JPH08504332A - 組重ね式複製連鎖反応を用いる核酸の標的セグメントの増幅の改良方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示された方法に従って外部及び内部の両方のプライマー・セットのアニーリング時間及び濃度を制御することにより、反応混合物容器から外部プライマーを減少させることなく又は除去することなく１つの反応混合物容器中でＤＮＡの標的部分の高度に特異的でかつ効率的な増幅が達成できる、ＤＮＡの標的部分の組重ね式複製連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行う改良方法。

Description

【発明の詳細な説明】 組重ね式複製連鎖反応を用いる核酸の 標的セグメントの増幅の改良方法発明の分野 本発明は核酸の標的セグメントの複製連鎖反応増幅を行う改良方法に関し、開 示された方法に従って外部及び内部（組重ね式）のプライマーの濃度並びに第１ 及び第２段階のアニーリング時間を操作することにより、核酸の標的セグメント の高度に特異的でかつ効率的な増幅を１つの反応器中で達成できる。該方法はプ ライマーを減少させることなく又は除去することなく外部プライマーの全量が増 幅の第２段階中維持されることを特徴とする。本出願人は食物中の微生物汚染物 質の迅速な同定のための高感度アッセイの方法を具体化した。発明の背 景 米国特許第４，６８３，２０２号及び同第４，６８３，１９５号明細書には、 複製連鎖反応又はＰＣＲとして知られている方法で核酸配列を増幅しそして検出 する方法が記載されている。ＰＣＲ法は３つの基本的工程からなる：１）高温下 における鋳型鎖の変性；２）注目の配列の３’末端で鋳型ＤＮＡに対してオリゴ ヌクレオチド・プライマーをハイブリッド形成させる温度におけるアニーリング ；及び３）ヌクレオチド三リン酸の存在下での耐熱性ポリメラーゼによる、所望 の鋳型配列を複製するためのプライマーの３’末端からの伸長。いずれのサイク ルのプライマー伸長産物もその後のサイクルで複製のための鋳型となりそして 標的配列が指数関数的に増幅されるようなサイクル方式で工程１〜３が繰り返さ れる。 また米国特許第４，６８３，２０２号明細書は第１のプライマー・セットで増 幅されたＤＮＡ配列内に含まれるより小さなＤＮＡ配列を増幅するために第２の プライマー・セットを用いるＰＣＲの段階的方法を特許請求している。 数多くの刊行物でＰＣＲの最適化が考えられている（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎｓ，Ｉｎｎｉｓ Ｍ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ Ｄ．Ｈ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ ．Ｊ．，ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ，ＮＹ，１ ９９０；Ｌｉｎｚ，Ｕ，Ｄｅｌｌｉｎｇ，Ｕ．ａｎｄ Ｒｕｂｓａｍｅｎ−Ｗａ ｉｇｍａｎｎ，Ｈ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２８，５，１９９０；Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｗ．Ｊ．，ａｎ ｄ Ｒｈｏａｄｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６４０ ９，１９９０；Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．，Ｕｇｇｏｚｏｌｉ，Ｌ．，Ｐａｌ，Ｂ．Ｋ．， Ｑｉａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉ ｏｌ．，１０，．２３３，１９９１）。緩衝液、マグネシウム、ヌクレオチド三 リン酸、プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ濃度並びにサイクル中に用いられる 時間及び温度の選択について指針が示されている。プライマー間の高二次構造又 は相補性を回避するためのプライマー配列の最適な選択について特に強調がなさ れている。また増幅の収率及び選択性を最大にするためのプライマーアニーリン グ温度の最適な選択についても強調がなされている。しかし、増幅の選択性及び 収 率に対するプライマー濃度及びアニーリング温度の影響については記載されてい ない。 組重ね式ＰＣＲは、非標識ＤＮＡ増幅からのバックグランドを減少させる一方 、標識ＤＮＡの検出感度を少なくとも二桁の大きさだけ増大させることが示され てきている（Ｇａｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｔｅｄｄｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｂｒｉｇｇｓ ，Ｍ．，Ｔｕｋｅ，Ｐ．，Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ａ．，Ｔｒｕｔｅ，Ａ． ，Ｐａｒｋｅｒ，Ｄ．，Ｂａｒｂａｒａ，Ｊ．Ａ．，Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｍ． ，ａｎｄ Ａｌｏｙｓｉｕｓ，Ｓ．，Ｌａｎｃｅｔ，３３５，１４１９，１９９ ０；Ｐｏｒｔｅｒ−Ｊｏｒｄａｎ，Ｋ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｉ．，Ｋｅ ｉｓｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｏｓｓ，Ａ．Ｍ．，Ｎａｓｉｍ ，Ｓ．， ａｎｄ Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｃ．Ｔ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，３ ０，８５，１９９０）。組重ね式ＰＣＲを有効に行うためには、内部プライマー のみが第２段階でＤＮＡを増幅するように外部プライマー・セットの増幅を第１ 段階後に終了させることが必要である。第２段階への外部プライマーのキャリオ ーバーを低減させるために、従来は第１段階産物を希釈するか（Ｒｉｍｓｔａｄ ，Ｅ．，Ｈｏｒｎｅｓ，Ｅ．，Ｏｌｓｖｉｋ，Ｏ．，ａｎｄ Ｈｙｌｌｓｅｔｈ ，Ｂ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８，２２７５，１９９０）、 或いはそれの少量の画分（２〜１０％）だけを第２段階反応混合物に添加してい る（Ｗｅｌｃｈ，Ｄ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．，ａｎｄ Ｌａｒｓｅｎ，Ｓ．Ｈ．， Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５６，２４９４，１９９０）。 Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ，Ｕ．Ｂ．及びＥｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，７６５２，１９８８，に はプライマー対の一方が通常濃度の五十分の一又は百分の一で存在する非対称増 幅が記載されている。十分なサイクルを行うことにより低濃度で存在するプライ マーが減少するため、残りのプライマーから作出されるＤＮＡがその後のサイク ルで選択的に富むことになる。該プライマー減少方法は第１段階プライマーを減 少させるのに必要なサイクル数が最初に存在する鋳型ＤＮＡ濃度に依存するとい う欠点を有する。最初に低濃度のサンプルＤＮＡが存在する状況下では、必要な サイクル数はかなり大きくなるので（３０〜４０）、該方法は１段階当たり低サ イクル数（２０〜２５）に依存する組重ね法に最適ではない。 五十嵐ら，欧州特許出願公開第０４９６１０号公報は、組重ね式ＰＣＲの第１ 段階での低減されたプライマー濃度によりバックグランド増幅に対する優れた標 的が生じるアッセイを特許請求している。低減された第１段階プライマー濃度は この発明中で記載されている動力学的に制御された方法における不可欠部分であ る。しかし、五十嵐らの組重ねプロトコルは少なくとも３つの点で本発明の方法 と異なっている。１）低減されたプライマー濃度と協調した増大アニーリング時 間が第１段階において増幅の高効率を得るために必須であることを、本発明の方 法は例証している。五十嵐らでは両段階において一定のアニーリング時間で操作 している。２）各々のプライマー／鋳型組み合わせのアニーリング動力学に基づ いてプライマー濃度及びアニーリング時間を選択しなければならないことを、本 発明の方法は例証している。五十嵐らには本願の特許請求された改良を最大にす るための最適増幅条件に到達する方法が開示されていない。３）五十嵐らは増幅 の第１段階の産物のわずかに１０％だけを第２段階に用いているのに対して、本 発明の方法では第１段階の 全産物を第２段階に用いている。 Ｙｏｕｒｎｏ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ，２，６０，１９９２，には単一段階増幅よりも約１００倍高感度である、単一 の閉じた増幅チューブ内での組重ね式ＰＣＲ法が記載されている。この方法では 、第２段階のプライマー及び反応混合物を温度循環液体上に位置するチューブの 冷却部分の高融点アガロースに閉じ込めてこれらを第１段階増幅から隔離してお く。第２段階の前にチューブを遠心させてアガロースを温度循環部分に下降させ 、そこでアガロースを熔融させてそして第２段階試薬を放出させている。またＹ ｏｕｒｎｏでは数倍低減した第１段階プライマー濃度で操作している。さらに、 この明細書には第１及び第２段階における一定のアニーリング時間が教示されて いるが；各段階における各プライマーの増幅効率については考慮がなされてなく ；そして増幅条件を操作するためのいかなる動力学的モデルも開示されてなく結 果として組重ね法の最適な実施も開示されていない。 Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ Ｄ．及びＳｎｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｊ ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，１６４３，１９９１，には両方のプライマー対を 最初に存在させ、そして増幅過程中に反応混合物の操作が不要であり、それによ りサンプル交差汚染の危険を低減する「ドロップ−イン（ｄｒｏｐ−ｉｎ）、ド ロップ−アウト（ｄｒｏｐ−ｏｕｔ）」組重ねが記載されている。外部プライマ ー・セットは内部セットよりも長いか或いはより高いＧＣ含量を有する。さらに 、それは外部プライマー・セットの伸長産物が内部プライマー伸長産物よりも相 当長いか或いはより高いＧＣ含量を有することを意味する。第１段階で十分に高 いア ニーリング及び変性温度を用いる場合には、内部プライマーのアニーリングが防 止される一方、外部プライマーのアニーリング、伸長及び変性が進行する。内部 プライマーのアニーリングを可能とし、外部プライマー伸長産物の変性を防止す るために、第２段階でアニーリング及び変性温度を低下させる。従って、内部プ ライマーは第２段階で低下アニーリング温度で進行して「ドロップ−イン」し、 そして外部プライマー増幅は低下変性温度で「ドロップ−アウト」する。あるい は、非対称増幅と類似の方法により第１段階で外部プライマーを減少させて外部 プライマーを「ドロップ−アウト」させることができる。低下変性温度で「ドロ ップ−アウト」させたプライマーの一般的な利用性及び効果は記載されていない 。 ＤＮＡに対するオリドヌクレオチド・プローブのアニーリング及びゲノムＤＮ Ａの変性鎖の再アニーリングが研究されてきており（Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｒ．Ｊ． ，ａｎｄ Ｋｏｈｎｅ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６１，５２９，１９６８ ，Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．，Ｊ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，３１，３２９，１９ ６８，Ｙｏｕｎｇ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， １３５，５７３，１９７３）、そして二次であると記載されている。そのような 速度モデルは、検出目的のためのアフィニティー捕捉に関与する研究におけるＤ ＮＡ濃度及び接触時間の関数としてのハイブリッド形成効率を企画している（Ｗ ｏｏｄ，Ｔ．Ｇ．及び Ｌｉｎｇｅｌ Ｊ．Ｂ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５２，４５７，１９７７；ａｎｄ Ｍｃ Ｍａｈｏｎ，Ｍ．Ｅ．，欧州特許出 願公開第９０１０４４１３．１号公報）。しかし、プライマー・アニーリング動 力学はＰＣＲによる遺伝子増幅の設計及び制御にお いて認識されている変数ではない。 本発明は外部プライマーを希釈するか、減少させるか或いはさもなければ除去 する必要がなく、組重ねの第１段階の全産物を第２段階に用いる組重ね式ＰＣＲ を行う方法である。各段階での鋳型に対するプライマー・アニーリングの速度を 単に制御するだけで、第１段階における外部プライマーの効率的で選択的な増幅 並びに第２段階におけるそれらのドロップ−アウト（脱落）を本出願人らは達成 した。各々のプライマー及び鋳型に関して独立にパラメーターを求める本出願人 らの二次動力学的モデルの予測に従って第１及び第２段階におけるプライマー濃 度及びアニーリング時間を注意深く選択しそして制御することにより、アニーリ ング動力学が操作される。 外部プライマーをドロップ−アウトする、動力学的に制御された本出願人の方 法は以下の点で既存の技術から識別できそして有利である。１）組重ね段階を通 じてプライマー・アニーリング温度を変える必要がない；２）いずれかの所望の サイクル数の後に第２段階を活性化できる。３）該方法は出発核酸濃度と無関係 であり、そしてプライマー伸長産物の相対サイズとも無関係である。１つの反応 容器内で該方法を行うことができる。 上述した本出願人の組重ね増幅方法は、分析、診断又は遺伝子クローニングの 目的で核酸の特定セグメントを複製するいずれの方法にも使用できることが企画 されているが、本発明は本願により食物中の微生物汚染物質の同定のための高感 度法において具体化されてきた。特に本出願人の食物診断方法学では第１段階で 注目されている各々の個々の微生物に関して、その微生物に関して診断的な、Ｄ ＮＡのランダムで特異的な セグメントを同定する必要がある。この診断的な核酸セグメントを同定しそして 得るために、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１８，Ｎ ｏ．２２，ｐｐ．６５３１−３５，Ｗｉｌｌｉａｍｓら及び米国特許第５，１２ ６，２３９号明細書（１９９２），イーアイ デュポン ドウ ヌムール アン ド カンパニーに記載されているように、１本鎖プライマーＲＡＰＤ（ランダム に増幅された多型性ＤＮＡ）分析を用いて注目されている各微生物から１群の多 型性マーカーを作出する。各微生物からのＲＡＰＤ群を他の微生物から同様に作 出したＲＡＰＤ群と比較し、そして注目されている各微生物に特異的なＲＡＰＤ マーカーを選択する。次に特異的なマーカーを単離し、増幅しそして配列決定す る。次に各マーカーに対する外部プライマー及び内部プライマーを作ることがで きる。これらプライマーはＲＡＰＤマーカー内の配列セグメントを含むであろう し、そしてプライマーの内部セットは核酸の標的部分の３’末端に相補的であろ う。次に本出願人の改良組重ね式ＰＣＲ増幅法で、これら外部及び内部組重ね式 プライマーを食物サンプルに使用すると、例えば微生物汚染物質の高感度で、迅 速でかつ正確な同定が可能になる。 微生物食物汚染物質を同定するために組重ね式ＰＣＲ技術を用いる他の方法が 公知である。しかし、これら方法のいずれも、増幅の各段階におけるプライマー 濃度及びアニーリング時間を操作して診断的な核酸標的の高効率増幅を達成する 本出願人の改良組重ね式ＰＣＲを使用していない（Ｏｌｉｖｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７，２６１，１９８９；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ ．Ｇ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．，Ａｐｐｌ．Ｅ ｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ．，５７，１７９３，１９９１；Ｆｕｒｒｅｒ，Ｂ．，Ｃａｎｄｒｉａｎ ，Ｕ．，Ｈｏｅｆｅｌｅｉｎ，Ｃ．，ａｎｄ Ｌｕｅｔｈｙ，Ｊ．，Ｊ．Ａｐｐ ｌ．Ｂａｃｔ．，７０，３７２，１９９１）。発明の概要 本出願人はサンプル核酸反応混合物から核酸の標的セグメントを選択的に増幅 する組重ね式複製連鎖反応を行う改良方法を提供する。該方法では、第１段階で 外部プライマー対に隣接した核酸セグメントを増幅しそして第２段階で内部又は 組重ね式プライマー対に隣接した核酸標的セグメントを増幅する。改良には第１ 及び第２段階で外部及び内部プライマーの濃度及びアニーリング時間を制御する ことにより、第２段階中に核酸の標的セグメントを選択的に増幅する方法が含ま れる。該方法は該反応混合物から外部プライマーを減少させることなく又は除去 することなく第１段階反応混合物の全容量が第２段階に用いられることを特徴と する。改良方法は以下の工程を含んでなる： 外部プライマー対を核酸反応混合物に添加してＰ₀₁₁で表される該外部プライ マーの濃度を達成し； 各サイクルにおいてｔ₁で表されるアニーリング時間で複製連鎖反応を繰り返 し行い； 内部（組重ね）プライマー対を核酸反応混合物に添加してＰ₀₂₂で表される該 内部プライマーの濃度を達成し；そして 各サイクルにおいてｔ₂で表されるアニーリング時間で複製連鎖反応を繰り返 し行う； ここでＰ₀₁₁、ｔ₁、Ｐ₀₂₂及びｔ₂は次式に従って選択される、 ε_{max 1}(1−exp-(k₁P₀₁₁t₁))＞0.4 ε_{max 2}(1−exp-(k₂P₀₂₂t₂))＞0.4 ε_{max 1}(1−exp(-k₁P₀₁₂t₂))＜1/5ε_{max 2}(1−exp(-k₂P₀₂₂t₂)) 式中、 Ｐ₀₁₁は第１段階における各外部プライマーの濃度であり； Ｐ₀₂₂は第２段階における各内部プライマーの濃度であり； Ｐ₀₁₂は第２段階における各外部プライマーの濃度であり； ｔ₁は第１段階におけるアニーリング時間であり； ｔ₂は第２段階におけるアニーリング時間であり； ｋ₁は外部プライマーから伸長産物を形成する二次速度定数であり； ｋ₂は内部プライマーから伸長産物を形成する二次速度定数であり； ε_{max 1}は１サイクル当たりの外部プライマーの最大伸長であり；そして ε_{max 2}は１サイクル当たりの内部プライマーの最大伸長である。図面の簡単な説明 図１はプライマー３３−１７−６及び３３−１７−３（表２）を用いたネズミ チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＤＮＡの１０及び ２８サイクルＰＣＲ増幅を比較する。サンプル１〜６はＤＮＡの連続的な１０倍 希釈液であり、最も高濃度のサンプルは生存細胞数に基づいて１ミリリットル当 たりゲノムＤＮＡの５ ｘ １０⁸のコピーである。サンプル７はサルモネラ（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＤＮＡを用いない対照である。 図２はプライマー１５−Ａ２及び１５−Ｌ（表２）を用いた大腸菌（Ｅ ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡの８及び２７サイクルＰＣＲ増幅を比較する。サンプル１〜 ６はＤＮＡの連続的な１０倍希釈液であり、最も高濃度のサンプルは生存細胞数 に基づいて１ミリリットル当たりゲノムＤＮＡの２ ｘ １０⁹のコピーである 。サンプル７は大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡを用いない対照である。 図３は種々のプライマー濃度及びアニーリング時間におけるプライマー３３− １７−３及び３３−１７−６（表２）を用いたネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＤＮＡの増幅を比較する。図１と同一のサン プルを用いた。 図４は図３及び表３のデータから得られたプライマー濃度とアニーリング時間 の積に対する１段階当たりの増幅効率のプロットである。またデータに対する動 力学的モデルの最適適合（ｆｉｔ）が認められる。 図５は種々のプライマー濃度及びアニーリング時間におけるプライマー３３− １７−１．５及び３３−１７−５．８（表２）を用いたネズミチフス菌（Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＤＮＡの増幅を比較する。図１と同 一のサンプルを用いた。 図６は図５及び表４のデータから得られたプライマー濃度とアニーリング時間 の積に対する１段階当たりの増幅効率のプロットである。またデータに対する動 力学的モデルの最適適合が認められる。 図７は種々のプライマー濃度及びアニーリング時間におけるプライマー１５− Ａ２及び１５−Ｌ（表２）を用いた大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡの増幅を比較 する。サンプル１〜６はＤＮＡの連続的な１０倍希釈液であり、最も高濃度のサ ンプルは生存細胞数に基づいて１ミリリットル当たりゲノムＤＮＡの２ ｘ １ ０⁹のコピーである。サンプル７は 大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡを用いない対照である。 図８は図７及び表５のデータから得られたプライマー濃度とアニーリング時間 の積に対する１段階当たりの増幅効率のプロットである。またデータに対する動 力学的モデルの最適適合が認められる。 図９は図１に記載されているサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＤＮＡサン プルを使用して外部プライマー３３−１７−３及び３３−１７−６並びに内部プ ライマー３３−１７−９及び３３−１７−１２ａを用いた動力学的に制御された 組重ねを例証する。各段階を分離した場合、２つの段階を併合した場合並びに第 １段階を連続して２回行った場合の結果を示す。 図１０は図１に記載されているサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＤＮＡサ ンプルを使用して外部プライマー３３−１７−１．５及び３３−１７−５．８並 びに内部プライマー３３−１７−３及び３３−１７−６を用いた動力学的に制御 された組重ねを例証する。各段階を分離した場合、２つの段階を併合した場合並 びに第１段階を連続して２回行った場合の結果を示す。 図１１は図２に記載されている大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡサンプルを使用 して外部プライマー１５−Ａ２及び１５−Ｌ並びに内部プライマー１５−Ｇ及び １５−Ｙを用いた動力学的に制御された組重ねを例証する。各段階を分離した場 合、２つの段階を併合した場合並びに第１段階を連続して２回行った場合の結果 を示す。 図１２は表６に列挙されている食物サンプルに適用した動力学的に制御された 組重ねの結果を示す。外部プライマー対は３３−２３−１．５及び３３−２３− ５．８であり、そして内部プライマー対は３３−２３ −３及び３３−２３−６であった。 図１３は任意の１２マー（ｍｅｒ）プライマーＣＮ０３を用いたサルモネラ（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ゲノムＤＮＡのパネルの増幅で得られたＲＡＰＤパター ンを示す。 図１４は任意の１２マー（ｍｅｒ）プライマーＣＮ０３を用いた非サルモネラ （ｎｏｎ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ゲノムＤＮＡのパネルの増幅で得られたＲＡ ＰＤパターンを示す。詳細な説明 以下の述語は本願の目的においては後述の意味を有するものと意図される。 「組重ね式複製連鎖反応（ｎｅｓｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」は、核酸の特定の第１セグメントに隣接した「外部（ｏ ｕｔｅｒ）」プライマーの対を第１段階で第１セグメントを複製するのに使用し ；次いで第２段階で「内部（ｉｎｎｅｒ）」又は「組重ね式（ｎｅｓｔｅｄ）」 プライマーの第２の対を第１セグメント内に含まれている核酸のより小さな「標 的（ｔａｒｇｅｔ）」セグメントを複製するのに使用する段階的な複製連鎖反応 プロセスをいう。内部又は組重ね式プライマーはその標的核酸に隣接するであろ う。「隣接したプライマー（フランキングプライマー）（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｐ ｒｉｍｅｒ）」はＰＣＲプロセス中に重合されそして増幅される２本鎖核酸セグ メントの３’末端部分のセグメントに相補的なプライマーを記述するのに用いら れる。複製連鎖反応（ＰＣＲ）及び組重ね式（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法は米国特 許第４，６８３，２０２号明細書に開示されているが、これは引用されて本明細 書に組み込まれる。本出願人は２つ のプライマー及び組重ねの２つの段階を用いる本発明の改良組重ね式ＰＣＲ法を 具体化したが、本発明の方法は組重ねの３つ又はもっと多い段階を用いる方法に も等しく適用可能である。バックグランドを超える標的の増幅のさらなる選択性 が要求される場合には組重ねの２段階以上が重要になり得るであろう。また、組 重ねの第１段階の終了後に内部組重ね式プライマー・セットを反応混合物に添加 する本発明の組重ね式ＰＣＲ法も具体化された。しかしまた、反応の第１段階の 前にプライマーの両方のセットを反応混合物に添加しそして温度サイクル（ｔｅ ｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｅｒ）の開始後に試薬を添加しないか或いは混合 物から除去しない、選択的でかつ高効率の動力学的に制御された組重ね式増幅を 達成する本出願人の方法も実施できる。この「動力学的に制御された非中断（ｋ ｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ） 」組重ね法は従来技術に記載されている「ドロップ−イン ドロップ−アウト」 組重ね法と同様の方法で実施でき、増幅中に増幅反応チューブを開ける必要がな いため、サンプル交差汚染の機会が減少する。本出願人の「動力学的に制御され た非中断」組重ねは、本発明の動力学的モデルに従いプライマー濃度及びアニー リング時間を操作することにより、そしてプライマーの減少或いは変性温度の変 動によるのではなく、プライマー対の活性又は失活が達成される点で「ドロップ −イン ドロップ−アウト 組重ね」と異なる。 非中断の動力学的に制御された組重ねの例として、誰でも以下の改変を加えて 本明細書中に具体化された方法を実施できるであろう。 １）外部プライマーは内部セットよりもより長いか或いはより高いＧＣ含量を有 しなければならない。２）第１段階のアニーリング温度は外部 プライマーが効率的にアニーリングするが内部プライマーがアニーリングしない ような十分に高い温度でなければならない。３）第２段階のアニーリング温度は 内部プライマーが効率的にアニーリングできるような十分に低い温度でなければ ならない。４）動力学的パラメータε_{max 1}，ｋ₁，ε_{max 2}及びｋ₂は２つのアニ ーリング温度で求めなければならない。そして５）全ての動力学的な観点から第 ２段階における第１段階アニーリング温度と第２段階アニーリング温度との間で 温度サイクルが費やす時間を外部プライマーに適用されるアニーリング時間に加 えなければならない。「動力学的に制御された非中断組重ね」の制御式は以下の ようになる。 ε_{max 1}(T₁)(1−exp-(k₁(T₁)P₀₁t₁))＞0.4 ε_{max 2}(T₂)(1−exp-(k₂(T₂)P₀₂t₂))＞0.4 ε_{max 1}(T₂)(1−exp-(k₁(T₂)P₀₁(t₂+△t)))＜ 1/5 ε_{max 2}(T₂)(1−exp-(k₂(T₂)p₀₂t₂)) 式中、 Ｐ₀₁は外部プライマーの濃度であり； Ｐ₀₂は内部（組重ね式）プライマーの濃度であり； Ｔ₁は第１段階アニーリング温度であり； Ｔ₂は第２段階アニーリング温度であり； ｋ₁（Ｔ₁）、ｋ₁（Ｔ₂）、ε_max1（Ｔ₁）、ε_max1（Ｔ₂）、ε_max2（Ｔ₂）、 ｋ₂（Ｔ₂）は所定のアニーリング温度で求めたアニーリング動力学的パラメータ であり；△ｔは第２段階における２つのアニーリング温度の間で温度サイクルが 費やす時間である。 この改変方法では、内部プライマーを物理的に添加するよりもむしろ アニーリング温度を下降させて内部プライマーを第２段階の前に導入する。 「増幅（ａｍｐｌｉｆｙ）」又は「選択的な増幅（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｍｐｌｉｆｙ）」により本出願人は核酸の標的配列の少なくとも１００のファ クターだけの増加並びにバックグランドＤＮＡ濃度に対して標的ＤＮＡ濃度の少 なくとも１００のファクターだけの豊富化を意味する。 「サンプル核酸混合物（ｓａｍｐｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｉｘｔ ｕｒｅ）」により本出願人はいずれかの植物、動物、酵母、微生物又はウイルス 生物を包含するいずれかの生息給源に由来する核酸或いは核酸を含むいずれかの その部分を包含する；生物のいずれかの個体群、菌株、菌種又は属からの核酸及 びその混合物を含むサンプルを意味する。例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及びウシからのＤＮＡからなるサンプル中 に含まれているサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属中のゲノムＤＮＡのセグ メントの増幅に該方法は適用できる。他の例としては、飲料、食物を含むサンプ ル中のリステリア・モノシトゲネス菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ ｅｎｅｓ）種もしくはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属又はブドウ球菌（Ｓｔ ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）種又は大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）種も しくは腸管毒性大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）亜種、及び他の微生物内の配列の検出が 挙げられる。また本発明は特に環境サンプル、例えば水、土壌又は植物サンプル 、からの核酸を増幅してそれらの中に存在するかもしれない微生物の存在を検出 するのにも好適である。さらに本発明は診断又は法医学の目的のために原核生物 、真核生物 又は細菌細胞の核酸の増幅にも適用できる。これら種類の生物給源の典型例には 血液、尿、組織、精液、細菌及び毛髪を含むヒト又は動物サンプルが含まれる。動力学的モデル ＰＣＲにおけるアニーリング動力学の記述に近似する数学モデルが開発された （式１）。鋳型ＤＮＡ鎖に対するプライマーのハイブリッド形成は二次動力学的 プロセスとしてモデル化された。二次動力学は一本鎖ＤＮＡに対するＲＮＡ又は ＤＮＡプローブのアニーリング並びに変性二本鎖ＤＮＡの再アニーリングを正確 に記述する（Ｙｏｕｎｇ，Ｂ．Ｄ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，１３５，５７３，１９７３ ａｎｄ Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋｏｈｎｅ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６１，５２９，１９６８）。従っ て、アニーリング速度は次式で示される。 式中、Ｈは鋳型ＤＮＡにハイブリッド形成したプライマーの濃度であり、Ｄはハ イブリッド形成しない鋳型の濃度であり、Ｐはハイブリッド形成しないプライマ ーの濃度であり、ｔは時間であり、そしてｋは二次速度定数である。ＰＣＲ反応 では、反対側の鎖にアニーリングする２つのプライマーが存在するためこの表示 は近似となる。従って、ＰＣＲに関して、式１に表されるアニーリング速度は２ つのプライマーのアニーリング速度の合計か或いは２つのアニーリング速度のう ちの遅い方のいずれかとみなすことができる。 ＰＣＲにおいては、変性工程後、アニーリング温度に到達するとハイ ブリッド形成プロセスが開始される。従って、初期状態は次式のように表される 。 ｔ＝０，Ｈ＝０で （２） 組重ね式ＰＣＲの特定方法では外部プライマー対の減少が要求される（Ｅｒｌ ｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，ａｎｄ Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ． ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，１６４３，１９９１）。対照的に、外部プライマー を減少することなく本発明の方法は最良に働き、そして組重ね式増幅の第２段階 への推移に伴い、外部プライマーのコピー数は伸長産物のコピー数より相当多く なる。従って、本発明の動力学的制御方法の間中プライマーは過剰である。その 結果、式１のプライマー濃度は増幅反応の開始時に添加された当初のプライマー 濃度と等しい定数であるとみなすことができる。従って、Ｐ＝Ｐ₀となる。最後 に、ハイブリッド形成したそしてハイブリッド形成しない鋳型の濃度の合計はサ イクルのアニーリング・セグメントの開始時の全鋳型ＤＮＡ濃度に等しい。 Ｈ＋Ｄ＝Ｄ₀ （３） 式及び初期条件１〜３を解くと次式が与えられる。 Ｈ／Ｄ₀＝α＝（１−ｅｘｐ−（ｋ Ｐ₀ｔ）） （４） 式４には、サイクルのアニーリング・セグメントにおいては鋳型にハイブリッ ド形成したプライマーの濃度はゼロで開始し、そして時間ｔが経過（増大）する につれて全鋳型ＤＮＡ濃度に漸近的に近づくことが記述されている。ハイブリッ ド形成の終了に近づく速度は、異なるプライマー配列、プライマーの長さ、アニ ーリング温度、塩濃度及び鋳型ＤＮＡの起源により異なる１つの固有パラメータ ｋで支配される。唯一の制 御変数はＰ₀ｔ、プライマー濃度とアニーリング時間の積である。変数の組み合 わせの積が等しい限り、プライマー濃度とアニーリング時間の異なる組み合わせ が同一の結果を達成できることは明白である。 本発明で推薦されている動力学的制御中、ＰＣＲプロセスの律速段階は鋳型に 対するプライマーのアニーリングの速度であると仮定されている。すなわち、Ｔ ａｑポリメラーゼ酵素（又は他の重合酵素）が反応混合物内で、鋳型にアニーリ ングしたすべてのプライマーを完全に伸長させるのに十分な活性を有すると仮定 されている。産物が高濃度に達する増幅の非常に後期の段階ではこの仮定は破れ る。しかし、実際上の観点からこの後期は本発明の動力学的に制御された組重ね 式プロセスの設計においては無視できる。従って、この仮定によればＰＣＲのＮ サイクルにわたる増幅度は次式で与えられる。 Ａ＝（１＋α）^N （５） 式中、ＡはＰＣＲの終了時の伸長産物のモル濃度を最初に存在する鋳型ＤＮＡの モル濃度で割ったものとして定義された増幅度である。コピー数（ｃｏｐｉｅｓ ）／ｍｌで表されるＤＮＡ濃度もＡと同一の値となる。式５は、すべてのアニー リングしたプライマーが増幅の各サイクルで伸長され、そして最終増幅は各サイ クルで作られた伸長産物の合計であることを明白に示している。サイクルＮの伸 長産物はサイクルＮ＋１の鋳型となる。 式５への１つの最終的な追加はモデルの現実のデータに対する適合性を改良す る。 Ａ＝（１＋Ｅ）^N （６） Ｅ＝ε_maxα 式中、ε_maxは１サイクル当たりの最大効率を表し、その値は０及び１の間であ る。 １サイクル中で伸長産物を作る鋳型分子の部分は部分ε_maxを超えることがで きない。このモデルを有効利用するにはこの制限の物理的解釈は必要ではない。 示唆されたモデルに従い、所定のプライマー／鋳型系に関してパラメータ値ε_max 及びＫを一旦知れば、１サイクル当たり及びいずれかのサイクル数にわたる 増幅効率はプライマー濃度及びアニーリング時間から予測できる。この予測可能 性により、誰でも本発明の組重ね法に用いる各段階での外部及び内部組重ね濃度 及びアニーリング時間を最適に選択できる。 Ｗｕら（Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．，Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．，Ｐａｌ，Ｂ．Ｋ．，Ｑｕ ｉａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌ．，１０，２３３，１９９１）はＰＣＲに関する最適アニーリング温度がプラ イマー及びその相補的オリゴヌクレオチドの融点より高いことを認めた。ＰＣＲ の間中、プライマーが鋳型に完全にはアニーリングしないで、むしろ酵素がその ３’末端を伸長させるのに十分な配向性でプライマーが鋳型に近づくことを彼ら は示唆している。プライマー伸長産物はアニーリング温度より高い融点を有し、 そしてハイブリッド形成はその温度で終了する。式４及び６のモデルはＷｕらが 提唱したメカニズムを説明する。Ｔａｑポリメラーゼによる鋳型の伸長を可能に する配向性で鋳型に近づくプライマー分子の部分としてＨを再定義する必要があ るだけである。動力学的パラメータの求め方 動力学的パラメータｋ及びε_maxは異なるプライマー、鋳型及びアニーリング 条件によって異なった値をとることは公知である。以下の議論により、いずれか の特定系中の実験データからモデルパラメータを求める好ましい態様が説明され る。さらに、本発明の実施に際して組重ねパラメータを修正するために、他のモ デル並びにパラメータの求め方が試行錯誤的であってさえ使用できる。 第１に、全増幅因子Ａは実験的に測定しなければならない。ＤＮＡ濃度は種々 の公知の方法、例えば放射標識により測定でき；鋳型ＤＮＡは放射能を帯びさせ ることができ、放射標識されたプライマー又はヌクレオチド三リン酸を増幅緩衝 液中に導入できる。さらに、ＤＮＡをゲル電気泳動で分離し、染色しそして精製 したＤＮＡをデンシトメトリーにかけ又はＵＶ吸収を測定して濃度を測定できる 。最後に、鋳型ＤＮＡが生存生物のゲノムに由来する場合には、ＤＮＡ濃度は寒 天塗布プレート上のコロニー数により推定できる。 増幅因子Ａはプライマー濃度とアニーリング時間の増加する積の関数として求 められる。式４及び６のモデルはパラメータｋ及びε_maxの推定値を得るために データに最適に適合する。本発明の方法における動力学的モデルの適用 本発明は、組重ね法の３つのパラメータが拘束される組重ね式複製連鎖反応を 行う改良方法である：１）組重ねの第１段階のプライマー伸長産物は外部プライ マー・セットから効率的に形成される；２）組重ねの第２段階のプライマー伸長 産物は内部プライマー・セットから優勢に形成される；そして３）組重ねの第２ 段階のプライマー伸長産物は内部プ ライマー・セットから効率的に形成される。各増幅サイクルで表示されたプライ マーから、サイクルの開始時に存在する少なくとも４０％の鋳型ＤＮＡから伸長 産物が作られるように、効率が定義される。第２段階の各サイクルで、内部プラ イマー・セットから外部セットよりも少なくとも５倍の伸長産物が作られるよう に、優勢さが定義される。記載される態様のさらなる特徴は次の通りである：４ ）有効な希釈なしに並びに外部プライマーを除去することなく又は減少させるこ となしに組重ねの第１段階の全産物が第２段階に用いられる；５）組重ねの両段 階中、同一のアニーリング温度が維持できる；そして６）組重ねの第１段階では 内部又は組重ねプライマーはなく、そしてこれは第１段階の産物に添加される。 本発明の最初の３つのパラメータを満たすには次の動力学的制御能力が要求さ れる：１）各サイクルで４０％より多いＤＮＡ鋳型が伸長されるような第１段階 における外部プライマーの伸長度；２）各サイクルで４０％より多いＤＮＡ鋳型 が伸長されるような、第２段階における内部プライマーの伸長度；及び３）各サ イクルで、外部プライマー産物よりも少なくとも５倍多い内部プライマー伸長産 物が作られるような、第２段階における内部及び外部プライマーの伸長度。 拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を数学的に記述するために、我々はＥ_ij（式６ ）を１サイクル当たりの組重ね段階ｊにおけるプライマー・セットｉで伸長され る鋳型ＤＮＡの部分であると定義した。プライマー・セット１は外部セットであ り、そしてプライマー・セット２は内部セットである。次に、拘束は次の通りで ある：１） Ｅ₁₁＞．４；２） Ｅ₂₂＞０．４；そして３） Ｅ₁₂＜１／５Ｅ₂₂ ． これを達成するには、プライマー伸長を例えばプライマー濃度、アニーリング 時間、アニーリング温度、Ｔａｑポリメラーゼ活性、ＮＴＰ（ヌクレオチド三リ ン酸）濃度、Ｍｇ濃度、ｐＨ，緩衝液組成、伸長時間、伸長温度などの他の反応 変数と相互に関連づけるために、ある程度のレベルのプライマー伸長の律速動力 学についての理解が必要である。本出願人の二次動力学的モデルに従えば、所定 のアニーリング温度では、プライマーの伸長度Ｅは単にＰ₀ｔと表示されるプラ イマー濃度とアニーリング時間の数学的な積だけで決定されるであろう。さらに 、連続的な減少勾配でＰ₀ｔの増加に伴いＥは増加し、そしてプライマーの最大 伸長度に近づく。ＥがＰ₀ｔの増加に伴いその最大値ε_maxに漸近的に近づく速度 は二次速度定数ｋで支配される。モデル式４及び６中のＥ、Ｐ₀及びｔの関係は 次式で示される。 Ｅ＝ε_max（１−ｅｘｐ−（ｋＰ₀ｔ）） ｋ値は所定のアニーリング温度及びポリメラーゼ緩衝液においては各プライマ ー／鋳型系に特徴的であり、温度及び緩衝液組成が変わると変動する。 モデルでは、例えばプライマー濃度及びアニーリング時間のような物理的制御 変数の点から拘束が賦課される。いくつかの新たなパラメータを定義する必要が ある：ｋ_iはプライマー・セットｉのアニーリングに関する二次速度定数ｋであ り；ε_maxiは１サイクル当たりのプライマー・セットｉの最大伸長効率であり； Ｐ_0ijは段階ｊにおけるプライマー・セットｉの濃度であり；そしてｔ_iは段階ｉ のアニーリング時間である。 組重ね式増幅の拘束不等式は次式の通りになる： ε_{max 1}(1−exp-(k₁P₀₁₁t₁))＞0.4 (9) ε_{max 2}(1-exp-(k₂P₀₂₂t₂))＞0.4 (10) ε_{max 1}(1-exp(-k₁P₀₁₂t₂))＜1/5ε_{max 2}(1-exp(-k₂P₀₂₂t₂)) (11) 第２段階の前に内部プライマー・セットが（追加的緩衝液、ＮＴＰ、マグネシ ウム等と一緒に）増幅の第１段階の産物に添加されるという理由のみで、P₀₁₁、 第１段階における外部プライマー濃度はP₀₁₂、第２段階における外部プライマー 濃度と異なる。数学的に記述すれば、P₀₁₁／P₀₁₂＝Ｖ₁／Ｖ₂（式中Ｖ₁及びＶ₂は 第１段階及び第２段階における全反応容量である）である。典型的にはＶ₁／Ｖ₂ は１及び４の間、より典型的には２及び４の間で選択される。 本発明の実施に際して、これら拘束を満たすように、両方のプライマー・セッ トに関するパラメータε_max及びｋを求め、そしてプライマー濃度、アニーリン グ時間及び第２段階の試薬混合物の容量を選択する必要がある。 通常ε_{max 1}及びε_{max 2}は０．８及び０．９の間におおよそ等しく、そして典 型的には(1-exp-(k₁P₀₁₁t₁))は０．７及び０．９の間で選択され、そして(1-exp -(k₂P₀₂₂t₂))は０．７より大きく選択される。 （k₁P₀₁₁t₁は１．２及び２．３の間であり、k₂P₀₂₂t₂は１．２より大きい）。従 って、式９及び１０の左半分はしばしばそれぞれ０．５５及び０．８の間であり 、そして０．５５より大きい。これら拘束を用いれば、式１１を満たすにはk₁P_{0 12} はk₂P₀₂₂よりも少なくとも８のファクターだけ小さくなければならない。最も しばしば、k₂P₀₂₂はk₁P₀₁₂よりも少なくとも１５〜２０のファクターだけ大きく なるように選択される。二次速度定数ｋは組重ね式プライマー・セットの間で４ のファクター未満、そして典型的には２のファクター未満で変動することが観察 されている。 これにより第２段階では内部プライマーが外部プライマーより８〜４０倍高い濃 度で存在することが示唆される。 15＜k₂P₀₂₂/k₁P₀₁₂は15＜V₂k₂P₀₂₂/V₁k₁P₀₁₁を示唆する。さらに、(k₁P₀₁₁t₁) （1.2及び2.3の間）は通常(k₂P₀₂₂t₂)（1.2より大きい）よりも小さいか或いは 等しいので、15＜V₂t₁/V₁t₂である場合には後者の不等式は満たされるであろう 。最後の不等式には、典型的な場合には、第１段階アニーリング時間は第２段階 アニーリング時間よりも第１及び第２段階の容量比に依存するファクター分だけ 長いことが記述されている。例えば、Ｖ₂／Ｖ₁＝２に関しては、第１段階のアニ ーリング時間は第２段階よりも少なくとも７倍長くなければならない。 要約すると、本発明の一般的な拘束式９〜１１はより典型的な場合に関して以 下の式に示されるように簡素化され、一般化される。 1.2＜k₁P₀₁₁t₁＜2.3 (12) 1.2＜k₂P₀₂₂t₂ (13) 15＜V₂t₁/V₁t₂ (14) 2＜V₂/V₁＜4 (15) 本発明の組重ね法を設計する好都合な方法は第１段階のアニーリング時間を約 １６V₁／V₂分に選択することである。次に第１段階における外部プライマー濃度 は式１２を解いて得られる。次に第２段階のアニーリング時間は式１４を用いて 計算される。最後に、第２段階における内部プライマー濃度は式１３から得られ る。 より望ましくないがなお実行可能な本発明の実施方法では、動力学的パラメー タｋ及びε_maxを系統的に求めることなく、試行錯誤的にプライマー濃度及びア ニーリング時間が決定される。他のプライマー／鋳型 系の動力学的パラメータを参照して最初の推定をなし得る。ｋの典型値である１ ０〜４０μＭ分を式１２〜１４の大ざっぱなルールに適用すると、本発明の一般 化された実施に際して以下のパラメータが提供される。 1＜V₂/V₁＜2に関しては (16) t₁=6.5〜13分 P₀₁₁=0.0015〜0.03μＭ t₂=0.5〜1.6分 P₀₂₂＝0.1〜1μＭ 2〈V₂／V₁〈3に関しては (17) t₁=4〜9分 P₀₁₁=0.0025〜0.05μＭ t₂=0.5〜1.6分 P₀₂₂＝0.1〜1μＭ 3〈V₂／V₁〈4に関しては (18) t_l=2.5〜6.5分 P₀₁₁=0.0035〜0.07μＭ t₂=0.5〜1.6分 P₀₂₂=0.1〜1μＭ V₂/V₁の他の値に関してもパラメータは適宜に推定できる。微生物を検出する方法の態様 本出願人の発明の好適な態様においては、未知の食物汚染微生物からのＤＮＡ を含むサンプル反応混合物から特定ＤＮＡセグメントを検出するために改良組重 ね式ＰＣＲ法が実施される。特定微生物に対して特異 的であることが知られているこの混合物からの増幅ＤＮＡセグメントの検出によ り、サンプル混合物中の微生物の存在が決定できる。 属、種、抗原型又は系統レベルで特定微生物に対して診断的であろうＤＮＡの 特異的なセグメントを選択するために、任意のプライマーを用いたスクリーニン グに基づく方法が開発されてきている。任意のプライマーの選択 標的微生物のゲノムをサンプリングする目的で、ＤＮＡ増幅反応により任意の 組成からなる４つの１２−塩基プライマーを調製した。増幅反応に微生物ゲノム ＤＮＡからの産物の特徴的パターンを作出する一本鎖のプライマーを用いた。こ れらパターンで同定された多型性はランダムに増幅された多型性ＤＮＡ（ＲＡＰ Ｄ）マーカーと呼ばれ、そしてＷｉｌｌｉｍａｓらによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２２，ｐｐ．６５３１−６５３ ５に記載されている。プライマーは以下の基準を具備する任意の配列を有する： １）配列は 〉４塩基のプライマー間に適合しない、 ２）一本鎖又は二本鎖の、〉２の塩基配列の繰り返しはない、例えば： ｉ）ＧＧは許容されるが、ＧＧＧは許容されない、 ｉｉ）ＣＴＣＴは許容されるが、ＣＴＣＴＣＴは許容されない、 ３）〉４塩基のプライマー内に逆相補性配列がない、そして ４）プライマーのＧ＋Ｃ組成は５０％である。 これら基準の目的は次の４つの部分からなる： １）微生物ゲノムの広範なサンプリングを保証すること； ２）高繰り返し配列の縮重増幅を減少させること； ３）プライマー−二マー（ｍｅｒ）増幅を減少させること；そして ４）同一の増幅条件下ですべてのプライマーを使用できることを保証すること 。 プライマー配列は次の通りに選択された： 可能な増幅部位を増大させるために、４つの１２−塩基プライマーの第２の群 を順次調製した。 ＣＮ０５〜０８の配列はそれぞれＣＮ０１〜０４の配列に由来する。最後の３ 〜４塩基をプライマーの３’末端から取り出しそしてそれらを５’末端に転移し て、それらを作出した。微生物試験パネルの選択 種々のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）抗原型並びに標準的な同定技術を 用いてサルモネラから識別するのが困難な関連する属の細菌を含む微生物試験パ ネルに従った。試験パネルの組成を表１に示す。 増幅プロトコル ＣＮ０１〜０８群からの個々のプライマーの存在下で微生物のこの試験パネル から単離されたゲノムＤＮＡ上で増幅反応を行った。増幅プロトコルの例を以下 に示す。 １．０．６ｍｌマイクロチューブに、１．２５μｌのゲノムＤＮＡを ２０ｎｇ／μｌで添加する； ２．以下の混合物を調製する：（貯蔵プライマーから新鮮なプライマー溶液を 調製する）。 １０Ｘ反応緩衝液 ５μｌ プライマー（１０μｍ） ２．５μｌ ｄＮＴＰ混合物（５ｍＭにおけるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ２μｌ ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ） 脱イオン水 ３５μｌ ３．４４．５μｌの混合物を各チューブに添加する。 ４．反応混合物を５分間９４℃に加熱し、そして短時間微量遠心（ｍｉｃｒｏ ｆｕｇｅ）する。 ５．１部のＴａｑポリメラーゼを３部のＴａｑ希釈緩衝液（１０ｍモルトリス ．塩酸、Ｐｈ８．０、１．０％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）と混合し、そし て１．６μｌの希釈されたＴａｑポリメラーゼを各チューブに添加し、渦巻状に 回転し、短時間微量遠心する。Ｔａｑポリメラーゼは例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌ ｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，コネチカット州、から商業的に容易に入 手できる。 ６．９３℃で３０秒間；４６℃で５分間；３分間ランプ（ｒａｍｐ）そして７ ２℃で２分間；の温度プロフィル（ｐｒｏｆｉｌｅ）で２８サイクルを行う。自 動熱サイクル器は例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌ ｋ，コネチカット州、から商業的に容易に入手できる。 ７．５．０μｌのアリコートを採り、アクリルアミドゲルにかける。 ローディングパターンは次の通りである：時間マーカー（ＴＭ）、サンプル、サ ンプル、ＴＭ、サンプル、サンプル等。最後のレーンにはまた時間マーカーが含 まれる。産物分析 増幅産物をポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲルの配合は４％のアクリル アミド／ビスアクリルアミド（２９／１の比）であった。電気泳動で流した緩衝 液は０．５Ｘ ＴＢＥであり、ゲルを１４Ｖ／ｃｍの電界強度で４５分間行った 。得られたＲＡＰＤパターンを分析して、すべてのサルモネラ抗原型に共通して 存在するが関連する属には欠ける増幅産物をいずれのプライマーが作出するのか を決定した。次にそのような産物をサルモネラＤＮＡの存在について診断的であ るとみなした。 数個のプライマーが上記基準を満たした。例えば、ＣＮ０３プライマーを用い たサルモネラ及び非サルモネラ試験パネルの増幅を図１３及び１４に示す。該図 のレーンは表１のサンプル番号に対応する。時間マーカーは２２８、４１２、６ ９３、１３３１及び２３０６ｂｐにある。８００塩基対フラグメントはサルモネ ラ間で維持されているようであるが、しかし非サルモネラでは存在しない。特定 のサルモネラでは、８００ｂｐフラグメントは微弱であり図中で見るのが困難で ある。所望のバンドの微弱さはおそらく増幅フラグメントを作出する他のＤＮＡ 配列による１２マー（ｍｅｒ）プライマーとの競合に起因するのであろう。さら に、ＲＡＰＤパターンは同様であるように見えるが、サルモネラ・アリゾナ（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｒｉｚｏｎａｅ）バンドはわずかにシフトしている。１ ２マー（ｍｅｒ）を用いるこれら複雑さにもかかわらず、増幅ＣＮ０３フラグメ ント内の配列から選択された１７〜２３マー（ｍ ｅｒ）は明瞭なバンドを生じ、そして試験した数百個のサルモネラ菌株の９９％ よりも多くて維持された。サルモネラ特異性ＣＮ０３増幅産物の特性決定 特定フラグメントからのＤＮＡ配列に基づく組重ね式増幅を実施するために、 最初にフラグメントの正確な配列組成を決定する必要がある。配列決定は当該技 術において公知である数種の方法のいずれで行ってもよいが、本発明では、ネズ ミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ） Ｄｕ Ｐｏｎ ｔ菌株番号５８７のゲノムＤＮＡからはじめに増幅されたフラグメントを低融点 のアガロースから単離し、次に豊富な量に再増幅した。次に再増幅産物を制限酵 素で消化させて同一の１２−塩基末端を有しない配列決定可能なフラグメントを 作出した。制限産物を低融点のアガロースゲル上で分離しそして単離した。蛍光 標識ジデオキシヌクレオチド及びジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）（商標）２００ ０ＤＮＡ分析システムを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）配列法で、これらフラ グメントの初期（ｉｎｉｔｉａｌ）配列を決定した。プライマーＣＮ０３を両方 のフラグメントに対しての初期配列プライマーとしても用いた。プライマーＣＮ ０３内部の配列を一旦決定した後、ＣＮ０３サルモネラ・フラグメントの部分を これら内部配列を用いて再増幅した。次にこれら同一の内部プライマーは配列プ ライマーとしても働いた。 配列決定されたＣＮ０３フラグメントから塩基長１７〜２６の多数のプライマ ー対を組重ね式増幅用に選択した。その中のいくつかが表２に列挙されているこ れらプライマーは、例えばシトロバクテール（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢 菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）及びエシェリヒア（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のような関連する属からのゲノムＤＮＡの増幅に比較し てサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ゲノムＤＮＡ配列の増幅に対して１００ ０倍より大きい選択性を有する。 大腸菌標的セグメントの選択 特定生物に特徴的な核酸のセグメントが既知である場合には、本発明は特定生 物の存在を同定するためにそのセグメントを増幅する好都合な手段を提供する。 本発明の場合、例えば本出願人が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの特定の特異的 なセグメントを知っていたため、これを大腸菌の存在を検出するための本出願人 の改良組重ね式ＰＣＲ法に用いた。組重ねを例証するために、大腸菌のリボソー ムＲＮＡオペロン内からの プライマー配列を選択した。オペロン配列はＢｒｏｓｌｕｓ，Ｊ．らによりＪ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４８，１０７，１９８１で公表されている。組重ね式ＰＣＲ法 Ａ．増幅プロトコル 以下の条件下でパーキンエルマー（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）９６００熱サ イクル器ですべての増幅を実施した。 熱変性： ９４℃、１５秒 アニーリング： 実施例に表示された時間及び温度 伸長： ７２℃、６０秒 サイクル数： 実施例に表示 増幅試薬： 緩衝液： ５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭ、 ＭｇＣｌ₂、０．００１％ゼラチン ｄＮＴＰ： ２００μＭ ツウィーン（Tween）20： ０．５７％ プライマー： 実施例に表示 酵素： パーキンエルマー（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）からの天然のＴａｑポリメラー ゼ、０．０５単位／μｌ 全ＤＮＡサンプル容量： 実施例に表示 Ｂ．ゲル電気泳動 増幅サンプルを４％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、エチジ ウムブロミド染色し、そしてトランス（ｔｒａｎｓ）照明装置上で観察した。ゲ ルの写真を、コンピュータにインターフェイスで連結したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉ ｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｓｔａｒ １ ＣＣＤ カメラで捕らえ、そしてより後 のプロセシングのためにデジタル方式でイメージを記憶させた。明るいバックグ ランドに対してバンドが暗くなるようにイメージを逆にした。マーカーバンドの 大きさは２２８、４１２、６９３、１３３１及び２３０６ｂｐである。 Ｃ．サルモネラＤＮＡサンプルの調製 ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｄｕ Ｐ ｏｎｔ菌株番号１０８４をＢＨＩブイヨン中で３７℃で１６時間成長させ、１ミ リリットル当たり約５ ｘ １０⁸ コロニー形成単位の最終的な培養物集団に した。培養物の連続的な１０倍希釈液を０．１％ペプトン水で作り、最初の個体 数の十分の一、百分の一、千分の一、一万分の一及び十万分の一の懸濁液を得た 。以下のプロトコルに従いこれら懸濁液のすべてからＤＮＡ抽出物を作った：５ ００μｌの細菌懸濁液、５０ｍＭ トリス ｐＨ８、に溶解した５００μｌの２ ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ及び５０μ１の１％ドデシル硫酸ナトリウムを混合 し、そして最初に５５℃で３０分間次いで９４℃で１０分間インキュベートした 。サンプルを一定量採取してそして−２０℃で凍結した。サルモネラＤＮＡの６ 個の連続的な１０倍減少濃度及びペプトン水ブランクをサルモネラ・サンプル１ 〜７と表示した。 Ｄ．大腸菌ＤＮＡサンプルの調製 大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｄｕ Ｐｏｎｔ菌株Ｎｏ．９２５をＢＨＩブイヨン中 で３７℃で１６時間成長させ、１ミリリットル当たり約 ２ ｘ １０⁹ コロニー形成単位の集団密度にした。この培養物を０．ペプト ン水で連続的に１０倍希釈し、そしてＤＮＡをサルモネラと同一の方法で抽出し た。大腸菌ＤＮＡの６つの連続的な１０倍減少濃度及びペプトン水ブランクを大 腸菌サンプル１〜７と表示した。 Ｅ．増幅ファクターの予測 モデルの動力学的パラメータを求めるには増幅ファクターを予測する必要があ る。増幅ファクターを得るための近似方法をここで述べる。各々０．４８μＭの プライマー３３−１７−３及び３３−１７−６（表２）を用いて２分間のアニー リング時間で６１℃のアニーリング温度でサルモネラＤＮＡサンプル１〜７を増 幅した。５０μｌの全反応容量中、５μｌのサンプルを用いた。図１は１０及び ２８サイクル実施した増幅の結果を示す。これらゲルより、サルモネラＤＮＡの いずれの連続的な希釈液からも微弱に見えるバンドを作出するのに必要な増幅フ ァクターを予測することが可能である。増幅の１０サイクルでは、レーン１に微 弱なバンドが見え（サルモネラ・サンプル１）、そしてより高い希釈液ではバン ドが見られない。増幅の２８サイクルでは、サンプル６に微弱なバンドが見え、 そしてより高いＤＮＡ濃度では明瞭なバンドが見える。１０サイクルゲルのレー ン１及び２８サイクルゲルのレーン６の増幅ＤＮＡ濃度はおおよそ等しいとみな される。動力学的モデルの式６を参照しそしてサンプルが連続的な１０倍希釈液 であることを認識すれば、次式を書くことができる： (1+E)¹⁰x10⁵=(1+E)²⁸ （１５） 式（１５）を解くと、Ｅ＝０．９であり、このことはサイクル平均で９０％の ＤＮＡが複製されることを意味する。サンプル１から微弱なバ ンドを作出するのに必要な増幅ファクターは（１＋Ｅ）¹⁰又は約６００である。 サンプル１〜６のいずれかから微弱なバンドを作出するのに必要な増幅ファクタ ーは６００ｘ１０^(n-1)（式中、ｎはサンプル番号である）である。 各々０．５３μＭのプライマー１５−Ａ２及び１５−Ｌ（表２）を用いて５５ ℃で２分間アニーリングして大腸菌ＤＮＡサンプルを増幅した。２５μｌの全反 応容量中、１μｌのＤＮＡサンプルを用いた。図２は８及び２７サイクルについ ての増幅の結果を示す。８サイクルでは、サンプル１が微弱なバンドを生じるの に対して、より希釈したサンプルレーンはブランクである。２７サイクルでは、 サンプル６が微弱なバンドを生じるのに対して、より濃縮したサンプルは明瞭な バンドを生じる。サルモネラＤＮＡの場合と同じ議論を用いて次式を得る： (1+E)⁸x10⁵=(1+E)²⁷ （１６） 式（１６）を解くと、Ｅ＝０．８３であり、そして大腸菌ＤＮＡサンプル１か ら微弱なバンドを作出するのに必要な増幅ファクターは約１２０である。他のサ ンプル希釈液からバンドを生じるための増幅ファクターは１２０ｘ１０^(n-1)（ 式中、ｎは大腸菌サンプル番号である）である。Ｆ．プライマー・アニーリング動力学的パラメータの予測 セクションＥの方法により、数多くの異なるプライマー濃度及びアニーリング 時間で増幅ファクターを予測した。パラメータε_max及びｋを求めるために式６ をこのデータに適合させた。 プライマー３３−１７−３及び３３−１７−６を用いて図３に示される濃度及 びアニーリング時間でサルモネラ・サンプル１〜７を増幅した。 ５０μｌの全容量中、５μｌのＤＮＡサンプルを用いた。６１℃のアニーリング 温度で３２サイクル増幅を行った。プライマー濃度ｐとアニーリング時間ｔの各 組み合わせに対して、サンプルｎが微弱なバンドを有するようにサンプル番号「 ｎ」を選択し得た。ｎが１又は６でない場合には、より大きい番号のサンプルで はバンドが認められず、より小さい番号のサンプルは明瞭なバンドを有していた 。例えば、プライマー濃度が０．０１６７μＭでありそしてアニーリング時間が １．６分の場合には、サンプル４が上記基準を満たしていた。次に増幅ファクタ ーを６００ｘ１０^(n-l)である上記方法で求めることができた。いくつかの場合 においては、微弱なバンドがはじめのゲル中に見えたが、図３の再生では見えな かった。増幅ファクターを求めるのに用いた表示された微弱なバンドはＤＮＡコ ピー数で変動し得ることが認められる。しかし、これら方法は本発明を有効に実 施するためには十分正確であることが例証されている。 Ｐ＝プライマー濃度、μＭ ｔ＝アニーリング時間、分 ｎ＝微弱なバンドに増幅されるサルモネラの連続的なサンプル番号 （〈又は〉、いずれのサンプルも微弱なバンドを示さなかった） Ａ＝増幅ファクター＝６００ｘ１０^(n-1) Ｅ＝１サイクル当たりの増幅効率＝Ａ^(1/32)− １、３２＝サイクル数 表３は図３の結果を要約する。各プライマー濃度及びアニーリング時間に関し て、微弱なバンドとして表示されたサンプル番号、上記方法により算出された増 幅ファクターＡ、及び１サイクル当たりのプライマー増幅効率（Ｅ＝Ａ^1/N、Ｎ ＝サイクル数）が示されている。〉６として表にされた「ｎ」は最も希釈された サンプルが明瞭なバンドを生じたことを示している。〈１の「ｎ」は最も濃縮さ れたサンプルでさえバンドが見られなかったことを示している。これらポイント は動力学的パラメータを求めるためには用いなかった。 図４では、１サイクル当たりの効率Ｅをプライマー濃度とアニーリング時間の 積（ｐ＊ｔ）の関数としてプロットした。動力学的モデルの式６はデータに最適 に適合し、次式を与える： Ｅ＝０．９（１−ｅｘｐ（−２６．８ｐｔ））。サルモネラＤＮＡに対するプラ イマー３３−１７−３及び３３−１７−６のアニーリングに関する動力学的パラ メータはε_max＝０．９でありそしてｋ＝２６．８（μＭ−分）^-1である。 プライマー３３−１７−１．５及び３３−１７−５．８を用いて図５に示され るプライマー濃度及びアニーリング時間でサルモネラ・サンプ ル１〜７を増幅した。すべての他の増幅条件はプライマー３３−１７−３及び３ ３−１７−６のそれらと同一であった。微弱なバンドを与えるサンプル番号、増 幅ファクター及び１サイクル当たりの効率を表４に示す。データをプロットした が、これは図６の動力学的モデルに最適に適合する。３３−１７−１．５及び３ ３−１７−５．８に関する動力学的パラメータはε_max＝０．９でありそしてｋ ＝１３．５（μＭ−分）^-1である。 Ｐ＝プライマー濃度、μＭ ｔ＝アニーリング時間、分 ｎ＝微弱なバンドに増幅されるサルモネラの連続的なサンプル番号 （〈又は〉、いずれのサンプルも微弱なバンドを示さなかった） Ａ＝増幅ファクター＝６００ｘ１０^(n-1) Ｅ＝１サイクル当たりの増幅効率＝Ａ^(1/32)− １、３２＝サイクル番号 プライマー１５−Ａ２及び１５−Ｌを用いて図７に示されるプライマー濃度及 びアニーリング時間で大腸菌サンプル１〜７を増幅した。２５μｌの全反応容量 中、１μｌのＤＮＡサンプルを５５℃のアニーリング温度で２８サイクル増幅し た。データを表５に要約しそして図８にプロットする。これらプライマーに関す る動力学的パラメータはε_max＝０．８３でありそしてｋ＝３５．９（μＭ−分 ）^-1である。 Ｐ＝プライマー濃度、μＭ ｔ＝アニーリング時間、分 ｎ＝微弱なバンドに増幅される大腸菌の連続的なサンプル番号 （〈又は〉、いずれのサンプルも微弱なバンドを示さなかった） Ａ＝増幅ファクター＝１２０ｘ１０^(n-1) Ｅ＝１サイクル当たりの増幅効率＝Ａ^(1/28)− １、２８＝サイクル番号実施例 実施例１ プライマー３３−１７−９及び３３−１７−１２ａ（表２）は、サルモネラ（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ゲノム内でのプライマー３３−１７−３及び３３−１７ −６の増幅産物内で組重ねられた配列を増幅する。この実施例では、これら２つ のプライマー対は本発明の方法に従って組重ねられた。式９〜１８の不等式拘束 （ｉｎｅｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を使用しそして各プライマー ・セットに関して実験的に求めたアニーリング動力学的パラメータを用いて、方 法を設計した。 サイクル条件は以下の通りであった： 第１段階外部プライマー濃度、Ｐ₀₁₁＝０．００７６ μＭ 第２段階内部プライマー濃度、P₀₂₂＝０．４８ μＭ 第１段階アニーリング時間、ｔ₁＝８分 第２段階アニーリング時間、ｔ₂＝０．８分 第１段階反応容量、Ｖ₁＝２５μｌ 第２段階反応容量、Ｖ₂＝５０μｌ 第１段階におけるサイクル数、Ｎ₁＝２０ 第２段階におけるサイクル数、Ｎ₂＝２０ プライマー３３−１７−３及び３３−１７−６（セクションＦのデータから） 並びにプライマー３３−１７−９及び３３−１７−１２ａ（データは示されてい ない）に関する動力学的パラメータは以下の通りである： これら条件下、不等式拘束９〜１５は以下のように満たされる： さらに、パラメータはＶ₂／Ｖ₁に関して、条件１６及び１７の境界内に首尾よ く入る。 図９Ａでは、サルモネラ・サンプル１〜７は組重ねの第１段階のみの２０サイ クルで遂行された。アニーリング温度は６１℃であり、そして反応混合物は１μ ｌのゲノムＤＮＡサンプルを含んでいた。このプロセスの最後で、バンドはサル モネラ希釈液２で見えるが、より希釈されたサンプルではバンドは見られない。 セクションＥの方法を用いると、第１段階における外部プライマーの増幅ファク ターは１５，０００と、そして１段階当たりの効率は０．６１と予測できる。こ れは本発明の定義で要求される１段階当たりの最小効率の０．４を超える。さら に、この測定された効率は動力学的モデルＥ₁₁＝ε_{max 1}(1-exp-(k₁P₀₁₁t₁))で 予測された効率０．７２に近い。 図９Ｂでは、サンプルは第２段階のみで増幅された。Ｔａｑポリメラーゼを削 除した以外は図９Ａと同じ方法で第１段階を行うことによりこのことが達成され た。第２段階の前に、０．９６μＭの組重ね式（３３−１７−９及び３３−１７ −１２Ａ）プライマー及びＴａｑポリメラーゼを含む２５μｌのさらなる緩衝液 混合物を増幅の第１段階産物に添加した。次に増幅を低減されたアニーリング時 間で２０のさらなるサイクルで継続した。微弱な３３−１７−９及び３３−１７ −１２Ａプライマー・バンドはサルモネラ・サンプル３で見えた。これは第２段 階の内部プライマーによる１５０，０００倍の増幅に相当し、１段階当たりの効 率０．８１を与える。これは要求される最小効率０．４を超える。さらに、測定 された効率はモデルＥ₂₂＝ε_{max 1}(1-exp-(k₂P₀₂₂t₂))で予測された値０．７２ に近い。 図９Ｃでは、増幅の両段階を活性にした。Ｔａｑポリメラーゼを第１段階で存 在させた以外は図９Ｂに関して述べたのと同じプロトコルに従った。内部プライ マーの産物は最も希釈されたサルモネラ・サンプル６ですら明瞭に見えた。両段 階の増幅ファクター全体は１０⁸より大きかった。従って、両段階を一緒に行っ た場合の増幅ファクターが個々に行った場合の各段階よりかなり大きいので、組 重ねが達成されたにちがいない。さらに、組重ねは、第１段階の全産物が第２段 階で用いられそして第２段階プライマーが第２段階の前に添加されるという要件 を満たす。 図９Ｄでは、第２段階の前に添加される混合物から組重ね式プライマー（３３ −１７−９及び３３−１７−１２ａ）を削除した以外は９Ｃと同じプロトコルに 従った。この方法では、微弱な３３−１７−３及び３３−１７−６プライマー産 物がサンプル２で見え、このサンプル２は第 １段階のみの後でバンドを生じる最も高濃度のサンプル番号である。サンプルは 連続的な１０倍希釈液であるので、第２段階の初期プライマーセットの増幅ファ クターは１０未満でなければならず、１サイクル当たりの効率は０．１２未満で なければならない。この効率は、第２段階の各サイクルで組重ね式のプライマー からは外部プライマーからに比べて少なくとも５倍多い伸長産物が作られるとい う本発明の基準を満たす。この場合、効率比は０．８１／．１２よりも大きく、 これは５より大きい。さらに、動力学的モデルは第２段階における外部プライマ ーの効率を、Ｅ₁₂＝ε_{max 1}(1-exp-(k₁P₀₁₂t₂))＝０．０７（これは０．１２未 満である）として正確に予測した。 図９Ｅでは、第１段階の後に添加された混合物からプライマー３３−１７−９ 及び３３−１７−１２ａが削除された。次に通常の４８秒ではなく８分のアニー リング時間で第２段階を行った。微弱なバンドはサンプル５で見えた。これを第 １段階のみと比較すると、１０００のファクターのさらなる３３−１７−３及び ３３−１７−６プライマー産物が第２段階で作られた。このことは第１段階プラ イマーが第１段階の後に減少しないこと、すなわち本発明の条件を例証している 。また、それは動力学的に制御された組重ねにおける低減されたアニーリング時 間の重要性も例証している。実施例２ この場合、外部プライマーは３３−１７−１．５及び３３−１７−５．８であ り、そして組重ね式セットは３３−１７−３及び３３−１７−６であった。サル モネラ・ゲノムＤＮＡを鋳型とした。 組重ねパラメータは以下の通りであった： 第１段階外部プライマー濃度、Ｐ₀₁₁＝０．０１３μＭ 第２段階内部プライマー濃度、Ｐ₀₂₂＝０．１１μＭ 第１段階アニーリング時間、ｔ₁＝８分 第２段階アニーリング時間、ｔ₂＝０．８分 第１段階反応容量、Ｖ₁＝２５μｌ 第２段階反応容量、Ｖ₂＝５０μｌ 第１段階におけるサイクル数、Ｎ₁＝２０ 第２段階におけるサイクル数、Ｎ₂＝２０ セクションＦからの動力学的パラメータデータを用いると、以下の不等式拘束 になる： 図１０Ａでは、サルモネラ・サンプル１〜７を第１段階のみで増幅した。サン プル３で見られる微弱なバンドは１５０，０００の増幅ファクター及び１サイク ル当たりの効率０．８１（要求される最小０．４を超える）を示す。モデルは効 率０．６８を予測した。 図１０Ｂでは、第２段階のみの産物が示されている。Ｔａｑポリメラーゼを削 除した以外は図１０Ａと同じ方法で第１段階を行った。第２段階の前に、０．２ ２μＭのプライマー３３−１７−３及び３３−１７− ６並びにＴａｑポリメラーゼの２５μｌを添加した。この場合もまた、微弱な３ ，６プライマー産物がサルモネラ・サンプル３で見られ、このことは１５０，０ ００の増幅ファクター及びモデル予測と同一の効率０．８１を示している。 図１０Ｃは、サンプル６で明瞭な３３−１７−３及び３３−１７−６バンドを 伴う両段階の産物を示し、そして１０⁸よりも大きい増幅ファクター全体を示す 。 図１０Ｄでは、第２段階混合物からプライマー３３−１７−３及び３３−１７ −６を削除した。サンプル希釈液２での微弱な１．５，５．８バンドにより、所 望されそしてモデルで予測されたようなさらなる産物は第２段階ではほとんど或 いは全く作られなかった。 最後に、図１０Ｅでは、第２段階プライマーを第２段階混合物から削除しそし て第２段階アニーリング時間を４８秒に代えて８分にした。第２段階におけるさ らなる増幅産物により、プライマーが第１段階の後に減少しないことが明白に例 証されている。実施例３ この実施例では、プライマー１５−Ｇ及び１５−Ｙをプライマー１５−Ａ２及 び１５−Ｌ内で組重ねた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡを鋳型とした。 組重ねパラメータは以下の通りであった： 第１段階外部プライマー濃度、Ｐ₀₁₁＝０．００５３μＭ 第２段階内部プライマー濃度、Ｐ₀₂₂＝０．２７μＭ 第１段階アニーリング時間、ｔ₁＝８分 第２段階アニーリング時間、ｔ₂＝０．８分 第１段階反応容量、Ｖ₁＝２５μｌ 第２段階反応容量、Ｖ₂＝５０μｌ 第１段階におけるサイクル数、Ｎ₁＝１８ 第２段階におけるサイクル数、Ｎ₂＝１８ セクションＦからの動力学的パラメータデータを用いると、以下の不等式拘束 になる： プライマー１５−Ｇ及び１５−Ｙについては動力学的パラメータを測定しなか ったので、不等式の幾つかを削除する。その代わりに、一般的な推薦である０． １及び１μＭの間のＰ₀₂₂を用いた。 図１１Ａでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）サンプル１〜７を第１段階のみで増幅 した。サンプル４で微弱なバンドが見られたが、これは１２０，０００の増幅フ ァクターを示している。モデルで予測された０．６５に比較して、１サイクル当 たりの効率は０．９１であった。 図１１Ｂでは、第２段階のみが示されている。第１段階からＴａｑを削除した 以外は第１及び第２段階の両方のプロトコルに従った。図１１Ｂはサンプル４で 微弱なバンドを示し、約１２０，０００の増幅ファクター及び１サイクル当たり の効率０．９１を示している。 図１１Ｃでは、両段階に存在させたＴａｑを用いた増幅の第１及び第 ２段階が示されている。サンプル６での１５−Ｇ、１５−Ｙバンドは１．２ ｘ １０⁷よりも大きい増幅ファクターを例証する。 図１１Ｄでは、第２段階混合物からプライマー１５−Ｇ及び１５−Ｙを除いて 第１及び第２段階を行った。このアウトプットを第１段階のみと比較すれば、第 ２段階でプライマー１５−Ａ２及び１５−ＬによりさらなるＤＮＡはほとんど或 いは全く増幅されなかった。最後に、図１１Ｅでは、１５−Ｇ及び１５−Ｙを第 ２段階混合物から削除しそして第２段階アニーリング時間を８分に増大した。顕 著な量の１５−Ａ２及び１５−Ｌ産物が改変した第２段階で作出されたが、この ことは第１段階の後にプライマーが減少しなかったことを示している。実施例４ 本実施例では、本発明の組重ね式方法を食物ホモジネート中のサルモネラ（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出に適用した。２３マー（ｍｅｒ）外部プライマー３ ３−２３−０．５及び３３−２３−５．８（表２）に関して、アニーリング動力 学的パラメータε_max＝０．８５及びｋ＝１２．８（μＭ−分）^-1を得た。内部 プライマー３３−２３−３及び３３−２３−６．１は動力学的パラメータε_max ＝０．８２及びｋ＝２０．５（μＭ−分）^-1を有していた。 生の牛粉、脱脂粉乳、チェダーチーズ、大豆粉及び黒コショー粉をスタマッチ ャ（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）ブレンダーでラクトース・ブイヨン中で１０％ｗ／ｖ にホモジネートした。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ ｒｉｕｍ）、サルモネラ・インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎｆａ ｎｔｉｓ）及び腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）を１ ミリリットル当たり１０⁷、 １０⁶、１０⁵及び１０⁴の生存カウント数で食物ホモジネートに添加した。各系 列の第５サンプルはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を添加しない食物ホモ ジネートであった。 添加されたホモジネートからのＤＮＡを上記のセクションＣの方法に従って抽 出した。 １μｌのＤＮＡ抽出物を２４μｌの第１段階反応混合物に添加した。 組重ねパラメータは以下の通りであった： 第１段階外部プライマー濃度、Ｐ₀₁₁＝０．０３１μＭ 第２段階内部プライマー濃度、Ｐ₀₂₂＝０．１７μＭ 第１段階アニーリング時間、ｔ₁＝４分 第２段階アニーリング時間、ｔ₂＝０．６７分 第１段階反応容量、Ｖ₁＝２５μｌ 第２段階反応容量、Ｖ₂＝７５μｌ 第１段階におけるサイクル数、Ｎ₁＝２３ 第２段階におけるサイクル数、Ｎ₂＝２３ 増幅の結果を図１２に示す。図１２中のレーンにおける増幅サンプルの同定を 表６に示す。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＤＮＡはす べての添加されたサンプルで強力に増幅されたのに対して、対照は増幅産物を生 じなかった。 配列リスト (1) 一般的なインフォメーション (i) 出願人： (A)名称： イー アイ デュポン ドウ ヌムール アンド カンパニー (B)ストリート： １００７ マーケット・ストリート (C)市： ウイルミントン (D)州： デラウエア (E)国： アメリカ合衆国 (F)郵便番号（ＺＩＰ）： １９８９８ (G)テレホン： ３０２−８９２−８１１２ (H)テレファクス： ３０２−７７３−０１６４ (I)テレックス： ６７１７３２５ (ii) 発明の名称： 組重ね式複製連鎖反応を用いる核酸の標的 セグメントの増幅の改良方法 (iii) 配列の数： ２２ (iv) コンピュータ読取りフォーム： (A)ミーディアム・タイプ： ディスケット、３．５０ インチ、１．０ＭＢ (B)コンピュータ： マッキントッシュ (C)オペレーティング・システム： マッキントッシュ ６．０ (D)ソフトウエア： ＰＡＴＥＮＴＩＮ リリース ＃１．０、バージョン ＃１．２５ (v) 本出願データ： (A)出願番号： ＭＤ−０１０３ (2) 配列番号：１に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １２塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１ (2) 配列番号：２に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １２塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：２ (2) 配列番号：３に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １２塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：３ (2) 配列番号：４に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １２塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：４ (2) 配列番号：５に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １２塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：５ (2) 配列番号：６に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １２塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：６ (2) 配列番号：７に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １２塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：７ (2)配列番号：８に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １２塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：８ (2) 配列番号：９に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： ２３塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：９ (2) 配列番号：１０に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： ２３塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１０ (2) 配列番号：１１に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： ２３塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１１ (2) 配列番号：１２に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： ２３塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１２ (2) 配列番号：１３に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１３ (2) 配列番号：１４に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１４ (2) 配列番号：１５に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１５ (2) 配列番号：１６に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１６ (2) 配列番号：１７に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１７ (2) 配列番号：１８に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１８ (2) 配列番号：１９に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １５塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１９ (2) 配列番号：２０に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １５塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：２０ (2) 配列番号：２１に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １５塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：２１ (2) 配列番号：２２に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １５塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：２２ (2) 配列番号：１６に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１６ (2) 配列番号：１７に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１７ (2) 配列番号：１８に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １７塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１８ (2) 配列番号：１９に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １５塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：１９ (2) 配列番号：２０に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １５塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：２０ (2) 配列番号：２１に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １５塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：２１ (2) 配列番号：２２に関する情報： (i) 配列の特徴： (A)長さ： １５塩基対 (B)型： 核酸 (C)鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） (iii) 配列： 配列番号：２２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第１段階で外部プライマー対に隣接した核酸セグメントを増幅しそして第２ 段階で内部組重ね式プライマー対に隣接した核酸標的セグメントを増幅して、サ ンプル核酸反応混合物からの核酸の標的セグメントを選択的に増幅する組重ね式 複製連鎖反応を行う改良方法において、 第１及び第２段階で外部及び内部プライマー対の濃度及びアニーリング時間を 制御することにより、第２段階中に内部プライマー対で標的セグメントの選択的 増幅が達成され、反応混合物からの外部プライマーを減少させることなく又は除 去することなく第１段階反応混合物の全容量が第２段階に用いられるものであっ て、 外部プライマー対をサンプル核酸反応混合物に添加してＰ₀₁₁で表される該外 部プライマーの濃度を達成し； 各サイクルにおいてｔ₁で表されるアニーリング時間で複製連鎖反応を繰り返 し行い； 内部プライマー対をサンプル核酸反応混合物に添加してＰ₀₂₂で表される該内 部プライマーの濃度を達成し；そして 各サイクルにおいてｔ₂で表されるアニーリング時間で複製連鎖反応を繰り返 し行う； ここでＰ₀₁₁、ｔ₁、Ｐ₀₂₂及びｔ₂は以下の式に従って選択される、 ε_{max 1}(1−exp-(k₁P₀₁₁t₁))＞0.4 ε_{max 2}(1−exp-(k₂P₀₂₂t₂))＞0.4 ε_{max 1}(1−exp(-k₁P₀₁₂t₂))＜1/5ε_{max 2}(1−exp(-k₂P₀₂₂t₂)) 式中、 Ｐ₀₁₁は第１段階における各外部プライマーの濃度であり； Ｐ₀₂₂は第２段階における各内部プライマーの濃度であり； Ｐ₀₁₂は第２段階における各外部プライマーの濃度であり； ｔ₁は第１段階におけるアニーリング時間であり； ｔ₂は第２段階におけるアニーリング時間であり； ｋ₁は外部プライマーから伸長産物を形成する二次速度定数であり； ｋ₂は内部プライマーから伸長産物を形成する二次速度定数であり； ε_{max 1}は１サイクル当たりの外部プライマーの最大伸長であり；そして ε_{max 2}は１サイクル当たりの内部プライマーの最大伸長である、 工程を含んでなる該改良方法。 ２．第１及び第２段階のプライマー濃度及びアニーリング時間が以下の通りであ る請求の範囲第１項記載の方法： 1.2＜k₁P₀₁₁t₁＜2.3、 1.2＜k₂P₀₂₂t₂＜2.3、 15＜V₂t₁/V₁t₂＜20、そして 2＜V₂/V₁＜4 式中、Ｖ₁は増幅の第１段階における全反応体容量であり、Ｖ₂は第２段階 における全反応体容量であり、そしてＶ₂−Ｖ₁は第１段階後であって第２段階前 に内部プライマーが添加される容量である。 ３．一般化された方法の実施に関して、プライマー濃度及びアニーリング時間が 以下のように好都合に選択される請求の範囲第１項記載の方法 ： 1＜V₂/V₁＜2に関して； t₁は６．５〜１３分であり、 P₀₁₁は０．００１５〜０．０３μＭであり、 t₂は０．５〜１．６分であり、そして P₀₂₂は０．１〜１μＭであり、 式中、Ｖ₁は増幅の第１段階における全反応体容量であり、Ｖ₂は第２段 階における全反応体容量であり、そしてＶ₂−Ｖ₁は第１段階後であって第２段階 前に内部プライマーが添加される容量である。 ４．一般化された方法の実施に関して、プライマー濃度及びアニーリング時間が 以下のように好都合に選択される請求の範囲第１項記載の方法： 2＜V₂/V₁＜3に関して； t₁は４〜９分であり、 P₀₁₁は０．００２５〜０．０５μＭであり、 t₂は０．５〜１．６分であり、そして P₀₂₂は０．１〜１μＭであり、 式中、Ｖ₁は増幅の第１段階における全反応体容量であり、Ｖ₂は第２段 階における全反応体容量であり、そしてＶ₂−Ｖ₁は第１段階後であって第２段階 前に内部プライマーが添加される容量である。 ５．一般化された方法の実施に関して、プライマー濃度及びアニーリング時間が 以下のように好都合に選択される請求の範囲第１項記載の方法 ： 3＜V₂/V₁＜4に関して； t₁は２．５〜６．５分であり、 P₀₁₁は０．００３５〜０．０７μＭであり、 t₂は０．５〜１．６分であり、そして P₀₂₂は０．１〜１μＭであり、 式中、Ｖ₁は増幅の第１段階における全反応体容量であり、Ｖ₂は第２段 階における全反応体容量であり、そしてＶ₂−Ｖ₁は第１段階後であって第２段階 前に内部プライマーが添加される容量である。 ６．核酸の標的セグメントがＤＮＡを含んでなる請求の範囲第１項記載の方法。 ７．核酸の標的セグメントが微生物の特定の属、菌種又は亜菌種に対して診断的 であると知られているＤＮＡを含んでなる請求の範囲第６項記載の方法。 ８．サンプル核酸反応混合物が未知の微生物から抽出されたＤＮＡを含んでなる 請求の範囲第７項記載の方法。 ９．１本鎖ＲＡＰＤプライマー分析を使用して１群のランダム多型性マーカーを 作出し次いで作出したものの中から特異的なマーカーを同定しそして選択して、 微生物の特定の属、菌種又は亜菌種のＤＮＡの診断的な標的セグメントを決定す る請求の範囲第７項記載の方法。 １０．ＤＮＡの選択的に増幅された標的セグメントの存在を検出する最終工程を さらに含み、これによりサンプル核酸反応混合物中の微生物の特定の属、菌種又 は亜菌種の存在を決定する請求の範囲第８項記載の方 法。 １１．サンプル核酸反応混合物が食物サンプルに由来するか或いは含まれる微生 物から抽出されたＤＮＡを含んでなる請求の範囲第１０項記載の方法。 １２．微生物の特定の属、菌種又は亜菌種が、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ）属；サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の亜群；リステリア（Ｌｉｓｔ ｅｒｉａ）属；リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙ ｔｏｇｅｎｅｓ）菌種；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ ｒｅｕｓ）種；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種；大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の腸管毒性亜菌種；及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の病原亜菌種からな る群より選択される請求の範囲第１１項記載の方法。 １３．サンプル核酸反応混合物が環境サンプルに由来するか或いは含まれる微生 物から抽出されたＤＮＡを含んでなる請求の範囲第１項記載の方法。 １４．サンプル核酸反応混合物がヒト又は動物の生物学的サンプルに由来するか 或いは含まれる細胞から抽出された核酸を含んでなる請求の範囲第１項記載の方 法。 １５．特定の微生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属である請求の範囲 第１２項記載の方法。 １６．サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）標的核酸の増幅を達成するために用 いられる外部又は内部プライマーが以下の核酸配列からなる群から選択される核 酸配列を有する請求の範囲第１５項記載の方法：