JPH08500248A - 骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための生物活性物質テンプレート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組織培養培地に曝して細胞を接種したときに骨組織の in vitro 形成を可能にする新規な非晶質の多孔質生物活性ガラス及びセラミック物質が開示されている。本発明は、このガラスを組織培養培地に曝してから細胞を接種したときに骨組織生育が in vitro で起こるようなｐＨにコントロールするために、生物活性ガラス物質を処理する方法も開示する。開示するガラス物質は、好ましくはＳｉＯ₂、ＣａＯ、Ｎａ₂Ｏ及びＰ₂Ｏ₅から形成され、多孔質非晶質構造体は、最も好ましくは、その構成成分を溶融し、冷却し、そして生成するガラスを粉砕し、次いでその粉末を発泡させて熱圧プレスすることによって作られる。本発明のガラスを成形して、種々の適用症に役立つテンプレート並びにペーストにできる顆粒を製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 骨組織の in vitro 合成のための生物活性物質テンプレート 本発明は、骨及び骨様組織の最適な in vitro 形成のための生物活性セラミッ クテンプレートの合成に関する。物質表面が骨細胞から in vitro 応答を引き出 す基本的メカニズムが最適化され、それによって骨組織の典型的特徴を有する細 胞外物質の高い生成速度がもたらされる。 発明の背景 物質は、まず、骨の治癒の間の構造的支持体を供給するために、又は損傷した 又は病んだ骨組織を交換するために用いられる。歴史的に、最も重要な物質選択 の規準は、反応性がないことであった。移植物質は、体内での反応をほんの僅か 起こすに過ぎないものであるべきであると考えられた。とはいえ、どんなに化学 的に不活性であっても、移植に際して常にある反応が起こることを認識するのは 大切なことである。反応の強さは、移植物質の表面及び内部特性だけでなく、手 術の際の外傷、移植部位、及び組織−移植片境界面の相対的な動きにも依存する 。この知見は、いわゆる不活性物質の代わりに“生物活性”物質を用いることを 推し進めてきた。生物活性物質は、有益な組織応答を誘発しなければならはい、 具体的には、その表面で正常組織の形成を引き起こして長い機能的寿命を促進す る境界面を作り出さなければならない。石灰化組織再構築の分野でこの目標は達 成されたが、この前進は最終段階のものではなく、より切望される目標、つまり in vitro骨組織形成のためのテンプレートとして役立ち得る物質の創作のための 踏み石に過ぎない。これは、生体物質の真の将来、つまり一旦体内に挿入すると 組織と置き換わるというよりもむしろ組織を再生する物質を創作することの一部 分である。 骨始原細胞又は骨芽細胞表現型の細胞での細胞培養研究が行われてきたが、納 得のゆく結果は得られていない。これら先行する研究の幾つかは、細胞外物質合 成の最適化自体を求めるものではなかった。幾つかの先行する研究は、骨髄抽出 物中に存在する骨始原細胞を用いた。焦点が骨芽細胞表現型発現の確認に置かれ ているか他に置かれているかに拘らず、これら結果を用いて、得られる骨芽細胞 表現型活性の現象の１つが外延的なものであったか否かを確認することができる 。 １５％ウシ胎児血清、調製直後のアスコルビン酸、β−グリセロリン酸ナトリ ウム、デキサメタソン（ＤＥＸ）及び抗生物質を補充したαＭＥＭ（最小必須培 地）で若い成体雄ウィスターラットの大腿骨を洗浄することにより、それから骨 髄細胞が得られることは公知である。ダビース（Davies）ら“Earlyextracellul ar matrix synthesis by bone cells，“Bone-BimterialsWorkshop”，J.E.Davi es Ed.，University of Toronto Press, (December 1990)を参照のこと。 ２本の大腿骨からの細胞を含有するこの細胞懸濁液のある量、例えば、３０ｍ ｌをこの材料支持体上に分配する。加湿９５％空気−５％ＣＯ₂雰囲気内で、こ の培養物を最低２週間維持する。硫黄をも含有する球状付着物の石灰化基質が形 成されることが分かった。この層は、骨組織内の反転線(reversal line)につい ての典型、つまりセメント質層であったので、その著者達により、その石灰化層 はその培養細胞による骨芽細胞表現型の発現の結果であることの証拠と考えられ た。続いて、いわゆる“フランク（frank）骨形成”があった。従って、基質生 成は、骨誘導細胞を in vitro で分化させることによって中間期間（１７日間） 内に始まることができる。しかしながら、多孔質セラミック上では石灰化組織が 形成しないということも報告された。ウチダら，“Growth of bone marrowcells on porous ceramics in vitro,”J. Biomed.Mat.Res.21:1-10(1987)を参照のこ と。セメント様線を堆積する細胞の内在能力に関する先行技術におけるこの知見 は、ともあれ確かに正しい。この特定の細胞活性が如何なる組織刺激性生体物質 もなく培養物中に存在することを示した上記の細胞培養法は、マニアトプロス（ Maniatopulos）らの“Bone formation in viLro by stromal cellsobtained fro m bone marrow of young adult rats，”Cell Tissue Res.254:317-330(1988)か ら派生したものである。 多孔質リン酸カルシウムセラミックの骨膜線維芽細胞、骨芽細胞、及び軟骨細 胞の生育及びホルモン応答への効果が、他の研究者によって開示されている。例 えば、チエン（Cheng）ら，“Growth of osteoblasts on porous calciumphosph ate ceramic: an in vitro model for biocompatibility study,”Biomaterials , 10,63-67(1989)を参照のこと。この文献に報告されているように、これら細胞 の数は、１０週間の間に２９、２３及び１７倍に増加した。骨芽細胞は、タイプ Ｉコラーゲンたけを産生することによってそれらの表現型発現を保持した。かつ て、チェンは、イヌ軟骨細胞の表現型発現は、多孔質ヒドロキシアパタイトセラ ミック顆粒上で培養すると、１３ヶ月まで保持されることを示した。チエン，“ In vitro cartilage formation on porous hydroxyapatiteceramic granules,” In Vitro Cellular & Developmental Biology, 21:6,353-357( 1985)を参照の こと。報告によれば、細胞外基質の同化は１週間で現れ始めて１３週間にわたっ て増加し続けた。 また、他の研究者は、種々のリン酸カルシウムセラミックと接触するＶ７９細 胞の付着とその後の生育を研究して、細胞生育はヒドロキシアパタイトにより顕 著に阻害され、リン酸三カルシウム及びガラスセラミックにより僅かに阻害され ることを見出した。カツフミら．“The influence of calcium phosphatecerami cs and glass ceramic on cultured cells and their surrounding media,”J. Biomed.Mat.Res.,24:1049-1066(1989)を参照のこと。小さな生物活性セラミック 粉末の食菌作用の条件下で、骨芽細胞個体群のＲＮＡ転写及びタンパク質合成が 刺激された。グレゴイヤ（Gregoire）ら“The influence of calciumphosphate biomaterials on human bone cell activities: An in vitroapproach,”J.Biom ed.Mat.Res.24:165-177(1990)を参照のこと。この現象は、食菌作用性線維芽細 胞についても認められた。ＤＮＡ内への³Ｈ−チミジン取り込み量の増加及びア ルカリ性ホスファターゼ活性の低下は、おそらく第二カルシウムメッセンジャー 経路から生じたのであろうことが示唆された。オルリイ（Orly）ら“Effect of synthetic calcium phosphate on the ³H-thymidineincorporation and alkalin e phosphate activity of human fibroblasts inculture，”J. Biomed.Mat.Res .23:1433-1440(1989)を参照のこと。プレオ（Puleo）らによる他の研究“Osteob last responses to orthopaedic implantmaterials in vitro,”J.Biomed.Mat.R es.25:711=723(1991)は、骨芽細胞 付着、骨芽細胞増殖及びコラーゲン合成に関して説得力のない結果を提供してい る。物質依存的組織応答パターンに関連する情報を提供しているin vitroで行わ れたもう１組の研究は注目に値するものである。多孔質ヒドロキシアパタイト及 び骨髄細胞での一連の実験が、オグシ（Ohgushi）、ゴールドバーグ（Goldberg ）及びカプラン（Caplan）により開始され、その後、日本の奈良ではオグシとそ の仲間により、米国オハイオ州のクリーブランドではカプランとその仲間により 別々に続けられた。オグシら，“Heterotopic osteogenesis inporous ceramics induced by marrow cells,”J.Ortho.Res., 7:568-578(1989)を参照のこと。こ れら実験は、異所に移植した骨髄細胞懸濁液の細胞の骨始原細胞性は、その懸濁 液を多孔質ヒドロキシアパタイト中に注入したときの方が単独で移植したときよ りも、より容易に活性化されることを証明している。 最後に、カプランらの米国特許第４,６０９,５０１号は、軟骨生成応答を刺激 できる可溶性骨タンパク質に同系線維芽細胞を in vitro で曝すことを含む骨生 育の刺激を開示している。これら暴された細胞をフィブリンの如き生分解性キャ リヤーと混合するのであるが、これら暴された細胞を人工器官とインキュベート してもよいことも示唆されている。関連するカプランらの特許、つまり米国特許 第４,６０９,５５１号は、骨タンパク質を解剖部位に送達する技術を開示してお り、やはりカプランらへの米国特許第４,６０８,１９９号は、適する骨タンパク 質を得る方法を開示している。 本発明は、支持物質に焦点を合わせており、その支持体として用いられる物質 を修飾すると in vitro での組織形成の量と速度において大きな差異が生じるこ とを示すものである。従って、本発明の目的は、生命過程、具体的には骨組織形 成がその上で盛んになる理想的なテンプレートとして役立つセラミック物質を合 成することである。 発明の要旨 これら及びその他の目的は、有意に結晶化させることなしに多孔質ガラスを合 成し、そして細胞付着が増進され広範な細胞外基質（ＥＣＭ）形成が起こること ができるようにそのガラス表面をコンディショニングすることにより満たされる 。 一旦この多孔質ガラス上に接種すると、細胞を死滅させない境界内の溶液中のｐ Ｈ変動値をもたらすための生物活性反応のコントロール法も開示する。 一般に、本発明は、組織培養培地中に入れたときに骨細胞付着及び活性を高め るよう表面処理されている結果、細胞を接種したときに骨組織が in vitro で生 成する、生物活性物質を開示する。好ましくは、この生物活性物質は、ｐＨを最 も好ましくは７.６未満にコントロールするように処理されたガラスを含む。好 ましい態様においては、この生物活性物質は、本質的にＳｉＯ₂；ＣａＯ；Ｎａ₂ Ｏ：及びＰ₂Ｏ₅からなる非晶質ガラスであって次の好ましい組成を有する：４５ 重量％ＳｉＯ₂；２４.５重量％ＣａＯ：２４.５重量％Ｎａ₂Ｏ；及び６重量％Ｐ₂ Ｏ₅。また、他の好ましい態様においては、本発明の生物活性物質はセラミック を含む。しかしながら、ガラス型又はセラミック型のいずれでも、この物質は好 ましくは多孔質であり、その多孔度は約２０〜３０％であって気孔サイズの範囲 は約７５〜２００μｍである。 従って、本発明は、本質的にＳｉＯ₂、Ｎａ₂Ｏ、ＣａＯ及びＰ₂Ｏ₅からなる混 合物を溶融し、次いで溶融した混合物を冷却してガラスフリットを作る工程を含 む多孔質ガラス支持体を作る方法を開示する。好ましくは約４０〜７０μｍの粒 子サイズを有するガラス粉末をこのガラスフリットから作る。次いで、この粉末 から発泡プロセスによって多孔質ガラス支持体を作る。本発明の重要な側面は、 生成する多孔質ガラスが、実質的に非晶質性を示すことである。結晶質性は場合 によっては許容できるが、その主要な欠点は表面の不均一な腐蝕速度、引いては 反応層の空間的変動である。更に、その腐蝕反応がかなり遅く、それによって長 いコンディショニング及びインキュベーション時間が必要である。別に、この多 孔質ガラス支持体は、ガラス粉末とポリビニルアルコールの如きバインダーとの スラリーを作ってそのスラリーを型に流し込み、そのスラリーを乾燥及び焼結す ることによって作ることができる。最後に、この多孔質ガラス支持体は、最初に 、ガラスが形成されるように冷却することによって形成することができる。この ガラスを１を超える結晶相を有するガラスセラミックに転換してから優先的に溶 解させると多孔質物質になる。この優先的溶解は、例えば、酸又は塩基の如き溶 媒を添加することによって行うことができる。 従って、本発明は、多孔質の、好ましくは非晶質の生物活性ガラスを作ること を開示する。とはいえ、あらゆる既知の生物活性ガラス又はセラミックも適当に 転換して骨組織の in vitro 合成用テンプレートにすることができることが見越 される。接種時間は多分かなり相違するであろう。ここに開示したガラス物質は 、ディスク状、スリーブ状、棒状又は他のあらゆる形状の支持体又はテンプレー トに成形することができる。また、ここで作られたガラスは、粒子の形状で供給 することもできる。 本発明のガラスを用いて生物活性及び骨形成性を高めるには、このガラスを処 理して、その表面に細胞が付着できるようにしかつ細胞を接種する前のｐＨをコ ントロールしなければならない。従って、本発明は、上記のガラス物質からなる 多孔質生物活性テンプレートを供給し、このテンプレートを緩衝溶液中に浸し、 そしてそのテンプレートを組織培養培地中に浸して、この表面上に細胞を接種し たときに骨細胞活性を有意に高める表面にする工程を含む骨組織を形成する方法 も開示する。最終的に、このテンプレートに細胞を接種してその上に骨組織を形 成させる。最も好ましくは、緩衝溶液は約６．８のｐＨで緩衝され、組織培養培 地は約７．６を超えないｐＨを有する。テンプレート上に接種される細胞は、骨 始原細胞を供給するあらゆる試料、骨髄細胞試料、骨芽細胞表現型潜在性又は骨 芽細胞表現型の細胞から選ぶことができる。接種は、線維芽細胞及び軟骨細胞で 始めることもできる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明に従って作られた支持体の断面図の顕微鏡写真であって、骨様 シート状物の形成を示す。 図２は、本発明に従って作られた生物活性ガラスの表面の顕微鏡写真であって 、コラーゲンフィブリルによって繋がれた球状の付着成長物を示す。 発明の詳細な説明 in vivo 骨生育の分野では、ガラスはリン酸カルシウムセラミックがもたらす 以上の有益な効果をもたらすことが知られている。例えば、シェパーズ （Schepers）ら“Bioactive glass particulate material as a filler forbone lesions,”J.Oral Rehabilitation,8,435-452(1991)を参照のこと。しかしなが ら、 in vivo でのこの効果は in vitro では再現されていない。本発明は、新 規な物理的形態のガラスに加えてin vitroで効果的である新規な表面処理を開示 するものである。 支持体の多孔度は必須ではないが、細胞との潜在的な接触比表面積が大きくな ることからみて有利である。この支持体を介して組織を生育させると、再移植に 必要とされる組織の速やかな形成がもたらされ、そしてこの人工物質はより速や かに分解する。従って、本発明の１側面は、生物活性なガラス多孔質体を作る方 法を提供する。先行技術で提案された方法は結晶化ガラスを作るものであること が認識されるであろう、そしてその結晶化は生物活性反応を妨害するので避けら れなければならない。言い換えれば、リン酸カルシウム表面、おそらく骨のミネ タル相に非常に類似している炭酸化カルシウム欠如ヒドロキシアバタイトをもた らす溶解及びイオン交換反応が、ガラス中に存在する結晶で相当に遅くなるので ある。その制限下では、この必要な富カルシウム−リン酸層が非常にゆっくり形 成されるので、細胞付着反応にとって最小限か又は全く取るに足らないものにな り得る。細胞付着が行われないと、細胞機能は妨害されないまでも制限されると 仮定できる。従って、分泌機能、即ち、細胞外基質形成又は骨組織様合成に具体 的に焦点を合わせた場合、それは、極めて大きく低下し、引いては真の利用は行 われない。本発明は細胞生物学に依拠しないとうことにまず留意すべきである。 骨芽細胞表現型の細胞に格上げ調節される潜在性を有する多くの細胞を用いるこ とができる。 Ａ．ガラス調製 計画通りの組成である４５％（重量％）ＳｉＯ₂、２４.５％Ｎａ₂Ｏ、２４.５ ％ＣａＯ及び６％Ｐ₂Ｏ₅を有する生物活性ガラスが、最も好ましい態様に該当し 、化学的に純粋な試薬グレードのＮａ₂ＣＯ₃、ＣａＣＯ₃、Ｃａ₁₀（ＯＨ）₂（Ｐ Ｏ₄）₆及びＳｉＯ₂から調製される。しかしながら、本発明の物質を作るにはこ れら構成成分の次の範囲が有用である：４０〜６０％ＳｉＯ₂；５〜３０％Ｎａ₂ Ｏ；１０〜３５％ＣａＯ及び０〜１２％Ｐ₂Ｏ₅。一定比率の量にした試薬を混合 してルツボ中で約１３５０℃で溶融する。溶融物含有ルツボを必要な回数、最も 好ましくは少なくとも３回渦巻かせることによってこの溶融物を確実に均質にす る。次いで、この溶融物を脱イオン水中に注ぎ入れる。次いで、この方法によっ て得られたガラスフリットを乾燥して多孔質ガラスの合成に用いる。多孔質ガラ スを合成するには、このガラスフリットを粉砕して約４０〜７０μｍの範囲の粒 子サイズを有する粉末に磨砕する。この粉末を発泡剤として用いられる２〜３％ のＣａＣＯ₃と混合する。この混合物を約５０ＭＰａ及び４６０℃で約２時間真 空下で熱圧プレスする。得られる気孔サイズ範囲は、約７０〜２００μｍである 。もっと大きな気孔サイズ範囲、例えば、約２００〜５００μｍは、もっと大き な粒子サイズのＣａＣＯ₃粉末を用いるか、又は発泡剤としてＮａＨＣＯ₃を用い ることにより得られる。平均の多孔度及び気孔サイズは、それぞれ重量測定及び 体積測定によって測定される。本発明に従って調製された多孔質生体ガラスのＸ 線回折は、発泡プロセス後の結晶化の兆候のない完全なガラス化を示す。 本発明に従うガラスの合成を最適化するために、幾つかの発泡剤（Ｎａ₂ＣＯ₃ 、ＮａＨＣＯ₃、ＮＨ₄Ｈ₂ＰＯ₄及び大理石）を異なる濃度（１％、２％、３％、 ６％及び１０％）で用い、そして幾つかの焼結及び発泡処理（４５０、５８０、 ４７５及び５５０℃）を異なる時間（１、２、３及び５時間）で用いた。２段階 熱処理（４５０℃で１時間：次いで４７５℃、５５０℃又は５８０℃のいずれか で１時間）も用いた。異なる粒子サイズ、例えば、約１１０μｍ及び約７０〜４ ０μｍのガラス粉末を用い、かける圧力も変動値として採用して約１００、７０ 及び４０ＭＰａを試した。測定可能な程度にガラス結晶化反応を開始しなった発 泡剤及び処理条件が好ましい。如何なる結晶化も、ガラスをより腐蝕抵抗性にす るか又は不均一な腐蝕をもたらす。これは、この有益な表面反応層の形成に逆に 影響するので避けられなければならない。 最良の結果は、グラファイト製ダイで約５０ＭＰａの圧力でプレスした約２. ３％ＣａＣＯ₃での約４０〜７０μｍの粒子サイズのガラス粉末を混合すること によって得られた。次いで、このプレスした混合物を約４６０℃に約２時間真空 で加熱する。高圧、例えば、約１００ＭＰａ及び約５８０℃での熱処理を用いる と、 非多孔質ガラスセラミック物質ができるので、これら変動値についてはこれら値 は好ましくない。更に、低圧、例えば、約４０ＭＰａを用いると、取り扱いがで きない崩れやすい物質が生成することが分かった。長時間の熱処理は、特に発泡 剤の存在下ではガラスの結晶化を開始するであろうから、最も短い熱処理時間が 最も好ましい態様である。 本発明で多孔質ガラス、ガラスセラミック、又はセラミックを作るのに有用な 別の方法は次の通りである。 (1)発泡と焼結 バインダー（例えば、ポリビニルアルコール）で水性セラミックスラリーを作 り、次いでそのスラリーを発泡剤（例えば、Ｈ₂Ｏ₂又はＣａＣＯ₃）と混合して その混合物を型に流し込み、それを乾燥させ、次いでそれを高温で焼結すること により、有用な物質を作ることができる。この方法は、ガラス表面の性質を変化 させて生物活性を制限してしまうので、あまり好ましくない。 (2)セラミック化と浸出 ガラスを１を超える結晶相に結晶化させ、次いで得られたガラスセラミックを 、好ましくは１相を溶解して他の相を残す酸又は塩基で処理することにより、多 孔質物質を作る。しかしながら、このセラミック化と浸出法は、富リン酸カルシ ウム相の浸出がこのガラスの生物活性を低下させることになるので、あまり好ま しくない態様に該当する。 (3)ゾルゲル法 当該技術分野で周知のように、セラミック又はガラスゲルの熱処理サイクルを コントロールすると、その物質の気孔と気孔−気孔間がコントロールされて多孔 質セラミックを得ることができる。しかしながら、この方法により調製される生 物活性ガラスの気孔サイズと多孔度パーセントのコントロールは、上記の発泡と 焼結法よりも、所期の範囲にあるものを得るのが非常に難しい。 Ｂ．ガラス表面のコンディショニング及びｐＨ変動値のコントロール 本発明のもう１つの重要な側面は、ガラス表面のコンディショニングと同時に 溶液のｐＨコントロールをすることである。かかるコンディショニングは、次の ２つの理由から必須である：(1)細胞をコンディショニングしていないガラスに 添加すると、起こるガラス腐蝕反応が、そのガラス表面及び溶液の主容積部分の ｐＨ値を、細胞を死滅させる値にしてしまう；及び(2)有利な細胞付着及び細胞 外基質堆積ができるように用意された表面を作らなければならない。ガラスの最 良のコンディショニング法を説明する前に、まず行った幾つかの実験を時系列で 説明する。 上記の技術に従って作ったガラスディスクを、間質液中に見られるのと類似の 濃度でイオンを含有するトリス緩衝溶液中に浸漬し、ロータリーテーブル上で３ ７℃（ｐＨ６.８４）で４８時間震盪した。この溶液の容量は１リッターであっ た。ガラス浸漬時間の間、ｐＨ値の変化は認められなかった。電子分散式Ｘ線回 折（ＥＤＸＡ）により、富リン酸カルシウム層がこの生物活性ガラス上に形成さ れていることが明らかになった。 他の実験では、このガラスディスクを修飾トリス緩衝溶液中で２０時間処理す るか又はトリス緩衝溶液中で２０時間処理した後に典型的組織培養培地（ＴＣＭ ）、即ち、Ｅ−ＭＥＭ（イーグル最小必須培地＋１０％ＮＢＳ＋２ｍＭ Ｌ−グ ルタミン）中で４８時間処理（処理ＴＢ２−Ｅ−ＭＥＭ）し、次いで細胞を接種 した。４つ又は５つのディスクを浸漬した。この溶液は３７℃に維持した。際立 った相違が、ガラスディスクに付着した細胞の数及び細胞外基質物質の分泌に認 められた。これら異なる処理を施した２つのガラスに付着した細胞の数を比較し たところ、トリス緩衝液単独で処理したガラスディスクにより多くの細胞が接着 していた。両方の組のサンプルには、コラーゲンフィブリルと石灰化小節が見ら れたが、如何なる骨様組織形成も見られなかった。ＴＢ２−Ｅ−ＭＥＭに従って 処理したガラスディスクに付着した細胞は、細胞間により多くのコラーゲンフィ ブリルを生成した。細胞付着は好ましい態様に該当するので、続く実験では、修 飾トリス溶液中での浸漬が好ましいと仮定した。この次の実験の組では、修飾ト リス中で２０時間処理した後にこれらディスク上に細胞を接種すると、細胞を死 滅させる可能性のあるｐＨ変化が起こるか否かという問題を扱った。これら実験 において、ディスクを修飾トリス中で２０時間処理した後に、細胞の接種及びイ ンキュベーションに用いるのと同じ組織培養培地中にディスクを浸漬して、ｐ Ｈ変化を測定した。これをまず、組織培養培地容量のガラス重量に対する１種類 の比率について行った。かくして、ガラスディスクをトリス緩衝液中で３７℃で ２０時間処理した後、Ｅ−ＭＥＭ中で３７℃で浸漬した。溶液容量のガラス重量 に対する比率は、約１９ｍｌ／ｇであった。このガラスの腐蝕生成物は、ＴＣＭ 溶液のｐＨを２４時間後に７.６から７.９に、そして４８時間後には７.６から ８.０に上昇させることが分かった。このｐＨの上昇は、細胞をかかる溶液中に 接種した際に逆作用をもたらし得る、即ち、細胞が死滅するであろう。 次の一続きの実験では、ガラス重量に対して異なる比率のＴＣＭ容量を用いた 。すぐ前の実験の結果に基づいて、トリス中への浸漬時間も２０時間から４８時 間に延ばした。これは、細胞が存在する場合でのガラスからＴＣＭ内への続く溶 解を最小限にしようとしたものであった。前のように、修飾トリス緩衝溶液中で ４８時間、次いでＴＣＭ中で３日間の２段階浸漬を行った。ＴＣＭの開始ｐＨは ７.６であった。ＴＣＭのｐＨを２４、４８及び７２時間後に測定した。次いで 、このＴＣＭをＴＣＭ＋３ｍＭβ−グリセロール・ホスフェートと置き換え、ｐ Ｈをやはり２４時間毎に３日間測定した。ＴＣＭのｐＨ値を変化させなかった最 小のＴＣＭ容量／ガラス重量比は９０ｍｌ／ｇであったが、ガラス表面とＴＣＭ の主容積部分の間には依然としてｐＨ勾配があり得る。更に、気孔内部のＴＣＭ のｐＨ値は、ペトリ皿内の溶液の主容積部分のＴＣＭの１点よりもかなり高いか も知れない。我々は、主容積部分ＴＣＭのｐＨが、例えば、ＴＣＭ容量のガラス 重量に対する比率が低いために、約７.８５に上昇したときは、予めコンディシ ョニングしたガラスディスク上に接種された細胞の活性が大きく阻害されること を見出した。これら培養物の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析により、細胞プロセ スが非常に制限されていること、及びサンプルをファーストレッド染色で染色し た際に見られる淡桃色からしてアルカリ性ホスファターゼ活性が最小であること が分かつた。 これら結果に基づいて、組織培養培地中に強い生物学的緩衝液を添加するもう １つの実験を行った。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを添加した。気孔内部のｐＨ値を安 定化するためにこの緩衝液を添加した。かくして、一組の全条件は次の通りであ る：修飾トリス内での４８時間の浸漬、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを補充したＥ−Ｍ ＥＭ中での浸漬、及びＴＣＭ容量のガラス重量に対する比率、９０ｍｌ／ｇ。ま た、この第２浸漬は、接種の条件に該当する。かくして、ガラスの気孔内及び表 面におけるｐＨが、細胞をそのガラス上に接種ずる間、７.６に安定化される場 合は、豊富な細胞プロセスが可能となり、培養後たった１週間で骨様組織が広範 に形成された。 これらガラスディスクを乾燥し、そして最も好ましくは細胞を接種する前にエ チレンオキシドにより滅菌する。 富リン酸カルシウム反応層の形成である浸漬処理の効果は公知である。ヘンチ （Hench）ら“Bonding mechanisms at the interface of ceramic prostheticma terials,”J. Biomed. Mater. Res. Symp., 2:117-141 (1972)を参照のこと。 この反応層は、不十分に結晶化した不完全なカルシウム・ヒドロキシアパタイト 構造に徐々に成熟する。キム（Kim）ら“Early stages of calcium phosphatela yer formation in bioglass,”J.Non-Cryst.Solids,113:195-202(1989)を参照の こと。しかしながら、本発明の浸漬処理は、上で参照したヘンチらにより用いら れた方法とは基本的なやり方において異なっている。この先行技術の意図するも のは、ガラス表面における幾つかのイオン交換、溶解、濃縮、沈降及び変換反応 の速度論を確立することであった。これらの理由から、間質骨液の如何なる典型 的成分も含有しないトリス緩衝溶液が用いられた。対照的に、本発明は、骨のミ ネラル相に似ているガラス表面であって、生物学的分子を含有する溶液に接触さ せるとすぐに生体分子を吸収するガラス表面を達成する。これは、次の２つの方 法のいずれかによって達成することができる：ｉ）修飾トリス緩衝液への浸漬の 後であって接種の前に、骨組織中に正常に存在する生物学的分子を含有するＴＣ Ｍ又は他のあらゆる適当な溶液にそのディスクを浸漬するか：又はii）生物学的 分子を含有する細胞懸濁液中にディスクを浸漬する。細胞接着の前に、これら生 物学的分子は、連続的に生長するガラス表面反応層に取り込まれてゆく。 その結果、この生長するリン酸カルシウム層が有機分子で被覆されそれとよく混 合されることになる。 Ｃ．in vitro で合成された骨組織の特徴付け 上記の修飾トリス緩衝液で前処理した後、１０ｍｍ径ディスクを６０ｍｍ径ペ トリ皿又は他の適当な容器に入れ、ＴＣＭで濡らし、そして１.２×１０⁶細胞／ ｍｌを含有する懸濁液からの約１×１０⁶ 個の新生子ラット頭蓋冠骨芽細胞を接 種する。ここで用いた細胞懸濁液は、０.２％コラゲナーゼを用いる酵素消化法 によって得た。細胞を付着させるために、それらペトリ皿をＴＣＭで満たす前に 約１時間インキュベーター内に保持した。２日後、そのＴＣＭを３ｍＭβ−グリ セロール・ホスフェートを補充したＴＣＭと交換した。この交換を日に４回繰り 返した。これらペトリ皿を日に７個を費やした。カルシウム、リン及び硫黄につ いての走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、エネルギー分散性Ｘ線マイクロアナリシス（ ＥＤＸＡ）を用いることによる形態学的分析、溶液中のアルカリ性ホスファター ゼ濃度の定性的及び定量的測定、及びＤＮＡ、コラゲナーゼＩ及びオステオカル シン合成により、形成された組織の特性が明らかになる。 図１に見られるように、これら多孔質試験片には、細胞及びそれらが同化した 細胞外基質が完全に侵入していることが分かった。図１は、１週間のインキュベ ーション後の多孔質生物活性ガラスの断面の走査電子顕微鏡写真（×１００）を 示す。骨様シート状物が、この多孔質ガラスサンプルの全厚みにわたって形成さ れた。図２は、生物活性ガラス表面の別の走査電子顕微鏡写真（×３５００）を 示す。この写真は、本発明のパラメーターがまだ最適化されていない時に作られ た。それは、広範な骨組織形成の前の幾つかの事象を示しており、ガラス表面に 直接接触している球状の付着成長物が見える。コラーゲンフィブリルがこれら球 状小節を繋いでいる。この石灰化セメント質様層は、まだ骨様シート状物によっ て覆われていないのでこのようにまだ見えるのである。 アルカリ性ホスファターゼ活性の定性的評価により、最高の活性が生物活性ガ ラスディスク上の細胞で存在し；そのガラスディスクを取り囲むペトリ皿の底部 には弱い活性しか存在しないことが明らかとなっている。 アルカリ性ホスファターゼ活性の定量的測定は、ペトリ皿当たりの平均を表す ものである。ローリイ（Lowry）ら“The quantitative histochemistry of theb rain：II．Enzyme measurements，”J. Biol.Chem.，207:19-37（1954）に記載 された放出ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）定量法を用いて、０.６２ nmol Ｐ ＮＰ／分／μｇタンパク質の速度が見出された。μｇＤＮＡに関しては、骨芽細 胞表現型発現についての典型的な値（２.０１μｇ／ｍｌ）が示された。これら 種々のサンプルの広範な形態学的観察は、次の仮説的な連続事象を示唆している ：第１段階で石灰化型の、径が１〜２μｍの小さな球のフォーカスがガラス表面 上に現れる、続いて、コラーゲンフィブリルが生成してこれら石灰化小節に付着 する。 コラゲナーゼＩ合成が確認されたことに留意すべきである。その上から、石灰 化物質及び絡み合ったフィブリルの両方の合成が連続し、それによって束の形成 が徐々に起こり、最終的に骨様物質のシート状物に合着する。これらシート状物 の表面は滑らかであり石灰化球がないことに留意することが重要である。かかる 結果は、これら石灰化球がコラーゲンフィブリルを橋架けするのに役立ち、それ によってこの連続的な骨様シート状物ができるという理諭と一致するので興味深 い。ガラス表面上のこれら小節の最初の同化なしには、細胞はコラーゲンフィブ リルを生成しないことももう１つの興味深い結果である。オステオカルシン放射 性免疫検定法（ヤギ抗ラットオステオカルシン、ロバ抗ヤギ第２抗体及びＩ−１ ２５ラットオステオカルシンを使用）により、かなりの濃度（約８ｎｇ／ｍｌ） のオステオカルシンが示された。オステオカルシンは、ガラスと骨芽細胞を含有 するペトリ皿上でだけ検出された。骨芽細胞はあるがガラスディスクがないコン トロールペトリ皿は、検出できる濃度のオステオカルシンを示さなかった。 同化物質の石灰化は、カルシウム及びリンが過飽和した溶液からの沈殿の物理 化学的現象の結果ではなく、これは本質的にガラス溶解の結果であった。ガラス はあるが細胞を接種しないコントロール実験、又は多孔質生物活性ガラスのない 細胞培養実験は、測定できるほどの石灰化をもたらさなかった。 ここに開示した in vitro 合成テンプレートの適用は、生物活性ガラスの顆粒 の利点及び欠点を解析することによって説明することができる。シェパーズら“ Bioactive glass particulate material as a filler for bone lesions,”J.Or al Rehabilitation，8,435-452(1991)を参照のこと。顆粒形のガラスを用いる大 きな利点の１つは、それらが現時点で臨床的用途にすぐに使えるが、 invitro 合成テンプレートはそうでない点である。両者はガラスを主成分とする製 品であるので、顆粒が市場に受入れられれば、テンプレートの将来の導入に大い なる助けとなり得る。 ここに開示したテンプレートを多孔質の粒子形態に作ることができることは留 意するだけの価値がある。手術では異なる多くの型がないことに遭遇するが、こ のことが、これらテンプレートをそれを満たすのに用れるようにする。しかしな がら、そうすることは、これらテンプレートのこの有意義な特質の１つ、即ち、 それらが大きな硬質構造体として利用できるという特質をなおざりにすることに なる。これは、骨損傷が重度のものでありかつ手術後の構造体に必要な高度を与 えるために修復及び再構築が固体ブロックで試みられなければならないような外 傷又は病的異常のいずれの状況においても非常に重要な事柄である。そのような 状況では、ペーストを形成する顆粒や粒子では限界がある。というのは、それら は送り込んだ部位から絞り出され得るからである。 本発明に従って作られるテンプレート上の in vitro 合成骨組織形成体の第２ に主要な利点は、それらを別の理由で限られた生育能力しか有しない部位に移植 できることである。本発明の方法に従ってテンプレート上に接種された細胞は移 植前に活性化されている。この観察は莫大な展望を開く。西洋人は絶えず高齢化 しており、この高齢層に骨粗鬆症が広がっている。骨形成よりも骨吸収の方が大 きいことを特徴とする骨粗鬆症は、年齢が５５歳を越える世代の５０％以上の人 々が患う。それは、脊椎を徐々に圧縮して典型的なものは背中を丸くする。骨粗 鬆症は、かなりの罹患率であり重要な二次的死亡率でさえある股関節骨折の高パ ーセンテージの原因でもある。要するに、ここに開示した in vitro 生育骨組織 を有する接種されたガラス表面は、骨折の高い危険性及び骨組織形成能力の低下 又は消失さえも示す身体の全領域に挿入することができる。多孔質で生物活性な 本発明のガラスの網状構造物を、脊椎の椎骨又は股関節骨の頸部における多孔質 骨網状構造に似せて作ることができる。 ここに開示した合成支持体上に接種される細胞は、最も好ましくはその患者か らの細胞である。実験では、骨芽細胞、即ち、骨組織物質を分泌する細胞を用い た。しかしながら、当業者に周知なように、骨芽細胞は、骨芽細胞系列の細胞の 最終段階の細胞に過ぎない。骨芽細胞の前駆体細胞である細胞を用いることも可 能であり、それらは典型的には骨髄中に存在する。簡単な抽出、その後の適当な 分離及びコンディショニングにより、接種できる細胞が得られる。これら細胞の 家族間授受は、治療を受ける患者の老化がもう限られた細胞活性しか持っていな い時点まで進行した場合、又は細胞生検材料を得ることができないような臨床的 状況の場合に計画される。 ここに開示した多孔質生物活性ガラステンプレートの第３の重要な利点は、そ れらをすぐに骨が必要である部位に移植できることである。一旦テンプレートに 接種すると、１週間後にはもう骨組織が in vitro で広範に形成されることにな る。 要するに、これら本テンプレートは、上記のシェパーズの文献で議論された非 多孔質顆粒と完全に置き換わるものではなく、むしろそれらは、これら顆粒がど ちらかと言えば制限されたやり方で以前に用いられた適用症を広げることになろ う。更に、それらは、上で示唆した骨粗鬆症における治療法の如き全く新規な治 療法を生み出すであろう。 当業者は、これら多孔質テンプレートも一次関節代用物に用いられるようにな ることを認識するであろう。多孔質被覆人工器官は、本発明に従って作られた多 孔質テンプレート物質のスリーブにより周囲を取り巻かれるであろう。約１〜２ 週間後に、それは患者に挿入されるであろう。その時点で、自生の大腿骨中への 非常に速いその装置の組み込みが起こるであろう。 本発明を応用することができる他の新規で有用な分野は、患者への薬品又は生 物学的分子の送逹である。この支持体に薬品又は生物学的分子を加えることによ って、骨代用に加えて他の治療的効果を得ることができる。 本発明の一定の態様及び適用を詳細に記載してきたが、上記明細書を参照すれ ば、当業者は、本発明がそのように限定されないことを認識するであろう。本発 明の精神から逸脱することなく、多くの変更、修飾及び他の適用症への応用がす ぐに明らかになるであろう。この理由から、本発明の真の範囲を確実にするため に、添付の請求の範囲が参照されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エル−ガンナム，アーメッド アメリカ合衆国ペンシルバニア州19104, フィラデルフィア，ボルティモア・アベニ ュー 4013 211 (72)発明者 シャピーロ，アーヴィング アメリカ合衆国ペンシルバニア州19146, フィラデルフィア，サウス・トゥエンティ シックスス・ストリート 426

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨芽細胞表現型を獲得することができる細胞の in vitro 接種のための、表 面を有する支持体を含む生物活性物質であって、前記表面が、該支持体が組織培 養培地のｐＨを接種で生理学的ｐＨを越えて上昇できないようにするのに効果が ある水性条件下で、接種前に処理されていることを特徴とする生物活性物質。 ２．該物質がガラスを含む、請求項１の生物活性物質。 ３．ガラスが本質的にＳｉＯ₂；ＣａＯ；Ｎａ₂Ｏ；及びＰ₂Ｏ₅からなる非晶質ガ ラスを含む、請求項２の生物活性物質。 ４．次の組成：４０〜５０重量％ＳｉＯ₂；２０〜３０重量％ＣａＯ；５〜３０ 重量％Ｎａ₂Ｏ；及び０〜１２重量％Ｐ₂Ｏ₅を有する、請求項３の生物活性物質 。 ５．該物質が多孔質であり、約１０〜８０％の多孔度と８００μｍ未満の気孔サ イズを示す、請求項１の生物活性物質。 ６．支持体、及び骨芽細胞表現型を獲得することができる細胞を接種することに よりin vitroで該支持体上に形成された骨組織を含む移植可能な骨代用物であっ て、前記支持体が、組織培養培地のｐＨを接種で生理学的ｐＨを越えて上昇でき ないようにするのに効果がある水性条件下で、接種前に処理されていることを特 徴とする移植可能な骨代用物。 ７．支持体が多孔質の生物活性セラミックを含む、請求項６の移植可能な骨代用 物。 ８．支持体がシートの形状にある、請求項７の移植可能な骨代用物。 ９．支持体が顆粒の形状にある、請求項７の移植可能な骨代用物。 10．請求項６〜９のいずれか１項の移植可能な骨代用物に用いるための多孔質ガ ラス支持体を作る方法であって、 本質的にＳｉＯ₂;Ｎａ₂Ｏ、ＣａＯ及びＰ₂Ｏ₅からなる混合物を溶融し; 溶融した混合物を冷却してガラスフリットを作り; このガラスフリットからガラス粉末を作り;そして このガラス粉末から多孔質ガラス支持体を作る ことを含み、それによって生成する多孔質ガラスが実質的に結晶性を示さない方 法。