JP3768257B2 - 改変タンパク質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、改変タンパク質に関する。さらに詳しくは、４本のヘリックス束構造を有するタンパク質のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することによって改変した改変タンパク質、それをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、並びに該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生物活性を有する天然タンパク質を各種疾患の治療薬として用いるための臨床開発が検討されている。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ＧＭ−ＣＳＦと略す。）、マクロファージコロニー刺激因子（以下、Ｍ−ＣＳＦと略す。）、インターロイキン３（以下、ＩＬ−３と略す。）、インターロイキン６（以下、ＩＬ−６と略す。）等、多くのサイトカイン類について臨床試験が実施され、あるいは臨床試験が検討されている（造血因子（1994年）５巻、６〜86頁）。
【０００３】
しかしながら、一般的には蛋白製剤を慢性的に投与する場合、投与量が大量であるほど自己抗体の出現による副作用や、製造コスト上の問題が生じやすくなるといった問題点がある。このような問題点を改善するには、例えば天然型よりも比活性の高い改変タンパク質を用いて投与量を抑制するといった方法を用いること等が考えられる。ここで、比活性の高い改変タンパク質を得るには構造活性相関解析等の基礎的データが必要となってくる。
【０００４】
サイトカイン類の中でも、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、成長ホルモン（以下、ＧＨと略す。）、プロラクチン（以下、ＰＲＬと略す。）、エリスロポエチン（以下、ＥＰＯと略す。）、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、及びＩＬ−３、ＩＬ−６等の各種インターロイキン類等は、いずれもαヘリックスに富み、共通構造として４本のヘリックス束構造（4-Helix Bundle) （なお、個々のヘリックスはＮ末端側からそれぞれヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと呼ぶ。）を有すると言われている(J. F.
Bazan, Neuron (1991年）７巻、197 頁）。
【０００５】
４本のヘリックス束構造を有するタンパク質は、１６０〜２００アミノ酸残基からなる長鎖構造のグループ（long-chain group) と１０５〜１４５アミノ酸からなる短鎖構造のグループ(short-chain group) に分類される(J. -L. Boulay & W. E. Paul, Curr. Biol. (1993年）３巻、573 頁、S. Sprang & J. Bazan, Curr. Opin. Struct. Biol.(1993年）３巻、815 頁）。前者には、ＧＨ、ＰＲＬ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、及びＩＬ−６、インターロイキン４（以下、ＩＬ−４と省略する）及びＧＭ−ＣＳＦ等を含む。
【０００６】
これらのサイトカイン類において、ヘリックスＡとヘリックスＢの間のアミノ酸残基（以下、ＡＢループ領域）及びヘリックスＤ領域に関しての生物活性発現に対する重要性が示されている。ＩＬ−６に関しても同様の報告がある (R. Sevino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993年）９０巻、4067頁、C. Lutticken et al., FEBS Lett.(1991年）282 巻、265 頁、J. P. J. Brakenhoff et al., J. Immunol.(1990年）145 巻、561 頁、X. Li et al., J. B. C. (1993年）268 巻、22377 頁）。ＧＨに関しては、変異体作製による同様の報告 (B. C. Cunningham et al., Science (1990年）247 巻、1461頁）と共に、ＧＨとＧＨ受容体との複合体のＸ線結晶解析により、直接の同定もなされている(A. M. DeVos et al., Science (1992年）255 巻、306 頁）。
【０００７】
また、バザーンはαヘリックスに富むサイトカイン類の中で、ヘリックスＣとヘリックスＤの間のアミノ酸残基（以下、ＣＤループ領域）とヘリックスＤの境界領域（以下、Ｄ１キャップ領域と省略する）において、Ｄ１モチーフと呼ぶアミノ酸の類似配列があることを示した(J. F. Bazan, Neuron (1991年）７巻、197 頁）。Ｄ１モチーフの配列は−φ−（Ｆ／Ｗ）−（Ｅ／Ｑ）−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−φ−Ｘ−Ｇ−（φは疎水性残基、Ｘはいずれの残基でも良いことを示す）であり、同領域は、例えばＬＩＦ（１５４〜１６１番目）、ＯＳＭ（１５９〜１６６番目）、ＩＬ−６（１５７〜１６４番目）、インターロイキン１１（以下、ＩＬ−１１と省略する）（１４８〜１５５番目）のそれぞれのアミノ酸に相当すると考えられる。このＣＤループ領域とヘリックスＤの境界領域に関しては、ＩＬ−６（J. P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁）及びＬＩＦ(R. C. Robinson et al., Cell (1994年）77巻、1101頁）において、受容体結合への重要性が報告されている。
【０００８】
しかしながら、ＩＬ−６のＤ１キャップ領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフとの類似性がないため、Ｄ１モチーフ上での改変に重要なアミノ酸の同定にはならず、また、ＬＩＦの同領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフと類似性が高いものの改変に重要なアミノ酸残基の同定はなされていない。また、他のαヘリックスに富むサイトカイン類では、同領域が活性発現に重要であるという報告は無い。
【０００９】
一方、ヒトＣＮＴＦは、２００個のアミノ酸残基からなり、αヘリックスに富み、５３％のαヘリックス、９％のβターン構造の含量からなると言われている(A. Negro et al., J. Neurosci. Res., (1991年）29巻、251 頁）。２次構造解析から、ヒトＣＮＴＦはαヘリックスに富むサイトカイン類と類似した構造であることが予想され、Ｄ１モチーフの配列はヒトＣＮＴＦにおいては１５１〜１５８番目のアミノ酸残基に相当する。このようにヒトＣＮＴＦは４本のヘリックス束構造を有するタンパク質の中では長鎖構造のグループに属し、同グループ内タンパク質とのより緊密な類似性が予想される。
【００１０】
また、ヒトＣＮＴＦに関して、細胞内へシグナルを伝える為の受容体としては、ＣＮＴＦ受容体α（以下、ＣＮＴＦ−Ｒαと省略する）、ＬＩＦ受容体（以下、ＬＩＦ−Ｒと省略する）及びｇｐ１３０の３種から構成されていると考えられている。ｇｐ１３０は、ヒトＣＮＴＦの場合と共に、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＩＬ−１１のシグナル伝達の場合にも共通な受容体である(S. Davis et al., Science(1991年）253 巻、59頁、S. Davis et al., Science (1993年）260 巻、1805頁、D. P. Gearing et al., Science(1992年）255 巻、1434頁、N. Y. Ip et al., Cell(1992年）69巻、1121頁）。前述の構造の類似性と共に、同じ受容体を共有しているという点から、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＩＬ−１１においては、それぞれのリガンド内で、同じ部位に相当するアミノ酸残基が受容体との結合に関わっている可能性が高いと考えられる。
【００１１】
ヒトＣＮＴＦは副交感神経である毛様体神経節の生存維持効果を示す因子として、１９７９年にシルビオ・バロン(S.Varon）らによって発見され(Brain Res. （1979年）173 巻、29-45 頁）、その後、精製およびクローニングについて報告されている(G. Barbin et al., J. Neurochem (1984 年）43巻、1468-1478 頁、L. F. Lin et al., Science (1989 年）246 巻、1023頁、P. Masiakowski et al., J. Neurochem (1991 年）57巻、1003頁、A. Negro et al., Eur. J. Biochem. (1991 年）201 巻、289 頁、J. R. McDonald et al., Biochim. Biophys. Acta.（1991年）、70巻、1090頁、国際公開番号 WO90／7341号公報、国際公開番号
WO91／4316号公報）。
【００１２】
ヒトＣＮＴＦの薬理作用に関し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、海馬、中隔ＧＡＢＡ作動性神経(N. Y. IP et al. J. Neursci. (1991) 11巻、3124-3134 頁）、視神経細胞(H. D. Hoffman J. Neurochem. (1988) 51巻、109-113 頁）、知覚神経(G. Barbin et al. J. Neurochem. (1984) 43 巻、1468-1478 頁）、副交感神経(Y. Arakawa et al. J. Neursci. (1990) 10巻、3507-3515 頁）および運動神経(M. Sendtner et al. J. Cell Science. suppl. (1991) 15 巻、103-109 頁）に対する生存維持効果、コリン作動性神経(S. Saadat et al. J. Cell Biol. (1989) 108巻、1807-1816 頁、U. Ernsberger et al. Neuron (1989) 2巻、1275-1284 頁）、タイプ２Ａアストロサイト(D. J. Anderson et al. TINS (1989) 12 巻、83頁）への分化活性、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、片側海馬−中隔野連絡路（Ｆ−Ｆ）切除モデルにおいて、中隔のコリン作動性神経の生存維持効果(T. Hagg et al. Neuron（1992年）8 巻、145 頁）、運動神経切断モデルにおける運動神経生存維持効果(M. Sendtner et al. Nature (1990) 345 巻、440-441 頁）、遺伝性運動疾患マウスにおける運動神経生存維持効果(M. Sendtner et al. Nature (1992) 358 巻、502-503 頁）、黒質−線条体切断モデルにおける黒質ドーパミン作動性神経に対する保護効果(T. Hogg & S. Varon Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1993) 90 巻、6315-6319 頁）、光受容体細胞の保護効果(M. M. LaVail et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1992) 89巻、11249-11253 頁）、視神経細胞の保護効果(K. Unoki & M. M. LaVail, Investigative Ophthalmology & Visual Science (1994) 35巻、907-915 頁）等が報告されている。
【００１３】
このようにヒトＣＮＴＦは神経細胞に作用して、その生存維持、突起伸展促進および神経伝達物質合成促進活性を示すことから、外傷による神経障害、アルツハイマー病、脳血管性痴呆症、筋萎縮性側索硬化症など神経細胞の萎縮・変性疾患に対し、有用な治療剤となることが期待されている(J. E. Springer, DN & P (1991) 4巻、394 頁、R. M. Lindsay, Neurobiol. of Aging (1994) 15巻、249-251 頁、R. M. Lindsay, TINS (1994) 17 巻、182 頁）。
【００１４】
さらに、運動神経変性疾患のモデル動物（Wobbler mice）における神経障害に対して、脳由来神経栄養因子との併用によるより効果的な保護効果が示され（H.Mitsumoto et al., Science （1994）265 巻、1107-1110 頁）、今後はヒトＣＮＴＦ単独だけではなく、他の神経栄養因子との併用による治療（R.Nishi, Science（1994）265 巻、1052-1053 頁）も含めて有用な治療剤となることが期待されている。
【００１５】
しかしながら、現在、米国で行われている筋萎縮性側索硬化症を対象とした天然型ヒトＣＮＴＦの臨床治験(Bio World Today, Sep. 8（1993年))では、週６ｍｇとかなり大量のヒトＣＮＴＦが投与されている。前記のように、一般的には蛋白製剤を慢性的に投与する場合、投与量が大量であるほど自己抗体の出現による副作用や、製造コスト上の問題が生じやすくなる。実際、ＣＮＴＦの米国のフェーズII、III 試験において、抗体の出現が見られ(BIO World Today, Sep 8 (1993)) 、他の副作用も問題となっている(BIO World Today, Jun 24 (1994)), Science (1994 年）264 巻、772-774 頁）。従って、天然型よりも比活性の高いヒトＣＮＴＦ改変体が期待されている。
【００１６】
このように天然型よりも比活性の高い改変タンパク質への期待は、ヒトＣＮＴＦのみならず、前記のような各種のサイトカイン類に対しても同様に強いものであり、構造活性相関の解析等による種々の検討がなされているものの、未だ効果的な改変体は見い出されていないのが実状である。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、４本のヘリックス束構造を有するタンパク質に関して天然型タンパク質よりも比活性の高い改変タンパク質を提供することにある。本発明の他の目的は、当該改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを提供することにある。本発明のさらに他の目的は、当該ＤＮＡを含有する発現ベクター、及び当該発現ベクターで形質転換された原核細胞又は真核細胞を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記課題を解決すべく、４本のヘリックス束構造を有するタンパク質のＤ１キャップ領域のアミノ酸残基に着目して鋭意研究したところ、Ｄ１キャップ領域に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸残基に置換することにより、当該タンパク質の比活性が上昇することを見いだし、本発明を完成するに到った。例えば、天然型ヒトＣＮＴＦでは、Ｄ１キャップ領域である１５５番目のリジン残基が活性発現に必須であることを発見した。また１５３番目のアミノ酸残基の置換がＣＮＴＦ活性の増加に有効であり、この位置のアミノ酸残基であるグルタミン酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、天然型ヒトＣＮＴＦの比活性を上昇できることを見出した。
【００１９】
即ち、本発明の要旨は、
（１） 天然型ヒト毛様体神経栄養因子（以下、毛様体神経栄養因子をＣＮＴＦと略す。）のアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基が、芳香族性アミノ酸残基又はアルギニン残基に置換されてなるヒトＣＮＴＦの改変タンパク質、
（２） 天然型ヒト毛様体神経栄養因子（以下、毛様体神経栄養因子をＣＮＴＦと略す。）のアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、プロリン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、リジン残基又はアルギニン残基に置換されてなるヒトＣＮＴＦの改変タンパク質、
（３） 天然型ヒトＣＮＴＦの６３位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基にさらに置換されている前記（１）又は（２）記載の改変タンパク質、
（４） 他のアミノ酸残基がアルギニン残基である前記（３）記載の改変タンパク質、
（５） 前記（１）〜（４）いずれか記載の改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、
（６） 前記（５）記載のＤＮＡを含有する発現ベクター、並びに、
（７） 天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基をアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、プロリン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、リジン残基又はアルギニン残基に置換する工程を含む、ヒトＣＮＴＦの改変タンパク質の製造方法、に関する。
【００２０】
本発明において「４本のヘリックス束構造を有するタンパク質」とは、ＬＩＦ、ＯＳＭ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＥＰＯ、インターロイキン２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、インターロイキン５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、骨髄単球成長因子（以下、ＭＧＦと略す。）、インターフェロンα（以下、ＩＦＮαと略す。）等のαヘリックスに富むサイトカイン類、及びヒトＣＮＴＦ等のタンパク質をいう。なかでも、細胞内へのシグナル伝達のための受容体としてｇｐ１３０を利用するタンパク質が好適であり、ヒトＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１等が挙げられる。
また、個々のヘリックス構造は、Ｎ末端側からそれぞれヘリックスＡ、ヘリックスＢ、ヘリックスＣ、ヘリックスＤという。本発明において「Ｄ１キャップ領域」とは、ＣＤループ領域（ヘリックスＣとヘリックスＤの間のアミノ酸残基をいう。）とヘリックスＤとの境界領域のことをいい、アミノ酸配列が−φ−（Ｆ／Ｗ）−（Ｅ／Ｑ）−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−φ−Ｘ−Ｇ−（φは疎水性残基、Ｘはいずれの残基でも良いことを示す。）で表される配列を有する領域をいう。この８個のアミノ酸からなる配列は、本発明における４本のヘリックス束構造を有するタンパク質において共通してみられるものであり、Ｄ１モチーフ配列と呼ばれる。表１に、上記４本のヘリックス束構造を有するタンパク質中のＤ１キャップ領域におけるＤ１モチーフのアミノ酸配列を示す。なお、ＩＬはインターロイキンを略記したものである。
【００２１】
【表１】
【００２２】
さらに、本発明において、「天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列」とは、国際公開番号WO９１／４３１６号公報に記載されたものであり（配列番号：１）、「天然型ＬＩＦのアミノ酸配列」とは、文献（R.C.Robinson et al.,Cell,(1994) 77巻1101頁）に記載されたものであり、「天然型ＯＳＭのアミノ酸配列」とは、文献（T.M.Rose and A.G.Bruce, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1991) 88巻8641頁, J.C.Kallestad et al., J.B.C.(1991) 266巻8940頁）に記載されたものであり、「天然型Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列」とは、文献（B.Lovejoy et al., J.Mol.Biol.(1993)234巻 640頁）に記載されたものである。本明細書におけるアミノ酸の位置の表記もこれらに従う。
【００２３】
本発明において、「改変タンパク質」とは、天然型タンパク質のアミノ酸配列中の少なくともＤ１キャップ領域に相当するアミノ酸残基（特にＤ１モチーフ中のアミノ酸残基）の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたタンパク質をいう。ここで、Ｄ１キャップ領域における改変、即ち、置換を受けるアミノ酸残基の数、種類、Ｄ１キャップ領域における位置等は限定されるものではない。しかしながら、改変タンパク質の比活性を高くする観点から、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されている改変体が好ましい。具体的には、ヒトＣＮＴＦにおける１５３位、ＬＩＦにおける１５６位、ＯＳＭにおける１６１位、Ｇ−ＣＳＦにおける１４６位が、ここでいうＤ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基に相当する。
【００２４】
本発明において、「他のアミノ酸残基」とは、天然のアミノ酸残基又は非天然のアミノ酸残基を意味する。他のアミノ酸残基が天然のアミノ酸残基の場合、中性又は塩基性アミノ酸残基が好ましい。即ち、本発明の改変タンパク質の好ましい例として、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン等の中性アミノ酸の残基や、ヒスチジン、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸の残基に置換されたものが挙げられる。なかでも、比活性の向上という観点から、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなどの芳香族性アミノ酸残基や、アルギニン等の残基に置換されたものがとりわけ好ましい。また、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、プロリン等の疎水性アミノ酸残基等も好適である。
【００２５】
また、他のアミノ酸残基が非天然のアミノ酸残基である場合としては、例えば蛋白質の合成段階で非天然アミノ酸を導入した場合、又は蛋白質合成後化学修飾された天然のアミノ酸残基等が挙げられる。蛋白質の合成段階で導入する方法として、部位特異的に様々な非天然アミノ酸を導入する一般的に有効な方法が報告されており(Science, 244, 182 (1989))、実際にパラ位をフッ素或いはニトロ基で修飾したフェニルアラニンを化学的にｔＲＮＡにアシル化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの蛋白合成系で発現した結果が示されている。また他の方法として、非天然のアミノ酸であるフラノマイシン(Furanomycin) を認識する大腸菌のIsoleucyl-ｔＲＮＡ(J. B. C., 265, 6931 (1990))を利用して目的の位置に導入したり、或いはCell−Freeの蛋白合成系(J. Biochem., 110, 166 (1991))において、目的の導入を行うことにより非天然のアミノ酸残基に置換されたもの等が挙げられる。
【００２６】
また、精製蛋白を利用して、アミノ酸残基特異的あるいは部位特異的に化学修飾したものも挙げられる（新生化学実験講座１，IV，11(1991)) 。例えばグルタミン酸残基に対しては、アミド化する、リジン残基に置換した後トリニトロフェニル化する、アルギニン残基に置換した後フェニルグリオキサールと反応させる、ヒスチジン残基に置換した後カルベトキシ化する、トリプトファン残基に置換した後アリールスルフェニルクロリドと反応させる、チロシン残基に置換した後ニトロ化する等の方法による改変体が挙げられる。これらの化学修飾は常法により行うことができる。
【００２７】
なお、本発明においては改変タンパク質の活性を著しく損なわないかぎり、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の置換に加え、その位置以外のアミノ酸残基に対する、通常蛋白工学分野で行われる改変（アミノ酸置換、アミノ酸削除、アミノ酸付加、およびドメイン置換等）を行うことも可能である。
【００２８】
例えば天然型ヒトＣＮＴＦにおいて、１５３位に加えて、さらに６３位、１３６位、１５４位、１５６位、１５７位、１６０位、１６３位、１６４位、１６７位、１７７位、１７８位、１８４位などのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したものが挙げられる。ここでいう１５３位以外のアミノ酸残基の置換は、前記のように定義される「他のアミノ酸残基」で置換される。天然型ヒトＣＮＴＦでは、アミノ酸配列の６３位のアミノ酸残基をアルギニン残基に置換することによりＣＮＴＦ活性が上昇することが既に公表されているが（Panayotatos et al., J.B.C., 268 巻,19000-19003頁（1993））、このようなヒトＣＮＴＦ上のＣＮＴＦ活性増加に有効な変異を組み合わせた置換を行うことにより、それぞれの部位の単独置換体以上の比活性を有する改変体をも得ることができる。例えば、１５３位に加えて６３位のアミノ酸残基も置換する場合、１５３位と６３位を共にアルギニンに置換したもの、１５３位はチロシンに６３位はアルギニンに置換したもの、１５３位をトリプトファンに６３位はアルギニンに置換したもの等が好適例として挙げられる。
【００２９】
本発明の改変タンパク質は、遺伝子工学分野における常法により作成することができる。即ち、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する場合、当該天然型タンパク質、又は当該改変体をコードするＤＮＡ含有ベクターの一部を合成オリゴヌクレオチドで置換して、当該天然型タンパク質のアミノ酸配列において、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸をコードするＤＮＡを他のアミノ酸をコードするＤＮＡに変え、これを適当な発現ベクターに連結して宿主内に導入し、形質転換させた宿主に目的の改変体を生産させることができる。以下、その詳細について述べる。
【００３０】
本発明の改変タンパク質の製造には、例えば、当該天然型タンパク質をコードする構造遺伝子を用いることができる。ヒトＣＮＴＦを改変する場合、天然型ヒトＣＮＴＦをコードするヒトＣＮＴＦ構造遺伝子は、例えばウサギあるいはヒトのゲノムＤＮＡからのクローニングによって既に取得されており(K. A. Stockli et al., Nature, 342, 316 (1989)., L. F. Lin et al., Science, 246, 1023 (1989)., P. Masiakowski et al., J. Neurochem., 57, 1003（1991)., A. Negro et al., Eur.J. Biochem., 201, 289（1991)., J. R. McDonald et al., Biochem. Biophys. Acta., 1090, 70（1991)., A. Lam et al., Gene, 102, 271 (1991)) 、そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列も知られている。従って、例えば常法（J. Sambrook et al., Molecular cloning : A laboratory manual)に従って、天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子をクローニングすることができる。また、ＬＩＦ、ＯＳＭ、Ｇ−ＣＳＦをコードする構造遺伝子も同様に取得されているので（J.F.Moreau et al., Nature(1988)336巻 690頁, M.N.Kallested et al., Mol.Cell.Biol.(1989) 9巻2847頁, H.Nomura et al., EMBO J.(1986) 5巻 871頁）、それらを用いてヒトＣＮＴＦと同様に行えばよい。
【００３１】
プラスミド中にクローニングした天然型タンパク質構造遺伝子の特定の配列を他の配列に置換する方法は、既に一般的に行える状況にあり、本発明においても常法により、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸残基を置換することができる。置換の方法は、目的とする置換したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを当該天然型タンパク質における置換の対象となる部分の配列（以下、相当配列と省略する。）と置き換える方法が便利である。
【００３２】
具体的には、例えば置換した塩基配列からなるオリゴヌクレチドと、増幅に必要なタンパク質の配列中、置換部位以外の塩基配列或いはベクター部分の配列に相当するオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、天然型タンパク質の構造遺伝子を含むプラスミドを鋳型にして、上記２種で挟まれた領域を増幅し、得られた増幅フラグメントを天然型タンパク質の相当配列と置き換える方法が便利である。２種のプライマーで挟まれた領域の増幅方法としては、例えば遺伝子増幅法（ＰＣＲ）（Gene, 77, 61-68 (1989)) が行われ、またこの操作を行うためには市販のＤＮＡ自動増幅装置が有効に用いられる。なお、１回の増幅反応で天然型タンパク質の相当配列との置き換えに都合の良い制限酵素切断部位を有するフラグメントが得られない場合には、１回目の遺伝子増幅産物を２回目の遺伝子増幅反応の１つのプライマーとして用い、目的の制限酵素切断部位を有するフラグメントを調製することもできる。
【００３３】
図１に、その一例としてヒトＣＮＴＦを対象とする場合を示す。図１に示されるように、２回の遺伝子増幅反応を行うことによって目的の置換した塩基配列が導入され、かつ天然型ヒトＣＮＴＦの相当配列との置き換えに都合の良い制限酵素切断部位を有するフラグメントを得ることができる。さらに、２つの異なる部位に置換を導入する場合には、別個にそれぞれの部位に変異を導入した後、適当な制限酵素切断部位を利用してクローニングし、両変異を持つ遺伝子を構築するか、あるいは一方の変異を導入したあと、その変異遺伝子をテンペレートとして用いて、さらに遺伝子増幅反応による一方の変異の導入を行い構築することができる。
【００３４】
目的の置換（あるいは挿入）が行われたＤＮＡ配列を確認するためには、ジデオキシ法（Science, 214, 1205（1981))の原理を利用し、例えばシークナーゼＤＮＡシークエンスキット（東洋紡社製）を用いて行うことができる。その他、実施例に記載されているような制限酵素によるＤＮＡの切断、欠失、それらにより生じるＤＮＡ断片の電気泳動による分離、回収、あるいは連結等の遺伝子操作は全て公知の方法（T.Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.（1982))に準じて行うことができる。
【００３５】
このようにして得られる改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡは、例えばｐＫＫ２２３−４（Pharmacia 社製、図２）等周知の発現ベクターに連結された後、適当な宿主に導入されることにより、本発明の目的物質である改変タンパク質を発現することができる。宿主としては、原核細胞または真核細胞のいずれでもよく、例えば大腸菌株や動物細胞株は、特に記載のない限り既に広く普及しており入手は容易である。例えば大腸菌宿主としては、ＪＭ１０９株等が挙げられる。また、動物細胞宿主としては、ＣＯＳ−１、ＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００３６】
発現ベクターを用いてこれらの宿主を形質転換するには、電気パルス法（高山伸一郎、細胞工学6、 771、 1987）、或いは塩化カルシウム法 (J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)) を用いればよい。このような形質転換された大腸菌株や動物細胞株等を用い、例えば常法(T. Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.（1982))に従って、改変タンパク質を発現させることができる。さらに、得られた菌株を常法に従い溶菌し、遠心分離（１０５００×ｇ）にかけて可溶性画分を得ることができる。発現された改変タンパク質は、必要に応じて常法に従って精製することも可能である。例えばヒトＣＮＴＦ改変体の場合は、J. Neurochem.,57, 1003（1991) に従って精製することができる。
【００３７】
ヒトＣＮＴＦ改変体の場合、具体的には、例えば、発現誘導後の大腸菌を、集菌後リゾチーム処理により溶解し、更に超音波処理を行う。遠心分離（１１０００×ｇ）を行い、ヒトＣＮＴＦ改変体を含む不溶性画分を得て、この画分を６Ｍの塩酸グアニジン溶液で可溶化し、次いでβメルカプトエタノールを含むトリス−塩酸緩衝液で透析し再生を行う。次に、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Asahipak-502NP: 旭化成社製）にかけた後、ＮａＣｌ直線濃度勾配により可溶化されたヒトＣＮＴＦ改変体を溶出する。更に、溶出した可溶性タンパク質を疎水性カラムクロマトグラフィー（Ether-5PW:東洋曹達社製）にのせ、洗浄後に硫酸アンモニウム直線濃度勾配で溶出することにより、精製ヒトＣＮＴＦ改変体を得ることができる(J. Neurochem., 57, 1004〜1005（1991）を参照し、一部改変した）。
【００３８】
発現された改変タンパク質の定量は、通常用いられる公知の方法でよい。例えば、天然型タンパク質を用いて得られる特異的抗体によるエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）やＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等が利用できる。ＥＬＩＳＡによる場合、上述と同様の方法で調製した天然型タンパク質の精製品を用い、例えば常法(Methods in Enzymology, 73, 46-52(1981))に従って、動物〔例えばニュージーランドホワイトラビット（♂，１ｋｇ）等〕に免疫して抗血清を取得することができる。抗血清からの特異的抗体の精製は、例えば天然型タンパク質を標品としてカラム担体〔例えば活性化セファロース（Pharmacia 社製, CNBr Activated Sepharose 等〕に結合させ、これを用いてカラムクロマトグラフィーを行うことにより可能である。該方法により得られる特異的抗体を用いて、改変タンパク質の定量のためのＥＬＩＳＡを行うことにより、未精製の状態で微量の改変タンパク質を検体とした場合でも、充分に定量を行うことが可能となる。
【００３９】
また、改変タンパク質を定量する別の方法として、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を利用することができる。即ち、公知の方法（Nature, 227, 680（1970))でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、当該タンパク質に由来するゲルバンドの濃度を画像処理ソフト（例えば、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４７）を用いて、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の場合と同様に未精製の状態で改変タンパク質の定量を行うことができる。
【００４０】
上述のようにして調製した改変タンパク質の生物活性は、それぞれのタンパク質に応じた方法で測定する。
例えばヒトＣＮＴＦ改変体タンパク質の生物活性は、ニワトリ後根神経節（ＤＲＧ）、毛様体神経節（ＣＧ）又はラットＤＲＧ等を用いることにより公知の方法（Nerve Growth Factors, 31-56,（1989))で測定することができる。また、ＬＩＦ改変体タンパク質の生物活性は、胎性幹細胞等種々の細胞を利用して、公知の方法（D.Metcalf, Growth Factors (1992) 7巻 169頁）で測定することができる。ＯＳＭ改変体タンパク質の生物活性は、黒色腫細胞の成長阻害活性等（D.Horn et al., Growth Factors (1990) 2巻 157頁）を利用して測定することができる。Ｇ−ＣＳＦ改変体タンパク質の生物活性は、造血系の腫瘍細胞であるＮＦＳ−６０細胞の成長促進活性（M.Tsuchiya et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83巻7633頁）等を利用して測定することができる。
【００４１】
本発明のヒトＣＮＴＦ改変体等の改変タンパク質は、天然型タンパク質と同等あるいはそれ以上の生物活性を有しているため、天然型に比べて有用な治療剤となり得ることが期待される。更に、天然型タンパク質の医薬品としての開発段階で問題になっている、大量投与による問題点、即ち、必要量を生産することの量的な難しさ、混在する物質による副作用、あるいは天然型タンパク質自身に対する抗体出現の為の副作用等の問題点を解決できる可能性があると考えられる。
【００４２】
例えばヒトＣＮＴＦ改変体の生物活性としては、後述の実施例において示されるように、１５３位のアミノ酸残基がアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、リジンの残基に置換された場合には、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して２〜３倍のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示し、１５３位のアミノ酸残基がチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニンの残基に置換された改変体は、ニワトリＤＲＧニューロン、ニワトリＣＧニューロン及びラットＤＲＧニューロンに対して天然型ヒトＣＮＴＦの約１０倍の生存維持活性を示す。また、１５３位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基（例えば、アルギニン、チロシン、トリプトファン残基）に置換され、かつ６３位のアミノ酸残基がアルギニン残基等に置換された場合には、ニワトリＤＲＧニューロンに対してそれぞれの単独置換体よりもさらに高い比活性を示す。
このように本発明のヒトＣＮＴＦ改変体は、天然型ヒトＣＮＴＦと同等あるいはそれ以上の生物活性を有しているため、天然型ヒトＣＮＴＦと同様に、運動神経変性疾患、末梢神経ニューロパチーなどの末梢神経関連疾患、アルツハイマー病、脳血管性痴呆症、パーキンソン病、ハンチング病などの中枢神経関連疾患、網膜色素変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜黄斑変性症などの眼関連神経の治療剤となり得る。更に、天然型ヒトＣＮＴＦの医薬品としての開発段階で問題になっている、大量投与による問題点、即ち、必要量を生産することの量的な難しさ、混在する物質による副作用、あるいはヒトＣＮＴＦ自身に対する抗体出現の為の副作用等の問題点を解決できる可能性があると考えられる。
【００４３】
前述したように、バザーンが、ＣＮＴＦ類縁タンパク質であるαヘリックスに富むサイトカイン類の中でＤ１キャップ領域においてＤ１モチーフと呼ぶアミノ酸の類似配列があることを示したが(J. F. Bazan, Neuron (1991年）７巻、197 頁）、本発明者らは今回初めてそのモチーフ内での各アミノ酸の役割を明らかにした。各タンパク質において、Ｄ１キャップ領域のＤ１モチーフとして予想されるアミノ酸配列を表１に示す。この時、長鎖構造のグループ（ＩＡ、ＩＢ）と短鎖構造のグループ（ＩＩ）を分類して表記し、更に長鎖構造のグループに関しては受容体としてｇｐ１３０を利用するグループ（ＩＡ；ＣＮＴＦはこのグループに属する）とそれ以外のグループ（ＩＢ）に分類して表記した。
ヒトＣＮＴＦと同様に、Ｄ１モチーフと類似配列を持つタンパク質は、長鎖構造のタンパク質に多く、特に受容体としてｇｐ１３０を利用するＬＩＦ及びＯＳＭ、あるいはＧ−ＣＳＦでの類似性が高い。
【００４４】
αヘリックスに富むサイトカイン類に関しては、現在までに多くの構造活性相関解析がなされており、ヒトＣＮＴＦと、より構造の類似性の高い長鎖構造のグループのタンパク質に関する構造活性相関解析の結果について、図３に簡略にまとめた。受容体としてｇｐ１３０を利用するグループ（Ａ）とそれ以外のグループ（Ｂ）に分類して表記し、また、実験的に活性発現に重要であることが既知の領域に関しては網掛けで、活性発現への関与が予測される領域に関しては破線で囲って表記した。
【００４５】
Ｄ１キャップを含むＣＤループとヘリックスＤの境界領域に関しては、前述のようにＩＬ−６ (J. P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁）及びＬＩＦ(R. C. Robinson et al., Cell (1994年）77巻、1101頁）において受容体結合への重要性が報告されている（但し、ＩＬ−６のＤ１キャップ領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフとの類似性が無いため、Ｄ１モチーフ上での改変に重要なアミノ酸の同定にはならず、また、ＬＩＦの同領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフと類似性が高いものの、改変に重要なアミノ酸残基の同定はなされていない）。また、他のαヘリックスに富むサイトカイン類で、同領域が活性発現に重要であるという報告は、後述するＧ−ＣＳＦを除くと報告されていない。また今回、ヒトＣＮＴＦにおいてＤ１キャップ領域の重要性が示されたことから、Ｄ１キャップ領域を受容体結合に利用するタンパク質の１つの共通項目として、ｇｐ１３０を受容体として利用するということが考えられる。同グループのタンパク質としては、ＣＮＴＦ以外にＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１が知られており、これらのタンパク質において、Ｄ１キャップ領域に相当するアミノ酸残基が、活性発現のための受容体結合に関与している可能性が高いと考えられる。
【００４６】
特に、ＬＩＦ及びＯＳＭはＤ１モチーフとの類似性が高いことから、ヒトＣＮＴＦにおけるＤ１キャップ領域での変異による効果と同じ効果が、それぞれのタンパク質での相当する部位の改変により起こることが予想される。具体的には、ヒトＣＮＴＦの１５５位のリジン残基に相当する、ＬＩＦの１５８位及びＯＳＭの１６３位のリジン残基の変異により、活性が激減することが予想され、またヒトＣＮＴＦの１５３位のグルタミン酸残基に相当する、ＬＩＦの１５６位及びＯＳＭの１６１位のグルタミン残基の変異により、ヒトＣＮＴＦの場合と同じような活性の上昇が期待される。また、この両残基に限らず、Ｄ１モチーフ内の他のアミノ酸の変異でも活性の変化があることが予想される。
【００４７】
ｇｐ１３０を利用しない、あるいは利用するという報告がないタンパク質の中で、Ｄ１モチーフの配列との類似性が顕著なものとしてＧ−ＣＳＦがある。Ｇ−ＣＳＦにおいては、同領域周辺を認識するモノクローナル抗体が、Ｇ−ＣＳＦの活性を中和するという報告もあり(J. E. Layton et al., J. B. C. (1991年）266 巻、23815 頁）、Ｄ１キャップ領域の受容体結合への関与が予想される。即ち、ヒトＣＮＴＦの１５３位のグルタミン酸残基に相当する、Ｇ−ＣＳＦの１４６位のグルタミン残基の変異により、ヒトＣＮＴＦの場合と同じような活性の上昇が期待され、Ｄ１モチーフ内の他のアミノ酸の変異により活性の変化が起こることが予想される。更に、Ｇ−ＣＳＦとの類似性が報告されているＭＧＦについても同様のことが予想され、ＭＧＦのＤ１キャップ領域内の変異により、活性の変化（あるいは上昇）が起こることが予想される。ｇｐ１３０を受容体として利用するタンパク質に限らず、Ｄ１モチーフという共通配列での受容体結合は一般に見られることかも知れない。
【００４８】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例において使用する略語の名称を以下に示す。
ＰＣＲ ： 遺伝子増幅法
ＢＡＰ ： bacterial alkaline phosphatase
ＩＰＴＧ ： isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
ＰＭＳＦ ： phenylmethanesulfonyl fluoride
ＰＢＳ ： phosphate buffered saline
ＢＳＡ ： bovine serum albumin
ＡＬＰ ： alkaline phosphatase
ＳＡ ： streptoavidine
ＰＮＰＰ ： p-nitrophenyl phosphate
ＤＲＧ ： dorsal root ganglion
ＤＭＥＭ ： dulbecco's modified eagle medium
ＦＣＳ ： fetal calf serum
ＭＴＴ： 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide
ＣＧ ： ciliary ganglion
【００４９】
実施例１
天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子への変異導入及びヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製
１）実験材料
大腸菌株ＪＭ１０９（lacIq : 宝酒造社製）をクローニングのため、また天然型ヒトＣＮＴＦおよびヒトＣＮＴＦ改変体の発現のための宿主菌として使用した。天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）としては、ｔａｃプロモーターを有する大腸菌発現ベクターであるpKK223-4（Pharmacia 社製、図２）に天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子及び該ＣＮＴＦ遺伝子の５’側にリンカーＤＮＡを挿入して作製したものを使用した（図４）。
【００５０】
２）変異導入遺伝子の増幅反応
ランダムなアミノ酸の部位特異的変異の導入は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）を利用した。数種の合成ＤＮＡプライマーを使用し、２段階のＰＣＲ反応により調製した（図１）。ＰＣＲには、テンペレートとして天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF)を使用し、ポリメラーゼは適合度（fidelity）の高いpfu ポリメラーゼ（Stratagene社製）を利用した。なお、使用したプライマーのシークエンスを図５に示した。変異部位のプライマーとしては、天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列における１５２番目から１５７番目のそれぞれのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したヒトＣＮＴＦ改変体（以下、例えば１５３位を置換したヒトＣＮＴＦ改変体を単に「Ｅ１５３位改変体」と省略する場合がある。）を得るためのプライマーを示したが、その相当部位において、第１コドン及び第２コドンはＧ、Ａ、Ｔ及びＣ、また第３コドンはＧ及びＣの混合として、合成の段階で調製した。これら３２種の混合プライマーにより、目的の部位については２０種のアミノ酸全てを網羅していることになる。
【００５１】
また、６３位のグルタミン残基をアルギニン残基に置換する場合は、目的の変異の単一のプライマーとして、図５に示すｐＱ６３Ｒを用いた。改変体作成の手法、条件等は、変異部位のプライマーとしてｐＥ１５３の代わりにｐＱ６３Ｒを用いた以外は、上記と同様である。また、６３位のグルタミン残基をアルギニン残基に置換したＣＮＴＦ改変体を「Ｑ６３Ｒ改変体」と省略する場合がある。なお、各ステップのＰＣＲの反応条件を図６に示した。
【００５２】
具体的にはまず、構造遺伝子の５’側或いは３’側のプライマー１と、変異部位のプライマー２（ｐＥ１５３又はｐＱ６３Ｒ）の２種のプライマーを利用して、１回目のＰＣＲ反応を行った。プライマー1 は、変異部位に近い方のプライマー（図５に記載の＃Ｎ）を用いた。増幅後、アガロースゲルにて電気泳動し、目的遺伝子を切り出し精製した。次に、この生成産物と図５に記載の＃Ｃ（ＲＶ）をプライマーとして利用し、ヒトＣＮＴＦ全構造遺伝子を増幅するようにして２回目のＰＣＲ反応を行った。この段階においては、１回目のＰＣＲによる生成産物をプライマーとして用いるが、使用量は約１〜２ｐｍｏｌと、ある程度狭い範囲でのみ増幅が可能であり、１回目のＰＣＲの生成産物量が、少な過ぎてもまた逆に多過ぎても増幅されなかった。また、アニーリングの温度は６０℃前後が適当であり、テンペレートにはpKKCNTF をPvuII で消化し線状（linear）ＤＮＡとして調製したものを用いた。
【００５３】
３）ヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製
天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）をBamHI 及びPstIで切断し、パッセンジャー部分である天然型ヒトＣＮＴＦ構造遺伝子部分を除き、ベクターとして用いた。一方、このベクターに挿入するパッセンジャー（ヒトＣＮＴＦ改変体構造遺伝子）部分には、BamHI 及びPstIの切断部位が構造遺伝子内にも存在する。そのため、BamHI 及びPstIサイトは使用できないので、それらとそれぞれ相同な（cohesive）部分を生成する、Bgl II（５’側）及び EcoT22I（３’側）の切断部位を遺伝子増幅のプライマー内にデザインし（図５）、これらの制限酵素による消化後、ベクターの BamHI、PstIサイトに挿入した。即ち、具体的には、まずpKKCNTF をBamHI 及びPstIで消化し、電気泳動後切り出し精製し、更に、ＢＡＰ処理を行った。一方、遺伝子増幅によって調製されたパッセンジャーをBgl IIとEcoT22I で切断し、このパッセンジャー（約１００ｎｇ：モル数でベクターの約１０倍）と上記調製したベクター（１００ｎｇ）を用いてライゲーションを行い、後述の方法でＪＭ１０９株へ形質転換した。得られたクローンについて塩基配列の決定を行い、変異の同定を行なった。塩基配列決定には、シークナーゼＤＮＡシークエンスキット（東洋紡社製）を利用した。このようにして、Ｅ１５３位改変体発現ベクターとＱ６３Ｒ改変体発現ベクターを得た。
【００５４】
４）両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた変異遺伝子及び発現ベクターの調製
pKKCNTF と同様、Ｑ６３Ｒ改変体の発現ベクター上には、制限酵素Hind IIIによる切断部位が２箇所存在する（図７）。図７に示したパッセンジャー部分をＥ１５３位改変体遺伝子の相当部分と置換することにより、両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた変異ＣＮＴＦの発現ベクターの調製を行った。具体的には、まず上記で得たＱ６３Ｒ改変体の発現ベクターをHind IIIで消化し、そのままライゲーションを行い、図７のパッセンジャー遺伝子を欠失した遺伝子を調製した。この遺伝子についてさらにHind IIIで消化を行い、消化されたＤＮＡを精製後ＢＡＰ処理し、ベクター部分とした。また、Ｅ１５３位改変体それぞれの発現ベクターをHind IIIで消化後パッセンジャー部分（約４００ｂｐ）を分離精製し、上記調製したベクター部分を用いてライゲーションを行い、同様に後述の方法でＪＭ１０９株へ形質転換した。得られたクローンについてパッセンジャー部分の挿入及び挿入方向を確認し、目的の挿入のあったクローンについて塩基配列決定により変異の再確認を行った。
【００５５】
その結果、表２に示すそれぞれ５１種のヒトＣＮＴＦ改変体を発現する発現ベクターを得た。
【００５６】
【表２】
【００５７】
５）発現ベクターで形質転換された大腸菌の調製
市販のＪＭ１０９株のコンピテントセル（東洋紡社製）１００μＬに、前記により調製したヒトＣＮＴＦまたはヒトＣＮＴＦ改変体を発現するベクターのＤＮＡ（約１００ｎｇ）を混合し、３０分間氷中に放置した。次いで４２℃で３０秒間熱処理を行った後、ＳＯＣ培地（トリプトン２０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム０．５８５ｇ、塩化カリウム０．１８６ｇ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、硫酸マグネシウム１０ｍＭ、グルコース２０ｍＭ：１リットルあたり）９００μＬに加え、３７℃で約１時間振盪培養した。５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ〔ｐＨ７〕：１リットルあたり）に塗り広げ、形質転換された大腸菌を選択した。
【００５８】
実施例２
１）大腸菌によるヒトＣＮＴＦ改変体の発現
実施例１により得られた本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換した後、この形質転換された大腸菌を利用しヒトＣＮＴＦ改変体を発現させた。発現はＴＹＧＰＮ培地（トリプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グリセリン８ｍＬ、リン酸１ナトリウム５ｇ、硝酸カリウム１ｇ〔ｐＨ６．１〕：１リットルあたり）を用い、少量培養を行った。
【００５９】
即ち、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＹＧＰＮ培地９００μＬに大腸菌株ＪＭ１０９の形質転換体の種培養１００μＬを加え、３７℃で振盪培養した。２時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、３時間培養した。遠心後、下記の溶菌操作を行った。培養液ペレットに溶菌溶液（５０ｍＭ トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、リゾチーム０．２７ｍｇ／ｍＬ、０．１３ｍＭ ＰＭＳＦ、６０Ｕ ＤＮａｓｅＩ）１００μＬを添加し、３７℃で１時間消化した後、遠心（１５０００ｒｐｍ×１５分）した。そのライセートの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる濃度検定及びＤＲＧニュ−ロンの生存維持活性測定のためのサンプルとした。なお、ＤＲＧニュ−ロンの生存維持活性測定サンプルは５０μＬのライセートの上清を、９５０μＬのＰＢＳ（０．１％ＢＳＡを含む。）に希釈し、ろ過除菌して調製した。
【００６０】
２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるヒトＣＮＴＦ改変体の発現の確認と定量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の条件で行った。
市販の１５％−２５％ポリアクリルアミド濃度のグラジエントゲル（第一化学薬品社製）を用いた。前記ライセートの上清の４μＬを各ウェルにのせ、定電流（４０ｍＡ）で１時間泳動を行った。
【００６１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた、Ｅ１５３位の改変体における泳動パターンを例として図８（Ａ）及び（Ｂ）に示した。図８（Ａ）中、レーン１は分子量マーカー、レーン２及びレーン１２は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン４〜１１は本実施例により得られたＥ１５３位改変体の前記ライセート上清（４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｋ、６：Ｅ１５３Ａ、７：Ｅ１５３Ｖ、８：Ｅ１５３Ｌ、９：Ｅ１５３Ｇ、１０：Ｅ１５３Ｐ、１１：Ｅ１５３Ｉ）の泳動パターンを示す。同様に図８（Ｂ）中、レーン１は分子量マーカー、レーン２及びレーン１２は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン４〜１１は本実施例により得られたＥ１５３位改変体の前記ライセート上清（４：Ｅ１５３Ｙ、５：Ｅ１５３Ｆ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｈ、８：Ｅ１５３Ｍ、９：Ｅ１５３Ｑ、１０：Ｅ１５３Ｎ、１１：Ｅ１５３Ｄ）の泳動パターンを示す。また、ヒトＣＮＴＦの位置を←で表記した。
【００６２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた、Ｅ１５３位の改変体、Ｑ６３Ｒ改変体及び本発明の両部位の変異の組み合わせ（Ｅ１５３／Ｑ６３Ｒ）による改変体における泳動パターンを図９に示した。図９中、レーン１は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン２は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン３〜９は本実施例により得られた各改変体の前記ライセート上清（３：Ｑ６３Ｒ、４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｙ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｒ／Ｑ６３Ｒ、８：Ｅ１５３Ｙ／Ｑ６３Ｒ、９：Ｅ１５３Ｗ／Ｑ６３Ｒ）の泳動パターンを示す。また、天然型ヒトＣＮＴＦの泳動位置を←（１）、Ｑ６３Ｒ改変体の泳動位置を←（２）で表記した。
【００６３】
この結果から、スキャナーを利用して電気泳動の画像を取り込み、ＣＮＴＦに由来するゲルバンドの濃度を画像処理ソフト（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４７）を用いて定量した。一例として、天然型ヒトＣＮＴＦ及びヒトＣＮＴＦ改変体（Ｅ１５３Ｒ）の定量の結果を示すと、それぞれ６．４μｇ／ｍＬ、７．０μｇ／ｍＬであった。
【００６４】
３）ＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＮＴＦ改変体の定量
精製抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体を利用して、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、活性測定サンプル中のヒトＣＮＴＦ改変体の濃度を定量した。即ち、予め抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体を固定化しておいた９６穴プレートに、５０μＬの測定サンプルをのせ、４℃で一晩放置した。ＰＢＳで各ウェルを洗浄（２００μＬ、３回）し、ビオチン化抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ3 に１０００倍希釈したもの）５０μＬを反応させた。２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼ結合ストレプトアビジン（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ3 に２０００倍希釈したもの）（ＶＥＣ社）５０μＬを入れ、室温にて２時間放置した。再度２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＮＰＰを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ９．８）溶液に室温にて溶解し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。なお、精製抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体の調製は、天然型ヒトＣＮＴＦをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
【００６５】
天然型ヒトＣＮＴＦ及びヒトＣＮＴＦ改変体（Ｅ１５３Ｒ）の定量の結果はそれぞれ７．６μｇ／ｍＬ、７．９μｇ／ｍＬであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から推定されたものとほぼ同程度であった。他の改変体に関しても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた定量値とＥＬＩＳＡ法から求めた定量値でほぼ同程度の結果が得られた。図１０〜１７では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた定量値で表している。
【００６６】
実施例３
ヒトＣＮＴＦ改変体の活性測定
ニワトリ後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの生存維持活性を指標として、実施例２により得られた各ＣＮＴＦ改変体の活性測定を行った。即ち、１０日令ニワトリ胚（Ｅ１０）からＤＲＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、３０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）でコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、７２時間）を行った。培養後の生存細胞について、１０μｇのＭＴＴを添加した際の還元能を指標として、フォルマザンの生成量を５７０ｎｍの吸光度で調べた。なお、各ＣＮＴＦ改変体は前培養の後、最終濃度０．００１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬとして各々添加した。
【００６７】
また、対照として、天然型ヒトＣＮＴＦを用いてＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を測定した。なお、活性測定に使用した天然型ヒトＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体サンプルは、同じ方法で同時に調製したものである。
【００６８】
また、１５３位のグルタミン酸残基をアルギニン残基に置換したＥ１５３Ｒ改変体、チロシン残基に置換したＥ１５３Ｙ改変体、ヒスチジン残基に置換したＥ１５３Ｈ改変体、フェニルアラニン残基に置換したＥ１５３Ｆ改変体、トリプトファン残基に置換したＥ１５３Ｗ改変体については、以下のようにニワトリ毛様体神経節（ＣＧ）ニューロンに対する生存維持活性も調べた。即ち、８日令ニワトリ胚（Ｅ８）からＣＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、６０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）でダブルコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、２４時間）を行った。培養後の生存細胞については、ＤＲＧの場合と同様にＭＴＴを用いて吸光度を測定し、生存維持活性の指標とした。
【００６９】
さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体については、以下のようにラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性も調べた。すなわち、２１日令ラット胚（Ｅ２１）からＤＲＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、３０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）でダブルコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、７２時間）を行った。培養後の生存細胞については、ニワトリＤＲＧの場合と同様にＭＴＴを用いて吸光度を測定し、生存維持活性の指標とした。
【００７０】
また、本実施例における生存維持活性の測定結果の一部として、上記と同様の方法により調製したライセートの上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦと精製天然型ヒトＣＮＴＦのニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１０）、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１１〜１４）、また、１５５番目のリジン残基に変異を導入した改変体（Ｋ１５５位改変体）のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１５）を示す。さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体のニワトリＣＧニューロンに対する生存維持活性（図１６）およびＥ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体のラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１７）についても、対応する図に示す。図１０〜１７において、縦軸は５７０ｎｍにおける吸光度（フォルマザンの生成を示す。）を、横軸は添加したＣＮＴＦの濃度をそれぞれ示す。
【００７１】
また、組換え天然型ヒトＣＮＴＦとＥ１５３位、Ｑ６３位の単独の置換体及び両部位の変異の組み合わせによる、改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性の測定も行った。結果を図１８に示す。図１８においては天然型ＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した場合の活性値を示しており、縦軸はＣＮＴＦ応答細胞の生存率（％）として、５７０ｎｍにおける吸光度を、１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ或いはＣＮＴＦ改変体を添加した場合を１００％とし（表記実験の場合は、Ａ570 ＝０．１９を１００％とする）、％表示したもの（フォルマザンの生成を示す。）である。ＰＢＳはブランクテストとして、ＣＮＴＦの代わりにＰＢＳ溶液（０．１％ＢＳＡを含む）を添加したもの、Ｗｉｌｄは天然型ヒトＣＮＴＦを添加したものである。
【００７２】
１）ライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦの活性
図１０は、ライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦと精製天然型ヒトＣＮＴＦのニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を比較したものであるが、両者はほぼ同等の活性を示したことから、ライセート上清中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦは活性型であることが定量的に確認された。
【００７３】
２）Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
図１１〜図１４において、１５３位のアミノ酸残基がメチオニン、ロイシン、バリン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、リジンの残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｍ、Ｅ１５３Ｌ、Ｅ１５３Ｖ、Ｅ１５３Ａ、Ｅ１５３Ｑ、Ｅ１５３Ｎ、Ｅ１５３Ｇ、Ｅ１５３Ｐ、Ｅ１５３Ｋ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して２〜３倍の生存維持活性を示し、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）は、約１０倍の生存維持活性を示した。また、１５３位のアミノ酸残基がアスパラギン酸またはイソロイシンに置換された場合（Ｅ１５３Ｄ、Ｅ１５３Ｉ）は、天然型と同程度の生存維持活性を示した。
【００７４】
図１８に示したＥ１５３位改変体及びＱ６３Ｒ改変体（それぞれ単独の変異）は天然型ＣＮＴＦよりも高い生存維持活性を示し、また各単独の改変体は同程度の比活性であることが確認された。さらに、両変異を組み合わせた改変体は、天然型ＣＮＴＦよりも、さらにはそれぞれ単独の改変体よりも高い比活性を示した（図１８）。
【００７５】
３）Ｋ１５５位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
図１５は、Ｋ１５５Ｒ改変体、Ｋ１５５Ａ改変体、Ｋ１５５Ｍ改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示したものであるが、元々のリジン残基と同様に正電荷を有するアルギニン残基への変異の時のみ、天然型ＣＮＴＦの１％弱の活性を保持しているが、他のアミノ酸残基への変異では、いずれも活性を消失してしまった。
【００７６】
４）Ｄ１キャップ領域に変異を導入した改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
また、本実施例におけるヒトＣＮＴＦのＤ１キャップ領域に変異を導入した改変体の、ニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を図１９にまとめた。前述の１５３位及び１５５位以外の改変体においても、変異による活性の変動が大きかった。
【００７７】
５）Ｅ１５３位改変体のニワトリＣＧニューロンに対する活性
図１６において、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して１０倍近い生存維持活性を示した。
ＤＲＧニューロンに対して高比活性を示した改変体はＣＧニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示したことから、当該改変体は他のニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すことが考えられる。
【００７８】
６）Ｅ１５３位改変体のラットＤＲＧニューロンに対する活性
図１７において、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して１０倍近い生存維持活性を示した。
この結果から、鳥類であるニワトリのニューロンに対して高比活性を示した改変体は、哺乳類であるラットのニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すと考えられる。さらにこの結果から、ヒトのニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すことが期待される。
【００７９】
これらの結果から以下のことが考察された。
１５３位の位置がグルタミン酸（天然型）又はアスパラギン酸の場合は活性が低いことから、１５３位の負電荷の存在はヒトＣＮＴＦの活性発現には不利であると考えられる。このことは、負電荷をなくす改変により活性が上昇するという事実により支持される。さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体が非常に高い活性を示した理由としては、グルタミン酸とは逆の電荷を持つアルギニンが１５３位に導入されたことによると考えられる。また、１５３位に芳香族性アミノ酸を導入した場合（Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ、Ｅ１５３Ｈ）にも非常に高い生存維持活性を示した。その理由としては、受容体側との疎水的相互作用又はＣＮＴＦ内の他の残基との活性発現に有利な相互作用の可能性が予想される。
【００８０】
比活性上昇に効果のある変異として同定された部位（Ｅ１５３位及びＱ６３位）について、それぞれ単独の変異よりも両変異を組み合わせることによる相加的な活性の上昇が示された。２つの部位は３次元的にも異なる位置にあり（図２０）、１分子中に２つの変異を行っても、それぞれの部位の改変の効果が現れたものと予想された。
【００８１】
また、１５５位にアミノ酸の置換を施した場合、元々のリジンと長さがほとんど同じメチオニン残基、あるいは長さが短く立体的障害はないと考えられるアラニン残基でも、１５５位のリジン残基の役割を補償することが全くできないということから、１５５位のリジン残基はＣＮＴＦの受容体に厳密に認識されていると考えられた。更に、実施例としては示さないが、Ｋ１５５Ａ改変体精製タンパク質は、天然型ヒトＣＮＴＦ精製タンパク質とほとんど同じ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示すことから、活性を消失したＫ１５５Ａ改変体は天然型ヒトＣＮＴＦとほとんど同じ全体構造を保持していると考えられた。また、このＫ１５５Ａ改変体は天然型ヒトＣＮＴＦの受容体への結合を阻害することから、活性を消失したＫ１５５Ａ改変体はＣＮＴＦの受容体への結合能力は保持していると考えられた。以上のことから、１５５位のリジン残基は細胞内へのシグナル伝達に必須のアミノ酸残基であると予想された。
【００８２】
Ｄ１キャップ領域内の他のアミノ酸残基の役割に関しては、前述の１５３位及び１５５位のアミノ酸のように、明快に考察することはできないが、少なくとも１５６位及び１５７位のアミノ酸残基は、Ｄ１キャップ領域の活性構造形成に重要であると予想された。いずれにしろ、単一の残基で活性を発現できるものではなく、ＣＮＴＦ受容体に厳密に認識される１５５位の周辺残基であるＤ１キャップ領域全体で、１つの活性構造を形成していると考えられ、当領域全体としての重要性が考えられた。
【００８３】
なお、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体とヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に構造のホモロジーがあると仮定し、ｈＧＨの３次構造上に変異導入部位（「Ｄ１キャップ領域」及び「Ｑ６３」としてとして図中に記載）を描き加えたものを図２０に表した。図２０中の各数字はヒトＣＮＴＦアミノ酸残基の番号を表す。
【００８４】
【発明の効果】
本発明で予測される改変タンパク質は、天然型タンパク質と同等あるいはそれ以上の活性を有するため、大量投与による自己抗体の出現等の副作用および、その他の副作用を減じた有用な治療剤としての利用が期待される。また更には、絶対投与量の低下に伴い、これら天然型タンパク質に混在する有害物質の削減、及び製造スケールの縮小が可能になると期待される。
【００８５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）による本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製方法の概略を示す。
【図２】図２は、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体の発現ベクターの作成に用いたベクター（pKK223-4）の構造を示す。
【図３】図３は、αヘリックスに富むサイトカイン類の中の、長鎖構造のグループに属するタンパク質に関して、構造活性相関解析の既知の結果、あるいは活性発現に関与すると予想される部位を簡略に示したものである。（Ａ）はシグナル伝達にｇｐ１３０を利用するタンパク質のグループであり、（Ｂ）はそれ以外のグループである。実験的に活性発現に重要であることが既知の領域に関しては網掛けで、活性発現への関与が予測される領域に関しては破線で囲って表記した。各タンパク質における構造活性相関解析の報告を以下に列挙する（R. Savino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1993年）90巻、4067頁、C. Lutticken et al., FEBS Lett.(1991年）282 巻、265 頁、J. P. J. Brakenhoff et al., J. Immunol.(1990年）145 巻、561 頁、X. Li et al., J. B. C. (1993年）268 巻、22377 頁、B. C. Cunningham et al., Science (1990年)247巻、1461頁、A. M. Devos et al., Science(1992年）255 巻、306 頁、J. P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁、R. C. Robinson et al., Cell(1994年）77巻、1101頁、J. C. Kallestad et al., J. B. C. (1991年)266巻、8940頁、I. Kawashima et al., FEBS Lett.(1991年）283 巻、199 頁、V. Goffin et al., Eur. J. Biochem. (1993年）214 巻、199 頁、B. Lovejoy et al., J. Mol. Biol. (1993年）234 巻、640 頁、D. Wen et al., J. B. C.(1994年）269 巻、22839 頁、B. F. Cheethan et al., Antiviral Res.(1991年）15巻、27頁）。
【図４】図４は、天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）の構築図を示す。
【図５】図５は、実施例１において用いたプライマーを示す。なお、下線部分は、導入した制限酵素認識部位を示し、！はミスマッチ位置を表す。・・はＧ、Ａ、Ｔ及びＣの混合を、＊はＧ及びＣの混合を表す。
【図６】図６は、実施例１において用いたＰＣＲによる各ステップの遺伝子増幅反応条件を示す。
【図７】図７は、両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製方法の概略を示す。
【図８】図８は、ヒトＣＮＴＦ改変体におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す写真である。図８（Ａ）〔レーン１: 分子量マーカー、レーン２: 大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３: 天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン４〜１１: Ｅ１５３位改変体のライセート上清（４：１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｋ、６：Ｅ１５３Ａ、７：Ｅ１５３Ｖ、８：Ｅ１５３Ｌ、９：Ｅ１５３Ｇ、１０：Ｅ１５３Ｐ、１１：Ｅ１５３Ｉ）、レーン１２：大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ〕、図８（Ｂ）〔レーン１: 分子量マーカー、レーン２: 大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３: 天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン４〜１１: Ｅ１５３位改変体のライセート上清（４：１５３Ｙ、５：Ｅ１５３Ｆ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｈ、８：Ｅ１５３Ｍ、９：Ｅ１５３Ｑ、１０：Ｅ１５３Ｎ、１１：Ｅ１５３Ｄ）、レーン１２：大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ〕。
【図９】図９は、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す写真である。図９中、レーン１は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン２は天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン３〜９は本実施例により得られた各改変体のライセート上清（３：Ｑ６３Ｒ、４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｙ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｒ／Ｑ６３Ｒ、８：Ｅ１５３Ｙ／Ｑ６３Ｒ、９：Ｅ１５３Ｗ／Ｑ６３Ｒ）の泳動パターンを示す。また、天然型ヒトＣＮＴＦの泳動位置を←（１）、Ｑ６３Ｒ改変体の泳動位置を←（２）で表記する。
【図１０】図１０は、大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ（○）と大腸菌のライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦ（●）のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。
【図１１】図１１は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）を示し、（Ｂ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（▲）、Ｅ１５３Ｙ（△）、Ｅ１５３Ｆ（○）、Ｅ１５３Ｗ（□）を示す。
【図１２】図１２は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｃ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ａ（□）、Ｅ１５３Ｖ（■）、Ｅ１５３Ｌ（△）を示し、（Ｄ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｇ（□）、Ｅ１５３Ｐ（■）を示す。
【図１３】図１３は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｅ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｍ（□）、Ｅ１５３Ｉ（△）を示し、（Ｆ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｋ（□）を示す。
【図１４】図１４は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｇ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｑ（○）、Ｅ１５３Ｎ（□）、Ｅ１５３Ｄ（■）を示す。
【図１５】図１５は、Ｋ１５５位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｋ１５５Ｒ（○）、Ｋ１５５Ａ（△）、Ｋ１５５Ｍ（□）を示す。
【図１６】図１６は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＣＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）、Ｅ１５３Ｙ（△）、Ｅ１５３Ｆ（□）を示し、（Ｂ）における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（△）、Ｅ１５３Ｗ（○）を示す。
【図１７】図１７は、Ｅ１５３位改変体のラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）、Ｅ１５３Ｙ（□）、Ｅ１５３Ｆ（■）を示し、（Ｂ）における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（△）、Ｅ１５３Ｗ（▲）を示す。
【図１８】図１８は、天然型ＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した場合の活性値を示す。縦軸は、ＣＮＴＦ応答細胞の生存率（％）として、５７０ｎｍにおける吸光度（フォルマザンの生成を示す）で、１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ或いはＣＮＴＦ改変体を添加した場合を１００％として（表記実験の場合、Ａ570 ＝０．１９を１００％とする）、その値に対する比率で表した。
【図１９】図１９は、ヒトＣＮＴＦにおけるＤ１キャップ領域の変異による改変体の、ニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。各点（●）が、それぞれの改変体を表し、５０％有効濃度（ＥＣ５０）の比較による、天然型ヒトＣＮＴＦに対する活性百分率（％）で表記した。
【図２０】図２０は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の３次構造上に、本発明におけるヒトＣＮＴＦ改変体の変異導入部位（「Ｄ１キャップ領域」及び「Ｑ６３」）を表記したものを示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、改変タンパク質に関する。さらに詳しくは、４本のヘリックス束構造を有するタンパク質のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することによって改変した改変タンパク質、それをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、並びに該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生物活性を有する天然タンパク質を各種疾患の治療薬として用いるための臨床開発が検討されている。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ＧＭ−ＣＳＦと略す。）、マクロファージコロニー刺激因子（以下、Ｍ−ＣＳＦと略す。）、インターロイキン３（以下、ＩＬ−３と略す。）、インターロイキン６（以下、ＩＬ−６と略す。）等、多くのサイトカイン類について臨床試験が実施され、あるいは臨床試験が検討されている（造血因子（1994年）５巻、６〜86頁）。
【０００３】
しかしながら、一般的には蛋白製剤を慢性的に投与する場合、投与量が大量であるほど自己抗体の出現による副作用や、製造コスト上の問題が生じやすくなるといった問題点がある。このような問題点を改善するには、例えば天然型よりも比活性の高い改変タンパク質を用いて投与量を抑制するといった方法を用いること等が考えられる。ここで、比活性の高い改変タンパク質を得るには構造活性相関解析等の基礎的データが必要となってくる。
【０００４】
サイトカイン類の中でも、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、成長ホルモン（以下、ＧＨと略す。）、プロラクチン（以下、ＰＲＬと略す。）、エリスロポエチン（以下、ＥＰＯと略す。）、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、及びＩＬ−３、ＩＬ−６等の各種インターロイキン類等は、いずれもαヘリックスに富み、共通構造として４本のヘリックス束構造（4-Helix Bundle) （なお、個々のヘリックスはＮ末端側からそれぞれヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと呼ぶ。）を有すると言われている(J. F.
Bazan, Neuron (1991年）７巻、197 頁）。
【０００５】
４本のヘリックス束構造を有するタンパク質は、１６０〜２００アミノ酸残基からなる長鎖構造のグループ（long-chain group) と１０５〜１４５アミノ酸からなる短鎖構造のグループ(short-chain group) に分類される(J. -L. Boulay & W. E. Paul, Curr. Biol. (1993年）３巻、573 頁、S. Sprang & J. Bazan, Curr. Opin. Struct. Biol.(1993年）３巻、815 頁）。前者には、ＧＨ、ＰＲＬ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、及びＩＬ−６、インターロイキン４（以下、ＩＬ−４と省略する）及びＧＭ−ＣＳＦ等を含む。
【０００６】
これらのサイトカイン類において、ヘリックスＡとヘリックスＢの間のアミノ酸残基（以下、ＡＢループ領域）及びヘリックスＤ領域に関しての生物活性発現に対する重要性が示されている。ＩＬ−６に関しても同様の報告がある (R. Sevino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993年）９０巻、4067頁、C. Lutticken et al., FEBS Lett.(1991年）282 巻、265 頁、J. P. J. Brakenhoff et al., J. Immunol.(1990年）145 巻、561 頁、X. Li et al., J. B. C. (1993年）268 巻、22377 頁）。ＧＨに関しては、変異体作製による同様の報告 (B. C. Cunningham et al., Science (1990年）247 巻、1461頁）と共に、ＧＨとＧＨ受容体との複合体のＸ線結晶解析により、直接の同定もなされている(A. M. DeVos et al., Science (1992年）255 巻、306 頁）。
【０００７】
また、バザーンはαヘリックスに富むサイトカイン類の中で、ヘリックスＣとヘリックスＤの間のアミノ酸残基（以下、ＣＤループ領域）とヘリックスＤの境界領域（以下、Ｄ１キャップ領域と省略する）において、Ｄ１モチーフと呼ぶアミノ酸の類似配列があることを示した(J. F. Bazan, Neuron (1991年）７巻、197 頁）。Ｄ１モチーフの配列は−φ−（Ｆ／Ｗ）−（Ｅ／Ｑ）−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−φ−Ｘ−Ｇ−（φは疎水性残基、Ｘはいずれの残基でも良いことを示す）であり、同領域は、例えばＬＩＦ（１５４〜１６１番目）、ＯＳＭ（１５９〜１６６番目）、ＩＬ−６（１５７〜１６４番目）、インターロイキン１１（以下、ＩＬ−１１と省略する）（１４８〜１５５番目）のそれぞれのアミノ酸に相当すると考えられる。このＣＤループ領域とヘリックスＤの境界領域に関しては、ＩＬ−６（J. P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁）及びＬＩＦ(R. C. Robinson et al., Cell (1994年）77巻、1101頁）において、受容体結合への重要性が報告されている。
【０００８】
しかしながら、ＩＬ−６のＤ１キャップ領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフとの類似性がないため、Ｄ１モチーフ上での改変に重要なアミノ酸の同定にはならず、また、ＬＩＦの同領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフと類似性が高いものの改変に重要なアミノ酸残基の同定はなされていない。また、他のαヘリックスに富むサイトカイン類では、同領域が活性発現に重要であるという報告は無い。
【０００９】
一方、ヒトＣＮＴＦは、２００個のアミノ酸残基からなり、αヘリックスに富み、５３％のαヘリックス、９％のβターン構造の含量からなると言われている(A. Negro et al., J. Neurosci. Res., (1991年）29巻、251 頁）。２次構造解析から、ヒトＣＮＴＦはαヘリックスに富むサイトカイン類と類似した構造であることが予想され、Ｄ１モチーフの配列はヒトＣＮＴＦにおいては１５１〜１５８番目のアミノ酸残基に相当する。このようにヒトＣＮＴＦは４本のヘリックス束構造を有するタンパク質の中では長鎖構造のグループに属し、同グループ内タンパク質とのより緊密な類似性が予想される。
【００１０】
また、ヒトＣＮＴＦに関して、細胞内へシグナルを伝える為の受容体としては、ＣＮＴＦ受容体α（以下、ＣＮＴＦ−Ｒαと省略する）、ＬＩＦ受容体（以下、ＬＩＦ−Ｒと省略する）及びｇｐ１３０の３種から構成されていると考えられている。ｇｐ１３０は、ヒトＣＮＴＦの場合と共に、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＩＬ−１１のシグナル伝達の場合にも共通な受容体である(S. Davis et al., Science(1991年）253 巻、59頁、S. Davis et al., Science (1993年）260 巻、1805頁、D. P. Gearing et al., Science(1992年）255 巻、1434頁、N. Y. Ip et al., Cell(1992年）69巻、1121頁）。前述の構造の類似性と共に、同じ受容体を共有しているという点から、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＩＬ−１１においては、それぞれのリガンド内で、同じ部位に相当するアミノ酸残基が受容体との結合に関わっている可能性が高いと考えられる。
【００１１】
ヒトＣＮＴＦは副交感神経である毛様体神経節の生存維持効果を示す因子として、１９７９年にシルビオ・バロン(S.Varon）らによって発見され(Brain Res. （1979年）173 巻、29-45 頁）、その後、精製およびクローニングについて報告されている(G. Barbin et al., J. Neurochem (1984 年）43巻、1468-1478 頁、L. F. Lin et al., Science (1989 年）246 巻、1023頁、P. Masiakowski et al., J. Neurochem (1991 年）57巻、1003頁、A. Negro et al., Eur. J. Biochem. (1991 年）201 巻、289 頁、J. R. McDonald et al., Biochim. Biophys. Acta.（1991年）、70巻、1090頁、国際公開番号 WO90／7341号公報、国際公開番号
WO91／4316号公報）。
【００１２】
ヒトＣＮＴＦの薬理作用に関し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、海馬、中隔ＧＡＢＡ作動性神経(N. Y. IP et al. J. Neursci. (1991) 11巻、3124-3134 頁）、視神経細胞(H. D. Hoffman J. Neurochem. (1988) 51巻、109-113 頁）、知覚神経(G. Barbin et al. J. Neurochem. (1984) 43 巻、1468-1478 頁）、副交感神経(Y. Arakawa et al. J. Neursci. (1990) 10巻、3507-3515 頁）および運動神経(M. Sendtner et al. J. Cell Science. suppl. (1991) 15 巻、103-109 頁）に対する生存維持効果、コリン作動性神経(S. Saadat et al. J. Cell Biol. (1989) 108巻、1807-1816 頁、U. Ernsberger et al. Neuron (1989) 2巻、1275-1284 頁）、タイプ２Ａアストロサイト(D. J. Anderson et al. TINS (1989) 12 巻、83頁）への分化活性、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、片側海馬−中隔野連絡路（Ｆ−Ｆ）切除モデルにおいて、中隔のコリン作動性神経の生存維持効果(T. Hagg et al. Neuron（1992年）8 巻、145 頁）、運動神経切断モデルにおける運動神経生存維持効果(M. Sendtner et al. Nature (1990) 345 巻、440-441 頁）、遺伝性運動疾患マウスにおける運動神経生存維持効果(M. Sendtner et al. Nature (1992) 358 巻、502-503 頁）、黒質−線条体切断モデルにおける黒質ドーパミン作動性神経に対する保護効果(T. Hogg & S. Varon Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1993) 90 巻、6315-6319 頁）、光受容体細胞の保護効果(M. M. LaVail et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1992) 89巻、11249-11253 頁）、視神経細胞の保護効果(K. Unoki & M. M. LaVail, Investigative Ophthalmology & Visual Science (1994) 35巻、907-915 頁）等が報告されている。
【００１３】
このようにヒトＣＮＴＦは神経細胞に作用して、その生存維持、突起伸展促進および神経伝達物質合成促進活性を示すことから、外傷による神経障害、アルツハイマー病、脳血管性痴呆症、筋萎縮性側索硬化症など神経細胞の萎縮・変性疾患に対し、有用な治療剤となることが期待されている(J. E. Springer, DN & P (1991) 4巻、394 頁、R. M. Lindsay, Neurobiol. of Aging (1994) 15巻、249-251 頁、R. M. Lindsay, TINS (1994) 17 巻、182 頁）。
【００１４】
さらに、運動神経変性疾患のモデル動物（Wobbler mice）における神経障害に対して、脳由来神経栄養因子との併用によるより効果的な保護効果が示され（H.Mitsumoto et al., Science （1994）265 巻、1107-1110 頁）、今後はヒトＣＮＴＦ単独だけではなく、他の神経栄養因子との併用による治療（R.Nishi, Science（1994）265 巻、1052-1053 頁）も含めて有用な治療剤となることが期待されている。
【００１５】
しかしながら、現在、米国で行われている筋萎縮性側索硬化症を対象とした天然型ヒトＣＮＴＦの臨床治験(Bio World Today, Sep. 8（1993年))では、週６ｍｇとかなり大量のヒトＣＮＴＦが投与されている。前記のように、一般的には蛋白製剤を慢性的に投与する場合、投与量が大量であるほど自己抗体の出現による副作用や、製造コスト上の問題が生じやすくなる。実際、ＣＮＴＦの米国のフェーズII、III 試験において、抗体の出現が見られ(BIO World Today, Sep 8 (1993)) 、他の副作用も問題となっている(BIO World Today, Jun 24 (1994)), Science (1994 年）264 巻、772-774 頁）。従って、天然型よりも比活性の高いヒトＣＮＴＦ改変体が期待されている。
【００１６】
このように天然型よりも比活性の高い改変タンパク質への期待は、ヒトＣＮＴＦのみならず、前記のような各種のサイトカイン類に対しても同様に強いものであり、構造活性相関の解析等による種々の検討がなされているものの、未だ効果的な改変体は見い出されていないのが実状である。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、４本のヘリックス束構造を有するタンパク質に関して天然型タンパク質よりも比活性の高い改変タンパク質を提供することにある。本発明の他の目的は、当該改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを提供することにある。本発明のさらに他の目的は、当該ＤＮＡを含有する発現ベクター、及び当該発現ベクターで形質転換された原核細胞又は真核細胞を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記課題を解決すべく、４本のヘリックス束構造を有するタンパク質のＤ１キャップ領域のアミノ酸残基に着目して鋭意研究したところ、Ｄ１キャップ領域に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸残基に置換することにより、当該タンパク質の比活性が上昇することを見いだし、本発明を完成するに到った。例えば、天然型ヒトＣＮＴＦでは、Ｄ１キャップ領域である１５５番目のリジン残基が活性発現に必須であることを発見した。また１５３番目のアミノ酸残基の置換がＣＮＴＦ活性の増加に有効であり、この位置のアミノ酸残基であるグルタミン酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、天然型ヒトＣＮＴＦの比活性を上昇できることを見出した。
【００１９】
即ち、本発明の要旨は、
（１） 天然型ヒト毛様体神経栄養因子（以下、毛様体神経栄養因子をＣＮＴＦと略す。）のアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基が、芳香族性アミノ酸残基又はアルギニン残基に置換されてなるヒトＣＮＴＦの改変タンパク質、
（２） 天然型ヒト毛様体神経栄養因子（以下、毛様体神経栄養因子をＣＮＴＦと略す。）のアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、プロリン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、リジン残基又はアルギニン残基に置換されてなるヒトＣＮＴＦの改変タンパク質、
（３） 天然型ヒトＣＮＴＦの６３位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基にさらに置換されている前記（１）又は（２）記載の改変タンパク質、
（４） 他のアミノ酸残基がアルギニン残基である前記（３）記載の改変タンパク質、
（５） 前記（１）〜（４）いずれか記載の改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、
（６） 前記（５）記載のＤＮＡを含有する発現ベクター、並びに、
（７） 天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基をアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、プロリン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、リジン残基又はアルギニン残基に置換する工程を含む、ヒトＣＮＴＦの改変タンパク質の製造方法、に関する。
【００２０】
本発明において「４本のヘリックス束構造を有するタンパク質」とは、ＬＩＦ、ＯＳＭ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＥＰＯ、インターロイキン２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、インターロイキン５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、骨髄単球成長因子（以下、ＭＧＦと略す。）、インターフェロンα（以下、ＩＦＮαと略す。）等のαヘリックスに富むサイトカイン類、及びヒトＣＮＴＦ等のタンパク質をいう。なかでも、細胞内へのシグナル伝達のための受容体としてｇｐ１３０を利用するタンパク質が好適であり、ヒトＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１等が挙げられる。
また、個々のヘリックス構造は、Ｎ末端側からそれぞれヘリックスＡ、ヘリックスＢ、ヘリックスＣ、ヘリックスＤという。本発明において「Ｄ１キャップ領域」とは、ＣＤループ領域（ヘリックスＣとヘリックスＤの間のアミノ酸残基をいう。）とヘリックスＤとの境界領域のことをいい、アミノ酸配列が−φ−（Ｆ／Ｗ）−（Ｅ／Ｑ）−（Ｋ／Ｒ）−（Ｋ／Ｒ）−φ−Ｘ−Ｇ−（φは疎水性残基、Ｘはいずれの残基でも良いことを示す。）で表される配列を有する領域をいう。この８個のアミノ酸からなる配列は、本発明における４本のヘリックス束構造を有するタンパク質において共通してみられるものであり、Ｄ１モチーフ配列と呼ばれる。表１に、上記４本のヘリックス束構造を有するタンパク質中のＤ１キャップ領域におけるＤ１モチーフのアミノ酸配列を示す。なお、ＩＬはインターロイキンを略記したものである。
【００２１】
【表１】
さらに、本発明において、「天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列」とは、国際公開番号WO９１／４３１６号公報に記載されたものであり（配列番号：１）、「天然型ＬＩＦのアミノ酸配列」とは、文献（R.C.Robinson et al.,Cell,(1994) 77巻1101頁）に記載されたものであり、「天然型ＯＳＭのアミノ酸配列」とは、文献（T.M.Rose and A.G.Bruce, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1991) 88巻8641頁, J.C.Kallestad et al., J.B.C.(1991) 266巻8940頁）に記載されたものであり、「天然型Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列」とは、文献（B.Lovejoy et al., J.Mol.Biol.(1993)234巻 640頁）に記載されたものである。本明細書におけるアミノ酸の位置の表記もこれらに従う。
【００２３】
本発明において、「改変タンパク質」とは、天然型タンパク質のアミノ酸配列中の少なくともＤ１キャップ領域に相当するアミノ酸残基（特にＤ１モチーフ中のアミノ酸残基）の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたタンパク質をいう。ここで、Ｄ１キャップ領域における改変、即ち、置換を受けるアミノ酸残基の数、種類、Ｄ１キャップ領域における位置等は限定されるものではない。しかしながら、改変タンパク質の比活性を高くする観点から、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されている改変体が好ましい。具体的には、ヒトＣＮＴＦにおける１５３位、ＬＩＦにおける１５６位、ＯＳＭにおける１６１位、Ｇ−ＣＳＦにおける１４６位が、ここでいうＤ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基に相当する。
【００２４】
本発明において、「他のアミノ酸残基」とは、天然のアミノ酸残基又は非天然のアミノ酸残基を意味する。他のアミノ酸残基が天然のアミノ酸残基の場合、中性又は塩基性アミノ酸残基が好ましい。即ち、本発明の改変タンパク質の好ましい例として、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン等の中性アミノ酸の残基や、ヒスチジン、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸の残基に置換されたものが挙げられる。なかでも、比活性の向上という観点から、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなどの芳香族性アミノ酸残基や、アルギニン等の残基に置換されたものがとりわけ好ましい。また、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、プロリン等の疎水性アミノ酸残基等も好適である。
【００２５】
また、他のアミノ酸残基が非天然のアミノ酸残基である場合としては、例えば蛋白質の合成段階で非天然アミノ酸を導入した場合、又は蛋白質合成後化学修飾された天然のアミノ酸残基等が挙げられる。蛋白質の合成段階で導入する方法として、部位特異的に様々な非天然アミノ酸を導入する一般的に有効な方法が報告されており(Science, 244, 182 (1989))、実際にパラ位をフッ素或いはニトロ基で修飾したフェニルアラニンを化学的にｔＲＮＡにアシル化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの蛋白合成系で発現した結果が示されている。また他の方法として、非天然のアミノ酸であるフラノマイシン(Furanomycin) を認識する大腸菌のIsoleucyl-ｔＲＮＡ(J. B. C., 265, 6931 (1990))を利用して目的の位置に導入したり、或いはCell−Freeの蛋白合成系(J. Biochem., 110, 166 (1991))において、目的の導入を行うことにより非天然のアミノ酸残基に置換されたもの等が挙げられる。
【００２６】
また、精製蛋白を利用して、アミノ酸残基特異的あるいは部位特異的に化学修飾したものも挙げられる（新生化学実験講座１，IV，11(1991)) 。例えばグルタミン酸残基に対しては、アミド化する、リジン残基に置換した後トリニトロフェニル化する、アルギニン残基に置換した後フェニルグリオキサールと反応させる、ヒスチジン残基に置換した後カルベトキシ化する、トリプトファン残基に置換した後アリールスルフェニルクロリドと反応させる、チロシン残基に置換した後ニトロ化する等の方法による改変体が挙げられる。これらの化学修飾は常法により行うことができる。
【００２７】
なお、本発明においては改変タンパク質の活性を著しく損なわないかぎり、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の置換に加え、その位置以外のアミノ酸残基に対する、通常蛋白工学分野で行われる改変（アミノ酸置換、アミノ酸削除、アミノ酸付加、およびドメイン置換等）を行うことも可能である。
【００２８】
例えば天然型ヒトＣＮＴＦにおいて、１５３位に加えて、さらに６３位、１３６位、１５４位、１５６位、１５７位、１６０位、１６３位、１６４位、１６７位、１７７位、１７８位、１８４位などのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したものが挙げられる。ここでいう１５３位以外のアミノ酸残基の置換は、前記のように定義される「他のアミノ酸残基」で置換される。天然型ヒトＣＮＴＦでは、アミノ酸配列の６３位のアミノ酸残基をアルギニン残基に置換することによりＣＮＴＦ活性が上昇することが既に公表されているが（Panayotatos et al., J.B.C., 268 巻,19000-19003頁（1993））、このようなヒトＣＮＴＦ上のＣＮＴＦ活性増加に有効な変異を組み合わせた置換を行うことにより、それぞれの部位の単独置換体以上の比活性を有する改変体をも得ることができる。例えば、１５３位に加えて６３位のアミノ酸残基も置換する場合、１５３位と６３位を共にアルギニンに置換したもの、１５３位はチロシンに６３位はアルギニンに置換したもの、１５３位をトリプトファンに６３位はアルギニンに置換したもの等が好適例として挙げられる。
【００２９】
本発明の改変タンパク質は、遺伝子工学分野における常法により作成することができる。即ち、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する場合、当該天然型タンパク質、又は当該改変体をコードするＤＮＡ含有ベクターの一部を合成オリゴヌクレオチドで置換して、当該天然型タンパク質のアミノ酸配列において、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸をコードするＤＮＡを他のアミノ酸をコードするＤＮＡに変え、これを適当な発現ベクターに連結して宿主内に導入し、形質転換させた宿主に目的の改変体を生産させることができる。以下、その詳細について述べる。
【００３０】
本発明の改変タンパク質の製造には、例えば、当該天然型タンパク質をコードする構造遺伝子を用いることができる。ヒトＣＮＴＦを改変する場合、天然型ヒトＣＮＴＦをコードするヒトＣＮＴＦ構造遺伝子は、例えばウサギあるいはヒトのゲノムＤＮＡからのクローニングによって既に取得されており(K. A. Stockli et al., Nature, 342, 316 (1989)., L. F. Lin et al., Science, 246, 1023 (1989)., P. Masiakowski et al., J. Neurochem., 57, 1003（1991)., A. Negro et al., Eur.J. Biochem., 201, 289（1991)., J. R. McDonald et al., Biochem. Biophys. Acta., 1090, 70（1991)., A. Lam et al., Gene, 102, 271 (1991)) 、そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列も知られている。従って、例えば常法（J. Sambrook et al., Molecular cloning : A laboratory manual)に従って、天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子をクローニングすることができる。また、ＬＩＦ、ＯＳＭ、Ｇ−ＣＳＦをコードする構造遺伝子も同様に取得されているので（J.F.Moreau et al., Nature(1988)336巻 690頁, M.N.Kallested et al., Mol.Cell.Biol.(1989) 9巻2847頁, H.Nomura et al., EMBO J.(1986) 5巻 871頁）、それらを用いてヒトＣＮＴＦと同様に行えばよい。
【００３１】
プラスミド中にクローニングした天然型タンパク質構造遺伝子の特定の配列を他の配列に置換する方法は、既に一般的に行える状況にあり、本発明においても常法により、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸残基を置換することができる。置換の方法は、目的とする置換したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを当該天然型タンパク質における置換の対象となる部分の配列（以下、相当配列と省略する。）と置き換える方法が便利である。
【００３２】
具体的には、例えば置換した塩基配列からなるオリゴヌクレチドと、増幅に必要なタンパク質の配列中、置換部位以外の塩基配列或いはベクター部分の配列に相当するオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、天然型タンパク質の構造遺伝子を含むプラスミドを鋳型にして、上記２種で挟まれた領域を増幅し、得られた増幅フラグメントを天然型タンパク質の相当配列と置き換える方法が便利である。２種のプライマーで挟まれた領域の増幅方法としては、例えば遺伝子増幅法（ＰＣＲ）（Gene, 77, 61-68 (1989)) が行われ、またこの操作を行うためには市販のＤＮＡ自動増幅装置が有効に用いられる。なお、１回の増幅反応で天然型タンパク質の相当配列との置き換えに都合の良い制限酵素切断部位を有するフラグメントが得られない場合には、１回目の遺伝子増幅産物を２回目の遺伝子増幅反応の１つのプライマーとして用い、目的の制限酵素切断部位を有するフラグメントを調製することもできる。
【００３３】
図１に、その一例としてヒトＣＮＴＦを対象とする場合を示す。図１に示されるように、２回の遺伝子増幅反応を行うことによって目的の置換した塩基配列が導入され、かつ天然型ヒトＣＮＴＦの相当配列との置き換えに都合の良い制限酵素切断部位を有するフラグメントを得ることができる。さらに、２つの異なる部位に置換を導入する場合には、別個にそれぞれの部位に変異を導入した後、適当な制限酵素切断部位を利用してクローニングし、両変異を持つ遺伝子を構築するか、あるいは一方の変異を導入したあと、その変異遺伝子をテンペレートとして用いて、さらに遺伝子増幅反応による一方の変異の導入を行い構築することができる。
【００３４】
目的の置換（あるいは挿入）が行われたＤＮＡ配列を確認するためには、ジデオキシ法（Science, 214, 1205（1981))の原理を利用し、例えばシークナーゼＤＮＡシークエンスキット（東洋紡社製）を用いて行うことができる。その他、実施例に記載されているような制限酵素によるＤＮＡの切断、欠失、それらにより生じるＤＮＡ断片の電気泳動による分離、回収、あるいは連結等の遺伝子操作は全て公知の方法（T.Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.（1982))に準じて行うことができる。
【００３５】
このようにして得られる改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡは、例えばｐＫＫ２２３−４（Pharmacia 社製、図２）等周知の発現ベクターに連結された後、適当な宿主に導入されることにより、本発明の目的物質である改変タンパク質を発現することができる。宿主としては、原核細胞または真核細胞のいずれでもよく、例えば大腸菌株や動物細胞株は、特に記載のない限り既に広く普及しており入手は容易である。例えば大腸菌宿主としては、ＪＭ１０９株等が挙げられる。また、動物細胞宿主としては、ＣＯＳ−１、ＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００３６】
発現ベクターを用いてこれらの宿主を形質転換するには、電気パルス法（高山伸一郎、細胞工学6、 771、 1987）、或いは塩化カルシウム法 (J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)) を用いればよい。このような形質転換された大腸菌株や動物細胞株等を用い、例えば常法(T. Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.（1982))に従って、改変タンパク質を発現させることができる。さらに、得られた菌株を常法に従い溶菌し、遠心分離（１０５００×ｇ）にかけて可溶性画分を得ることができる。発現された改変タンパク質は、必要に応じて常法に従って精製することも可能である。例えばヒトＣＮＴＦ改変体の場合は、J. Neurochem.,57, 1003（1991) に従って精製することができる。
【００３７】
ヒトＣＮＴＦ改変体の場合、具体的には、例えば、発現誘導後の大腸菌を、集菌後リゾチーム処理により溶解し、更に超音波処理を行う。遠心分離（１１０００×ｇ）を行い、ヒトＣＮＴＦ改変体を含む不溶性画分を得て、この画分を６Ｍの塩酸グアニジン溶液で可溶化し、次いでβメルカプトエタノールを含むトリス−塩酸緩衝液で透析し再生を行う。次に、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Asahipak-502NP: 旭化成社製）にかけた後、ＮａＣｌ直線濃度勾配により可溶化されたヒトＣＮＴＦ改変体を溶出する。更に、溶出した可溶性タンパク質を疎水性カラムクロマトグラフィー（Ether-5PW:東洋曹達社製）にのせ、洗浄後に硫酸アンモニウム直線濃度勾配で溶出することにより、精製ヒトＣＮＴＦ改変体を得ることができる(J. Neurochem., 57, 1004〜1005（1991）を参照し、一部改変した）。
【００３８】
発現された改変タンパク質の定量は、通常用いられる公知の方法でよい。例えば、天然型タンパク質を用いて得られる特異的抗体によるエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）やＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等が利用できる。ＥＬＩＳＡによる場合、上述と同様の方法で調製した天然型タンパク質の精製品を用い、例えば常法(Methods in Enzymology, 73, 46-52(1981))に従って、動物〔例えばニュージーランドホワイトラビット（♂，１ｋｇ）等〕に免疫して抗血清を取得することができる。抗血清からの特異的抗体の精製は、例えば天然型タンパク質を標品としてカラム担体〔例えば活性化セファロース（Pharmacia 社製, CNBr Activated Sepharose 等〕に結合させ、これを用いてカラムクロマトグラフィーを行うことにより可能である。該方法により得られる特異的抗体を用いて、改変タンパク質の定量のためのＥＬＩＳＡを行うことにより、未精製の状態で微量の改変タンパク質を検体とした場合でも、充分に定量を行うことが可能となる。
【００３９】
また、改変タンパク質を定量する別の方法として、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を利用することができる。即ち、公知の方法（Nature, 227, 680（1970))でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、当該タンパク質に由来するゲルバンドの濃度を画像処理ソフト（例えば、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４７）を用いて、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の場合と同様に未精製の状態で改変タンパク質の定量を行うことができる。
【００４０】
上述のようにして調製した改変タンパク質の生物活性は、それぞれのタンパク質に応じた方法で測定する。
例えばヒトＣＮＴＦ改変体タンパク質の生物活性は、ニワトリ後根神経節（ＤＲＧ）、毛様体神経節（ＣＧ）又はラットＤＲＧ等を用いることにより公知の方法（Nerve Growth Factors, 31-56,（1989))で測定することができる。また、ＬＩＦ改変体タンパク質の生物活性は、胎性幹細胞等種々の細胞を利用して、公知の方法（D.Metcalf, Growth Factors (1992) 7巻 169頁）で測定することができる。ＯＳＭ改変体タンパク質の生物活性は、黒色腫細胞の成長阻害活性等（D.Horn et al., Growth Factors (1990) 2巻 157頁）を利用して測定することができる。Ｇ−ＣＳＦ改変体タンパク質の生物活性は、造血系の腫瘍細胞であるＮＦＳ−６０細胞の成長促進活性（M.Tsuchiya et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83巻7633頁）等を利用して測定することができる。
【００４１】
本発明のヒトＣＮＴＦ改変体等の改変タンパク質は、天然型タンパク質と同等あるいはそれ以上の生物活性を有しているため、天然型に比べて有用な治療剤となり得ることが期待される。更に、天然型タンパク質の医薬品としての開発段階で問題になっている、大量投与による問題点、即ち、必要量を生産することの量的な難しさ、混在する物質による副作用、あるいは天然型タンパク質自身に対する抗体出現の為の副作用等の問題点を解決できる可能性があると考えられる。
【００４２】
例えばヒトＣＮＴＦ改変体の生物活性としては、後述の実施例において示されるように、１５３位のアミノ酸残基がアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、リジンの残基に置換された場合には、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して２〜３倍のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示し、１５３位のアミノ酸残基がチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニンの残基に置換された改変体は、ニワトリＤＲＧニューロン、ニワトリＣＧニューロン及びラットＤＲＧニューロンに対して天然型ヒトＣＮＴＦの約１０倍の生存維持活性を示す。また、１５３位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基（例えば、アルギニン、チロシン、トリプトファン残基）に置換され、かつ６３位のアミノ酸残基がアルギニン残基等に置換された場合には、ニワトリＤＲＧニューロンに対してそれぞれの単独置換体よりもさらに高い比活性を示す。
このように本発明のヒトＣＮＴＦ改変体は、天然型ヒトＣＮＴＦと同等あるいはそれ以上の生物活性を有しているため、天然型ヒトＣＮＴＦと同様に、運動神経変性疾患、末梢神経ニューロパチーなどの末梢神経関連疾患、アルツハイマー病、脳血管性痴呆症、パーキンソン病、ハンチング病などの中枢神経関連疾患、網膜色素変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜黄斑変性症などの眼関連神経の治療剤となり得る。更に、天然型ヒトＣＮＴＦの医薬品としての開発段階で問題になっている、大量投与による問題点、即ち、必要量を生産することの量的な難しさ、混在する物質による副作用、あるいはヒトＣＮＴＦ自身に対する抗体出現の為の副作用等の問題点を解決できる可能性があると考えられる。
【００４３】
前述したように、バザーンが、ＣＮＴＦ類縁タンパク質であるαヘリックスに富むサイトカイン類の中でＤ１キャップ領域においてＤ１モチーフと呼ぶアミノ酸の類似配列があることを示したが(J. F. Bazan, Neuron (1991年）７巻、197 頁）、本発明者らは今回初めてそのモチーフ内での各アミノ酸の役割を明らかにした。各タンパク質において、Ｄ１キャップ領域のＤ１モチーフとして予想されるアミノ酸配列を表１に示す。この時、長鎖構造のグループ（ＩＡ、ＩＢ）と短鎖構造のグループ（ＩＩ）を分類して表記し、更に長鎖構造のグループに関しては受容体としてｇｐ１３０を利用するグループ（ＩＡ；ＣＮＴＦはこのグループに属する）とそれ以外のグループ（ＩＢ）に分類して表記した。
ヒトＣＮＴＦと同様に、Ｄ１モチーフと類似配列を持つタンパク質は、長鎖構造のタンパク質に多く、特に受容体としてｇｐ１３０を利用するＬＩＦ及びＯＳＭ、あるいはＧ−ＣＳＦでの類似性が高い。
【００４４】
αヘリックスに富むサイトカイン類に関しては、現在までに多くの構造活性相関解析がなされており、ヒトＣＮＴＦと、より構造の類似性の高い長鎖構造のグループのタンパク質に関する構造活性相関解析の結果について、図３に簡略にまとめた。受容体としてｇｐ１３０を利用するグループ（Ａ）とそれ以外のグループ（Ｂ）に分類して表記し、また、実験的に活性発現に重要であることが既知の領域に関しては網掛けで、活性発現への関与が予測される領域に関しては破線で囲って表記した。
【００４５】
Ｄ１キャップを含むＣＤループとヘリックスＤの境界領域に関しては、前述のようにＩＬ−６ (J. P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁）及びＬＩＦ(R. C. Robinson et al., Cell (1994年）77巻、1101頁）において受容体結合への重要性が報告されている（但し、ＩＬ−６のＤ１キャップ領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフとの類似性が無いため、Ｄ１モチーフ上での改変に重要なアミノ酸の同定にはならず、また、ＬＩＦの同領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフと類似性が高いものの、改変に重要なアミノ酸残基の同定はなされていない）。また、他のαヘリックスに富むサイトカイン類で、同領域が活性発現に重要であるという報告は、後述するＧ−ＣＳＦを除くと報告されていない。また今回、ヒトＣＮＴＦにおいてＤ１キャップ領域の重要性が示されたことから、Ｄ１キャップ領域を受容体結合に利用するタンパク質の１つの共通項目として、ｇｐ１３０を受容体として利用するということが考えられる。同グループのタンパク質としては、ＣＮＴＦ以外にＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１が知られており、これらのタンパク質において、Ｄ１キャップ領域に相当するアミノ酸残基が、活性発現のための受容体結合に関与している可能性が高いと考えられる。
【００４６】
特に、ＬＩＦ及びＯＳＭはＤ１モチーフとの類似性が高いことから、ヒトＣＮＴＦにおけるＤ１キャップ領域での変異による効果と同じ効果が、それぞれのタンパク質での相当する部位の改変により起こることが予想される。具体的には、ヒトＣＮＴＦの１５５位のリジン残基に相当する、ＬＩＦの１５８位及びＯＳＭの１６３位のリジン残基の変異により、活性が激減することが予想され、またヒトＣＮＴＦの１５３位のグルタミン酸残基に相当する、ＬＩＦの１５６位及びＯＳＭの１６１位のグルタミン残基の変異により、ヒトＣＮＴＦの場合と同じような活性の上昇が期待される。また、この両残基に限らず、Ｄ１モチーフ内の他のアミノ酸の変異でも活性の変化があることが予想される。
【００４７】
ｇｐ１３０を利用しない、あるいは利用するという報告がないタンパク質の中で、Ｄ１モチーフの配列との類似性が顕著なものとしてＧ−ＣＳＦがある。Ｇ−ＣＳＦにおいては、同領域周辺を認識するモノクローナル抗体が、Ｇ−ＣＳＦの活性を中和するという報告もあり(J. E. Layton et al., J. B. C. (1991年）266 巻、23815 頁）、Ｄ１キャップ領域の受容体結合への関与が予想される。即ち、ヒトＣＮＴＦの１５３位のグルタミン酸残基に相当する、Ｇ−ＣＳＦの１４６位のグルタミン残基の変異により、ヒトＣＮＴＦの場合と同じような活性の上昇が期待され、Ｄ１モチーフ内の他のアミノ酸の変異により活性の変化が起こることが予想される。更に、Ｇ−ＣＳＦとの類似性が報告されているＭＧＦについても同様のことが予想され、ＭＧＦのＤ１キャップ領域内の変異により、活性の変化（あるいは上昇）が起こることが予想される。ｇｐ１３０を受容体として利用するタンパク質に限らず、Ｄ１モチーフという共通配列での受容体結合は一般に見られることかも知れない。
【００４８】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例において使用する略語の名称を以下に示す。
ＰＣＲ ： 遺伝子増幅法
ＢＡＰ ： bacterial alkaline phosphatase
ＩＰＴＧ ： isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
ＰＭＳＦ ： phenylmethanesulfonyl fluoride
ＰＢＳ ： phosphate buffered saline
ＢＳＡ ： bovine serum albumin
ＡＬＰ ： alkaline phosphatase
ＳＡ ： streptoavidine
ＰＮＰＰ ： p-nitrophenyl phosphate
ＤＲＧ ： dorsal root ganglion
ＤＭＥＭ ： dulbecco's modified eagle medium
ＦＣＳ ： fetal calf serum
ＭＴＴ： 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide
ＣＧ ： ciliary ganglion
【００４９】
実施例１
天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子への変異導入及びヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製
１）実験材料
大腸菌株ＪＭ１０９（lacIq : 宝酒造社製）をクローニングのため、また天然型ヒトＣＮＴＦおよびヒトＣＮＴＦ改変体の発現のための宿主菌として使用した。天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）としては、ｔａｃプロモーターを有する大腸菌発現ベクターであるpKK223-4（Pharmacia 社製、図２）に天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子及び該ＣＮＴＦ遺伝子の５’側にリンカーＤＮＡを挿入して作製したものを使用した（図４）。
【００５０】
２）変異導入遺伝子の増幅反応
ランダムなアミノ酸の部位特異的変異の導入は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）を利用した。数種の合成ＤＮＡプライマーを使用し、２段階のＰＣＲ反応により調製した（図１）。ＰＣＲには、テンペレートとして天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF)を使用し、ポリメラーゼは適合度（fidelity）の高いpfu ポリメラーゼ（Stratagene社製）を利用した。なお、使用したプライマーのシークエンスを図５に示した。変異部位のプライマーとしては、天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列における１５２番目から１５７番目のそれぞれのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したヒトＣＮＴＦ改変体（以下、例えば１５３位を置換したヒトＣＮＴＦ改変体を単に「Ｅ１５３位改変体」と省略する場合がある。）を得るためのプライマーを示したが、その相当部位において、第１コドン及び第２コドンはＧ、Ａ、Ｔ及びＣ、また第３コドンはＧ及びＣの混合として、合成の段階で調製した。これら３２種の混合プライマーにより、目的の部位については２０種のアミノ酸全てを網羅していることになる。
【００５１】
また、６３位のグルタミン残基をアルギニン残基に置換する場合は、目的の変異の単一のプライマーとして、図５に示すｐＱ６３Ｒを用いた。改変体作成の手法、条件等は、変異部位のプライマーとしてｐＥ１５３の代わりにｐＱ６３Ｒを用いた以外は、上記と同様である。また、６３位のグルタミン残基をアルギニン残基に置換したＣＮＴＦ改変体を「Ｑ６３Ｒ改変体」と省略する場合がある。なお、各ステップのＰＣＲの反応条件を図６に示した。
【００５２】
具体的にはまず、構造遺伝子の５’側或いは３’側のプライマー１と、変異部位のプライマー２（ｐＥ１５３又はｐＱ６３Ｒ）の２種のプライマーを利用して、１回目のＰＣＲ反応を行った。プライマー1 は、変異部位に近い方のプライマー（図５に記載の＃Ｎ）を用いた。増幅後、アガロースゲルにて電気泳動し、目的遺伝子を切り出し精製した。次に、この生成産物と図５に記載の＃Ｃ（ＲＶ）をプライマーとして利用し、ヒトＣＮＴＦ全構造遺伝子を増幅するようにして２回目のＰＣＲ反応を行った。この段階においては、１回目のＰＣＲによる生成産物をプライマーとして用いるが、使用量は約１〜２ｐｍｏｌと、ある程度狭い範囲でのみ増幅が可能であり、１回目のＰＣＲの生成産物量が、少な過ぎてもまた逆に多過ぎても増幅されなかった。また、アニーリングの温度は６０℃前後が適当であり、テンペレートにはpKKCNTF をPvuII で消化し線状（linear）ＤＮＡとして調製したものを用いた。
【００５３】
３）ヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製
天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）をBamHI 及びPstIで切断し、パッセンジャー部分である天然型ヒトＣＮＴＦ構造遺伝子部分を除き、ベクターとして用いた。一方、このベクターに挿入するパッセンジャー（ヒトＣＮＴＦ改変体構造遺伝子）部分には、BamHI 及びPstIの切断部位が構造遺伝子内にも存在する。そのため、BamHI 及びPstIサイトは使用できないので、それらとそれぞれ相同な（cohesive）部分を生成する、Bgl II（５’側）及び EcoT22I（３’側）の切断部位を遺伝子増幅のプライマー内にデザインし（図５）、これらの制限酵素による消化後、ベクターの BamHI、PstIサイトに挿入した。即ち、具体的には、まずpKKCNTF をBamHI 及びPstIで消化し、電気泳動後切り出し精製し、更に、ＢＡＰ処理を行った。一方、遺伝子増幅によって調製されたパッセンジャーをBgl IIとEcoT22I で切断し、このパッセンジャー（約１００ｎｇ：モル数でベクターの約１０倍）と上記調製したベクター（１００ｎｇ）を用いてライゲーションを行い、後述の方法でＪＭ１０９株へ形質転換した。得られたクローンについて塩基配列の決定を行い、変異の同定を行なった。塩基配列決定には、シークナーゼＤＮＡシークエンスキット（東洋紡社製）を利用した。このようにして、Ｅ１５３位改変体発現ベクターとＱ６３Ｒ改変体発現ベクターを得た。
【００５４】
４）両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた変異遺伝子及び発現ベクターの調製
pKKCNTF と同様、Ｑ６３Ｒ改変体の発現ベクター上には、制限酵素Hind IIIによる切断部位が２箇所存在する（図７）。図７に示したパッセンジャー部分をＥ１５３位改変体遺伝子の相当部分と置換することにより、両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた変異ＣＮＴＦの発現ベクターの調製を行った。具体的には、まず上記で得たＱ６３Ｒ改変体の発現ベクターをHind IIIで消化し、そのままライゲーションを行い、図７のパッセンジャー遺伝子を欠失した遺伝子を調製した。この遺伝子についてさらにHind IIIで消化を行い、消化されたＤＮＡを精製後ＢＡＰ処理し、ベクター部分とした。また、Ｅ１５３位改変体それぞれの発現ベクターをHind IIIで消化後パッセンジャー部分（約４００ｂｐ）を分離精製し、上記調製したベクター部分を用いてライゲーションを行い、同様に後述の方法でＪＭ１０９株へ形質転換した。得られたクローンについてパッセンジャー部分の挿入及び挿入方向を確認し、目的の挿入のあったクローンについて塩基配列決定により変異の再確認を行った。
【００５５】
その結果、表２に示すそれぞれ５１種のヒトＣＮＴＦ改変体を発現する発現ベクターを得た。
【００５６】
【表２】
５）発現ベクターで形質転換された大腸菌の調製
市販のＪＭ１０９株のコンピテントセル（東洋紡社製）１００μＬに、前記により調製したヒトＣＮＴＦまたはヒトＣＮＴＦ改変体を発現するベクターのＤＮＡ（約１００ｎｇ）を混合し、３０分間氷中に放置した。次いで４２℃で３０秒間熱処理を行った後、ＳＯＣ培地（トリプトン２０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム０．５８５ｇ、塩化カリウム０．１８６ｇ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、硫酸マグネシウム１０ｍＭ、グルコース２０ｍＭ：１リットルあたり）９００μＬに加え、３７℃で約１時間振盪培養した。５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ〔ｐＨ７〕：１リットルあたり）に塗り広げ、形質転換された大腸菌を選択した。
【００５８】
実施例２
１）大腸菌によるヒトＣＮＴＦ改変体の発現
実施例１により得られた本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換した後、この形質転換された大腸菌を利用しヒトＣＮＴＦ改変体を発現させた。発現はＴＹＧＰＮ培地（トリプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グリセリン８ｍＬ、リン酸１ナトリウム５ｇ、硝酸カリウム１ｇ〔ｐＨ６．１〕：１リットルあたり）を用い、少量培養を行った。
【００５９】
即ち、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＹＧＰＮ培地９００μＬに大腸菌株ＪＭ１０９の形質転換体の種培養１００μＬを加え、３７℃で振盪培養した。２時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、３時間培養した。遠心後、下記の溶菌操作を行った。培養液ペレットに溶菌溶液（５０ｍＭ トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、リゾチーム０．２７ｍｇ／ｍＬ、０．１３ｍＭ ＰＭＳＦ、６０Ｕ ＤＮａｓｅＩ）１００μＬを添加し、３７℃で１時間消化した後、遠心（１５０００ｒｐｍ×１５分）した。そのライセートの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる濃度検定及びＤＲＧニュ−ロンの生存維持活性測定のためのサンプルとした。なお、ＤＲＧニュ−ロンの生存維持活性測定サンプルは５０μＬのライセートの上清を、９５０μＬのＰＢＳ（０．１％ＢＳＡを含む。）に希釈し、ろ過除菌して調製した。
【００６０】
２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるヒトＣＮＴＦ改変体の発現の確認と定量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の条件で行った。
市販の１５％−２５％ポリアクリルアミド濃度のグラジエントゲル（第一化学薬品社製）を用いた。前記ライセートの上清の４μＬを各ウェルにのせ、定電流（４０ｍＡ）で１時間泳動を行った。
【００６１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた、Ｅ１５３位の改変体における泳動パターンを例として図８（Ａ）及び（Ｂ）に示した。図８（Ａ）中、レーン１は分子量マーカー、レーン２及びレーン１２は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン４〜１１は本実施例により得られたＥ１５３位改変体の前記ライセート上清（４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｋ、６：Ｅ１５３Ａ、７：Ｅ１５３Ｖ、８：Ｅ１５３Ｌ、９：Ｅ１５３Ｇ、１０：Ｅ１５３Ｐ、１１：Ｅ１５３Ｉ）の泳動パターンを示す。同様に図８（Ｂ）中、レーン１は分子量マーカー、レーン２及びレーン１２は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン４〜１１は本実施例により得られたＥ１５３位改変体の前記ライセート上清（４：Ｅ１５３Ｙ、５：Ｅ１５３Ｆ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｈ、８：Ｅ１５３Ｍ、９：Ｅ１５３Ｑ、１０：Ｅ１５３Ｎ、１１：Ｅ１５３Ｄ）の泳動パターンを示す。また、ヒトＣＮＴＦの位置を←で表記した。
【００６２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた、Ｅ１５３位の改変体、Ｑ６３Ｒ改変体及び本発明の両部位の変異の組み合わせ（Ｅ１５３／Ｑ６３Ｒ）による改変体における泳動パターンを図９に示した。図９中、レーン１は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン２は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン３〜９は本実施例により得られた各改変体の前記ライセート上清（３：Ｑ６３Ｒ、４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｙ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｒ／Ｑ６３Ｒ、８：Ｅ１５３Ｙ／Ｑ６３Ｒ、９：Ｅ１５３Ｗ／Ｑ６３Ｒ）の泳動パターンを示す。また、天然型ヒトＣＮＴＦの泳動位置を←（１）、Ｑ６３Ｒ改変体の泳動位置を←（２）で表記した。
【００６３】
この結果から、スキャナーを利用して電気泳動の画像を取り込み、ＣＮＴＦに由来するゲルバンドの濃度を画像処理ソフト（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４７）を用いて定量した。一例として、天然型ヒトＣＮＴＦ及びヒトＣＮＴＦ改変体（Ｅ１５３Ｒ）の定量の結果を示すと、それぞれ６．４μｇ／ｍＬ、７．０μｇ／ｍＬであった。
【００６４】
３）ＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＮＴＦ改変体の定量
精製抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体を利用して、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、活性測定サンプル中のヒトＣＮＴＦ改変体の濃度を定量した。即ち、予め抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体を固定化しておいた９６穴プレートに、５０μＬの測定サンプルをのせ、４℃で一晩放置した。ＰＢＳで各ウェルを洗浄（２００μＬ、３回）し、ビオチン化抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ3 に１０００倍希釈したもの）５０μＬを反応させた。２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼ結合ストレプトアビジン（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ3 に２０００倍希釈したもの）（ＶＥＣ社）５０μＬを入れ、室温にて２時間放置した。再度２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＮＰＰを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ９．８）溶液に室温にて溶解し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。なお、精製抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体の調製は、天然型ヒトＣＮＴＦをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
【００６５】
天然型ヒトＣＮＴＦ及びヒトＣＮＴＦ改変体（Ｅ１５３Ｒ）の定量の結果はそれぞれ７．６μｇ／ｍＬ、７．９μｇ／ｍＬであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から推定されたものとほぼ同程度であった。他の改変体に関しても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた定量値とＥＬＩＳＡ法から求めた定量値でほぼ同程度の結果が得られた。図１０〜１７では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた定量値で表している。
【００６６】
実施例３
ヒトＣＮＴＦ改変体の活性測定
ニワトリ後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの生存維持活性を指標として、実施例２により得られた各ＣＮＴＦ改変体の活性測定を行った。即ち、１０日令ニワトリ胚（Ｅ１０）からＤＲＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、３０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）でコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、７２時間）を行った。培養後の生存細胞について、１０μｇのＭＴＴを添加した際の還元能を指標として、フォルマザンの生成量を５７０ｎｍの吸光度で調べた。なお、各ＣＮＴＦ改変体は前培養の後、最終濃度０．００１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬとして各々添加した。
【００６７】
また、対照として、天然型ヒトＣＮＴＦを用いてＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を測定した。なお、活性測定に使用した天然型ヒトＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体サンプルは、同じ方法で同時に調製したものである。
【００６８】
また、１５３位のグルタミン酸残基をアルギニン残基に置換したＥ１５３Ｒ改変体、チロシン残基に置換したＥ１５３Ｙ改変体、ヒスチジン残基に置換したＥ１５３Ｈ改変体、フェニルアラニン残基に置換したＥ１５３Ｆ改変体、トリプトファン残基に置換したＥ１５３Ｗ改変体については、以下のようにニワトリ毛様体神経節（ＣＧ）ニューロンに対する生存維持活性も調べた。即ち、８日令ニワトリ胚（Ｅ８）からＣＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、６０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）でダブルコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、２４時間）を行った。培養後の生存細胞については、ＤＲＧの場合と同様にＭＴＴを用いて吸光度を測定し、生存維持活性の指標とした。
【００６９】
さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体については、以下のようにラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性も調べた。すなわち、２１日令ラット胚（Ｅ２１）からＤＲＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、３０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）でダブルコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、７２時間）を行った。培養後の生存細胞については、ニワトリＤＲＧの場合と同様にＭＴＴを用いて吸光度を測定し、生存維持活性の指標とした。
【００７０】
また、本実施例における生存維持活性の測定結果の一部として、上記と同様の方法により調製したライセートの上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦと精製天然型ヒトＣＮＴＦのニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１０）、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１１〜１４）、また、１５５番目のリジン残基に変異を導入した改変体（Ｋ１５５位改変体）のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１５）を示す。さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体のニワトリＣＧニューロンに対する生存維持活性（図１６）およびＥ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体のラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１７）についても、対応する図に示す。図１０〜１７において、縦軸は５７０ｎｍにおける吸光度（フォルマザンの生成を示す。）を、横軸は添加したＣＮＴＦの濃度をそれぞれ示す。
【００７１】
また、組換え天然型ヒトＣＮＴＦとＥ１５３位、Ｑ６３位の単独の置換体及び両部位の変異の組み合わせによる、改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性の測定も行った。結果を図１８に示す。図１８においては天然型ＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した場合の活性値を示しており、縦軸はＣＮＴＦ応答細胞の生存率（％）として、５７０ｎｍにおける吸光度を、１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ或いはＣＮＴＦ改変体を添加した場合を１００％とし（表記実験の場合は、Ａ570 ＝０．１９を１００％とする）、％表示したもの（フォルマザンの生成を示す。）である。ＰＢＳはブランクテストとして、ＣＮＴＦの代わりにＰＢＳ溶液（０．１％ＢＳＡを含む）を添加したもの、Ｗｉｌｄは天然型ヒトＣＮＴＦを添加したものである。
【００７２】
１）ライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦの活性
図１０は、ライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦと精製天然型ヒトＣＮＴＦのニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を比較したものであるが、両者はほぼ同等の活性を示したことから、ライセート上清中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦは活性型であることが定量的に確認された。
【００７３】
２）Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
図１１〜図１４において、１５３位のアミノ酸残基がメチオニン、ロイシン、バリン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、リジンの残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｍ、Ｅ１５３Ｌ、Ｅ１５３Ｖ、Ｅ１５３Ａ、Ｅ１５３Ｑ、Ｅ１５３Ｎ、Ｅ１５３Ｇ、Ｅ１５３Ｐ、Ｅ１５３Ｋ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して２〜３倍の生存維持活性を示し、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）は、約１０倍の生存維持活性を示した。また、１５３位のアミノ酸残基がアスパラギン酸またはイソロイシンに置換された場合（Ｅ１５３Ｄ、Ｅ１５３Ｉ）は、天然型と同程度の生存維持活性を示した。
【００７４】
図１８に示したＥ１５３位改変体及びＱ６３Ｒ改変体（それぞれ単独の変異）は天然型ＣＮＴＦよりも高い生存維持活性を示し、また各単独の改変体は同程度の比活性であることが確認された。さらに、両変異を組み合わせた改変体は、天然型ＣＮＴＦよりも、さらにはそれぞれ単独の改変体よりも高い比活性を示した（図１８）。
【００７５】
３）Ｋ１５５位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
図１５は、Ｋ１５５Ｒ改変体、Ｋ１５５Ａ改変体、Ｋ１５５Ｍ改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示したものであるが、元々のリジン残基と同様に正電荷を有するアルギニン残基への変異の時のみ、天然型ＣＮＴＦの１％弱の活性を保持しているが、他のアミノ酸残基への変異では、いずれも活性を消失してしまった。
【００７６】
４）Ｄ１キャップ領域に変異を導入した改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
また、本実施例におけるヒトＣＮＴＦのＤ１キャップ領域に変異を導入した改変体の、ニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を図１９にまとめた。前述の１５３位及び１５５位以外の改変体においても、変異による活性の変動が大きかった。
【００７７】
５）Ｅ１５３位改変体のニワトリＣＧニューロンに対する活性
図１６において、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して１０倍近い生存維持活性を示した。
ＤＲＧニューロンに対して高比活性を示した改変体はＣＧニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示したことから、当該改変体は他のニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すことが考えられる。
【００７８】
６）Ｅ１５３位改変体のラットＤＲＧニューロンに対する活性
図１７において、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して１０倍近い生存維持活性を示した。
この結果から、鳥類であるニワトリのニューロンに対して高比活性を示した改変体は、哺乳類であるラットのニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すと考えられる。さらにこの結果から、ヒトのニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すことが期待される。
【００７９】
これらの結果から以下のことが考察された。
１５３位の位置がグルタミン酸（天然型）又はアスパラギン酸の場合は活性が低いことから、１５３位の負電荷の存在はヒトＣＮＴＦの活性発現には不利であると考えられる。このことは、負電荷をなくす改変により活性が上昇するという事実により支持される。さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体が非常に高い活性を示した理由としては、グルタミン酸とは逆の電荷を持つアルギニンが１５３位に導入されたことによると考えられる。また、１５３位に芳香族性アミノ酸を導入した場合（Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ、Ｅ１５３Ｈ）にも非常に高い生存維持活性を示した。その理由としては、受容体側との疎水的相互作用又はＣＮＴＦ内の他の残基との活性発現に有利な相互作用の可能性が予想される。
【００８０】
比活性上昇に効果のある変異として同定された部位（Ｅ１５３位及びＱ６３位）について、それぞれ単独の変異よりも両変異を組み合わせることによる相加的な活性の上昇が示された。２つの部位は３次元的にも異なる位置にあり（図２０）、１分子中に２つの変異を行っても、それぞれの部位の改変の効果が現れたものと予想された。
【００８１】
また、１５５位にアミノ酸の置換を施した場合、元々のリジンと長さがほとんど同じメチオニン残基、あるいは長さが短く立体的障害はないと考えられるアラニン残基でも、１５５位のリジン残基の役割を補償することが全くできないということから、１５５位のリジン残基はＣＮＴＦの受容体に厳密に認識されていると考えられた。更に、実施例としては示さないが、Ｋ１５５Ａ改変体精製タンパク質は、天然型ヒトＣＮＴＦ精製タンパク質とほとんど同じ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示すことから、活性を消失したＫ１５５Ａ改変体は天然型ヒトＣＮＴＦとほとんど同じ全体構造を保持していると考えられた。また、このＫ１５５Ａ改変体は天然型ヒトＣＮＴＦの受容体への結合を阻害することから、活性を消失したＫ１５５Ａ改変体はＣＮＴＦの受容体への結合能力は保持していると考えられた。以上のことから、１５５位のリジン残基は細胞内へのシグナル伝達に必須のアミノ酸残基であると予想された。
【００８２】
Ｄ１キャップ領域内の他のアミノ酸残基の役割に関しては、前述の１５３位及び１５５位のアミノ酸のように、明快に考察することはできないが、少なくとも１５６位及び１５７位のアミノ酸残基は、Ｄ１キャップ領域の活性構造形成に重要であると予想された。いずれにしろ、単一の残基で活性を発現できるものではなく、ＣＮＴＦ受容体に厳密に認識される１５５位の周辺残基であるＤ１キャップ領域全体で、１つの活性構造を形成していると考えられ、当領域全体としての重要性が考えられた。
【００８３】
なお、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体とヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に構造のホモロジーがあると仮定し、ｈＧＨの３次構造上に変異導入部位（「Ｄ１キャップ領域」及び「Ｑ６３」としてとして図中に記載）を描き加えたものを図２０に表した。図２０中の各数字はヒトＣＮＴＦアミノ酸残基の番号を表す。
【００８４】
【発明の効果】
本発明で予測される改変タンパク質は、天然型タンパク質と同等あるいはそれ以上の活性を有するため、大量投与による自己抗体の出現等の副作用および、その他の副作用を減じた有用な治療剤としての利用が期待される。また更には、絶対投与量の低下に伴い、これら天然型タンパク質に混在する有害物質の削減、及び製造スケールの縮小が可能になると期待される。
【００８５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）による本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製方法の概略を示す。
【図２】図２は、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体の発現ベクターの作成に用いたベクター（pKK223-4）の構造を示す。
【図３】図３は、αヘリックスに富むサイトカイン類の中の、長鎖構造のグループに属するタンパク質に関して、構造活性相関解析の既知の結果、あるいは活性発現に関与すると予想される部位を簡略に示したものである。（Ａ）はシグナル伝達にｇｐ１３０を利用するタンパク質のグループであり、（Ｂ）はそれ以外のグループである。実験的に活性発現に重要であることが既知の領域に関しては網掛けで、活性発現への関与が予測される領域に関しては破線で囲って表記した。各タンパク質における構造活性相関解析の報告を以下に列挙する（R. Savino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1993年）90巻、4067頁、C. Lutticken et al., FEBS Lett.(1991年）282 巻、265 頁、J. P. J. Brakenhoff et al., J. Immunol.(1990年）145 巻、561 頁、X. Li et al., J. B. C. (1993年）268 巻、22377 頁、B. C. Cunningham et al., Science (1990年)247巻、1461頁、A. M. Devos et al., Science(1992年）255 巻、306 頁、J. P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁、R. C. Robinson et al., Cell(1994年）77巻、1101頁、J. C. Kallestad et al., J. B. C. (1991年)266巻、8940頁、I. Kawashima et al., FEBS Lett.(1991年）283 巻、199 頁、V. Goffin et al., Eur. J. Biochem. (1993年）214 巻、199 頁、B. Lovejoy et al., J. Mol. Biol. (1993年）234 巻、640 頁、D. Wen et al., J. B. C.(1994年）269 巻、22839 頁、B. F. Cheethan et al., Antiviral Res.(1991年）15巻、27頁）。
【図４】図４は、天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）の構築図を示す。
【図５】図５は、実施例１において用いたプライマーを示す。なお、下線部分は、導入した制限酵素認識部位を示し、！はミスマッチ位置を表す。・・はＧ、Ａ、Ｔ及びＣの混合を、＊はＧ及びＣの混合を表す。
【図６】図６は、実施例１において用いたＰＣＲによる各ステップの遺伝子増幅反応条件を示す。
【図７】図７は、両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製方法の概略を示す。
【図８】図８は、ヒトＣＮＴＦ改変体におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す写真である。図８（Ａ）〔レーン１: 分子量マーカー、レーン２: 大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３: 天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン４〜１１: Ｅ１５３位改変体のライセート上清（４：１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｋ、６：Ｅ１５３Ａ、７：Ｅ１５３Ｖ、８：Ｅ１５３Ｌ、９：Ｅ１５３Ｇ、１０：Ｅ１５３Ｐ、１１：Ｅ１５３Ｉ）、レーン１２：大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ〕、図８（Ｂ）〔レーン１: 分子量マーカー、レーン２: 大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３: 天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン４〜１１: Ｅ１５３位改変体のライセート上清（４：１５３Ｙ、５：Ｅ１５３Ｆ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｈ、８：Ｅ１５３Ｍ、９：Ｅ１５３Ｑ、１０：Ｅ１５３Ｎ、１１：Ｅ１５３Ｄ）、レーン１２：大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ〕。
【図９】図９は、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す写真である。図９中、レーン１は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン２は天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン３〜９は本実施例により得られた各改変体のライセート上清（３：Ｑ６３Ｒ、４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｙ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｒ／Ｑ６３Ｒ、８：Ｅ１５３Ｙ／Ｑ６３Ｒ、９：Ｅ１５３Ｗ／Ｑ６３Ｒ）の泳動パターンを示す。また、天然型ヒトＣＮＴＦの泳動位置を←（１）、Ｑ６３Ｒ改変体の泳動位置を←（２）で表記する。
【図１０】図１０は、大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ（○）と大腸菌のライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦ（●）のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。
【図１１】図１１は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）を示し、（Ｂ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（▲）、Ｅ１５３Ｙ（△）、Ｅ１５３Ｆ（○）、Ｅ１５３Ｗ（□）を示す。
【図１２】図１２は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｃ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ａ（□）、Ｅ１５３Ｖ（■）、Ｅ１５３Ｌ（△）を示し、（Ｄ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｇ（□）、Ｅ１５３Ｐ（■）を示す。
【図１３】図１３は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｅ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｍ（□）、Ｅ１５３Ｉ（△）を示し、（Ｆ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｋ（□）を示す。
【図１４】図１４は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｇ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｑ（○）、Ｅ１５３Ｎ（□）、Ｅ１５３Ｄ（■）を示す。
【図１５】図１５は、Ｋ１５５位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｋ１５５Ｒ（○）、Ｋ１５５Ａ（△）、Ｋ１５５Ｍ（□）を示す。
【図１６】図１６は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＣＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）、Ｅ１５３Ｙ（△）、Ｅ１５３Ｆ（□）を示し、（Ｂ）における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（△）、Ｅ１５３Ｗ（○）を示す。
【図１７】図１７は、Ｅ１５３位改変体のラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）、Ｅ１５３Ｙ（□）、Ｅ１５３Ｆ（■）を示し、（Ｂ）における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（△）、Ｅ１５３Ｗ（▲）を示す。
【図１８】図１８は、天然型ＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した場合の活性値を示す。縦軸は、ＣＮＴＦ応答細胞の生存率（％）として、５７０ｎｍにおける吸光度（フォルマザンの生成を示す）で、１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ或いはＣＮＴＦ改変体を添加した場合を１００％として（表記実験の場合、Ａ570 ＝０．１９を１００％とする）、その値に対する比率で表した。
【図１９】図１９は、ヒトＣＮＴＦにおけるＤ１キャップ領域の変異による改変体の、ニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。各点（●）が、それぞれの改変体を表し、５０％有効濃度（ＥＣ５０）の比較による、天然型ヒトＣＮＴＦに対する活性百分率（％）で表記した。
【図２０】図２０は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の３次構造上に、本発明におけるヒトＣＮＴＦ改変体の変異導入部位（「Ｄ１キャップ領域」及び「Ｑ６３」）を表記したものを示す。
Claims (7)
- 天然型ヒト毛様体神経栄養因子（以下、毛様体神経栄養因子をＣＮＴＦと略す。）のアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基が、芳香族性アミノ酸残基又はアルギニン残基に置換されてなるヒトＣＮＴＦの改変タンパク質。
- 天然型ヒト毛様体神経栄養因子（以下、毛様体神経栄養因子をＣＮＴＦと略す。）のアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、プロリン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、リジン残基又はアルギニン残基に置換されてなるヒトＣＮＴＦの改変タンパク質。
- 天然型ヒトＣＮＴＦの６３位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基にさらに置換されている請求項１又は２記載の改変タンパク質。
- 他のアミノ酸残基がアルギニン残基である請求項３記載の改変タンパク質。
- 請求項１〜４いずれか記載の改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
- 請求項５記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
- 天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列の少なくとも１５３位に相当するアミノ酸残基をアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、プロリン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、リジン残基又はアルギニン残基に置換する工程を含む、ヒトＣＮＴＦの改変タンパク質の製造方法。
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