JPH08500723A

JPH08500723A - ゲノム不適正走査

Info

Publication number: JPH08500723A
Application number: JP5519581A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，パトリック; ネルソン，スタンレー; クラフォルツ，スー
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1992-05-06
Filing date: 1993-05-04
Publication date: 1996-01-30
Also published as: EP0672182A1; WO1993022462A1; US5376526A; AU4369593A; CA2132968A1; EP0672182A4

Abstract

(57)【要約】遺伝子マッピングが２つの関連一般手法のいずれかにより提供される。第一の手法においては、マッピングは、２つの個体に由来するDNA断片が結合して塩基不適合を有しない広範なハイブリッドを形成し得る遺伝子領域を同定することにより提供される。２つの個体からのDNA間に形成される完全適合ハイブリッドDNA分子を両鎖が同一個体のDNAから形成される単数又は複数の不完全対合DNAハイブリッドから分離させる方法により、DNAをプロセッシングする。次いで完全適合ハイブリッドDNAを標識し、標識化DNAをプローブとして用いて２個体間の血縁による同一性の遺伝子座を同定し得る。第二の手法では、個々の一倍体ゲノム中のヘテロ接合性の領域からの非同一性対立遺伝子間に形成されるDNAハイブリッド中にニックを特異的に導入する。次に、ニック化ＤＮＡ分子を特異的に標識して、個体のゲノム中のヘテロ接合性の領域を同定するためのプローブを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ゲノム不適正走査発明の詳細な説明政府の特許付与に対する参照本発明は、National Institutes of Healthにより課せられた約定HG00450下で政府の支持でなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。関連出願に対する参照本出願は1992年５月６日提出の出願番号第880,167号の一部継続出願である。産業上の利用分野本発明は遺伝子マッピングに関する。発明の背景ヒト、動物及び植物の易罹患性及び他の特性に関与する遺伝子の連鎖マッピングは、近年、生物学及び医学の進歩の最も重要な手段の一つになっている。連鎖マッピングのための境界標識のような多型DNAマーカーの開発は、この進歩の主要因子であった。しかしながら、ヒトにおける連鎖マッピングのためのこれらのマーカーに頼る現行の方法は労力を要し、一度に高々２〜３のマーカーしかスクリーニングできない。さらにそれらの力は、ヒトゲノムの多くの部分において非常に有益なマーカーが乏しいことにより限定される。全生物体においてのみ認識される遺伝子をマッピングするためには、標準的アプローチは特性と地図位置がすでに公知の遺伝子マーカーとの間の連鎖を同定することに頼っている。ヒトゲノムにおける最も豊富で且つ一般的に有用な種類のマーカーは、DNA配列多型性−即ち制限断片長多型性（RFLP）、あるいは特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより又は特異的プライマーを用いた増幅により検出され得る他のDNA多型性である。 RFLPマッピング及び関連方法は、劇的な成功をおさめた。しかしながら、それらの用途は２つの間題により限定される：第一に、多数の別々の遺伝子座を検査する必要があるが、しかし１つ又は２〜３の遺伝子座のみを一度に確定し得るに過ぎず、この手法は困難である；第二に、利用可能なマーカーの地図上での低密度及び低多型性情報内容は、２つだけしか間題の特性を共有しない場合でも、有用な連鎖情報を得るために各家族の多様な成員を型決定する必要があることを意味する。自動化及び技術的改良により、並びにきちんと間隔を置いた非常に多型性のマーカーを開発することにより、これらの欠点はある程度克服し得るが、しかし特異的地図間隔のための別々のマーカーの使用は固有の限界を有する。各々の家族での分析を要する個体数を低減しようとするマッピングストラテジーに適用する場合に限界は特に顕著である。一般的に特性が分離している少数の大きな十分に実証された血統を集めるよりも問題の特性を共有する血縁個体の多数のペアを集める方がはるかに容易である。この場合は、個体の絶対数が少ない。医学的に有意の特性に関しては、罹患個体は検査のために現れると思われるが、一方他の家族員を追跡し補充する必要がある。さらに血統分析に欠くべからざる個体が減少する恐れがある。さらに利用可能なマーカーが低密度及び低情報内容であると、RFLP分析による連鎖マッピングのためには系図の使用がほとんど必須となる。適切な家族の収集には、しばしばヒトの特性、特に遺伝的に複雑な特性に影響を及ぼす遺伝子のマッピングを阻む重大な難関がある。多様な極小組の罹患親類（典型的にはペアあるいは単一個体の場合もある）からのDNAにおける情報を用いた連鎖マッピングに関してのストラテジーが報告されている。しかしながら、これらのストラテジーは、遺伝子地図全体できちんと間隔を置いた高度情報遺伝子マーカーの有効性に依っている。連鎖マッピングに関して上に挙げた論点は、医学における遺伝的リスクアセスメントにも当てはまる。原則的に、対立遺伝子配列の間で異なるあらゆる塩基が連鎖分析のためのマーカーとして役立つ。２つの異なる半数体ゲノムからの対立遺伝子単一複写配列間の単一塩基差は、異系交配西ヨーロッパ集団で300bp当たり約１回生じると見積もられた。これは、半数体ゲノム当たりで連鎖分析のための潜在的マーカーは計約10⁷個であると算定する。これらのヌクレオチド差を有する極小分画のみが現行方法を用いたマッピングに寄与する。したがって、利用可能なゲノム情報をより効率よく利用し、多遺伝子特性に関する情報を提供し得る新規の方法の開発に実質的な関心がある。このような方法は、遺伝子マッピングだけでなく遺伝子診断及びリスクアセスメントに関しても有益である。関連文献 RFLPの使用を説明した論文は、以下に記載されている：Bots tein,et al., （ 1980） Am.J.Hum.Genet．32：314ー331；Donis-Keller,et al., （1988）Cell 51 ：319-337；Kidd, et al., （1989）Cytogenet. Cell. Genet．51：622-947及び Risch （1990） Am.J.Hum. Genet．46：242-253。マッピングストラテジーは以下に記載されている：Risch（1990）Am.J.Hum.Genet．46：229-241；Bishopand Williams on（1990） Am.J.Hum.Genet．46：254-265。Sandraand Ford,（1986） Nucleic Acids Res．14：7265-7282及びCasna,et al.,（1986） Nucleic Acids Res．14 ：7285-7303はゲノム分析を記載する。発明の要約以下の工程によりゲノム分析を達成する：２つの異なる供給源（通常は遺伝的に血縁関係のある又は遺伝的血縁関係があると思われる個体）からの比較すべき DNAを相対的にまれに切断する制限酵素で消化し；ヘテロハイブリッド（各個体からの一方の鎖を含有するハイブリッド）がホモハイブリッド（同一個体からの両方の鎖を含有するハイブリッド）と区別され得る条件下で２個体からのゲノム断片の一重鎖を結び合わせ；ホモハイブリッドをヘテロハイブリッドから分離し；不適合無含有ヘテロハイブリッドを不適合を有するハイブリッドから分離し；不適合無含有ヘテロハイブリッドから標識化プローブを調製し；そして上記標識化プローブにより２個体間の遺伝的同一性を有する領域を同定する。非同一性領域から形成される十分大きなハイブリッドDNA分子は少なくとも１つのそして通常は多数の塩基不適合を有すると予測されるため、不適合無含有ヘテロハイブリッドは、血統による遺伝的同一性を有する領域に対する高度特異的プローブを提供する。あるいは、多重複写DNAを実質的に含有しないDNA断片を単離し；DNAを融解し、再アニーリングしてハイブリッド断片を提供し；ニックを不適合化DNAに特異的に導入し；ニック化DNAを標識し；そして標識化DNAをプローブとして用いてヘテロ接合性を有する領域を同定することにより単一個体のヘテロ接合性及び推論的にホモ接合性を有する領域をマッピングし得る。ヘテロ接合性又は半接合性の領域（ここではすべての又は有意部分の染色体を欠いている。例えば異数体）は、ハイブリッド化標識の非存在により推定される。特定の実施例の説明２つのDNA供給源からのDNA配列が長い範囲（一般に10³〜２×10⁴nt）に亘って完全に同一であるゲノムの領域を同定することによりゲノムマッピングのための方法及び組成物が提供される。プローブの性質により、手法が変わる。２個体間に遺伝子同一性を有する領域の標識化を考慮に入れる手法においては、まれに切断する制限酵素でDNA供給源を消化する；その結果生じたDNAをプロセッシングして不適合無含有ヘテロハイブリッドdsDNA断片を不適合含有又はホモハイブリッド断片から単離し；不適合無含有ヘテロハイブリッド断片を標識化して、次に２供給源間の遺伝的同一性を有する領域を同定するために用いる。あるいは、ある個体のゲノムにおけるホモ接合性又はヘテロ接合性を有する領域をマッピングするためには、その個体からのDNAを消化し；任意に多重複写DNA を除去し；DNAを融解し、再アニーリングして；ニックを不適合化dsDNA中に導入し；不適合化dsDNAを標識し；そして標識化DNAをヘテロ接合性のゲノム領域を同定するためのプローブとして用い、ホモ接合性又は事実上低標識化された半接合性の領域は残したままにする。 DNA供給源は一般的に真核細胞性の、半数体〜多数体ゲノムのあらゆる供給源であって、その例としては植物及び動物を含む脊椎動物及び無脊椎動物、特に哺乳類、例えばヒトが挙げられる。DNAは各々の供給源が通常５×10⁴bp以上、通常 10⁶bp以上、さらに通常は約10⁷bp以上を有する高複雑性のものである。したがって供給源が関連するか否かをそれらの遺伝的同一性に関してDNAの２つの供給源を比較したいあらゆる場合に、本方法を用い得る。通常、供給源は関連し、同一種のものであり、そして６世代、しばしば４世代以上離れていない共通の先祖を有する点でより密接に関連し得る。連鎖マッピング又は遺伝子診断のためには、遺伝的血縁個体を要する。したがって本方法は、植物及び動物の繁殖に関連した特性の下記の分離に用途を見出し得る：特定の特性、特に多重遺伝子に関連した特性を有するゲノム地図での特定の領域の会合、先祖又は親から子孫への特性の伝達、特定の特性に関連している場合の異なる遺伝子座からの遺伝子の相互作用等。２つの供給源だけが比較に関与し得るが、しかし20又はそれ以上の供給源といったより大きなサンプリングも関与し得る。この場合、種々の供給源間で対方式比較がなされる。種々の供給源間の関係は、例えば祖父母及び孫、兄弟姉妹、いとこ等と広範に変わり得る。遺伝的同一性を有する領域が標識されるかあるいは非同一性の領域が標識されるかによって、供給源からのDNAの処理が変わる。DNAは最初に慣用的方法によりプロセッシングし、細胞を溶解し、細胞破屑を除去し、混合物中に存在する蛋白質、脂質又は他の成分からDNAを分離し、次いで制限酵素消化のために単離DNAを用いる（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. （eds.Sambrook et al.） CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY 1989.参照）。通常、少なくとも約0.5μｇ、さらに通常は少なくとも約５μｇのDNAを用いるが、通常は50μｇ未満のDNAで十分である。以下の手順は単に、２人の血縁個体間の血統による同一性の領域に対応するDN Aの単離及び標識化のために用いる方法を扱う。両細胞供給源からの全DNAを相対的にまれに切断する制限酵素で完全に消化すると、一般的に約0.2〜10×10⁴nt、好ましくは約0.5〜２×10⁴ntの鎖の断片が提供される。少なくとも１つのGATC配列の存在、及び血統による同一性を示さないあらゆる対立遺伝子断片間の少なくとも１つの塩基差を事実上保証するよう、即ちホモハイブリッド断片、又は血統による同一性を示さないヘテロハイブリッド断片がその後の工程において少なくとも１つの切断を維持するのを保証するようにサイズを選択する。この酵素は普通は少なくとも６−ヌクレオチド一致配列を認識し、ブラント末端化又は付着端化切断に関与する。本明細書中に詳細に記載する方法に関しては、切断して突起型３′末端を残す酵素が必要である。突起型３′末端は、エキソヌクレアーゼIII消化とその後のBNDC結合を最後に用いてホモハイブリッド及び不適合DNAを除去する場合に特に好ましい。他の種類の末端を生じる制限酵素は、以下でさらに説明するように、他の特異的工程が代用される場合に好ましい。その結果生じたDNA断片を次にプロセッシングして相補的DNAハイブリッド（ここで、２本の鎖は異なる供給源からのものである）を２本の鎖が同一供給源からのものである相補的DNAハイブリッドから分離する手段を提供する。これは異なる方法で達成し得る。本発明に例示した方法は、以下の工程を用いる。一方の供給源からのDNAを、Damメチラーゼ又は制限メチラーゼのような配列特異的メチラーゼでメチル化して、一方の供給源からのDNAの一致配列を事実上完全にメチル化する。他の供給源は未修飾のままか又は異なる制限メチラーゼで完全にメチル化する。次に２つのDNA標本を混合し、変性して、再アニーリングさせる。実用的速度の複合DNA標本の完全アニーリングは、大型DNA鎖を保存する条件下で化学的又は蛋白質触媒を用いて達成し得る (Casna,et al.(1986) Nucleic Acids Res．14 ：7285-7303；Baar and Emanuel （1990）Anal. Bioch．186：369-373 ；Anasino(1986)同書152:304-307 ）。分散反復配列がそれらの中に埋封される場合でも純然たる完全二重鎖生成物を回収し得るように、非対立遺伝子反復配列の急速なハイブリダイゼーションに起因する網状結合形成を避けるか又は最小にする必要もある。これらの要件を満たすよう示されたアニーリング条件が、Casna(1986)（上記）が記載したようなF PERT条件である。再アニーリング化DNA混合物を２つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化する。２つの異なるDNA検体間に形成されるハイブリッドをメチル化部位で半メチル化する。制限酵素は、メチル化されていない又は二重にメチル化された部位は消化するが半メチル化部位は切断できないように選択する。望ましくは、配列は相対的共通配列であって、一般に平均約１〜10×10²、好ましくは１〜５×10²で生じる。混合供与ハイブリッドのためのより厳密な選択は、制限／修飾酵素の別の組み合わせを用いて達成し得る（Casna（1986）上記）。任意に、あらゆる便利な方法、例えばBNDCへの吸着を用いてこの時点で再アニーリング化 DNA（一重鎖DNA）を除去し得る。種々の組み合わせの酵素を用いることができる。組み合わせは、任意のホモハイブリッド断片に少なくとも１つの、好ましくは２つ又はそれ以上の切断が存在するのを保証すべきであり、そこで配列は相対的に共通である必要がある。例えば、メチル化のためにGATCを認識する大腸菌damメチラーゼをメチル化に用いてもよい。その場合この修飾酵素は、GATC部位で切断するメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼDpnＩ及びMboＩ（前者は二重メチル化部位で、後者は非メチル化部位で）とともに用い得る。特定配列“GATC”は、ヒトゲノム中に200〜300bp毎に見出される。単一制限／修飾部位が好ましいが、２〜３の部位が関与してもよい（この場合は異なる組合せの修飾及び制限酵素を用いる）。ヒト以外の供給源からのDNAを用いる場合、修飾酵素と制限酵素の他の組合せを用いてもよい。別の手法を以下に示す。各々に関して異なる制限酵素を用いて２つのDNA標本を切断することにより−特異的に、共通認識配列を共有する２つの酵素はある場合にはＮ−塩基３′オーバーハングで切断し、他の場合にはＮ−塩基５′オーバーハングで切断する−、ヘテロハイブリッドのみがブラント末端を有する。Ｎ＝４の場合のこのような制限酵素対の例は、Acc65Ｉ及びKpnＩである。同一DNA標本に由来する両鎖を有するハイブリッドは、５′又は３′オーバーハング端を保有する。ブラント末端化ヘテロハイブリッドは、オリゴヌクレオチドのようなブラント末端化パートナーに珍しく結紮される。このオリゴヌクレオチドは、“キャップ化”末端がエキソヌクレアーゼ消化から保護されるように、例えばヘアピン構造を有する。この原則の変更は可能であって、血縁制限酵素ペアを用いる場合、ホモハイブリッドと比較してヘテロハイブリッドの末端の示差的構造を利用する。ヘテロハイブリッドを選択するためのこのストラテジーは、ヘテロハイブリッドの選択におけるMboＩ／ DpnＩ消化工程に取って代わり得る。しかしながら、下記に概略を説明する手法におけるMutHLSニック化工程後に、エキソヌクレアーゼIIIの他に又はその代わりに用いられるバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼのような５′〜３′エキソヌクレアーゼ、あるいはヘリカーゼとエキソヌクレアーゼVII及び／又はＩとの組合せ、あるいはすべての非キャップ化末端の消化を可能にする酵素の組合せが必要である。ヘテロハイブリッドからのホモハイブリッドの初期分離には他の技法を用いてもよい。重同位体標識化ヌクレオシド、重原子標識化ヌクレオシド又は他の同位体標識化前駆体を用いて供給源の１つからの細胞を増殖させると、異なる供給源からの２本の鎖は密度が異なる。使用し得る同位体としては、¹⁵Ｎ，¹³Ｃ，²Ｈ等が挙げられる。次に密度バンディングにより二重鎖を分離する。あるいは、例えば標識化ヌクレオチド及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、無作為接合等により、異なる標識で２つの供給源からの DNAを標識する。次いで標識するために二重鎖をすべて分離して、その群をホモ −及びヘテロ標識化二重鎖に分ける。例えば、ビオチン及びアビジンを用いて一段階で分離（この場合アビジンは磁気ビーズに結合する）し、次いで２，４−ジニトロフェニル及び抗−（２，４−ジニトロフェニル）を二次分離に用いる（この場合、抗−（２，４−ジニトロフェニル）は支持体と結合する）。あるいは、オーバーハングを提供する制限酵素を選択してもよいが、この場合、ヘテロハイブリッドはホモハイブリッドの場合とは異なるブラント末端又はオーバーハングを生じる。次にオーバーハングを用いてホモハイブリッドを分離し、ヘテロハイブリッドを残す。原則的態様の説明に戻ると、その結果生じる非切断ヘテロハイブリッドとMbo Ｉ又はDpnＩ切断ホモハイブリッドとの混合物を次に、いくつかの不適合塩基対を有するDNA二重鎖を相補的完全適合DNA二重鎖から分離させる系にかける（例えば、Lahue,et al.(1989)Science 245：160-164；Su and Modrich (1986) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83：5057-5061；Grilley, et al.（1989）J.Biol.Chem. 2 64 ：1000-1004；Su, et al.（1989）Genome 31：104-111；及びLearn and Graf strom （1989） J.Bacteriol. 171：6473-6481参照）。このような系の例は、大腸菌の“特定メチル不適合修復”経路である。この系は、精製mutS, mutL, mutH及びuvrD遺伝子精製物、並びにエキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼXII又はRecJエキソヌクレアーゼ、一重鎮結合(SSB)蛋白質及びDNAポリメラーゼIIIを用いる。In vitroでは、考えられる８つの単一塩基不適合のうち７つ、並びに小挿入及び欠失が有効に認識される。DNA合成が妨げられると、本系は不適合含有分子に大型ギャップを特異的に導入する。精製mutS, mutL及びmutH蛋白質は協力して作用し、塩基不適合を含有するDNA分子中に特異的にニックを導入する。Ｃ−Ｃ不適合の場合を除いて、他の不適合は１つ又はそれ以上のMutX酵素（ＸはＳ，Ｌ又はＨを示す）により有効に同定される。エキソヌクレアーゼIIIはニックでエキソヌクレアーゼ分解性消化を開始し、３′−５′方向にニック化鎖を消化してギャップを生成する。エキソヌクレアーゼIIIは凹型又はブラント３′未満でも消化を開始し得るが、しかし線状二重鎖の突起型３′末端で消化を開始することはできない。したがって線状DNAハイブリッドの末端からの消化は、ゲノムＤＮＡの最初の消化のための突起型３′末端を生成する制限酵素を選択することにより阻止し得る（Henikoiff (1984)Gene 2 8：351-360）。非メチル化又はジメチル化部位から半メチル化部位を識別するためのより小さな断片を作るために用いる制限酵素により生成されるDNA末端は、凹型（例えばMboＩ）又はブラント（DpnＩ）３′末端を提供するよう選択され、これらの末端はエキソヌクレアーゼIIIに消化され易い。したがって、エキソヌクレアーゼIIIは、両鎖が同一個体に由来するか又は鎖が塩基不適合を含有するハイブリッド分子中に部分的一重鎖を提供する。本方法を実行するに際しては、アニーリング及び制限消化から得られた二重鎖をin vitroで特定メチル不適合修復系に露出する。 mutS, mutL及びmutHはニックを特異的に不適合化DNA分子中に導入し、一方エキソヌクレアーゼIIIはニック化部位及び凹型３′末端にギャップを導入し得る。供給源間の血統による同一性を有する領域に対応する不適合無含有ヘテロハイブリッドは、ここで、有意ギャップ又は部分的一重鎖領域の非存在によって他の二重鎖すべてから識別される。部分的一重鎖及び一重鎮DNAをここで完全二重鎮DNAから分離する。これはベンゾイル化ナフチル化DEAEセルロース(BNDC)を用いて有効に達成し得る。高塩濃度で、BNDCは一重鎖及び部分的一重鎖DNA分子を高効率で保持し、遠心分離又は他の分離手段により分離される。非結合DNA分子を回収するが、この場合、これは２供給源からの相補的配列を含有する。より完全な特定メチル不適合修復酵素系は結局は、MutS, MutL及びMutHのみを用いた単純系よりも特異性の点で優れていることを立証し得る。例えばMutL, Mu tS及びMutH＋ヘリカーゼII（UvrD 蛋白質）、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼVII、一重鎖結合蛋白質及びDNAポリメラーゼIIIは協力して作用して、不適合依存性DNA合成を実行し、それにより標識化又は修飾化ヌクレオチドを不適合含有DNA分子中に特異的に導入し得る。例えば、ビオチニル化ヌクレオチドを用いることにより、不適合化DNA分子は特異的にビオチニル化され、次いで固定化アビジン又は関連方法を用いて完全適合化及び不適合化DNA分子の混合物から不適合化分子を除去し得る。あるいは、同一組の酵素（DNAポリメラーゼを除く）を用いて、エキソヌクレアーゼIII工程を省いて不適合化DNA中にギャップを直接導入し得る。このような手法に関しては、最初のアニーリング工程で生成される線状DNA分子の末端はエキソヌクレアーゼ及びヘリカーゼの作用から保護される必要がある。したがってこの手法は、ヘテロハイブリッド分子に対する別の選択方法と同様に上記の末端キャッピング法とよく調和する。大腸菌又は他の生物体からの不適合修復蛋白質を基礎にした関連酵素系は、原則的にここでは上記の特定の酵素系と取り代え得るということはまったく明らかである。不適合無含有ヘテロハイブリッドdsDNA二重鎖は、延伸せずに用い得る。本発明の方法はそれらの標識化及びプローブとしての直接使用を可能にするのに十分な量での不適合無含有ヘテロハイブリッドdsDNA二重鎖の十分にきれいな分離を提供する。各供給源からの、有効に取り扱い得る容易に利用可能な量のDNA、一般に約0.5〜100μｇのDNA、通常薬１〜10μｇのDNAを用いて、申し分ない量の不適合無含有ヘテロハイブリッドdsDNA二重鎖がDNA標本の標識化及びプローブ化のために得られる。２つの供給源からの不適合無含有ヘテロハイブリッドdsDNA配列は、２供給源間の血統による同一性を有ずる領域を同定するために用い得る。 dsDNAは対応するゲノム領域を同定するためのプローブとして用いるために標識化すると便利である。特に放射性同位体、蛍光体、酵素等の広範な標識を用い得る。標識の特定の選択は、望ましい感受性、プローブされているゲノム標本の性質、必要とされる検出感受性等に依っている。したがって、分析中のゲノムが複雑であるほど、望ましい感受性は高くなる。放射能、蛍光等の検出のためには種々の計器が用いられる。プローブは任意の便利な方法、例えばニック翻訳、無作為ヘキサマープライマー化標識化、分散反復配列又は無作為配列から外側にプライムするプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応等により調製する。プローブ化されるDNAは種々の形態を取ることができるが、しかし本質的にはゲノム中の対応する配列の物理的配置と裏返しの関係を有する物理的規則整列の DNA配列から成る（Boyle,et al.(1990)Genomics 7：127-130；Penkel, et al.（ 1988） PNAS USA 87：634-6638）。中期染色体展開はこのような整列の天然の例の１つである。あるいは、そして好ましくは、膜あるいはシリコーン又はプラスチックチップのような個体物質上に規則的配列で固定化された公知の遺伝子位置に対応するクローン化、増幅又は合成DNA配列の一部又は完全収集物は、プロービング用の標的として用い得る。プローブとのハイブリダイゼーションは、DNAプローブの複合混合物の使用を可能にし、反復配列に対する人為的ハイブリダイゼーションを抑制する条件下で実施する（Boyle, et al.（1990） Genomics7：127-133；Pinkel, et al.（1988 ）Proc. Natl. Acad. Sci. USA85：9138-9142；Lichter, et al.（1990）上記87 ：6634-6638）。例えば、祖父母−孫ペアの場合、ハイブリダイゼーションは約2 5という大パッチ（前中期染色体を用いた場合は平均約４μの長さ）で生じるべきであり、凝集した場合にはゲノムの約半分をカバーするべきである。パッチの境界は、染色体末端及び減数分裂性交差の部位で測定する。境界は、２人の親類間に介在する減数分裂において生じる減数分裂性組換えの部位を反映する。ハイブリダイゼーションの領域は一般的には大きな隣接するパッチ内にあるため、２被験者間で同一でない領域を表す配列によるプローブの汚染に関しては、本方法は非常に丈夫である。血統的同一配列のささやかな増加のみが達成された場合でも、同一性及び非同一性のパッチはより大きな又はより低い信号強度の隣接ブロックとして識別可能である必要がある。あるいは、選択した不適合無含有ヘテロハイブリッド制限断片をプローブとして用いるよりは、それら自体を固体物質上で固定化し得る。一般的にはゲル電気泳動によりDNA制限断片を分解後にサザーンブロッティングを実施する。次に間題の領域に特異的な標識化DNAプローブを用いてハイブリダイゼーションにより固定化断片をプローブ化する。特異的対合式比較から回収されるハイブリダイジング帯の存在又は非存在は、対が間題の遺伝子座で血統による同一性を有するか否かを示す。この手法は、選択断片をプローブとして用いて初期マッピングを達成後に、地図の分解能を改良するのに有用であると思われる。このマッピング法により同定される遺伝子領域を標準的方法で、あるいはいくつかの場合にはゲノム不適合走査により選択される配列の直接クローニングによりクローニングし得る。次にこれらの配列をその生物学的機能に関して分析し、いくつかの場合には診断又は治療に用いるために直接にあるいは合成又は修飾形態で用い得る。２人又はそれ以上の個体間の遺伝的同一性の領域が十分小さい場合、例えば有用な特性に対する選択による戻し交配の生成物が比較される植物の繁殖の場合は、その結果生じるクローンプールが望ましい遺伝子配列（選択した特性に関与する）に非常に富んでいるため、選択された血統的に同一な制限断片をクローニングするのは有用であると思われる。遺伝子マッピングの別の態様は、個体ゲノム内の差異に目を向けている。個体又は標本がヘテロ接合性である、又はそうでない遺伝子地図の領域を同定することに留意する。この方法は、個体のDNAが変性及び再アニーリングされる場合に塩基不適合を伴うハイブリッドDNA分子を生じる個体のDNAの能力を基礎にした、被験個体におけるヘテロ接合性の領域に対応する単一複写配列の単離に基づいている。次に選択不適合ハイブリッド配列を標識化し、ゲノムDNA 標本の物理的規則整列に対するハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いる。ヘテロ接合性を欠くゲノムの領域は塩基不適合を有する単一複写DNAハイブリッドを生成できないため、これらの領域をハイブリダイゼーションパターンでのギャップとして視覚化する。以下にプロトコールの例を示す。 DNA標本を、結果的に生じる断片の大半が反復配列を含有しない程十分頻繁にD NAを切断する制限酵素で完了まで消化する。制限酵素の例としては、４つのヌクレオチド一致配列を有する酵素、例えばAluＩ, RsaＩ, TaqＩ, HaeIII及びMboＩが挙げられる。その結果生じる断片は、大半の部分に関して、約200〜4000ヌクレオチドの範囲内である。DNAを融解又は変性後、DNAを溶液中で再アニーリングさせるが、この場合、例えばその急速な再アニーリングに基づいてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより急速再アニーリング多重複写又は反復DNA配列（低C₀t）を除去し、その後残存するDNAを完全にアニーリングさせる。低C₀t 数DNAの除去が望ましいが、しかし不可欠というわけではない。完全再アニーリング後、望ましくは残留非アニーリング化DNAを除去し、残存する小さな、主として単一複写DNA断片を上記の特定メチル不適合修復蛋白質及びATPと一緒にインキュベートして不適合化DNA二重鎖中にニックを生成する。特定メチル不適合修復により不適合分子中に特異的に導入されるニックはDNAポリメラーゼによりニック翻訳DNA合成を考慮に入れ、したがって放射能標識化又は他の標識化ヌクレオチドトリホスフェートによる標識化を可能にする。３′〜５′エキソヌクレアーゼ活性は欠くがしかし５′〜３′エキソヌクレアーゼ活性を保持するポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼが、断片の末端での置換合成による標識化を避けるためにこの工程には好ましい。前記手法は、被験個体においてヘテロ接合性である遺伝子地図の領域を密に且つ特異的にカバーするプローブを提供する。逆に、ヘテロ接合性でない領域は標識化プローブを提供せず、したがってハイブリダイゼーション信号における示差的ギャップとして認識される必要がある。概して、同系交配係数が非常に低い場合を除いて、ホモ接合性を有する領域は、ホモ接合部位とヘテロ接合部位との間のハイブリダイゼーション強度の少しの、例えば３〜10倍の差が識別可能な境界を生じるのに十分なサイズの隣接パッチ内にある。したがって、前述のように、ヘテロ接合配列のホモ接合配列からの分離は絶対に必要だというわけではない。臨床的及びマッピング用途の他に、戻し交配及び選択を用いてヘテロ接合性又はホモ接合性を有する小領域に対する問題の特性の原因となる遺伝子を単離し得るため、この手法は植物及び動物の繁殖に有用であると思われる。必要な試薬を便利な形態で一緒に提供するキットが供給されると便利である。例えば、ゲノム不適合スクリーニングのためには、下記の少なくとも２つを含有するキットが提供される：制限酵素：約0.5〜10×10⁴の範囲のサイズの標的ゲノムから平均的断片を提供する１つ又はそれ以上の酵素；１つ又はそれ以上の修飾酵素；並びに半メチル化配列と非メチル化又はジメチル化一致配列との間を識別する制限酵素；不適合でニックを導入し、ニックを多数（≧10）のヌクレオチドのギャップに延伸することができる酵素；DNAポリメラーゼ；BNDCセルロース；並びに標識化トリホスフェート又はブラント末端結紮のための標識化リンカー、プローブを提供するために配列を標識化するための他の組成物。他の成分、例えば固定化DNAゲノムクローン又は中期染色体の物理的規則的整列、ハイブリダイゼーション結果を確定し解釈するための自動化系、データを分析するためのソフトウェア、又は他の補助器具を、用いられる特定のプロトコールに依って包含してもよい。本発明の方法は、影響を受ける親類ペア、即ち遺伝的に影響を受ける問題の特性を有する親類のペアを用いることにより、特定の用途を見出し得る。特に特性を付与する対立遺伝子の浸透度が低いか又は年齢依存性である場合に、あるいは特性が多遺伝子性又は定量的である場合（例えば身長及び体格）に、“罹患親類ペア”法が好ましい。易罹患性遺伝子が特に当てはまる。遺伝子地図上で２を含めた少数組の“罹患”親類は共通供給源からの継承同一配列を有する場所を確定することにより、そして他の家族成員を無視して、血統から連鎖情報を抽出するための非常に有効なストラテジーが提供される。その結果生じる同様の罹患親類の多数のペアからの血縁による同一性地図を組み合わせ得るし、罹患親類間の遺伝子型一致が思いがけなく予測よりも頻繁に起きる遺伝子座に関して合成地図を精査し得る。十分多数の罹患親類ペアを用いた場合、このような分析から、特性に対するわずかな感受性にも関与する遺伝子の位置が明らかにされる。本手法は、家族が共有する遺伝的リスクに対するルーチンのスクリーニングにも広範な用途を見出し得る。以下の実施例で本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。実験遺伝的に最もよく特性表示された真核生物であり、明確な遺伝的血縁性を有する酵母菌の調製及び特性付けが容易であるために、Saccharomyces cerviseae（ビール酵母菌）、即ちBaker酵母菌を試験系として用いた。方法の試験：サッカロミセス属Saccharomyces Ｙ55（HO his4 leu2CAN1^S ura3 Ga12）及びＹ24（ho HIS4 LEU2 MATa can1^R URA3 GAL2）（共通の１ab株の両誘導体である）の２つの別々に単離した半数体クローンを実験に用いた。Ｙ55及びＹ24（S288Cの誘導体）が100塩基対当たり約１塩基対で異なるということをRFLP分析から我々は概算した。２つの株を掛け合わせ、その結果生じた二倍体ハイブリッドを胞子形成させて、４つの半数体胞子クローンを生じた。あらゆる既定遺伝子座に関して、各胞子クローン（“娘”）はＹ55 又はＹ24対立遺伝子を受け取った。この試験の目的は、ペア間で血縁による同一性が認められない領域すべてからのDNAを除いて、２つの個体（ここでは親クローンと娘クローンのペア）が遺伝的同一性を共有する全遺伝子座からDNAをひとまとめに特異的に単離し得るか否かを調べることであった。我々は、胞子クローンが各親との血縁同一性を有するいくつかの遺伝子座を調べるために我々のゲノム不適合走査法を適用した。ゲノム不適合走査分析の結果を、栄養要求性及び薬剤耐性マーカーを用いて慣用的分析による結果（表１）と比較した。慣用的分析は、適切な選択培地上での増殖に関する試験で構成されていた。４つの遺伝子座：即ちHIS4，CAN1，URA3，GAL2を試験した。HIS4は染色体３上に、CAN1及びURA3 は染色体５上に、GAL2は染色体12上にある。これらの遺伝子座についての我々の分析は、15の個々のPstＩ制限断片全部を包含し、ゲノム内のそれらの時折の隣接位置は選択に際してのそれらの行動にとって重要でないので、この各々がゲノム不適合走査法の別々の試験を構成した。試験の結果は、比較されている親及び娘間で血縁的同一性を示した場合に、そしてその場合のみ分析した15のPstＩ制限断片すべてが回収されたということであった（表１及び２）。この結果はゲノム不適合走査の基礎をなす原理を確証した。手段：１．DNA単離：標準的方法（Methods in Enzymology 194（Chapter 11）：169-182）により、高分子DNAを各酵母菌株（親又は胞子クローン）から単離した。２．初期制限酵素消化：各DNA標本をPstＩ制限酵素で完全に消化した。フェノール：クロロホルム抽出によりDNAを回収し、エタノール沈殿させて、Tris-HCl 10mM EDTA 1mM,pH8.0中に再懸濁した。３．親株からのDNAのDamメチラーゼによるメチル化：２つの親株Ｙ55及びＹ24からのDNA標本を、0.25mg／mlのDNA濃度で、４単位の酵素／μｇのDNAを用いてメーカー推奨の緩衝液中で37℃で一晩インキュベーションして大腸菌Damメチラーゼ（NewEngland Biolabs）により十分にメチル化した。標本をフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させて、Tris-HCl 10mMEDTA 1mM, pH8.0中に再懸濁した。４．対合試験DNA標本の混合及び溶液ハイブリダイゼーション：Ａ．Ｙ55DNA（45μｌ中に５μｇ）＋胞子クローン１b DNA（80μｌ中に５μｇ）を５Ｍ Na0H 7.5μｌを加えて変性した。室温で１０分後、３Ｍ MOPS酸16μ ｌを加えて標本を中和した。次にホルムアミド32μｌ及び２Ｘ PERT緩衝液（4 M NaSCN 20mM Tris-HClpH7.9, 0.2mM EDTA）200μｌを加え、標本を水で400μｌに調整した。水に溶解した90％フェノールを明らかに乳濁液になるまで（約80μ ｌ）加え、次に標本を室温（一般的に約23℃）で12時間攪拌して乳濁液を保持した。Ｂ．Ｙ55DNA（45μｌ中に５μｇ）＋胞子クローン１ｃ DNA（45μｌ中に５μ ｇ）を５Ｍ Na0H 5.4μｌを加えて変性した。室温で10分後、３Ｍ MOPS酸12μ ｌを加えて標本を中和した。次にホルムアミド32μｌ及び２Ｘ PERT緩衝液200 μｌを加え、標本を水で400μｌに調整した。水に溶解した90％フェノールを明らかに乳濁液になるまで（約150μｌ）加え、次に標本を室温（一般的に約23℃）で12時間攪拌して乳濁液を保持した。Ｃ．Ｙ24DNA（45μｌ中に５μｇ）＋胞子クローン１ａ DNA（45μｌ中に５μ ｇ）を５Ｍ NaOH 5.4μｌを加えて変性した。室温で１０分後、３Ｍ MOPS酸12 μｌを加えて標本を中和した。次にホルムアミド32μｌ及び２Ｘ PERT緩衝液20 0μｌを加え、標本を水で400μｌに調整した。水に溶解した90％フェノールを明らかに乳濁液になるまで（約150μｌ）加え、次に標本を室温（一般的に約23℃ ）で12時間攪拌して乳濁液を保持した。Ｄ．Ｙ24DNA（45μｌ中に５μｇ）＋胞子クローン１ｃ DNA（45μｌ中に５μ ｇ）を５Ｍ Na0H 5.4μｌを加えて変性した。室温で１０分後、３Ｍ MOPS酸12 μｌを加えて標本を中和した。次にホルムアミド32μｌ及び２Ｘ PERT緩衝液20 0μｌを加え、標本を水で400μｌに調整した。水に溶解した90％フェノールを明らかに乳濁液になるまで（約150μｌ）加え、次に標本を室温（一般的に約23℃ ）で12時間攪拌して乳濁液を保持した。 DNAを回収するために、標本を各々クロロホルムで１回抽出し、次いでエタノール沈殿させて、Tris／EDTA 200μｌに再懸濁した。５．ホモハイブリッド分子（同一供給源からの両株）のDpn Ｉ＋及びMbo Ｉ＋による消化：各ホモハイブリッド株105μｌを最終容量400μｌのNEB緩衝液中で1 00単位のDpn Ｉ及び２５単位のMbo Ｉを用いて37℃で２時間消化した。６．残留非アニーリング化ＤＮＡの除去：Mbo Ｉ／Dpn Ｉ消化後、標本をフェノール／クロロホルムで抽出し、5Ｍ NaCl 100μｌを各々に加えて、次に標本を50μＭ Tris, pH8.0, １Ｍ NaClで平衡させたBNDCセルロース（Sigma）100 mgを用いて４℃で３時間インキュベートした。標本を遠心機中で14000rpmで遠心分離し、上清をフェノール／クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出して、エタノール沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、乾燥して90μｌのTris-HCI 10mM EDTA 1mM, pH8.0 中に再懸濁した。７．不適合化ハイブリッドDNAの選択的ニック化：各DNA標本15μｌをMutＨ蛋白質5.2ng, MutL蛋白質340ng, MutS蛋白質700ng（蛋白質はすべて、Paul Modric h, Duke Universityにより精製形態で提供された）と最終容量60μｌの緩衝液（ 50mM Hepes, pH8.0, 20mMKCl, 5mM MgCl₂, 1mM DTT, 50μｇ／ml，ウシ血清アルブミン、及び２mM ATP）中で混合した。混合物を37℃で３０分インキュベートし、次いで65゜Ｃに10分間加熱して反応を停止させた。８．ニックを一重鎖ギャップに、Mbo I又はDpn I切断による末端を一重鎖尾部に変換するためのエキソヌクレアーゼIII消化：緩衝液（50mM Tris-HCI, pH8.0, 5mM MgCl₂, 10mM β−メルカプトエタノール）140μｌを加えることにより、工程７からの全標本容量を200μｌに調整した。次に10単位のエキソヌクレアーゼIIIを加え、37℃で10分間インキュベーションを継続した。EDTAを10mMまで加えてこの反応を停止させた後、フェノール／クロロホルムで抽出した。９．混合物からの一部又は全部一重鎖ＤＮＡ分子の除去：5Ｍ NaCl50μｆ＋１Ｍ NaCl 250μｌを加えて１Ｍ NaClの濃度で500μｌの容量に調整した。50mM Tris, pH8.0, 1M NaClで平衡させたBNDCセルロース100mgを加え、混合物を４℃ で３時間インキュベートした（Sedert,et al.（1967）J. Mol. Biol. 26:537-54 0 ;Iyer and Rupp（1971） Bioch. Biophys. Acta. 228:117-126）。混合物を14 000rpmで１分間遠心分離し、次いで上清をフェノール／クロロホルムで１回抽出して、一晩エタノール沈殿させた。小ペレットを15μｌのTris-HCI 10mM, EDTA 1mM, pH8.0中に再懸濁した。 10．サザーンブロッティングによる選択DNAプールの分析：結果的に生じた各DNA標本の６分の１を、TBE緩衝液中で0.7％アガロースゲルに通して、70ボルトで15時間電気泳動に掛けた。サザーンブロッティングにより DNA をナイロンフィルターに移し、４つの特異的遺伝子座HIS４， CAN１， URA３及びGAL２に対応するラムダファージクローンからの標識化DNAを用いてフィルターを首尾よくプローブ化した。各々の場合、試験遺伝子座に血統による同一性を有するDNA標本に対応するレーンで３−５制限断片が容易に検出され、プローブ化されている遺伝子座で適合しないことが直接試験から公知の標本に対応するレーンでは検出されなかった（表１及び２参照）。各遺伝子座の２つの対立遺伝子を、Ｙ24及びＹ55に存在する対立遺伝子に関してそれぞれＡ及びＢと呼ぶ。各胞子クローンはその二親の一方からの対立遺伝子を、即ちＹ24からの対立遺伝子Ａ又はＹ55からの対立遺伝子Ｂを継承した。これらの遺伝子座の対立遺伝子は、特異的培地で増殖させて試験することにより直接識別し得る。 “−”は、指示遺伝子座に特異的なDNAプローブにより検出されたあらゆる制限断片に関してDNAが回収されなかったことを示す（交差ハイブリダイゼーション〜悲連鎖配列の不明瞭な帯は無視する）。 “＋”は、指示遺伝子座に特異的なDNAプローブにより検出された全制限帯におけるDNAの回収を示す。指示遺伝子座に対して用いたプローブにより残存した制限断片帯の数を、表の最下列の括弧内に示す。各場合に用いたプローブは、Maynard Olsenが確立した規則収集によるバクテリオファージラムダクローンであった。プローブとして用いた特異的クローンを以下に示す： CAN1：クローン5917、HIS4：クローン4711 、URA3：クローン6150、GAL2 ：クローン6637。クローン番号は、MaynardOlsen が指定した番号である。便宜上、考え得る親娘の組合せ８つのうち４つのみを試験した。４遺伝子座に関する遺伝的試験結果を表１に示す。後に調べた多数の他のペア方式比較は、同様の結果を示した。本発明の方法が多数の利益を提供することは上記の結果から明らかである。本方法は小家族単位を用いた連鎖マッピングに必要な多数組の高度多型マーカーの入手手段を提供する。単一手法で全マーカーを平行してスクリーニングするために、個体試験の数を対応的に増大しなくても、有効数の情報性マーカーを大いに増大し得る。連鎖マッピングに使用する血縁個体が極少数組でよいために、罹患親類ペア及び血縁によるホモ接合性マッピング法は、ヒト遺伝子地図の開発に伴う経費及び労力を大いに低減し得る。ゲノム不適合走査は、遺伝的に不均質な又は定量的な特性、例えば心臓血管性疾患、喘息、精神医学的障害、癲癇、肥満症、癌及び糖尿病に対する連鎖マッピングの実用的使用を可能にする。本発明の方法はいかなる既存マッピング化遺伝子マーカーにも頼らない。したがって、事前の地図情報がほとんど又はまったく得られないゲノムの遺伝的及び物理的地図の開発をただちに始めるのに本発明の方法を使用し得る。これは、植物又は動物種の繁殖に、並びにこのような種の遺伝学の開発に特に重要な用途を見出し得る。各ペア方式分析は減数分裂的組換えの部位のマッピングを可能にする。祖父母 −孫ペアにおいては、血統的同一性地図は、対応する親の減数分裂的組換えの部位を特異的に同定する。遺伝子地図と物理的地図との間の関係、増強又は縮小組換えの部位の位置、減数分裂的組換えの頻度及び分布に及ぼす年齢、性別及び他の因子の影響、並びに組換えと非接合障害との関係といった疑問は、本方法で容易に調べがつく。最後に、ヘテロ接合性を失ったゲノムの領域を直接検出する能力は、特異的遺伝子座出のヘテロ接合性の損失は多数の癌の発達における遺伝子的事象に重要であると考えられるため、推定上の癌抑制遺伝子を同定するのに、そして悪性新生物の初期診断に有用であると思われる。本明細書中に引用した論文及び特許出願はすべて、個々の論文又は特許出願の各々が特にそして個別に参照により含まれると指示されていない場合にも、参照により本明細書に含めるものとする。明らかにし理解させるために説明及び実施例により本発明を詳細に記載したが、本発明の教示にかんがみて、添付の請求の範囲の精神及び範囲を逸脱しない限りにおいてはある種の変更及び修正をなし得ることは当業者には明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年４月６日【補正内容】請求の範囲１．遺伝子マッピング又は同定に用い得るDNA二重鎖を２つの血縁供給源からのDNAの複合混合物から分離する方法であって、上記供給源の各々が少なくとも約５×10⁴ bpのDNAに関与し、以下の：前記２つの血縁供給源からDNAを単離し；前記２つの血縁供給源からの前記DNAを消化し、第１の制限断片を供給し；（１）メチル化、（２）前記消化においての異なった制限酵素の使用、及び（３）ラベルされたヌクレオチドの組込みから成る群からの方法により前記供給源の１つからのＤＮＡを変性し、ここで前記変性は前記１つの供給源からのDNAを区別する手段を提供し；前記制限断片を変性し、一重鎖DNAを供給し；前記２つの供給源からの前記一重鎖DNAを組合し、ヘテロハイブリッド及びホモハイブリッドから成る二重鎖を供給し；ホモハイブリッドとヘテロハイブリッドとを分離し；ミスマッチを有するヘテロハイブリッドにギャップを導入し；ギャップされていないヘテロハイブリッドからギャップされたヘテロハイブリッドを分離し；そして前記ギャップされていないヘテロハイブリッドをラベルし、ラベルされたDNA プローブを供給し；ここで前記ラベルされたDNAプローブは遺伝子同定又はマッピングのために有用である；工程を含んで成る方法。２．ミスマッチを有するヘテロハイブリッドにおけるギャップの前記導入が：ミスマッチを有するDNA二重鎖中にニックを導入し；そして一本鎖、部分的一本鎖の二重鎖及び二重鎖DNAの混合物を生成するためにニックを有するDNA二重鎖中に一本鎖のギャップを導入する段階を含んで成り；そして前記供給源の１つからのDNAの変性がメチル化であり、そしてヘテロハイブリッドからのホモハイブリッドの分離が：ヘテロハイブリッドが消化されない条件下で、第２の断片を生成するために少なくとも１つのメチル感受性制限酵素により前記二重鎖を消化する段階を含んで成り、そして得られる消化された二重鎖の末端が前記第１の制限断片の末端と異なり；ニックを有するDNA二重鎖中への一本鎖ギャップの導入が前記第２の制限断片の末端でギャップをさらに導入する請求の範囲第１項記載の方法。３．２種の遺伝的に関連する供給源からのDNAの複合混合物から遺伝的同一性を有するいづれかのDNA断片を分離するための方法であって、上記供給源の各々が少なくとも約10⁶ bpのDNAに関与し、以下の：前記２種の供給源からDNAを単離し；第１の制限断片を供給するために前記２種の供給源からの前記DNAを消化し；前記供給源の１つからのDNAを配列特異的メチラーゼによりメチル化し；１本鎖DNAを供給するために前記制限断片を変性し；ヘテロハイブリッド及びホモハイブリッドから成る二重鎖を供給するために前記２種の供給源からの前記一本鎖DNAを組合し；ホモハイブリッドのみが消化される条件下で、第２の制限断片を供給するために少なくとも１つのメチル感受性制限酵素により前記二重鎖を消化し、そして前記得られる第２の制限断片の末端が前記第１の制限断片の末端と異なっており；ミスマッチされたDNA二重鎖中にニックを導入し；一本鎖、部分的一本鎖の二重鎖、及びギャップ化されていない二重鎖DNAの混合物を生成するために、（１）ニック化されたDNA二重鎖及び（２）前記第２の制限断片中に一本鎖ギャップを導入し；ギャップ化されていない二重鎮DNAを単離し；そしてラベルされたDNAプローブを供給するために前記ギャップ化されていないヘテロハイブリッドをラベルし、ここで前記ラベルされたDNAプローブが２種の関連する供給源間の相続により遺伝的同一性の領域を同定する段階を含んで成る方法。４．Ｅ．コリの酵素MutL, MutS及びMutHがミスマッチされたDNA二重鎖中に前記ニックを導入し；そしてニック化されたDNA二重鎖及び前記第２の制限断片中に前記一本鎖ギャップを導入する酵素が、（Ａ）ヘリカーゼII、一本鎖結合タンパク質及び少なくとも１つのエキソヌクレアーゼＩ又はVII及び（Ｂ）Ｅ．コリのエキソヌクレアーゼIII から成る群から選択される請求の範囲第３項記載の方法。５．前記ギャップ化されていない二重鎖DNAの単離が：一本鎖、部分的一本鎖の二重鎖及びギャップされていない二重鎖DNAの混合物を、高塩濃度でベンゾイル化され、ナフチル化されたDEAEセルロース（BNDC）とを組合し、ここで一本鎖及び部分的一本鎮DNAがBNDCに結合し；ギャップ化されていない二重鎖DNAを供給するために結合されていないDNAから結合されたDNAを分離し；そしてラベルされたプローブを供給するために前記ギャップ化されていないヘテロハイブリッドDNAをラベルする階段を含んで成る請求の範囲第４項記載の方法。６．DNAプローブにより同一性の核酸領域を同定するための方法であって：請求の範囲第１項又は第３項のいづれか１項記載の方法によりラベルされたDN Aプローブを得；前記ラベルされたDNAプローブと遺伝子地図の少なくとも一部分を表わす規則列挙のDNA分子とを、前記ラベルされたDNAプローブが相同DNAにハイブリダイズする条件下で組合し；そして前記ラベルされたDNAプローブにより前記同一性の領域を検出することを含んで成る方法。７．前記規則列挙が、（Ａ）中期拡張、（Ｂ）前記遺伝子地図の少なくとも一部を表わすクローンの列挙及び（Ｃ）前記遺伝子地図の少なくとも一部を表わすインビトロ増幅されたDNA配列の列挙から成る群から選択される請求の範囲第６項記載の方法。８．個人のゲノムにおいて同じ遺伝子座のためにヘテロ接合性であるDNA配列を同定するための方法であって：前記個人からDNAを単離し；第１の制限断片を供給するために前記２種の供給源から前記DNAを消化し；一本鎖DNAを供給するために前記制限断片を変性し；二重鎖を供給するために前記一本鎖DNAを再アニール化し；Ｅ．コリの酵素MutL, MutS及びMutHによりミスマッチされたDNA二重鎖中にニックを導入し；ラベルされたプローブを供給するために前記ニック化されたDNA二重鎖をラベルし；前記ラベルされたプローブと前記ゲノムの少なくとも一部を表わす規則列挙の DNA分子とを、前記プローブが相同DNAにハイブリダイズする条件下で組合し；そして前記ラベルされたプローブにより同じ遺伝子座のためにヘテロ接合性である前記DNA配列を同定することを含んで成る方法。９．２種の関連する供給源間での相続により遺伝的同一性をマッピングするための方法であって：請求の範囲第１又は第３項のいづれか１項記載の方法によりラベルされたDNA プローブを得；そして相続により遺伝的同一性の部位を検出し、そして／又はマッピングするために前記関連する供給源の１つのDNAと前記ラベルされたDNAプローブとを組合することを含んで成る方法。 10．MutL, MutS, MutH酵素、ラベルされたトリホスフェート又はラベルされたリンカー、及びDNAポリメラーゼ並びに次のもの：変性酵素及び前記変性酵素により認識されるメミメチル化された部位以外で切断する変性酵素；エキソヌクレアーゼ；ヘリカーゼII；一本鎖結合タンパク質；BNDCセルロース；及び遺伝子地図の少なくとも一部を含んで成る規則列挙のDNA分子の少なくとも１つを含んで成るキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ネルソン，スタンレーアメリカ合衆国，カリフォルニア 94025, メンロパーク，ハイトストリート 315 (72)発明者クラフォルツ，スーアメリカ合衆国，カリフォルニア 94305, スタンフォード，ピーターコーツサークル 76

Claims

【特許請求の範囲】１．遺伝子マッピングは同定に用い得るDNA二重鎖を２つの血縁供給源からのD NAの複合混合物から分離する方法であって、上記供給源の各々が少なくとも約５ ×１０⁴bpのDNAに関与し、以下の：制限断片を提供するために一次及び二次血縁供給源からのDNA（ここで、上記一次及び二次血縁供給源からのDNAは上記DNAの示差的修飾の、あるいは消化における異なる制限酵素の使用の結果として区別できる）を消化して、ホモハイブリッド及びヘテロハイブリッドで構成されるDNA二重鎖を提供し；ホモハイブリッドをヘテロハイブリッドから分離し；不適合を有するヘテロハイブリッドに損傷を導入し；そして損傷を有するヘテロハイブリッドを完全相補的ヘテロハイブリッドから単離する工程から成る方法。２．上記示差的修飾及び分離が以下の：異なるメチラーゼを用いて上記血縁供給源の一方からのDNAをメチル化するか又は上記供給源の両方からのDNAをメチル化し；上記DNA二重鎖をメチル感受性制限酵素で切断して、ホモハイブリッドDNAの切断を引き起こし；ヘテロハイブリッドDNAを切断ホモハイブリッドDNAから分離することにより、そして上記損傷導入が：上記ヘテロハイブリッドDNAを特定メチル不適合修復経路の酵素及びエキソヌクレアーゼと結び合わせて、それによりニックが損傷を含有する上記ヘテロハイブリッドDNA 中に導入され、上記損傷が上記エキソヌクレアーゼによりギャップに拡大されて部分的一重鎖及び一重鎖DNAを提供し；上記部分的一重鎖及び一重鎖DNAを上記完全相補的DNA二重鎖から分離し；遺伝子マッピング又は同定に用いるために上記完全相補的DNA二重鎖を標識することによる請求項１記載の方法。３．上記酵素が大腸菌のMutL, MutS及びMutHを包含する請求項２記載の方法。４．上記連合工程に含まれるものがヘリカーゼII、一重鎖結合蛋白質、及びエキソヌクレアーゼＩ及びVIIの少なくとも１つであり、あるいは上記エキソヌクレアーゼが大腸菌のエキソヌクレアーゼIIIである請求項２記載の方法。５．上記分離が：上記部分的一重鎖及び一重鎖DNA及びDNA二重鎖を高塩濃度でベンゾイル化ナフチル化DEAEセルロース（BNDC）と結合し； BNDCセルロースと結合するDNAを完全相補的DNA二重鎖から取り外す工程から成る請求項２記載の方法。６．遺伝子マッピング又は同定のために用い得るDNA二重鎖を２つの血縁ゲノムからのDNAの複合混合物から分離する方法であって、上記ゲノムの各々が少なくとも約10⁶bpのDNAに関与し、以下の：一次及び二次関連ゲノムからのDNA制限断片（ここで、上記DNAは事実上GATC配列を包含する制限断片から成る）を融解及び再アニーリング条件下で結合させて、ホモハイブリッド及びヘテロハイブリッドDNA二重鎖を形成し（ここで、上記一次及び二次供給源からのDNA断片は異なる）；上記DNA二重鎖の差によりヘテロハイブリッドDNA二重鎖からホモハイブリッドを分離し；ヘテロハイブリッドDNA二重鎖を大腸菌のMutL, MutS及びMutHから成る酵素と結び合わせて、不適合を含有するDNA二重鎖におけるニックから成る損傷を引き起こし；その結果生じるニック化及び非ニック化DNA分子を混合物中のニック化 DNA分子が部分的一重鎖にされるようにエキソヌクレアーゼIIIで処理し；上記部分的一重鎖DNAを完全二重鎖DNAから分離する工程から成る方法。７．以下の：上記結び合わせにおいて、又はその後の工程において、DNAポリメラーゼ及び標識化ヌクレオチド（ここで、標識化ヌクレオチドは上記ニック化DNA二重鎖に組み込まれるようになる）を包含し；そして上記標識により非標識化DNAから上記標識化DNAを分離し；あるいは上記部分的一重鎖及び一重鎖DNA及び完全二重鎖DNAを高塩濃度でベンゾイル化ナフチル化DEAEセルロースと結合させて；そしてセルロースと結合するDNAを完全二重鎖DNAから分離し；あるいは部分的一重鎖DNAを上記一重鎖の部位で切断して小DNA二重鎖を提供し；そして上記小DNA二重鎖を非切断DNA二重鎖から分離する工程の１つを包含する請求項６記載の方法。８．上記DNA制限断片が異なる末端を有する点で異なる請求項６記載の方法であって、末端の差異がヘテロハイブリッドをホモハイブリッドから分離するのに用いられる方法。９．上記結び合わせがさらに：上記ヘテロハイブリッドDNAに関して、ヘリカーゼII、エキソヌクレアーゼＩ及び／又はXII、一重鎖結合蛋白質、DNAポリメラーゼIII、並びに標識化ヌクレオチド（ここで、標識化ヌクレオチドは部分的一重鎖DNAに組み込まれるようになって、標識化DNAを提供する）を含有し；上記標識化DNAを上記標識によって非標識化DNAから分離する工程を包含する請求項６記載の方法。 10．２つの関連供給源からのDNAの複合混合物からDNA二重鎖を分離するための分離方法により得られるプローブを用いて識別点の核酸領域を同定するための方法であって、上記供給源の各々が少なくとも約５×10⁴bpのDNAに関与し、以下の：制限断片を提供するために一次及び二次血縁供給源からのDNA（ここで、上記一次及び二次血縁供給源からのDNAは上記DNAの示差的修飾の、あるいは消化における異なる制限酵素の使用の結果として区別できる）を消化して、ホモハイブリッド及びヘテロハイブリッドで構成される DNA二重鎖を提供し；ホモハイブリッドをヘテロハイブリッドから分離し；不適合を有するヘテロハイブリッドに損傷を導入し；そして損傷を有するヘテロハイブリッドを完全相補的ヘテロハイブリッドから単離し；上記の完全相補的ヘテロハイブリッドを標識する工程から成る方法であって、以下の：上記プローブが相同DNAと交雑する条件下で上記プローブを遺伝子地図の少なくとも一部を表すDNA分子の定序列と結び合わせて；そして上記標識により同一性領域を検出する工程から成る方法。 11．上記定序列が中期染色体展開物である請求項10記載の方法。 12．上記定序列が上記遺伝子地図の少なくとも一部を表すクローンの列である請求項10記載の方法。 13．上記定序列が上記遺伝子地図の少なくとも一部を表すin vitro増幅された DNA配列の列である請求項10記載の方法。 14．個体のゲノムにおける同一遺伝子座に関してヘテロ接合性であるDNA配列の同定方法であって、以下の：ゲノムDNA を少なくとも１つの制限酵素で消化して約200〜5000bpの小DNA断片を提供し；上記DNA断片を融解及び再アニーリングし；上記DNA断片を特定メチル不適合修復経路の酵素と結び合わせて、それによりニックが上記DNAの不適合含有断片中に導入され；上記ニック化DNA断片を標識してプローブを提供し；上記プローブが相同DNAと交雑する条件下で上記プローブを上記ゲノムの少なくとも一部を表すDNA分子の定序列と結び合わせて；そして上記標識により上記DNA配列を同定する工程から成る方法。 15．上記標識が、小DNA断片を含有する上記損傷を３′〜５′エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ及び標識化ヌクレオチドトリホフファターゼを用いてインキュベートすることから成る請求項14記載の方法。 16．個体のゲノムにおける同一遺伝子座に関してヘテロ接合性であるDNA配列の同定方法であって、以下の：ゲノムDNAを少なくとも１つの制限酵素で消化して約200〜5000bpの小DNA断片を提供し；上記DNA断片を融解及び再アニーリングし；上記DNA断片を特定メチル不適合修復経路の酵素と結び合わせて、それによりニックが上記 DNAの不適合含有断片中に導入され；ニックを有するそれらの断片が一重鎖又は部分的一重鎖となるように上記DNA 断片をエキソヌクレアーゼで処理し； BNDCに吸着させて一重鎖及び部分的一重鎖断片を完全二重鎖DNA断片から分離し；上記一重鎖又は部分的一重鎖小DNA断片を標識するかあるいは完全相補的dsDNA を標識してプローブを提供し；上記プローブが相同DNAと交雑する条件下で上記プローブを上記ゲノムの少なくとも一部を表すDNA分子の定序列と結び合わせて；上記標識により上記DNA配列を同定する工程から成る方法。 17．部分的一重鎖DNAを含有する上記損傷の上記標識化がDNAポリメラーゼIII 及び標識を包含するヌクレオチドトリホスフェートを上記部分的一重鎖DNAに付加することから成る請求項16記載の方法。 18．以下の：上記断片がアニーリングして一緒にヘテロハイブリッドdsDNA二重鎖及びホモハイブリッドdsDNA二重鎖を形成し得る条件下で２つの異なる供給源からの断片化一次ゲノムDNA（ここで、断片の大きさは血縁的に同一でない遺伝子領域から形成されるヘテロハイブリッドが少なくとも１つの塩基不適合を含有することを事実上保証するか、あるいは完全適合二重鎖を不適合二重鎖から分離する能力を保証するよう選択される）を結合させ；好ましくはヘテロハイブリッド二重鎖及び不適合二重鎖を修飾することによりヘテロハイブリッド二重鎮をホモハイブリッド二重鎖から、適合二重鎖を不適合二重鎖から分離し；上記適合ヘテロハイブリッド二重鎖を延伸せずに上記適合ヘテロハイブリッド二重鎮の鎖の少なくとも一方を標識して検出可能なプローブを提供し；そして二次ゲノムDNAを上記検出可能プローブと結び合わせて上記供給源の適合DNAのＶを検出及び／又はマッピングする工程から成る遺伝子マッピング方法。 19．さらに：各供給源からのDNAに対して異なる酵素を用いて特異的一致配列で上記供給源の少なくとも１つからのDNAをメチル化する工程を包含し、そして上記分離が：少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを用いて上記二重鎖（ここで、メチル化されていない又は二重にメチル化された二重鎖は切断されて小断片を提供する）を切断し；上記切断二重鎖と結合していない非切断二重鎖を単離し；不適合二重鎖をニック化し、適合二重鎖は変えずにそのままにして上記ニック化不適合二重鎖にギャップを導入し；そしてギャップ化二重鎮を適合二重鎖から分離する工程から成る請求項18記載の方法。 20．上記ニック化及びギャップ導入が特定メチル不適合修復経路の蛋白質を使用する請求項９記載の方法。 21．上記ニック化及びギャップ導入が特定メチル不適合修復経路の蛋白質及びエキソヌクレアーゼIIIを使用する請求項19記載の方法。 22．上記分離が上記二重鎖をBNDCセルロースと結び合わせ、上記BNDCセルロースと結合するDNAを未結合二重鎖から分離する工程から成る請求項19記載の方法。 23．上記二次ゲノムDNAが遺伝子地図の少なくとも一部を表すDNA分子の定序列である請求項18記載の方法。 24．MutL, MutS, MutH酵素、標識化トリホスフェート又は標識化リンカー、及びDNAポリメラーゼを包含するキャット。 25．さらに以下の：修飾酵素及び上記修飾酵素に認識される半メチル化部位以外で切断する酵素；エキソヌクレアーゼ；ヘリカーゼII；一重鎖結合蛋白質；BN DCセロース；遺伝子地図の少なくとも一部を含むDNA分子の定序列の少なくとも１つを包含する請求項24記載のキット。