JPH0827190A - コレシストキニン−ｂ／ガストリン受容体蛋白及び遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は，配列表配列番号３，４及び配列番
号６に記載のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体蛋白及びこ
れをコードする遺伝子に関する。 【効果】 ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の入手を可能
とし，ヒトの疾患に関する該受容体拮抗薬，例えば胃酸
分泌阻害剤，抗不安剤等のスクリーニング及び評価に有
用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，医薬，特にコレシスト
キニン−Ｂ（以下，ＣＣＫ−Ｂと略す）／ガストリン受
容体拮抗薬を開発する際に必要な評価系に用いるＣＣＫ
−Ｂ／ガストリン受容体に関する。

【０００２】

【従来の技術】ガストリンは，胃幽門部に存在するＧ細
胞より分泌されるペプタイドホルモンであり，胃粘膜の
酸分泌を誘導する作用をもっている。一方，コレシスト
キニンは，中枢神経及び消化器系などの末梢神経に存在
する神経性ペプタイドである。両ペプタイドは，共通し
た５個のＣ末端アミノ酸配列を有しており，細胞膜上に
存在する同一の受容体に親和性を持っていることが示さ
れている。これらのペプタイドの生理作用は，標的とす
る受容体に結合することにより誘導されるため，それぞ
れの受容体の性質の解明はそれぞれのペプタイドの生理
現象，ひいては病態との関わりを解明する上で重要なこ
とである。

【０００３】コレシストキニン及びガストリンに関する
受容体は，それぞれのペプタイドに対する親和力の差に
より，大きく２種類（コレシストキニン−Ａ（以下ＣＣ
Ｋ−Ａと略す）受容体及びＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容
体）に分類することができる。ＣＣＫ−Ａ受容体がガス
トリンに比べコレシストキニンに１０００倍の親和性を
有しているのに対し，ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体
は，ガストリン，コレシストキニンにほぼ同程度の親和
性を示す (Chang et al.: Mol. Pharmacol. 30,212-21
7. 1986 及び Lotti et al.: Eur. J. Pharmacol. 162,
273-280, 1989)。ＣＣＫ−Ａ受容体は消化管，特に膵
臓に発現しており，消化酵素の分泌に関与していると考
えられている。一方，ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体
は，主に脳と胃粘膜に発現していることから，胃粘膜に
発現しているＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体は，胃粘膜
壁細胞からの胃酸分泌 (Debas:"Physiology of the Ga
strointestional Tract" Vol. 2, PP931-945, Raven Pr
ess, New York, 1987及びPatelet al.: Br. J. Pharmac
ol. 106, 275-282, 1992) 並びに胃粘膜細胞の増殖(Ry
berg et al.: Gastroenterology 99, 935-942, 1990)
などを制御していると考えられている。

【０００４】一方、中枢に発現しているＣＣＫ−Ｂ／ガ
ストリン受容体は、うつ病や不安などの精神病に関係し
ていると考えられている。また、肺癌、膵癌、大腸癌、
胃癌、Ｔ細胞性リンパ腫など、多くの悪性腫瘍細胞株に
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の発現が認められ、同受
容体と癌化との関連性も指摘されている。そのため、Ｃ
ＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体とそのリガンドとの結合の
阻害物質は、過剰胃酸分泌による胃潰瘍や、高ガストリ
ン血症に伴う胃粘膜肥厚などの消化器疾患に対する治療
薬をはじめとして、向精神薬や抗癌薬としての可能性を
もっている。ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡ
は、既にイヌ胃粘膜壁細胞及びヒト脳（ヨーロッパ特許
出願公開第５６１４９６号公報：以下ＥＰ ５６１４９
６号とする）、ラット脳（Wank et al.: Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A., 89, 8691-8695, 1992）、及び、Mas
tomys natalensis ＥＣＬ 腫瘍細胞 （Nakata et a
l.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 187, 1151-115
7, 1992）より単離されている。これらのｃＤＮＡのコ
ードするアミノ酸配列は、それぞれ９０％前後の高い相
同性を示しており、１種類の染色体遺伝子に由来すると
考えられている。

【０００５】しかし，１種類のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン
受容体によって，前述のようなガストリン及びコレシス
トキニンの生理作用が全て制御されているか否かは，未
だに疑問を残すところである。例えば，ドーパミンＤ₂
受容体は１種類の染色体遺伝子によってコードされてい
るが，オルタナティブスプライシングによって生ずる２
種類のアイソフォームが存在し，それぞれ組織によって
発現様式が異なることが知られている (Montmayeur et
al.：FEBS Lett. 278, 239-243, 1991)。異なるアイソ
フォームの存在は，異なる生理作用にそれぞれのアイソ
フォームが関係している可能性を示している。すなわ
ち，ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体アイソフォームの探
索は，ガストリン及びコレシストキニンの関与する病態
治療のターゲットをさらに細分化する意味で重要な課題
である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は，従来
のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体とは異なり，新規なＣ
ＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を得るためのＣＣＫ−Ｂ／
ガストリン受容体をコードする遺伝子を提供することに
ある。また，本発明の別の目的は，該遺伝子を用いて発
現させたＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のポリペプチド
を提供することにある。さらなる目的として上記ポリペ
プチドを用いてＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体拮抗剤を
開発する際に必要な評価系を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決しようとする手段】本発明者らは，遺伝子
工学的手法などを用いて鋭意研究を行なった結果，イヌ
胃粘膜及びヒト胃由来のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体
をコードする新規な遺伝子を単離し，さらに該遺伝子を
発現させることにより本発明を完成した。即ち，本発明
は後記配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からな
るポリペプチドをコードする遺伝子，配列番号４に記載
のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝
子，配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプ
チドをコードする遺伝子である。これら遺伝子のうち配
列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを
コードする遺伝子，配列番号４に記載のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドをコードする遺伝子はイヌ由来ＣＣ
Ｋ−Ｂ／ガストリン受容体をコードし，配列番号６に記
載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺
伝子はヒト由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体をコード
するものである。さらに、本発明は後記配列表の配列番
号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列
番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配
列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドで
ある。これらポリペプチドのうち配列番号３に記載のア
ミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号４に記載の
アミノ酸配列からなるポリペプチドはイヌ由来ＣＣＫ−
Ｂ／ガストリン受容体であり、配列番号６に記載のアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドはヒト由来ＣＣＫ−Ｂ／
ガストリン受容体である。また，本発明には，上記配列
の部分配列であり，配列番号３又は配列番号４記載のイ
ヌ由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体，及び配列番号６
記載のヒト由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と同様の
機能を有するポリペプチド，及びこれをコードする遺伝
子も包含される。

【０００８】以下，本発明の遺伝子又はポリペプチドの
製造法について説明する。 第１製法：まず，ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の遺伝
子を産生する能力を有する細胞あるいは組織からｍＲＮ
Ａを抽出する。次いで，このｍＲＮＡを鋳型として該受
容体をコードするｍＲＮＡ全体または一部のｍＲＮＡ領
域をはさんだ２種類のプライマーを用い，逆転写酵素−
ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＲＴ−ＰＣＲという）を行
うことにより，該受容体をコードするｃＤＮＡまたはそ
の一部を得ることができる。さらに，得られたＣＣＫ−
Ｂ／ガストリン受容体のｃＤＮＡまたはその一部を適当
な発現ベクターに組み込み，これで形質転換された宿主
細胞を発現させ，該受容体またはその一部を製造するこ
とができる。

【０００９】以下，上記製造法につき詳述する。 １）ｍＲＮＡの抽出 本発明のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のＤＮＡは該受
容体産生能力を有する細胞，例えば脳細胞又は胃粘膜細
胞から該受容体をコードするものを包含するｍＲＮＡを
既知の方法により抽出する。抽出法としては，グアニジ
ン・チオシアネート・ホット・フェノール法，グアニジ
ン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられ
るが，好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシ
ウム法が挙げられる。

【００１０】２）ｍＲＮＡの精製 ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく，例えばｍＲＮＡを
オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着・溶出させ，精
製することができる。さらに，ショ糖密度勾配遠心法等
によりｍＲＮＡをさらに分画することもできる。また，
ｍＲＮＡを抽出せずとも，抽出済ｍＲＮＡが市販されて
いるものもある。上記のｍＲＮＡがＣＣＫ−Ｂ／ガスト
リン受容体をコードするものを含むことを確認するため
には，ｍＲＮＡを翻訳させ，該受容体に特異的な抗体を
作用させて検出する等の方法で行うことができる。

【００１１】例えば，アフリカツメガエル (Xenopus la
evis) の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳させたり
(Gurdon, J. B. et al.: Nature 233, 177-182, 197
2)，あるいはウサギ網状赤血球系や小麦胚芽系を利用し
た翻訳反応が行われている(Schleif, R. F. and Wensin
k, P. C. (1981): " Practical Methods in Molecular
Biology ", Springer-Verlog, NY.)。

【００１２】３）第１鎖ｃＤＮＡの合成及び該ｃＤＮＡ
を鋳型としたＰＣＲ 精製されたｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄ
Ｔプライマーの存在下で，逆転写酵素反応を行い第１鎖
ｃＤＮＡを合成する。この合成は常法によって行うこと
ができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡ又はその一部の領域
をはさんだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲに供し，
目的とするＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡを増
幅する。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等に
より分画する。

【００１３】第２製法：本発明の遺伝子は上述の製造法
の他，常法の遺伝子工学的手法を用いて製造することも
できる。まず，前述２）で得たｍＲＮＡを鋳型として逆
転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後，この１
本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法
としてはＳｉヌクレアーゼ法 (Efstratiadis, A. et a
l.: Cell 7. 279-288, 1976), Land 法 (Land, H. et
al.: Nucleic Acids Res. 9. 2251-2266, 1981), O. Jo
on Yoo 法 (Yoo, O. J. et al.: Proc. Natl. Acad. Sc
i.USA 79, 1049-1053, 1983), Okayama-Berg 法 (Okaya
ma, H. and Berg, P.: Mol .Cell. Biol. 2, 161-170,
1982) などが挙げられる。

【００１４】次に，上述の方法で得られる組換えプラス
ミドを大腸菌，例えばＤＨ５α株に導入して形質転換さ
せて，テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性
を指標として組換体を選択することができる。宿主細胞
の形質転換は，例えば，宿主細胞が大腸菌の場合には H
anahan の方法 (Hanahan, D.: J. Mol. Biol. 166, 557
-580, 1983)，すなわちＣａＣｌ₂やＭｇＣｌ₂またはＲ
ｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に該組換
えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。
なお，ベクターとしてはプラスミド以外にもラムダ系な
どのファージベクターも用いることができる。上記によ
り得られる形質転換株から，目的のＣＣＫ−Ｂ／ガスト
リン受容体のＤＮＡを有する株を選択する方法として
は，例えば以下に示す各種方法を採用できる。

【００１５】 合成オリゴヌクレオチドプローブを用
いるスクリーニング法 ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の全部または一部に対応
するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合コドン使用
頻度を用いて導いたヌクレオチド配列または考えられる
ヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列
のどちらでもよく，また後者の場合，イノシンを含ませ
てその種類を減らすこともできる），これをプローブ（
³²Ｐ又は³⁵Ｓで標識する）として，形質転換株のＤＮＡ
を変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリ
ダイズさせ，得られたポジティブ株を検索して，これを
選択する。

【００１６】 ポリメラーゼ連鎖反応により作製した
プローブを用いるスクリーニング法 ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の一部に対応するセンス
ストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレオ
チドを合成し，これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応
(Saiki, R. K. et al.: Science 239, 487-491, 1988)
を行い，目的のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の全部
又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用
いる鋳型ＤＮＡとしては，イヌ由来若しくはヒト由来Ｃ
ＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を産生する細胞のｍＲＮＡ
より逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ，またはゲノムＤ
ＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤ
ＮＡ断片を³²Ｐ又は³⁵Ｓで標識し，これをプローブとし
て用いてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラー
クハイブリダイゼーションを行うことにより目的のクロ
ーンを選択する。

【００１７】 他の動物細胞でＣＣＫ−Ｂ／ガストリ
ン受容体を産生させてスクリーニングする方法 前述の形質転換株を培養し，遺伝子を増幅させ，その遺
伝子を動物細胞にトランスフェクトし（この場合，ベク
ターは自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラ
スミドもしくは動物細胞の染色体に組み込まれ得るよう
なプラスミドのいずれでもよい），遺伝子にコードされ
た蛋白を細胞表面に産生させる。ついで，ＣＣＫ−Ｂ／
ガストリン受容体に対する抗体を用いて該受容体を検出
することにより，元の形質転換株より目的のＣＣＫ−Ｂ
／ガストリン受容体をコードするｃＤＮＡを有する株を
選択する。

【００１８】 ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対す
る抗体を用いて選択する方法 あらかじめ，ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み，形質転
換株表面で蛋白を産生させ，ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受
容体に対する抗体および該抗体に対する２次抗体を用い
て，所望のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体産生株を検出
し，目的の株を選択する。

【００１９】 セレクティブ・ハイブリダイゼーショ
ン・トランスレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃＤＮＡを，ニトロセルロース
フィルター等にブロットし，ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受
容体細胞からのｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後，ｃ
ＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ，回収する。回収
されたｍＲＮＡを蛋白翻訳系，例えばアフリカツメガエ
ルの卵母細胞への注入や，ウサギ網状赤血球ライゼート
や小麦胚芽等の無細胞系で蛋白に翻訳させ，ＣＣＫ−Ｂ
／ガストリン受容体に対する抗体を用いて検出して，目
的の株を選択する。

【００２０】得られた目的の形質転換株より所望のＣＣ
Ｋ−Ｂ／ガストリン受容体をコードするＤＮＡを採取す
る方法は，公知の方法 (Maniatis, T. et al. (1982):"
Molecular Cloning-A Laboratory Manual "Cold Sprin
g Harbor Laboratory, NY)に従い実施できる。例えば細
胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し，該プ
ラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を切り出すことにより
行ない得る。

【００２１】以上，得られたＤＮＡの配列決定は，例え
ばマキサム−ギルバートの化学修飾法 (Maxam, A. M. a
nd Gilbert, W.: " Methods in Enzymology "65, 499-5
59,1980)やＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法 (Messing, J. and Vieira, J.: Gene 1
9, 269-276, 1982) 等により行うことができる。このよ
うにしてクローン化されたイヌ由来若しくはヒト由来Ｃ
ＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体をコードする遺伝子を含む
断片は，適当なベクターＤＮＡに再び組込むことによ
り，他の真核生物の宿主細胞を形質転換させることがで
きる。さらに，これらのベクターに適当なプロモーター
および形質発現にかかわる配列を導入することにより，
それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現させることが
可能である。

【００２２】真核生物の宿主細胞には，脊椎動物，昆
虫，酵母等の細胞が含まれ，脊椎動物細胞としては，例
えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞 (Gluzman, Y.: Cell
23, 175-182, 1981) やチャイニーズ・ハムスター卵巣
細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株 (Ur
laub ,G. and Chasin, L. A.: Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77, 4216-4220, 1980) 等がよく用いられている
が，これらに限定されるわけではない。

【００２３】脊椎動物細胞の発現ベクターとしては，通
常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー，ＲＮＡのスプライス部位，ポリアデニル化部位およ
び転写終結配列等を有するものを使用でき，これはさら
に必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクター
の例としては，ＳＶ４０の初期プロモーターを有するpS
V2dhfr(Subramani, S. et al.: Mol. Cell. Biol. 1, 8
54-864, 1981) 等を例示できるが，これに限定されな
い。

【００２４】宿主細胞として，ＣＯＳ細胞を用いる場合
を例に挙げると，発現ベクターとしては，ＳＶ４０複製
起点を有し，ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であ
り，さらに転写プロモーター，転写終結シグナルおよび
ＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ
る。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法 (Lut
hman, H. and Magnusson, G.: Nucleic Acids Res. 11,
1295-1308, 1983)，リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿
法 (Graham, F. L. and van der Ed, A. J.: Virology
52, 456-457, 1973) および電気パスル穿孔法（Neuman
n, E. et al.: EMBO J. 1, 841-845, 1982) 等によりＣ
ＯＳ細胞に取り込ませることができ，かくして所望の形
質転換細胞を得ることができる。また，宿主細胞として
ＣＨＯ細胞を用いる場合には，発現ベクターと共に，Ｇ
４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現
し得るベクター，例えば pRSVneo(Sambrook, J. et al.
(1989): " Molecular Cloning-A Laboratory Manual "
Cold Spring Harbor Laboratory, NY) や pSV2-neo(So
uthern, P. J. and Berg, P.: J. Mol. Appl. Genet.1,
327-341, 1983) 等をコ・トランスフェクトし，Ｇ４１
８耐性のコロニーを選択することによりＣＣＫ−Ｂ／ガ
ストリン受容体を安定に産生する形質転換細胞を得るこ
とができる。

【００２５】上記で得られる所望の形質転換体は，常法
に従い培養することができ，該培養により細胞内または
細胞表面にＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体が生産され
る。該培養に用いられる培地としては，採用した宿主細
胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき，例え
ば上記ＣＯＳ細胞であればＲＰＭＩ−１６４０培地やダ
ルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培
地に必要に応じ牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添
加したものを使用できる。

【００２６】上記により，形質転換体の細胞内または細
胞外に生産されるＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体は，該
受容体の物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公
知の分離操作法により，それらより分離・精製すること
ができる。該方法としては，具体的には、例えば受容体
を含む膜分画を可溶化した後、通常の蛋白沈殿剤による
処理，限外濾過，分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル
濾過），吸着クロマトグラフィー，イオン交換体クロマ
トグラフィー，アフィニティクロマトグラフィー，高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロ
マトグラフィー，透析法，これらの組合せ等により行う
ことができる。

【００２７】このようにして本発明の遺伝子を利用して
遺伝子工学的手法により得られる物質がＣＣＫ−Ｂ／ガ
ストリン受容体機能を発現するためには，必ずしも配列
表配列番号３，配列番号４及び配列番号６に記載のアミ
ノ酸配列のすべてを有するものである必要は無く，例え
ばその一部の配列であって，それが配列番号３，４又は
６記載のイヌ又はヒト由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容
体と同様の機能を示す限り，それらのアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子もまた本発明の遺伝子に包含される。本
発明のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体をコードする遺伝
子は，配列表配列番号１に記載のヌクレオチド配列，配
列番号２に記載のヌクレオチド配列，配列番号５に記載
のヌクレオチド配列が好適である。

【００２８】一般に真核生物の遺伝子はインターフェロ
ン遺伝子等で知られているように，多型現象 (polymorp
hism) を示すと考えられ（例えば，Nishi, T. et al.:
J. Biochem. 97, 153-159, 1985 を参照），この多型現
象によって１個またはそれ以上のアミノ酸が置換される
場合もあれば，ヌクレオチド配列の変化はあってもアミ
ノ酸は全く変わらない場合もある。

【００２９】配列表配列番号３，配列番号４及び配列番
号６に記載のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるＣＣ
Ｋ−Ｂ／ガストリン受容体は，アミノ酸配列の中の，一
つ若しくは二つ以上の部位において，一つ若しくは二つ
以上のアミノ酸残基が欠失，挿入若しくは置換されてい
るポリペプチドでも同様のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン結合
活性を有することがある。これらのポリペプチドを本発
明においては，ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の同効物
と呼ぶ。

【００３０】このような各種の本発明の遺伝子は，上記
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の情報に基づいて，例え
ばホスファイト・トリエステル法(Hunkapiller, M. et
al.:Nature 10,105-111, 1984) 等の常法に従い，核酸
の化学合成により製造することもできる。

【００３１】なお，所望アミノ酸に対するコドンはそれ
自体公知であり，その選択も任意でよく，例えば利用す
る宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定でき
る(Crantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9
43-74)。さらに，これらヌクレオチド配列のコドンの
一部改変は，常法に従い，所望の改変をコードする合成
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したサイ
トスペシフィック・ミュータジェネシス (site specifi
c mutagenesis)(Mark, D. F. et al.: Proc. Natl .Aca
d. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984) 等に従うことが
できる。

【００３２】

【発明の効果】本発明は，新規ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン
受容体の入手を可能にし，該受容体拮抗薬，例えば胃酸
分泌阻害剤，抗不安剤等の探索及び評価に有用である。
また，該受容体のモノクローナル抗体を該受容体拮抗薬
として提供することができる。

【００３３】また，本発明の遺伝子の一部を改変するこ
とにより，ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の変異タンパ
ク質を作成することも可能である。得られた変異体のリ
ガンド結合活性を検討することにより，該受容体のどの
アミノ酸配列が結合に重要であるかを検討することがで
きる。得られた情報は，結合阻害物にどのような構造が
必要であるかを検索する上で重要である。さらに，受容
体は該リガンドと結合するための構造だけでなく，細胞
内のセカンド・メッセンジャーの変動を制御するための
構造も有している。遺伝子改変による変異タンパク質の
作成は，結合に重要な構造だけでなく，セカンド・メッ
センジャー制御に関係した構造をも明らかにするであろ
う。このことは，セカンド・メッセンジャーの変動を制
御することを作用機作としたコレシストキニンあるいは
ガストリンの阻害物質のデザインに重要な情報を提供す
るであろう。これらのことから，本発明によりＣＣＫ−
Ｂ／ガストリン受容体を提供することにより，該受容体
を用いた阻害活性物質等のスクリーニング方法を確立
し，それにより活性の高い化合物を選択し，該受容体の
関与する疾患に対する治療薬を提供することができる。

【００３４】コレシストキニン及びガストリン拮抗薬の
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を用いた評価方法として
は被検薬物の存在下で，ＣＣＫ−Ｂあるいは，ガストリ
ンの本発明受容体に対する親和力を測定する方法があ
り，このことより拮抗薬をスクリーニングすることがで
きる。本発明受容体に対するＣＣＫ−Ｂあるいは，ガス
トリン親和力は，ラジオ・アイソトープで標識されたア
ゴニスト（例えば，［¹²⁵Ｉ］Ａｓｐ¹−ＣＣＫ８あるい
は，［¹²⁵Ｉ］Tyr¹²-gastrin I) の受容体への結合量
を測定することで求められる。

【００３５】

【実施例】以下実施例により本発明を詳述するが，本発
明は以下に示す実施例によって限定するものではない。

【００３６】実施例１ イヌ由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体アイソフォーム
ｃＤＮＡの単離 イヌ由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のｃＤＮＡはＥ
Ｐ ５６１４９６号記載のイヌ胃粘膜ＣＣＫ−Ｂ／ガス
トリン受容体のｃＤＮＡ のコーディング領域の両端の
配列をプライマー (20-mer) として用い，イヌ胃粘膜由
来のｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法により得た。
実行の詳細を以下に示す。イヌ胃粘膜組織からグアニジ
ン・チオシアネート法により抽出し，オリゴ（ｄＴ）セ
ルロース・クロマトグラフィーにより精製したイヌ胃粘
膜ｍＲＮＡ（１μｇ）から，AMV reverse transcripta
se (40 units; Boehringer社製) により，第一鎖ｃＤ
ＮＡを合成した。逆転写酵素反応は，２０μｌの反応溶
液中で，AMV reverse transcriptaseに添付のランダム
プライマーを用いて行なった。得られた第一鎖ｃＤＮＡ
（１μｌ）を鋳型として，100μl の反応溶液中で，Ta
q DNA polymerase (2.5 units；Toyobo社製) によるＰ
ＣＲを実施した。

【００３７】Forward プライマーとして，5'-CCATGGAGC
T GCTAAAGCTG-3'（配列番号７）を，Reverse プライマ
ーとして，5'-CTCAGCCAGG CCCTAGCGTG-3'（配列番号
８）をそれぞれ５０ｐｍｏｌ用いた。ＰＣＲは５％ジメ
チルスルホキシド存在下で，変性温度９４℃で１分間，
アニーリング温度６０℃で２分間，ポリメラーゼ反応温
度７２℃で３分間からなるサイクルを，３０サイクル実
施した。得られたＰＣＲ産物をアガロース・ゲル電気泳
動により分画し，約１．３−１．４ｋｂのＤＮＡフラグ
メントを含むゲルを切り出し，ＤＮＡを精製した。精製
されたＤＮＡフラグメントは TA cloning kit (Invitro
gen社製) の手順に従って，添付のpCRIIベクターに挿入
し，クローン化した。pCRII ベクターに挿入されたＲＴ
−ＰＣＲ産物の塩基配列は，Taq DyeDeoxy Terminator
Cycle Sequencing 法 (Applied Biosystems, Inc.)に従
って決定した。その結果，前述のＥＰ ５６１４９６号
によって報告されたｃＤＮＡとともに，それとは一部塩
基配列の異なる新規なクローンが２種類得られた。

【００３８】一方のクローンは，ＥＰ ５６１４９６号
により報告されているイヌ由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン
受容体ｃＤＮＡコーディング領域の１５２番目に相当す
る位置に８８塩基の挿入配列を持つものであり，この挿
入配列中に終止コドン及び新たな開始コドンを含んでい
た。もう一方は３８０−４０３番目までの２４塩基の配
列が欠損していた。それぞれのコーディング領域の塩基
配列を配列番号１及び２に，さらにその配列より推定さ
れるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。

【００３９】実施例２ ヒト由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体アイソフォーム
ｃＤＮＡの単離 ヒト胃粘膜由来のｍＲＮＡを用い，ＥＰ ５６１４９６
号記載のヒト脳由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤ
ＮＡのコーディング領域の１５２番目の塩基をはさんだ
ＰＣＲ用プライマーの組み合せでＲＴ−ＰＣＲを行なっ
た。具体的には，まず，ヒト胃のｍＲＮＡ (Clonetech
社製）０．５μｇから，実施例１に準じて，第一鎖ｃＤ
ＮＡを合成し，得られたＤＮＡを鋳型として，100μl
の反応溶液中で，ＰＣＲを実施した。Forward プライマ
ーとして，5'-CTCAACAGCA GCAGTGTGG-3'（配列番号９）
を，Reverse プライマーとして，5'-GAAGGCATTG GTGACA
GTCC-3'（配列番号１０）をそれぞれ 25 pmol 用い
た。ＰＣＲは，変性温度９４℃で１分間，アニーリング
温度５９℃で２分間，ポリメラーゼ反応温度７２℃で３
分間からなるサイクルを，３５サイクル実施した。

【００４０】得られたＰＣＲ産物をアガロース・ゲル電
気泳動により分画し，主要なＰＣＲ産物である約２００
及び約３５０塩基のＤＮＡフラグメントを精製した後，
pCRII ベクターを用いてクローン化した。pCRII ベクタ
ーに挿入されたＲＴ−ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した
結果，約２００塩基のＰＣＲ産物は，前述のＥＰ ５６
１４９６号によって報告されたヒト脳由来ＣＣＫ−Ｂ／
ガストリン受容体ｃＤＮＡのコーディング領域の８５−
２７６番目に相当したが，約３５０塩基のＰＣＲ産物
は，前述のＥＰ ５６１４９６号記載のヒト脳由来ＣＣ
Ｋ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡのコーディング領域
の１５２番目に相当する位置に，１６０塩基の終止コド
ンを含む挿入配列を持つものであった。挿入部分の配列
である 5'-CAGGAGAAGA ACTGAACTGT CC-3'（配列番号１
１）と3'-noncoding region 上の配列である 5'-ATCTAT
GTGT GTGAGAGGCA GG-3'（配列番号１２）をプライマー
としたＰＣＲ（変性温度９４℃、１分間、アニーリング
温度６０℃、２分間、ポリメラーゼ反応温度７２℃、３
分間、３５サイクル）を行い，さらに、上記プライマー
セットの内側の配列である 5'-TGATGAGATG ATGCTCACGG-
3'（配列番号１３）と 5'-TATCAGAGGC ATGCCTCCTT-3'
（配列番号１４）を用いて、上記フラグメントをＰＣＲ
増幅し，その塩基配列を決定したところ，１つのオープ
ンリーディングフレームを含むことがわかった。本発明
ヒト由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体アイソフォーム
ｃＤＮＡのコーディング領域の塩基配列を配列番号５
に，さらにその配列より推定されるアミノ酸配列を配列
番号６に示す。

【００４１】実施例３ イヌＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のＣＯＳ細胞におけ
る発現の誘導 イヌＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡを組み込ん
だ発現ベクターを用いて、アフリカミドリザル腎臓由来
線維芽細胞株ＣＯＳを形質転換させ、該受容体を発現さ
せた。イヌＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体用発現ベクタ
ーは，実施例１で得た既知のクローン１種を含む３種類
のクローンのうち，配列番号１に示すｃＤＮＡと実施例
１で得た既知クローンであるＥＰ ５６１４９６号に記
載されたイヌＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡを
用いて構築した。まず，ＥＰ ５６１４９６号に記載さ
れたｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res.，
vol.18, p5322,1990）にサブクローニングし，ＥＰ ５
６１４９６号記載のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体用発
現ベクターを作製した。次に，実施例１で得たｃＤＮＡ
（配列番号１）を含むｐＣＲＩＩベクターから，配列番
号１の１−４６６番目を含むＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ断片
を切り出し，この断片を平滑末端にした後，上記のＥＰ
５６１４９６号記載のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体用
発現ベクターのＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ領域を平滑末端に
したものとつなげることにより，配列番号３に示すイヌ
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を発現するベクターを構
築した。次に，上記配列番号３に示すイヌＣＣＫ−Ｂ／
ガストリン受容体用発現ベクターＤＮＡ及びＥＰ ５６
１４９６号記載のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体用発現
ベクター各１５μｇをそれぞれＤＥＡＥ・dextrane（２
５０μｇ／ｍｌ）とともにＣＯＳ細胞培養液中に添加し
た。ＤＮＡ／ＤＥＡＥ・dextrane添加１４時間後に，培
地を取り除き，chloroquine（０．１ｍＭ）で２．５時
間処理した。培地を１０％牛胎児血清含有Dulbecco's m
odified Eagle's mediumに置換した後，３日間培養する
ことにより，イヌＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の発現
が認められた。なお，該受容体の発現は［¹²⁵Ｉ］ＣＣ
Ｋ８結合活性を測定することにより確認した。

【００４２】実施例４ ヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のＣＯＳ細胞におけ
る発現の誘導 ヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡを組み込ん
だ発現ベクターを用いて，アフリカミドリザル腎臓由来
繊維芽細胞株ＣＯＳを形質転換させ，該受容体を発現さ
せた。本発明ヒト胃由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体
（配列番号６）用発現ベクターは，Biochemical Pharma
cology 47,1339-1343,1994 に本発明者が報告したヒト
脳由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡのＴｆｉ
Ｉ／ＮｏｔＩ断片と，実施例２で得られた3'-noncoding
region上の配列であるｃＤＮＡのＢｇｌII／ＴｆｉＩ
断片とを結合させ，ｐＥＦ−ＢＯＳに挿入することによ
り作製した。次に，上記ヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受
容体（配列番号６）用発現ベクターＤＮＡ及びヒト脳由
来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体（ＥＰ ５６１４９６
号記載）用発現ベクター各１５μｇをＤＥＡＥ・dextra
ne（２５０μｇ／ｍｌ）とともに、ＣＯＳ細胞培養液中
に添加した。ここでヒト脳由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン
受容体（ＥＰ ５６１４９６号記載）用発現ベクター
は，Biochemical Pharmacology 47,1339-1343,1994の方
法に従って作製した。次いでＤＮＡ／ＤＥＡＥ・dextra
ne添加１４時間後に、培地を取り除き、chloroquine
（０．１ｍＭ）で２．５時間処理した。培地を１０％牛
胎児血清含有 Dulbecco's modified Eagle'smedium に
置換した後、２日間培養することにより、ヒトＣＣＫ−
Ｂ／ガストリン受容体の発現が認められた。なお、該受
容体の発現は、［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８結合活性を測定する
ことにより確認した。

【００４３】実施例５ イヌＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ
８結合実験 実施例３で得た配列番号３記載のイヌＣＣＫ−Ｂ／ガス
トリン受容体用発現ベクター及びＥＰ ５６１４９６号
記載のイヌＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体用発現ベクタ
ーで形質転換したＣＯＳをセル・スクレーパーで培養デ
イッシュよりはがし、それぞれbinding buffer（２５ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４及び０．１％ＢＳＡ含有 H
ank's balanced salt solution）に懸濁した。この細胞
懸濁液０．２ｍｌに［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８ ０．０５ｍｌ
（最終濃度１００ｐＭ）を添加することで、反応を開始
した。３７℃で、８０分間、振とう（１００回／分）し
た後、セル・ハーベスターを用いて、細胞をグラス・フ
ィルター上に回収し、ｉｃｅ−ｃｏｌｄ ５０ｍＭ Tri
s buffer，ｐＨ７．４（０．０１％ＢＳＡ含有）で洗浄
した。回収した細胞の放射活性をガンマー・カウンター
により測定し、本発明の受容体にＣＣＫ８が結合するこ
とを確認した。［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８と各濃度のＣＣＫ８
またはガストリン−１７をそれぞれ上記ＣＯＳ細胞懸濁
液に添加し、３７℃で８０分間インキュベート後、セル
・ハーベスターを用いて細胞をグラス・フィルター上に
回収し、ｉｃｅ−ｃｏｌｄ ５０ｍＭ Tris buffer，
ｐＨ７．４（０．０１％ＢＳＡ含有）で洗浄した。さら
に、回収した細胞の放射活性をガンマー・カウンターに
より測定し総結合量とした。また，非特異的結合量は，
１μＭ非標識ＣＣＫ８存在下での標識ＣＣＫ８結合量と
した。総結合量から非特異的結合量を差し引き
［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８の特異的結合量を求めた。結果を図
１に示す。

【００４４】実施例６ ヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ
８結合実験 配列番号６記載のヒト胃由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受
容体用発現ベクター及びＥＰ ５６１４９６号記載のヒ
ト脳由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体用発現ベクター
で形質転換したＣＯＳをそれぞれセル・スクレーパーで
培養ディッシュよりはがし，binding buffer（２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４及び０．１％ＢＳＡ含有 Ha
nk's balanced salt solution）に懸濁した。この細胞
懸濁液０．２ｍｌに［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８（最終濃度は，
配列番号６記載の受容体は５００ｐＭ，ＥＰ ５６１４
９６号記載の受容体は１００ｐＭ）を添加することで，
反応を開始した。３７℃で，６０分間振とう（１００回
／分）した後，セル・ハーベスターを用いて，細胞をグ
ラス・フィルター上に回収し，ｉｃｅ−ｃｏｌｄ５０ｍ
Ｍ Tris buffer，ｐＨ７．４（０．０１％ ＢＳＡ含
有）で洗浄した。回収した細胞の放射活性をガンマー・
カウンターにより測定し，本発明の受容体にＣＣＫ８が
結合することを確認した。［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８と各濃度
のＣＣＫ８またはガストリン−１７をそれぞれ上記ＣＯ
Ｓ細胞懸濁液に添加し、３７℃で６０分間インキュベー
ト後、セル・ハーベスターを用いて細胞をグラス・フィ
ルター上に回収し、ｉｃｅ−ｃｏｌｄ ５０ｍＭ Tris
buffer，ｐＨ７．４（０．０１％ＢＳＡ含有）で洗浄
した。さらに、回収した細胞の放射活性をガンマー・カ
ウンターにより測定し総結合量とした。また，非特異的
結合量は，配列番号６記載の受容体は１０μＭ，ＥＰ
５６１４９６号記載の受容体は１μＭの非標識ＣＣＫ８
存在下での標識ＣＣＫ８結合量とした。総結合量から非
特異的結合量を差し引き［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８の特異的結
合量を求めた。結果を図２に示す。

【００４５】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の薬理学特
性は、各種リガンドの阻害活性を検討することにより評
価することができる。本発明のイヌＣＣＫ−Ｂ／ガスト
リン受容体及びＥＰ ５６１４９６号記載のＣＣＫ−Ｂ
／ガストリン受容体の薬理学特性を図１に示し、本発明
ヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体及びＥＰ ５６１４
９６号記載のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の薬理学特
性を図２に示した。この結果より本発明受容体を検討
し、本発明の受容体は先行のＥＰ ５６１４９６号記載
の受容体に比べリガンドとの親和性が異なることがわか
った。本発明のイヌ及びヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受
容体はＥＰ ５６１４９６号記載の受容体に比べガスト
リン−１７よりもＣＣＫ−８に特異的であった。この結
果は、本発明の受容体が、既報のＥＰ ５６１４９６号
記載の受容体とは、異なる生体機能を制御している可能
性を示唆している。

【００４６】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体拮抗薬のス
クリーニング方法 ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体拮抗薬は上記［¹²⁵Ｉ］
ＣＣＫ８結合実験の反応系に、被験薬物を添加すること
によりスクリーニングできる。具体的には、［¹²⁵Ｉ］
ＣＣＫ８と各濃度の被験薬物を上記ＣＯＳ細胞懸濁液に
添加し、３７℃で６０−８０分間インキュベート後、セ
ル・ハーベスターを用いて細胞をグラス・フィルター上
に回収し、ｉｃｅ−ｃｏｌｄ ５０ｍＭ Tris buffe
r，ｐＨ７．４（０．０１％ＢＳＡ含有）で洗浄する。
さらに、回収した細胞の放射活性をガンマー・カウンタ
ーにより測定し総結合量とする。また，非特異的結合量
は，１μＭ非標識ＣＣＫ８存在下での標識ＣＣＫ８結合
量とする。総結合量から非特異的結合量を差し引き［
¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８の特異的結合量を求める。拮抗力の強
さは、［¹²⁵Ｉ］ＣＣＫ８結合を阻害する活性で表すこ
とができ、阻害活性の高い薬物を選択することにより，
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体拮抗薬をスクリーニング
することができる。

【００４７】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１２２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATGATGCCCA CAGAATTGGA GCTGGCCATT AGGGTCACCC TTTATGCAGT GATCTTTCTG 60 ATGAGTGTTG GAGGAAATGT GCTCATCATC GTGGTCCTGG GACTGAGTCG CCGGCTGAGG 120 ACTGTCACCA ACGCCTTCCT GCTCTCACTG GCAGTCAGCG ACCTCCTGCT GGCTGTGGCT 180 TGCATGCCCT TCACCCTCCT GCCCAATCTC ATGGGCACGT TCATCTTTGG CACAGTCGTC 240 TGTAAGGCAG TTTCCTACCT CATGGGGGTG TCTGTGAGTG TGTCCACACT AAGCCTTGTG 300 GCCATCGCCC TGGAGCGATA CAGCGCCATC TGCCGGCCGC TACAAGCACG CGTGTGGCAG 360 ACGCGTTCCC ATGCGGCTCG TGTGATCATC GCCACTTGGA TGCTCTCTGG ACTGCTCATG 420 GTGCCCTACC CGGTGTACAC CGCCGTACAG CCCGCAGGAG GGGCCCGGGC GCTGCAGTGC 480 GTGCATCGTT GGCCCAGTGC GCGTGTCCGC CAAACCTGGT CGGTACTGCT GCTCCTGCTT 540 TTGTTCTTCG TCCCAGGCGT GGTTATGGCT GTGGCCTACG GGCTCATCTC CCGCGAGCTC 600 TACTTAGGGC TTCGCTTCGA CGAGGACAGC GACAGCGAAA GCCGAGTCCG AAGCCAAGGA 660 GGGCTGCGGG GTGGGGCGGG ACCAGGTCCT GCCCCCCCCA ATGGGAGTTG CCGGCCGGAG 720 GGCGGGCTGG CTGGCGAGGA CGGCGACGGC TGCTACGTGC AGCTTCCGCG CTCGCGTCAG 780 ACCCTGGAGC TGTCCGCGCT GACCGCGCCC ACTCCTGGGC CCGGAGGTGG CCCCCGGCCC 840 TACCAGGCCA AGCTGTTGGC CAAGAAGCGC GTGGTGCGGA TGCTGCTGGT GATCGTCGTG 900 CTTTTTTTCC TGTGTTGGTT GCCACTGTAT AGTGCCAACA CGTGGCGTGC CTTCGACAGC 960 TCTGGTGCAC ACCGCGCACT TTCAGGAGCG CCAATCTCTT TCATCCACTT GCTGAGCTAC 1020 GCCTCAGCCT GCGTCAACCC CCTGGTCTAC TGCTTCATGC ACCGTCGCTT CCGCCAGGCC 1080 TGCCTTGAGA CGTGTGCCCG CTGCTGCCCC AGGCCTCCAC GAGCTCGCCC CCGGCCCCTT 1140 CCAGACGAGG ACCCTCCCAC CCCTTCCATT GCTTCACTGT CCAGACTGAG CTACACCACC 1200 ATCAGCACGC TAGGGCCTGG CTGA 1224

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：１３３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATGGAGCTGC TAAAGCTGAA CCGGAGCGCG CAGGGGTCCG GAGCCGGGCC GGGGGCTTCC 60 CTGTGCCGCG CGGGGGGCGC CCTCCTCAAC AGCAGCGGTG CGGGCAATCT CAGCTGCGAG 120 CCGCCTCGCC TCCGCGGAGC CGGGACACGA GAATTGGAGC TGGCCATTAG GGTCACCCTT 180 TATGCAGTGA TCTTTCTGAT GAGTGTTGGA GGAAATGTGC TCATCATCGT GGTCCTGGGA 240 CTGAGTCGCC GGCTGAGGAC TGTCACCAAC GCCTTCCTGC TCTCACTGGC AGTCAGCGAC 300 CTCCTGCTGG CTGTGGCTTG CATGCCCTTC ACCCTCCTGC CCAATCTCAT GGGCACGTTC 360 ATCTTTGGCA CAGTCGTCTG GGTGTCTGTG AGTGTGTCCA CACTAAGCCT TGTGGCCATC 420 GCCCTGGAGC GATACAGCGC CATCTGCCGG CCGCTACAAG CACGCGTGTG GCAGACGCGT 480 TCCCATGCGG CTCGTGTGAT CATCGCCACT TGGATGCTCT CTGGACTGCT CATGGTGCCC 540 TACCCGGTGT ACACCGCCGT ACAGCCCGCA GGAGGGGCCC GGGCGCTGCA GTGCGTGCAT 600 CGTTGGCCCA GTGCGCGTGT CCGCCAAACC TGGTCGGTAC TGCTGCTCCT GCTTTTGTTC 660 TTCGTCCCAG GCGTGGTTAT GGCTGTGGCC TACGGGCTCA TCTCCCGCGA GCTCTACTTA 720 GGGCTTCGCT TCGACGAGGA CAGCGACAGC GAAAGCCGAG TCCGAAGCCA AGGAGGGCTG 780 CGGGGTGGGG CGGGACCAGG TCCTGCCCCC CCCAATGGGA GTTGCCGGCC GGAGGGCGGG 840 CTGGCTGGCG AGGACGGCGA CGGCTGCTAC GTGCAGCTTC CGCGCTCGCG TCAGACCCTG 900 GAGCTGTCCG CGCTGACCGC GCCCACTCCT GGGCCCGGAG GTGGCCCCCG GCCCTACCAG 960 GCCAAGCTGT TGGCCAAGAA GCGCGTGGTG CGGATGCTGC TGGTGATCGT CGTGCTTTTT 1020 TTCCTGTGTT GGTTGCCACT GTATAGTGCC AACACGTGGC GTGCCTTCGA CAGCTCTGGT 1080 GCACACCGCG CACTTTCAGG AGCGCCAATC TCTTTCATCC ACTTGCTGAG CTACGCCTCA 1140 GCCTGCGTCA ACCCCCTGGT CTACTGCTTC ATGCACCGTC GCTTCCGCCA GGCCTGCCTT 1200 GAGACGTGTG CCCGCTGCTG CCCCAGGCCT CCACGAGCTC GCCCCCGGCC CCTTCCAGAC 1260 GAGGACCCTC CCACCCCTTC CATTGCTTCA CTGTCCAGAC TGAGCTACAC CACCATCAGC 1320 ACGCTAGGGC CTGGCTGA 1338

【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：４０７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Met Pro Thr Glu Leu Glu Leu Ala Ile Arg Val Thr Leu Tyr Ala 1 5 10 15 Val Ile Phe Leu Met Ser Val Gly Gly Asn Val Leu Ile Ile Val Val 20 25 30 Leu Gly Leu Ser Arg Arg Leu Arg Thr Val Thr Asn Ala Phe Leu Leu 35 40 45 Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Leu Ala Val Ala Cys Met Pro Phe 50 55 60 Thr Leu Leu Pro Asn Leu Met Gly Thr Phe Ile Phe Gly Thr Val Val 65 70 75 80 Cys Lys Ala Val Ser Tyr Leu Met Gly Val Ser Val Ser Val Ser Thr 85 90 95 Leu Ser Leu Val Ala Ile Ala Leu Glu Arg Tyr Ser Ala Ile Cys Arg 100 105 110 Pro Leu Gln Ala Arg Val Trp Gln Thr Arg Ser His Ala Ala Arg Val 115 120 125 Ile Ile Ala Thr Trp Met Leu Ser Gly Leu Leu Met Val Pro Tyr Pro 130 135 140 Val Tyr Thr Ala Val Gln Pro Ala Gly Gly Ala Arg Ala Leu Gln Cys 145 150 155 160 Val His Arg Trp Pro Ser Ala Arg Val Arg Gln Thr Trp Ser Val Leu 165 170 175 Leu Leu Leu Leu Leu Phe Phe Val Pro Gly Val Val Met Ala Val Ala 180 185 190 Tyr Gly Leu Ile Ser Arg Glu Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Asp Glu 195 200 205 Asp Ser Asp Ser Glu Ser Arg Val Arg Ser Gln Gly Gly Leu Arg Gly 210 215 220 Gly Ala Gly Pro Gly Pro Ala Pro Pro Asn Gly Ser Cys Arg Pro Glu 225 230 235 240 Gly Gly Leu Ala Gly Glu Asp Gly Asp Gly Cys Tyr Val Gln Leu Pro 245 250 255 Arg Ser Arg Gln Thr Leu Glu Leu Ser Ala Leu Thr Ala Pro Thr Pro 260 265 270 Gly Pro Gly Gly Gly Pro Arg Pro Tyr Gln Ala Lys Leu Leu Ala Lys 275 280 285 Lys Arg Val Val Arg Met Leu Leu Val Ile Val Val Leu Phe Phe Leu 290 295 300 Cys Trp Leu Pro Leu Tyr Ser Ala Asn Thr Trp Arg Ala Phe Asp Ser 305 310 315 320 Ser Gly Ala His Arg Ala Leu Ser Gly Ala Pro Ile Ser Phe Ile His 325 330 335 Leu Leu Ser Tyr Ala Ser Ala Cys Val Asn Pro Leu Val Tyr Cys Phe 340 345 350 Met His Arg Arg Phe Arg Gln Ala Cys Leu Glu Thr Cys Ala Arg Cys 355 360 365 Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Arg Pro Arg Pro Leu Pro Asp Glu Asp 370 375 380 Pro Pro Thr Pro Ser Ile Ala Ser Leu Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr 385 390 395 400 Ile Ser Thr Leu Gly Pro Gly 405

【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：４４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Glu Leu Leu Lys Leu Asn Arg Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ala Gly 1 5 10 15 Pro Gly Ala Ser Leu Cys Arg Ala Gly Gly Ala Leu Leu Asn Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Gly Asn Leu Ser Cys Glu Pro Pro Arg Leu Arg Gly Ala Gly 35 40 45 Thr Arg Glu Leu Glu Leu Ala Ile Arg Val Thr Leu Tyr Ala Val Ile 50 55 60 Phe Leu Met Ser Val Gly Gly Asn Val Leu Ile Ile Val Val Leu Gly 65 70 75 80 Leu Ser Arg Arg Leu Arg Thr Val Thr Asn Ala Phe Leu Leu Ser Leu 85 90 95 Ala Val Ser Asp Leu Leu Leu Ala Val Ala Cys Met Pro Phe Thr Leu 100 105 110 Leu Pro Asn Leu Met Gly Thr Phe Ile Phe Gly Thr Val Val Trp Val 115 120 125 Ser Val Ser Val Ser Thr Leu Ser Leu Val Ala Ile Ala Leu Glu Arg 130 135 140 Tyr Ser Ala Ile Cys Arg Pro Leu Gln Ala Arg Val Trp Gln Thr Arg 145 150 155 160 Ser His Ala Ala Arg Val Ile Ile Ala Thr Trp Met Leu Ser Gly Leu 165 170 175 Leu Met Val Pro Tyr Pro Val Tyr Thr Ala Val Gln Pro Ala Gly Gly 180 185 190 Ala Arg Ala Leu Gln Cys Val His Arg Trp Pro Ser Ala Arg Val Arg 195 200 205 Gln Thr Trp Ser Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Phe Val Pro Gly 210 215 220 Val Val Met Ala Val Ala Tyr Gly Leu Ile Ser Arg Glu Leu Tyr Leu 225 230 235 240 Gly Leu Arg Phe Asp Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ser Arg Val Arg Ser 245 250 255 Gln Gly Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly Pro Gly Pro Ala Pro Pro Asn 260 265 270 Gly Ser Cys Arg Pro Glu Gly Gly Leu Ala Gly Glu Asp Gly Asp Gly 275 280 285 Cys Tyr Val Gln Leu Pro Arg Ser Arg Gln Thr Leu Glu Leu Ser Ala 290 295 300 Leu Thr Ala Pro Thr Pro Gly Pro Gly Gly Gly Pro Arg Pro Tyr Gln 305 310 315 320 Ala Lys Leu Leu Ala Lys Lys Arg Val Val Arg Met Leu Leu Val Ile 325 330 335 Val Val Leu Phe Phe Leu Cys Trp Leu Pro Leu Tyr Ser Ala Asn Thr 340 345 350 Trp Arg Ala Phe Asp Ser Ser Gly Ala His Arg Ala Leu Ser Gly Ala 355 360 365 Pro Ile Ser Phe Ile His Leu Leu Ser Tyr Ala Ser Ala Cys Val Asn 370 375 380 Pro Leu Val Tyr Cys Phe Met His Arg Arg Phe Arg Gln Ala Cys Leu 385 390 395 400 Glu Thr Cys Ala Arg Cys Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Arg Pro Arg 405 410 415 Pro Leu Pro Asp Glu Asp Pro Pro Thr Pro Ser Ile Ala Ser Leu Ser 420 425 430 Arg Leu Ser Tyr Thr Thr Ile Ser Thr Leu Gly Pro Gly 435 440 445

【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：１１４６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATGAGCGTTG GAGGAAATAT GCTCATCATC GTGGTCCTGG GACTGAGCCG CCGCCTGAGG 60 ACTGTCACCA ATGCCTTCCT CCTCTCACTG GCAGTCAGCG ACCTCCTGCT GGCTGTGGCT 120 TGCATGCCCT TCACCCTCCT GCCCAATCTC ATGGGCACAT TCATCTTTGG CACCGTCATC 180 TGCAAGGCGG TTTCCTACCT CATGGGGGTG TCTGTGAGTG TGTCCACGCT AAGCCTCGTG 240 GCCATCGCAC TGGAGCGGTA CAGCGCCATC TGCCGACCAC TGCAGGCACG AGTGTGGCAG 300 ACGCGCTCCC ACGCGGCTCG CGTGATTGTA GCCACGTGGC TGCTGTCCGG ACTACTCATG 360 GTGCCCTACC CCGTGTACAC TGTCGTGCAA CCAGTGGGGC CTCGTGTGCT GCAGTGCGTG 420 CATCGCTGGC CCAGTGCGCG GGTCCGCCAG ACCTGGTCCG TACTGCTGCT TCTGCTCTTG 480 TTCTTCATCC CGGGTGTGGT TATGGCCGTG GCCTACGGGC TTATCTCTCG CGAGCTCTAC 540 TTAGGGCTTC GCTTTGACGG CGACAGTGAC AGCGACAGCC AAAGCAGGGT CCGAAACCAA 600 GGCGGGCTGC CAGGGGCTGT TCACCAGAAC GGGCGTTGCC GGCCTGAGAC TGGCGCGGTT 660 GGCGAAGACA GCGATGGCTG CTACGTGCAA CTTCCACGTT CCCGGCCTGC CCTGGAGCTG 720 ACGGCGCTGA CGGCTCCTGG GCCGGGATCC GGCTCCCGGC CCACCCAGGC CAAGCTGCTG 780 GCTAAGAAGC GCGTGGTGCG AATGTTGCTG GTGATCGTTG TGCTTTTTTT TCTGTGTTGG 840 TTGCCAGTTT ATAGTGCCAA CACGTGGCGC GCCTTTGATG GCCCGGGTGC ACACCGAGCA 900 CTCTCGGGTG CTCCTATCTC CTTCATTCAC TTGCTGAGCT ACGCCTCGGC CTGTGTCAAC 960 CCCCTGGTCT ACTGCTTCAT GCACCGTCGC TTTCGCCAGG CCTGCCTGGA AACTTGCGCT 1020 CGCTGCTGCC CCCGGCCTCC ACGAGCTCGC CCCAGGGCTC TTCCCGATGA GGACCCTCCC 1080 ACTCCCTCCA TTGCTTCGCT GTCCAGGCTT AGCTACACCA CCATCAGCAC ACTGGGCCCT 1140 GGCTGA 1146

【００５２】配列番号：６ 配列の長さ：３８１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Ser Val Gly Gly Asn Met Leu Ile Ile Val Val Leu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Arg Arg Leu Arg Thr Val Thr Asn Ala Phe Leu Leu Ser Leu Ala Val 20 25 30 Ser Asp Leu Leu Leu Ala Val Ala Cys Met Pro Phe Thr Leu Leu Pro 35 40 45 Asn Leu Met Gly Thr Phe Ile Phe Gly Thr Val Ile Cys Lys Ala Val 50 55 60 Ser Tyr Leu Met Gly Val Ser Val Ser Val Ser Thr Leu Ser Leu Val 65 70 75 80 Ala Ile Ala Leu Glu Arg Tyr Ser Ala Ile Cys Arg Pro Leu Gln Ala 85 90 95 Arg Val Trp Gln Thr Arg Ser His Ala Ala Arg Val Ile Val Ala Thr 100 105 110 Trp Leu Leu Ser Gly Leu Leu Met Val Pro Tyr Pro Val Tyr Thr Val 115 120 125 Val Gln Pro Val Gly Pro Arg Val Leu Gln Cys Val His Arg Trp Pro 130 135 140 Ser Ala Arg Val Arg Gln Thr Trp Ser Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 145 150 155 160 Phe Phe Ile Pro Gly Val Val Met Ala Val Ala Tyr Gly Leu Ile Ser 165 170 175 Arg Glu Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Asp Gly Asp Ser Asp Ser Asp 180 185 190 Ser Gln Ser Arg Val Arg Asn Gln Gly Gly Leu Pro Gly Ala Val His 195 200 205 Gln Asn Gly Arg Cys Arg Pro Glu Thr Gly Ala Val Gly Glu Asp Ser 210 215 220 Asp Gly Cys Tyr Val Gln Leu Pro Arg Ser Arg Pro Ala Leu Glu Leu 225 230 235 240 Thr Ala Leu Thr Ala Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ser Arg Pro Thr Gln 245 250 255 Ala Lys Leu Leu Ala Lys Lys Arg Val Val Arg Met Leu Leu Val Ile 260 265 270 Val Val Leu Phe Phe Leu Cys Trp Leu Pro Val Tyr Ser Ala Asn Thr 275 280 285 Trp Arg Ala Phe Asp Gly Pro Gly Ala His Arg Ala Leu Ser Gly Ala 290 295 300 Pro Ile Ser Phe Ile His Leu Leu Ser Tyr Ala Ser Ala Cys Val Asn 305 310 315 320 Pro Leu Val Tyr Cys Phe Met His Arg Arg Phe Arg Gln Ala Cys Leu 325 330 335 Glu Thr Cys Ala Arg Cys Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Arg Pro Arg 340 345 350 Ala Leu Pro Asp Glu Asp Pro Pro Thr Pro Ser Ile Ala Ser Leu Ser 355 360 365 Arg Leu Ser Tyr Thr Thr Ile Ser Thr Leu Gly Pro Gly 370 375 380

【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴ ＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧ ２０

【００５４】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧ ＣＣＣＴＡＧＣＧＴＧ ２０

【００５５】配列番号：９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＣＡＡＣＡＧＣＡ ＧＣＡＧＴＧＴＧＧ １９

【００５６】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＡＧＧＣＡＴＴＧ ＧＴＧＡＣＡＧＴＣＣ ２０

【００５７】配列番号：１１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡ ＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴ ＣＣ
２２

【００５８】配列番号：１２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＴＣＴＡＴＧＴＧＴ ＧＴＧＡＧＡＧＧＣＡ ＧＧ
２２

【００５９】配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧ ＡＴＧＣＴＣＡＣＧＧ ２０

【００６０】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＡＴＣＡＧＡＧＧＣ ＡＴＧＣＣＴＣＣＴＴ ２０

【図面の簡単な説明】

【図１】イヌ由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の薬理
学特性を示す。図中，ＡはＥＰ ５６１４９６号記載の
受容体，Ｂは配列番号３に示す受容体である。

【図２】ヒト由来ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の薬理
学特性を示す。図中，ＡはＥＰ ５６１４９６号記載の
受容体，Ｂは配列番号６に示す受容体である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/04 6807−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＬ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＬ (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号３、配列番号４及び配
   列番号６に記載のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた
   １つのポリペプチドであるコレシストキニン−Ｂ／ガス
   トリン受容体。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配
   列からなるポリペプチドであるコレシストキニン−Ｂ／
   ガストリン受容体。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
   列からなるポリペプチドであるコレシストキニン−Ｂ／
   ガストリン受容体。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配
   列からなるポリペプチドであるコレシストキニン−Ｂ／
   ガストリン受容体。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号３，配列番号４及び配
   列番号６に記載のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた
   １つのポリペプチドをコードするコレシストキニン−Ｂ
   ／ガストリン受容体の遺伝子。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配
   列からなるポリペプチドをコードするコレシストキニン
   −Ｂ／ガストリン受容体の遺伝子。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
   列からなるポリペプチドをコードするコレシストキニン
   −Ｂ／ガストリン受容体の遺伝子。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配
   列からなるポリペプチドをコードするコレシストキニン
   −Ｂ／ガストリン受容体の遺伝子。
9. 【請求項９】 配列表の配列番号１に記載のコレシスト
   キニン−Ｂ／ガストリン受容体をコードする遺伝子。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号２に記載のコレシス
    トキニン−Ｂ／ガストリン受容体をコードする遺伝子。
11. 【請求項１１】 配列表の配列番号５に記載のコレシス
    トキニン−Ｂ／ガストリン受容体をコードする遺伝子。
12. 【請求項１２】 請求項５記載の遺伝子が組み込まれた
    ベクター
13. 【請求項１３】 請求項１２記載のベクターで形質転換
    された細胞
14. 【請求項１４】 請求項１記載のポリペプチドを用い、
    コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体拮抗薬をスク
    リーニングする方法。