CN103088126A - 一种根据像素计算dna片段大小的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种根据像素计算DNA片段大小的方法，首先将全式金TRANS DL1000Marker作为已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的条带作为未知条带，并对前5条的DNA条带进行分析；然后分别用7％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用银染进行染色；最后在拍照后用AdobePhotoshop7.0读取泳距，将条带大小和其对应的泳距输入SPSS的两列作为自变量和因变量，将数据区选中后依次点击分析、回归、曲线估计，该计算DNA片段大小的方法，误差小、精确度高，实用性强，具有较强的推广与应用价值。

Description

一种根据像素计算DNA片段大小的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种根据像素计算DNA片段大小的方法。

背景技术

在分子生物学实验中，检测DNA片段的大小或比较群体间PCR扩增产物的多态性时，利用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行监测是一项基础性的、常用实验技术。相对于琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶的孔径较小，对于较小的DNA分子有更好的分辨效果，可用于5-500bp的DNA分子，由于本实验主要用于定量计算，对于DNA分离的要求较高，因此选用聚丙烯酰胺凝胶电泳。通常无论是普通的琼脂糖凝胶电泳，还是分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳，人们普遍通过用DNA片段与各种分子量标记(Marker)进行比较后，估计或计算目标DNA片段的大小。若目标DNA片段的大小与所使用的DNA-marker中所具有的某一条带非常接近时，能大概估计出目标DNA片段的大小，但是，若想得到更为精确的目标条带的大小，仅仅靠估计是很难做到的。而且通过Marker目测估计目标片段大小存在随意性大，重复性差等特点。目前关于线性双链DNA条带的泳距与其长度间的关系的研究较少，而且主要有3种观点：①DNA分子长度的常用对数与泳距成反比；②DNA分子的长度与泳距成反比；③DNA分子长度与泳距呈反向逻辑斯蒂增长关系。但是这些算法均因非线性回归算法复杂，且每块凝胶结果都需要单独回归分析运算，使得其应用受到很大限制。而且在应用这些算法进行计算的过程中，测量泳距所用的方法有：用尺子量出DNA片段的泳距，用扫描仪扫描胶后，再用作图工具测量出泳距，和用像素较高的相机照下胶后再用作图工具测量出泳距，而且无论是哪一种方法，其测量泳距的最小精度的单位为毫米。这很容易造成1毫米泳距的差异可能导致DNA片段的大小达到几个甚至几十个bp的差异。加大了DNA片段大小的误差，造成DNA片段大小不准确。

发明内容

本发明提供了一种根据像素计算DNA片段大小的方法，旨在解决现有技术提供的计算DNA片段大小的方法，误差大，不精确的问题。

本发明的目的在于提供一种根据像素计算DNA片段大小的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，将全式金TRANS DL1000Marker作为已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的条带作为未知条带，并对前5条的DNA条带进行分析；

步骤二，分别用7％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用银染进行染色；

步骤三，拍照后用Adobe Photoshop7.0读取泳距，将条带大小和其对应的泳距输入SPSS的两列作为自变量和因变量，将数据区选中后依次点击分析、回归、曲线估计。

进一步，在步骤一中，全式金TRANS DL1000Marker作为已知大小的DNA片段时，条带大小分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp和1000bp。

进一步，在步骤一中，DL2000Marker上的条带作为未知条带时，条带大小分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。

进一步，7％聚丙烯酰胺凝胶的配方为：尿素7.2g、ddH₂O31.25ml、10×TBE6ml、40％Acr-bis10.5ml、10％过硫酸铵0.6ml、TEMED27μl。

进一步，在步骤二中，电泳条件为：室温、恒电压120V、电泳时间3小时。

进一步，在步骤三中，拍照后用Adobe Photoshop7.0读取泳距时，用鼠标点在有DNA片段的条带正中，便可得出条带在PHOTOSHOP中的像素值，然后再用鼠标点在电泳的起始点，得出起始点处在PHOTOSHOP中的像素值，两者之差便是泳距的大小。

本发明提供的根据像素计算DNA片段大小的方法，首先将全式金TRANSDL1000Marker作为已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的条带作为未知条带，并对前5条的DNA条带进行分析；然后分别用7％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用银染进行染色；最后在拍照后用Adobe Photoshop7.0读取泳距，将条带大小和其对应的泳距输入SPSS的两列作为自变量和因变量，将数据区选中后依次点击分析、回归、曲线估计，该计算DNA片段大小的方法，误差小，结果的精确度高，实用性强，具有较强的推广与应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例提供的根据像素计算DNA片段大小的方法的实现流程图；

图2是本发明实施例提供的根据像素计算DNA片段大小时二次和三次多项式拟合的函数图象示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

图1示出了本发明实施例提供的根据像素计算DNA片段大小的方法的实现流程。

该方法包括以下步骤：

步骤S101，将全式金TRANS DL1000Marker作为已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的条带作为未知条带，并对前5条的DNA条带进行分析；

步骤S102，分别用7％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用银染进行染色；

步骤S103，拍照后用Adobe Photoshop7.0读取泳距，将条带大小和其对应的泳距输入SPSS的两列作为自变量和因变量，将数据区选中后依次点击分析、回归、曲线估计。

在本发明实施例中，在步骤S101中，全式金TRANS DL1000Marker作为已知大小的DNA片段时，条带大小分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp和1000bp。

在本发明实施例中，在步骤S101中，DL2000Marker上的条带作为未知条带时，条带大小分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。

在本发明实施例中，7％聚丙烯酰胺凝胶的配方为：尿素7.2g、ddH₂O31.25ml、10×TBE6ml、40％Acr-bis10.5ml、10％过硫酸铵0.6ml、TEMED27μl。

在本发明实施例中，在步骤S102中，电泳条件为：室温、恒电压120V、电泳时间3小时。

在本发明实施例中，在步骤S103中，拍照后用Adobe Photoshop7.0读取泳距时，用鼠标点在有DNA片段的条带正中，便可得出条带在PHOTOSHOP中的像素值，然后再用鼠标点在电泳的起始点，得出起始点处在PHOTOSHOP中的像素值，两者之差便是泳距的大小。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

材料与方法：

全式金TRANS DL1000Marker作为已知大小的DNA片段(条带大小分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp和1000bp)和DL2000Marker(100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp)上的条带作为未知条带，并对前5条的DNA条带进行分析。并分别用7％聚丙烯酰胺凝胶(配方：尿素7.2g、ddH2O31.25ml、10×TBE6ml、40％Acr-bis10.5ml、10％过硫酸铵0.6ml、TEMED27μl)，电泳后采用银染进行染色。电泳条件为：室温、恒电压120V、电泳时间3小时整。拍照后用Adobe Photoshop7.0读取泳距，在读取泳距时，用鼠标点在有DNA片段的条带正中，便可得出条带在PHOTOSHOP中的像素值，然后再用鼠标点在电泳的起始点，得出起始点处在PHOTOSHOP中的像素值，两者之差便是泳距的大小，将条带大小和其对应的泳距输入SPSS的两列作为自变量和因变量，将数据区选中后依次点击分析、回归、曲线估计。

结果：利用PHOTOSHOP量取的个条带和其对应的泳距分别为：100bp-1784像素、200bp-1161像素、300bp-795像素、400bp-606像素、500bp-447像素、700bp-304像素、1000bp-203像素。

由于7％聚丙烯酰胺对500bp以上的条带分辨率较差，500bp以上的条带在7％的聚丙烯酰胺凝胶上的迁移距离已经非常接近。可以看出500bp的条带和1000bp的条带距离仅相差243像素。在此区间内，由于像素距离读取而产生的误差将对最终结果产生很大的影响。因此，如果需对500bp以上的条带进行分析，可采用低浓度胶分离DNA片段后再进行分析。故在本实验中舍去750bp和1000bp两条带，并将剩余的5组数据输入SPSS进行回归分析其结果如表一所示。

其中各种拟合模型的拟合公式如下：

线性：           Y＝b0+b1*t

二次多项式：     Y＝b0+b1*t+b2*t²

复合：           Y＝b0*b1^t

增长：           Y＝e^(b0+b1*t)

对数：           Y＝b0+b1*1n(t)

三次多项式：     Y＝b0+b1*t+b2*t²+b3*t³

S：              Y＝e^(b0+b1/t)

指数：           Y＝b0*e^(b1*t)

倒数(反比例)：   Y＝b0+b1/t

幂函数：         Y＝b0*t^b1

Logistic：       Y＝1/((1/u)+b0*b1^t)(其中u为函数的上限)

表一.模型汇总和参数估计值

可以从表一中看出各模型的可决系数R2除了线性拟合和S曲线的拟合度较差以外，其余的拟合曲线拟合程度均较高且F值也较大，表明回归效果显著。为了进一步考察各函数回归的实际效果，将各条带泳距带入上述方程，考察计算得到的条带大小，结果表二所示。可见各曲线的计算结果中，以二次多项式、三次多项式、复合函数、增长、指数和Logistic曲线为好。

表二将泳距带入回归所得方程的计算结果

在表二中虽然二次多项式和三次多项式虽然其拟合度较高，但是将函数图象做出后却不尽人意，这是因为泳距与DNA片段的大小在整个图象上应为一个单调的凹函数，二次多项式在图像上有一个极值点，这与事实不符，三次多项式又在图像上显示其凸凹性上前后不一致。因此我认为在此处二次和三次多项式拟合均不合适，较为合适的函数为对数函数、复合函数、增长，指数函数和逻辑斯蒂函数，又以逻辑斯蒂函数最优，图2示出了二次和三次多项式拟合的函数图象。

本发明实施例提供的根据像素计算DNA片段大小的方法，首先将全式金TRANS DL1000Marker作为已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的条带作为未知条带，并对前5条的DNA条带进行分析；然后分别用7％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用银染进行染色；最后在拍照后用Adobe Photoshop7.0读取泳距，将条带大小和其对应的泳距输入SPSS的两列作为自变量和因变量，将数据区选中后依次点击分析、回归、曲线估计，该计算DNA片段大小的方法，误差小，结果的精确度高，实用性强，具有较强的推广与应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种根据像素计算DNA片段大小的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一，将全式金TRANS DL1000Marker作为已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的条带作为未知条带，并对前5条的DNA条带进行分析；

步骤二，分别用7％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用银染进行染色；

步骤三，拍照后用Adobe Photoshop7.0读取泳距，将条带大小和其对应的泳距输入SPSS的两列作为自变量和因变量，将数据区选中后依次点击分析、回归、曲线估计。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤一中，全式金TRANSDL1000Marker作为已知大小的DNA片段时，条带大小分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp和1000bp。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤一中，DL2000Marker上的条带作为未知条带时，条带大小分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，7％聚丙烯酰胺凝胶的配方为：尿素7.2g、ddH₂O31.25ml、10×TBE6ml、40％Acr-bis10.5ml、10％过硫酸铵0.6ml、TEMED27μl。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤二中，电泳条件为：室温、恒电压120V、电泳时间3小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤三中，拍照后用AdobePhotoshop7.0读取泳距时，用鼠标点在有DNA片段的条带正中，便可得出条带在PHOTOSHOP中的像素值，然后再用鼠标点在电泳的起始点，得出起始点处在PHOTOSHOP中的像素值，两者之差便是泳距的大小。