506748A),以及微流芯片中的DNA长度筛分方法(专利CN105506748B),可以直接得到的是DNA样品按照长度排列后的荧光强度分布,直接测量得到的是DNA样品中不同长度DNA的荧光强度分布,而不是不同长度DNA的条数分布,因此简单的类比将导致误差;光镊、磁镊、原子力显微镜、DNA分子梳、微流沟道中流场拉伸等单分子DNA拉伸实验能够逐一测量单分子DNA的长度进而获得不同长度DNA条数的统计分布,但是该方法操作复杂,数据分析成本高、时间长。因此,仪器便宜、操作简单、分析准确快速的不同长度DNA条数分布测量分析方法依然有待开发并具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对目前不同长度DNA的条数分布的检测分析方法存在的不足,提出了一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,解决了现有方法误差较大、操作复杂、数据分析成本高、时间长等问题。
为实现以上目的,本发明通过以下技术方案予以实现:
一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,包括:
将待测DNA样品与DNA标记物进行长度筛分,即将DNA样品中的DNA分子按照分子量大小的顺序进行排布;并通过利用DNA荧光成像仪作出DNA荧光强度条带图等方式,获得DNA长度筛分结果;从DNA长度筛分结果中提取和拟合参数关系,根据提取和拟合的参数关系推导得出DNA样品中不同长度的DNA的条数分布情况;
所述DNA标记物是由几种不同长度的DNA片段混合组成,且各DNA片段的长度和总质量均已知。
进一步的,长度筛分方法包括凝胶电泳、毛细管电泳及微流芯片筛分方法中的任意一种或多种。
进一步的,从DNA长度筛分结果中提取和拟合的参数关系包括:
DNA分子迁移位置MD和迁移位置处荧光强度FI|MD的关系:FI|MD=f1(MD);(该关系从DNA长度筛分实验的DNA样品和DNA标记物的荧光强度条带图中提取)
迁移位置MD与该处DNA分子的长度FL之间的关系:MD=f2(FL);(该关系从已知DNA片段的长度的DNA标记物的荧光条带图中提取获得)
进一步的,根据提取和拟合的参数关系进行推导可得出长度为FL的DNA分子的条数关系:
基于此得出DNA条数分布。
进一步的,DNA分子迁移位置MD与迁移位置处荧光强度FI|MD之间的关系FI|MD=f1(MD),通过imageJ、MATLAB等分析处理软件对荧光强度条带图进行数据分析处理获得。
进一步的,从已知DNA长度的DNA标记物的荧光强度条带图中提取几种已知长度的DNA条带处迁移位置MD和DNA分子长度FL之间的关系,进而通过拟合方法得到函数关系MD=f2(FL)。
进一步的,给定迁移位置处的单位质量的DNA产生的荧光强度与该迁移位置处DNA片段长度FL之间的关系是从已知DNA片段的总质量的DNA标记物的荧光强度条带图中提取几种已知总质量的DNA条带处单位质量的DNA产生的荧光强度与该迁移位置处DNA片段长度FL之间的关系,进而通过拟合方法得到函数关系
进一步提供一种实施方式,当上述DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法中选用凝胶电泳方法进行DNA长度筛分时。
所述凝胶电泳筛分方法包括:
向待检测DNA样品与DNA标记物中添加缓冲液;
将待检测DNA样品混合物荧光染料及DNA标记物加载到琼脂糖凝胶中,用凝胶电泳装置进行长度筛分;
其中,荧光染料直接加入到琼脂糖凝胶中或添加到待检测DNA样品中后再将待检测DNA样品混合物加载到琼脂糖凝胶中。
进一步的,所述缓冲液选用TAE、TBE、TPE电泳缓冲液中的一种或多种。
在凝胶电泳筛分后,用荧光成像仪对具有分离的DNA片段的琼脂糖凝胶进行荧光成像。DNA分子迁移位置MD和迁移位置处荧光强度FI|MD的关系通过imageJ、MATLAB等软件对实验所得的电泳荧光图进行数据分析处理,得到电泳通道沿着电泳距离的荧光强度关系:FI|MD=f1(MD)。迁移位置MD与该处DNA分子的长度FL之间的关系是从已知DNA长度的DNA标记物的荧光条带图中提取提取DNA标记物中已知长度的条带在电泳泳道中的位置,利用曲线拟合得到电泳距离与DNA的长度(例如以碱基数表示)之间的关系:MD=f2(FL)。给定迁移位置处的单位质量的DNA产生的荧光强度与该迁移位置处DNA片段长度FL之间的关系是从已知DNA片段的总质量的DNA标记物(DNA marker)的荧光条带图中提取几种已知总质量的DNA条带处单位质量的DNA产生的荧光强度和DNA分子长度FL之间的关系:给定迁移位置处DNA的总碱基数Nbp|MD与该迁移位置处的荧光强度FI|MD之间的关系:是从已知DNA片段的总质量的DNA标记物的荧光条带图中提取获得的。
DNA样品中长度为FL的DNA的条数
基于此可以得出DNA条数分布。
与现有技术相比较,本发明的有益效果如下:
1)本发明公开的一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的电泳实验测量与数据分析方法拓展了对于不同长度的DNA分子的条数分布的分析方法,有益于当前生物技术与医学应用的发展。
2)本发明所提供的实验测量与数据分析方法与以往采用的检测方法相比,具有操作简便、测量成本低、数据分析快等优点,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为DNA电泳荧光图;
图2为DNA分子迁移位置MD和迁移位置处荧光强度FI|MD的关系:FI|MD=f1(MD);
图3为迁移位置MD与该处DNA分子的长度FL之间的关系拟合:MD=f2(FL);
图6为DNA样品1-4的不同长度的DNA的条数分布,曲线为使用本发明得到的分布,柱状图为通过其他数值模拟方法的分析结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
参照附图1-6所示,一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的电泳实验测量与数据分析方法:
将DNA样品与λDNA、λDNA III(Tiangen,北京,中国)和8k DNA marker(转基因生物技术,北京,中国)进行电泳实验,λDNAIII与8k DNA marker的作用是作为电泳的大小标记,其中8k DNA marker中不同长度的DNA的组分的质量已知。
电泳实验的具体操作步骤为:将DNA样品与DNA加载缓冲液(最终浓度1x,Solarbio,北京,中国)和Sybr Green(最终浓度1x,Dingguo Biotech,北京,中国)混合。然后,将DNA样品混合物和DNA标记装载到0.5%琼脂糖凝胶(常规琼脂糖G-10,Biowest,Spain)中,该凝胶与TBE缓冲液(最终浓度0.5x,Solarbio,北京,中国)混合。电泳实验是在110伏电压下用凝胶电泳装置(DYY-6D,LiuYi,北京,中国)进行的。然后,用荧光成像仪(ChampGel15000,北京,中国)对具有分离的DNA片段的琼脂糖凝胶进行成像。
通过imageJ、MATLAB等软件对荧光电泳图进行分析处理,获得DNA样品和DNA标记物沿凝胶道的迁移距离与位置处荧光强度之间的关系:FI|MD=f1(MD),其中DNA marker需要满足不同长度的DNA质量已知。
提取DNA标记物(DNA marker)中已知长度的条带在电泳泳道中的位置进行对比,利用曲线拟合得到电泳距离与DNA的长度之间的关系得到:MD=f2(FL)=0.719×e-0.326×FL+0.181×e-0.012×FL。
8k DNA marker的条带中几种不同长度的DNA质量已知,由此可以通过曲线拟合得到单位碱基数量条件下DNA片段长度跟条带亮度的关系。即将8k DNA marker的片段荧光条带亮度和DNA片段长度建立拟合公式得到:
针对f3现象的一种解释是:因为DNA分子两端的双螺旋结构松弛,较短的DNA片段与荧光染料结合更困难。在碱基对总数相同的情况下,较长的DNA片段具有更稳定的双螺旋结构区域,可以吸收更多的荧光染料,从而产生更强的荧光。
进一步就可得DNA样品中不同长度的DNA的条数分布。
实验具体结果如图(6)所示,曲线为使用本发明得到的分布,柱状图为通过其他数值模拟方法的分析结果。通过两者的对比可确认本发明的正确性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,其特征在于,包括:
将待测DNA样品与DNA标记物进行长度筛分,从DNA长度筛分结果中提取和拟合参数关系,根据提取和拟合的参数关系推导得出DNA样品中不同长度的DNA的条数分布情况;
所述DNA标记物是由几种不同长度的DNA片段混合组成,且各DNA片段的长度和总质量均已知。
2.根据权利要求1所述的一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,其特征在于,长度筛分方法包括凝胶电泳、毛细管电泳及微流芯片筛分方法中的任意一种或多种。
3.根据权利要求2所述的一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,其特征在于,所述凝胶电泳筛分方法包括:
向待检测DNA样品与DNA标记物中添加缓冲液;
将待检测DNA样品混合物、荧光染料及DNA标记物加载到琼脂糖凝胶中,用凝胶电泳装置进行长度筛分;
其中,荧光染料直接加入到琼脂糖凝胶中或添加到待检测DNA样品中后再将待检测DNA样品混合物加载到琼脂糖凝胶中。
4.根据权利要求3所述的一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,其特征在于,所述缓冲液选用TAE、TBE、TPE电泳缓冲液中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,其特征在于,DNA分子迁移位置MD与迁移位置处荧光强度FI|MD之间的关系,通过分析处理软件对荧光强度条带图进行数据分析处理获得。
8.根据权利要求5所述的一种DNA样品中不同长度DNA的条数分布的分析方法,其特征在于,从已知DNA长度的DNA标记物的荧光强度条带图中提取几种已知长度的DNA条带处迁移位置MD和DNA分子长度FL之间的关系,进而通过拟合方法得到函数关系MD=f2(FL)。
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