JPH08157493A - 改変タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】４本のヘリックス束構造を有するタンパク質の
アミノ酸配列中、Ｄ１キャップ領域に相当するアミノ酸
残基の少なくとも１つが、他のアミノ酸残基に置換され
ていることを特徴とする改変タンパク質、該改変タンパ
ク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含有する発現ベクター、並びに該発現ベクターで形質
転換された原核細胞又は真核細胞。 【効果】本発明で予測される改変タンパク質は、天然型
タンパク質と同等あるいはそれ以上の活性を有するた
め、大量投与による自己抗体の出現等の副作用および、
その他の副作用を減じた有用な治療剤としての利用が期
待される。また更には、絶対投与量の低下に伴い、これ
ら天然型タンパク質に混在する有害物質の削減、及び製
造スケールの縮小が可能になると期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、改変タンパク質に関す
る。さらに詳しくは、４本のヘリックス束構造を有する
タンパク質のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換す
ることによって改変した改変タンパク質、それをコード
する塩基配列を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発
現ベクター、並びに該発現ベクターで形質転換された形
質転換体に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、生物活性を有する天然タンパク質
を各種疾患の治療薬として用いるための臨床開発が検討
されている。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子（以下、ＧＭ−ＣＳＦと略す。）、マクロファー
ジコロニー刺激因子（以下、Ｍ−ＣＳＦと略す。）、イ
ンターロイキン３（以下、ＩＬ−３と略す。）、インタ
ーロイキン６（以下、ＩＬ−６と略す。）等、多くのサ
イトカイン類について臨床試験が実施され、あるいは臨
床試験が検討されている（造血因子（1994年）５巻、６
〜86頁）。

【０００３】しかしながら、一般的には蛋白製剤を慢性
的に投与する場合、投与量が大量であるほど自己抗体の
出現による副作用や、製造コスト上の問題が生じやすく
なるといった問題点がある。このような問題点を改善す
るには、例えば天然型よりも比活性の高い改変タンパク
質を用いて投与量を抑制するといった方法を用いること
等が考えられる。ここで、比活性の高い改変タンパク質
を得るには構造活性相関解析等の基礎的データが必要と
なってくる。

【０００４】サイトカイン類の中でも、ＧＭ−ＣＳＦ、
Ｍ−ＣＳＦ、成長ホルモン（以下、ＧＨと略す。）、プ
ロラクチン（以下、ＰＲＬと略す。）、エリスロポエチ
ン（以下、ＥＰＯと略す。）、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、及
びＩＬ−３、ＩＬ−６等の各種インターロイキン類等
は、いずれもαヘリックスに富み、共通構造として４本
のヘリックス束構造（4-Helix Bundle) （なお、個々の
ヘリックスはＮ末端側からそれぞれヘリックスＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄと呼ぶ。）を有すると言われている(J. F.Bazan,
Neuron (1991年）７巻、197 頁）。

【０００５】４本のヘリックス束構造を有するタンパク
質は、１６０〜２００アミノ酸残基からなる長鎖構造の
グループ（long-chain group) と１０５〜１４５アミノ
酸からなる短鎖構造のグループ(short-chain group) に
分類される(J. -L. Boulay &W. E. Paul, Curr. Biol.
(1993年）３巻、573 頁、S. Sprang & J. Bazan, Curr.
Opin. Struct. Biol.(1993年）３巻、815 頁）。前者
には、ＧＨ、ＰＲＬ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、及
びＩＬ−６、インターロイキン４（以下、ＩＬ−４と省
略する）及びＧＭ−ＣＳＦ等を含む。

【０００６】これらのサイトカイン類において、ヘリッ
クスＡとヘリックスＢの間のアミノ酸残基（以下、ＡＢ
ループ領域）及びヘリックスＤ領域に関しての生物活性
発現に対する重要性が示されている。ＩＬ−６に関して
も同様の報告がある (R. Sevino et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1993年）９０巻、4067頁、C. Luttick
en et al., FEBS Lett.(1991年）282 巻、265 頁、J.
P. J. Brakenhoff et al., J. Immunol.(1990年）145
巻、561 頁、X. Li et al., J. B. C. (1993年）268
巻、22377 頁）。ＧＨに関しては、変異体作製による同
様の報告 (B. C. Cunningham et al., Science (1990
年）247 巻、1461頁）と共に、ＧＨとＧＨ受容体との複
合体のＸ線結晶解析により、直接の同定もなされている
(A. M. DeVos et al., Science (1992年）255 巻、306
頁）。

【０００７】また、バザーンはαヘリックスに富むサイ
トカイン類の中で、ヘリックスＣとヘリックスＤの間の
アミノ酸残基（以下、ＣＤループ領域）とヘリックスＤ
の境界領域（以下、Ｄ１キャップ領域と省略する）にお
いて、Ｄ１モチーフと呼ぶアミノ酸の類似配列があるこ
とを示した(J. F. Bazan, Neuron (1991年）７巻、197
頁）。Ｄ１モチーフの配列は−φ−（Ｆ／Ｗ）−（Ｅ／
Ｑ）−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−φ−Ｘ−Ｇ−（φは疎
水性残基、Ｘはいずれの残基でも良いことを示す）であ
り、同領域は、例えばＬＩＦ（１５４〜１６１番目）、
ＯＳＭ（１５９〜１６６番目）、ＩＬ−６（１５７〜１
６４番目）、インターロイキン１１（以下、ＩＬ−１１
と省略する）（１４８〜１５５番目）のそれぞれのアミ
ノ酸に相当すると考えられる。このＣＤグループとヘリ
ックスＤの境界領域に関しては、ＩＬ−６（J. P. J. B
rakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁）
及びＬＩＦ(R. C. Robinson et al., Cell (1994年）77
巻、1101頁）において、受容体結合への重要性が報告さ
れている。

【０００８】しかしながら、ＩＬ−６のＤ１キャップ領
域のアミノ酸配列はＤ１モチーフとの類似性がないた
め、Ｄ１モチーフ上での改変に重要なアミノ酸の同定に
はならず、また、ＬＩＦの同領域のアミノ酸配列はＤ１
モチーフと類似性が高いものの改変に重要なアミノ酸残
基の同定はなされていない。また、他のαヘリックスに
富むサイトカイン類では、同領域が活性発現に重要であ
るという報告は無い。

【０００９】一方、ヒトＣＮＴＦは、２００個のアミノ
酸残基からなり、αヘリックスに富み、５３％のαヘリ
ックス、９％のβターン構造の含量からなると言われて
いる(A. Negro et al., J. Neurosci. Res., (1991年）
29巻、251 頁）。２次構造解析から、ヒトＣＮＴＦはα
ヘリックスに富むサイトカイン類と類似した構造である
ことが予想され、Ｄ１モチーフの配列はヒトＣＮＴＦに
おいては１５１〜１５８番目のアミノ酸残基に相当す
る。このようにヒトＣＮＴＦは４本のヘリックス束構造
を有するタンパク質の中では長鎖構造のグループに属
し、同グループ内タンパク質とのより緊密な類似性が予
想される。

【００１０】また、ヒトＣＮＴＦに関して、細胞内へシ
グナルを伝える為の受容体としては、ＣＮＴＦ受容体α
（以下、ＣＮＴＦ−Ｒαと省略する）、ＬＩＦ受容体
（以下、ＬＩＦ−Ｒと省略する）及びｇｐ１３０の３種
から構成されていると考えられている。ｇｐ１３０は、
ヒトＣＮＴＦの場合と共に、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ
及びＩＬ−１１のシグナル伝達の場合にも共通な受容体
である(S. Davis et al., Science(1991年）253 巻、59
頁、S. Davis et al., Science (1993年）260 巻、1805
頁、D. P. Gearing et al., Science(1992年）255 巻、
1434頁、N. Y. Ipet al., Cell(1992年）69巻、1121
頁）。前述の構造の類似性と共に、同じ受容体を共有し
ているという点から、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、Ｏ
ＳＭ及びＩＬ−１１においては、それぞれのリガンド内
で、同じ部位に相当するアミノ酸残基が受容体との結合
に関わっている可能性が高いと考えられる。

【００１１】ヒトＣＮＴＦは副交感神経である毛様体神
経節の生存維持効果を示す因子として、１９７９年にシ
ルビオ・バロン(S.Varon）らによって発見され(Brain R
es.（1979年）173 巻、29-45 頁）、その後、精製およ
びクローニングについて報告されている(G. Barbin et
al., J. Neurochem (1984 年）43巻、1468-1478 頁、L.
F. Lin et al., Science (1989 年）246 巻、1023頁、
P. Masiakowski et al., J. Neurochem (1991 年）57
巻、1003頁、A. Negro et al., Eur. J. Biochem. (199
1 年）201 巻、289 頁、J. R. McDonald et al., Bioch
im. Biophys. Acta.（1991年）、70巻、1090頁、国際公
開番号 WO90／7341号公報、国際公開番号WO91／4316号
公報）。

【００１２】ヒトＣＮＴＦの薬理作用に関し、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおいて、海馬、中隔ＧＡＢＡ作動性神経(N.
Y. IP et al. J. Neursci. (1991) 11巻、3124-3134
頁）、視神経細胞(H. D. Hoffman J. Neurochem. (198
8) 51巻、109-113 頁）、知覚神経(G. Barbin et al.
J. Neurochem. (1984) 43 巻、1468-1478 頁）、副交感
神経(Y. Arakawa et al. J. Neursci. (1990) 10巻、35
07-3515 頁）および運動神経(M. Sendtner et al. J. C
ell Science. suppl. (1991) 15 巻、103-109 頁）に対
する生存維持効果、コリン作動性神経(S. Saadat et a
l. J. Cell Biol. (1989) 108巻、1807-1816 頁、U. Er
nsberger et al. Neuron (1989) 2巻、1275-1284
頁）、タイプ２Ａアストロサイト(D. J. Anderson et a
l. TINS (1989) 12巻、83頁）への分化活性、ｉｎ ｖ
ｉｖｏにおいては、片側海馬−中隔野連絡路（Ｆ−Ｆ）
切除モデルにおいて、中隔のコリン作動性神経の生存維
持効果(T. Hagg et al. Neuron（1992年）8 巻、145
頁）、運動神経切断モデルにおける運動神経生存維持効
果(M. Sendtner et al. Nature (1990) 345 巻、440-44
1 頁）、遺伝性運動疾患マウスにおける運動神経生存維
持効果(M. Sendtner et al. Nature (1992) 358 巻、50
2-503 頁）、黒質−線条体切断モデルにおける黒質ドー
パミン作動性神経に対する保護効果(T. Hogg & S. Varo
n Proc. Natl. Acad. Sci,USA, (1993) 90 巻、6315-63
19 頁）、光受容体細胞の保護効果(M. M. LaVailet al.
Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1992) 89巻、11249-11
253 頁）、視神経細胞の保護効果(K. Unoki & M. M. La
Vail, Investigative Ophthalmology & Visual Science
(1994) 35巻、907-915 頁）等が報告されている。

【００１３】このようにヒトＣＮＴＦは神経細胞に作用
して、その生存維持、突起伸展促進および神経伝達物質
合成促進活性を示すことから、外傷による神経障害、ア
ルツハイマー病、脳血管性痴呆症、筋萎縮性側索硬化症
など神経細胞の萎縮・変性疾患に対し、有用な治療剤と
なることが期待されている(J. E. Springer, DN & P(19
91) 4巻、394 頁、R. M. Lindsay, Neurobiol. of Agin
g (1994) 15巻、249-251 頁、R. M. Lindsay, TINS (19
94) 17 巻、182 頁）。

【００１４】さらに、運動神経変性疾患のモデル動物
（Wobbler mice）における神経障害に対して、脳由来神
経栄養因子との併用によるより効果的な保護効果が示さ
れ（H.Mitsumoto et al., Science （1994）265 巻、11
07-1110 頁）、今後はヒトＣＮＴＦ単独だけではなく、
他の神経栄養因子との併用による治療（R.Nishi, Scien
ce（1994）265 巻、1052-1053 頁）も含めて有用な治療
剤となることが期待されている。

【００１５】しかしながら、現在、米国で行われている
筋萎縮性側索硬化症を対象とした天然型ヒトＣＮＴＦの
臨床治験(Bio World Today, Sep. 8（1993年))では、週
６ｍｇとかなり大量のヒトＣＮＴＦが投与されている。
前記のように、一般的には蛋白製剤を慢性的に投与する
場合、投与量が大量であるほど自己抗体の出現による副
作用や、製造コスト上の問題が生じやすくなる。実際、
ＣＮＴＦの米国のフェーズII、III 試験において、抗体
の出現が見られ(BIO World Today, Sep 8 (1993)) 、他
の副作用も問題となっている(BIO World Today, Jun 24
(1994)), Science (1994 年）264 巻、772-774 頁）。
従って、天然型よりも比活性の高いヒトＣＮＴＦ改変体
が期待されている。

【００１６】このように天然型よりも比活性の高い改変
タンパク質への期待は、ヒトＣＮＴＦのみならず、前記
のような各種のサイトカイン類に対しても同様に強いも
のであり、構造活性相関の解析等による種々の検討がな
されているものの、未だ効果的な改変体は見い出されて
いないのが実状である。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、４本のヘリックス束構造を有するタンパク質に
関して天然型タンパク質よりも比活性の高い改変タンパ
ク質を提供することにある。本発明の他の目的は、当該
改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ
を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、当
該ＤＮＡを含有する発現ベクター、及び当該発現ベクタ
ーで形質転換された原核細胞又は真核細胞を提供するこ
とにある。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決すべく、４本のヘリックス束構造を有するタンパク
質のＤ１キャップ領域のアミノ酸残基に着目して鋭意研
究したところ、Ｄ１キャップ領域に相当するアミノ酸残
基の少なくとも１つを他のアミノ酸残基に置換すること
により、当該タンパク質の比活性が上昇することを見い
だし、本発明を完成するに到った。例えば、天然型ヒト
ＣＮＴＦでは、Ｄ１キャップ領域である１５５番目のリ
ジン残基が活性発現に必須であることを発見した。また
１５３番目のアミノ酸残基の置換がＣＮＴＦ活性の増加
に有効であり、この位置のアミノ酸残基であるグルタミ
ン酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、天
然型ヒトＣＮＴＦの比活性を上昇できることを見出し
た。

【００１９】即ち、本発明の要旨は、（１） ４本のヘ
リックス束構造（Ｎ末端側からヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、
Ｄと呼ぶ。）を有するタンパク質のアミノ酸配列中、Ｄ
１キャップ領域（但し、Ｄ１キャップ領域とはヘリック
スＣとヘリックスＤの間であるＣＤループ領域とヘリッ
クスＤとの境界領域のことをいい、そのアミノ酸配列が
−φ−（Ｆ／Ｗ）−（Ｅ／Ｑ）−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／
Ｒ）−φ−Ｘ−Ｇ−（φは疎水性残基、Ｘはいずれの残
基でも良いことを示す）で表されるＤ１モチーフ配列を
有する領域をいう。）に相当するアミノ酸残基の少なく
とも１つが、他のアミノ酸残基に置換されていることを
特徴とする改変タンパク質、（２） ４本のヘリックス
束構造を有するタンパク質が、細胞内へのシグナル伝達
のための受容体としてｇｐ１３０を利用するタンパク質
である前記（１）記載の改変タンパク質、（３） ４本
のヘリックス束構造を有するタンパク質が、細胞内への
シグナル伝達のための受容体としてｇｐ１３０を利用す
るタンパク質であって、Ｄ１モチーフ配列のＮ末端側か
ら３番目のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換さ
れていることを特徴とする前記（１）記載の改変タンパ
ク質、（４） ４本のヘリックス束構造を有するタンパ
ク質が、ヒトＣＮＴＦであって、そのアミノ酸配列中、
天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列の少なくとも１５３
位に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換
されているヒトＣＮＴＦ改変体であることを特徴とする
前記（１）記載の改変タンパク質、（５） ４本のヘリ
ックス束構造を有するタンパク質が、ＬＩＦであって、
そのアミノ酸配列中、天然型ＬＩＦのアミノ酸配列の少
なくとも１５６位に相当するアミノ酸残基が、他のアミ
ノ酸残基に置換されているＬＩＦ改変体であることを特
徴とする前記（１）記載の改変タンパク質、（６） ４
本のヘリックス束構造を有するタンパク質が、ＯＳＭで
あって、そのアミノ酸配列中、天然型ＯＳＭのアミノ酸
配列の少なくとも１６１位に相当するアミノ酸残基が、
他のアミノ酸残基に置換されているＯＳＭ改変体である
ことを特徴とする前記（１）記載の改変タンパク質、
（７） ４本のヘリックス束構造を有するタンパク質
が、Ｇ−ＣＳＦであって、そのアミノ酸配列中、天然型
Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列の少なくとも１４６位に相当
するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されてい
るＧ−ＣＳＦ改変体であることを特徴とする前記（１）
記載の改変タンパク質、（８） 他のアミノ酸残基が天
然のアミノ酸残基又は非天然のアミノ酸残基であること
を特徴とする前記（１）〜（７）いずれか記載の改変タ
ンパク質、（９） 他のアミノ酸残基が中性又は塩基性
アミノ酸残基であることを特徴とする前記（８）記載の
改変タンパク質、（１０） 中性又は塩基性アミノ酸残
基が、ヒスチジンを含む芳香族性アミノ酸残基又はアル
ギニン残基であることを特徴とする前記（９）記載の改
変タンパク質、（１１） ヒスチジンを含む芳香族性ア
ミノ酸残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプト
ファン、又はヒスチジン残基であることを特徴とする前
記（１０）記載の改変タンパク質、（１２） 中性又は
塩基性アミノ酸残基が、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギ
ン、グリシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニ
ン、トリプトファン、ヒスチジン、リジン又はアルギニ
ン残基であることを特徴とする前記（９）記載の改変タ
ンパク質、（１３） 天然型ヒトＣＮＴＦの６３位に相
当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基にさらに置換さ
れていることを特徴とする前記（４）記載の改変タンパ
ク質、（１４） ６３位に相当するアミノ酸残基がアル
ギニン残基に置換されていることを特徴とする前記（１
３）記載の改変タンパク質、（１５） 前記（１）〜
（１４）いずれか記載の改変タンパク質をコードする塩
基配列を含有するＤＮＡ、（１６） 前記（１５）記載
のＤＮＡを含有する発現ベクター、並びに（１７） 前
記（１６）記載の発現ベクターで形質転換された原核細
胞又は真核細胞、に関する。以下、本発明についてさら
に詳細に説明する。

【００２０】本発明において「４本のヘリックス束構造
を有するタンパク質」とは、ＬＩＦ、ＯＳＭ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＥＰＯ、インターロ
イキン２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、インターロイキン５、
ＩＬ−６、ＩＬ−１１、骨髄単球成長因子（以下、ＭＧ
Ｆと略す。）、インターフェロンα（以下、ＩＦＮαと
略す。）等のαヘリックスに富むサイトカイン類、及び
ヒトＣＮＴＦ等のタンパク質をいう。なかでも、細胞内
へのシグナル伝達のための受容体としてｇｐ１３０を利
用するタンパク質が好適であり、ヒトＣＮＴＦ、ＬＩ
Ｆ、ＯＳＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１等が挙げられる。ま
た、個々のヘリックス構造は、Ｎ末端側からそれぞれヘ
リックスＡ、ヘリックスＢ、ヘリックスＣ、ヘリックス
Ｄという。本発明において「Ｄ１キャップ領域」とは、
ＣＤループ領域（ヘリックスＣとヘリックスＤの間のア
ミノ酸残基をいう。）とヘリックスＤとの境界領域のこ
とをいい、アミノ酸配列が−φ−（Ｆ／Ｗ）−（Ｅ／
Ｑ）−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−φ−Ｘ−Ｇ−（φは疎
水性残基、Ｘはいずれの残基でも良いことを示す。）で
表される配列を有する領域をいう。この８個のアミノ酸
からなる配列は、本発明における４本のヘリックス束構
造を有するタンパク質において共通してみられるもので
あり、Ｄ１モチーフ配列と呼ばれる。表１に、上記４本
のヘリックス束構造を有するタンパク質中のＤ１キャッ
プ領域におけるＤ１モチーフのアミノ酸配列を示す。な
お、ＩＬはインターロイキンを略記したものである。

【００２１】

【表１】

【００２２】さらに、本発明において、「天然型ヒトＣ
ＮＴＦのアミノ酸配列」とは、国際公開番号WO９１／４
３１６号公報に記載されたものであり（配列番号：
１）、「天然型ＬＩＦのアミノ酸配列」とは、文献（R.
C.Robinson et al.,Cell,(1994)77巻1101頁）に記載さ
れたものであり、「天然型ＯＳＭのアミノ酸配列」と
は、文献（T.M.Rose and A.G.Bruce, Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,(1991) 88巻8641頁,J.C.Kallestad et al., J.
B.C.(1991) 266巻8940頁）に記載されたものであり、
「天然型Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列」とは、文献（B.Lo
vejoy et al., J.Mol.Biol.(1993)234巻 640頁）に記載
されたものである。本明細書におけるアミノ酸の位置の
表記もこれらに従う。

【００２３】本発明において、「改変タンパク質」と
は、天然型タンパク質のアミノ酸配列中の少なくともＤ
１キャップ領域に相当するアミノ酸残基（特にＤ１モチ
ーフ中のアミノ酸残基）の少なくとも１つが他のアミノ
酸残基に置換されたタンパク質をいう。ここで、Ｄ１キ
ャップ領域における改変、即ち、置換を受けるアミノ酸
残基の数、種類、Ｄ１キャップ領域における位置等は限
定されるものではない。しかしながら、改変タンパク質
の比活性を高くする観点から、Ｄ１モチーフのＮ末端側
から３番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換さ
れている改変体が好ましい。具体的には、ヒトＣＮＴＦ
における１５３位、ＬＩＦにおける１５６位、ＯＳＭに
おける１６１位、Ｇ−ＣＳＦにおける１４６位が、ここ
でいうＤ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残
基に相当する。

【００２４】本発明において、「他のアミノ酸残基」と
は、天然のアミノ酸残基又は非天然のアミノ酸残基を意
味する。他のアミノ酸残基が天然のアミノ酸残基の場
合、中性又は塩基性アミノ酸残基が好ましい。即ち、本
発明の改変タンパク質の好ましい例として、Ｄ１モチー
フのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基が、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタ
ミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、セリン、ス
レオニン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、
トリプトファン等の中性アミノ酸の残基や、ヒスチジ
ン、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸の残基に置
換されたものが挙げられる。なかでも、比活性の向上と
いう観点から、チロシン、フェニルアラニン、トリプト
ファン、ヒスチジンなどの芳香族性アミノ酸残基や、ア
ルギニン等の残基に置換されたものがとりわけ好まし
い。また、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、
プロリン等の疎水性アミノ酸残基等も好適である。

【００２５】また、他のアミノ酸残基が非天然のアミノ
酸残基である場合としては、例えば蛋白質の合成段階で
非天然アミノ酸を導入した場合、又は蛋白質合成後化学
修飾された天然のアミノ酸残基等が挙げられる。蛋白質
の合成段階で導入する方法として、部位特異的に様々な
非天然アミノ酸を導入する一般的に有効な方法が報告さ
れており(Science, 244, 182 (1989))、実際にパラ位を
フッ素或いはニトロ基で修飾したフェニルアラニンを化
学的にｔＲＮＡにアシル化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの蛋白
合成系で発現した結果が示されている。また他の方法と
して、非天然のアミノ酸であるフラノマイシン(Furanom
ycin) を認識する大腸菌のIsoleucyl-ｔＲＮＡ(J. B.
C., 265, 6931 (1990))を利用して目的の位置に導入し
たり、或いはCell−Freeの蛋白合成系(J. Biochem., 11
0, 166 (1991))において、目的の導入を行うことにより
非天然のアミノ酸残基に置換されたもの等が挙げられ
る。

【００２６】また、精製蛋白を利用して、アミノ酸残基
特異的あるいは部位特異的に化学修飾したものも挙げら
れる（新生化学実験講座１，IV，11(1991)) 。例えばグ
ルタミン酸残基に対しては、アミド化する、リジン残基
に置換した後トリニトロフェニル化する、アルギニン残
基に置換した後フェニルグリオキサールと反応させる、
ヒスチジン残基に置換した後カルベトキシ化する、トリ
プトファン残基に置換した後アリールスルフェニルクロ
リドと反応させる、チロシン残基に置換した後ニトロ化
する等の方法による改変体が挙げられる。これらの化学
修飾は常法により行うことができる。

【００２７】なお、本発明においては改変タンパク質の
活性を著しく損なわないかぎり、Ｄ１モチーフのＮ末端
側から３番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の
置換に加え、その位置以外のアミノ酸残基に対する、通
常蛋白工学分野で行われる改変（アミノ酸置換、アミノ
酸削除、アミノ酸付加、およびドメイン置換等）を行う
ことも可能である。

【００２８】例えば天然型ヒトＣＮＴＦにおいて、１５
３位に加えて、さらに６３位、１３６位、１５４位、１
５６位、１５７位、１６０位、１６３位、１６４位、１
６７位、１７７位、１７８位、１８４位などのアミノ酸
残基を他のアミノ酸残基に置換したものが挙げられる。
ここでいう１５３位以外のアミノ酸残基の置換は、前記
のように定義される「他のアミノ酸残基」で置換され
る。天然型ヒトＣＮＴＦでは、アミノ酸配列の６３位の
アミノ酸残基をアルギニン残基に置換することによりＣ
ＮＴＦ活性が上昇することが既に公表されているが（Pa
nayotatos et al., J.B.C., 268 巻,19000-19003頁（19
93））、このようなヒトＣＮＴＦ上のＣＮＴＦ活性増加
に有効な変異を組み合わせた置換を行うことにより、そ
れぞれの部位の単独置換体以上の比活性を有する改変体
をも得ることができる。例えば、１５３位に加えて６３
位のアミノ酸残基も置換する場合、１５３位と６３位を
共にアルギニンに置換したもの、１５３位はチロシンに
６３位はアルギニンに置換したもの、１５３位をトリプ
トファンに６３位はアルギニンに置換したもの等が好適
例として挙げられる。

【００２９】本発明の改変タンパク質は、遺伝子工学分
野における常法により作成することができる。即ち、Ｄ
１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸残
基を他のアミノ酸残基に置換する場合、当該天然型タン
パク質、又は当該改変体をコードするＤＮＡ含有ベクタ
ーの一部を合成オリゴヌクレオチドで置換して、当該天
然型タンパク質のアミノ酸配列において、Ｄ１モチーフ
のＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸をコードする
ＤＮＡを他のアミノ酸をコードするＤＮＡに変え、これ
を適当な発現ベクターに連結して宿主内に導入し、形質
転換させた宿主に目的の改変体を生産させることができ
る。以下、その詳細について述べる。

【００３０】本発明の改変タンパク質の製造には、例え
ば、当該天然型タンパク質をコードする構造遺伝子を用
いることができる。ヒトＣＮＴＦを改変する場合、天然
型ヒトＣＮＴＦをコードするヒトＣＮＴＦ構造遺伝子
は、例えばウサギあるいはヒトのゲノムＤＮＡからのク
ローニングによって既に取得されており(K. A. Stockli
et al., Nature, 342, 316 (1989)., L. F. Lin et a
l., Science, 246, 1023(1989)., P. Masiakowski et a
l., J. Neurochem., 57, 1003（1991)., A. Negro et
al., Eur.J. Biochem., 201, 289（1991)., J. R. McDo
nald et al., Biochem. Biophys. Acta., 1090, 70（19
91)., A. Lam et al., Gene, 102, 271 (1991)) 、その
ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列も知られている。従って、
例えば常法（J. Sambrook et al., Molecular cloning
: A laboratory manual)に従って、天然型ヒトＣＮＴ
Ｆ遺伝子をクローニングすることができる。また、ＬＩ
Ｆ、ＯＳＭ、Ｇ−ＣＳＦをコードする構造遺伝子も同様
に取得されているので（J.F.Moreau et al., Nature(19
88)336巻 690頁, M.N.Kallested et al., Mol.Cell.Bio
l.(1989) 9巻2847頁, H.Nomura et al., EMBO J.(1986)
5巻 871頁）、それらを用いてヒトＣＮＴＦと同様に行
えばよい。

【００３１】プラスミド中にクローニングした天然型タ
ンパク質構造遺伝子の特定の配列を他の配列に置換する
方法は、既に一般的に行える状況にあり、本発明におい
ても常法により、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に
相当するアミノ酸残基を置換することができる。置換の
方法は、目的とする置換したアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを当該天
然型タンパク質における置換の対象となる部分の配列
（以下、相当配列と省略する。）と置き換える方法が便
利である。

【００３２】具体的には、例えば置換した塩基配列から
なるオリゴヌクレチドと、増幅に必要なタンパク質の配
列中、置換部位以外の塩基配列或いはベクター部分の配
列に相当するオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、
天然型タンパク質の構造遺伝子を含むプラスミドを鋳型
にして、上記２種で挟まれた領域を増幅し、得られた増
幅フラグメントを天然型タンパク質の相当配列と置き換
える方法が便利である。２種のプライマーで挟まれた領
域の増幅方法としては、例えば遺伝子増幅法（ＰＣＲ）
（Gene, 77, 61-68 (1989)) が行われ、またこの操作を
行うためには市販のＤＮＡ自動増幅装置が有効に用いら
れる。なお、１回の増幅反応で天然型タンパク質の相当
配列との置き換えに都合の良い制限酵素切断部位を有す
るフラグメントが得られない場合には、１回目の遺伝子
増幅産物を２回目の遺伝子増幅反応の１つのプライマー
として用い、目的の制限酵素切断部位を有するフラグメ
ントを調製することもできる。

【００３３】図１に、その一例としてヒトＣＮＴＦを対
象とする場合を示す。図１に示されるように、２回の遺
伝子増幅反応を行うことによって目的の置換した塩基配
列が導入され、かつ天然型ヒトＣＮＴＦの相当配列との
置き換えに都合の良い制限酵素切断部位を有するフラグ
メントを得ることができる。さらに、２つの異なる部位
に置換を導入する場合には、別個にそれぞれの部位に変
異を導入した後、適当な制限酵素切断部位を利用してク
ローニングし、両変異を持つ遺伝子を構築するか、ある
いは一方の変異を導入したあと、その変異遺伝子をテン
ペレートとして用いて、さらに遺伝子増幅反応による一
方の変異の導入を行い構築することができる。

【００３４】目的の置換（あるいは挿入）が行われたＤ
ＮＡ配列を確認するためには、ジデオキシ法（Science,
214, 1205（1981))の原理を利用し、例えばシークナー
ゼＤＮＡシークエンスキット（東洋紡社製）を用いて行
うことができる。その他、実施例に記載されているよう
な制限酵素によるＤＮＡの切断、欠失、それらにより生
じるＤＮＡ断片の電気泳動による分離、回収、あるいは
連結等の遺伝子操作は全て公知の方法（T.Maniatis et
al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Lab.（1982))に準じて行うことができ
る。

【００３５】このようにして得られる改変タンパク質を
コードする塩基配列を含有するＤＮＡは、例えばｐＫＫ
２２３−４（Pharmacia 社製、図２）等周知の発現ベク
ターに連結された後、適当な宿主に導入されることによ
り、本発明の目的物質である改変タンパク質を発現する
ことができる。宿主としては、原核細胞または真核細胞
のいずれでもよく、例えば大腸菌株や動物細胞株は、特
に記載のない限り既に広く普及しており入手は容易であ
る。例えば大腸菌宿主としては、ＪＭ１０９株等が挙げ
られる。また、動物細胞宿主としては、ＣＯＳ−１、Ｃ
ＨＯ細胞が挙げられる。

【００３６】発現ベクターを用いてこれらの宿主を形質
転換するには、電気パルス法（高山伸一郎、細胞工学6、
771、 1987）、或いは塩化カルシウム法 (J. Mol. Bio
l. 53, 159 (1970)) を用いればよい。このような形質
転換された大腸菌株や動物細胞株等を用い、例えば常法
(T. Maniatis et al., Molecular cloning, A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Lab.（1982))に従っ
て、改変タンパク質を発現させることができる。さら
に、得られた菌株を常法に従い溶菌し、遠心分離（１０
５００×ｇ）にかけて可溶性画分を得ることができる。
発現された改変タンパク質は、必要に応じて常法に従っ
て精製することも可能である。例えばヒトＣＮＴＦ改変
体の場合は、J. Neurochem.,57, 1003（1991) に従って
精製することができる。

【００３７】ヒトＣＮＴＦ改変体の場合、具体的には、
例えば、発現誘導後の大腸菌を、集菌後リゾチーム処理
により溶解し、更に超音波処理を行う。遠心分離（１１
０００×ｇ）を行い、ヒトＣＮＴＦ改変体を含む不溶性
画分を得て、この画分を６Ｍの塩酸グアニジン溶液で可
溶化し、次いでβメルカプトエタノールを含むトリス−
塩酸緩衝液で透析し再生を行う。次に、陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフィー（Asahipak-502NP: 旭化成社
製）にかけた後、ＮａＣｌ直線濃度勾配により可溶化さ
れたヒトＣＮＴＦ改変体を溶出する。更に、溶出した可
溶性タンパク質を疎水性カラムクロマトグラフィー（Et
her-5PW:東洋曹達社製）にのせ、洗浄後に硫酸アンモニ
ウム直線濃度勾配で溶出することにより、精製ヒトＣＮ
ＴＦ改変体を得ることができる(J. Neurochem., 57, 10
04〜1005（1991）を参照し、一部改変した）。

【００３８】発現された改変タンパク質の定量は、通常
用いられる公知の方法でよい。例えば、天然型タンパク
質を用いて得られる特異的抗体によるエンザイムイムノ
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）やＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等が利用できる。ＥＬ
ＩＳＡによる場合、上述と同様の方法で調製した天然型
タンパク質の精製品を用い、例えば常法(Methods in En
zymology, 73, 46-52(1981))に従って、動物〔例えばニ
ュージーランドホワイトラビット（♂，１ｋｇ）等〕に
免疫して抗血清を取得することができる。抗血清からの
特異的抗体の精製は、例えば天然型タンパク質を標品と
してカラム担体〔例えば活性化セファロース（Pharmaci
a 社製, CNBr Activated Sepharose 等〕に結合させ、
これを用いてカラムクロマトグラフィーを行うことによ
り可能である。該方法により得られる特異的抗体を用い
て、改変タンパク質の定量のためのＥＬＩＳＡを行うこ
とにより、未精製の状態で微量の改変タンパク質を検体
とした場合でも、充分に定量を行うことが可能となる。

【００３９】また、改変タンパク質を定量する別の方法
として、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）を利用することができる。即ち、公知の
方法（Nature, 227, 680（1970))でＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行い、当該タンパク質に由来するゲルバンドの濃度を画
像処理ソフト（例えば、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４
７）を用いて、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）の場合と同様に未精製の状態で改変タンパク質の定
量を行うことができる。

【００４０】上述のようにして調製した改変タンパク質
の生物活性は、それぞれのタンパク質に応じた方法で測
定する。例えばヒトＣＮＴＦ改変体タンパク質の生物活
性は、ニワトリ後根神経節（ＤＲＧ）、毛様体神経節
（ＣＧ）又はラットＤＲＧ等を用いることにより公知の
方法（Nerve Growth Factors, 31-56,（1989))で測定す
ることができる。また、ＬＩＦ改変体タンパク質の生物
活性は、胎性幹細胞等種々の細胞を利用して、公知の方
法（D.Metcalf, Growth Factors (1992) 7巻 169頁）で
測定することができる。ＯＳＭ改変体タンパク質の生物
活性は、黒色腫細胞の成長阻害活性等（D.Horn et al.,
Growth Factors (1990) 2巻 157頁）を利用して測定す
ることができる。Ｇ−ＣＳＦ改変体タンパク質の生物活
性は、造血系の腫瘍細胞であるＮＦＳ−６０細胞の成長
促進活性（M.Tsuchiya et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.(1986)83巻7633頁）等を利用して測定することがで
きる。

【００４１】本発明のヒトＣＮＴＦ改変体等の改変タン
パク質は、天然型タンパク質と同等あるいはそれ以上の
生物活性を有しているため、天然型に比べて有用な治療
剤となり得ることが期待される。更に、天然型タンパク
質の医薬品としての開発段階で問題になっている、大量
投与による問題点、即ち、必要量を生産することの量的
な難しさ、混在する物質による副作用、あるいは天然型
タンパク質自身に対する抗体出現の為の副作用等の問題
点を解決できる可能性があると考えられる。

【００４２】例えばヒトＣＮＴＦ改変体の生物活性とし
ては、後述の実施例において示されるように、１５３位
のアミノ酸残基がアラニン、バリン、ロイシン、メチオ
ニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリ
ン、リジンの残基に置換された場合には、１５３位がグ
ルタミン酸（天然型）のものに対して２〜３倍のニワト
リＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示し、１５
３位のアミノ酸残基がチロシン、フェニルアラニン、ト
リプトファン、ヒスチジン、アルギニンの残基に置換さ
れた改変体は、ニワトリＤＲＧニューロン、ニワトリＣ
Ｇニューロン及びラットＤＲＧニューロンに対して天然
型ヒトＣＮＴＦの約１０倍の生存維持活性を示す。ま
た、１５３位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基（例え
ば、アルギニン、チロシン、トリプトファン残基）に置
換され、かつ６３位のアミノ酸残基がアルギニン残基等
に置換された場合には、ニワトリＤＲＧニューロンに対
してそれぞれの単独置換体よりもさらに高い比活性を示
す。このように本発明のヒトＣＮＴＦ改変体は、天然型
ヒトＣＮＴＦと同等あるいはそれ以上の生物活性を有し
ているため、天然型ヒトＣＮＴＦと同様に、運動神経変
性疾患、末梢神経ニューロパチーなどの末梢神経関連疾
患、アルツハイマー病、脳血管性痴呆症、パーキンソン
病、ハンチング病などの中枢神経関連疾患、網膜色素変
性症、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜黄斑変性症などの
眼関連神経の治療剤となり得る。更に、天然型ヒトＣＮ
ＴＦの医薬品としての開発段階で問題になっている、大
量投与による問題点、即ち、必要量を生産することの量
的な難しさ、混在する物質による副作用、あるいはヒト
ＣＮＴＦ自身に対する抗体出現の為の副作用等の問題点
を解決できる可能性があると考えられる。

【００４３】前述したように、バザーンが、ＣＮＴＦ類
縁タンパク質であるαヘリックスに富むサイトカイン類
の中でＤ１キャップ領域においてＤ１モチーフと呼ぶア
ミノ酸の類似配列があることを示したが(J. F. Bazan,
Neuron (1991年）７巻、197頁）、本発明者らは今回初
めてそのモチーフ内での各アミノ酸の役割を明らかにし
た。各タンパク質において、Ｄ１キャップ領域のＤ１モ
チーフとして予想されるアミノ酸配列を表１に示す。こ
の時、長鎖構造のグループ（ＩＡ、ＩＢ）と短鎖構造の
グループ（ＩＩ）を分類して表記し、更に長鎖構造のグ
ループに関しては受容体としてｇｐ１３０を利用するグ
ループ（ＩＡ；ＣＮＴＦはこのグループに属する）とそ
れ以外のグループ（ＩＢ）に分類して表記した。ヒトＣ
ＮＴＦと同様に、Ｄ１モチーフと類似配列を持つタンパ
ク質は、長鎖構造のタンパク質に多く、特に受容体とし
てｇｐ１３０を利用するＬＩＦ及びＯＳＭ、あるいはＧ
−ＣＳＦでの類似性が高い。

【００４４】αヘリックスに富むサイトカイン類に関し
ては、現在までに多くの構造活性相関解析がなされてお
り、ヒトＣＮＴＦと、より構造の類似性の高い長鎖構造
のグループのタンパク質に関する構造活性相関解析の結
果について、図３に簡略にまとめた。受容体としてｇｐ
１３０を利用するグループ（Ａ）とそれ以外のグループ
（Ｂ）に分類して表記し、また、実験的に活性発現に重
要であることが既知の領域に関しては網掛けで、活性発
現への関与が予測される領域に関しては破線で囲って表
記した。

【００４５】Ｄ１キャップを含むＣＤループとヘリック
スＤの境界領域に関しては、前述のようにＩＬ−６ (J.
P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269
巻、86頁）及びＬＩＦ(R. C. Robinson et al., Cell
(1994年）77巻、1101頁）において受容体結合への重要
性が報告されている（但し、ＩＬ−６のＤ１キャップ領
域のアミノ酸配列はＤ１モチーフとの類似性が無いた
め、Ｄ１モチーフ上での改変に重要なアミノ酸の同定に
はならず、また、ＬＩＦの同領域のアミノ酸配列はＤ１
モチーフと類似性が高いものの、改変に重要なアミノ酸
残基の同定はなされていない）。また、他のαヘリック
スに富むサイトカイン類で、同領域が活性発現に重要で
あるという報告は、後述するＧ−ＣＳＦを除くと報告さ
れていない。また今回、ヒトＣＮＴＦにおいてＤ１キャ
ップ領域の重要性が示されたことから、Ｄ１キャップ領
域を受容体結合に利用するタンパク質の１つの共通項目
として、ｇｐ１３０を受容体として利用するということ
が考えられる。同グループのタンパク質としては、ＣＮ
ＴＦ以外にＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１が知
られており、これらのタンパク質において、Ｄ１キャッ
プ領域に相当するアミノ酸残基が、活性発現のための受
容体結合に関与している可能性が高いと考えられる。

【００４６】特に、ＬＩＦ及びＯＳＭはＤ１モチーフと
の類似性が高いことから、ヒトＣＮＴＦにおけるＤ１キ
ャップ領域での変異による効果と同じ効果が、それぞれ
のタンパク質での相当する部位の改変により起こること
が予想される。具体的には、ヒトＣＮＴＦの１５５位の
リジン残基に相当する、ＬＩＦの１５８位及びＯＳＭの
１６３位のリジン残基の変異により、活性が激減するこ
とが予想され、またヒトＣＮＴＦの１５３位のグルタミ
ン酸残基に相当する、ＬＩＦの１５６位及びＯＳＭの１
６１位のグルタミン残基の変異により、ヒトＣＮＴＦの
場合と同じような活性の上昇が期待される。また、この
両残基に限らず、Ｄ１モチーフ内の他のアミノ酸の変異
でも活性の変化があることが予想される。

【００４７】ｇｐ１３０を利用しない、あるいは利用す
るという報告がないタンパク質の中で、Ｄ１モチーフの
配列との類似性が顕著なものとしてＧ−ＣＳＦがある。
Ｇ−ＣＳＦにおいては、同領域周辺を認識するモノクロ
ーナル抗体が、Ｇ−ＣＳＦの活性を中和するという報告
もあり(J. E. Layton et al., J. B. C. (1991年）266
巻、23815 頁）、Ｄ１キャップ領域の受容体結合への関
与が予想される。即ち、ヒトＣＮＴＦの１５３位のグル
タミン酸残基に相当する、Ｇ−ＣＳＦの１４６位のグル
タミン残基の変異により、ヒトＣＮＴＦの場合と同じよ
うな活性の上昇が期待され、Ｄ１モチーフ内の他のアミ
ノ酸の変異により活性の変化が起こることが予想され
る。更に、Ｇ−ＣＳＦとの類似性が報告されているＭＧ
Ｆについても同様のことが予想され、ＭＧＦのＤ１キャ
ップ領域内の変異により、活性の変化（あるいは上昇）
が起こることが予想される。ｇｐ１３０を受容体として
利用するタンパク質に限らず、Ｄ１モチーフという共通
配列での受容体結合は一般に見られることかも知れな
い。

【００４８】

【実施例】以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定
されるものではない。なお、本実施例において使用する
略語の名称を以下に示す。 ＰＣＲ ： 遺伝子増幅法 ＢＡＰ ： bacterial alkaline phosphatase ＩＰＴＧ ： isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside ＰＭＳＦ ： phenylmethanesulfonyl fluoride ＰＢＳ ： phosphate buffered saline ＢＳＡ ： bovine serum albumin ＡＬＰ ： alkaline phosphatase ＳＡ ： streptoavidine ＰＮＰＰ ： p-nitrophenyl phosphate ＤＲＧ ： dorsal root ganglion ＤＭＥＭ ： dulbecco's modified eagle medium ＦＣＳ ： fetal calf serum ＭＴＴ： 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenylt
etrazolium bromide ＣＧ ： ciliary ganglion

【００４９】実施例１ 天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子への変異導入及びヒトＣＮＴ
Ｆ改変体発現ベクターの調製 １）実験材料 大腸菌株ＪＭ１０９（lacI^q : 宝酒造社製）をクローニ
ングのため、また天然型ヒトＣＮＴＦおよびヒトＣＮＴ
Ｆ改変体の発現のための宿主菌として使用した。天然型
ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）としては、ｔａ
ｃプロモーターを有する大腸菌発現ベクターであるpKK2
23-4（Pharmacia 社製、図２）に天然型ヒトＣＮＴＦ遺
伝子及び該ＣＮＴＦ遺伝子の５’側にリンカーＤＮＡを
挿入して作製したものを使用した（図４）。

【００５０】２）変異導入遺伝子の増幅反応 ランダムなアミノ酸の部位特異的変異の導入は、遺伝子
増幅法（ＰＣＲ）を利用した。数種の合成ＤＮＡプライ
マーを使用し、２段階のＰＣＲ反応により調製した（図
１）。ＰＣＲには、テンペレートとして天然型ヒトＣＮ
ＴＦ発現ベクター（pKKCNTF)を使用し、ポリメラーゼは
適合度（fidelity）の高いpfu ポリメラーゼ（Stratage
ne社製）を利用した。なお、使用したプライマーのシー
クエンスを図５に示した。変異部位のプライマーとして
は、天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列における１５２
番目から１５７番目のそれぞれのアミノ酸残基を他のア
ミノ酸残基に置換したヒトＣＮＴＦ改変体（以下、例え
ば１５３位を置換したヒトＣＮＴＦ改変体を単に「Ｅ１
５３位改変体」と省略する場合がある。）を得るための
プライマーを示したが、その相当部位において、第１コ
ドン及び第２コドンはＧ、Ａ、Ｔ及びＣ、また第３コド
ンはＧ及びＣの混合として、合成の段階で調製した。こ
れら３２種の混合プライマーにより、目的の部位につい
ては２０種のアミノ酸全てを網羅していることになる。

【００５１】また、６３位のグルタミン残基をアルギニ
ン残基に置換する場合は、目的の変異の単一のプライマ
ーとして、図５に示すｐＱ６３Ｒを用いた。改変体作成
の手法、条件等は、変異部位のプライマーとしてｐＥ１
５３の代わりにｐＱ６３Ｒを用いた以外は、上記と同様
である。また、６３位のグルタミン残基をアルギニン残
基に置換したＣＮＴＦ改変体を「Ｑ６３Ｒ改変体」と省
略する場合がある。なお、各ステップのＰＣＲの反応条
件を図６に示した。

【００５２】具体的にはまず、構造遺伝子の５’側或い
は３’側のプライマー１と、変異部位のプライマー２
（ｐＥ１５３又はｐＱ６３Ｒ）の２種のプライマーを利
用して、１回目のＰＣＲ反応を行った。プライマー1
は、変異部位に近い方のプライマー（図５に記載の＃
Ｎ）を用いた。増幅後、アガロースゲルにて電気泳動
し、目的遺伝子を切り出し精製した。次に、この生成産
物と図５に記載の＃Ｃ（ＲＶ）をプライマーとして利用
し、ヒトＣＮＴＦ全構造遺伝子を増幅するようにして２
回目のＰＣＲ反応を行った。この段階においては、１回
目のＰＣＲによる生成産物をプライマーとして用いる
が、使用量は約１〜２ｐｍｏｌと、ある程度狭い範囲で
のみ増幅が可能であり、１回目のＰＣＲの生成産物量
が、少な過ぎてもまた逆に多過ぎても増幅されなかっ
た。また、アニーリングの温度は６０℃前後が適当であ
り、テンペレートにはpKKCNTF をPvuII で消化し線状
（linear）ＤＮＡとして調製したものを用いた。

【００５３】３）ヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調
製 天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）をBamHI
及びPstIで切断し、パッセンジャー部分である天然型ヒ
トＣＮＴＦ構造遺伝子部分を除き、ベクターとして用い
た。一方、このベクターに挿入するパッセンジャー（ヒ
トＣＮＴＦ改変体構造遺伝子）部分には、BamHI 及びPs
tIの切断部位が構造遺伝子内にも存在する。そのため、
BamHI 及びPstIサイトは使用できないので、それらとそ
れぞれ相同な（cohesive）部分を生成する、Bgl II
（５’側）及び EcoT22I（３’側）の切断部位を遺伝子
増幅のプライマー内にデザインし（図５）、これらの制
限酵素による消化後、ベクターの BamHI、PstIサイトに
挿入した。即ち、具体的には、まずpKKCNTF をBamHI 及
びPstIで消化し、電気泳動後切り出し精製し、更に、Ｂ
ＡＰ処理を行った。一方、遺伝子増幅によって調製され
たパッセンジャーをBglIIとEcoT22I で切断し、このパ
ッセンジャー（約１００ｎｇ：モル数でベクターの約１
０倍）と上記調製したベクター（１００ｎｇ）を用いて
ライゲーションを行い、後述の方法でＪＭ１０９株へ形
質転換した。得られたクローンについて塩基配列の決定
を行い、変異の同定を行なった。塩基配列決定には、シ
ークナーゼＤＮＡシークエンスキット（東洋紡社製）を
利用した。このようにして、Ｅ１５３位改変体発現ベク
ターとＱ６３Ｒ改変体発現ベクターを得た。

【００５４】４）両部位の置換（１５３位／６３位）を
組み合わせた変異遺伝子及び発現ベクターの調製 pKKCNTF と同様、Ｑ６３Ｒ改変体の発現ベクター上に
は、制限酵素Hind IIIによる切断部位が２箇所存在する
（図７）。図７に示したパッセンジャー部分をＥ１５３
位改変体遺伝子の相当部分と置換することにより、両部
位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた変異ＣＮ
ＴＦの発現ベクターの調製を行った。具体的には、まず
上記で得たＱ６３Ｒ改変体の発現ベクターをHind IIIで
消化し、そのままライゲーションを行い、図７のパッセ
ンジャー遺伝子を欠失した遺伝子を調製した。この遺伝
子についてさらにHind IIIで消化を行い、消化されたＤ
ＮＡを精製後ＢＡＰ処理し、ベクター部分とした。ま
た、Ｅ１５３位改変体それぞれの発現ベクターをHind I
IIで消化後パッセンジャー部分（約４００ｂｐ）を分離
精製し、上記調製したベクター部分を用いてライゲーシ
ョンを行い、同様に後述の方法でＪＭ１０９株へ形質転
換した。得られたクローンについてパッセンジャー部分
の挿入及び挿入方向を確認し、目的の挿入のあったクロ
ーンについて塩基配列決定により変異の再確認を行っ
た。

【００５５】その結果、表２に示すそれぞれ５１種のヒ
トＣＮＴＦ改変体を発現する発現ベクターを得た。

【００５６】

【表２】

【００５７】５）発現ベクターで形質転換された大腸菌
の調製 市販のＪＭ１０９株のコンピテントセル（東洋紡社製）
１００μＬに、前記により調製したヒトＣＮＴＦまたは
ヒトＣＮＴＦ改変体を発現するベクターのＤＮＡ（約１
００ｎｇ）を混合し、３０分間氷中に放置した。次いで
４２℃で３０秒間熱処理を行った後、ＳＯＣ培地（トリ
プトン２０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム０．５
８５ｇ、塩化カリウム０．１８６ｇ、塩化マグネシウム
１０ｍＭ、硫酸マグネシウム１０ｍＭ、グルコース２０
ｍＭ：１リットルあたり）９００μＬに加え、３７℃で
約１時間振盪培養した。５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシ
リンを含有するＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ〔ｐＨ
７〕：１リットルあたり）に塗り広げ、形質転換された
大腸菌を選択した。

【００５８】実施例２ １）大腸菌によるヒトＣＮＴＦ改変体の発現 実施例１により得られた本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発
現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換した後、この形
質転換された大腸菌を利用しヒトＣＮＴＦ改変体を発現
させた。発現はＴＹＧＰＮ培地（トリプトン２０ｇ、酵
母エキス１０ｇ、グリセリン８ｍＬ、リン酸１ナトリウ
ム５ｇ、硝酸カリウム１ｇ〔ｐＨ６．１〕：１リットル
あたり）を用い、少量培養を行った。

【００５９】即ち、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含
むＴＹＧＰＮ培地９００μＬに大腸菌株ＪＭ１０９の形
質転換体の種培養１００μＬを加え、３７℃で振盪培養
した。２時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを
加え、３時間培養した。遠心後、下記の溶菌操作を行っ
た。培養液ペレットに溶菌溶液（５０ｍＭ トリス・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、リゾチーム０．２７ｍｇ／ｍＬ、０．１３ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ、６０Ｕ ＤＮａｓｅＩ）１００μＬを添
加し、３７℃で１時間消化した後、遠心（１５０００ｒ
ｐｍ×１５分）した。そのライセートの上清をＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる濃度検定及びＤＲＧニュ−ロンの生存維
持活性測定のためのサンプルとした。なお、ＤＲＧニュ
−ロンの生存維持活性測定サンプルは５０μＬのライセ
ートの上清を、９５０μＬのＰＢＳ（０．１％ＢＳＡを
含む。）に希釈し、ろ過除菌して調製した。

【００６０】２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるヒトＣＮＴＦ
改変体の発現の確認と定量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の条件で行った。市販の１５
％−２５％ポリアクリルアミド濃度のグラジエントゲル
（第一化学薬品社製）を用いた。前記ライセートの上清
の４μＬを各ウェルにのせ、定電流（４０ｍＡ）で１時
間泳動を行った。

【００６１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた、Ｅ１５
３位の改変体における泳動パターンを例として図８
（Ａ）及び（Ｂ）に示した。図８（Ａ）中、レーン１は
分子量マーカー、レーン２及びレーン１２は大腸菌発現
天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３は天然型ヒトＣＮＴ
Ｆの前記ライセート上清、レーン４〜１１は本実施例に
より得られたＥ１５３位改変体の前記ライセート上清
（４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｋ、６：Ｅ１５３Ａ、
７：Ｅ１５３Ｖ、８：Ｅ１５３Ｌ、９：Ｅ１５３Ｇ、１
０：Ｅ１５３Ｐ、１１：Ｅ１５３Ｉ）の泳動パターンを
示す。同様に図８（Ｂ）中、レーン１は分子量マーカ
ー、レーン２及びレーン１２は大腸菌発現天然型精製ヒ
トＣＮＴＦ、レーン３は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライ
セート上清、レーン４〜１１は本実施例により得られた
Ｅ１５３位改変体の前記ライセート上清（４：Ｅ１５３
Ｙ、５：Ｅ１５３Ｆ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３
Ｈ、８：Ｅ１５３Ｍ、９：Ｅ１５３Ｑ、１０：Ｅ１５３
Ｎ、１１：Ｅ１５３Ｄ）の泳動パターンを示す。また、
ヒトＣＮＴＦの位置を←で表記した。

【００６２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた、Ｅ１５
３位の改変体、Ｑ６３Ｒ改変体及び本発明の両部位の変
異の組み合わせ（Ｅ１５３／Ｑ６３Ｒ）による改変体に
おける泳動パターンを図９に示した。図９中、レーン１
は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン２は天然
型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン３〜９は
本実施例により得られた各改変体の前記ライセート上清
（３：Ｑ６３Ｒ、４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｙ、
６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｒ／Ｑ６３Ｒ、８：Ｅ１
５３Ｙ／Ｑ６３Ｒ、９：Ｅ１５３Ｗ／Ｑ６３Ｒ）の泳動
パターンを示す。また、天然型ヒトＣＮＴＦの泳動位置
を←（１）、Ｑ６３Ｒ改変体の泳動位置を←（２）で表
記した。

【００６３】この結果から、スキャナーを利用して電気
泳動の画像を取り込み、ＣＮＴＦに由来するゲルバンド
の濃度を画像処理ソフト（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４
７）を用いて定量した。一例として、天然型ヒトＣＮＴ
Ｆ及びヒトＣＮＴＦ改変体（Ｅ１５３Ｒ）の定量の結果
を示すと、それぞれ６．４μｇ／ｍＬ、７．０μｇ／ｍ
Ｌであった。

【００６４】３）ＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＮＴＦ改変
体の定量 精製抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体を利用して、サンドイッ
チＥＬＩＳＡ法により、活性測定サンプル中のヒトＣＮ
ＴＦ改変体の濃度を定量した。即ち、予め抗天然型ヒト
ＣＮＴＦ抗体を固定化しておいた９６穴プレートに、５
０μＬの測定サンプルをのせ、４℃で一晩放置した。Ｐ
ＢＳで各ウェルを洗浄（２００μＬ、３回）し、ビオチ
ン化抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／
ＮａＮ₃に１０００倍希釈したもの）５０μＬを反応さ
せた。２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、アルカリ
性ホスファターゼ結合ストレプトアビジン（３％ＢＳＡ
／ＰＢＳ／ＮａＮ₃ に２０００倍希釈したもの）（ＶＥ
Ｃ社）５０μＬを入れ、室温にて２時間放置した。再度
２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍ
Ｌ濃度のＰＮＰＰを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム、１ｍ
Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ９．８）溶液に室温にて溶解
し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。なお、精製抗天然
型ヒトＣＮＴＦ抗体の調製は、天然型ヒトＣＮＴＦをリ
ガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー
により行った。

【００６５】天然型ヒトＣＮＴＦ及びヒトＣＮＴＦ改変
体（Ｅ１５３Ｒ）の定量の結果はそれぞれ７．６μｇ／
ｍＬ、７．９μｇ／ｍＬであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結
果から推定されたものとほぼ同程度であった。他の改変
体に関しても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた定量値とＥ
ＬＩＳＡ法から求めた定量値でほぼ同程度の結果が得ら
れた。図１０〜１７では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた
定量値で表している。

【００６６】実施例３ ヒトＣＮＴＦ改変体の活性測定 ニワトリ後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの生存維持活
性を指標として、実施例２により得られた各ＣＮＴＦ改
変体の活性測定を行った。即ち、１０日令ニワトリ胚
（Ｅ１０）からＤＲＧニューロンを摘出し、トリプシン
（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％
ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、３０分）
を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）
でコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含
むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７
℃、７２時間）を行った。培養後の生存細胞について、
１０μｇのＭＴＴを添加した際の還元能を指標として、
フォルマザンの生成量を５７０ｎｍの吸光度で調べた。
なお、各ＣＮＴＦ改変体は前培養の後、最終濃度０．０
０１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬとして各々添加し
た。

【００６７】また、対照として、天然型ヒトＣＮＴＦを
用いてＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を測定し
た。なお、活性測定に使用した天然型ヒトＣＮＴＦ及び
各ＣＮＴＦ改変体サンプルは、同じ方法で同時に調製し
たものである。

【００６８】また、１５３位のグルタミン酸残基をアル
ギニン残基に置換したＥ１５３Ｒ改変体、チロシン残基
に置換したＥ１５３Ｙ改変体、ヒスチジン残基に置換し
たＥ１５３Ｈ改変体、フェニルアラニン残基に置換した
Ｅ１５３Ｆ改変体、トリプトファン残基に置換したＥ１
５３Ｗ改変体については、以下のようにニワトリ毛様体
神経節（ＣＧ）ニューロンに対する生存維持活性も調べ
た。即ち、８日令ニワトリ胚（Ｅ８）からＣＧニューロ
ンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓ
ｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前
培養（３７℃、６０分）を行った。次に、ポリオルニチ
ン（０．５ｍｇ／ｍＬ）及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）
でダブルコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μ
Ｌ、３７℃、２４時間）を行った。培養後の生存細胞に
ついては、ＤＲＧの場合と同様にＭＴＴを用いて吸光度
を測定し、生存維持活性の指標とした。

【００６９】さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改
変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３
Ｗ改変体については、以下のようにラットＤＲＧニュー
ロンに対する生存維持活性も調べた。すなわち、２１日
令ラット胚（Ｅ２１）からＤＲＧニューロンを摘出し、
トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理し
た後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７
℃、３０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５
ｍｇ／ｍＬ）及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）でダブルコ
ートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤ
ＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、
７２時間）を行った。培養後の生存細胞については、ニ
ワトリＤＲＧの場合と同様にＭＴＴを用いて吸光度を測
定し、生存維持活性の指標とした。

【００７０】また、本実施例における生存維持活性の測
定結果の一部として、上記と同様の方法により調製した
ライセートの上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦ
と精製天然型ヒトＣＮＴＦのニワトリＤＲＧニューロン
に対する生存維持活性（図１０）、Ｅ１５３位改変体の
ニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１
１〜１４）、また、１５５番目のリジン残基に変異を導
入した改変体（Ｋ１５５位改変体）のニワトリＤＲＧニ
ューロンに対する生存維持活性（図１５）を示す。さら
に、Ｅ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ
改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体のニワト
リＣＧニューロンに対する生存維持活性（図１６）およ
びＥ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改
変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体のラットＤ
ＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１７）につい
ても、対応する図に示す。図１０〜１７において、縦軸
は５７０ｎｍにおける吸光度（フォルマザンの生成を示
す。）を、横軸は添加したＣＮＴＦの濃度をそれぞれ示
す。

【００７１】また、組換え天然型ヒトＣＮＴＦとＥ１５
３位、Ｑ６３位の単独の置換体及び両部位の変異の組み
合わせによる、改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対
する生存維持活性の測定も行った。結果を図１８に示
す。図１８においては天然型ＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改
変体を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した場合の活性値を示
しており、縦軸はＣＮＴＦ応答細胞の生存率（％）とし
て、５７０ｎｍにおける吸光度を、１００ｎｇ／ｍＬの
ＣＮＴＦ或いはＣＮＴＦ改変体を添加した場合を１００
％とし（表記実験の場合は、Ａ₅₇₀ ＝０．１９を１００
％とする）、％表示したもの（フォルマザンの生成を示
す。）である。ＰＢＳはブランクテストとして、ＣＮＴ
Ｆの代わりにＰＢＳ溶液（０．１％ＢＳＡを含む）を添
加したもの、Ｗｉｌｄは天然型ヒトＣＮＴＦを添加した
ものである。

【００７２】１）ライセート上清希釈液中の組換え天然
型ヒトＣＮＴＦの活性 図１０は、ライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒト
ＣＮＴＦと精製天然型ヒトＣＮＴＦのニワトリＤＲＧニ
ューロンに対する生存維持活性を比較したものである
が、両者はほぼ同等の活性を示したことから、ライセー
ト上清中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦは活性型であるこ
とが定量的に確認された。

【００７３】２）Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニ
ューロンに対する活性 図１１〜図１４において、１５３位のアミノ酸残基がメ
チオニン、ロイシン、バリン、アラニン、グルタミン、
アスパラギン、グリシン、プロリン、リジンの残基に置
換された場合（Ｅ１５３Ｍ、Ｅ１５３Ｌ、Ｅ１５３Ｖ、
Ｅ１５３Ａ、Ｅ１５３Ｑ、Ｅ１５３Ｎ、Ｅ１５３Ｇ、Ｅ
１５３Ｐ、Ｅ１５３Ｋ）、１５３位がグルタミン酸（天
然型）のものに対して２〜３倍の生存維持活性を示し、
１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チ
ロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換
された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ
１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）は、約１０倍の生存維持活性を
示した。また、１５３位のアミノ酸残基がアスパラギン
酸またはイソロイシンに置換された場合（Ｅ１５３Ｄ、
Ｅ１５３Ｉ）は、天然型と同程度の生存維持活性を示し
た。

【００７４】図１８に示したＥ１５３位改変体及びＱ６
３Ｒ改変体（それぞれ単独の変異）は天然型ＣＮＴＦよ
りも高い生存維持活性を示し、また各単独の改変体は同
程度の比活性であることが確認された。さらに、両変異
を組み合わせた改変体は、天然型ＣＮＴＦよりも、さら
にはそれぞれ単独の改変体よりも高い比活性を示した
（図１８）。

【００７５】３）Ｋ１５５位改変体のニワトリＤＲＧニ
ューロンに対する活性 図１５は、Ｋ１５５Ｒ改変体、Ｋ１５５Ａ改変体、Ｋ１
５５Ｍ改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存
維持活性を示したものであるが、元々のリジン残基と同
様に正電荷を有するアルギニン残基への変異の時のみ、
天然型ＣＮＴＦの１％弱の活性を保持しているが、他の
アミノ酸残基への変異では、いずれも活性を消失してし
まった。

【００７６】４）Ｄ１キャップ領域に変異を導入した改
変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性 また、本実施例におけるヒトＣＮＴＦのＤ１キャップ領
域に変異を導入した改変体の、ニワトリＤＲＧニューロ
ンに対する生存維持活性を図１９にまとめた。前述の１
５３位及び１５５位以外の改変体においても、変異によ
る活性の変動が大きかった。

【００７７】５）Ｅ１５３位改変体のニワトリＣＧニュ
ーロンに対する活性 図１６において、１５３位のアミノ酸残基がアルギニ
ン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプ
トファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３
Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）、１５３位
がグルタミン酸（天然型）のものに対して１０倍近い生
存維持活性を示した。ＤＲＧニューロンに対して高比活
性を示した改変体はＣＧニューロンに対しても天然型よ
り高い生存維持活性を示したことから、当該改変体は他
のニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を
示すことが考えられる。

【００７８】６）Ｅ１５３位改変体のラットＤＲＧニュ
ーロンに対する活性 図１７において、１５３位のアミノ酸残基がアルギニ
ン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプ
トファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３
Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）、１５３位
がグルタミン酸（天然型）のものに対して１０倍近い生
存維持活性を示した。この結果から、鳥類であるニワト
リのニューロンに対して高比活性を示した改変体は、哺
乳類であるラットのニューロンに対しても天然型より高
い生存維持活性を示すと考えられる。さらにこの結果か
ら、ヒトのニューロンに対しても天然型より高い生存維
持活性を示すことが期待される。

【００７９】これらの結果から以下のことが考察され
た。１５３位の位置がグルタミン酸（天然型）又はアス
パラギン酸の場合は活性が低いことから、１５３位の負
電荷の存在はヒトＣＮＴＦの活性発現には不利であると
考えられる。このことは、負電荷をなくす改変により活
性が上昇するという事実により支持される。さらに、Ｅ
１５３Ｒ改変体が非常に高い活性を示した理由として
は、グルタミン酸とは逆の電荷を持つアルギニンが１５
３位に導入されたことによると考えられる。また、１５
３位に芳香族性アミノ酸を導入した場合（Ｅ１５３Ｙ、
Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ、Ｅ１５３Ｈ）にも非常に高い
生存維持活性を示した。その理由としては、受容体側と
の疎水的相互作用又はＣＮＴＦ内の他の残基との活性発
現に有利な相互作用の可能性が予想される。

【００８０】比活性上昇に効果のある変異として同定さ
れた部位（Ｅ１５３位及びＱ６３位）について、それぞ
れ単独の変異よりも両変異を組み合わせることによる相
加的な活性の上昇が示された。２つの部位は３次元的に
も異なる位置にあり（図２０）、１分子中に２つの変異
を行っても、それぞれの部位の改変の効果が現れたもの
と予想された。

【００８１】また、１５５位にアミノ酸の置換を施した
場合、元々のリジンと長さがほとんど同じメチオニン残
基、あるいは長さが短く立体的障害はないと考えられる
アラニン残基でも、１５５位のリジン残基の役割を補償
することが全くできないということから、１５５位のリ
ジン残基はＣＮＴＦの受容体に厳密に認識されていると
考えられた。更に、実施例としては示さないが、Ｋ１５
５Ａ改変体精製タンパク質は、天然型ヒトＣＮＴＦ精製
タンパク質とほとんど同じ円偏光二色性（ＣＤ）スペク
トルを示すことから、活性を消失したＫ１５５Ａ改変体
は天然型ヒトＣＮＴＦとほとんど同じ全体構造を保持し
ていると考えられた。また、このＫ１５５Ａ改変体は天
然型ヒトＣＮＴＦの受容体への結合を阻害することか
ら、活性を消失したＫ１５５Ａ改変体はＣＮＴＦの受容
体への結合能力は保持していると考えられた。以上のこ
とから、１５５位のリジン残基は細胞内へのシグナル伝
達に必須のアミノ酸残基であると予想された。

【００８２】Ｄ１キャップ領域内の他のアミノ酸残基の
役割に関しては、前述の１５３位及び１５５位のアミノ
酸のように、明快に考察することはできないが、少なく
とも１５６位及び１５７位のアミノ酸残基は、Ｄ１キャ
ップ領域の活性構造形成に重要であると予想された。い
ずれにしろ、単一の残基で活性を発現できるものではな
く、ＣＮＴＦ受容体に厳密に認識される１５５位の周辺
残基であるＤ１キャップ領域全体で、１つの活性構造を
形成していると考えられ、当領域全体としての重要性が
考えられた。

【００８３】なお、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体とヒト
成長ホルモン（ｈＧＨ）に構造のホモロジーがあると仮
定し、ｈＧＨの３次構造上に変異導入部位（「Ｄ１キャ
ップ領域」及び「Ｑ６３」としてとして図中に記載）を
描き加えたものを図２０に表した。図２０中の各数字は
ヒトＣＮＴＦアミノ酸残基の番号を表す。

【００８４】

【発明の効果】本発明で予測される改変タンパク質は、
天然型タンパク質と同等あるいはそれ以上の活性を有す
るため、大量投与による自己抗体の出現等の副作用およ
び、その他の副作用を減じた有用な治療剤としての利用
が期待される。また更には、絶対投与量の低下に伴い、
これら天然型タンパク質に混在する有害物質の削減、及
び製造スケールの縮小が可能になると期待される。

【００８５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２００ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu １ ５ 10 15 Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr 20 25 30 Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile 35 40 45 Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 65 70 75 80 Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val 85 90 95 His Phe Tyr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu 100 105 110 Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile 115 120 125 Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile 130 135 140 Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys 145 150 155 160 Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu 165 170 175 Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His 180 185 190 Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met 195 200

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）による本発明
のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製方法の概略を
示す。

【図２】図２は、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体の発現ベ
クターの作成に用いたベクター（pKK223-4）の構造を示
す。

【図３】図３は、αヘリックスに富むサイトカイン類の
中の、長鎖構造のグループに属するタンパク質に関し
て、構造活性相関解析の既知の結果、あるいは活性発現
に関与すると予想される部位を簡略に示したものであ
る。（Ａ）はシグナル伝達にｇｐ１３０を利用するタン
パク質のグループであり、（Ｂ）はそれ以外のグループ
である。実験的に活性発現に重要であることが既知の領
域に関しては網掛けで、活性発現への関与が予測される
領域に関しては破線で囲って表記した。各タンパク質に
おける構造活性相関解析の報告を以下に列挙する（R. S
avino et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1993
年）90巻、4067頁、C. Lutticken et al.,FEBS Lett.(1
991年）282 巻、265 頁、J. P. J. Brakenhoff et al.,
J. Immunol.(1990年）145 巻、561 頁、X. Li et al.,
J. B. C. (1993年）268 巻、22377 頁、B. C. Cunning
ham et al., Science (1990年)247巻、1461頁、A. M. D
evos et al., Science(1992年）255 巻、306 頁、J. P.
J. Brakenhoff et al., J.B. C. (1994年）269 巻、86
頁、R. C. Robinson et al., Cell(1994年）77巻、1101
頁、J. C. Kallestad et al., J. B. C. (1991年)266
巻、8940頁、I. Kawashima et al., FEBS Lett.(1991
年）283 巻、199 頁、V. Goffin et al., Eur. J. Bioc
hem. (1993年）214 巻、199 頁、B. Lovejoy et al.,
J. Mol. Biol. (1993年）234 巻、640 頁、D. Wen et a
l., J. B. C.(1994年）269 巻、22839 頁、B. F. Cheet
han et al., Antiviral Res.(1991年）15巻、27頁）。

【図４】図４は、天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pK
KCNTF ）の構築図を示す。

【図５】図５は、実施例１において用いたプライマーを
示す。なお、下線部分は、導入した制限酵素認識部位を
示し、！はミスマッチ位置を表す。・・はＧ、Ａ、Ｔ及
びＣの混合を、＊はＧ及びＣの混合を表す。

【図６】図６は、実施例１において用いたＰＣＲによる
各ステップの遺伝子増幅反応条件を示す。

【図７】図７は、両部位の置換（１５３位／６３位）を
組み合わせた本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクター
の調製方法の概略を示す。

【図８】図８は、ヒトＣＮＴＦ改変体におけるＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す写真である。図８
（Ａ）〔レーン１: 分子量マーカー、レーン２: 大腸菌
発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３: 天然型ヒトＣ
ＮＴＦのライセート上清、レーン４〜１１: Ｅ１５３位
改変体のライセート上清（４：１５３Ｒ、５：Ｅ１５３
Ｋ、６：Ｅ１５３Ａ、７：Ｅ１５３Ｖ、８：Ｅ１５３
Ｌ、９：Ｅ１５３Ｇ、１０：Ｅ１５３Ｐ、１１：Ｅ１５
３Ｉ）、レーン１２：大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴ
Ｆ〕、図８（Ｂ）〔レーン１: 分子量マーカー、レーン
２: 大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３: 天
然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン４〜１１:
Ｅ１５３位改変体のライセート上清（４：１５３Ｙ、
５：Ｅ１５３Ｆ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｈ、
８：Ｅ１５３Ｍ、９：Ｅ１５３Ｑ、１０：Ｅ１５３Ｎ、
１１：Ｅ１５３Ｄ）、レーン１２：大腸菌発現天然型精
製ヒトＣＮＴＦ〕。

【図９】図９は、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体のＳＤＳ
−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す写真である。図
９中、レーン１は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、
レーン２は天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レー
ン３〜９は本実施例により得られた各改変体のライセー
ト上清（３：Ｑ６３Ｒ、４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３
Ｙ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｒ／Ｑ６３Ｒ、８：
Ｅ１５３Ｙ／Ｑ６３Ｒ、９：Ｅ１５３Ｗ／Ｑ６３Ｒ）の
泳動パターンを示す。また、天然型ヒトＣＮＴＦの泳動
位置を←（１）、Ｑ６３Ｒ改変体の泳動位置を←（２）
で表記する。

【図１０】図１０は、大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴ
Ｆ（○）と大腸菌のライセート上清希釈液中の組換え天
然型ヒトＣＮＴＦ（●）のニワトリＤＲＧニューロンに
対する生存維持活性を示す。

【図１１】図１１は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲ
Ｇニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中
（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ
（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）を示し、（Ｂ）における各デ
ーターは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ
（▲）、Ｅ１５３Ｙ（△）、Ｅ１５３Ｆ（○）、Ｅ１５
３Ｗ（□）を示す。

【図１２】図１２は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲ
Ｇニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中
（Ｃ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ
（●）、Ｅ１５３Ａ（□）、Ｅ１５３Ｖ（■）、Ｅ１５
３Ｌ（△）を示し、（Ｄ）における各データーは、天然
型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｇ（□）、Ｅ１５３Ｐ
（■）を示す。

【図１３】図１３は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲ
Ｇニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中
（Ｅ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ
（●）、Ｅ１５３Ｍ（□）、Ｅ１５３Ｉ（△）を示し、
（Ｆ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ
（●）、Ｅ１５３Ｋ（□）を示す。

【図１４】図１４は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲ
Ｇニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中
（Ｇ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ
（●）、Ｅ１５３Ｑ（○）、Ｅ１５３Ｎ（□）、Ｅ１５
３Ｄ（■）を示す。

【図１５】図１５は、Ｋ１５５位改変体のニワトリＤＲ
Ｇニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中
における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｋ１
５５Ｒ（○）、Ｋ１５５Ａ（△）、Ｋ１５５Ｍ（□）を
示す。

【図１６】図１６は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＣＧ
ニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中
（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ
（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）、Ｅ１５３Ｙ（△）、Ｅ１５
３Ｆ（□）を示し、（Ｂ）における各データは、天然型
ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（△）、Ｅ１５３Ｗ
（○）を示す。

【図１７】図１７は、Ｅ１５３位改変体のラットＤＲＧ
ニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中
（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ
（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）、Ｅ１５３Ｙ（□）、Ｅ１５
３Ｆ（■）を示し、（Ｂ）における各データは、天然型
ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（△）、Ｅ１５３Ｗ
（▲）を示す。

【図１８】図１８は、天然型ＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改
変体を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した場合の活性値を示
す。縦軸は、ＣＮＴＦ応答細胞の生存率（％）として、
５７０ｎｍにおける吸光度（フォルマザンの生成を示
す）で、１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ或いはＣＮＴＦ改
変体を添加した場合を１００％として（表記実験の場
合、Ａ₅₇₀ ＝０．１９を１００％とする）、その値に対
する比率で表した。

【図１９】図１９は、ヒトＣＮＴＦにおけるＤ１キャッ
プ領域の変異による改変体の、ニワトリＤＲＧニューロ
ンに対する生存維持活性を示す。各点（●）が、それぞ
れの改変体を表し、５０％有効濃度（ＥＣ５０）の比較
による、天然型ヒトＣＮＴＦに対する活性百分率（％）
で表記した。

【図２０】図２０は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の３
次構造上に、本発明におけるヒトＣＮＴＦ改変体の変異
導入部位（「Ｄ１キャップ領域」及び「Ｑ６３」）を表
記したものを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/54 14/575 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 1/107 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 伊藤 彰 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内 (72)発明者 木村 徹 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内 (72)発明者 中山 智加男 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内 (72)発明者 野口 浩 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ４本のヘリックス束構造（Ｎ末端側から
   ヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと呼ぶ。）を有するタンパク
   質のアミノ酸配列中、Ｄ１キャップ領域（但し、Ｄ１キ
   ャップ領域とはヘリックスＣとヘリックスＤの間である
   ＣＤループ領域とヘリックスＤとの境界領域のことをい
   い、そのアミノ酸配列が−φ−（Ｆ／Ｗ）−（Ｅ／Ｑ）
   −（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−φ−Ｘ−Ｇ−（φは疎水性
   残基、Ｘはいずれの残基でも良いことを示す）で表され
   るＤ１モチーフ配列を有する領域をいう。）に相当する
   アミノ酸残基の少なくとも１つが、他のアミノ酸残基に
   置換されていることを特徴とする改変タンパク質。
2. 【請求項２】 ４本のヘリックス束構造を有するタンパ
   ク質が、細胞内へのシグナル伝達のための受容体として
   ｇｐ１３０を利用するタンパク質である請求項１記載の
   改変タンパク質。
3. 【請求項３】 ４本のヘリックス束構造を有するタンパ
   ク質が、細胞内へのシグナル伝達のための受容体として
   ｇｐ１３０を利用するタンパク質であって、Ｄ１モチー
   フ配列のＮ末端側から３番目のアミノ酸残基が、他のア
   ミノ酸残基に置換されていることを特徴とする請求項１
   記載の改変タンパク質。
4. 【請求項４】 ４本のヘリックス束構造を有するタンパ
   ク質が、ヒト毛様体神経栄養因子（以下、ヒトＣＮＴＦ
   と略す。）であって、そのアミノ酸配列中、天然型ヒト
   ＣＮＴＦのアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当す
   るアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されている
   ヒトＣＮＴＦ改変体であることを特徴とする請求項１記
   載の改変タンパク質。
5. 【請求項５】 ４本のヘリックス束構造を有するタンパ
   ク質が、白血球遊走阻止因子（以下、ＬＩＦと略す。）
   であって、そのアミノ酸配列中、天然型ＬＩＦのアミノ
   酸配列の少なくとも１５６位に相当するアミノ酸残基
   が、他のアミノ酸残基に置換されているＬＩＦ改変体で
   あることを特徴とする請求項１記載の改変タンパク質。
6. 【請求項６】 ４本のヘリックス束構造を有するタンパ
   ク質が、オンコスタチンＭ（以下、ＯＳＭと略す。）で
   あって、そのアミノ酸配列中、天然型ＯＳＭのアミノ酸
   配列の少なくとも１６１位に相当するアミノ酸残基が、
   他のアミノ酸残基に置換されているＯＳＭ改変体である
   ことを特徴とする請求項１記載の改変タンパク質。
7. 【請求項７】 ４本のヘリックス束構造を有するタンパ
   ク質が、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと
   略す。）であって、そのアミノ酸配列中、天然型Ｇ−Ｃ
   ＳＦのアミノ酸配列の少なくとも１４６位に相当するア
   ミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されているＧ−
   ＣＳＦ改変体であることを特徴とする請求項１記載の改
   変タンパク質。
8. 【請求項８】 他のアミノ酸残基が天然のアミノ酸残基
   又は非天然のアミノ酸残基であることを特徴とする請求
   項１〜７いずれか記載の改変タンパク質。
9. 【請求項９】 他のアミノ酸残基が中性又は塩基性アミ
   ノ酸残基であることを特徴とする請求項８記載の改変タ
   ンパク質。
10. 【請求項１０】 中性又は塩基性アミノ酸残基が、ヒス
    チジンを含む芳香族性アミノ酸残基又はアルギニン残基
    であることを特徴とする請求項９記載の改変タンパク
    質。
11. 【請求項１１】 ヒスチジンを含む芳香族性アミノ酸残
    基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、
    又はヒスチジン残基であることを特徴とする請求項１０
    記載の改変タンパク質。
12. 【請求項１２】 中性又は塩基性アミノ酸残基が、アラ
    ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、
    グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、チロ
    シン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジ
    ン、リジン又はアルギニン残基であることを特徴とする
    請求項９記載の改変タンパク質。
13. 【請求項１３】 天然型ヒトＣＮＴＦの６３位に相当す
    るアミノ酸残基が他のアミノ酸残基にさらに置換されて
    いることを特徴とする請求項４記載の改変タンパク質。
14. 【請求項１４】 ６３位に相当するアミノ酸残基がアル
    ギニン残基に置換されていることを特徴とする請求項１
    ３記載の改変タンパク質。
15. 【請求項１５】 請求項１〜１４いずれか記載の改変タ
    ンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載のＤＮＡを含有する発
    現ベクター。
17. 【請求項１７】 請求項１６記載の発現ベクターで形質
    転換された原核細胞又は真核細胞。