JPH08252088A

JPH08252088A - クロストリジウム属細菌の培養方法

Info

Publication number: JPH08252088A
Application number: JP7059075A
Authority: JP
Inventors: Kiyotaka Otoari; 清高音在; Nobuhiro Taguchi; 信洋田口; Itsuki Fujita; 逸樹藤田; Tsuneo Asai; 常夫浅井
Original assignee: Nippoh Chemicals Co Ltd
Current assignee: Nippoh Chemicals Co Ltd
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1996-10-01

Abstract

(57)【要約】【目的】菌の増殖の促進および増殖した菌体の溶菌の
防止を計ることによって、純粋で高密度な菌を培養し、
さらに効率的に菌体を得ることが可能なクロストリジウ
ム属細菌の培養方法を提供する。【構成】アルカリ水溶液を用いて、培地のｐＨを５．
０〜６．０の範囲内に保つことを特徴とする、クロスト
リジウム属細菌の培養方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なクロストリジウ
ム属細菌の培養方法に関するものである。さらに詳しく
述べると、本発明は、クロストリジウム属細菌の溶菌を
防止し、該細菌の培養を高密度化することができ、かつ
純粋な菌体を効率よく得ることが可能であるクロストリ
ジウム属細菌の培養方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】クロストリジウム属細菌は、グラム陽性
桿菌で、主に、ヒトや他の動物の腸管内および土壌中な
どに分布する偏性嫌気性、芽胞形成性のバシラセアエ(B
acillaceae) 科の細菌である。これらのクロストリジウ
ム属細菌の中には、抗腫瘍性剤（特開昭５５−１１８，
４１７号及び特開昭５７−１４５，８１５号）、抗コク
シジウム症剤（特開昭５９−４６，２１０号）、免疫賦
活剤（特開平４−２１７，９２２号）及び抗体増強用製
剤（特開平５−２２７，８９９号）等のヒトを含む動物
用の医薬品、食品、家畜用飼料（特開平３−６８，６６
０号）や肥料などの様々な分野で利用される産業的に有
用な菌株が数多く含まれている。

【０００３】従来、クロストリジウム属に属する細菌の
菌体を得るためには、ペプトン、酵母エキスおよびグル
コースからなる培地（ＰＹＧ培地）などを培地として用
いる静置培養が行われてきた（チェンアワー−ヤング
(Chen Hour-Young) ら、ジャパニーズ・ジャーナル・オ
ブ・メディカル・マイコロジー(Jpn. J. Med. Mycol.)
、２８巻、ページ２６２〜２６９、１９８７年）。ク
ロストリジウム属に属する細菌は、培養中の菌の自己溶
解作用、いわゆる溶菌が見られ、溶菌してしまうことで
得られる培養液の最終的な菌密度は必ずしも高くなかっ
た。加えて、嫌気性発酵では酸を産生することが多く、
培養中の培地のｐＨが低下して、培地成分を多く加えて
も、産生された酸によって菌の増殖が阻害を受け、培養
における菌密度はそれほど上がらないという欠点があっ
た。そこで、ｐＨの低下を防ぐためアルカリなどの添加
が考えられたが、中和量のアルカリをあらかじめ培地に
加えると、培地のｐＨは菌の増殖が困難な程、アルカリ
性を呈してしまうという問題がある。また、特公昭３７
−８，３００号において記載されているように、培地の
ｐＨが下がってからアルカリを添加することによる中和
方法は、添加するアルカリ液が溶存酸素や攪拌下による
培地嫌気度の低下等、嫌気培養に対して悪影響を及ぼす
と考えられており、さらに上記中和方法は一定間隔で手
動によりｐＨの調整を行うため、ｐＨが目的とする範囲
を逸脱し溶菌が起こり十分な菌体重量が得られないとい
う欠点をも有する。

【０００４】さらに、上記問題点を考慮して、不溶性の
アルカリを利用して培地のｐＨを調整する方法が提案さ
れた（特公昭５２−４８，１６９号）。この方法は、コ
ーンスターチ、アミノ酸液及び炭酸カルシウム（ＣａＣ
Ｏ₃）からなる培地を用いてクロストリジウム属細菌の
培養を行なう方法であり、コーンスターチによって酸の
生成速度を遅くし、さらにＣａＣＯ₃によって生成する
酸を適度に中和するという特長を有すると記載された方
法である。しかしながら、上記培養方法は、ＣａＣＯ₃
は不溶性であるため中和効率が悪く、過剰のＣａＣＯ₃
を添加する必要性から集菌時に菌体との分離が困難であ
るばかりでなく、配管の詰まりやタンクの汚れなどの原
因となるという問題点を有している。さらに、上記方法
では純粋な菌体が得られないという欠点をも有する。

【０００５】このため、従来に用いられるクロストリジ
ウム属細菌培養方法としては、３７℃で２４〜４８時間
静置培養する方法が用いられてきたが、この方法では得
られる菌体量が乾燥菌体重量で０．３〜１．６ｇ／リッ
トル程度と少ないという問題点がある。

【０００６】したがって、純粋なクロストリジウム属細
菌が効率よく得られる培養方法の開発が望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、菌の増殖の促進および増殖した菌体の溶菌の防
止を計ることによって、高密度な菌を培養し、さらに効
率的に純粋な菌体を得ることが可能なクロストリジウム
属細菌の培養方法を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、炭酸カル
シウムに代わる中和剤を使用したクロストリジウム属細
菌の培養方法について鋭意検討を行った結果、水酸化ナ
トリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸
化カリウム及び炭酸カリウムからなる群より選ばれたア
ルカリの水溶液で培地のｐＨを４．５〜６．５の範囲内
に保ちながら、クロストリジウム属細菌を培養すること
によって、上記目的が達成されることが分かり、これに
より、本発明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、上記目的は、アルカリ水溶液を
用いて、培地のｐＨを４．５〜６．５の範囲内に保つこ
とを特徴とする、クロストリジウム属細菌の培養方法に
よって達成される。

【００１０】本発明は、上記培地のｐＨを５．０〜６．
０の範囲内に保つ、クロストリジウム属細菌の培養方法
を示すものである。本発明は、上記アルカリが水酸化ナ
トリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸
化カリウムおよび炭酸カリウムからなる群より選ばれた
少なくとも１つである、クロストリジウム属細菌の培養
方法を示すものである。本発明はまた、クロストリジウ
ム属細菌の培養温度を１５〜３０℃の範囲内に設定す
る、クロストリジウム属細菌の培養方法を示すものであ
る。本発明はさらに、クロストリジウム属細菌の培養温
度を、菌密度が最高に達するまでは３０〜５０℃の範囲
内に、さらに、菌密度が最高に達した後は０〜３０℃の
範囲内に設定する、クロストリジウム属細菌の培養方法
を示すものである。

【００１１】

【作用】本発明のクロストリジウム属細菌の培養方法
は、培養中の培養温度および培地のｐＨを一定範囲内に
維持することによって菌の増殖を促進し、かつ溶菌を防
止することを特徴とするものである。

【００１２】以下、本発明を詳しく説明する。

【００１３】本発明の培養方法において用いられる細菌
は、クロストリジウム属に属するものであれば特に制限
されないが、具体的には、クロストリジウム・ブチリカ
ム(Clostridium butyricum) 、クロストリジウム・ディ
フィシル(Clostridium difficile) 、クロストリジウム
・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)、クロストリ
ジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)
、クロストリジウム・パスツリアヌム(Clostridium pa
steurianum)、クロストリジウム・エーロフェチダム(Cl
ostridium aerofoetidum)、クロストリジウム・アセト
ブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリ
ジウム・バイファーメンタンス(Clostridium biferment
ans)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium bot
ulinum) 、クロストリジウム・カダヴェリス(Clostridi
um cadaveris) 、クロストリジウム・カピトヴェイル(C
lostridium capitovale)、クロストリジウム・カーニス
(Clostridium carnis)、クロストリジウム・ショウベイ
(Clostridium chauvoei)、クロストリジウム・クロモゲ
ネス(Clostridium chromogenes) 、クロストリジウム・
コクレアリウム(Clostridium cochlearium) 、クロスト
リジウム・ファラックス(Clostridium fallax)、クロス
トリジウム・ガンモサム(Clostridium gammosum)、クロ
ストリジウム・ヘモリチカム(Clostridium haemolyticu
m)、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium h
istolyticum)、クロストリジウム・インノミナタム(Clo
stridium innominatum) 、クロストリジウム・リモーサ
ム(Clostridium limosum) 、クロストリジウム・ミクロ
スポラム(Clostridium microsporum) 、クロストリジウ
ム・マルチファーメンタンス(Clostridium multifermen
tans) 、クロストリジウム・ニグリフィカンス(Clostri
dium nigrificans) 、クロストリジウム・ノビイ(Clost
ridium novyi) 、クロストリジウム・パラボツリナム(C
lostridium parabotulinum) 、クロストリジウム・パラ
プトリフィカム(Clostridium paraputrificum)、クロス
トリジウム・パラーパーフリンジェンス(Clostridium p
araperfringens) 、クロストリジウム・パーフリンジェ
ンス(Clostridium perfringens) 、クロストリジウム・
シュードテタニカム(Clostridium pseudotetanicum) 、
クロストリジウム・ラモーサム(Clostridium ramosum)
、クロストリジウム・セプチカム(Clostridium septic
um)、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium
sphenoides)、クロストリジウム・ソルデリィイ(Clostr
idium sordellii) 、クロストリジウム・テール(Clostr
idium tale)、クロストリジウム・ターチウム(Clostrid
ium tertium) 、クロストリジウム・テタニ(Clostridiu
m tetani)、クロストリジウム・テタノイデス(Clostrid
ium tetanoides)、クロストリジウム・テタノモルファ
ム(Clostridium tetanomorphum) 、クロストリジウム・
サーモサッカロリチカム(Clostridium thermosaccharol
yticum) 、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostri
dium beijerinckii)、クロストリジウム・プロピオニク
ム(Clostridium propionicum) 、クロストリジウム・プ
ツリフィーカム(Clostridium putrificum)、およびクロ
ストリジウム・サーモアセチクム(Clostridium thermoa
ceticum)等が挙げられる。これらの細菌のうち、クロス
トリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum) 、ク
ロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficil
e) 、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sp
orogenes)、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostr
idium tyrobutyricum) およびクロストリジウム・パス
ツリアヌム(Clostridium pasteurianum)が好ましく使用
される。また、クロストリジウム・ブチリカム(Clostri
dium butyricum) ＦＥＲＭＢＰ−２７８９、ＡＴＣＣ
１９３９８、ＡＴＣＣ８６０、クロストリジウム・
ディフィシル(Clostridium difficile) ＦＥＲＭＢＰ
−２８７７、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostri
dium sporogenes)ＦＥＲＭＰ−９５７０、クロストリ
ジウム亜種(Clostridium sp.) ＦＥＲＭＰ−１３４８
４、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium t
yrobutyricum) ＡＴＣＣ２５７５５およびクロストリジ
ウム・パスツリアヌム(Clostridium pasteurianum)ＡＴ
ＣＣ６０１３が特に好ましく使用される。

【００１４】本発明の培養方法で使用する培地は、使用
するクロストリジウム属細菌の種類等によっても異なる
が、使用するクロストリジウム属細菌が資化しうる炭素
源、適量の窒素源、無機塩及びビタミン類などのその他
の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然
培地のいずれでもよい。

【００１５】例えば、本発明による培地中で使用される
炭素源の例として、使用する菌株が資化できる炭素源で
あれば特に制限されない。炭素源としては、必ずしも糖
に制限されないが、菌体の増殖を考慮すると、使用する
細菌が利用可能な糖または糖を含むものが好ましく使用
される。使用できる炭素源の具体例としては、資化性を
考慮して、セロビオース、グルコース、フルクトース、
ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、
メリビオース、ラフィノース、リボース、サリシン、ス
ターチ、シュクロース、トレハロース、キシロース、デ
キストリン、グリセリン、ペクチン、グルコマンナンお
よび糖蜜等が挙げられる。これらの炭素源のうち、グル
コース、フルクトース、シュクロース及び糖蜜が好まし
く使用される。上記した炭素源を、使用するクロストリ
ジウム属細菌の資化性を考慮して、１種または２種以上
選択して使用してもよい。なお、表１に、先に列挙した
クロストリジウム属細菌のうち特に好ましく使用される
とされた細菌の炭素源（糖及びアルコール）の資化能を
示す。この際、以下のようにして各細菌を培養し、炭素
源の利用能を試験した。ペプトン、酵母エキス、表１に
示される炭素源を各１％含む培地に表１に示される細菌
をそれぞれ１０⁶個／ｍｌの菌体濃度になるように接種
し、３７℃で４８時間の静置培養した後に、ｐＨ指示薬
（ブロムクレゾールグリーン）を滴下して酸の産生を測
定することにより炭素源の利用能を試験した。

【００１６】

【表１】

【００１７】表１からも、グルコース、フルクトースお
よびシュクロースが炭素源として好ましく使用されるこ
とが分かった。

【００１８】また、上記炭素源の添加濃度は、使用する
細菌や炭素源の種類および使用する培地の炭素源以外の
培地組成等によっても異なるが、通常、重量比で、０．
５〜５％、好ましくは、１〜３％である。

【００１９】本発明において使用される窒素源およびビ
タミン類としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母
エキス、味液等の大豆及び小麦の加水分解物、大豆粉
末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コー
ンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加
水分解物等の有機窒素化合物、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム
塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、亜硝酸塩および尿素
等の無機窒素化合物が挙げられる。これらの窒素源のう
ち、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー及
び味液が好ましく使用される。上記した窒素源及びビタ
ミン類を、使用するクロストリジウム属細菌の生育を向
上させるために、１種または２種以上選択して使用して
もよい。なお、表２に、先に列挙したクロストリジウム
属細菌のうち特に好ましく使用されるとされた細菌を表
２に示すような炭素源、窒素源及びビタミン類を含む培
地で生育させた際の増殖を示す。この際、以下のように
して各細菌を培養し、各菌株の増殖を測定した。グルコ
ース、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカ
ー、味液及び糖蜜を表２に示されるようにして組み合わ
せた培地に、表２に示される各細菌をそれぞれ１０⁶個
／ｍｌの菌体濃度になるように接種し、３７℃で４８時
間の静置培養した後に、トーマ式血球計算盤によって菌
数を測定した。その結果を表２に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】表２より、すべての培地について、１０⁸
個／ｍｌを越えるような良好な生育が認められた。ま
た、いずれの菌株においても、その増殖には糖の添加が
有効であることが分かった。

【００２２】また、上記窒素源の添加濃度は、使用する
細菌や窒素源の種類および使用する培地の窒素源以外の
培地組成等によっても異なるが、窒素源を多く含むペプ
トンを使用する際には、重量比で、通常、０．５〜４
％、好ましくは、１〜３％であり、窒素源及びビタミン
類を多く含む味液やコーンスティープリカーを使用する
際には、重量比で、通常、０．５〜６％、好ましくは、
１〜４％であり、さらに、ビタミン類を多く含む酵母エ
キスを使用する際には、重量比で、通常、０．２〜４
％、好ましくは、０．５〜３％である。

【００２３】本発明において使用できる無機塩として
は、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウ
ム、カリウム、モリブデン、ストロンチウム、ホウ素、
銅、鉄、スズ及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸
塩、酪酸塩、プロピオン酸塩及び酢酸塩等から選ばれた
１種または２種以上を使用することができる。また、培
地中に、必要に応じて、消泡剤、植物油、界面活性剤、
血液及び血液成分、ビタミン類、抗生物質などの薬剤、
植物または動物ホルモンなどの生理活性物質等を適宜添
加してもよい。

【００２４】本発明において行われる培養の条件は、本
発明に使用するクロストリジウム属細菌の生育の範囲
（ｐＨや温度等）等の生理学的性質によって異なるが、
クロストリジウム属細菌は偏性嫌気性であるため、通気
しない、または窒素若しくは炭酸ガスを通気しながら、
または培地中に還元剤を加えることにより酸化還元電位
を下げるなどによって嫌気的条件下培養されることが必
要である。その際の培養条件は、使用される微生物の生
育の範囲、培地の組成や培養法によって適宜選択され、
本菌株が増殖できる条件であれば特に制限されない。具
体的には、培養温度は、菌の増殖が可能でかつ増殖した
菌が溶菌しにくい温度である１５〜３０℃、好ましくは
２０〜３０℃である。または、培養温度を３０℃以上に
設定することも可能である。ただし、３０℃以上の温度
で培養する際は、培養液の菌密度が最高値に達するまで
は培養温度を３０〜５０℃、好ましくは３０〜４３℃に
設定し、菌密度が最高値に達した後は培養温度を０〜３
０℃、好ましくは４〜３０℃に制御することが必要であ
る。

【００２５】また、本発明において、クロストリジウム
属細菌の培養は、アルカリ水溶液によって培地のｐＨを
設定ｐＨの範囲内に抑えながら行われることが必須であ
る。なお、「設定ｐＨ」は、培養期間中に予め設定され
ている培地のｐＨを意味し、「設定ｐＨの範囲」とは、
培養期間中に許容されるｐＨの範囲であり、一般的に
は、設定ｐＨ±許容差で表わす。本発明によると、設定
ｐＨは、通常、４．５〜６．５、好ましくは５．０〜
６．０の範囲内で設定され、設定ｐＨの範囲は、設定ｐ
Ｈ±０．３、望ましくは設定ｐＨ±０．２である。

【００２６】さらに、本発明において、培養を行う間の
培地のｐＨは、菌の接種時では中性付近、好ましくは
６．５〜７．５とし、その後菌の増殖時においてはアル
カリ水溶液を加えて、酸素が混入しないように緩やかに
攪拌しながら設定ｐＨの範囲内に入るよう維持する。こ
のように菌の接種時および菌の増殖時のｐＨを制御する
ことによって、菌密度を飛躍的に増大させるとともに、
溶菌を防止することができるという特長がある。

【００２７】発酵途中で生成する酸を上記した範囲のｐ
Ｈに中和する際に使用されるアルカリ水溶液のアルカリ
源としては、水に溶解しやすい水酸化ナトリウム（Ｎａ
ＯＨ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ₃）、炭酸ナ
トリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）
及び炭酸カリウム（Ｋ₂ＣＯ₃）等が挙げられ、これら
のうち、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及び炭
酸ナトリウムが好ましく使用される。また、水溶液にお
ける上記アルカリ濃度は、極力嫌気度を低下させないた
めに、比較的濃い、すなわち、重量比で、１〜３０％、
好ましくは５〜１０％である。また、発酵途中で生成す
る酸をアルカリ水溶液によって中和する際には培地の攪
拌を伴うが、培養の初期段階等アルカリ水溶液を添加し
ない段階では酸素が混入しないように攪拌を行なわず、
増殖中にｐＨが低下し始め、中和が必要となる設定ｐＨ
になって初めて、酸素が混入しない程度に緩やかに攪拌
することが、培地の嫌気度の低下を防ぐために必要であ
る。上記を満足するための攪拌速度は、４〜５０ｒｐ
ｍ、好ましくは１０〜３０ｒｐｍである。

【００２８】また、上記ｐＨの制御方法は、一般的に細
菌の培養に用いられている既知のｐＨの制御方法を用い
ることができる。本発明において使用できるｐＨの制御
方法としては、ｐＨコントローラーを用いる方法が好ま
しく使用される。

【００２９】本発明において、クロストリジウム属細菌
の初期培養濃度は、クロストリジウム属細菌が生育でき
る範囲であれば特に制限されず、通常クロストリジウム
属細菌の培養で行われるものと同様である。具体的に
は、通常、１０³〜１０⁸個／ｍｌ、好ましくは１０⁵
〜１０⁷個／ｍｌである。

【００３０】以下、本発明のクロストリジウム属細菌の
培養方法の好ましい一実施態様として、クロストリジウ
ム・ブチリカムＦＥＲＭＢＰ−２７８９株を使用し
た場合における培養例を示す。

【００３１】１％ペプトン、１．５％酵母エキス、
３％グルコースからなる培地（ＰＹＧ培地）にクロス
トリジウム・ブチリカムＦＥＲＭＢＰ−２７８９株
を１０⁶個／ｍｌになるように接種し、２７℃の培養温
度で２０ｒｐｍで緩やかに攪拌し、ｐＨコントローラー
を用いて５％水酸化ナトリウム水溶液で設定ｐＨの範囲
が５．５±０．２になるように制御しながら、２０時間
培養する。

【００３２】上記した培養方法を用いることによって、
ｐＨと温度の制御により菌の増殖を促すとともに溶菌を
防止し、クロストリジウム属細菌の高密度培養を達成す
る技術、さらには、菌密度が最高値に達した後の培養液
のｐＨと温度を管理することで溶菌を防止して、集菌時
まで菌密度を保持する技術が確立できた。

【００３３】

【実施例】以下、実施例および比較例によって本発明を
さらに具体的に説明する。

【００３４】実施例１ペプトン、酵母エキス、グルコース各１％からなる培地
（ＰＹＧ培地）にクロストリジウム・ブチリカムＦＥ
ＲＭＢＰ−２７８９株を初期の菌体濃度が１０⁶個／
ｍｌとなるように接種し、３７℃の培養温度で２０ｒｐ
ｍで緩やかに攪拌し、ｐＨコントローラーを用いて５％
ＮａＯＨ水溶液で設定ｐＨの範囲が６．０±０．２にな
るように培地のｐＨを制御しながら、菌密度が最高時
（アルカリ消費終了時）になるまで培養した。その後、
温度を各々３２、２７、２２、１５、４℃に保ち、２０
時間まで培養し、菌密度が最高に達した後の溶菌による
菌密度の低下を培養液１リットル当たりの乾燥菌体重量
（以下、単に「乾燥菌体重量」と称する）で測定した。
結果を表３に示す。

【００３５】

【表３】

【００３６】表３より、菌密度が最高に達した後、なる
べく低温に培養温度を保つことにより、溶菌による菌密
度の低下を防止することができ、特に３２℃という作用
中で規定された温度を越えると急激に乾燥菌体重量が減
ることが示された。

【００３７】実施例２実施例１で使用したのと同様のＰＹＧ（各１％）培地に
クロストリジウム・ブチリカムＦＥＲＭＢＰ−２７
８９株を初期の菌体濃度が１０⁶個／ｍｌとなるように
接種し、培養温度をそれぞれ３７℃と２７℃に設定し、
２０ｒｐｍで緩やかに攪拌し、ｐＨコントローラーを用
いて５％ＮａＯＨ水溶液で設定ｐＨの範囲を６．０±
０．２に制御しながら培養し、菌密度が最高に達したと
きの乾燥菌体重量、さらに２０時間まで培養したときの
乾燥菌体重量をそれぞれ測定した。結果を表４に示す。

【００３８】

【表４】

【００３９】表４から、培養温度を３０℃以下の２７℃
に保つことにより、菌密度が最高に達した後の溶菌をか
なり防止することができることが分かった。

【００４０】実施例３実施例１で使用したのと同様のＰＹＧ（各１％）培地に
クロストリジウム・ブチリカムＦＥＲＭＢＰ−２７
８９株を初期の菌体濃度が１０⁶個／ｍｌになるように
接種し、ｐＨコントローラーを用いて、２０ｒｐｍでゆ
るく攪拌しながら５％ＮａＯＨ水溶液によって培地の設
定ｐＨをそれぞれ７．０、６．５、６．０、５．５、
５．０、４．５（設定ｐＨの範囲は各設定ｐＨ±０．
２）に制御しながら、２７℃で２０時間培養した後、乾
燥菌体重量を測定した。結果を表５に示す。

【００４１】

【表５】

【００４２】表５に示されるように、ｐＨ５．５で最大
の乾燥菌体重量２．１５ｇが得られた。また、培養時の
培地の設定ｐＨは、５．０〜６．０の範囲内に設定され
ることが好ましいことも示された。

【００４３】実施例４実施例１で使用したのと同様のＰＹＧ（各１％）培地に
クロストリジウム・ブチリカムＦＥＲＭＢＰ−２７
８９株を初期の菌体濃度が１０⁶個／ｍｌになるように
接種し、ｐＨコントローラーを用いて、２０ｒｐｍでゆ
るく攪拌しながら培地のｐＨを、それぞれ５％ＮａＯＨ
水溶液、１０％Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液、１０％ＮａＨＣＯ
₃水溶液によって５．５に制御し、２７℃で２０時間培
養した後、乾燥菌体重量を測定した。結果を表６に示
す。

【００４４】

【表６】

【００４５】表６から、ＮａＯＨ、Ｎａ₂ＣＯ₃、Ｎａ
ＨＣＯ₃をアルカリ源として用いた場合においても同様
の結果が得られることから、いずれのアルカリも好まし
く使用できる。

【００４６】実施例５、比較例１〜３１％ペプトン、１．５％酵母エキス、３％グルコースか
らなるＰＹＧ培地に、クロストリジウム・ブチリカム
ＦＥＲＭＢＰ−２７８９、ＡＴＣＣ１９３９８、ＡＴ
ＣＣ８６０、クロストリジウム・ディフィシルＦＥＲ
ＭＢＰ−２８７７、クロストリジウム・スポロゲネス
ＦＥＲＭＰ−９５７０、クロストリジウム亜種Ｆ
ＥＲＭＰ−１３４８４、クロストリジウム・チロブチ
リカムＡＴＣＣ２５７５５、クロストリジウム・パスツ
リアヌムＡＴＣＣ６０１３の各細菌を、中和剤を加
えない静置培養法（比較例１）によって、または対数増
殖期に入る前までは２時間おきに対数増殖期には２０〜
３０分おきに培地のｐＨを測定し培地のｐＨが５〜６の
範囲内になるように５％ＮａＯＨ水溶液を添加するアル
カリ添加培養法（比較例２）によって、または中和剤と
してＣａＣＯ₃を重量比で１％の濃度で加えた静置培養
法（比較例３）によって、またはｐＨコントローラーを
用いて２０ｒｐｍでゆるく攪拌しながら５％ＮａＯＨ水
溶液で設定ｐＨの範囲を５．５±０．２に制御するｐＨ
制御培養法（実施例５）によって、それぞれ培養を行
い、それぞれの場合における乾燥菌体重量を測定、比較
した。なお、本実施例および比較例では、菌体の初期濃
度はすべて１０⁶個／ｍｌであり、また、静置培養法お
よびアルカリ添加培養法では３７℃で２０時間後に、ｐ
Ｈ制御培養法では２７℃で２０時間後に、それぞれ乾燥
菌体重量を測定した。また、ＣａＣＯ₃を１％濃度で加
えた静置培養法では、乾燥菌体重量の測定前に５０％
（容積比）Ｈ₂ＳＯ₄水溶液を用いて培養液のｐＨを
２．０に調節することによって、不溶のＣａＣＯ₃を溶
解した後に乾燥菌体重量を測定した。結果を表７に示
す。

【００４７】

【表７】

【００４８】表７から、いずれの菌株についても、従来
の培養法と比較すると、ｐＨ制御培養法で飛躍的な乾燥
菌体重量の増加が認められることが示された。また、ｐ
Ｈ制御培養法では、ＣａＣＯ₃を含まない純粋な菌体が
得られるという長所もある。さらに、特公昭３７−８，
３００号に開示されている方法であるアルカリ添加培養
法は、培養温度が３７℃であるおよび一定間隔でｐＨの
調整を行うためｐＨが目的とする範囲を逸脱することが
ありこれにより溶菌が起こることから、結果として得ら
れる乾燥菌体重量が本発明の方法であるｐＨ制御培養法
に比べてかなり少ない値しか得られない。

【００４９】比較例４実施例１で使用したのと同様のＰＹＧ（各１％）培地
に、クロストリジウム・ブチリカムＦＥＲＭＢＰ−
２７８９を初期の菌体濃度が１０⁶個／ｍｌになるよう
に接種し、３７℃で培養を行なった。この際、ｐＨコン
トローラーを用い培地を攪拌しながら５％ＮａＯＨ水溶
液の滴下により、培養による培地ｐＨを６．０±０．２
に維持しながら細菌を培養し、２時間ごとに乾燥菌体重
量を測定した。

【００５０】その結果、培養６時間で乾燥菌体重量は
１．８２ｇを示したが、その後、溶菌により菌密度の低
下が認められ、２０時間では乾燥菌体重量０．９４ｇま
で減少した。これらの結果から、培養温度を３７℃に変
更した以外は実施例１と同様にしてｐＨを制御して培養
したにもかかわらず溶菌が起こり乾燥菌体重量が著しく
減少したことから、３７℃の培養温度で継続的に培養を
行なうことは、得られる乾燥菌体重量を減少させてしま
い不利と考えられる。

【００５１】比較例５実施例１で使用したのと同様のＰＹＧ（各１％）培地
に、クロストリジウム・ブチリカムＦＥＲＭＢＰ−
２７８９を初期の菌体濃度が１０⁶個／ｍｌになるよう
に接種し、３７℃で静置培養を行い、２時間ごとに乾燥
菌体重量を測定した。

【００５２】この結果、培養６時間で乾燥菌体重量は
０．７０ｇとなり、培養２０時間後においても乾燥菌体
重量は０．７４ｇであり、ほとんど増加は認められなか
った。また、培養２０時間後のｐＨは４．４であった。

【００５３】

【発明の効果】以上述べたように、本発明のクロストリ
ジウム属細菌の培養方法は、アルカリ水溶液を用いて、
培地のｐＨを４．５〜６．５の特定の範囲内に保つこと
を特徴とする方法である。したがって、本発明の培養方
法を用いることによって、クロストリジウム属細菌の増
殖中に生成する代謝産物、特に酸による細菌の増殖阻止
を受けることなく、培地成分を有効利用して細菌が増殖
できる。また、培養温度を１５〜３０℃に保つ、あるい
は３０〜５０℃で培養した後培養温度を０〜３０℃に下
げるという特定の条件を設定することによって、溶菌に
よる乾燥菌体重量の減少を抑制することができる。した
がって、本発明の方法によって生育した菌体量は、乾燥
菌体重量で従来方法である静置培養法と比較した場合、
約２〜１０倍という高い値を示し、かつ得られる菌体は
ＣａＣＯ₃を含まない純粋な菌体として生産できる。

【００５４】したがって、本発明によりアルカリ水溶液
で培養中に産生される酸を特定範囲内に維持することに
よって、菌の増殖を促進するとともに、温度、培地ｐＨ
を菌の増殖は可能であるが溶菌の起こりにくい条件に設
定する培養技術が確立することが可能となった。

【００５５】さらに、上記したような溶菌を防止できる
技術は、一旦生育した培養液中の菌体を、以降の操作で
菌密度を低下させることなく保持できるという作業上に
おいても有用な技術であり、工業的なクロストリジウム
属細菌の培養方法および菌体製造方法の一環として好適
に使用できるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者浅井常夫千葉県夷隅郡岬町岩熊3296

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アルカリ水溶液を用いて、培地のｐＨを
４．５〜６．５の範囲内に保つことを特徴とする、クロ
ストリジウム属細菌の培養方法。
【請求項２】該培地のｐＨを５．０〜６．０の範囲内
に保つ、請求項１に記載のクロストリジウム属細菌の培
養方法。
【請求項３】該アルカリが水酸化ナトリウム、炭酸ナ
トリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウムおよび
炭酸カリウムからなる群より選ばれた少なくとも１つで
ある、請求項１または２に記載のクロストリジウム属細
菌の培養方法。
【請求項４】クロストリジウム属細菌の培養温度を１
５〜３０℃の範囲内に設定する、請求項１から３のいず
れかに記載のクロストリジウム属細菌の培養方法。
【請求項５】クロストリジウム属細菌の培養温度を、
菌密度が最高に達するまでは３０〜５０℃の範囲内に、
さらに、菌密度が最高に達した後は０〜３０℃の範囲内
に設定する、請求項１から３のいずれかに記載のクロス
トリジウム属細菌の培養方法。