JPH08196270A - リボソーム不活性化物質高含有カルスの作出方法および該カルスからのリボソーム不活性化物質の製造方法 - Google Patents
リボソーム不活性化物質高含有カルスの作出方法および該カルスからのリボソーム不活性化物質の製造方法Info
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- JPH08196270A JPH08196270A JP7030247A JP3024795A JPH08196270A JP H08196270 A JPH08196270 A JP H08196270A JP 7030247 A JP7030247 A JP 7030247A JP 3024795 A JP3024795 A JP 3024795A JP H08196270 A JPH08196270 A JP H08196270A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ニチニチ草カルスにアグロバクテリウム属に
属する微生物を感染させ、リボソーム不活性化物質の含
有量を高めることを特徴とするリボソーム不活性化物質
高含有カルスの作出方法並びにリボソーム不活性化物質
高含有カルスに、ポリビニルピロリドン含有リン酸緩衝
液を加え、ホモジナイズした後、固液分離して得た活性
タンパク質含有抽出液をクロマトグラフィーで分画し、
リボソーム不活性化物質を採取することを特徴とするリ
ボソーム不活性化物質の製造方法。 【効果】 本発明によれば、リボソーム不活性化物質高
含有のニチニチ草カルスを作出することができる。ま
た、このカルスからリボソーム不活性化物質を高収率で
得ることができる。このリボソーム不活性化物質は抗ウ
ィルス作用があり、抗エイズおよび抗ガン作用が期待さ
れており、エイズおよびガンの治療に大きく貢献するこ
とが可能である。
属する微生物を感染させ、リボソーム不活性化物質の含
有量を高めることを特徴とするリボソーム不活性化物質
高含有カルスの作出方法並びにリボソーム不活性化物質
高含有カルスに、ポリビニルピロリドン含有リン酸緩衝
液を加え、ホモジナイズした後、固液分離して得た活性
タンパク質含有抽出液をクロマトグラフィーで分画し、
リボソーム不活性化物質を採取することを特徴とするリ
ボソーム不活性化物質の製造方法。 【効果】 本発明によれば、リボソーム不活性化物質高
含有のニチニチ草カルスを作出することができる。ま
た、このカルスからリボソーム不活性化物質を高収率で
得ることができる。このリボソーム不活性化物質は抗ウ
ィルス作用があり、抗エイズおよび抗ガン作用が期待さ
れており、エイズおよびガンの治療に大きく貢献するこ
とが可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リボソーム不活性化物
質高含有カルスの作出方法および該カルスからのリボソ
ーム不活性化物質の製造方法に関する。本発明に係るリ
ボソーム不活性化物質は、タンパク質合成の場であるリ
ボソームを不活性化し、タンパク質合成を阻害する作用
を有する新規な活性タンパク質である。
質高含有カルスの作出方法および該カルスからのリボソ
ーム不活性化物質の製造方法に関する。本発明に係るリ
ボソーム不活性化物質は、タンパク質合成の場であるリ
ボソームを不活性化し、タンパク質合成を阻害する作用
を有する新規な活性タンパク質である。
【０００２】
【従来の技術】リボソーム不活性化タンパク質（Riboso
me Inactivating Protein; RIPs)としては、Trichosant
hes kirilowii から作出されるトリコサンチン（Tricho
santin）[Yeung H.W. etc.: Int. J. Pept. Protein Re
s., 31,265-268(1988)] やPhytolacca americanaから作
出されるPokewood antiviral protein [Irvin J.D. et
c.: Arch. Biochem. Biophys., 169,522-528(1975)]が
知られている。トリコサンチンは、抗エイズ活性が認め
られ、既に臨床試験に入っているが、その薬理作用に対
する評価は定まっていない[Byers V.S. etc.: AIDS, 4,
1189-1196(1990)],[Kahn J.D. etc.: AIDS, 4,1197-120
4(1990)] 。
me Inactivating Protein; RIPs)としては、Trichosant
hes kirilowii から作出されるトリコサンチン（Tricho
santin）[Yeung H.W. etc.: Int. J. Pept. Protein Re
s., 31,265-268(1988)] やPhytolacca americanaから作
出されるPokewood antiviral protein [Irvin J.D. et
c.: Arch. Biochem. Biophys., 169,522-528(1975)]が
知られている。トリコサンチンは、抗エイズ活性が認め
られ、既に臨床試験に入っているが、その薬理作用に対
する評価は定まっていない[Byers V.S. etc.: AIDS, 4,
1189-1196(1990)],[Kahn J.D. etc.: AIDS, 4,1197-120
4(1990)] 。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、特定の植物
由来のカルスを用いてRIPsを高収率で得ることを目的と
している。本発明者らは、ニチニチ草（Catharanthus r
oseuse）由来のカルスを培養して得られるリボソーム不
活性化タンパク質が既知のRIPsとは異なる新規な物質で
あることを見出し、ニチニチ草由来のカルスから新規な
RIP's を高収率で得る方法を確立して本発明を完成した
のである。
由来のカルスを用いてRIPsを高収率で得ることを目的と
している。本発明者らは、ニチニチ草（Catharanthus r
oseuse）由来のカルスを培養して得られるリボソーム不
活性化タンパク質が既知のRIPsとは異なる新規な物質で
あることを見出し、ニチニチ草由来のカルスから新規な
RIP's を高収率で得る方法を確立して本発明を完成した
のである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載の本発明
は、ニチニチ草カルスにアグロバクテリウム属に属する
微生物を感染させ、リボソーム不活性化物質の含有量を
高めることを特徴とするリボソーム不活性化物質高含有
カルスの作出方法である。また、請求項６に記載の本発
明は、リボソーム不活性化物質高含有カルスに、ポリビ
ニルピロリドン含有リン酸緩衝液を加え、ホモジナイズ
した後、固液分離して得た活性タンパク質含有抽出液を
クロマトグラフィーで分画し、リボソーム不活性化物質
を採取することを特徴とするリボソーム不活性化物質の
製造方法である。
は、ニチニチ草カルスにアグロバクテリウム属に属する
微生物を感染させ、リボソーム不活性化物質の含有量を
高めることを特徴とするリボソーム不活性化物質高含有
カルスの作出方法である。また、請求項６に記載の本発
明は、リボソーム不活性化物質高含有カルスに、ポリビ
ニルピロリドン含有リン酸緩衝液を加え、ホモジナイズ
した後、固液分離して得た活性タンパク質含有抽出液を
クロマトグラフィーで分画し、リボソーム不活性化物質
を採取することを特徴とするリボソーム不活性化物質の
製造方法である。
【０００５】本発明者らは、ニチニチ草，ヨウシュヤマ
ゴボウ，ダイズなどの様々な種類のカルスについてRIPs
活性を測定し、これらの中から該活性の高かったニチニ
チ草カルスを選択し、本発明に供した。ニチニチ草カル
スの調製は常法により行えばよく、特別な条件を要しな
い。
ゴボウ，ダイズなどの様々な種類のカルスについてRIPs
活性を測定し、これらの中から該活性の高かったニチニ
チ草カルスを選択し、本発明に供した。ニチニチ草カル
スの調製は常法により行えばよく、特別な条件を要しな
い。
【０００６】調製したニチニチ草カルスは、２週間毎に
新鮮なＳＨ培地（組成は第１表に示した）に移植して継
代培養を行う。具体的には、ＳＨ寒天培地に移植し、２
０〜２８℃、好ましくは２５℃で培養し、約２週間毎に
継代する。なお、寒天培地の代わりに液体培地で継代培
養する場合、振盪の回転数１００〜２００ｒｐｍ、好ま
しくは１２０ｒｐｍで培養する。
新鮮なＳＨ培地（組成は第１表に示した）に移植して継
代培養を行う。具体的には、ＳＨ寒天培地に移植し、２
０〜２８℃、好ましくは２５℃で培養し、約２週間毎に
継代する。なお、寒天培地の代わりに液体培地で継代培
養する場合、振盪の回転数１００〜２００ｒｐｍ、好ま
しくは１２０ｒｐｍで培養する。
【０００７】
【表１】
【０００８】次に、ニチニチ草カルスを形質転換させる
ために用いる感染菌として、本発明ではアグロバクテリ
ウム属に属する微生物を使用する。該微生物としては、
アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhiz
ogenes）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ag
robacterium tumefaciens)などが用いられる。アグロバ
クテリウム属微生物をＹＥＢ培地（組成は第２表に示し
た）やＬＢ培地等の寒天培地または液体培地に植菌し、
好ましくは暗条件下、２０〜２８℃、好ましくは２５℃
で、約２週間毎に継代培養を行う。液体培地を用いる場
合は振盪培養を行う。
ために用いる感染菌として、本発明ではアグロバクテリ
ウム属に属する微生物を使用する。該微生物としては、
アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhiz
ogenes）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ag
robacterium tumefaciens)などが用いられる。アグロバ
クテリウム属微生物をＹＥＢ培地（組成は第２表に示し
た）やＬＢ培地等の寒天培地または液体培地に植菌し、
好ましくは暗条件下、２０〜２８℃、好ましくは２５℃
で、約２週間毎に継代培養を行う。液体培地を用いる場
合は振盪培養を行う。
【０００９】
【表２】
【００１０】アグロバクテリウム属微生物によりニチニ
チ草カルスを形質転換させるには、該アグロバクテリウ
ム属微生物を前述した液体培地で好ましくは暗条件下、
２０〜２８℃、好ましくは２５℃で数時間〜数日間、好
ましくは１〜２日間、振盪培養を行って得た培養液にニ
チニチ草カルスを浸漬する。この場合、カルスには傷を
付けておき、感染し易くする。また、カルスは液体培地
量に対して１〜５０％、好ましくは１０〜２０％量の割
合で添加し、前記したと同じ条件でさらに数分〜数日
間、好ましくは１日培養し、アグロバクテリウム属微生
物を感染させる。
チ草カルスを形質転換させるには、該アグロバクテリウ
ム属微生物を前述した液体培地で好ましくは暗条件下、
２０〜２８℃、好ましくは２５℃で数時間〜数日間、好
ましくは１〜２日間、振盪培養を行って得た培養液にニ
チニチ草カルスを浸漬する。この場合、カルスには傷を
付けておき、感染し易くする。また、カルスは液体培地
量に対して１〜５０％、好ましくは１０〜２０％量の割
合で添加し、前記したと同じ条件でさらに数分〜数日
間、好ましくは１日培養し、アグロバクテリウム属微生
物を感染させる。
【００１１】その後、培養液を濾過してカルスを取り出
し、抗生物質、特にクラフォランまたはカルベニシリン
を培地量に対して０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましく
は０．５〜１ｍｇ／ｍｌを添加したＭＳ寒天培地（組成
は第３表に示した）に移し、好ましくは暗条件下，２０
〜２８℃、好ましくは２５℃で１日〜数週間の継代培養
を数回行うことにより微生物を完全に死滅させる。この
カルスをさらにホルモンフリーのＭＳ培地の寒天または
液体培地にて、前記したカルスの継代培養と同様の方法
で１ヶ月毎に継代培養を行う。この操作はすべて無菌的
に行う必要がある。
し、抗生物質、特にクラフォランまたはカルベニシリン
を培地量に対して０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましく
は０．５〜１ｍｇ／ｍｌを添加したＭＳ寒天培地（組成
は第３表に示した）に移し、好ましくは暗条件下，２０
〜２８℃、好ましくは２５℃で１日〜数週間の継代培養
を数回行うことにより微生物を完全に死滅させる。この
カルスをさらにホルモンフリーのＭＳ培地の寒天または
液体培地にて、前記したカルスの継代培養と同様の方法
で１ヶ月毎に継代培養を行う。この操作はすべて無菌的
に行う必要がある。
【００１２】
【表３】
【００１３】このようにして得られた形質転換カルスを
ホモジネイトし、水またはリン酸緩衝液で抽出すること
によって、リボソーム不活性化物質を分離、採取するこ
とができる。なお、カルスをホモジネイトするに先立
ち、カルス１ｇあたり０．０５〜０．３ｇ、好ましくは
０．１ｇのポリビニルピロリドンを含むリン酸緩衝液
（５〜５０ｍＭ）を加えることが望ましい。ホモジネイ
トした後、固液分離して得た抽出液に水またはリン酸緩
衝液を加え、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分
間）してリボソーム不活性化物質を含む上清を得る。こ
の物質を精製する場合は、クロマトグラフィー等の常法
手段を用いて実施すればよく、これにより精製されたリ
ボソーム不活性化物質を得ることができる。
ホモジネイトし、水またはリン酸緩衝液で抽出すること
によって、リボソーム不活性化物質を分離、採取するこ
とができる。なお、カルスをホモジネイトするに先立
ち、カルス１ｇあたり０．０５〜０．３ｇ、好ましくは
０．１ｇのポリビニルピロリドンを含むリン酸緩衝液
（５〜５０ｍＭ）を加えることが望ましい。ホモジネイ
トした後、固液分離して得た抽出液に水またはリン酸緩
衝液を加え、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分
間）してリボソーム不活性化物質を含む上清を得る。こ
の物質を精製する場合は、クロマトグラフィー等の常法
手段を用いて実施すればよく、これにより精製されたリ
ボソーム不活性化物質を得ることができる。
【００１４】
【実施例】次に、本発明を実施例によって詳細に説明す
るが、本発明はこれらにより制限されるものではない。 実施例１ １．ニチニチ草カルスの調製 ニチニチ草（C. roseuse）の茎および葉を流水中でよく
洗浄し、７０％エタノール溶液に１０秒間浸漬した。次
に、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液に５分間浸漬して
殺菌後、滅菌水でよく洗浄した。この材料を１〜１．５
ｃｍの長さの切片にしてＳＨ培地（第１表）に置床し、
２５℃、明条件下で１週間培養することによってカルス
を得た。誘導されたカルスは、試験に供するまで、２週
間毎に新鮮なＳＨ培地に移植し、２５℃で継代培養を行
った。
るが、本発明はこれらにより制限されるものではない。 実施例１ １．ニチニチ草カルスの調製 ニチニチ草（C. roseuse）の茎および葉を流水中でよく
洗浄し、７０％エタノール溶液に１０秒間浸漬した。次
に、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液に５分間浸漬して
殺菌後、滅菌水でよく洗浄した。この材料を１〜１．５
ｃｍの長さの切片にしてＳＨ培地（第１表）に置床し、
２５℃、明条件下で１週間培養することによってカルス
を得た。誘導されたカルスは、試験に供するまで、２週
間毎に新鮮なＳＨ培地に移植し、２５℃で継代培養を行
った。
【００１５】２．アグロバクテリウム属微生物による感
染 アグロバクテリウム・リゾゲネスＡ４菌株をＹＥＢ寒天
培地（第２表）に接種して２５℃、１２０ｒｐｍの条件
で少なくとも２週間毎に継代し、２０日間振盪培養し、
培養液を得た。この培養液に、前記カルスにナイフ等で
傷をつけたものを培養液量の１〜２０％の割合で添加し
て浸漬し、１０〜２０分間放置して感染させた。次い
で、該カルスをクラフォランを含むホルモンフリーのＭ
Ｓ寒天培地（第３表）に移植し、２５℃で培養し、毛状
根を発生させ、７〜１０日毎に新鮮な培地に移植して継
代培養を行った。これを３度繰り返してアグロバクテリ
ウム・リゾゲネスＡ４菌株を完全に死滅させた。その
後、該カルスをクラフォランを含まないホルモンフリー
のＭＳ寒天培地に移植し、２５℃で継代培養を行った。
染 アグロバクテリウム・リゾゲネスＡ４菌株をＹＥＢ寒天
培地（第２表）に接種して２５℃、１２０ｒｐｍの条件
で少なくとも２週間毎に継代し、２０日間振盪培養し、
培養液を得た。この培養液に、前記カルスにナイフ等で
傷をつけたものを培養液量の１〜２０％の割合で添加し
て浸漬し、１０〜２０分間放置して感染させた。次い
で、該カルスをクラフォランを含むホルモンフリーのＭ
Ｓ寒天培地（第３表）に移植し、２５℃で培養し、毛状
根を発生させ、７〜１０日毎に新鮮な培地に移植して継
代培養を行った。これを３度繰り返してアグロバクテリ
ウム・リゾゲネスＡ４菌株を完全に死滅させた。その
後、該カルスをクラフォランを含まないホルモンフリー
のＭＳ寒天培地に移植し、２５℃で継代培養を行った。
【００１６】実施例２ 実施例１で得られたＲＩＰｓ含有カルスをスパチュラで
丁寧に取り出し、新鮮カルス重量１ｇあたり０．１ｇの
ポリビニルピロリドンを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７）を添加し、ホモジナイザーにてホモジナイズ
した。得られた抽出液に新鮮カルス重量１ｇあたり２ｍ
ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、遠心分離（１００
００ｒｐｍ、３０分間）を行い、得られた上清をポアサ
イズ０．２μｍのフィルターで濾過し、イオン交換クロ
マトグラフィーに供した。担体であるS-Sepharose Fast
-Flow resin をカラム（１６ｍｌ）に充填し、２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化してから、上記タンパ
ク質抽出液をロードした。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７）で洗浄後、０−１Ｍ ＮａＣｌで直線的にグラジェ
ントをかけ溶出した。溶出液の流量は２ｍｌ／分で、２
８０ｎｍでモニターし、４ｍｌ毎に分別した。フラクシ
ョン１−３、４−１６、１７−２７、３７−４４、４５
−５２を図１に示したようにそれぞれまとめ、フラクシ
ョン２８〜３６は各々別個に測定に供した。
丁寧に取り出し、新鮮カルス重量１ｇあたり０．１ｇの
ポリビニルピロリドンを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７）を添加し、ホモジナイザーにてホモジナイズ
した。得られた抽出液に新鮮カルス重量１ｇあたり２ｍ
ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、遠心分離（１００
００ｒｐｍ、３０分間）を行い、得られた上清をポアサ
イズ０．２μｍのフィルターで濾過し、イオン交換クロ
マトグラフィーに供した。担体であるS-Sepharose Fast
-Flow resin をカラム（１６ｍｌ）に充填し、２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化してから、上記タンパ
ク質抽出液をロードした。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７）で洗浄後、０−１Ｍ ＮａＣｌで直線的にグラジェ
ントをかけ溶出した。溶出液の流量は２ｍｌ／分で、２
８０ｎｍでモニターし、４ｍｌ毎に分別した。フラクシ
ョン１−３、４−１６、１７−２７、３７−４４、４５
−５２を図１に示したようにそれぞれまとめ、フラクシ
ョン２８〜３６は各々別個に測定に供した。
【００１７】各画分のタンパク量をマイクロブラッドフ
ォード法[Bradford M.M.: Anal. Biochem., 72,248-254
(1976)] を用いて測定し、その結果を図１に示した。な
お、タンパク量測定のスタンダードには、牛血清アルブ
ミンを用いた。ＲＩＰｓ活性は、Promega's in vitro t
ranslation kit（Promega's 製）を用いて測定し、結果
を図２に示した。図中、２０ｍＭ ｐｈｏｓはリン酸緩
衝液,ｆｔｃｓはトリコサンチンを示す。フラクション
２９と３０は、トリコサンチンとほぼ同等のＲＩＰｓ活
性を示した。フラクション２９と３０のタンパク量はそ
れぞれ０．０４５ｍｇ／ｍｌ，０．０２３ｍｇ／ｍｌで
あり、タンパクｍｇあたりのＲＩＰｓ活性はトリコサン
チンの活性よりも高いことを示している。また、タンパ
クを含んでいないフラクション４５−５２もトリコサン
チンとほぼ同等のＲＩＰｓ活性を示し、タンパク以外に
もリボソーム不活性化活性を有する物質が存在すること
が認められた。
ォード法[Bradford M.M.: Anal. Biochem., 72,248-254
(1976)] を用いて測定し、その結果を図１に示した。な
お、タンパク量測定のスタンダードには、牛血清アルブ
ミンを用いた。ＲＩＰｓ活性は、Promega's in vitro t
ranslation kit（Promega's 製）を用いて測定し、結果
を図２に示した。図中、２０ｍＭ ｐｈｏｓはリン酸緩
衝液,ｆｔｃｓはトリコサンチンを示す。フラクション
２９と３０は、トリコサンチンとほぼ同等のＲＩＰｓ活
性を示した。フラクション２９と３０のタンパク量はそ
れぞれ０．０４５ｍｇ／ｍｌ，０．０２３ｍｇ／ｍｌで
あり、タンパクｍｇあたりのＲＩＰｓ活性はトリコサン
チンの活性よりも高いことを示している。また、タンパ
クを含んでいないフラクション４５−５２もトリコサン
チンとほぼ同等のＲＩＰｓ活性を示し、タンパク以外に
もリボソーム不活性化活性を有する物質が存在すること
が認められた。
【００１８】活性のあったフラクションを電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）し、銀染色を行った。なお、分子量の
スタンダードにはSDS-PAGE Standards Low Range (BioR
ad製）を用いた。その結果、メインのバンドは分子量７
０ｋＤａであった。トリコサンチンの分子量は２３〜３
２ｋＤａもしくは６０〜６５ｋＤａと報告されており、
本発明のＲＩＰｓは既知のＲＩＰｓとは異なることが証
明された。
ＤＳ−ＰＡＧＥ）し、銀染色を行った。なお、分子量の
スタンダードにはSDS-PAGE Standards Low Range (BioR
ad製）を用いた。その結果、メインのバンドは分子量７
０ｋＤａであった。トリコサンチンの分子量は２３〜３
２ｋＤａもしくは６０〜６５ｋＤａと報告されており、
本発明のＲＩＰｓは既知のＲＩＰｓとは異なることが証
明された。
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば、ニチニチ草カルスにア
グロバクテリウム属に属する微生物を感染させて形質転
換したリボソーム不活性化物質高含有のカルスを作出す
ることができる。また、このカルスからリボソーム不活
性化物質を高収率で得ることができる。このリボソーム
不活性化物質は抗ウィルス作用があり、抗エイズおよび
抗ガン作用が期待されており、エイズおよびガンの治療
に大きく貢献することが可能である。
グロバクテリウム属に属する微生物を感染させて形質転
換したリボソーム不活性化物質高含有のカルスを作出す
ることができる。また、このカルスからリボソーム不活
性化物質を高収率で得ることができる。このリボソーム
不活性化物質は抗ウィルス作用があり、抗エイズおよび
抗ガン作用が期待されており、エイズおよびガンの治療
に大きく貢献することが可能である。
【図１】 マイクロブラッドフォード法によるタンパク
量の測定結果を示した図である。
量の測定結果を示した図である。
【図２】 Promega's in vitro translation kitを用い
て測定したＲＩＰｓ活性の結果を示した図である。
て測定したＲＩＰｓ活性の結果を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 35/78 ＡＤＹ Ｐ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 高橋 英樹 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13−46 塩水 港精糖株式会社内 (72)発明者 斉藤 香子 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13−46 塩水 港精糖株式会社内 (72)発明者 近藤 征男 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13−46 塩水 港精糖株式会社内 (72)発明者 原 耕三 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13−46 塩水 港精糖株式会社内
Claims (7)
- 【請求項１】 ニチニチ草カルスにアグロバクテリウム
属に属する微生物を感染させ、リボソーム不活性化物質
の含有量を高めることを特徴とするリボソーム不活性化
物質高含有カルスの作出方法。 - 【請求項２】 ニチニチ草カルスが、洗浄、殺菌処理し
たニチニチ草の茎および／または葉の切片をＳＨ培地で
培養して得たものである請求項１記載の作出方法。 - 【請求項３】 アグロバクテリウム属に属する微生物
が、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium
rhizogenes）またはアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens ）である請求項１記
載の作出方法。 - 【請求項４】 ＹＥＢ液体培地で培養したアグロバクテ
リウム属に属する微生物の培養液に、傷を付けたニチニ
チ草カルスを浸漬して感染させた後、該カルスを抗生物
質含有、ホルモンフリーのＭＳ寒天培地に移植して発生
した毛状根を新鮮な該ＭＳ寒天培地に移植し、必要に応
じてこの処理を繰り返すことにより、アグロバクテリウ
ム属に属する微生物を死滅させ、次いで該カルスを抗生
物質を含まないホルモンフリーのＭＳ寒天培地に移植
し、培養することによりリボソーム不活性化物質の含有
量を高める請求項１記載の作出方法。 - 【請求項５】 リボソーム不活性化物質が、カルス抽出
液からクロマトグラフィーで分画して得られた、分子量
が７０ｋＤａの活性タンパク質である請求項１記載の作
出方法。 - 【請求項６】 リボソーム不活性化物質高含有カルス
に、ポリビニルピロリドン含有リン酸緩衝液を加え、ホ
モジナイズした後、固液分離して得た活性タンパク質含
有抽出液をクロマトグラフィーで分画し、リボソーム不
活性化物質を採取することを特徴とするリボソーム不活
性化物質の製造方法。 - 【請求項７】 リボソーム不活性化物質が、分子量が７
０ｋＤａの活性タンパク質である請求項６記載の作出方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7030247A JPH08196270A (ja) | 1995-01-27 | 1995-01-27 | リボソーム不活性化物質高含有カルスの作出方法および該カルスからのリボソーム不活性化物質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7030247A JPH08196270A (ja) | 1995-01-27 | 1995-01-27 | リボソーム不活性化物質高含有カルスの作出方法および該カルスからのリボソーム不活性化物質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08196270A true JPH08196270A (ja) | 1996-08-06 |
Family
ID=12298389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7030247A Withdrawn JPH08196270A (ja) | 1995-01-27 | 1995-01-27 | リボソーム不活性化物質高含有カルスの作出方法および該カルスからのリボソーム不活性化物質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08196270A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10267952B2 (en) | 2005-02-14 | 2019-04-23 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Comfortable ophthalmic device and methods of its production |
-
1995
- 1995-01-27 JP JP7030247A patent/JPH08196270A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10267952B2 (en) | 2005-02-14 | 2019-04-23 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Comfortable ophthalmic device and methods of its production |
| US11150383B2 (en) | 2005-02-14 | 2021-10-19 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Comfortable ophthalmic device and methods of its production |
| US11953651B2 (en) | 2005-02-14 | 2024-04-09 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Comfortable ophthalmic device and methods of its production |
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