JPH08506117A

JPH08506117A - ラパマイシン誘導体、その製造法および用途

Info

Publication number: JPH08506117A
Application number: JP6517822A
Authority: JP
Inventors: フォード，ブライアン・ダグラス
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1993-02-10
Filing date: 1994-02-10
Publication date: 1996-07-02
Also published as: DE69427687D1; GB9302567D0; DE69427687T2; EP0683783A1; EP0683783B1; WO1994018206A1; US5583018A

Abstract

(57)【要約】式（Ｉ）：

Description

【発明の詳細な説明】ラパマイシン誘導体、その製造法および用途本発明は、新規化合物およびその誘導体、それらの製造法、それらを含有する医薬処方、医学的治療、特に微生物感染症の治療におけるそれらの使用、および免疫調節剤としてのそれらの使用に関する。ラパマイシンは公知化合物であり、真菌ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）の抽出物として最初に単離され、抗真菌活性を有することが報告されている（英国特許１４３６４４７）。その後、ラパマイシンは免疫抑制剤として示されている（マーテル，アール・アール（Martel R.R .）ら、カナディアン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・アンド・ファーマコロジー（Can．J．Physiol．Pharmacol.）55，48-51，1977）。多数の微生物が種々の化合物を産生することが判明しており、これらはその後単離され、有用な治療的性質を有することが示されている。また、公知化合物の存在下での微生物のインキュベートまたは培養することにより新規化合物が得られている。かかる新規化合物の１つに１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンがある。この新規化合物は有用な抗微生物および抗癌および免疫調節活性を有することが判明している。従って、本発明は、１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンおよびその誘導体を提供する。さらに本発明は第２の態様において、微生物をラパマイシンと接触させ、ついで１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンまたはその誘導体をインキュベーションから単離することを特徴とする１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンの製造法を提供する。１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンは式（Ｉ）：で示される構造を有すると考えられる。この化合物は、ジェイ・フィンドレイ（J．Findlay）ら、カナディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Can．J．Chem．）（1980）58，579の位置番号系に従い、本明細書中で１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンと称する。しかし、ジェイ・マック・アルピン（J．Mc Alpine）ら、J．Antibiotics（1991）44 ，688のより最近の位置番号系によると、これは９−１０−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンとして知られている。ケミカル・アブストラクツ（Chemical Abstracts）（１１版キュミュレイティヴ・インデックス（11th Cumulative Index）1982-86頁60719CS）による位置番号系に従えば、本発明の化合物は１３，１５−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンと呼ばれる。式（Ｉ）の化合物は以下の特徴を有する：ｉ）高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析により９１８の見掛け分子量を有する； ii）ストレプトミセス属からの微生物をラパマイシン存在下で培養し、培養培地からの１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンまたはその誘導体を回収することにより得られる； iii）¹³ＣＮＭＲ分光法により、該分子中に５１個の炭素があることが示されている； iv）抗真菌活性を示す；ｖ）免疫調節活性を示す。本明細書中に用いる「培養」なる語（およびその語の派生語）は、同化し得る炭素源、窒素源、硫黄源および無機塩源の存在下での生物の意図的好気的増殖を意味する。かかる好気的増殖は、固体または半固体栄養培地中で、または栄養素が溶解または懸濁している液体培地中で起こってもよい。培養は、好気的表面上でまたは液内培養により行ってもよい。栄養培地は複合栄養素よりなるものであってもよいし、あるいは化学的に規定されているものであってもよい。本発明の製造法に用いる適当な微生物は、１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンを同化する能力を有するストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌株を包含することが判明している。さらに、かかる株は例えば、天然より単離されているエスピー（sp）ＮＣＩＭＢ４０５３５またはその突然変異体であることが判明している。本明細書中で用いる「突然変異体」なる語は、自然にまたは外用剤（これが意図的に適用されるか否かにかかわらず）の作用により生じるいずれかの突然変異株を包含する。突然変異株の適当な製造法は、プロシーディングズ・オブ・ア・シンポジウム，ビエンナ（Proceedings of ａ Symposium，Vienna）1973、241頁、インターナショナル・アトミック・エネルギー・オーソリティー（Internatio nalAtomic Energy Authority）「産業用微生物のための放射線および放射性同位体（Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms）」中の「微生物の発生のための技術（Techniques for the Development of Microorganis ms）」中でエイチ・アイ・アドラー（H．I．Adler）により略述されている方法を包含し、（ｉ）電離放射線（例、Ｘ線およびγ線）、紫外線、紫外線と光増感剤（例、８−メトキシプソラレン）との併用、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ピリミジン塩基アナログ（例、５−ブロモウラシル）、アクリジン、アルキル化剤（例、マスタードガス、エチル−メタンスルホナート）、過酸化水素、フェノール類、ホルムアルデヒド、熱、および（ii）例えば組換え、形質転換、形質導入、溶原化、溶原変換、プロトプラスト融合および自然突然変異体のための選択的技術を含む遺伝子技術を包含する。ベッカービー（Becker B.）、レヒェバリアーエム・ピー（Lechevalier M.P .）、ゴードンアール・イー（GordonR.E.）、レヒェバリアーエイチ・エイ（Lechevalier H.A.）、1964、Appl．Microbiol．12，421-423およびウィリアムズエス・ティー（Williams S.T.）、グッドフェロウエム（Goodfellow M.）、ウェリントンイー・エム・エイチ（Wellington E.M.H.）、ビッカーズジェイ・シー（Vickers J.C.）、アルダーソンジー（Alderson G.）、スニーズピー・エイチ・エイ（Sneath P.H.A.）、サッキンエム・ジェイ（Sackin M.J. ）およびモーチマーエム（Mortimer M）1983 J．Gen．Microbiol．129，1815-18 30の方法を用い、エスピーＮＣＩＭＢがまだ報告されていない非定型のストレプトミセスの株として同定されており、従って、特に生物学的に純粋な形態で本発明の一部分を形成する。それはＮＣＩＭＢ４０５３５号で１９９３年１月１８日にザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテイッド（the Nathional Collections of Industrial an dMarine Bacteria Ltd.）（N.C.I.M.B.），アバディーン（Aberdeen）、スコットランド（Scotland）に寄託されている。エスピーＮＣＩＭＢ４０５３５の培養用培地は、適切には、同化し得る炭素源および同化し得る窒素源を無機塩と共に含有する。適当な窒素源としては、酵母エキス、大豆粉、肉エキス、綿実粉、麦芽、蒸留乾燥溶解物、アミノ酸、タンパク質加水分解産物およびアンモニウムおよび硝酸塩窒素などが挙げられる。適当な炭素源としては、グルコース、ラクトース、マルトース、デンプン、グリセロールなどが挙げられる。また適切には、培養培地はアルカリ金属イオン（例えばナトリウム）、ハロゲン化物イオン（例えば塩化物イオン）、およびアルカリ土類金属イオン（例えばカルシウムおよびマグネシウム）、並びに鉄、コバルトのような微量元素を含む。培養は適切には約２０〜３５℃の温度で行われてもよく、２０〜３０℃が有利である。例えば下記の単離後に所望の生成物の最大収量を得るために、適切には７日間以下、好ましくは約３〜５日間、培養をラパマイシンと接触させてもよい。所望の生成物またはその誘導体を、該化合物のための通常の技術を用いて、培養培地から単離し、後処理し、精製してもよい。かかるすべての単離および精製手法は、冷温から室温、例えば４〜４００℃、便宜には２０〜３５℃の温度範囲で便宜に行い得る。所望の化合物は、生物学的活性について試験しおよび／またはh.p.l.c.保持時間を監視することにより通常方法で容易に同定し得る。適切には、分離方法には、好ましくは最終工程として、高速液体クロマトグラフィー工程が含まれていてもよい。水性メタノールを用いて溶出を行ってもよい。１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンおよびその誘導体は結晶性であっても非結晶性であってもよく、結晶性であれば所望により水和させても溶媒和させてもよい。該誘導体は、好ましくは、医薬上許容される誘導体である。誘導体としては、医薬上許容される対イオンとの塩が含まれてもよい。本発明の化合物は適切には実質的に純粋な形態、例えば少なくとも５０％の純度、適切には少なくとも６０％の純度、有利には少なくとも７５％の純度、好ましくは少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、特に少なくとも９８％の純度（％はすべて重量／重量として算出されている）で提供される。本発明の化合物の不純なまたはそれほど純粋でない形態を、例えば、医薬用途に適した同じ化合物または関連化合物（例えば対応する誘導体）のより純粋な形態の調製に使用してもよい。１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンおよびその医薬上許容される誘導体は抗真菌活性を有し、動物、特にヒトを含む哺乳動物、なかでもヒトおよび家畜動物（農場動物を含む）における真菌感染症の予防的および治療的処理に有用である。該化合物は、とりわけカンジダ（Candida）（例、カンジダ・アルビカンス（Candida Albicans））、トリコフィトン（Trichophyton）（例、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes））、ミクロスポルム（Microsporum）（例、ミクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum））またはエピデルモフィトン（Epidermophyton）の種により起こされるヒトにおける局所的真菌感染症、またはカンジダ・アルビカンス（Candida Albicans）（例、口腔および膣カンジダ症）により起こされる粘膜感染症の治療に用いてもよい。また、例えばカンジダ・アルビカンス（Candida Albicans）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）、コクシディオイデス（Coccidiodes）、パラコクシジオイデス（Paracocciciodes）、ヒストプラスマ（Histoplasma）またはブラストミセス（Blastomyces）スピーシーズ（spp）によって起こされる全身真菌感染症の治療に用いてもよい。また、真菌腫（eumycotic mycetoma）、クロモブラストミコーシスおよびムコール症の治療に有用であるかもしれない。また、１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンおよびその医薬上許容される誘導体は免疫調節剤としても活性である。本明細書中で用いる「免疫調節剤」なる語は、本発明化合物が、インビトロでＴ（およびＢ）細胞応答を阻害することにより、および／または、アジュバント誘導関節炎における炎症系応答仲介二次障害の統計学的に有意な減少を生じさせることにより免疫抑制を誘導する能力を有することを意味する。治療の適応症には以下の病的状態の治療が含まれるが、これらに限定されるものではない：慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、急性移植／グラフト拒絶、重症筋無力症、全身性進行性硬化症、多発性骨髄症、アトピー性皮膚炎、過度免疫グロブリンＥ、Ｂ型肝炎抗原陰性慢性急性肝炎、橋本甲状腺炎、家族性地中海熱、バセドウ病、自己免疫性溶血性貧血、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病。また、１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンおよびその医薬上許容される誘導体は、発癌性腫瘍に対して活性を有するはずである。より詳しくは、該化合物は、腫瘍の大きさを減少させ、腫瘍増殖を阻害し、および／または、腫瘍担持動物の生存時間を延長させるのに有用であるはずである。したがって、本発明は、医学的治療において、特に抗真菌剤または免疫調節剤または発癌性腫瘍に対する薬剤として使用するための１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンまたはその誘導体を提供する。さらに、本発明は、有効量の１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンまたはその誘導体を投与することによる、真菌感染症に罹ったヒトまたは動物を治療する方法を提供する。さらに本発明は、有効量の１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンまたはその誘導体を投与することによる、免疫調節を必要とするヒトまたは動物を治療する方法を提供する。また、本発明は、有効量かつ非毒性量の１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンまたはその誘導体をヒトまたは動物に投与することを特徴とする、かかるヒトまたは動物における発癌性腫瘍の治療方法を提供する。さらに、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩および医薬上許容される希釈剤または担体よりなる医薬組成物を提供する。該組成物は、好ましくはヒト用の錠剤、カプセル剤、注射剤またはクリーム剤の形態である。ヒトに対する使用では、１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンまたはその誘導体を単独で投与することができるが、一般には、意図する投与経路および標準的な医薬プラクチスを考慮して選択される医薬担体と混合して投与する。例えば、それらは、デンプンまたは乳糖のような賦形剤を含有する錠剤の形態で、またはカプセルまたは膣坐剤として単独でまたは賦形剤と混合して、または香味剤または着色剤を含有するエリキシル剤または懸濁剤の形態で経口投与してもよい。それらは、例えば静脈内、筋内または皮下に非経口的に注射投与してもよい。非経口投与には、それらは、他の物質、例えば溶液を等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有していてもよい無菌溶液の形態で最良に使用される。真菌感染症に罹ったヒトの患者に対する経口および非経口投与には、経口または非経口経路のいずれかで投与する場合、式（Ｉ）の抗真菌性化合物の１日投与量は０．０５〜１００、好ましくは０．１〜１０mg／kg（分割で）であると予想される。したがって、該化合物の錠剤またはカプセル剤は、１回または２回以上の適当な回数の投与では活性化合物の５mg〜０．５gを含有すると予想される。いずれの場合においても、個々の患者に最も適切である実際の投与量は医師により決定され、個々の患者の年齢、体重および反応に応じて変化する。上記投与量は平均的な場合の例示である。勿論、個々の場合によっては、より多い又はより少ない投与量範囲が良い場合があり、かかる場合も本発明の範囲内にある。免疫調節を要するヒトの患者についても同等に、該化合物またはその誘導体についての１日の非経口または経口投与計画は、好ましくは０．１mg／kg〜３０mg ／kgである。発癌性腫瘍の治療のための化合物またはその誘導体の有効かつ非毒性な量がどれほどであるかは、当業者であれば通常の実験により決定することができる。しかしながら、一般には、有効な投与量は約０．０５〜１００mg／kg体重／日であると予想される。該化合物を上記投与量範囲で投与する場合、許容できない毒物学的効果は全く予想されない。本発明の化合物および組成物は、他の抗真菌剤、抗癌剤または免疫調節剤から類推して、ヒトまたは獣医薬に使用するためにいずれかの便宜な方法で投与用に処方してもよい。経口投与用の化合物および錠剤およびカプセル剤は、単位投与形であってもよく、例えば結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガントまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば乳糖、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；打錠滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；崩壊剤、例えばジャガイモデンプン；および医薬上許容される湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムを包含する通常の賦形剤を含有していてもよい。該錠剤は、通常の医薬プラクチスにおいてよく知られている方法によりコーティングされていてもよい。経口液体製剤は、例えば、水性または油性の懸濁剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であってもよく、使用前に水または他の適当なビヒクルでで再構成するための乾燥品として提供されてもよい。かかる液体製剤は、例えば、懸濁化剤、例えばソルビトール、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウムゲルまたは水素化食用脂肪；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタン、モノオレアートまたはアラビアゴム；非水性ビヒクル（食用油を含んでもよい）、例えばアーモンド油、油性エステル類（例えばグリセリン）、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；保存剤、例えばパラオキシ安息香酸メチルまたはプロピルエステルまたはソルビン酸；および所望により用いる通常の香味剤および着色剤を包含する通常の添加剤を含有していてもよい。局所投与用に意図される本発明の組成物は、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、眼軟膏剤、点眼剤、点耳剤、含浸包帯剤およびエアゾール剤の形態であってもよく、例えば保存剤、薬物浸透を助ける溶剤、および軟膏剤およびクリーム剤中の緩和薬を包含する適当な通常の添加物を含有していてもよい。また、かかる局所処方は、適合性のある通常の担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、およびローション剤用のエタノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよい。かかる担体は、処方に対して約１重量％〜約９８重量％を構成していてもよい。担体が担体処方に対して約８０重量％以下を構成するのがより普通である。本発明の組成物は、通常の坐剤基剤、例えばカカオ脂または他のグリセリドを含有してもよい坐剤として処方されてもよい。非経口投与用に意図される本発明の組成物は、便宜には、該化合物および無菌ビヒクル、ポリエチレングリコールを用いて製造される流体単位投与形であってもよい。化合物は、用いるビヒクルおよび濃縮物に応じて、ビヒクル中に懸濁されても溶解されてもよい。非経口懸濁剤は、該化合物をビヒクルに溶解させるかわりに懸濁させること、および濾過滅菌を行い得ないいこと以外は実質的に同じ方法で調製してもよい。その代わりに、該化合物は無菌ビヒクルに懸濁させる前にエチレンオキシドにさらすことにより滅菌してもよい。該化合物の均一な分散を促進するために、かかる懸濁剤に界面活性剤または湿潤剤を含ませると有利である。また、本発明の組成物は、吸入により投与してもよい。「吸入」は、経鼻および経口吸入投与を意味する。通常の技術により、エアゾール処方、ミータードドーズ吸入器（metered dose inhaler）のようなかかる投与のための適当な投与形を調製してもよい。以下、実施例により本発明を例示する。実施例１１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンの製造ラパマイシンから１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンを生産する能力を有する培養をストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）と分類し、受託番号ＮＣＩＭＢ４０５３５号でザ・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア（the National Collectionof Indu strial and Marine Bacteria）、２３、マチャー・ドライブ・ストリート、アバーディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランド、英国（23，St．Machar Drive，Ab erdeen AB2 1RY，Scotland，UK.）に寄託した。培養１００ml Ｍ２培地［アーカソイ（arkasoy），１０g／ｌ；グリセロール，２０g／ｌ；ＣoＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ，０．００５g／ｌ；ＭgＣl₂・２Ｈ₂Ｏ，０．１g／ｌ；FeＣl₃，０．０３g／ｌ；ＺnＣl₂，０．００５g／ｌ；ＣuＣl₂・２Ｈ₂Ｏ，０．００５g／ｌ；ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ，０．００５g／ｌ、pＨ６．６、未調整］を含有する５本の５００mlフラスコのそれぞれに、ペトリ皿中のＡ３寒天［酵母エキス，５g／ｌ；麦芽エキス，１０g／ｌ；グリセロール，１０g／ｌ；ペプトンソヤ，５g／ｌ；寒天Ｎo.３，２０g／ｌ；pＨ６．５］上で良く成長した培養からの２プラグ（plugs）の寒天を接種した。あるいは、ペトリ皿からのよく成長した培養の大白金匙量を３mlのツイーン（Tween）８０と混合し、全含量を５００mlフラスコ中の１００ml Ｍ２培地に加え、２８℃、２４０rpmで３日間増殖させ、ついで培養ブロスの１mlを用いて１００ml Ｍ２培地を上記５本のフラスコのそれぞれに接種した。ついで該フラスコを２８℃、２４０rpmで増殖させた。インキュベーション５日後、アセトン（３．５ml）中の溶液としてのラパマイシン（２０ｍｇ）を各フラスコに加えた。ラパマイシンは、１９９０年９月１４日に寄託されたラパマイシン生成培養ＮＣＩＭＢ４０３１９から、またはラパマイシン生成生物、例えば１９７５年１２月３０日発行の米国特許第３，９２９，９９２号（その全開示を出典明示により本明細書の一部とする）に開示されているＮＲＲＬ５４９１を培養することにより得られる。フラスコを２８℃、２４０rpmで約２０時間インキュベートした。単離方法溶媒抽出フラスコの内容物をバルキングし、希硫酸でpＨ４に調整した。５００mlのジクロロメタンを加え、混合物を２時間攪拌し、遠心分離により層を分離させて有機溶媒層を回収し、さらに２００mlのジクロロメタンを加え、１時間攪拌した。有機溶媒層を合わせ、真空中で濃縮して油状物を得た。該油状物に１００mlのメタノールを加え、該メタノール抽出物を濾過し、該濾液を真空中で濃縮して油状物を得た。シリカクロマトグラフィー該油状物を、アセトン：ヘキサン（１５：８５）中に充填したキーゼルゲル（ Kieselgel）６０（７０〜２３０メッシュ）カラム（２５×５０mm）上に載せた。載せた後、該カラムをアセトン−ヘキサンの段階グラジエントにより溶出した。３５：６５アセトン：ヘキサン後に溶出した画分に１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンが含有されていた。これらを集め、真空中で濃縮乾固し、−２０℃で保存した。分取hplc 保存固体を５００μlメタノールに溶解し、１００μl部分を逆相ミクロソルブ（Microsorb）Ｃ−１８カラムおよびプレカラム（２１．４mm×２５cmおよび２１．４×５cm）（ライニン・インスツルメンツ（Rainin Instruments、米国））上に別々に注入した。注入後、７８：２２メタノール：Ｈ₂Ｏで６ml／分で溶出を続け、２７８nmにおけるＵＶ吸収について監視した。５回の注入の合計からの目的化合物を含有する画分をプールし、真空中で濃縮してメタノールを除き、凍結乾燥した。スフェリソルブ（Spherisorb）Ｓ１００ＤＳ２（フェイズ・セプ（PhaseSep ））カラム（２５cm×４．６mm）およびウォーターズプレカラム（Waters preco lumn）を用いる逆相hplcにより、目的化合物を含有する画分を分析した。該カラムを２７８nmにおけるＵＶ吸収により監視し、７８：２２メタノールー水で２ml ／分で溶出した。これらの条件下、目的化合物は６．８分の保持時間を有していた（ラパマイシンの保持時間８．４分と相違する）。分光データ質量分析（ＦＡＢ１ＮａＣl）［Ｍ＋Ｎa］⁺＝９４０およびプロトン核磁気共鳴分光法（下記表１参照）により、得られた化合物を特徴づけした。ＵＶ分光法はアセトン中でのＵＶ１_maxを示す。実施例２１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンの生物活性以下のバイオアッセイにより、該化合物を抗真菌および免疫抑制活性について分析した。Ａ．抗真菌活性についての検定対数成長にある酵母生物（サッカロミセス・セレビシアエ（SaccharomycesCer evisiae））を完全寒天培地（ＹＰＤ）上で平板培養した。適当な水性または有機溶媒に溶解した化合物を寒天中に穴をあけたウェルに入れた。平板を４８時間インキュベートし、阻止帯を測定した。薬物濃度の対数に対する阻止帯のプロットの退縮分析により化合物の効力を定量した。Ｂ．免疫抑制活性についての有糸分裂誘発検定ＲＰＭＩおよび１０％ウシ胎児血清中、５×１０⁶／mlでＢＤＦＩ雌マウスの牌臓細胞を樹立した。この懸濁液の１００mlアリコート（５×１０⁵細胞）を９６ウェルの丸底マイクロタイタープレート（リンブロ（Linbro）、フロウ・ラボラトリーズ（Flow Laboratories））に分注した。コンカナバリンＡ（５μg／ml ）をマイトジェン剌激剤として加え、マイクロタイターウェル中の最終容量をＲＰＭＩで２００μlに調整した。細胞培養を５％ＣＯ₂雰囲気中３７℃で７２時間インキュベートし、７２時間の培養の最後の１８時間、０．５μＣｉ³Ｈ−チミジン（比活性２．００Ｃｉ／モル）でパルスした。自動マルチプル・サンプル・ハーベスター上で該細胞を収穫し、ベックマン液体シンチレーション・カウンター中で細胞結合放射活性を計数した。４重の測定から導出された平均値として結果を示す。７２時間のインキュベーション後、トリパン・ブルー・エクスクルージョン（trypan blue exclusion）により細胞成長能を測定した。細胞の添加前に、試験化合物を適当な希釈にてマイクロタイタープレートに加えた。本発明の化合物についてのこれら２個の検定の結果を表２に示す。実施例３組成物実施例Ａ−ＨＡ−カプセル組成物カプセル形態の本発明の医薬組成物は、標準的な２片の硬ゼラチンカプセルに５０mgの粉末状の本発明化合物、１００mgの乳糖、３２mgのタルクおよび８mgのステアリン酸マグネシウムを充填することにより製造する。Ｂ−注射非経口組成物注射投与に適切な形態の本発明の医薬組成物は、１０％容量％のプロピレングリコールおよび水中の１．５重量％の本発明化合物を攪拌することにより製造する。該溶液は濾過滅菌する。Ｃ−軟膏組成物本発明化合物１．０g 白色軟パラフィンで１００．０gにする。本発明化合物を小容量のビヒクルに分散させ、ビヒクルのバルク中に顆粒状に取り込ませて滑らかで均一な生成物を得る。折り畳み式の金属チューブにその分散液を充填する。Ｄ−局所クリーム組成物本発明化合物１．０g ポラワックス（Polawax）ＧＰ２００２０．０ｇ無水ラノリン２．０g 白色蜜ろう２．５ｇヒドロキシ安息香酸メチル０．１ｇ蒸留水で１００．０gにするポラワックス、蜜ろうおよびラノリンを一緒に６０℃で加熱する。ついで本発明化合物を加え、分散させ、該組成物をゆっくり攪拌しながら冷却する。Ｅ−局所ローション組成物本発明化合物１．０g モノラウリン酸ソルビタン０．６ｇポリソルベート２００．６ｇセトステアリルアルコール１．２ｇグリセリン６．０ｇヒドロキシ安息香酸メチル０．２g 蒸留水ＢＰで１００．００mlにする。ヒドロキシ安息香酸メチルおよびグリセリンを７０mlの水に７５で溶解する。モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート２０およびセトステアリルアルコールを一緒に７５℃で溶融し、該水溶液に加えた。得られた乳濁液を均一化し、連続的に攪拌しながら冷却し、残りの水中の懸濁液として本発明化合物を加える。均一になるまで全懸濁液を攪拌する。Ｆ−点滴組成物本発明化合物０．５g ヒドロキシ安息香酸メチル０．０１ｇヒドロキシ安息香酸プロピル０．０４g 蒸留水Ｂ．Ｐ．で１００．００ml（Ｂ．Ｐ．＝英国薬局方）ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピルを７５℃で７０mlの精製水に溶解し、得られた溶液を冷却する。ついで本発明化合物を加え、該溶液をメンブランフィルター（０．２２μm細孔径）で濾過滅菌し、適当な無菌容器に無菌的に充填した。Ｇ−吸入投与用組成物１５〜２０ml容量のエアゾール容器では、本発明化合物１０mgをポリソルベート８５またはオレイン酸のような滑沢剤０．２〜０．２％と混合し、該混合物をフレオンのような噴射剤、好ましくは（１，２ジクロロテトラフルオロエタン）とジフルオロクロロメタンとを合わせたものの中に分散し、経鼻または経口吸入投与用の適当なエアゾール容器アダプター中に入れる。Ｈ−吸入投与用組成物１５〜２０ml容量のエアゾール容器では、本発明化合物１０mgをエタノール（６〜８ml）に溶解し、ポリソルベート８５またはオレイン酸のような滑沢剤０．１〜０．２％を加え、これをフレオンのような噴射剤、好ましくは（１，２ジクロロテトラフルオロエタン）とジフルオロクロロメタンとを合わせたものの中に分散し、経鼻または経口吸入投与用の適当なエアゾール容器アダプター中に入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 17/18 Ａ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims

【特許請求の範囲】１．１３，１４−ビス（ジヒドロ）ラパマイシンまたはその医薬上許容される誘導体。２．式（Ｉ）：で表される化合物。３．以下の特徴を有する化合物：ｉ）高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析により９１８の見掛け分子量を有する； ii）ＮＣＩＭＢ４０５３５をラパマイシン存在下で培養することにより得られる； iii）¹³ＣＮＭＲ分光法により、該分子中に５１個の炭素があることが示される； iv）抗真菌活性を示す；ｖ）免疫調節活性を示す。４．生物学的に純粋な形態のストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp. ）ＮＣＩＭＢ４０５３５またはその突然変異体。５．ストレプトミセス（Streptomyces）属からの微生物をラパマイシン存在下で培養し、ついで請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物またはその誘導体を培地から回収することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の製造法。６．微生物がストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＣＩＭＢ４０５３５またはその突然変異体である請求項５記載の製造法。７．治療に使用するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。８．抗真菌剤または免疫調節剤として、または抗腫瘍剤として使用するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。９．抗真菌、免疫調節または抗腫瘍治療で使用するための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。１０．請求項１〜３項のいずれか１項に記載の化合物および医薬上許容される希釈剤または担体よりなる医薬組成物。