KR101026816B1 - 핵산 집단내 오류 저감 방법 - Google Patents

핵산 집단내 오류 저감 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 임의의 소정 서열을 갖는 다양한 크기의 이중 가닥 DNA 분자의 직접 합성 방법에 관한 것이다. 합성하고자 하는 DNA 분자를 더 작은 중첩 DNA 단편으로 논리적으로 분해한다. 마스크리스 마이크로어레이 합성기를 사용하여 기판 상의 DNA 마이크로어레이를 제조하는데, 여기서 어레이의 각 구성요소 또는 각 특징부에는 중첩 DNA 단편 중 하나의 DNA가 위치한다. 각 단편의 상보체 역시 마이크로어레이 내에 제조한다. 상기 DNA 단편은 기판으로부터 분리되어 DNA의 하이브리드화를 촉진하는 조건 하에 유지되는데, 그 조건 하에서는 단편들이 하이브리드화하여 이중 가닥을 형성한다. 그 후 부적절하게 형성된 DNA 나선에 결합하는 DNA 결합제를 사용하여 이중 가닥을 분리하여 DNA 분자 세트로부터 오류를 제거한다. 그 후 단편들을 서로 하이브리드화하여 더 큰 목표 DNA 서열을 조립할 수 있다.

Description

핵산 집단내 오류 저감 방법{METHOD OF ERROR REDUCTION IN NUCLEIC ACID POPULATIONS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2002년 2월 28일자로 출원된 미국 가출원 제60/360,563호를 기초로 우선권을 주장한다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발에 대한 언급
본 발명은 상무성 산하의 첨단 기술 연구 계획청(DOC ARPA) 승인 번호: N39998-01-2-7070에 의해 제공된 미국 정부 지원 하에 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.
본 발명은 일반적으로 생물학 분야에 관한 것이며, 구체적으로는 정해진 또는 원하는 서열로 이루어진 DNA 분자의 제조를 위한 기법 및 장치에 관한 것이다. 또한 DNA 분자의 제조는 임의의 원하는 펩티드, 단백질 또는 원하는 대로 단백질 및 핵산의 조립체의 합성을 가능하게 한다.
재조합 DNA 화학 기법을 이용하여 DNA 서열을 그 원천으로부터 복제하고 증폭시키는 방법과, 그러한 서열을 구성요소 부분으로 분해한 후, 이들을 새로운 DNA 서열로 재조합 또는 재조립하는 방법은 현재 통상적으로 이용되고 있는 방법이다. 올리고뉴클레오티드라고 불리는 짧은 DNA 서열은 개별 뉴클레오시드로부터 직접 합성하는 것이 가능하고 또 일반적으로 이용되고 있지만, 약 400 염기쌍 이상의 DNA 서열의 대형 단편 또는 조립체를 직접 작제하는 것은 일반적으로 비현실적인 것으로 인식되어 왔다. 그 결과 대형 DNA 단편은 일반적으로 개별적으로 구입, 클로닝 또는 합성이 가능한 구성요소 부분 및 단편으로부터 작제한 후 원하는 DNA 분자로 조립한다.
예를 들어, 발현 벡터가 선택된 숙주에서 새로운 단백질을 발현하도록 하길 원한다면 과학자는 흔히 분자 생물학 공급품 회사로부터 범용 발현 벡터를 구입한 후 발현시키고자 하는 유전자에 대한 단백질 암호화 영역을 클로닝 또는 합성할 수 있다. 암호화 영역은, 벡터가 숙주 내에서 원하는 단백질을 효과적으로 발현하도록 정확한 위치와 배향으로 벡터에 결찰시켜야 한다. 벡터 구매자는 또한 벡터의 다른 DNA 구성요소가 구매자가 수행하고자 하는 실험에 불리한 영향을 줄지도 모르는 다른 특성을 갖고 있지 않도록 확실히 하기 위해 벡터의 서열을 조사해야 한다. 따라서, 임의의 새로운 원하는 대형 DNA 작제물을 작제하는 데 있어서의 어려움은 유사한 작제물, 또는 작제물의 구성요소들을 공공 공급원으로부터 구입 또는 수득할 수 있는지와, 그러한 구성요소들의 서열에 관한 유용한 정보가 얼마나 많은지에 달려 있다.
DNA 마이크로어레이에서 작제된 DNA를 사용하는 것에 기초하여 새로이 디자인된 무한한 길이의 DNA 서열을 작제하고 조립하는 신규 방법이 개발되었다. DNA 마이크로어레이는 기판 상에 배열된 단일 가닥 DNA 프로브의 다수의 세트로 이루어진다. 프로브 세트는 그 뉴클레오티드 서열이 동일하지만, 다른 프로브 세트와는 서열이 상이하다. 맞춤형 어레이의 제조에 알맞는 DNA 마이크로어레이의 동일계(in situ) 합성을 위한 기법이 개시되었다. PCT 특허 출원 공개 공보 WO 99/42813 및 미국 특허 출원 제6,375,903호는 그러한 어레이의 제조 방법에 대해 기술하는데, 이 방법에서는 컴퓨터로부터의 소프트웨어 제어 하에 고밀도 마이크로미러 어레이에 의해 합성되는 어레이에 빛을 선택적으로 조사한다. 마이크로미러 어레이는 완전히 소프트웨어 제어 하에 작동되므로, 복잡한 고비용의 포토리소그래피 마스크를 제조할 필요가 전혀 없다. 그러한 맞춤형 마이크로어레이를 이용하여 불확정 길이의 이중 가닥 DNA 분자를 조립하는 데 필요하고 충분한 단일 가닥 DNA 단편을 제공할 수 있다. 본원에서 참고 문헌으로 포함하는 PCT 출원 공개 공보 WO 02/095073에 이 방법이 개시되어 있다. 요약하면, 이 방법을 이용하여 마이크로어레이 상에 짧은 단일 가닥 DNA 단편을 제조하고, 각 프로브의 일부분이 어레이 상의 다른 세트의 다른 두 올리고뉴클레오티드에 상보성이 되도록 디자인한다. 그 후 이론적으로는, 올리고뉴클레오티드가 어레이의 기판으로부터 분리될 경우, 각 상보성 단편은 그 상보체에 하이브리드화하기 때문에 DNA 단편은 원하는 완전한 DNA 분자로 자체 조립된다.
이와 같은 일반적 DNA 합성 방법에서는 합성 과정 또는 생화학적 과정이 완벽하게 효율적이지도 정확하지도 않다는 점에서 복잡함이 발생한다. 따라서, 이러한 방법에 의해 제조된 DNA 단편에는 우발적인 결실 및 치환 오류가 발생하는 것을 피할 수 없다. 유익하고 우수한 품질을 갖는 더 긴 DNA 분자의 실용적 합성을 촉진하기 위해서는 프로브 합성 및 조립 과정에 있어서의 각종 오류 및 비효율성을 통해 발생하는 인위적 결과로부터 원하는 DNA 서열을 정제하는 방법을 개발하여야 한다.
발명의 개요
본 발명은 부정확한 서열의 DNA 분자로부터 정확한 서열의 DNA 분자를 분리하는 방법으로서 요약되며, 이 방법은 형태 불규칙성을 갖는 이중 가닥 DNA 분자에 선택적으로 결합하는 DNA 결합제에 이중 가닥 DNA 분자의 용액을 노출시키는 단계 및 DNA 결합제가 결합하지 않은 DNA 분자로부터 DNA 결합제가 결합한 DNA 분자를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명은 최소 오류를 갖는 실질적으로 임의의 크기의 DNA 작제물의 실용적 제조 방법을 제공한다. 이 방법에 의해 DNA 또는 유전자 발현에 대한 실험을 수행하고자 하는 연구자들은 시판되는 벡터 또는 유전자 구성요소를 사용하여 실험해야하는 제약으로부터 해방된다. 그 대신, 마이크로어레이 기반 기법을 이용하여 컴퓨터 상에서 최초로 단시간 내에 DNA 서열을 고안하고 제작할 수 있다.
본 발명은 또한 대부분의 정확한 서열을 보유하는 서열의 집합체(pool)로부터 소량의 부정확한 서열을 보유하는 DNA 이중 가닥을 분리해 내는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 이중 가닥 DNA 분자를 변성시키는 단계; DNA 분자를 하이브리드화하여 새로운 DNA 이중 가닥 분자를 형성하는 단계; DNA 이중 가닥의 형태에 불규칙성을 갖는 DNA 분자에 선택적으로 결합하는 DNA 결합제에 상기 이중 가닥 DNA 분자를 노출시키는 단계; 및 DNA 결합제가 결합된 DNA 분자를 분리해 냄으로써 DNA 분자를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 목적, 특징 및 장점은 첨부 도면을 참조하면 후술하는 발명의 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명 방법을 개략적으로 도시한다.
도 2는 본 발명 방법의 다른 단계를 개략적으로 도시한다.
도 3은 DNA 서열의 집합체로부터 부정확한 서열의 DNA를 제거하는 구상을 개략적으로 도시한다.
도 4는 후술하는 실시예 중 하나에서 사용된 절차를 도시한다.
도 5는 후술하는 실시예 중 하나에서 올리고뉴클레오티드로부터 조립된 이중 가닥을 도시한다.
한 구체예에서, 본 발명은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 합성 중에 발생한 오류의 양을 저감하는 방법으로서 창안되었다. 본 발명자들은 이 방법을 "일치 필터링(coincidence filtering)"이라 칭한다. "일치 필터"란 용어는 전자학 및 광물리학에서 차용한 것으로, 상기 분야에서 일치 필터는 일치하는 빛 또는 에너지 신호를 필터링하기 위해 사용된다. 본원에서 상기 용어는 일치하는 DNA 단편이나 또는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 부정합(mismatch) 뉴클레오티드를 갖지 않는 DNA 단편에 대해서만 선택적으로 과정을 통과하도록 하는 과정을 의미한다. 이 과정은 핵산 집단으로부터 그 내부에 부정합 또는 결실을 갖는 핵산을 제거한다. 전체 과정은 또한 정확한 정합 서열을 갖지만, 제조된 DNA 분자의 집단에서 다수의 DNA 서열과는 상이한 서열을 갖는 임의의 이중 가닥 DNA 분자를 선택적으로 필터링하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법은, 역시 본원에서 참고 문헌으로 포함하는 미국 특허 제6,375,903호에 개시된 유형의 마스크리스(maskless) DNA 합성 장치의 대량 동시 DNA 제작능을 이용하여 범용 DNA 합성 과정을 개발하기 위한 노력으로부터 시작되었다. 마스크리스 어레어 합성기는 컴퓨터 제어 하에 단시간 내에 다수의 단일 가닥 DNA 프로브를 동시에 제조할 수 있도록 한다. 이 기법에 의하면 수 시간 내에 맞춤형 DNA 마이크로어레이의 제작이 가능하며, 여기서 어레이 내의 단일 가닥 DNA 프로브는 임의의 DNA 서열이 될 수 있다. 마이크로어레이는, 소정의 특징부(feature)에서의 모든 프로브가 동일한 DNA 서열(이것은 임의의 다른 특징부에서의 프로브의 서열과 다를 수 있다)로 존재하는 특징부로 배열된다. 이 기법에 의하면 단일 마이크로어레이에서 수만 내지 수십만의 상이한 특징부(각 특징부는 길이가 20∼150 뉴클레오티드인 DNA 프로브로 구성됨)를 대략 수 시간 내에 합성할 수 있다. 여기서, 마이크로어레이 합성 장치는 단일 가닥 DNA 단편의 대량 동시 생성기로서 사용되며, 본원에 개시된 방법은 합성 과정에서 오류를 제거함과 동시에 그러한 단편을 긴 DNA 단편으로 조립하는 것에 관한 것이다.
상기한 PCT 출원 공개 공보 WO 02/095073에 기개된 기법은 이미, 길이가 매우 긴 소정의 DNA 서열을 제조하기 위해 사용될 수 있는 마스크리스 어레이 합성기의 대량 동시 DNA 합성 능력을 이용하는 것을 착상하였다. 본 발명은 그 중에서도 하기의 문제점을 해결하기 위한 방법에 관한 것이다. 마이크로어레이에서 DNA 프로브에 뉴클레오티드를 부가하는 데 있어서 모든 단계의 효율성 및 정확성을 99%라고 간주한다. 상기 효율성 수준은 부가되는 뉴클레오티드 100개당 1개의 뉴클레오티드가 잘못된 위치에 부가되거나 또는 잘못된 위치에 전혀 부가되지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 오류율은, DNA 단편이 모두 25량체이거나 또는 25개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 경우, 평균적으로 프로브 4개당 1개가 그 안에서 오류를 갖는다는 것을 의미한다. 실제 효율은 사실상 99%를 초과하도록 할 수 있지만 오류율이 0이 될 수는 없다. 프로브 중 몇 개는 오류를 가질 수 있다. 오류는 다음 중 하나일 수 있다: 뉴클레오티드를 부가하지 못하는 것, 즉 결실; 뉴클레오티드를 부정확한 위치에 부가하는 것, 즉 부가; 뉴클레오티드 서로 간의 완전한 오류 배치, 즉 치환; 또는 뉴클레오티드의 화학적 변형. 따라서 정제 과정은 오류의 유형과 관계없이 오류를 포함하는 프로브가 가능한 한 많이, 하이브리드화 과정 중에 제조된 집단 서열로부터 제거되도록 배열하여야 한다. 본원에 기재된 방법은 상기 사항을 충족시킨다. 본 발명의 방법은 DNA 합성을 위한 마이크로어레이 기법을 이용한다는 점에서 DNA 정제 및 분리의 상기한 특수한 문제점을 해결하도록 고안 및 의도되었지만, 이 방법은 궁극적으로 소정의 단일 DNA 분자의 카피를 얻고자 하는 임의의 다른 DNA 합성에도 유용할 것이다.
도 1을 참조하면, 마이크로어레이 기판으로부터 프로브가 분리된 후에 단일 단계로 표적 DNA의 조립이 수행되는 방법이 도시되어 있으며, 이 방법은 WO 02/095073의 명세서에 처음으로 착안되어 개시되었다. 이 구상은 도 1의 왼쪽 도해에 도시되어 있다. 이러한 기본적 방법을 이용하면 각 특징부에서의 프로브의 DNA 서열은 다른 두 특징부의 프로브의 DNA 서열과 부분적으로 중첩된다. 이때, 상기 방법에 대한 추가를 고려한다. 여기서, DNA의 모든 단편의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 마이크로어레이 상에 작제하는 것이 제시된다. 다시 말해서, 어레이 상에 존재하는 각 특징부에 대하여, 어레이 상의 어느 곳에나, 프로브가 정확한 상보 서열을 갖는 특징부가 존재한다. 이것은 DNA 합성 능력을 낭비시키는 것으로 생각되는데, 그 이유는 이로 인하여 단일 마이크로어레이로부터의 이론적 수율이 절반으로 감소되기 때문이다. 그러나, 이러한 DNA 합성 방법의 역량은 매우 크기 때문에 이러한 낭비는 유의적이지 않으며, 이 방법의 장점은 곧 명백해질 것이다.
상보 서열 프로브를 갖는 마이크로어레이가 제조되면, 기판으로부터 프로브를 분리시킨다. 그렇게 제조된 DNA 가닥의 용액을 가열한 후 그 용액을 서서히 냉각시키면 각 프로브는 정확한 상보체를 발견하여 하이브리드화할 기회를 갖게 된다. 이것은 도 1의 오른편에 도시되어 있다. 따라서 다수의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 생성되고, 각각은 그 길이가 마이크로어레이 상에 제작된 프로브의 길이와 동일하다. 이 지점에서 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 더 큰 DNA 분자로 자체 조립하지 않고, 대신에 단순히 짧은 이중 가닥 DNA 단편이 된다.
이러한 이중 가닥 올리고뉴클레오티드군은 하나의 단일 가닥 또는 다른 단일 가닥 상에 오류를 갖는 일부 이중 가닥 단편을 포함할 것이다. 또, 가장 일반적인 오류는 3 가지 종류, 즉 결실, 삽입 또는 치환일 것이다. 오류가 드물다고 가정하면, 내부에 오류를 포함하는 각 단일 가닥은 완전히 상보적인 서열을 갖지 않는 상보성 가닥에 하이브리드화할 가능성이 가장 높다. 임의의 각 프로브가 오류를 갖고 제작될 경우, 그 프로브에 대한 상보성 가닥이 정확하게 상보성 오류를 갖도록 제작될 가능성은 매우 낮다. 따라서, 형성된 이중 가닥 DNA 단편의 경우, 오류를 갖는 것은 부정합된 뉴클레오티드일 것이다. 서열의 부정합은, 결실, 부가 또는 치환 여부와 관련 없이, 이중 가닥 DNA 형태의 불규칙성을 유발한다. 간단히 요약하면, 이중 가닥 DNA 분자는 과잉의 부정합된 뉴클레오티드에 의해 유발되는 혹 또는 돌출부를 가질 것이다. 하기 실시예에 사용된 DNA 가닥의 일부를 예시하고자 하는 도 5를 참조하면, 비정합 뉴클레오티드가 DNA의 규칙적인 이중 나선으로부터 밀려나오기 때문에 단일 뉴클레오티드의 결실이 이중 가닥 DNA의 형태 불규칙성을 유발한다. 오류가 결실, 삽입 또는 치환인지 여부와 관련 없이 동일한 형태 불규칙성이 일어난다. 각 경우에, 2개의 DNA 가닥 내의 뉴클레오티드는 그렇게 되어야 하는 상태로 정렬되지 않는다. 제1 단계로서, 본 명세서에 제시된 절차는 완전히 정합되는 것에 대해 염기쌍 부정합을 갖는 이중 가닥 DNA 분자를 필터링하거나 분리해 내기 위한 것이다. 그러한 방식으로, 어느 한 가닥에 오류를 갖는 이중 가닥 DNA 단편을 올리고뉴클레오티드군으로부터 제거한다.
그 과정은 도 2에 개략적으로 예시되어 있다. 도 2의 상부에서, 10으로 표시된 단계에서는 단일 가닥 DNA 단편이 형성되어 그들이 형성된 기판으로부터 분리된다. 단일 가닥 DNA는 이중 가닥 이중 가닥으로 형성된다. 오류는 문자 X로 표시되어 있다. 오류가 있는 경우, 그 가닥은 상보적이지만 동일한 오류를 보유하지는 않는 가닥에 하이브리드화한다. 그 다음, 형성된 이중 가닥은 부적당한 나선 형상의 DNA에 선택적으로 결합하는 DNA 결합제에 노출된다. 그러한 제제의 바람직한 구체예는 세포내 DNA 보정 메카니즘과 관련된 박테리아 단백질인 MutS이다. MutS는 가닥 부정합에 의해 유발된 부적당한 혹 또는 루프를 갖는 DNA에 우선적으로 결합한다. 결합제가 부착된 DNA 이중 가닥을 DNA 이중 가닥의 전체 군 또는 집합체로부터 제거한다. 이것은, DNA 결합제에 대한 친화성 분리를 이용하여 DNA 이중 가닥의 전체 집합체를 분리함으로써 편리하게 실시된다. 도 2를 참조하면, 20으로 표시된 단계는 단일 가닥 프로브가 이중 가닥으로 어닐링되는 단계를 의미한다. 30으로 표시되는 단계는 MutS와 같은 결합제를 적용하고, 결합제가 결합하는 이중 가닥을 분리해 내는 단계를 의미한다. 단계(30)는 1회 수행으로는 완전한 효과를 나타낼 수 없으며, 원하는 정도로 오류 서열이 없도록 이중 가닥을 정제하기 위해서는 적절히 단계 (20) 및 (30)을 수회 반복 수행하는 것이 바람직할 수 있다.
이 시점에서 짧은 이중 가닥 DNA 단편을 목적하는 전체 표적 DNA로 조립하는 것이 필요하다. 이것은 여러 가지 방법으로 실시할 수 있다. 리가제 연쇄 반응(LCR) 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 정해진 서열을 완성한다는 구상이 도 2에 도시되어 있다. 적절한 방법은 이중 가닥을 가열하고, 변성시킨 다음, 짧은 이중 가닥을 형성하는 전 단계에서보다 용액을 더욱 빨리 냉각시키는 것이다. 단일 가닥 DNA는 하이브리드화하지만, 이들 전부가 짧은 상보성 프로브와 재하이브리드화하지는 않는다. 각 단일 가닥 DNA는, 정확한 상보체 외에, 하이브리드화할 수 있는 2개의 DNA 가닥을 갖는다는 것을 기억해야 한다. 다른 가닥은 제1 가닥의 상보체와 중첩되는 서열을 갖도록 작제된 본래의 DNA 프로브이다. 단일 가닥 중 일부는 1/2 상보체 가닥에 하이브리드화할 것이다. DNA 폴리머라제를 사용하여 만들어진 부분 이중 가닥/부분 단일 가닥 복합체를 채우고, 대형 표적 DNA 분자가 조립될 때까지 그 단계를 필요에 따라 수회 반복할 수 있다.
대형 DNA 이중 가닥 분자가 일단 조립되면, 대부분의 서열이 정확하다는 가정 하에 일치 필터링 기법을 이용하여 오류 서열을 제거할 수 있다. 길이가 더 긴 이중 가닥 DNA 분자의 집합체를 고려하면, 대부분은 서열이 정확하고 양 가닥에서 정합된다. 최악의 경우를 고려하여, 역시 결실, 삽입 또는 치환일 수 있는 오류가, 상보체에 하이브리드화하지 않는 단일 가닥의 일부 상에 일어난 다음 DNA 폴리머라제를 사용하여 단일 가닥을 연장시켰다고 가정하였다. DNA 폴리머라제는 주형을 기준으로 단일 가닥 상에 정합 뉴클레오티드를 채우고, 따라서 오류에 대한 상보체도 채울 것이다. 분자의 두 가닥이 상보적이기 때문에, 이 지점에서 이중 가닥 DNA는 부적당한 DNA 나선 형태를 나타내지 않을 것이다. 이들 오류를 필터링하기 위해서, 더 긴 DNA 가닥 모두를 취하고, 다시 가열하고, 변성시킨 다음, 다시 급냉하는 과정을 실시한다. 오류를 포함하는 가닥이 동일한 오류를 갖는 상보성 가닥에 다시 하이브리드화할 가능성은 매우 낮다. 대신에, 오류를 포함하는 가닥은 오류를 갖지 않는 정확한 상보 가닥과 짝을 이룰 가능성이 휠씬 높으며, 따라서 오류 지점에서 형성된 이중 가닥에 구조 불규칙성이 도입된다. 동일한 현상이 상보성 가닥에서 일어난다. 그 후 다시 MutS와 같은 결합제에 이중 가닥을 노출시키고 집합체로부터 MutS가 결합하는 이중 가닥 분자를 제거할 수 있다. 또, 통계적 측면에서 목적하는 수준의 순도가 실현될 때까지 이 단계를 반복적으로 실시할 수 있다.
도 3은 DNA 가닥 집합체를 "필터링"하여 MutS와 같은 DNA 결합제를 사용하여 오류를 제거하는 일반적 구상이 예시되어 있다. DNA 가닥에 결합하기 위해 이용 가능한 결합된 MutS를 이용하여 친화성 컬럼을 제조한다. DNA 이중 가닥의 집합체를 친화성 컬럼에 노출시키면, 나선 구조에 불규칙성을 갖는 가닥이 컬럼에 결합할 것이다. 서열이 정확한 DNA 이중 가닥은 불규칙성이 없으며, MutS에 결합하지 않아서, 결합됨이 없이 컬럼을 통과할 것이다. 부적당하게 형성된 DNA 이중 가닥에 대한 DNA 결합제의 결합에 의해 형성된 복합체를 선별해 내는 다른 방법들이 있다. 예를 들어, 결합제가 부착된 이중 가닥 DNA는 결합제가 부착되지 않은 DNA보다 느리게 겔 또는 점성 유체를 통과한다. 이로 인해 집합체 내의 나머지 DNA로부터 결합제가 부착된 DNA를 분리해 내는 데 전기영동 또는 액체 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
이 방법에 사용하기 위한 DNA 결합제의 주요 요건은 두 가닥 사이에 서열 부정합이 있는 이중 가닥 DNA에 우선적으로 결합해야 한다는 것이다. 바람직한 제제는 박테리아 단백질인 MutS이다. 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 MutS는 미국 위스콘신주 메디슨의 Epicenter Corporation에서 카탈로그 번호 SP72100 및 SP72250으로 시판된다. 이 단백질에 대한 유전자 서열은 역시 공지되어 있으며, 문헌[Jour. Biol. Chem. 271:5040-5048 (1996)]에 공개되어 있고, GenBank 수탁번호 U33117로 이용 가능하다. 따라서, 당업자는 또한 종래의 유전자 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킨 박테리아를 배양하여 이 단백질을 쉽게 생성할 수 있다. 이 과정에서 DNA 결합제로서 사용될 수 있는 또 다른 분자는 삽입, 결실 및 염기 치환 부정합에 대한 특이성이 높은 셀러리로부터 유래한 CEL1 엔도뉴클레아제이며, 5개 뉴클레오티드가 서로 이격되어 있는 2개의 다형태를 검출할 수 있다. G-G 부정합에 결합하는 합성 리간드인 이량체 나프티리딘 1과 같은 특이적 뉴클레오티드 부정합에 결합하는 작은 유기 분자를 디자인 및 합성할 수 있다. 조합시 모든 가능한 부정합을 인식하는 그러한 리간드의 칵테일은 MutS를 대체할 수 있다. 정합 및 부정합 이중 가닥을 구별할 수 있는 다른 단백질 제제를 사용할 수도 있다. 예를 들어, T7 엔도뉴클레아제 I은 부정합 위치에서 DNA 가닥을 특이적으로 절단하며, 이 효소를 부정합 서열의 촉매 파괴제로서 사용하거나 또는 이 과정에서 부정합 결합제로서 사용하기 위한 효소의 절단 기능을 불활성화시킬 수 있다. T4 엔도뉴클레아제 VII은 이중 가닥 부정합 지점에서 DNA에 특이적으로 결합하여 절단하고, 뉴클레아제 활성은 결여되어 있지만 돌연변이 이중 가닥 DNA 분자에 결합하는 능력을 갖는 이 효소의 돌연변이 형태가 이미 조작되어 있다[Golz and Kemper, Nucleic Acids Research, 27:e7 (1999)]. SP 뉴클레아제는 구아닌 잔기를 함유하는 것 외에는 모든 부정합을 절제하는 시금치 유래의 고도의 활성 뉴클레아제로서, 이 효소는 절단 활성을 제거하도록 조작되거나 바로 사용될 수 있다. 이들 결합제 중 2 이상의 결합제를 조합하여, 하나의 제제가 모든 가능한 부정합에 결합하지 않는 경우 모든 종류의 서열 오류에 작용하도록 하거나, 또는 필터링에 엄격성을 추가로 제공할 수 있다.
본 발명은 예시한 바와 같은 특정 구체예들에 한정되는 것은 아니며, 하기 청구범위 내에 속하는 그러한 모든 변형된 형태를 포함한다.
1. 이중 가닥 DNA 서열의 합성에 대한 일반적인 프로토콜(예언적 프로토콜)
보호된 디아민 링커와 광불안정성 뉴클레오티드 숙시네이트의 합성은, 참고 인용한 WO 02/095073호에 개시되어 있으므로, 본 명세서에서 추가로 논의하지는 않는다.
슬라이드의 제조 및 올리고뉴클레오티드 합성(염기 불안정성 링커)
Singh-Gasson 등의 문헌[Nature Biotechnology 17, 974-978(1999)]에 개시된 바와 같이 현미경 슬라이드를 제작하여, 말단에 유리 알콜을 보유하는 링커로 유도화된 유리 표면을 얻는다. 이 슬라이드를 무수 디클로로메탄 중의 카르보닐디이미다졸 0.6 M 용액 중에 침지하고(6 시간), 무수 디클로로메탄으로 세척한 다음, MeNPOC-보호된 디아민(0.4 M) 용액 중에 12 시간 침지한다. 계속해서, 디클로로메탄으로 슬라이드를 세척하여, 광불안정성 보호기 MeNPOC로 캡핑된 2차 아민을 갖는 표면을 얻는다. 합성의 처음 4회 사이클에서, 마스크리스 어레이 합성기는 보호된 뉴클레오티드-3'-숙시네이트 각각을 DMF 중 커플링 시약인 O-벤조트리아졸-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄-헥사플루오로-포스페이트(HBUT)로 부착시키기 위해 적절한 어레이 부재 중에서 2차 아민을 광-탈보호시킨다. 이어서 미반응 유리 아민을 피리딘 중 아세트산 무수물로 캡핑한다. 3'-뉴클레오티드가 표면에 부착되면, 후속 탈보호 및 연장 사이클을 Singh-Gasson 등의 문헌[Nature Biotechnology, 17, 974-978(1999)]과 PCT 특허 출원 공개 공보 W0 99/42813호에 개시된 바와 같이 실시한다.
유전자 합성
본 실시예에서, 마스크리스 어레이 합성기를 사용하여 유리 슬라이드 상에서 올리고뉴클레오티드 단편의 합성을 실시한다. 슬라이드로부터 올리고뉴클레오티드 단편이 분리된 후에, 자체 조립과 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR) 또는 양자에 의해 상기 단편들이 정해진 서열의 긴 이중 가닥 DNA로 조립될 것이다.
본 실시예를 위해서, 임의의, 그러나 정해진 서열의 420개 염기쌍 길이의 이중 가닥 DNA 단편의 합성을 고려한다. 표적 서열을 20개의 중첩되는 40량체 올리고뉴클레오티드로 나눈다. 20개 올리고뉴클레오티드 또는 단편 중에서, 표적 서열의 각 가닥에 대해 10개를 지정하고, 각 가닥에 대해 20개 염기의 3'-돌출부에 의해서 전체 길이 서열로 자체 조립할 수 있도록 단편을 디자인한다. 소프트웨어를 이용하여 표적 서열로부터 가상의 올리고뉴클레오티드를 선택하고, 20개 올리고뉴클레오티드 단편의 합성에 대해 칩 상의 이용 가능한 어레이 부재를 균등하게 나눈다. 상기한 바와 같이 합성이 완료된 후에, 슬라이드를 최소량의 진한 수산화암모늄과 함께 항온처리하고, 4 시간 동안 55℃로 가열하여 슬라이드의 표면으로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하고 염기로부터 모든 보호기를 제거한다. 이 용액을 Speedvac에서 농축 건조하고, 50 ㎕의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 완충제(프로메가) 중에 재용해시키고, 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록실을 37℃에서 2 시간 동안 T4-폴리뉴클레오티드 키나제(프로메가) 20 U로 인산화한다. 인산화된 올리고뉴클레오티드의 생성 혼합물을 8% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 크기별로 분리한다. 전체 길이 40량체 올리고뉴클레오티드에 해당하는 밴드를 겔로부터 잘라내어, 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 냉동/해동과 용출에 의해 겔로부터 정제한다(이들 각 절차에 대한 상세한 프로토콜은 문헌[Short Protocols in Molecular Biology 4th edition F. M. Ausubel et. al. Eds. 1999]을 참조할 수 있다). 8 U의 Pfu DNA 리가제(스트라타젠)를 함유하는 LCR 완충액(스트라타젠) 중에 정제된 올리고뉴클레오티드를 용해한다. 이러한 과정의 결과는 열적 사이클링(94℃ - 1분; 55℃, 90초, 70℃, 90초, 95℃, 30초로 40 사이클; 55℃, 2분, 72℃, 2분)에 의해 개별 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 서로 결찰하여 전체 길이 DNA 서열을 생성하는 것이다. 그 후, 본 실시예에서 3'-돌출부에 상보성인 2개의 20량체 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 LCR 반응으로부터 표준 프로토콜을 이용하여 PCR로 전체 길이 올리고뉴클레오티드를 증폭시킨다.
상기에 상세히 설명된 유전자 합성 프로토콜은 본 발명을 실시하기 위한 예로서 제공된다. 올리고뉴클레오티드를 더 긴 이중 가닥 DNA 서열로 어닐링하고 증폭시키기 위해서 LCR, PCR 또는 양자를 이용하여 이 프로토콜에 대한 여러가지한 변형이 가능하다(Kneidinger et al., BioTechniques, 30, 248-249 (2001); Withers-Martinez et al., Protein Eng. 12, 1113-1120 (1999); Casimiro et al., Structure (London), 5, 1407-1412(1997); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 1995, 4, 299-302 (1995); Prodromou et al., Protein Eng. 5, 827-829 (1992); Engels, Angew. Chem., 101, 733-52 (1989)). 당업자들은 이러한 프로토콜의 세부 사항을 변경하여 링커 화학, 올리고뉴클레오티드의 길이, 각 올리고뉴클레오티드에서의 코돈 사용 방식과 이에 따른 서열의 하이브리드화 특성, 각 단편의 작제에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 수, LCR 및/또는 PCR 조립 반응의 조건 등을 변경하는 것 등의 명백한 각종 방법으로 공정의 효율을 최적화할 수 있다. DNA 단편은 모두 동일한 길이일 필요는 없지만, 특정 화학법으로 소정의 장치를 사용하여 생성할 수 있는 단편의 품질 한계 내에서 임의의 목적하는 길이일 수 있다.
2. (수행된) 동시 필터링의 용도
일반 프로토콜
본 발명의 한 구체예에서, 20∼200개의 염기로 이루어진 DNA 올리고뉴클레오티드를 임의의 방법으로 합성한다. 소정의 서열이 생성되는 경우, 그의 안티센스 상보성 가닥도 생성된다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 먼저 95℃로 가열하여 변성시키고, 이어서 서서히 냉각한 다음 어닐링한다. 이어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 염기 부정합 또는 결실를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 결합하거나 상기 올리고뉴클레오티드를 절단하는 단백질 또는 단백질들(예를 들어, 박테리아 MutS)과 함께 항온처리하였다. 상기 단백질은 오류를 포함한 올리고뉴클레오티드를 보유 또는 변경하는 반면, 오류 비포함 올리고뉴클레오티드는 후속 사용에 자유롭다. 이어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 효소로 추가 처리하여 남아있는 임의의 오류 또는 단일 가닥을 제거할 수 있다. 전술한 바와 같이, 부정합은 기타 방법으로 그 위치를 확인하고 제거할 수 있다.
올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드 서열은 플라스미드 pGFPuv(GenBank 수탁 번호 U62636) 내에 함유된 녹색 형광 단백질 UV 유전자로부터 유래된 것이었다. 이 서열은 GFP의 향후 생물학적 분석에서 리포터 유전자로서의 유용성 때문에 선택하였다. 비돌연변이 또는 야생형(wt) 안티센스 가닥의 5' 말단을 형광 염료 Cy5로 표지하였다. 20번 위치에서 C에서 A로의 치환 또는 결실을 함유하는 돌연변이 안티센스 가닥의 5' 말단을 플루오레세인으로 표지하였다. 올리고뉴클레오티드는 미국 캘리포니아 알라메다에 소재하는 오페론 인코포레이티드로부터 구입하였다.
GFPuv 351-390 MP 81.7℃
센스 GTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAG
안티센스 CTTCACCCTCTCCACTGACAGAAAATTTGTGCCCATTAAC
안티-del 20 CTTCACCCTCTCCACTGACGAAAATTTGTGCCCATTAAC
안티 C>A CTTCACCCTCTCCACTGAAAGAAAATTTGTGCCCATTAAC
어닐링
전형적인 반응에서는, 비표지 센스 가닥 80 pmol을 1X Muts 완충액(10 mM 트리스-HCl pH 8.8, 5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100) 중 Cy5 표지된 안티센스 가닥 40 pmol 및 플루오레세인 표지된 돌연변이 가닥(del 20 또는 C>A)과 혼합하였다. 상기 혼합물은 95℃에서 5분 동안 1차 변성한 후 열사이클러에서 어닐링하였다. 이어서, 상기 혼합물을 온도가 25℃에 이를 때까지 0.2℃/sec로 냉각하였다. 이렇게 형성된 이중 가닥 DNA는 도 5에 나타냈다.
결합 반응
MutSt 단백질(미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 에피센터 테크놀로지스) 2 ㎍ 또는 6 ㎍을 상기 어닐링된 올리고뉴클레오티드에 첨가하였다. 이어서, 상기 혼합물을 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다.
로딩 염료(프로메가 6X)를 반응물에 첨가하였다. 5 mM MgCl2가 되도록 조정한 6% TBE-PAGE 겔 상에 반응물 전체를 로딩하였다. (전개 완충액 1X TBE는 5 mM MgCl2가 되도록 조정하였다). 전기영동은 120 볼트에서 3 시간 동안 수행하였다. 분석은 청색(플루오레세인) 레이저 및 적색(Cy5) 레이저를 이용하여 몰리큘러 다이나믹스 STORM 860 상에서 수행하였다. 결과는 몰리큘러 다이나믹스 이미지퀀트 소프트웨어를 사용하여 정량하였다.
결과
야생형(wt) 센스 가닥은 Cy5 표지된 wt 안티센스 가닥과 20번 위치에서 결실을 포함하는 플루오레세인 표지된 안티센스 가닥의 50/50 혼합물로 어닐링하였다. MutS 단백질은 이동된 DNA 단백질 복합체를 형성한다. MutS 단백질은 20번 위치에서 결실을 포함하는 플루오레세인 표지된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드(del 20)에 우선적으로 결합한다. 이 결과는 최종 겔 상의 플루오레세인 채널에서의 훨씬 더 진한 MutS/DNA 복합체 밴드로 확인되었다. 상기 레인에 프로테아제 K를 첨가하여 MutS 단백질을 분해하였으며, 이 분해는 이동된 밴드를 제거하였는데, 이는 이동이 단백질 결합에 기인하는 것임을 입증하는 것이다.
MutS에 의한 DNA 결합이 오류 포함 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에 특이적인가를 입증하기 위해, 본 발명자들은 MutS 단백질로부터 분리된 DNA와 10배 몰 과량의 비표지된 이중 가닥 야생형 올리고뉴클레오티드(wt) 또는 20번 위치에서 결실을 포함하는 비표지 이중 가닥 올리고뉴클레오티드(del 20)의 경쟁을 시도하였다. 그 결과, 10배 과량은 MutS의 부재(MutS 없음) 하에서 어떠한 유형의 밴드 이동도 유발하지 않았으며, MutS 단백질 6 ㎍과 함께하는 경우, 10배 과량의 wt 올리고뉴클레오티드는 DNA/MutS 복합체와 경쟁하지 않았다. 동시에, 10배 과량의 del 20 올리고뉴클레오티드는 DNA/MutS 복합체와 경쟁하였다. 이는 MutS 결합이 오류가 있는 올리고뉴클레오티드에 특이적임을 의미하는 것이다.
올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 생성하는 경우, 가장 흔한 오류는 차단기 제거 장애 또는 염기 커플링 장애에 기인하는 결실이다. 이 실험으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, MutS 단백질은, 중앙부에 A 대 G 부정합을 가진 올리고뉴클레오티드보다 더 효율적으로 결실 돌연변이를 가진 올리고뉴클레오티드(del 20)에 결합하며, 이는 겔 상에서 전개된 del 20 레인에서 이동된 밴드가 더 진한 것으로 확인할 수 있다. 이 실험에서, DNA 복합체는 Cy5 및 플루오레세인 레인 둘 다에서 나타났는데, 그 이유는 센스 가닥도 Cy5 표지되었기 때문이다.
결론
이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 생성으로 본 발명자들은 부정합 특이적 단백질, 예를 들어 MutS를 이용하여 오류를 검출 및 제거할 수 있다. MutS의 결합은 오류 포함 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에 대해 특이적이다. 오류 포함 올리고뉴클레오티드는 매우 과량의 오류 비포함 올리고뉴클레오티드에서도 검출할 수 있다. 가장 흔한 유형의 오류(결실)가 우선적으로 검출된다.
정확한 서열의 집합체로부터 돌연변이 올리고뉴클레오티드 이중 가닥을 제거할 수 있는 MutS의 능력을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 녹색 형광 단백질 천연 서열로부터 재차 선택하였다(이 경우 647∼717로 넘버링한 GFPuv 염기, 68량체). 또한, 돌연변이 유형의 68량체는 염기 33, 즉 T가 결실된 상태로 생성되었다. 최초 시도에서, 정확한 서열의 센스 및 안티센스 각각 2.5 nmole을 함유하는 22.2 ㎕를 1 x Taq 완충액 및 1.5 mM MgCl2와 함께 반응물 중에 첨가하였다. 이 반응물을 95℃에서 5분 동안 가열하여 변성한 후, 온도가 25℃에 이를 때까지 0.1℃/sec로 온도를 감소시킴으로써 어닐링하였다. 야생형 및 조합된 돌연변이 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유사한 반응을 수행하였으며, 상기 돌연변이 올리고뉴클레오티드는 총 0.25 nmole의 안티센스 DNA로 0.25 nmole로 스파이킹되었다. 2개의 반응 혼합물을 각각 1/2씩 나누고, MutS의 존재 또는 부재 하에 항온처리하였다. 이 반응은 전체 반응물 부피 30 ㎕에 대해 1.25 nmole DNA 이중 가닥, 75 mM MgCl2 2 ㎕, 물 13.9 ㎕ 및 (a) MutS 단백질(2 ㎍/㎕ 또는 0.067 nmole) 3 ㎕ 또는 (b) 물 3 ㎍을 포함하는 이중 가닥 DNA 용액 11.1 ㎕를 사용하였다. 상기 용액은 30분 동안 37℃로 가열하였다. 이어서, 5 mM MgCl2가 되도록 조정한 2.5% 아가로스 겔에 용액 전체를 로딩하고, 완충액(5 mM MgCl2를 함유한 1 x TBE)을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 겔은 EtBr로 염색하였다. 겔 상의 밴드들을 분석하여 이동 및 비이동 여부를 확인하였다. 비이동 밴드들은 겔로부터 잘라내고, DNA는 퀴아젠 겔 정제 키트를 이용하여 겔 정제하였다. 회수된 DNA 중 일부를 Topo-TA 플라스미드 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 HB101 세포로 형질전환하고, 평판 배양하였다. 콜로니로부터 미니프렙을 제조하고, DNA를 회수하고, 회수된 DNA의 서열을 결정하였다. 서열결정 분석의 결과는, MutS가 포함되지 않은 반응의 경우 클론의 30%가 야생형 또는 정확한 서열인 반면, MutS가 포함된 반응에서는, 클론의 58%가 야생형 또는 정확한 서열이었다. 이는 군집 내 정확한 야생형 클론 수의 93% 증가를 의미하는 것이다. 투입 DNA의 단지 10%만이 의도적으로 돌연변이되는 경우, 돌연변이 클론의 비율이 그렇게 높은 이유는 구입한 그 상태의 올리고뉴클레오티드의 순도가 부족하기 때문일 수 있다. 그러나, 정제 효과는 데이타에서 여전히 명백하게 확인할 수 있다.
오류를 포함하는 서열의 조립체
본 실험은 기능 분석을 수행하고, 녹색 형광 단백질의 발현을 관찰하여 오류 필터링을 분석하고 더 작은 프로브를 오류 서열이 존재하는 더 큰 DNA 조립체로 조립하기 위해 수행하였다. 그 구상은 PCR 프로세스가 남아있는 돌연변이 이중 가닥에 대하여 선택하는가 여부를 확인하는 것이었다.
본 실험에서 사용한 DNA는 GFPuv 서열의 445∼585번 염기에 걸쳐 있는 인산화된 올리고뉴클레오티드였다. 윗쪽 가닥 및 (상보적인) 아랫쪽 가닥들은 3개의 40량체 및 1개의 20량체로부터 제조하였다. 조립된 단편 내에 효소 NcoI 및 BsrGI에 대한 특유의 제한 부위가 존재한다. 사용된 프로토콜은 총 부피가 40 ㎕가 되도록, 10 x Pfu DNA 리가제 완충액 4 ㎕, Pfu DNA 리가제 2 ㎕(4 μ/㎕) 및 물 19 ㎕를 포함하는 반응물 중 15 ㎕의 각각의 프라이머 0.47 nmole을 조립하는 것이었다. 리가제 연쇄 반응은 95℃에서 1분의 온도 프로필로 수행하였으며, 이어서 55℃에서 90초, 70℃에서 90초 및 95℃에서 30초의 40 사이클, 이어서 55℃에서 2분 및 70℃에서 2분 동안 수행하였다.
본 실험을 수행하기 위해, 반응 혼합물을 총 부피 20 ㎕로 1/2씩 나누고, 각각에 75 mM MgCl2 5 ㎕, 10 x 리가제 완충액 5 ㎕, MutS 단백질(2 ㎍/㎕) 22.5 ㎕ 또는 물 22.5 ㎕, 및 물 22.5 ㎕를 첨가하여 총 부피를 75 ㎕로 하였다. 이렇게 조립된 반응물 각각은 0.0235 nmole의 조립된 DNA 이중 가닥 및 MutS 단백질 45 ㎍을 보유하였으며, 상기 MutS 단백질은 DNA 부정합을 인식하고 결합하는 이량체로서 작용한다. 상기 반응물은 50℃에서 30분 동안 두었다. 이어서, 5 mM MgCl2가 되도록 조정한 2.5% 아가로스 겔 상에 전체 부피를 로딩하고, 전개 완충액으로 1 x TBE + 5 mM MgCl2를 이용하여 전기영동하였다. 전기영동 후, 겔을 EtBr로 염색하고, 비이동 밴드는 겔로부터 잘라냈다. 퀴아젠 겔 정제 키트를 이용하여 DNA를 정제하였다. 이어서, DNA를 가장 바깥쪽 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 이 DNA를 NocI 및 BsrGI로 분해하고, 겔 정제하였다. 이 DNA를 pGVPuv-NcoI-BsrGI로 결찰하고, HB101 세포로 형질전환시켰다. 이 과정은 도 4에 도시하였다.
본 실시예의 결과는 MutS 함유 복사체 및 MutS 비함유 복사체 둘 다로부터 유래한 750개의 콜로니를 스캐닝한 후, 콜로니의 95% 이상이 UV 조명 하에서 발광한다는 것이다. GFT를 함유하지 않는 플라스미드를 갖는 대조군은 발광하지 않았으며, 원형의 pGFPuv 카세트를 갖는 양성 대조군은 모두 발광하였다. 삽입체를 보유하지 않는 pGVPuv-NcoI-BsrGI 플라스미드를 이용한 다른 음성 대조군도 발광하지 않았다. 이 결과는, (1) 다중 결실 또는 삽입이 프레임쉬프트의 생성을 무효화하거나 또는 (2) PCR이 돌연변이를 갖는 이중 가닥의 증폭에 대해 편향되지 않는다면, 다소 놀라운 것이다. 클론 내에 존재하는 가능한 침묵 돌연변이의 수를 결정하고 정량하기 위해, 부분 집단을 성장시키고 그들의 DNA를 추출하고 서열결정하였다. 서열결정 반응을 통해 MutS 음성 집합체로부터 유래한 콜로니 중 81%가 야생형 서열을 보유하는 반면, 19%는 돌연변이 서열을 보유하였으며, 모든 돌연변이는 치환임이 확인되었다. MutS 함유 반응물로부터 유래한 콜로니 중 테스트된 전부는 야생형 또는 정확한 서열을 나타내었다. 이 서열은 각 콜로니의 이중 서열결정을 통해 확인하였다.
이 결과는 LCR 반응에서 생성된 DNA 이중 가닥 집합체로부터 소수의 오류 서열을 분리해 내는 데 DNA 결합제를 성공적으로 이용할 수 있음을 입증하는 것이다. GFP 기능 분석은 진단용 분석은 아니지만, MutS에 의한 DNA의 결합은 소정 서열에 대해 DNA 집합체를 정제함에 있어서 유용한 도구였다.

Claims (14)

  1. (a) 단일 가닥 DNA 프로브의 마이크로어레이를 제조하는 단계로서, 상기 프로브는 각 프로브가 마이크로어레이 상의 다른 프로브에 대해 부분적으로 상보성인 상보성 부분을 갖도록 작제되고, 또 각 프로브 세트에 대해 완전 상보성 프로브 세트가 구성되도록 작제되는 것인 단계;
    (b) 상기 마이크로어레이로부터 단일 가닥 DNA 프로브를 분리시키는 단계;
    (c) 서열에 오류를 갖는 프로브와 형성된 이중 가닥은 이중 가닥 DNA에 구조적 불규칙성을 갖고, 완전 상보성 프로브에 하이브리드화된 프로브로 주로 이루어진 DNA 이중 가닥이 형성되도록 단일 가닥 프로브를 냉각시키는 단계;
    (d) 구조적 형태에 불규칙성을 갖는 이중 가닥 DNA 분자에 선택적으로 결합하는 DNA 결합제에 상기 DNA 이중 가닥을 노출시키는 단계; 및
    (e) 상기 DNA 결합제가 결합된 DNA 분자를 DNA 결합제가 결합되지 않은 DNA 분자로부터 분리하는 단계
    를 포함하는, 부정확한 서열의 DNA 분자로부터 정확한 서열의 DNA 분자를 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (e) 분리하는 단계는 고정된 위치의 DNA 결합제에 대한 친화성 결합에 의해 수행하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (e) 분리하는 단계는 전기영동에 의해 수행하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 상기 DNA 결합제가 MutS인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 상기 단계 (d) 및 단계 (e)는 정확한 서열의 순도가 목적 수준에 도달할 때까지 반복 수행하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서,
    (f) 상기 DNA 이중 가닥을 변성시켜 DNA 이중 가닥으로부터 단일 가닥 DNA 프로브를 분리시키는 단계;
    (g) 상기 단일 가닥 DNA 프로브의 적어도 일부가 부분적으로만 상보성인 프로브에 결합하는 것을 촉진하는 조건 하에 DNA 이중 가닥을 냉각시켜서, 적어도 일부분 이중 가닥으로 이루어진 DNA 복합체를 형성하는 단계; 및
    (h) 상기 DNA 복합체의 남아 있는 단일 가닥 부분에 제2 DNA 가닥을 부가하기 위하여 상기 DNA 복합체를 연장시키는 단계
    를 더 포함하는, 부정확한 서열의 DNA 분자로부터 정확한 서열의 DNA 분자를 분리하는 방법.
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