JPH10237043A

JPH10237043A - Ｒｋｓ−１７７８、その製造方法、細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤

Info

Publication number: JPH10237043A
Application number: JP9040543A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Osada; 裕之長田; Hideaki Kakeya; 秀昭掛谷; Makoto Yoshihama; 誠吉浜; Kenichi Kimura; 賢一木村
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1997-02-25
Publication date: 1998-09-08

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞周期阻害剤、抗腫瘍活性を有する新規物
質を提供する。【解決手段】下記の式（Ｉ）で表される RKS-1778 を
生産するフォーマ (Phoma)属に属する生産菌 SNF-1778
株を培養し、RKS-1778を生成蓄積せしめ、これを採取す
ることにより得られる RKS-1778 を有効成分とする細胞
周期阻害剤、および抗腫瘍剤。【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規物質 RKS-177
8 、その製造方法、それを有効成分とする細胞周期阻害
剤、および抗腫瘍剤に関する。さらに詳しくは、培地中
に RKS-1778 を生産するフォーマ (Phoma)属に属する生
産菌 SNF-1778 株を培養し、RKS-1778を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする RKS-1778 の製造
方法、並びにRKS-1778を有効成分とする細胞周期阻害
剤、及び抗腫瘍剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の研究により、高等真核生物におけ
る細胞の分化、癌化、老化などは、いずれも細胞周期制
御におけるイベントの１つと認識されるようになってき
た。細胞周期制御機構の解明は、これら高次の生体制御
を理解する上で非常に重要であり、そのためのアプロー
チとして特異的な細胞周期阻害剤を利用した生物学は、
遺伝的手法と並んで非常に重要な位置を占める。このよ
うな状況のもと、細胞周期の進行や調節に干渉する低分
子化合物は、基礎的な解析試薬として非常に有用であ
る。また、このような低分子化合物は、細胞周期阻害剤
としてのみではなく、抗腫瘍物質としても極めて有望で
あると考えられる。抗腫瘍物質に関しては、既に多数の
化合物が医薬品として実用化されているが、新規な作用
機序を有する抗腫瘍物質の開発には不断の希求があると
いえよう。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の希求
に応えるものであり、細胞周期阻害活性、および抗腫瘍
活性を有する新規物質、その製造方法、それを有効成分
とする細胞周期阻害剤、および抗腫瘍剤の提供を目的と
する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題の解
決のために鋭意検討した結果、土壌から分離されたフォ
ーマ (Phoma)属に属するカビ SNF-1778 株が細胞周期阻
害活性、および抗腫瘍活性を有する物質を生産すること
を見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は、以
下の一般式（Ｉ）で表される新規物質 RKS-1778 を提供
するものである。

【０００５】

【化２】

【０００６】本発明の RKS-1778 は、フォーマ属に属す
るRKS-1778生産菌を培地に培養し、RKS-1778を生成蓄積
せしめ、これを採取することにより製造することができ
る。本発明で使用する RKS-1778 生産菌の好ましい例と
しては、フォーマ属 SNF-1778 株が挙げられる。本発明
はさらに、新規物質 RKS-1778 を有効成分とする細胞周
期阻害剤、および抗腫瘍剤を提供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。本
発明の新規物質 RKS-1778 は以下の式（Ｉ）で表され
る。

【０００８】

【化３】

【０００９】本発明の物質 RKS-1778 は、フォーマ属に
属する微生物により生産可能であるが、その具体例とし
てはフォーマ属 SNF-1778 株が挙げられる。長野県松本
市の土壌より分離した糸状菌 SNF-1778 株を、ポテトキ
ャロット寒天平板培地に接種し、ブラックライト照射
下、25℃で 7-14 日間培養した。培養後、生育した集落
の色調及び組織、分生子形成構造等の観察を行った。SN
F-1778株は、胞子は１細胞であり、コロニー、胞子は暗
色を示した。分生子は、細胞性の壁をそなえた分生子殻
の内壁に形成され、菌糸は隔壁があった。微分干渉顕微
鏡で分生子殻を観察したところ、ふくらんだフラスコ型
として観察された。以上の観察結果から、SNF-1778株
は、不完全菌類の一属のフォーマ (Phoma)属であると判
明した。なお、当該菌株は工業技術院生命工学工業技術
研究所に生命研菌寄第 15994号(FERM P-15994) として
寄託されている。

【００１０】本発明の新規物質 RKS-1778 (以下「本発
明化合物」とも記載する) を製造するには、上記糸状菌
フォーマ属 SNF-1778 株を培養し、当該培養物から目的
の本発明化合物を分離採取すればよい。具体的には後述
する製造例に記載するが、糸状菌フォーマ属 SNF-1778
株の培養方法及び培養条件は、概ねフォーマ属に属する
菌の培養方法に従って実施することができる。培養終了
後、培養液から本発明の RKS-1778 を精製、単離するに
は、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられ
る手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種
イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、又は活性炭、アルミナ、シリカゲル等の
吸着剤によるクロマトグラフィー及び高速液体クロマト
グラフィー、あるいは結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥の手
段をそれぞれ単独又は適宜組み合わせて、あるいは反復
して使用することが可能である。

【００１１】以上のようにして製造される新規な RKS-1
778 は、後述の試験例に示すように細胞周期阻害活性、
および抗腫瘍活性を有する。本発明の RKS-1778 を有効
成分とする細胞周期阻害剤、および抗腫瘍剤は、その使
用目的に合わせて、使用方法、剤型、投与量 (使用量)
が適宜決定される。例えば、本発明の RKS-1778 を有効
成分とする細胞周期阻害剤、および抗腫瘍剤の場合、そ
の投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。剤型
としては、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、
エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤又は注射剤もしく
は座剤等の非経口投与剤を挙げることができる。これら
の製剤は、賦形剤、結合剤等の製薬上許容される添加剤
を用いて、既知の方法で製造される。また、上記の RKS
-1778 を有効成分として含有する細胞周期阻害剤、およ
び抗腫瘍剤の臨床的投与量は、年齢、体重、患者の感受
性、症状の程度により異なるが、通常効果的な量は、成
人一日 0.1 mg 〜 1g 程度であり、一日一回又は数回に
わけて投与することも可能である。また、必要により上
記の範囲外の量を用いることができる。

【００１２】また生化学試験用試薬として使用する場
合、有機溶剤または含水有機溶剤に溶解して各種培養細
胞系へ直接投与すると、細胞周期の進行を M期で成長を
抑制する。使用可能な有機溶剤としては、例えば、メタ
ノールやジメチルスルホキシド等を挙げることができ
る。剤型としては、例えば、粉末または顆粒等の固形剤
もしくは有機溶剤または含水有機溶剤に溶解した液体剤
等を挙げることができる。通常、上記 RKS-1778 を有効
成分とする癌細胞成長抑制の効果的な使用量範囲は１ｘ
10^-7〜１ｘ10^-5g/mLであるが、適切な使用量は培養細胞
系の種類や使用目的により異なる。また、必要により上
記の範囲外の量を用いることができる。

【００１３】

【実施例】以下、実施例等を記載して本発明を具体的に
記載する。〔製造例１〕グリセロール 1％、大豆粉 2％、可溶性澱
粉 3％、酵母エキス 0.3％、塩化カリウム 0.3％、リン
酸二水素カリウム 0.05 ％、硫酸マグネシウム 0.05
％、炭酸カルシウム 0.2％の組成の培地 (pH 6.0) に、
前記菌株フォーマ属 SNF-1778株を接種して28℃で96時
間振盪培養を行った。培養液 1.0 Lを80％アセトン 1 L
を用いて抽出した。吸引濾過、減圧濃縮後得られた水溶
液をpH 7.0に調整し、 1 Lの酢酸エチルで３回抽出を繰
り返した。抽出後、全ての酢酸エチルを合わせて減圧濃
縮し、褐色のシロップ状物質 828 mgを得た。このシロ
ップ状物質 828mgを少量のメタノールに溶解し、メタノ
ールに浸潤した ODSカラム[Sep-Pak Plus Cartridges
(Waters社) （直径 10 mm、長さ 30 mm) ] にのせ、溶
出溶媒にメタノールを用いて溶出した。溶出したメタノ
ール溶液を減圧濃縮することによって褐色油状物質を得
た。続いて、ODS カラム (直径 10 mm、長さ 250 mm;カ
プセルパック、資生堂社製) と 65 ％含水アセトニトリ
ル溶出溶媒を用いて流速 2.3 mL/分と検出波長 215nm
の条件下で分取高速液体クロマトグラフィーにより精製
を行った。この結果、無色粉末として本発明化合物 RKS
-1778 を 6 mg 得た。以下に当該精製標品 RKS-1778 の
物理化学的性質を表１に、NMR スペクトルデータを表２
及び表３に示す。

【００１４】

【表１】 RKS-1778 の物理化学的性質 ────────────────────────────────── 性状白色粉末融点 117 〜120 ℃ 比旋光度 −20゜(c 0.05, MeOH, 23 ℃）分子式 C₃₀H₃₉NO₄ 分子量 FAB-MS m/z 478 (M+H) ⁺ 分子量 HR-FAB-MS 計算値 478.2958 (M+H)⁺ 実測値 478.2920 IRν_max(KBr) cm^-1 3425, 2925, 1745, 1695 1630, 1235, 965, 625 UVλ_maxnm (MeOH) 末端吸収 Rf値 CHCl₃-MeOH (10:1) 0.67 (Merck Silica gel 60F₂₅₄) 溶解性溶解 CHCl₃, MeOH 不溶 H₂O, n-ヘキサン

【００１５】

【表２】 RKS-1778 の 400 MHz¹H NMR および100 MHz ¹³C NMR 化学シフト値（δ(ppm))^a) ─────────────────────────────── 位置 ¹³C^b) ¹H^C) (J/Hz) 1 175.20 s - 2 - 5.45 br s 3 55.66 d 3.15 m 4 54.00 d 2.17 dd 4.2, 4.3 5 35.17 d 2.45 m 6 137.73 s - 7 127.94 d 5.36 m 8 43.02 d 3.21 m 9 56.04 s - 10 46.00 t 2.58 dd 10.1, 13.4 2.90 dd 4.0, 13.4 11 13.95 q 1.13 d 7.4 12 19.81 q 1.71 s 13 129.08 d 5.82 ddd 1.5, 10.4, 15.3 14 135.38 d 5.23 ddd 4.6, 10.4, 15.3 15 42.66 t 1.76 m 2.00 m

【００１６】

【表３】 RKS-1778 の 400 MHz¹H NMR および100 MHz ¹³C NMR 化学シフト値（δ(ppm))^a) ─────────────────────────────── 位置 ¹³C^b) ¹H^C) (J/Hz) 16 28.59 d 1.76 m 17 53.36 t 1.53 m 1.89 m 18 74.43 s - 19 136.94 d 5.51 dd 2.1, 16.5 20 126.49 d 5.91 dd 2.8, 16.5 21 77.07 d 5.65 dd 2.1, 2.5 22 26.40 q 1.03 d 6.4 23 31.46 q 1.34 s 24 170.05 s - 25 20.91 q 2.21 s 26 137.67 s - 27, 31 128.93 d 7.14 d 7.0 28, 30 128.93 d 7.32 dd 7.0, 7.6 29 126.99 d 7.25d 7.6 a)シグナルは、¹H-¹H COSY、PFG-HMQC、PFG-HMBC、および NOE差スペクトルの結果に基づいて帰属し、内部標準としてTMS を用いた。 b) 100 MHz. c) 400 MHz.

【００１７】本発明化合物の活性は以下の方法に従って
測定した。〔試験例１〕 RKS-1778 の細胞周期阻害活性細胞は、M 期、G1期、S 期、G2期という一連の過程から
なる細胞周期を回転することにより分裂・増殖する。こ
の細胞周期の制御機構に異常が生じると恒常性に乱れが
生じ、癌や免疫疾患になる可能性が高まる。tsFT210 細
胞は、細胞周期の調節蛋白質である p34^cdc2キナーゼが
温度感受性に変異したマウス乳癌細胞であり、通常、32
℃で 5% 仔牛血清を含む RPMI1640培地にて 5% 炭酸ガ
スと水蒸気を飽和させた培養器内で培養する。tsFT210
細胞を、非許容温度(39 ℃）において培養すると、細胞
周期が G2 期で停止し、これを許容温度(32 ℃）にシフ
トダウンすると細胞は再び細胞分裂を開始して G1 期に
移行する。シフトダウンと同時に一連の希釈系列の RKS
-1778を添加し、18時間後の細胞周期の進行をフローサ
イトメトリーにより解析した。結果を表４に示す。

【００１８】

【表４】 RKS-1778 の tsFT210細胞における細胞周期阻害活性 ───────────────────────────── 化合物濃度Ｍ期停止効果 RKS-1778 0.21 μＭ − RKS-1778 0.63 μＭ＋ RKS-1778 2.1 μＭ＋＋＋ RKS-1778 6.3 μＭ＋＋＋ RKS-1778 21 μＭ＋＋＋注）−：阻害効果なし、＋：弱く M期で停止（＜25％）、＋＋：M 期で停止 (25 〜50％）、＋＋＋：強く M期で停止（＞50％）

【００１９】表４の結果は、本発明の RKS-1778 が細胞
周期阻害剤、および抗腫瘍剤とし有効であることを示し
ている。

【００２０】〔試験例２〕 RKS-1778 の細胞増殖抑制効
果 K562及び HL-60細胞を RPMI 1640培地(10%の牛胎仔血清
を含む) で、 WI-38細胞を DMEM 培地(10%の牛胎仔血清
を含む) で、5%炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内
で培養した。これに一連の希釈系列のRKS-1778を加え、
24時間培養した後、MTT 試薬を加えて生育を計測した。
その結果を表５に示す。

【００２１】

【表５】 RKS-1778の細胞増殖抑制効果 IC50値 [50％増殖抑制濃度 (mM) で示す] ──────────────────── 被検細胞 IC50 K-562 7.0 HL-60 5.6 WI-38 ＞10 K-562 ：ヒト慢性骨髄性白血病細胞 HL-60 ：ヒト前骨髄性白血病細胞 WI-38 ：ヒト肺線維芽細胞

【００２２】表５の結果は、本発明の RKS-1778 が抗腫
瘍剤とし有効であることを示している。

【００２３】〔製剤例１〕（注射・点滴剤） RKS-1778 10 mgを含有するように、粉末ブドウ糖 5 gを
加えてバイアルに無菌的に分配し密封し、窒素、ヘリウ
ムなどの不活性ガスを封入して冷暗所に保存した。使用
前にエタノールに溶解し、0.85% 生理的食塩水 100 ml
を添加して静脈内注射剤とし、一日、10-100 ml を症状
に応じて静脈内注射または点滴で投与する。〔製剤例２〕（顆粒剤） RKS-1778 1 g、乳糖 98 g 及びヒドロキシプロピルセル
ロース 1 gを各々取り、よく混合した後、常法に従って
粒状に形成し、これをよく乾燥して、瓶、ヒートシール
包装などに適した顆粒剤を製造した。一日、100-1000 m
g を症状に応じて経口投与できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】RKS-1778の赤外線吸収スペクトル (KBr)を示
す。

【図２】RKS-1778の¹H NMR (CDCl₃) スペクトルを示
す。

【図３】RKS-1778の¹³C NMR (CDCl₃) スペクトルを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (72)発明者吉浜誠栃木県宇都宮市江曽島町1400−８ (72)発明者木村賢一栃木県宇都宮市平松町878−９

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式 (I)で表される RKS-1778 。【化１】
【請求項２】培地中に請求項１記載の式（Ｉ）で表さ
れる RKS-1778 を生産するフォーマ (Phoma)属に属する
生産菌 SNF-1778 株を培養し、RKS-1778を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする、 RKS-1778 の製
造方法。
【請求項３】請求項１記載の式（Ｉ）で表されるRKS-
1778を有効成分とする細胞周期阻害剤。
【請求項４】請求項１記載の式（Ｉ）で表されるRKS-
1778を有効成分とする抗腫瘍剤。