JP4226912B2

JP4226912B2 - 核酸塩基配列決定方法

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Publication number: JP4226912B2
Application number: JP2003001950A
Authority: JP
Inventors: 智嗣平田; 伴　　秀行; 真一福薗; 康吉菅野
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Tochigi Prefecture
Current assignee: Tochigi Prefecture; Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2003-01-08
Filing date: 2003-01-08
Publication date: 2009-02-18
Anticipated expiration: 2023-01-08
Also published as: JP2004208650A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸試料を電気泳動して得られる蛍光強度波形データを解釈して、塩基配列決定やスプライシング異常の検出を行う核酸塩基配列決定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）からタンパク質が作られる過程には、遺伝情報を正しいタンパク質合成に導くために、多くのステップが必要とされる。中でもスプライシングという現象はこの過程の中で重要なステップのひとつと考えられており、「遺伝子ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡ（リボ核酸）が作られる際、情報をもたない部分であるイントロンを切り捨て、情報を担う部分であるエクソンだけをつなぐ機構」のことを指している。
【０００３】
例えば、５個のイントロン（Ｉ１〜Ｉ５）と５個のエクソン（Ｅ１〜Ｅ５）からなるＤＮＡがあった場合、［Ｉ１］−［Ｅ１］−［Ｉ２］−［Ｅ２］−［Ｉ３］−［Ｅ３］−［Ｉ４］−［Ｅ４］−［Ｉ５］−［Ｅ５］の順に配列されたものとなっている。これが、スプライシングにより、５個のエクソン（Ｅ１〜Ｅ５）のみの［Ｅ１］−［Ｅ２］−［Ｅ３］−［Ｅ４］−［Ｅ５］の順に配列されたメッセンジャーＲＮＡが作られる。ここで、イントロン［Ｉ１］、エクソン［Ｅ１］等は遺伝子が配列されたものであるが、ここでは、それらの個々の配列には意味はない。
【０００４】
このスプライシングに異常が生じた場合、本来の機能を欠いたタンパク質が生成され、そのタンパク質が種々の疾患に関わる可能性が生じてくる。実際に、家族性アルツハイマー病が、プレセニリン１と呼ばれる遺伝子のエクソン４やエクソン９を欠失するスプライシング異常により発症することが報告されている。他にも多くの神経難病の発症に、スプライシング異常が深く関わると考えられており、スプライシング異常による疾患発生の機序解明が望まれている。
【０００５】
現在、このスプライシング異常を検出する方法が幾つか開発されているが、信頼度が高く異常部位を直接検出できる塩基配列決定を行う場合が多い。従来、この塩基配列を決定するため、核酸断片を蛍光標識する技術、高解像度のゲル電気泳動技術、及び高感度の蛍光検出技術を組み合わせたＤＮＡシーケンシング法が広く用いられてきた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来のＤＮＡシーケンシング法を用いた核酸塩基配列決定方法では、上記のようなスプライシング異常が生じている試料を計測した場合、スプライシング異常が生じているピーク以降の塩基配列を正しく解析することが困難となる。即ち、従来法による解析では、ある遺伝子の「あるピーク」以降でスプライシング異常が生じた場合、前記「あるピーク」以降の多くのピーク位置の塩基種がヘテロ（混合塩基）と判定されてしまう。
【０００７】
何故ならヒトＤＮＡ遺伝子等では、父由来の遺伝子と母由来の遺伝子が一対となっており、遺伝子の殆どの部分で父由来の塩基種と母由来の塩基種が同一であり、またスプライシング異常は、通常、父由来の遺伝子もしくは母由来の遺伝子のうち、どちらか一方にのみで生じるためである。これにより、スプライシング異常が生じていない領域の殆どはホモと判定され、スプライシング異常が生じたピーク以降の領域の殆どはヘテロと判定されてしまう。
【０００８】
このヘテロと判定された全てのピーク位置については、父由来の塩基種と母由来の塩基種に分離する必要があるが、この作業は熟練した作業者が波形データを目視しながら行う手作業に頼らざるを得なかった。
【０００９】
また、上述したように、５個のイントロン（Ｉ１〜Ｉ５）と５個のエクソン（Ｅ１〜Ｅ５）からなるＤＮＡがあり、［Ｉ１］−［Ｅ１］−［Ｉ２］−［Ｅ２］−［Ｉ３］−［Ｅ３］−［Ｉ４］−［Ｅ４］−［Ｉ５］−［Ｅ５］の順に配列されている場合、スプライシング異常により［Ｅ２］の欠損が生じた場合には、下記のような３種類のメッセンジャーＲＮＡが作られる可能性が生じる。
［Ｅ１］−［Ｅ３］−［Ｅ４］−［Ｅ５］
［Ｅ１］−［Ｅ４］−［Ｅ５］
［Ｅ１］−［Ｅ５］
すなわち、［Ｅ１］の次には、［Ｅ２］より後ろのエクソンである［Ｅ３］［Ｅ４］［Ｅ５］と３個のエクソンが続く場合のみならず、［Ｅ４］［Ｅ５］と２個のエクソンが続く場合、［Ｅ５］の１個のみのエクソンが続く場合とがある。このように、スプライシング異常が生じた後に通常とは異なるエクソンが続く現象をエクソンスキップと呼ぶ。そして、どのエクソンにスキップしたか、という情報は、上述したスプライシング異常による疾患発生の機序解明のための重要な情報源となる。
【００１０】
しかしながら、従来のＤＮＡシーケンシング法を用いた核酸塩基配列決定方法で得られた解析結果では、どのエクソンへスキップしたかを判定するのは非常に困難であり、熟練した作業者の目視及び手作業に頼らざるを得なかった。
【００１１】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑み、スプライシング異常の検出や、スプライシング異常が生じたピーク以降の核酸塩基配列の決定、およびどのエクソンにスキップしたかを容易に判定することのできる方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明による核酸塩基配列決定方法では、核酸試料から作製した種々の長さの核酸断片を電気泳動して得られた４種類の塩基の蛍光強度波形データにおいて、各ピークの情報を元に前記核酸試料の塩基配列を仮決定するステップと、前記仮決定した塩基配列と既知塩基配列に対してホモロジー検索を行い、前記仮決定した塩基配列に相同性が高い既知塩基配列を並置するステップとを含み、前記既知塩基配列と前記仮決定した塩基配列が、所定の数以上連続して一致した後、所定のピーク（第１のピーク）以降で所定の数以上連続して一致しない領域があった場合に、前記第１のピーク以降でスプライシング（遺伝子ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡが作られる際、情報をもたない部分であるイントロンを切り捨て、情報を担う部分であるエクソンだけをつなぐ機構）に異常が生じている可能性があると判定することを特徴とする。
【００１３】
さらに、前記核酸試料の蛍光強度波形データと前記既知塩基配列に対応する蛍光強度波形データの差分波形データを作成するステップとを含み、前記差分波形データの前記スプライシング異常が生じていると判定した前記第１のピーク以降の範囲において、前記差分波形データの各ピーク情報を元に塩基配列を決定することを特徴とする。
【００１４】
また、前記スプライシング異常が生じていると判定した前記第１のピーク以降の決定した塩基配列と、前記スプライシング異常が生じていると判定した前記第１のピーク以降の既知塩基配列に対してホモロジー検索を行うステップを含み、前記決定した第１のピーク以降の塩基配列に相同性が高い既知塩基配列を選定することを特徴とする。
【００１５】
既知塩基配列に対応する蛍光強度波形データとしては、当該既知塩基配列に同定された複数の既知蛍光強度波形データを統計処理して作成した蛍光強度データベース波形を用いることができる。
【００１６】
また、前記差分波形データの作成に先立ち、前記二つの波形データの対応する各ピークが一致するように、予め各ピーク間隔を両者で同一とする前処理及び／又は、対応する各ピークの強度基準が一致するようにピーク強度の基準を両者で同等とする前処理を行ってもよい。
【００１７】
本発明によると、スプライシング異常の検出や、スプライシング異常が生じたピーク以降の核酸塩基配列の決定、および「どのエクソンにスキップしたか」を判定することができる。そして、その解析結果を用いることにより、スプライシング異常が深く関わると考えられている多くの神経難病の発症機序解明に役立てることができる。また、判定結果を用いて遺伝子診断を行うことにより、疾患遺伝子の探索や疾患感受性の判断、及び医薬品の開発（テーラーメイド医療）等を、高精度かつ迅速に行えるようになる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１９】
図１に、本発明が適用される核酸塩基配列決定装置の構成例をブロック図で示す。この装置は、核酸断片泳動部１１、蛍光信号計測部１２、蛍光信号演算部１３、データ表示部１４、データ格納部１５、各部を制御する装置制御部１６を備える。核酸断片泳動部１１は、蛍光標識した核酸断片群を電気泳動させ塩基長の違いにより分離する。蛍光信号計測部１２は、分離した核酸断片にレーザーを照射する光学機器及び発生する蛍光を検出する検出器等からなる。蛍光信号演算部１３は、計測した蛍光強度波形データを信号処理し塩基配列の決定等を行う。データ表示部１４は、蛍光強度波形データ及び決定した塩基配列に関連する情報の表示を行う。データ格納部１５は、蛍光強度波形データ及び決定した塩基配列等の記録を行う。装置制御部１６は、核酸断片泳動部１１の電源の制御、蛍光信号計測部１２の光源制御と検出器のサンプリング条件の制御、蛍光信号演算部１３とデータ表示部１４及びデータ格納部１５間のデータ転送の制御、蛍光信号演算部１３におけるデータ処理内容の制御等を行う。
【００２０】
データ格納部１５において蛍光強度波形データや決定した塩基配列及びピーク位置等を記録する際の形式（フォーマット）としては既に様々なものが提案されているが、一例としてＳＣＦフォーマットと呼ばれる形式について、簡単に説明する。ＳＣＦフォーマット（version 3.00）では、以下の項目に対応する値が、ファイルに順次、記録されている。
【００２１】
項目内容
magic_number ＝フォーマット識別数（文字列”.SCF”を数値化したもの）
samples ＝波形点数
samples_offset ＝波形強度が記録されている最初の番地（バイトオフセット）
bases ＝塩基数
bases_left_clip ＝不使用(No. bases in left clip)
bases_right_clip ＝不使用(No. bases in right clip)
bases_offset ＝塩基配列が記録されている最初の番地（バイトオフセット）
comments_size ＝コメントの大きさ
comments_offset ＝コメントが記録されている最初の番地（バイトオフセット）
version ＝バージョン
sample_size ＝波形強度値のビットサイズ（1=8ビット、2=16ビット）
code_set ＝使用されているコードセット
private_size ＝プライベートデータの大きさ
private_offset ＝プライベート値が記録されている最初の番地（バイトオフセット）
spare ＝予備
Samples for A trace ＝アデニン（Ａ）塩基の波形データ
Samples for C trace ＝シトシン（Ｃ）塩基の波形データ
Samples for G trace ＝グアニン（Ｇ）塩基の波形データ
Samples for T trace ＝チミン（Ｔ）塩基の波形データ
Offset into peak index for each base ＝各塩基のピーク位置
Accuracy estimate bases being ‘Ａ’ ＝Ａ塩基の同定信頼性
Accuracy estimate bases being ‘Ｃ’ ＝Ｃ塩基の同定信頼性
Accuracy estimate bases being ‘Ｇ’ ＝Ｇ塩基の同定信頼性
Accuracy estimate bases being ‘Ｔ’ ＝Ｔ塩基の同定信頼性
The called bases ＝同定された塩基種（決定塩基配列）
Reserved for future use ＝予備
Comments ＝コメント
Private data ＝プライベートデータ
本実施形態においては、電気泳動で得られた各塩基の蛍光強度波形データ、決定した塩基配列、ピーク位置等を上記ＳＣＦフォーマットにてデータ格納部１５に記録するが、勿論他のフォーマットによって記録しても構わない。
【００２２】
図１に示した塩基配列決定装置を用いて塩基配列を決定（仮決定）するためには、核酸断片泳動部１１において、サンガー法等を用いて塩基配列を決定すべき核酸試料を元に様々な長さの核酸断片群を調製する。反応には、蛍光色素により標識したプライマー、または蛍光色素により標識したｄｄＮＴＰを用い、核酸断片群に蛍光色素を標識する。
【００２３】
まず初めに、塩基配列を知りたいＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を用意する。通常、未知の配列を持ったＤＮＡをプラスミド（細菌等の細胞内にある核以外の細胞質中のＤＮＡで、主に複製開始情報のみを有する）に組み込んだものか、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）法で塩基配列を直接増幅した核酸断片を用いる。次に、ターゲットＤＮＡとプライマー（ターゲットＤＮＡの特定部分の配列と相補的な塩基配列を有するもので、ＰＣＲ法を用いる場合は反応で利用する片側のものに相当する）を試験管内の溶液中で混合し、温度をコントロールすることでプライマーとテンプレートが相補的な二本鎖を形成するようにする（アニーリング）。更に、このプライマーを起点としてＤＮＡを複製する過程に進み、複製はＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる酵素を触媒として行われる。そして、この反応液中にはＤＮＡの合成に必要なｄＮＴＰ（各種塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）（もしくはウラシル（Ｕ））のモノマー）と、４種類のｄｄＮＴＰ（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ（Ｕ）のターミネーター）を所定の割合で混合し所定の濃度で入れておく。すると、ＤＮＡが合成されていく時、ｄｄＮＴＰが取り込まれるとＤＮＡの合成がそれ以上進まなくなる（伸長反応）。ここで、ｄｄＮＴＰにそれぞれの塩基に応じて色の異なる蛍光色素を標識しておく。その結果、末端にｄｄＮＴＰを持つ様々な長さ（塩基長）で合成が止まった核酸断片が生成され、各断片はその末端塩基に応じた蛍光色で標識されることになる。
【００２４】
次に、標識された核酸断片群に対して電気泳動を行い、蛍光信号計測部１２において、蛍光信号を検出して蛍光強度波形データを作成する。具体的には、上記のようにしてできた核酸断片を含む溶液を濃縮精製した後、一本鎖に変性して、ゲル電気泳動装置を用いて塩基長毎に核酸断片を分離する。以下では、ゲル電気泳動装置の一例として、キャピラリ泳動装置を用いた場合について説明する。まず、粘性のある高分子ポリマーをキャピラリ（ガラス細管）に充填しておき、その両端に電圧を印加することにより、負の電荷を有する核酸断片をキャピラリの片側から導入・泳動させる。この時、核酸断片は鎖状の重合体高分子であるため、ポリマー中を分子量に反比例した速度で移動し、短い（分子量が小さい）核酸断片ほど速く、長い（分子量が大きい）核酸断片ほどゆっくり移動するため、塩基長毎に核酸断片を分離することができる。そしてキャピラリの終端付近（各核酸断片を１塩基の長さの差異で分離可能となった位置）で核酸断片にレーザー光を照射し、各断片末端塩基から発生する蛍光を検出器により測定する。前記の通り、短い核酸断片から順番に蛍光を発生していくので、４塩基種毎の蛍光強度曲線が得られ、各ピーク位置での４種類の蛍光強度等を比較することにより、塩基種（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ（Ｕ））の配列決定が可能となる。
【００２５】
図２は、蛍光強度波形データの例２１と、それを解釈して決定される塩基配列の例２２を示す図である。実際には、１度の計測で数百塩基分のデータが得られるが、ここでは説明のためにその一部を示している。縦軸は蛍光強度を表し、横軸は泳動時間を表している。蛍光強度波形データ２１に現れるピークの高さは、ある長さの核酸断片の量を反映したものである。通常、長い核酸断片ほど泳動時間が遅いところにピークが現れ、ピーク間隔は核酸断片が長くなるにつれて大きくなる傾向がある。そこで、表示の時間軸が塩基長に比例するように、泳動電圧等の泳動条件で決まるパラメータを用いて補正するのも有効である。
【００２６】
図３は、未知核酸断片の塩基配列を仮決定するために蛍光強度波形データに対して通常行う処理を示す図である。この処理は、図１の蛍光信号演算部１３によって行われる。
【００２７】
蛍光信号演算部１３は、未知核酸断片の蛍光強度波形データに対して、スムージング処理（ステップ３１）及びバックグラウンド補正（ステップ３２）を行う。その後、ピークの検出（ステップ３３）及びピーク間隔の決定（ステップ３４）を行う。また、電気泳動時の泳動むら（スマイリング）によりピーク間隔は常に一定になるとは限らないため、得られたピーク間隔の大きさから必要に応じてピーク位置の補正（スマイリング補正）を行う（ステップ３５）。次に、各ピーク位置での各塩基種の信号強度（あるいは各ピークの面積等）を比較して、所定の同定基準に従い塩基種を順次決定する（塩基配列の仮決定）（ステップ３６）。
【００２８】
この同定基準の例としては、あるピーク位置においてある塩基種（例えばＡ）の信号強度が一番大きく、残る３つの塩基種の中で最も大きな塩基種（例えばＣ）の信号強度が最大塩基種（ここではＡ）の信号値のＴ％未満であった場合（Ｔは閾値は例えば５０％）、最大塩基種（ここではＡ）として同定する。また、二番目の塩基種（ここではＣ）がＴ％（例えば５０％）以上であり、かつ三番目の塩基種（例えばＧ）の強度が最大塩基種（ここではＡ）の信号値のＴ％（例えば５０％）未満であった場合、最大塩基種（ここではＡ）と二番目の塩基種（ここではＣ）のヘテロ（混合塩基＝同一ピーク位置に複数の塩基が含まれていると同定された部位）として決定される（ここではＭ（＝Ａ＋Ｃ））。同様にして全ての組み合わせに応じて混合塩基の表示方法（ＩＵＢ規格の混合塩基表示法）が決められているが、その判定基準としては明確な値は示されていない）。
【００２９】
図４は、データベース波形及びその付随情報を取得する処理の一例を示す図である。データベース波形及びその付随情報は、図１の蛍光信号演算部１３で取得して図１のデータ格納部１５に格納してもよいし、他の装置によって取得されたものを図１のデータ格納部１５に格納して利用してもよい。
【００３０】
図４の処理では、塩基配列が既知である蛍光強度波形データの集合である既知塩基波形データ群に対し、塩基種毎に全波形の横軸を揃える処理（ステップ４１）及び全波形の縦軸を揃える処理（ステップ４２）を行い、全波形を平均して平均波形を作成する（ステップ４３）。こうして作成された塩基種毎の波形をデータベース波形として保存する（ステップ４４）。また、塩基種毎にピーク位置を検出してピーク位置情報として保存する（ステップ４５）と共に、塩基配列の情報を既知塩基配列情報として保存する（ステップ４６）。
【００３１】
具体的には、横軸および縦軸が揃った「変異を含まない同一の塩基配列に同定された」ｎ個の蛍光強度波形データセット（４塩基種分の蛍光強度波形データを１セットとする）を用意し、ｉ番目（１≦ｉ≦ｎ）のデータセットのＡ塩基の波形データをＡｉ（ｔ）とした場合（ｔは泳動時刻に相当する横軸変数）、Ａのデータベース波形Ａｂ（ｔ）は、下記（１）式で算出する。
【００３２】
【数１】

同様にして残るＣ，Ｇ，Ｔに対しても、それぞれのデータベース波形Ｃｂ（ｔ），Ｇｂ（ｔ），Ｔｂ（ｔ）は、下記（２）式〜（４）式で算出される。
【００３３】
【数２】

【数３】

【数４】

上記の手順で作成したデータベース波形と各ピーク位置の情報、及び前記既知塩基配列情報は、図４のステップ４４，４５，４６において前記ＳＣＦフォーマット等で保存する。
【００３４】
次に、図１の蛍光信号演算部１３は、図１のデータ格納部１５にデータベースとして格納されている既知塩基配列と、未知の核酸試料に対して図３の処理を経て仮決定した塩基配列とを比較することにより、未知核酸断片の塩基配列の確定とスプライシング異常の検出を行う。
【００３５】
図５はスプライシング異常の検出を行うための処理フローの例を示す。まず、仮決定した塩基配列とデータベース中の既知塩基配列に対してホモロジー検索を実施し、仮決定した塩基配列の各々の部位について既知の塩基配列との関連付けを行い、相同性が高い既知の塩基配列を並置する（ステップ５１）。その後、仮決定塩基配列と既知塩基配列の比較を行い（ステップ５２）、所定の比較基準に基づいてスプライシング異常の有無の判定を行う（ステップ５３）。ステップ５３でスプライシング異常が検出された場合には、塩基配列が既知である蛍光強度波形データと電気泳動して新規に得られた塩基配列を決定すべき蛍光強度波形データの横軸を揃え（ステップ５４）、次に縦軸を揃え（ステップ５５）、両波形データの差分波形を作成し（ステップ５６）、所定の基準に基づいてスプライシング異常以降の塩基配列の決定を行い（ステップ５７）、エクソンスキップ先の選定を行う（ステップ５８）。ステップ５３でスプライシング異常が検出されなかった場合には処理を終了する。
【００３６】
以下、ステップ５３でスプライシング異常が検出された場合の処理について詳しく説明を行う。
【００３７】
実際の核酸試料の塩基配列を決定する際には、ある特定部位の塩基変異を調べる場合のように、塩基配列を決定すべき核酸試料の塩基配列の少なくとも一部が既知である場合が多い。このような参照できる既知の塩基配列が存在する場合、前記のようにして仮決定した塩基配列と既知の塩基配列に対してホモロジー検索を実施し、仮決定した塩基配列の各々の部位について既知の塩基配列との関連付けを行い、相同性が高い既知の塩基配列を並置して参照することが可能となる。ホモロジー検索による並置に際しては、「スミス・ウォーターマンの方法（ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー、第１４７巻、１９５頁〜１９７頁）」等を用いる。
【００３８】
次に、既知塩基配列と仮決定塩基配列を並置した後、先頭のピーク位置から順に、二つの配列が一致しているかどうかを調べていく。スプライシング異常が生じていない場合には、仮決定時の判定誤りや実際に生じている塩基変異により、既知塩基配列と仮決定塩基配列の間に多少の相違は生じるものの、最終ピーク位置までの殆どのピーク位置で塩基種が一致し、不一致が数塩基以上続くことはない。これに対して、スプライシング異常が生じている場合には、スプライシング異常が生じているピーク以降で、既知塩基配列と仮決定配列の間に相違が生じ、最終ピークまで殆どのピーク位置で一致しない状態となる。
【００３９】
これは、ヒトＤＮＡ遺伝子等では、父由来の遺伝子と母由来の遺伝子が一対となっており、遺伝子の殆どの部分で父由来の塩基種と母由来の塩基種が同一であり、またスプライシング異常は、比較的稀な現象であるため、父由来の遺伝子もしくは母由来の遺伝子のどちらか一方にのみ生じることが多いためである。これにより、スプライシング異常が生じたピーク以降の領域の殆どはヘテロとなり、既知塩基配列とは一致しなくなる。
【００４０】
図６は、遺伝子ｈＭＬＨ１の４番目のエクソンと５番目のエクソンの境でスプライシング異常が生じている場合の解析結果の一例である。図の上段に塩基配列が既知である解析済み波形（データベース波形−ＤＢ波形）を、下段にはこれから解析を行う未知の波形（ターゲット波形−ＴＧ波形）を、２段に並べて表示している。この表示範囲での既知のデータベース配列（ＤＢ配列）は、
ＡＴＡＣＡＧＡＧＣＡＡＧＴＴ（配列番号１）
であり、ターゲット波形の仮決定配列は、
ＡＴＡＣＡＧＲＫＳＲＡＧＫＷ（配列番号２）
と仮決定されている。ここで、ＲはＡとＧのヘテロ、ＫはＧとＴのヘテロ、ＳはＣとＧのヘテロ、ＷはＡとＴのヘテロを、それぞれ、表している。
【００４１】
この例では、既知のデータベース配列（ＤＢ配列）とターゲット波形（ＴＧ波形）の仮決定配列の２つの配列は先頭から２５９番目の塩基Ｇまでは完全に一致していたが、２６０番目からはターゲット波形の仮決定配列の多くがヘテロとなっているため、ターゲット波形（ＴＧ波形）の仮決定配列がホモのままであるピーク（２６４番目の塩基Ａおよび２６５番目の塩基Ｇ）以外の多くのピーク位置で一致していない。このような場合、例えば「既知塩基配列と仮決定配列が４ピーク以上連続して一致した後、あるピーク以降で４ピーク以上連続して一致しない領域があった場合に、スプライシング異常が生じていると判定する」ことにより、前記「あるピーク」以降のスプライシング異常を検出することが可能になる。
【００４２】
次に、上記の手順で「スプライシング異常が生じている」と判定された場合には、さらに、前記ターゲット波形（ＴＧ波形）データから前記データベース波形（ＤＢ波形）データを差し引いた差分波形データを作成することにより、この差分波形データの各ピーク情報を元に、前記塩基配列の仮決定の手順と同様の手順により、スプライシング異常発生後の塩基配列を、決定することが可能になる。
【００４３】
図７はこれを説明するために、上段には既知のデータベース配列（ＤＢ配列）に対応するデータベース波形（ＤＢ波形）を、下段には、このＤＢ波形と仮決定配列がなされ、これから解析を行うターゲット波形（ＴＧ波形）との差分を、２段に並べて表示している。この下段に示した差分波形から、スプライシング異常が発生したターゲットＤＮＡの断片の塩基配列を、下記のように決定することが可能になる。
【００４４】
ＡＴＡＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡ（配列番号３）
図７の差分波形では、例えば、２６０番目の塩基の差分について見ると、ＤＢ波形は塩基Ａだけに対応するものであるのに対して、ＴＧ波形ではヘテロ塩基Ｒの波形、すなわち「塩基Ｇ＋塩基Ａ」の波形であるから、塩基Ｇに対応する波形は差分として正側に表れ、塩基Ａに対応する波形は負側に現れることになる。ここでは、負側に現れる波形はヘテロ塩基のうちＤＢ波形にある塩基を意味するから、スプライシング異常が発生したターゲットＤＮＡの断片の塩基配列の決定には意味を持たないから無視すれば良い。したがって、スプライシング異常が発生したターゲットＤＮＡの断片の２６０番目の塩基は塩基Ｇと決定できる。同様に、２６１番目のヘテロ塩基Ｋは「塩基Ｇ＋塩基Ｔ」であるから、正側に表れる波形は塩基Ｔに対応するものとなる。なお、負側に現れる波形は意味を持たないと言う点から言えば、差分波形は正側に表れるものだけを処理するものとしても良い。
【００４５】
また、上述の説明からも分かるように、データベース波形、ターゲット波形および差分波形のように、波形データを処理するのに代えて、配列文字列間での引き算により、スプライシング異常が発生したターゲットＤＮＡの断片の塩基配列を決定することも可能となる。
ＲＫＳＲＡＧＫＷ−ＡＧＣＡＡＧＴＴ＝ＧＴＧＧＡＧＧＡ
すなわち、仮決定配列のＲＫＳＲＡＧＫＷは（Ｇ＋Ａ）（Ｇ＋Ｔ）（Ｃ＋Ｇ）（Ｇ＋Ａ）（Ａ＋Ａ）（Ｇ＋Ｇ）（Ｇ＋Ｔ）（Ｔ＋Ａ）のように２つの塩基の組として扱われるから、それぞれの組からデータベース配列のＡＧＣＡＡＧＴＴを引き算すれば、データベース配列との比較やデータベース波形との差分算出を行わなくても「スプライシング発生後の塩基配列決定」が可能となる。なお、ここでは、上記ターゲット波形の仮決定配列ＲＫＳＲＡＧＫＷ中の「Ａ」、「Ｇ」は、それぞれ「ＡとＡのホモ（一対）」、「ＧとＧのホモ」を表しているものと考えて処理を行う。
【００４６】
この配列文字列間での引き算による処理は「スプライシング異常の有無の判定」にも適用することができる。すなわち、前述したように、既知塩基配列と仮決定塩基配列を並置した後、先頭のピーク位置から順に、二つの配列が一致しているかどうかを調べて、スプライシング異常が生じているか否かを判定する段階で、配列文字列間での引き算による判定をするものとすれば、データベース波形およびターゲット波形のピーク検出による判定に代えることができる。
【００４７】
この場合には、しかしながら、スプライシング異常が生じた後のピーク位置にズレが生じ、本来のピーク位置と本来のピーク位置の間にズレた方のピークが発生した場合には、ターゲット波形の仮決定配列が、スプライシング異常後では父方の塩基ピークと母方の塩基ピークが交互に同定され、
ＣＡＴＡＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡ（配列番号４）
と仮決定されることがあり、この場合には、データベース配列との比較やデータベース波形との差分算出を行うことが必須となる。すなわち、配列文字列間での引き算による判定では「スプライシング異常の有無の判定」や「スプライシング発生後の塩基配列決定」を行うことが出来ない。
【００４８】
上記の例では、仮決定配列に多数のヘテロが含まれている場合のスプライシング異常の有無判定に、「あるピーク位置を先頭にヘテロが４ピーク以上連続して続いた場合に、スプライシング異常が生じていると判定する」という基準を用いる場合について述べたが、ピーク数が４以上連続の基準以外にも、種々の基準を設定することができる。例えば、「あるピーク位置を先頭にヘテロが２ピーク以上連続して続いた場合にはスプライシング異常が生じていると判定する」ことを判定基準としても良い。
【００４９】
次に、スプライシング異常の結果、どのピーク位置にスキップしたかを決定する方法について説明する。図７を参照して説明したように、「あるピーク」以降のスプライシング異常が発生した塩基配列「ＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴ」と、前記スプライシング異常が生じていると判定した前記「あるピーク」以降の父もしくは母由来の全ての既知塩基配列に対してホモロジー検索を行い、前記スプライシング異常が発生したＤＮＡ断片の塩基配列と相同性が高い既知塩基配列を選定することにより、どのピーク位置にスキップしたかを決定することが可能となる。
【００５０】
例えば、スプライシング異常が発生した塩基配列「ＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴ」と相同性が高い既知塩基配列が、
ＡＧＣＡＡＧ・・・ＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＴ・・・ＴＧＴＴＡＡ
であった場合、上記配列中のアンダーラインを付した配列「ＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴ」の部分にスキップしたことが分かる。この配列「ＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴ」と相同性が高い既知塩基配列が前記「遺伝子ｈＭＬＨ１」の６番目のエクソンであった場合、スプライシング異常により「６番目のエクソン」にスキップしたと判定することが可能になる。
【００５１】
判定後に、この「何番目のピークでスプライシング異常が生じたかという情報」及び／又は、「何番目のエクソンにスキップしたかという情報」を、図１のデータ表示部１４に表示しても良いし、上記ＳＣＦフォーマット等の解析結果保存用ファイルにコメントやプライベートデータとして、図１のデータ格納部１５に記録しておいても良い。
【００５２】
なお上記の例では、全ての既知塩基配列に対してホモロジー検索を行っているが、全ての既知塩基配列ではなく、前記「あるピーク」以降の全エクソンの先頭塩基配列（例えば１１ピーク分）のみを、ホモロジー検索の対象としても良い。
【００５３】
上記の例では、１１ピーク分の塩基配列でホモロジー検索を行っているが、これ以外（１１ピーク以外）のピーク数の塩基配列でホモロジー検索を行った場合にも、同等の効果を得ることができる。例えば、５ピーク分の塩基配列でホモロジー検索を行った場合にも、スキップ先を選定することが可能である。
【００５４】
前記図６および図７は、ＴＧ波形とＤＢ波形の横軸（ピーク間隔）と縦軸（ピーク強度）がほぼ同等であったため、前処理を行わずにそのまま差分波形を得ることができた場合の例について述べたものであるが、図８（Ａ）に示す例のように、ＴＧ波形とＤＢ波形間で、電気泳動時の泳動速度及び泳動むらが異なる（ピーク間隔が異なる）場合、両者の対応する各ピークが正確に一直線上に並ぶように、予め各ピーク間隔が両者で同一となるような前処理（横軸（泳動時間軸）を揃える為の内挿処理や間引き処理）を行えば良い。前処理後、図８（Ｂ）に示すように波形は泳動速度が両者で一致するように調整されたものとなる。なお、図８の例では、ＤＢ波形のピーク間隔を補正してＴＧ波形に合わせているが、反対にＴＧ波形のピーク間隔を補正してＤＢ波形に合わせても良い。この「横軸を揃える前処理」は、図５のステップ５４に相当するものであるが、図４のＤＢ波形を作成する際の前処理ステップ４１に関しても、同様の手順で行えばよい。すなわち、最初に、全波形における各ピーク間隔の平均を算出し、各波形のピーク間隔を各平均ピーク間隔に合わせる処理を行えば良い。
【００５５】
図９（Ａ）に示す例のように、ＴＧ波形とＤＢ波形間で、蛍光信号強度が異なる（信号強度軸のスケールが異なる）場合、両者の対応する各ピークの強度基準が一致するように、予め、全ピーク強度の基準が両者で同等となるような前処理（縦軸（信号強度軸）を揃える前処理）を行えば良い。前処理後、図９（Ｂ）に示すように、波形は信号強度軸が揃える処理のなされたものとなる。なお、図９の例では、ＤＢ波形のピーク強度を補正してＴＧ波形に合わせているが、反対にＴＧ波形のピーク強度を補正してＤＢ波形に合わせても良い。
【００５６】
前記の図９に示す「縦軸を揃える前処理」の際には、両者の全ピーク強度の平均値を算出し、その平均値の比を一方の蛍光強度波形全体に乗じることにより、実施することができる。即ち、比較を行う一方の蛍光強度波形セット１（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ（Ｕ）の４波形分で１セット）の全ピーク位置での信号値の平均値がＡ_１、他方の蛍光強度波形セット２の全ピーク位置での信号値の平均値がＡ_２であった場合、Ａ_１／Ａ_２を蛍光強度波形セット２の波形全体に乗じるか、Ａ_２／Ａ_１を蛍光強度波形セット１の波形全体に乗じれば良い。また、全ピーク位置での信号値の平均値を用いずに、所定の（注目している）ピークを含む前後の数ピーク（例えば、前後２０ピーク）の平均信号値を用いても良い。
【００５７】
この「縦軸を揃える前処理」は、図５のステップ５５に相当するものであるが、図４のＤＢ波形を作成する際の前処理ステップ４２に関しても、同様の手順で行えばよい。すなわち、最初に、全波形における全ピーク強度の平均値を算出し、各波形の全ピーク強度の平均値が全波形での平均値と同等になるようにすれば良い。
【００５８】
なお、上記のターゲット波形の仮決定配列例「ＡＴＡＣＡＧＲＫＳＲＡＧＫＷ」のように、その配列自身に多数のヘテロが含まれている場合、例えば「あるピーク位置を先頭にヘテロが４ピーク以上連続して続いた場合に、スプライシング異常が生じていると判定する」ことにより、前記「あるピーク位置」以降のスプライシング異常を検出するようにすることも可能である。
【００５９】
また前記の例では、二つの波形の表示後、スプライシング異常の有無判定やスプライシング異常発生後の塩基配列決定を行う場合について述べたが、波形表示を行わずにスプライシング異常の有無判定やスプライシング異常発生後の塩基配列決定を自動的に行い、その結果を記録（保存）するようにしても良い。
【００６０】
また前記の例では、波形比較を行う際の基準波形として「同一の既知塩基配列に同定された複数の既知蛍光強度波形を統計処理して作成した蛍光強度データベース波形」を用いる場合について述べたが、「既知塩基配列に同定された或る一つの既知の蛍光強度波形」を基準波形として用いた場合にも、同様の効果を得ることができる。
【００６１】
また、図１には、核酸断片泳動部１１及び蛍光信号計測部１２を含む装置構成例が示されているが、これらの構成部分は必ずしも必要ではなく、別の蛍光強度波形計測装置等で測定された蛍光強度波形データを読み込む機能を、蛍光信号演算部１３に持たせた場合にも、同様の効果を得ることができる。なお、前記データの読み込み方法には、フロッピー（登録商標）ディスクや光ディスク等の記録媒体を用いる情報伝達方法や、通信回線を用いる方法等がある。
【００６２】
さらに、図１では、蛍光信号演算部１３、データ表示部１４、データ格納部１５および各部を制御する装置制御部１６が独立した機能ブロックとして表現されているが、これらは、いわゆる、所定のプログラムを備えるパーソナルコンピュータにより実現できるものであることは、言うまでもない。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、核酸断片を測定して得られた蛍光強度波形データを解釈して、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（Ｕ）等の塩基配列を決定する際に、スプライシング異常の検出や、スプライシング異常が生じたピーク以降の核酸塩基配列の決定、および「どのエクソンにスキップしたか」を判定することが可能となる。

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明が適用される核酸塩基配列決定装置の構成例を示すブロック図。
【図２】蛍光強度波形データの例と、それを解釈して決定される塩基配列の例を示す図。
【図３】未知核酸断片の塩基配列を仮決定するために蛍光強度波形データに対して行う処理を示す図。
【図４】データベース波形及びその付随情報を取得する処理の一例を示す図。
【図５】本発明における塩基配列決定処理フローの例を示す図。
【図６】本発明をスプライシング異常の有るデータに適用した例を示す図。
【図７】本発明により差分波形を作成した例を示す図。
【図８】（Ａ）は横軸補正前のＴＧ波形とＤＢ波形の例、（Ｂ）は横軸補正後のＴＧ波形とＤＢ波形の例を示す図。
【図９】（Ａ）は縦軸補正前のＴＧ波形とＤＢ波形の例、（Ｂ）は縦軸補正後のＴＧ波形とＤＢ波形の例を示す図。
【符号の説明】
１１…核酸断片泳動部、１２…蛍光信号計測部、１３…蛍光信号演算部、１４…データ表示部、１５…データ格納部、１６…各部を制御する装置制御部、ＴＧ…ターゲット、ＤＢ…データベース。

Claims

核酸試料から作製した種々の長さの核酸断片を電気泳動して得られた４種類の塩基の蛍光強度波形データの各ピークの情報を元に前記核酸試料の塩基配列を仮決定するステップと、
前記仮決定した塩基配列と既知塩基配列に対してホモロジー検索を行い、前記仮決定した塩基配列に相同性が高い既知塩基配列を並置するステップとを含み、
前記既知塩基配列と前記仮決定した塩基配列とが、所定の数以上連続して一致した後、第１のピーク以降で所定の数以上連続して一致しない領域があった場合に、前記第１のピーク以降で、前記核酸試料に、スプライシングに異常が生じている可能性があると判定する段階と、
前記核酸試料の蛍光強度波形データと前記既知塩基配列に対応する蛍光強度波形データの差分波形データを作成するステップを含み、前記差分波形データの前記スプライシングに異常が生じていると判定された前記第１のピーク以降の範囲に対して前記差分波形データの各ピーク情報を元に前記核酸試料の塩基配列を決定する段階とを有することを特徴とする核酸塩基配列決定方法。
前記スプライシング異常が生じていると判定された前記第１のピーク以降の決定された塩基配列と、前記スプライシング異常が生じていると判定された前記第１のピーク以降の既知塩基配列に対してホモロジー検索を行うステップを含み、
前記決定された第１のピーク以降の塩基配列に相同性が高い既知塩基配列を選定する請求項１記載の核酸塩基配列決定方法。
前記既知塩基配列に対応する蛍光強度波形データとして、当該既知塩基配列に同定された複数の既知蛍光強度波形データを統計処理して作成した蛍光強度データベース波形を用いる請求項１または２記載の核酸塩基配列決定方法。
前記差分波形データの作成に先行して、前記二つの波形データの対応する各ピークが一致するように、予め各ピーク間隔を両者で同一とする前処理及び／又は、対応する各ピークの強度基準が一致するように予めピーク強度の基準を両者で同等とする前処理を行う請求項１乃至３のいずれか一つに記載の核酸塩基配列決定方法。