JP3768257B2 - Modified protein - Google Patents

Description

【００２２】
さらに、本発明において、「天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列」とは、国際公開番号WO９１／４３１６号公報に記載されたものであり（配列番号：１）、「天然型ＬＩＦのアミノ酸配列」とは、文献（R.C.Robinson et al.,Cell,(1994) 77巻1101頁）に記載されたものであり、「天然型ＯＳＭのアミノ酸配列」とは、文献（T.M.Rose and A.G.Bruce, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1991) 88巻8641頁, J.C.Kallestad et al., J.B.C.(1991) 266巻8940頁）に記載されたものであり、「天然型Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列」とは、文献（B.Lovejoy et al., J.Mol.Biol.(1993)234巻 640頁）に記載されたものである。本明細書におけるアミノ酸の位置の表記もこれらに従う。
【００２３】
本発明において、「改変タンパク質」とは、天然型タンパク質のアミノ酸配列中の少なくともＤ１キャップ領域に相当するアミノ酸残基（特にＤ１モチーフ中のアミノ酸残基）の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたタンパク質をいう。ここで、Ｄ１キャップ領域における改変、即ち、置換を受けるアミノ酸残基の数、種類、Ｄ１キャップ領域における位置等は限定されるものではない。しかしながら、改変タンパク質の比活性を高くする観点から、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されている改変体が好ましい。具体的には、ヒトＣＮＴＦにおける１５３位、ＬＩＦにおける１５６位、ＯＳＭにおける１６１位、Ｇ−ＣＳＦにおける１４６位が、ここでいうＤ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基に相当する。
【００２４】
本発明において、「他のアミノ酸残基」とは、天然のアミノ酸残基又は非天然のアミノ酸残基を意味する。他のアミノ酸残基が天然のアミノ酸残基の場合、中性又は塩基性アミノ酸残基が好ましい。即ち、本発明の改変タンパク質の好ましい例として、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン等の中性アミノ酸の残基や、ヒスチジン、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸の残基に置換されたものが挙げられる。なかでも、比活性の向上という観点から、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなどの芳香族性アミノ酸残基や、アルギニン等の残基に置換されたものがとりわけ好ましい。また、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、プロリン等の疎水性アミノ酸残基等も好適である。
【００２５】
また、他のアミノ酸残基が非天然のアミノ酸残基である場合としては、例えば蛋白質の合成段階で非天然アミノ酸を導入した場合、又は蛋白質合成後化学修飾された天然のアミノ酸残基等が挙げられる。蛋白質の合成段階で導入する方法として、部位特異的に様々な非天然アミノ酸を導入する一般的に有効な方法が報告されており(Science, 244, 182 (1989))、実際にパラ位をフッ素或いはニトロ基で修飾したフェニルアラニンを化学的にｔＲＮＡにアシル化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの蛋白合成系で発現した結果が示されている。また他の方法として、非天然のアミノ酸であるフラノマイシン(Furanomycin) を認識する大腸菌のIsoleucyl-ｔＲＮＡ(J. B. C., 265, 6931 (1990))を利用して目的の位置に導入したり、或いはCell−Freeの蛋白合成系(J. Biochem., 110, 166 (1991))において、目的の導入を行うことにより非天然のアミノ酸残基に置換されたもの等が挙げられる。
【００２６】
また、精製蛋白を利用して、アミノ酸残基特異的あるいは部位特異的に化学修飾したものも挙げられる（新生化学実験講座１，IV，11(1991)) 。例えばグルタミン酸残基に対しては、アミド化する、リジン残基に置換した後トリニトロフェニル化する、アルギニン残基に置換した後フェニルグリオキサールと反応させる、ヒスチジン残基に置換した後カルベトキシ化する、トリプトファン残基に置換した後アリールスルフェニルクロリドと反応させる、チロシン残基に置換した後ニトロ化する等の方法による改変体が挙げられる。これらの化学修飾は常法により行うことができる。
【００２７】
なお、本発明においては改変タンパク質の活性を著しく損なわないかぎり、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の置換に加え、その位置以外のアミノ酸残基に対する、通常蛋白工学分野で行われる改変（アミノ酸置換、アミノ酸削除、アミノ酸付加、およびドメイン置換等）を行うことも可能である。
【００２８】
例えば天然型ヒトＣＮＴＦにおいて、１５３位に加えて、さらに６３位、１３６位、１５４位、１５６位、１５７位、１６０位、１６３位、１６４位、１６７位、１７７位、１７８位、１８４位などのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したものが挙げられる。ここでいう１５３位以外のアミノ酸残基の置換は、前記のように定義される「他のアミノ酸残基」で置換される。天然型ヒトＣＮＴＦでは、アミノ酸配列の６３位のアミノ酸残基をアルギニン残基に置換することによりＣＮＴＦ活性が上昇することが既に公表されているが（Panayotatos et al., J.B.C., 268 巻,19000-19003頁（1993））、このようなヒトＣＮＴＦ上のＣＮＴＦ活性増加に有効な変異を組み合わせた置換を行うことにより、それぞれの部位の単独置換体以上の比活性を有する改変体をも得ることができる。例えば、１５３位に加えて６３位のアミノ酸残基も置換する場合、１５３位と６３位を共にアルギニンに置換したもの、１５３位はチロシンに６３位はアルギニンに置換したもの、１５３位をトリプトファンに６３位はアルギニンに置換したもの等が好適例として挙げられる。
【００２９】
本発明の改変タンパク質は、遺伝子工学分野における常法により作成することができる。即ち、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する場合、当該天然型タンパク質、又は当該改変体をコードするＤＮＡ含有ベクターの一部を合成オリゴヌクレオチドで置換して、当該天然型タンパク質のアミノ酸配列において、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸をコードするＤＮＡを他のアミノ酸をコードするＤＮＡに変え、これを適当な発現ベクターに連結して宿主内に導入し、形質転換させた宿主に目的の改変体を生産させることができる。以下、その詳細について述べる。
【００３０】
本発明の改変タンパク質の製造には、例えば、当該天然型タンパク質をコードする構造遺伝子を用いることができる。ヒトＣＮＴＦを改変する場合、天然型ヒトＣＮＴＦをコードするヒトＣＮＴＦ構造遺伝子は、例えばウサギあるいはヒトのゲノムＤＮＡからのクローニングによって既に取得されており(K. A. Stockli et al., Nature, 342, 316 (1989)., L. F. Lin et al., Science, 246, 1023 (1989)., P. Masiakowski et al., J. Neurochem., 57, 1003（1991)., A. Negro et al., Eur.J. Biochem., 201, 289（1991)., J. R. McDonald et al., Biochem. Biophys. Acta., 1090, 70（1991)., A. Lam et al., Gene, 102, 271 (1991)) 、そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列も知られている。従って、例えば常法（J. Sambrook et al., Molecular cloning : A laboratory manual)に従って、天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子をクローニングすることができる。また、ＬＩＦ、ＯＳＭ、Ｇ−ＣＳＦをコードする構造遺伝子も同様に取得されているので（J.F.Moreau et al., Nature(1988)336巻 690頁, M.N.Kallested et al., Mol.Cell.Biol.(1989) 9巻2847頁, H.Nomura et al., EMBO J.(1986) 5巻 871頁）、それらを用いてヒトＣＮＴＦと同様に行えばよい。
【００３１】
プラスミド中にクローニングした天然型タンパク質構造遺伝子の特定の配列を他の配列に置換する方法は、既に一般的に行える状況にあり、本発明においても常法により、Ｄ１モチーフのＮ末端側から３番目に相当するアミノ酸残基を置換することができる。置換の方法は、目的とする置換したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを当該天然型タンパク質における置換の対象となる部分の配列（以下、相当配列と省略する。）と置き換える方法が便利である。
【００３２】
具体的には、例えば置換した塩基配列からなるオリゴヌクレチドと、増幅に必要なタンパク質の配列中、置換部位以外の塩基配列或いはベクター部分の配列に相当するオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、天然型タンパク質の構造遺伝子を含むプラスミドを鋳型にして、上記２種で挟まれた領域を増幅し、得られた増幅フラグメントを天然型タンパク質の相当配列と置き換える方法が便利である。２種のプライマーで挟まれた領域の増幅方法としては、例えば遺伝子増幅法（ＰＣＲ）（Gene, 77, 61-68 (1989)) が行われ、またこの操作を行うためには市販のＤＮＡ自動増幅装置が有効に用いられる。なお、１回の増幅反応で天然型タンパク質の相当配列との置き換えに都合の良い制限酵素切断部位を有するフラグメントが得られない場合には、１回目の遺伝子増幅産物を２回目の遺伝子増幅反応の１つのプライマーとして用い、目的の制限酵素切断部位を有するフラグメントを調製することもできる。
【００３３】
図１に、その一例としてヒトＣＮＴＦを対象とする場合を示す。図１に示されるように、２回の遺伝子増幅反応を行うことによって目的の置換した塩基配列が導入され、かつ天然型ヒトＣＮＴＦの相当配列との置き換えに都合の良い制限酵素切断部位を有するフラグメントを得ることができる。さらに、２つの異なる部位に置換を導入する場合には、別個にそれぞれの部位に変異を導入した後、適当な制限酵素切断部位を利用してクローニングし、両変異を持つ遺伝子を構築するか、あるいは一方の変異を導入したあと、その変異遺伝子をテンペレートとして用いて、さらに遺伝子増幅反応による一方の変異の導入を行い構築することができる。
【００３４】
目的の置換（あるいは挿入）が行われたＤＮＡ配列を確認するためには、ジデオキシ法（Science, 214, 1205（1981))の原理を利用し、例えばシークナーゼＤＮＡシークエンスキット（東洋紡社製）を用いて行うことができる。その他、実施例に記載されているような制限酵素によるＤＮＡの切断、欠失、それらにより生じるＤＮＡ断片の電気泳動による分離、回収、あるいは連結等の遺伝子操作は全て公知の方法（T.Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.（1982))に準じて行うことができる。
【００３５】
このようにして得られる改変タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡは、例えばｐＫＫ２２３−４（Pharmacia 社製、図２）等周知の発現ベクターに連結された後、適当な宿主に導入されることにより、本発明の目的物質である改変タンパク質を発現することができる。宿主としては、原核細胞または真核細胞のいずれでもよく、例えば大腸菌株や動物細胞株は、特に記載のない限り既に広く普及しており入手は容易である。例えば大腸菌宿主としては、ＪＭ１０９株等が挙げられる。また、動物細胞宿主としては、ＣＯＳ−１、ＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００３６】
発現ベクターを用いてこれらの宿主を形質転換するには、電気パルス法（高山伸一郎、細胞工学6、 771、 1987）、或いは塩化カルシウム法 (J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)) を用いればよい。このような形質転換された大腸菌株や動物細胞株等を用い、例えば常法(T. Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.（1982))に従って、改変タンパク質を発現させることができる。さらに、得られた菌株を常法に従い溶菌し、遠心分離（１０５００×ｇ）にかけて可溶性画分を得ることができる。発現された改変タンパク質は、必要に応じて常法に従って精製することも可能である。例えばヒトＣＮＴＦ改変体の場合は、J. Neurochem.,57, 1003（1991) に従って精製することができる。
【００３７】
ヒトＣＮＴＦ改変体の場合、具体的には、例えば、発現誘導後の大腸菌を、集菌後リゾチーム処理により溶解し、更に超音波処理を行う。遠心分離（１１０００×ｇ）を行い、ヒトＣＮＴＦ改変体を含む不溶性画分を得て、この画分を６Ｍの塩酸グアニジン溶液で可溶化し、次いでβメルカプトエタノールを含むトリス−塩酸緩衝液で透析し再生を行う。次に、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Asahipak-502NP: 旭化成社製）にかけた後、ＮａＣｌ直線濃度勾配により可溶化されたヒトＣＮＴＦ改変体を溶出する。更に、溶出した可溶性タンパク質を疎水性カラムクロマトグラフィー（Ether-5PW:東洋曹達社製）にのせ、洗浄後に硫酸アンモニウム直線濃度勾配で溶出することにより、精製ヒトＣＮＴＦ改変体を得ることができる(J. Neurochem., 57, 1004〜1005（1991）を参照し、一部改変した）。
【００３８】
発現された改変タンパク質の定量は、通常用いられる公知の方法でよい。例えば、天然型タンパク質を用いて得られる特異的抗体によるエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）やＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等が利用できる。ＥＬＩＳＡによる場合、上述と同様の方法で調製した天然型タンパク質の精製品を用い、例えば常法(Methods in Enzymology, 73, 46-52(1981))に従って、動物〔例えばニュージーランドホワイトラビット（♂，１ｋｇ）等〕に免疫して抗血清を取得することができる。抗血清からの特異的抗体の精製は、例えば天然型タンパク質を標品としてカラム担体〔例えば活性化セファロース（Pharmacia 社製, CNBr Activated Sepharose 等〕に結合させ、これを用いてカラムクロマトグラフィーを行うことにより可能である。該方法により得られる特異的抗体を用いて、改変タンパク質の定量のためのＥＬＩＳＡを行うことにより、未精製の状態で微量の改変タンパク質を検体とした場合でも、充分に定量を行うことが可能となる。
【００３９】
また、改変タンパク質を定量する別の方法として、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を利用することができる。即ち、公知の方法（Nature, 227, 680（1970))でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、当該タンパク質に由来するゲルバンドの濃度を画像処理ソフト（例えば、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４７）を用いて、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の場合と同様に未精製の状態で改変タンパク質の定量を行うことができる。
【００４０】
上述のようにして調製した改変タンパク質の生物活性は、それぞれのタンパク質に応じた方法で測定する。
例えばヒトＣＮＴＦ改変体タンパク質の生物活性は、ニワトリ後根神経節（ＤＲＧ）、毛様体神経節（ＣＧ）又はラットＤＲＧ等を用いることにより公知の方法（Nerve Growth Factors, 31-56,（1989))で測定することができる。また、ＬＩＦ改変体タンパク質の生物活性は、胎性幹細胞等種々の細胞を利用して、公知の方法（D.Metcalf, Growth Factors (1992) 7巻 169頁）で測定することができる。ＯＳＭ改変体タンパク質の生物活性は、黒色腫細胞の成長阻害活性等（D.Horn et al., Growth Factors (1990) 2巻 157頁）を利用して測定することができる。Ｇ−ＣＳＦ改変体タンパク質の生物活性は、造血系の腫瘍細胞であるＮＦＳ−６０細胞の成長促進活性（M.Tsuchiya et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83巻7633頁）等を利用して測定することができる。
【００４１】
本発明のヒトＣＮＴＦ改変体等の改変タンパク質は、天然型タンパク質と同等あるいはそれ以上の生物活性を有しているため、天然型に比べて有用な治療剤となり得ることが期待される。更に、天然型タンパク質の医薬品としての開発段階で問題になっている、大量投与による問題点、即ち、必要量を生産することの量的な難しさ、混在する物質による副作用、あるいは天然型タンパク質自身に対する抗体出現の為の副作用等の問題点を解決できる可能性があると考えられる。
【００４２】
例えばヒトＣＮＴＦ改変体の生物活性としては、後述の実施例において示されるように、１５３位のアミノ酸残基がアラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、リジンの残基に置換された場合には、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して２〜３倍のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示し、１５３位のアミノ酸残基がチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニンの残基に置換された改変体は、ニワトリＤＲＧニューロン、ニワトリＣＧニューロン及びラットＤＲＧニューロンに対して天然型ヒトＣＮＴＦの約１０倍の生存維持活性を示す。また、１５３位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基（例えば、アルギニン、チロシン、トリプトファン残基）に置換され、かつ６３位のアミノ酸残基がアルギニン残基等に置換された場合には、ニワトリＤＲＧニューロンに対してそれぞれの単独置換体よりもさらに高い比活性を示す。
このように本発明のヒトＣＮＴＦ改変体は、天然型ヒトＣＮＴＦと同等あるいはそれ以上の生物活性を有しているため、天然型ヒトＣＮＴＦと同様に、運動神経変性疾患、末梢神経ニューロパチーなどの末梢神経関連疾患、アルツハイマー病、脳血管性痴呆症、パーキンソン病、ハンチング病などの中枢神経関連疾患、網膜色素変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜黄斑変性症などの眼関連神経の治療剤となり得る。更に、天然型ヒトＣＮＴＦの医薬品としての開発段階で問題になっている、大量投与による問題点、即ち、必要量を生産することの量的な難しさ、混在する物質による副作用、あるいはヒトＣＮＴＦ自身に対する抗体出現の為の副作用等の問題点を解決できる可能性があると考えられる。
【００４３】
前述したように、バザーンが、ＣＮＴＦ類縁タンパク質であるαヘリックスに富むサイトカイン類の中でＤ１キャップ領域においてＤ１モチーフと呼ぶアミノ酸の類似配列があることを示したが(J. F. Bazan, Neuron (1991年）７巻、197 頁）、本発明者らは今回初めてそのモチーフ内での各アミノ酸の役割を明らかにした。各タンパク質において、Ｄ１キャップ領域のＤ１モチーフとして予想されるアミノ酸配列を表１に示す。この時、長鎖構造のグループ（ＩＡ、ＩＢ）と短鎖構造のグループ（ＩＩ）を分類して表記し、更に長鎖構造のグループに関しては受容体としてｇｐ１３０を利用するグループ（ＩＡ；ＣＮＴＦはこのグループに属する）とそれ以外のグループ（ＩＢ）に分類して表記した。
ヒトＣＮＴＦと同様に、Ｄ１モチーフと類似配列を持つタンパク質は、長鎖構造のタンパク質に多く、特に受容体としてｇｐ１３０を利用するＬＩＦ及びＯＳＭ、あるいはＧ−ＣＳＦでの類似性が高い。
【００４４】
αヘリックスに富むサイトカイン類に関しては、現在までに多くの構造活性相関解析がなされており、ヒトＣＮＴＦと、より構造の類似性の高い長鎖構造のグループのタンパク質に関する構造活性相関解析の結果について、図３に簡略にまとめた。受容体としてｇｐ１３０を利用するグループ（Ａ）とそれ以外のグループ（Ｂ）に分類して表記し、また、実験的に活性発現に重要であることが既知の領域に関しては網掛けで、活性発現への関与が予測される領域に関しては破線で囲って表記した。
【００４５】
Ｄ１キャップを含むＣＤループとヘリックスＤの境界領域に関しては、前述のようにＩＬ−６ (J. P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁）及びＬＩＦ(R. C. Robinson et al., Cell (1994年）77巻、1101頁）において受容体結合への重要性が報告されている（但し、ＩＬ−６のＤ１キャップ領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフとの類似性が無いため、Ｄ１モチーフ上での改変に重要なアミノ酸の同定にはならず、また、ＬＩＦの同領域のアミノ酸配列はＤ１モチーフと類似性が高いものの、改変に重要なアミノ酸残基の同定はなされていない）。また、他のαヘリックスに富むサイトカイン類で、同領域が活性発現に重要であるという報告は、後述するＧ−ＣＳＦを除くと報告されていない。また今回、ヒトＣＮＴＦにおいてＤ１キャップ領域の重要性が示されたことから、Ｄ１キャップ領域を受容体結合に利用するタンパク質の１つの共通項目として、ｇｐ１３０を受容体として利用するということが考えられる。同グループのタンパク質としては、ＣＮＴＦ以外にＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１が知られており、これらのタンパク質において、Ｄ１キャップ領域に相当するアミノ酸残基が、活性発現のための受容体結合に関与している可能性が高いと考えられる。
【００４６】
特に、ＬＩＦ及びＯＳＭはＤ１モチーフとの類似性が高いことから、ヒトＣＮＴＦにおけるＤ１キャップ領域での変異による効果と同じ効果が、それぞれのタンパク質での相当する部位の改変により起こることが予想される。具体的には、ヒトＣＮＴＦの１５５位のリジン残基に相当する、ＬＩＦの１５８位及びＯＳＭの１６３位のリジン残基の変異により、活性が激減することが予想され、またヒトＣＮＴＦの１５３位のグルタミン酸残基に相当する、ＬＩＦの１５６位及びＯＳＭの１６１位のグルタミン残基の変異により、ヒトＣＮＴＦの場合と同じような活性の上昇が期待される。また、この両残基に限らず、Ｄ１モチーフ内の他のアミノ酸の変異でも活性の変化があることが予想される。
【００４７】
ｇｐ１３０を利用しない、あるいは利用するという報告がないタンパク質の中で、Ｄ１モチーフの配列との類似性が顕著なものとしてＧ−ＣＳＦがある。Ｇ−ＣＳＦにおいては、同領域周辺を認識するモノクローナル抗体が、Ｇ−ＣＳＦの活性を中和するという報告もあり(J. E. Layton et al., J. B. C. (1991年）266 巻、23815 頁）、Ｄ１キャップ領域の受容体結合への関与が予想される。即ち、ヒトＣＮＴＦの１５３位のグルタミン酸残基に相当する、Ｇ−ＣＳＦの１４６位のグルタミン残基の変異により、ヒトＣＮＴＦの場合と同じような活性の上昇が期待され、Ｄ１モチーフ内の他のアミノ酸の変異により活性の変化が起こることが予想される。更に、Ｇ−ＣＳＦとの類似性が報告されているＭＧＦについても同様のことが予想され、ＭＧＦのＤ１キャップ領域内の変異により、活性の変化（あるいは上昇）が起こることが予想される。ｇｐ１３０を受容体として利用するタンパク質に限らず、Ｄ１モチーフという共通配列での受容体結合は一般に見られることかも知れない。
【００４８】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例において使用する略語の名称を以下に示す。
ＰＣＲ ： 遺伝子増幅法
ＢＡＰ ： bacterial alkaline phosphatase
ＩＰＴＧ ： isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
ＰＭＳＦ ： phenylmethanesulfonyl fluoride
ＰＢＳ ： phosphate buffered saline
ＢＳＡ ： bovine serum albumin
ＡＬＰ ： alkaline phosphatase
ＳＡ ： streptoavidine
ＰＮＰＰ ： p-nitrophenyl phosphate
ＤＲＧ ： dorsal root ganglion
ＤＭＥＭ ： dulbecco's modified eagle medium
ＦＣＳ ： fetal calf serum
ＭＴＴ： 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide
ＣＧ ： ciliary ganglion
【００４９】
実施例１
天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子への変異導入及びヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製
１）実験材料
大腸菌株ＪＭ１０９（lacI^q : 宝酒造社製）をクローニングのため、また天然型ヒトＣＮＴＦおよびヒトＣＮＴＦ改変体の発現のための宿主菌として使用した。天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）としては、ｔａｃプロモーターを有する大腸菌発現ベクターであるpKK223-4（Pharmacia 社製、図２）に天然型ヒトＣＮＴＦ遺伝子及び該ＣＮＴＦ遺伝子の５’側にリンカーＤＮＡを挿入して作製したものを使用した（図４）。
【００５０】
２）変異導入遺伝子の増幅反応
ランダムなアミノ酸の部位特異的変異の導入は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）を利用した。数種の合成ＤＮＡプライマーを使用し、２段階のＰＣＲ反応により調製した（図１）。ＰＣＲには、テンペレートとして天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF)を使用し、ポリメラーゼは適合度（fidelity）の高いpfu ポリメラーゼ（Stratagene社製）を利用した。なお、使用したプライマーのシークエンスを図５に示した。変異部位のプライマーとしては、天然型ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列における１５２番目から１５７番目のそれぞれのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したヒトＣＮＴＦ改変体（以下、例えば１５３位を置換したヒトＣＮＴＦ改変体を単に「Ｅ１５３位改変体」と省略する場合がある。）を得るためのプライマーを示したが、その相当部位において、第１コドン及び第２コドンはＧ、Ａ、Ｔ及びＣ、また第３コドンはＧ及びＣの混合として、合成の段階で調製した。これら３２種の混合プライマーにより、目的の部位については２０種のアミノ酸全てを網羅していることになる。
【００５１】
また、６３位のグルタミン残基をアルギニン残基に置換する場合は、目的の変異の単一のプライマーとして、図５に示すｐＱ６３Ｒを用いた。改変体作成の手法、条件等は、変異部位のプライマーとしてｐＥ１５３の代わりにｐＱ６３Ｒを用いた以外は、上記と同様である。また、６３位のグルタミン残基をアルギニン残基に置換したＣＮＴＦ改変体を「Ｑ６３Ｒ改変体」と省略する場合がある。なお、各ステップのＰＣＲの反応条件を図６に示した。
【００５２】
具体的にはまず、構造遺伝子の５’側或いは３’側のプライマー１と、変異部位のプライマー２（ｐＥ１５３又はｐＱ６３Ｒ）の２種のプライマーを利用して、１回目のＰＣＲ反応を行った。プライマー1 は、変異部位に近い方のプライマー（図５に記載の＃Ｎ）を用いた。増幅後、アガロースゲルにて電気泳動し、目的遺伝子を切り出し精製した。次に、この生成産物と図５に記載の＃Ｃ（ＲＶ）をプライマーとして利用し、ヒトＣＮＴＦ全構造遺伝子を増幅するようにして２回目のＰＣＲ反応を行った。この段階においては、１回目のＰＣＲによる生成産物をプライマーとして用いるが、使用量は約１〜２ｐｍｏｌと、ある程度狭い範囲でのみ増幅が可能であり、１回目のＰＣＲの生成産物量が、少な過ぎてもまた逆に多過ぎても増幅されなかった。また、アニーリングの温度は６０℃前後が適当であり、テンペレートにはpKKCNTF をPvuII で消化し線状（linear）ＤＮＡとして調製したものを用いた。
【００５３】
３）ヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製
天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）をBamHI 及びPstIで切断し、パッセンジャー部分である天然型ヒトＣＮＴＦ構造遺伝子部分を除き、ベクターとして用いた。一方、このベクターに挿入するパッセンジャー（ヒトＣＮＴＦ改変体構造遺伝子）部分には、BamHI 及びPstIの切断部位が構造遺伝子内にも存在する。そのため、BamHI 及びPstIサイトは使用できないので、それらとそれぞれ相同な（cohesive）部分を生成する、Bgl II（５’側）及び EcoT22I（３’側）の切断部位を遺伝子増幅のプライマー内にデザインし（図５）、これらの制限酵素による消化後、ベクターの BamHI、PstIサイトに挿入した。即ち、具体的には、まずpKKCNTF をBamHI 及びPstIで消化し、電気泳動後切り出し精製し、更に、ＢＡＰ処理を行った。一方、遺伝子増幅によって調製されたパッセンジャーをBgl IIとEcoT22I で切断し、このパッセンジャー（約１００ｎｇ：モル数でベクターの約１０倍）と上記調製したベクター（１００ｎｇ）を用いてライゲーションを行い、後述の方法でＪＭ１０９株へ形質転換した。得られたクローンについて塩基配列の決定を行い、変異の同定を行なった。塩基配列決定には、シークナーゼＤＮＡシークエンスキット（東洋紡社製）を利用した。このようにして、Ｅ１５３位改変体発現ベクターとＱ６３Ｒ改変体発現ベクターを得た。
【００５４】
４）両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた変異遺伝子及び発現ベクターの調製
pKKCNTF と同様、Ｑ６３Ｒ改変体の発現ベクター上には、制限酵素Hind IIIによる切断部位が２箇所存在する（図７）。図７に示したパッセンジャー部分をＥ１５３位改変体遺伝子の相当部分と置換することにより、両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた変異ＣＮＴＦの発現ベクターの調製を行った。具体的には、まず上記で得たＱ６３Ｒ改変体の発現ベクターをHind IIIで消化し、そのままライゲーションを行い、図７のパッセンジャー遺伝子を欠失した遺伝子を調製した。この遺伝子についてさらにHind IIIで消化を行い、消化されたＤＮＡを精製後ＢＡＰ処理し、ベクター部分とした。また、Ｅ１５３位改変体それぞれの発現ベクターをHind IIIで消化後パッセンジャー部分（約４００ｂｐ）を分離精製し、上記調製したベクター部分を用いてライゲーションを行い、同様に後述の方法でＪＭ１０９株へ形質転換した。得られたクローンについてパッセンジャー部分の挿入及び挿入方向を確認し、目的の挿入のあったクローンについて塩基配列決定により変異の再確認を行った。
【００５５】
その結果、表２に示すそれぞれ５１種のヒトＣＮＴＦ改変体を発現する発現ベクターを得た。
【００５６】
【表２】

【００５７】
５）発現ベクターで形質転換された大腸菌の調製
市販のＪＭ１０９株のコンピテントセル（東洋紡社製）１００μＬに、前記により調製したヒトＣＮＴＦまたはヒトＣＮＴＦ改変体を発現するベクターのＤＮＡ（約１００ｎｇ）を混合し、３０分間氷中に放置した。次いで４２℃で３０秒間熱処理を行った後、ＳＯＣ培地（トリプトン２０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム０．５８５ｇ、塩化カリウム０．１８６ｇ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、硫酸マグネシウム１０ｍＭ、グルコース２０ｍＭ：１リットルあたり）９００μＬに加え、３７℃で約１時間振盪培養した。５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ〔ｐＨ７〕：１リットルあたり）に塗り広げ、形質転換された大腸菌を選択した。
【００５８】
実施例２
１）大腸菌によるヒトＣＮＴＦ改変体の発現
実施例１により得られた本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換した後、この形質転換された大腸菌を利用しヒトＣＮＴＦ改変体を発現させた。発現はＴＹＧＰＮ培地（トリプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グリセリン８ｍＬ、リン酸１ナトリウム５ｇ、硝酸カリウム１ｇ〔ｐＨ６．１〕：１リットルあたり）を用い、少量培養を行った。
【００５９】
即ち、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＹＧＰＮ培地９００μＬに大腸菌株ＪＭ１０９の形質転換体の種培養１００μＬを加え、３７℃で振盪培養した。２時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、３時間培養した。遠心後、下記の溶菌操作を行った。培養液ペレットに溶菌溶液（５０ｍＭ トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、リゾチーム０．２７ｍｇ／ｍＬ、０．１３ｍＭ ＰＭＳＦ、６０Ｕ ＤＮａｓｅＩ）１００μＬを添加し、３７℃で１時間消化した後、遠心（１５０００ｒｐｍ×１５分）した。そのライセートの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる濃度検定及びＤＲＧニュ−ロンの生存維持活性測定のためのサンプルとした。なお、ＤＲＧニュ−ロンの生存維持活性測定サンプルは５０μＬのライセートの上清を、９５０μＬのＰＢＳ（０．１％ＢＳＡを含む。）に希釈し、ろ過除菌して調製した。
【００６０】
２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるヒトＣＮＴＦ改変体の発現の確認と定量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の条件で行った。
市販の１５％−２５％ポリアクリルアミド濃度のグラジエントゲル（第一化学薬品社製）を用いた。前記ライセートの上清の４μＬを各ウェルにのせ、定電流（４０ｍＡ）で１時間泳動を行った。
【００６１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた、Ｅ１５３位の改変体における泳動パターンを例として図８（Ａ）及び（Ｂ）に示した。図８（Ａ）中、レーン１は分子量マーカー、レーン２及びレーン１２は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン４〜１１は本実施例により得られたＥ１５３位改変体の前記ライセート上清（４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｋ、６：Ｅ１５３Ａ、７：Ｅ１５３Ｖ、８：Ｅ１５３Ｌ、９：Ｅ１５３Ｇ、１０：Ｅ１５３Ｐ、１１：Ｅ１５３Ｉ）の泳動パターンを示す。同様に図８（Ｂ）中、レーン１は分子量マーカー、レーン２及びレーン１２は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン４〜１１は本実施例により得られたＥ１５３位改変体の前記ライセート上清（４：Ｅ１５３Ｙ、５：Ｅ１５３Ｆ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｈ、８：Ｅ１５３Ｍ、９：Ｅ１５３Ｑ、１０：Ｅ１５３Ｎ、１１：Ｅ１５３Ｄ）の泳動パターンを示す。また、ヒトＣＮＴＦの位置を←で表記した。
【００６２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた、Ｅ１５３位の改変体、Ｑ６３Ｒ改変体及び本発明の両部位の変異の組み合わせ（Ｅ１５３／Ｑ６３Ｒ）による改変体における泳動パターンを図９に示した。図９中、レーン１は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン２は天然型ヒトＣＮＴＦの前記ライセート上清、レーン３〜９は本実施例により得られた各改変体の前記ライセート上清（３：Ｑ６３Ｒ、４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｙ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｒ／Ｑ６３Ｒ、８：Ｅ１５３Ｙ／Ｑ６３Ｒ、９：Ｅ１５３Ｗ／Ｑ６３Ｒ）の泳動パターンを示す。また、天然型ヒトＣＮＴＦの泳動位置を←（１）、Ｑ６３Ｒ改変体の泳動位置を←（２）で表記した。
【００６３】
この結果から、スキャナーを利用して電気泳動の画像を取り込み、ＣＮＴＦに由来するゲルバンドの濃度を画像処理ソフト（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４７）を用いて定量した。一例として、天然型ヒトＣＮＴＦ及びヒトＣＮＴＦ改変体（Ｅ１５３Ｒ）の定量の結果を示すと、それぞれ６．４μｇ／ｍＬ、７．０μｇ／ｍＬであった。
【００６４】
３）ＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＮＴＦ改変体の定量
精製抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体を利用して、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、活性測定サンプル中のヒトＣＮＴＦ改変体の濃度を定量した。即ち、予め抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体を固定化しておいた９６穴プレートに、５０μＬの測定サンプルをのせ、４℃で一晩放置した。ＰＢＳで各ウェルを洗浄（２００μＬ、３回）し、ビオチン化抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ₃ に１０００倍希釈したもの）５０μＬを反応させた。２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼ結合ストレプトアビジン（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ₃ に２０００倍希釈したもの）（ＶＥＣ社）５０μＬを入れ、室温にて２時間放置した。再度２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＮＰＰを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ９．８）溶液に室温にて溶解し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。なお、精製抗天然型ヒトＣＮＴＦ抗体の調製は、天然型ヒトＣＮＴＦをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
【００６５】
天然型ヒトＣＮＴＦ及びヒトＣＮＴＦ改変体（Ｅ１５３Ｒ）の定量の結果はそれぞれ７．６μｇ／ｍＬ、７．９μｇ／ｍＬであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から推定されたものとほぼ同程度であった。他の改変体に関しても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた定量値とＥＬＩＳＡ法から求めた定量値でほぼ同程度の結果が得られた。図１０〜１７では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求めた定量値で表している。
【００６６】
実施例３
ヒトＣＮＴＦ改変体の活性測定
ニワトリ後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの生存維持活性を指標として、実施例２により得られた各ＣＮＴＦ改変体の活性測定を行った。即ち、１０日令ニワトリ胚（Ｅ１０）からＤＲＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、３０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）でコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、７２時間）を行った。培養後の生存細胞について、１０μｇのＭＴＴを添加した際の還元能を指標として、フォルマザンの生成量を５７０ｎｍの吸光度で調べた。なお、各ＣＮＴＦ改変体は前培養の後、最終濃度０．００１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬとして各々添加した。
【００６７】
また、対照として、天然型ヒトＣＮＴＦを用いてＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を測定した。なお、活性測定に使用した天然型ヒトＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体サンプルは、同じ方法で同時に調製したものである。
【００６８】
また、１５３位のグルタミン酸残基をアルギニン残基に置換したＥ１５３Ｒ改変体、チロシン残基に置換したＥ１５３Ｙ改変体、ヒスチジン残基に置換したＥ１５３Ｈ改変体、フェニルアラニン残基に置換したＥ１５３Ｆ改変体、トリプトファン残基に置換したＥ１５３Ｗ改変体については、以下のようにニワトリ毛様体神経節（ＣＧ）ニューロンに対する生存維持活性も調べた。即ち、８日令ニワトリ胚（Ｅ８）からＣＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、６０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）でダブルコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、２４時間）を行った。培養後の生存細胞については、ＤＲＧの場合と同様にＭＴＴを用いて吸光度を測定し、生存維持活性の指標とした。
【００６９】
さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体については、以下のようにラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性も調べた。すなわち、２１日令ラット胚（Ｅ２１）からＤＲＧニューロンを摘出し、トリプシン（０．１２５％）及びＤＮａｓｅＩで処理した後、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養（３７℃、３０分）を行った。次に、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）でダブルコートした９６穴プレートを用いて、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で分散培養（各ウェル１００μＬ、３７℃、７２時間）を行った。培養後の生存細胞については、ニワトリＤＲＧの場合と同様にＭＴＴを用いて吸光度を測定し、生存維持活性の指標とした。
【００７０】
また、本実施例における生存維持活性の測定結果の一部として、上記と同様の方法により調製したライセートの上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦと精製天然型ヒトＣＮＴＦのニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１０）、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１１〜１４）、また、１５５番目のリジン残基に変異を導入した改変体（Ｋ１５５位改変体）のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１５）を示す。さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体のニワトリＣＧニューロンに対する生存維持活性（図１６）およびＥ１５３Ｒ改変体、Ｅ１５３Ｙ改変体、Ｅ１５３Ｈ改変体、Ｅ１５３Ｆ改変体、Ｅ１５３Ｗ改変体のラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性（図１７）についても、対応する図に示す。図１０〜１７において、縦軸は５７０ｎｍにおける吸光度（フォルマザンの生成を示す。）を、横軸は添加したＣＮＴＦの濃度をそれぞれ示す。
【００７１】
また、組換え天然型ヒトＣＮＴＦとＥ１５３位、Ｑ６３位の単独の置換体及び両部位の変異の組み合わせによる、改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性の測定も行った。結果を図１８に示す。図１８においては天然型ＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した場合の活性値を示しており、縦軸はＣＮＴＦ応答細胞の生存率（％）として、５７０ｎｍにおける吸光度を、１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ或いはＣＮＴＦ改変体を添加した場合を１００％とし（表記実験の場合は、Ａ₅₇₀ ＝０．１９を１００％とする）、％表示したもの（フォルマザンの生成を示す。）である。ＰＢＳはブランクテストとして、ＣＮＴＦの代わりにＰＢＳ溶液（０．１％ＢＳＡを含む）を添加したもの、Ｗｉｌｄは天然型ヒトＣＮＴＦを添加したものである。
【００７２】
１）ライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦの活性
図１０は、ライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦと精製天然型ヒトＣＮＴＦのニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を比較したものであるが、両者はほぼ同等の活性を示したことから、ライセート上清中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦは活性型であることが定量的に確認された。
【００７３】
２）Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
図１１〜図１４において、１５３位のアミノ酸残基がメチオニン、ロイシン、バリン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、プロリン、リジンの残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｍ、Ｅ１５３Ｌ、Ｅ１５３Ｖ、Ｅ１５３Ａ、Ｅ１５３Ｑ、Ｅ１５３Ｎ、Ｅ１５３Ｇ、Ｅ１５３Ｐ、Ｅ１５３Ｋ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して２〜３倍の生存維持活性を示し、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）は、約１０倍の生存維持活性を示した。また、１５３位のアミノ酸残基がアスパラギン酸またはイソロイシンに置換された場合（Ｅ１５３Ｄ、Ｅ１５３Ｉ）は、天然型と同程度の生存維持活性を示した。
【００７４】
図１８に示したＥ１５３位改変体及びＱ６３Ｒ改変体（それぞれ単独の変異）は天然型ＣＮＴＦよりも高い生存維持活性を示し、また各単独の改変体は同程度の比活性であることが確認された。さらに、両変異を組み合わせた改変体は、天然型ＣＮＴＦよりも、さらにはそれぞれ単独の改変体よりも高い比活性を示した（図１８）。
【００７５】
３）Ｋ１５５位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
図１５は、Ｋ１５５Ｒ改変体、Ｋ１５５Ａ改変体、Ｋ１５５Ｍ改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示したものであるが、元々のリジン残基と同様に正電荷を有するアルギニン残基への変異の時のみ、天然型ＣＮＴＦの１％弱の活性を保持しているが、他のアミノ酸残基への変異では、いずれも活性を消失してしまった。
【００７６】
４）Ｄ１キャップ領域に変異を導入した改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する活性
また、本実施例におけるヒトＣＮＴＦのＤ１キャップ領域に変異を導入した改変体の、ニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を図１９にまとめた。前述の１５３位及び１５５位以外の改変体においても、変異による活性の変動が大きかった。
【００７７】
５）Ｅ１５３位改変体のニワトリＣＧニューロンに対する活性
図１６において、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して１０倍近い生存維持活性を示した。
ＤＲＧニューロンに対して高比活性を示した改変体はＣＧニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示したことから、当該改変体は他のニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すことが考えられる。
【００７８】
６）Ｅ１５３位改変体のラットＤＲＧニューロンに対する活性
図１７において、１５３位のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン残基に置換された場合（Ｅ１５３Ｒ、Ｅ１５３Ｈ、Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ）、１５３位がグルタミン酸（天然型）のものに対して１０倍近い生存維持活性を示した。
この結果から、鳥類であるニワトリのニューロンに対して高比活性を示した改変体は、哺乳類であるラットのニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すと考えられる。さらにこの結果から、ヒトのニューロンに対しても天然型より高い生存維持活性を示すことが期待される。
【００７９】
これらの結果から以下のことが考察された。
１５３位の位置がグルタミン酸（天然型）又はアスパラギン酸の場合は活性が低いことから、１５３位の負電荷の存在はヒトＣＮＴＦの活性発現には不利であると考えられる。このことは、負電荷をなくす改変により活性が上昇するという事実により支持される。さらに、Ｅ１５３Ｒ改変体が非常に高い活性を示した理由としては、グルタミン酸とは逆の電荷を持つアルギニンが１５３位に導入されたことによると考えられる。また、１５３位に芳香族性アミノ酸を導入した場合（Ｅ１５３Ｙ、Ｅ１５３Ｆ、Ｅ１５３Ｗ、Ｅ１５３Ｈ）にも非常に高い生存維持活性を示した。その理由としては、受容体側との疎水的相互作用又はＣＮＴＦ内の他の残基との活性発現に有利な相互作用の可能性が予想される。
【００８０】
比活性上昇に効果のある変異として同定された部位（Ｅ１５３位及びＱ６３位）について、それぞれ単独の変異よりも両変異を組み合わせることによる相加的な活性の上昇が示された。２つの部位は３次元的にも異なる位置にあり（図２０）、１分子中に２つの変異を行っても、それぞれの部位の改変の効果が現れたものと予想された。
【００８１】
また、１５５位にアミノ酸の置換を施した場合、元々のリジンと長さがほとんど同じメチオニン残基、あるいは長さが短く立体的障害はないと考えられるアラニン残基でも、１５５位のリジン残基の役割を補償することが全くできないということから、１５５位のリジン残基はＣＮＴＦの受容体に厳密に認識されていると考えられた。更に、実施例としては示さないが、Ｋ１５５Ａ改変体精製タンパク質は、天然型ヒトＣＮＴＦ精製タンパク質とほとんど同じ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示すことから、活性を消失したＫ１５５Ａ改変体は天然型ヒトＣＮＴＦとほとんど同じ全体構造を保持していると考えられた。また、このＫ１５５Ａ改変体は天然型ヒトＣＮＴＦの受容体への結合を阻害することから、活性を消失したＫ１５５Ａ改変体はＣＮＴＦの受容体への結合能力は保持していると考えられた。以上のことから、１５５位のリジン残基は細胞内へのシグナル伝達に必須のアミノ酸残基であると予想された。
【００８２】
Ｄ１キャップ領域内の他のアミノ酸残基の役割に関しては、前述の１５３位及び１５５位のアミノ酸のように、明快に考察することはできないが、少なくとも１５６位及び１５７位のアミノ酸残基は、Ｄ１キャップ領域の活性構造形成に重要であると予想された。いずれにしろ、単一の残基で活性を発現できるものではなく、ＣＮＴＦ受容体に厳密に認識される１５５位の周辺残基であるＤ１キャップ領域全体で、１つの活性構造を形成していると考えられ、当領域全体としての重要性が考えられた。
【００８３】
なお、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体とヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に構造のホモロジーがあると仮定し、ｈＧＨの３次構造上に変異導入部位（「Ｄ１キャップ領域」及び「Ｑ６３」としてとして図中に記載）を描き加えたものを図２０に表した。図２０中の各数字はヒトＣＮＴＦアミノ酸残基の番号を表す。
【００８４】
【発明の効果】
本発明で予測される改変タンパク質は、天然型タンパク質と同等あるいはそれ以上の活性を有するため、大量投与による自己抗体の出現等の副作用および、その他の副作用を減じた有用な治療剤としての利用が期待される。また更には、絶対投与量の低下に伴い、これら天然型タンパク質に混在する有害物質の削減、及び製造スケールの縮小が可能になると期待される。
【００８５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）による本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製方法の概略を示す。
【図２】図２は、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体の発現ベクターの作成に用いたベクター（pKK223-4）の構造を示す。
【図３】図３は、αヘリックスに富むサイトカイン類の中の、長鎖構造のグループに属するタンパク質に関して、構造活性相関解析の既知の結果、あるいは活性発現に関与すると予想される部位を簡略に示したものである。（Ａ）はシグナル伝達にｇｐ１３０を利用するタンパク質のグループであり、（Ｂ）はそれ以外のグループである。実験的に活性発現に重要であることが既知の領域に関しては網掛けで、活性発現への関与が予測される領域に関しては破線で囲って表記した。各タンパク質における構造活性相関解析の報告を以下に列挙する（R. Savino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1993年）90巻、4067頁、C. Lutticken et al., FEBS Lett.(1991年）282 巻、265 頁、J. P. J. Brakenhoff et al., J. Immunol.(1990年）145 巻、561 頁、X. Li et al., J. B. C. (1993年）268 巻、22377 頁、B. C. Cunningham et al., Science (1990年)247巻、1461頁、A. M. Devos et al., Science(1992年）255 巻、306 頁、J. P. J. Brakenhoff et al., J. B. C. (1994年）269 巻、86頁、R. C. Robinson et al., Cell(1994年）77巻、1101頁、J. C. Kallestad et al., J. B. C. (1991年)266巻、8940頁、I. Kawashima et al., FEBS Lett.(1991年）283 巻、199 頁、V. Goffin et al., Eur. J. Biochem. (1993年）214 巻、199 頁、B. Lovejoy et al., J. Mol. Biol. (1993年）234 巻、640 頁、D. Wen et al., J. B. C.(1994年）269 巻、22839 頁、B. F. Cheethan et al., Antiviral Res.(1991年）15巻、27頁）。
【図４】図４は、天然型ヒトＣＮＴＦ発現ベクター（pKKCNTF ）の構築図を示す。
【図５】図５は、実施例１において用いたプライマーを示す。なお、下線部分は、導入した制限酵素認識部位を示し、！はミスマッチ位置を表す。・・はＧ、Ａ、Ｔ及びＣの混合を、＊はＧ及びＣの混合を表す。
【図６】図６は、実施例１において用いたＰＣＲによる各ステップの遺伝子増幅反応条件を示す。
【図７】図７は、両部位の置換（１５３位／６３位）を組み合わせた本発明のヒトＣＮＴＦ改変体発現ベクターの調製方法の概略を示す。
【図８】図８は、ヒトＣＮＴＦ改変体におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す写真である。図８（Ａ）〔レーン１: 分子量マーカー、レーン２: 大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３: 天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン４〜１１: Ｅ１５３位改変体のライセート上清（４：１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｋ、６：Ｅ１５３Ａ、７：Ｅ１５３Ｖ、８：Ｅ１５３Ｌ、９：Ｅ１５３Ｇ、１０：Ｅ１５３Ｐ、１１：Ｅ１５３Ｉ）、レーン１２：大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ〕、図８（Ｂ）〔レーン１: 分子量マーカー、レーン２: 大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン３: 天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン４〜１１: Ｅ１５３位改変体のライセート上清（４：１５３Ｙ、５：Ｅ１５３Ｆ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｈ、８：Ｅ１５３Ｍ、９：Ｅ１５３Ｑ、１０：Ｅ１５３Ｎ、１１：Ｅ１５３Ｄ）、レーン１２：大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ〕。
【図９】図９は、本発明のヒトＣＮＴＦ改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す写真である。図９中、レーン１は大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ、レーン２は天然型ヒトＣＮＴＦのライセート上清、レーン３〜９は本実施例により得られた各改変体のライセート上清（３：Ｑ６３Ｒ、４：Ｅ１５３Ｒ、５：Ｅ１５３Ｙ、６：Ｅ１５３Ｗ、７：Ｅ１５３Ｒ／Ｑ６３Ｒ、８：Ｅ１５３Ｙ／Ｑ６３Ｒ、９：Ｅ１５３Ｗ／Ｑ６３Ｒ）の泳動パターンを示す。また、天然型ヒトＣＮＴＦの泳動位置を←（１）、Ｑ６３Ｒ改変体の泳動位置を←（２）で表記する。
【図１０】図１０は、大腸菌発現天然型精製ヒトＣＮＴＦ（○）と大腸菌のライセート上清希釈液中の組換え天然型ヒトＣＮＴＦ（●）のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。
【図１１】図１１は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）を示し、（Ｂ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（▲）、Ｅ１５３Ｙ（△）、Ｅ１５３Ｆ（○）、Ｅ１５３Ｗ（□）を示す。
【図１２】図１２は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｃ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ａ（□）、Ｅ１５３Ｖ（■）、Ｅ１５３Ｌ（△）を示し、（Ｄ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｇ（□）、Ｅ１５３Ｐ（■）を示す。
【図１３】図１３は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｅ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｍ（□）、Ｅ１５３Ｉ（△）を示し、（Ｆ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｋ（□）を示す。
【図１４】図１４は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ｇ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｑ（○）、Ｅ１５３Ｎ（□）、Ｅ１５３Ｄ（■）を示す。
【図１５】図１５は、Ｋ１５５位改変体のニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｋ１５５Ｒ（○）、Ｋ１５５Ａ（△）、Ｋ１５５Ｍ（□）を示す。
【図１６】図１６は、Ｅ１５３位改変体のニワトリＣＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）、Ｅ１５３Ｙ（△）、Ｅ１５３Ｆ（□）を示し、（Ｂ）における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（△）、Ｅ１５３Ｗ（○）を示す。
【図１７】図１７は、Ｅ１５３位改変体のラットＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。なお、図中（Ａ）における各データーは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｒ（○）、Ｅ１５３Ｙ（□）、Ｅ１５３Ｆ（■）を示し、（Ｂ）における各データは、天然型ヒトＣＮＴＦ（●）、Ｅ１５３Ｈ（△）、Ｅ１５３Ｗ（▲）を示す。
【図１８】図１８は、天然型ＣＮＴＦ及び各ＣＮＴＦ改変体を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した場合の活性値を示す。縦軸は、ＣＮＴＦ応答細胞の生存率（％）として、５７０ｎｍにおける吸光度（フォルマザンの生成を示す）で、１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ或いはＣＮＴＦ改変体を添加した場合を１００％として（表記実験の場合、Ａ₅₇₀ ＝０．１９を１００％とする）、その値に対する比率で表した。
【図１９】図１９は、ヒトＣＮＴＦにおけるＤ１キャップ領域の変異による改変体の、ニワトリＤＲＧニューロンに対する生存維持活性を示す。各点（●）が、それぞれの改変体を表し、５０％有効濃度（ＥＣ５０）の比較による、天然型ヒトＣＮＴＦに対する活性百分率（％）で表記した。
【図２０】図２０は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の３次構造上に、本発明におけるヒトＣＮＴＦ改変体の変異導入部位（「Ｄ１キャップ領域」及び「Ｑ６３」）を表記したものを示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a modified protein. More specifically, a modified protein modified by substituting amino acid residues of a protein having a four-helix bundle structure with another amino acid residue, DNA containing a base sequence encoding the protein, and expression containing the DNA The present invention relates to a vector and a transformant transformed with the expression vector.
[0002]
[Prior art]
In recent years, clinical development for using biologically active natural proteins as therapeutic agents for various diseases has been studied. For example, granulocyte macrophage colony stimulating factor (hereinafter abbreviated as GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (hereinafter abbreviated as M-CSF), interleukin 3 (hereinafter abbreviated as IL-3), interleukin. No. 6 (hereinafter abbreviated as IL-6), clinical trials have been carried out on many cytokines, or clinical trials have been examined (hematopoietic factor (1994) Vol. 5, pp. 6-86).
[0003]
However, in general, when a protein preparation is administered chronically, there is a problem that as the dose is increased, side effects due to the appearance of autoantibodies and problems in production costs are more likely to occur. In order to improve such a problem, for example, it is conceivable to use a method of suppressing the dose using a modified protein having a higher specific activity than that of the natural type. Here, in order to obtain a modified protein with high specific activity, basic data such as structure-activity relationship analysis is required.
[0004]
Among cytokines, GM-CSF, M-CSF, growth hormone (hereinafter abbreviated as GH), prolactin (hereinafter abbreviated as PRL), erythropoietin (hereinafter abbreviated as EPO), G-CSF, LIF, And various interleukins such as IL-3 and IL-6 are all rich in α-helices, and have a 4-helix bundle structure as a common structure (individual helices from the N-terminal side) (Referred to as helices A, B, C, D respectively) (JF
Bazan, Neuron (1991), 7, 197).
[0005]
Proteins with four helix bundle structures are classified into a long-chain group consisting of 160-200 amino acid residues and a short-chain group consisting of 105-145 amino acids. (J. -L. Boulay & WE Paul, Curr. Biol. (1993) 3 volumes, 573 pages, S. Sprang & J. Bazan, Curr. Opin. Struct. Biol. (1993) 3 volumes, 815). The former includes GH, PRL, EPO, G-CSF, LIF, IL-6, interleukin 4 (hereinafter abbreviated as IL-4), GM-CSF, and the like.
[0006]
In these cytokines, the importance of the amino acid residue between helix A and helix B (hereinafter referred to as AB loop region) and the expression of biological activity with respect to helix D region has been shown. There is a similar report on IL-6 (R. Sevino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 4067, C. Lutticken et al., FEBS Lett. (1991 282, 265, JPJ Brakenhoff et al., J. Immunol. (1990) 145, 561, X. Li et al., JBC (1993) 268, 22377). With regard to GH, together with a similar report (BC Cunningham et al., Science (1990) Vol. 247, p. 1461) on the generation of mutants, direct identification by X-ray crystallographic analysis of the complex of GH and GH receptor (AM DeVos et al., Science (1992) 255, 306).
[0007]
Bazaan is an α-helix-rich cytokine among amino acid residues between helix C and helix D (hereinafter referred to as CD loop region) and the boundary region between helix D (hereinafter abbreviated as D1 cap region). It was shown that there is a similar amino acid sequence called the D1 motif (JF Bazan, Neuron (1991) vol. 7, p. 197). The sequence of the D1 motif is -φ- (F / W)-(E / Q)-(K / R)-(K / R) -φ-XG- (φ is a hydrophobic residue, X is any This region may be, for example, LIF (154th to 161st), OSM (159th to 166th), IL-6 (157th to 164th), interleukin 11 (hereinafter referred to as IL-). (Abbreviated as 11) (148th to 155th positions). This CD Loop area Regarding the boundary region between helix D and helix D, IL-6 (JPJ Brakenhoff et al., JBC (1994) 269, 86) and LIF (RC Robinson et al., Cell (1994) 77, 1101) In US, the importance to receptor binding has been reported.
[0008]
However, since the amino acid sequence of the D1 cap region of IL-6 has no similarity to the D1 motif, it does not identify an amino acid important for modification on the D1 motif, and the amino acid sequence of the same region of LIF is Although there is a high similarity to the D1 motif, amino acid residues important for modification have not been identified. In addition, in other α-helix-rich cytokines, there is no report that this region is important for activity expression.
[0009]
On the other hand, human CNTF consists of 200 amino acid residues, is rich in α-helices, and is said to consist of 53% α-helix and 9% β-turn structure (A. Negro et al., J. Neurosci. Res., (1991) 29, 251). From the secondary structure analysis, human CNTF is predicted to have a structure similar to α-helix-rich cytokines, and the sequence of the D1 motif corresponds to the 151st to 158th amino acid residues in human CNTF. Thus, human CNTF belongs to a group of long chain structures among proteins having four helix bundle structures, and closer similarity to proteins within the same group is expected.
[0010]
Regarding human CNTF, receptors for transmitting signals into cells include CNTF receptor α (hereinafter abbreviated as CNTF-Rα), LIF receptor (hereinafter abbreviated as LIF-R), and gp130. It is considered to be composed of three types. gp130 is a common receptor for IL-6, LIF, OSM and IL-11 signaling as well as for human CNTF (S. Davis et al., Science (1991) 253, 59 Page, S. Davis et al., Science (1993) 260, 1805, DP Gearing et al., Science (1992) 255, 1434, NY Ip et al., Cell (1992) 69 1121). In the CNTF, IL-6, LIF, OSM, and IL-11, amino acid residues corresponding to the same site in each ligand in that they share the same receptor together with the structural similarity described above. Are likely to be involved in receptor binding.
[0011]
Human CNTF was discovered by S. Varon et al. In 1979 (Brain Res. (1979) Vol. 173, 29-45) as a factor showing the survival maintenance effect of ciliary ganglia which are parasympathetic nerves. ), And subsequent reports on purification and cloning (G. Barbin et al., J. Neurochem (1984) 43, 1468-1478, LF Lin et al., Science (1989) 246, 1023, P. Masiakowski et al., J. Neurochem (1991) 57, 1003, A. Negro et al., Eur. J. Biochem. (1991) 201, 289, JR McDonald et al ., Biochim. Biophys. Acta. (1991), 70, 1090, International Publication Number WO90 / 7341 Publication, International Publication Number
WO91 / 4316).
[0012]
Regarding the pharmacological action of human CNTF, the hippocampus, septal GABAergic nerve (NY IP et al. J. Neursci. (1991) 11, 3124-3134), optic nerve cell (HD Hoffman J. Neurochem. (1988) 51, 109-113), sensory nerve (G. Barbin et al. J. Neurochem. (1984) 43, 1468-1478), parasympathetic nerve (Y. Arakawa et al. J. Neursci. (1990) 10: 3507-3515) and motor nerve (M. Sendtner et al. J. Cell Science. Suppl. (1991) 15: 103-109), survival maintenance effect, cholinergic nerve (S Saadat et al. J. Cell Biol. (1989) 108, 1807-1816, U. Ernsberger et al. Neuron (1989) 2, 1275-1284), type 2A astrocytes (DJ Anderson et al. TINS (1989) Vol. 12, pp. 83) In vivo, in the unilateral hippocampal-septal junction (F-F) resection model, the effect of maintaining the survival of cholinergic nerves in the septum (T Hagg et al. Neuron (1992) Vol. 8, p. 145), motor nerve survival maintenance effect in motor nerve cutting model (M. Sendtner et al. Nature (1990) vol. 345, pages 440-441), motor nerve survival maintenance effect in mice with inherited motor disease (M Sendtner et al. Nature (1992) Vol. 358, pp. 502-503), T. Hogg & S. Varon Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1993) 90, 6315-6319), Protective effect of photoreceptor cells (MM LaVail et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1992) 89, 11249-11253) Protective effects on optic nerve cells (K. Unoki & MM LaVail, Investigative Ophthalmology & Visual Science (1994) 35, 907-915) have been reported.
[0013]
As described above, human CNTF acts on nerve cells and exhibits survival maintenance, process extension promotion, and neurotransmitter synthesis promotion activity. Therefore, neuropathy caused by trauma, Alzheimer's disease, cerebrovascular dementia, muscle atrophic side It is expected to be a useful therapeutic agent for neuronal atrophy / degenerative diseases such as cord sclerosis (JE Springer, DN & P (1991) vol.4, p.394, RM Lindsay, Neurobiol. Of Aging ( 1994) 15, 249-251, RM Lindsay, TINS (1994) 17, 182).
[0014]
Furthermore, more effective protective effect was shown by combined use with brain-derived neurotrophic factor against neuropathy in motor neurodegenerative disease model animals (Wobbler mice) (H. Mitsumoto et al., Science (1994)). 265, 1107-1110), and not only human CNTF alone but also treatment with other neurotrophic factors (R.Nishi, Science (1994) 265, 1052-1053) Expected to be a therapeutic agent.
[0015]
However, in a clinical trial (Bio World Today, Sep. 8 (1993)) of natural human CNTF for amyotrophic lateral sclerosis currently being conducted in the United States, a considerably large amount of human being 6 mg per week CNTF is being administered. As described above, in general, when a protein preparation is administered chronically, the larger the dose, the more likely to cause side effects due to the appearance of autoantibodies and problems in production costs. In fact, in the US phase II and III trials of CNTF, the appearance of antibodies (BIO World Today, Sep 8 (1993)) and other side effects are also a problem (BIO World Today, Jun 24 (1994)). ), Science (1994) 264, 772-774). Therefore, a human CNTF variant having a higher specific activity than the natural type is expected.
[0016]
Thus, the expectation for a modified protein having a higher specific activity than the natural type is not only strong for human CNTF but also for various cytokines as described above. Although various investigations have been made, no actual effective variant has yet been found.
[0017]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a modified protein having a specific activity higher than that of a natural protein with respect to a protein having a four-helix bundle structure. Another object of the present invention is to provide a DNA containing a base sequence encoding the modified protein. Still another object of the present invention is to provide an expression vector containing the DNA, and a prokaryotic cell or a eukaryotic cell transformed with the expression vector.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have intensively studied paying attention to the amino acid residue in the D1 cap region of a protein having a four-helix bundle structure. As a result, at least one amino acid residue corresponding to the D1 cap region has been studied. It was found that the specific activity of the protein is increased by substituting one amino acid residue with another amino acid residue, and the present invention has been completed. For example, in natural human CNTF, it was discovered that the 155th lysine residue, which is the D1 cap region, is essential for activity expression. In addition, substitution of the 153rd amino acid residue is effective for increasing CNTF activity. By replacing the glutamic acid residue, which is the amino acid residue at this position, with another amino acid residue, the specific activity of natural human CNTF can be increased. I found that I could rise.
[0019]
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) An amino acid residue corresponding to at least position 153 of the amino acid sequence of a natural human ciliary neurotrophic factor (hereinafter, ciliary neurotrophic factor is abbreviated as CNTF), Aromatic amino acid residues or arginine residues A modified protein of human CNTF,
(2) An amino acid residue corresponding to at least position 153 of the amino acid sequence of a natural human ciliary neurotrophic factor (hereinafter, ciliary neurotrophic factor is abbreviated as CNTF) is an alanine residue, a valine residue, or a leucine residue. , Methionine residue, glutamine residue, asparagine residue, glycine residue, proline residue, tyrosine residue, phenylalanine residue, tryptophan residue, histidine residue, lysine residue or arginine residue CNTF A modified protein of
( 3 The amino acid residue corresponding to position 63 of natural human CNTF is further substituted with another amino acid residue (1) Or (2) The described modified protein,
( 4 The above (wherein the other amino acid residue is an arginine residue) 3 ) The modified protein of
( 5 ) ( 1 ) ~ ( 4 ) DNA containing a base sequence encoding any one of the modified proteins,
( 6 ) Said ( 5 And an expression vector containing the described DNA, and
( 7 ) An amino acid residue corresponding to at least position 153 of the amino acid sequence of natural human CNTF Alanine residue, valine residue, leucine residue, methionine residue, glutamine residue, asparagine residue, glycine residue, proline residue, tyrosine residue, phenylalanine residue, tryptophan residue, histidine residue, lysine residue Group or arginine residue The manufacturing method of the modified protein of human CNTF including the process of substituting for.
[0020]
In the present invention, “a protein having a four-helix bundle structure” means LIF, OSM, G-CSF, GM-CSF, GH, PRL, EPO, interleukin 2, IL-3, IL-4, and interleukin 5. IL-6, IL-11, bone marrow monocyte growth factor (hereinafter abbreviated as MGF), cytokines rich in α helices such as interferon α (hereinafter abbreviated as IFNα), and proteins such as human CNTF. . Among these, proteins that use gp130 as a receptor for signal transduction into cells are suitable, and examples include human CNTF, LIF, OSM, IL-6, and IL-11.
The individual helix structures are referred to as helix A, helix B, helix C, and helix D, respectively, from the N-terminal side. In the present invention, the “D1 cap region” refers to a boundary region between a CD loop region (which means an amino acid residue between helix C and helix D) and helix D, and the amino acid sequence is -φ- (F / W)-(E / Q)-(K / R)-(K / R) -φ-XG- (φ is a hydrophobic residue, X is any residue). A region having the sequence represented. This sequence consisting of 8 amino acids is commonly found in proteins having a four-helix bundle structure in the present invention, and is called a D1 motif sequence. Table 1 shows the amino acid sequence of the D1 motif in the D1 cap region in the protein having the above four helix bundle structure. IL is an abbreviation for interleukin.
[0021]
[Table 1]

[0022]
Furthermore, in the present invention, “natural amino acid sequence of human CNTF” is described in International Publication No. WO91 / 4316 (SEQ ID NO: 1), and “amino acid sequence of natural LIF” , Described in the literature (RCRobinson et al., Cell, (1994) vol. 77, p. 1101), and the “amino acid sequence of natural OSM” refers to the literature (TMRose and AGBruce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1991) 88, 8641, JCKallestad et al., JBC (1991) 266, 8940), and "the amino acid sequence of natural G-CSF" refers to the literature (B. Lovejoy et al., J. Mol. Biol. (1993) 234, 640). The description of the position of the amino acid in this specification also follows these.
[0023]
In the present invention, the “modified protein” means that at least one amino acid residue (especially the amino acid residue in the D1 motif) corresponding to the D1 cap region in the amino acid sequence of the natural protein is substituted with another amino acid residue. Refers to the processed protein. Here, the modification in the D1 cap region, that is, the number and type of amino acid residues to be substituted, the position in the D1 cap region, and the like are not limited. However, from the viewpoint of increasing the specific activity of the modified protein, a modified product in which the third amino acid residue from the N-terminal side of the D1 motif is substituted with another amino acid residue is preferable. Specifically, position 153 in human CNTF, position 156 in LIF, position 161 in OSM, and position 146 in G-CSF correspond to the third amino acid residue from the N-terminal side of the D1 motif here.
[0024]
In the present invention, “another amino acid residue” means a natural amino acid residue or a non-natural amino acid residue. When the other amino acid residues are natural amino acid residues, neutral or basic amino acid residues are preferred. That is, as a preferable example of the modified protein of the present invention, the third amino acid residue from the N-terminal side of the D1 motif is alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, glutamine, asparagine, glycine, proline, serine, threonine, cysteine. , Tyrosine, phenylalanine, tryptophan and other neutral amino acid residues, and histidine, lysine, arginine and other basic amino acid residues. Of these, those substituted with aromatic amino acid residues such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan and histidine, and residues such as arginine are particularly preferable from the viewpoint of improving specific activity. Also suitable are hydrophobic amino acid residues such as alanine, valine, leucine, methionine, proline and the like.
[0025]
Examples of the case where the other amino acid residue is an unnatural amino acid residue include, for example, an unnatural amino acid introduced at the protein synthesis stage, or a natural amino acid residue chemically modified after protein synthesis. It is done. A generally effective method for introducing various unnatural amino acids in a site-specific manner has been reported (Science, 244, 182 (1989)). Alternatively, the results are shown in which phenylalanine modified with a nitro group is chemically acylated into tRNA and expressed in an in vitro protein synthesis system. As another method, Escherichia coli Isoleucyl-tRNA (JBC, 265, 6931 (1990)) that recognizes the non-natural amino acid furanomycin is introduced into a target position, or Cell- Examples of the free protein synthesis system (J. Biochem., 110, 166 (1991)) include those substituted with unnatural amino acid residues by introducing the target.
[0026]
In addition, a protein that has been chemically modified in an amino acid residue-specific or site-specific manner using a purified protein can also be mentioned (Neochemistry Experiment Course 1, IV, 11 (1991)). For example, for a glutamic acid residue, amidation, substitution with a lysine residue followed by trinitrophenylation, substitution with an arginine residue followed by reaction with phenylglyoxal, substitution with a histidine residue followed by carbethoxylation, Examples include modifications by methods such as substitution with tryptophan residues and subsequent reaction with arylsulfenyl chloride, substitution with tyrosine residues and nitration. These chemical modifications can be performed by conventional methods.
[0027]
In the present invention, unless the activity of the modified protein is significantly impaired, in addition to substitution of the amino acid residue corresponding to the third amino acid residue from the N-terminal side of the D1 motif, Modifications (amino acid substitution, amino acid deletion, amino acid addition, domain substitution, etc.) performed in the protein engineering field can also be performed.
[0028]
For example, in natural human CNTF, in addition to 153, 63, 136, 154, 156, 157, 160, 163, 164, 167, 177, 178, 184, etc. In which the amino acid residue is substituted with another amino acid residue. The substitution of amino acid residues other than position 153 here is substituted with “another amino acid residue” as defined above. In natural human CNTF, it has already been published that CNTF activity is increased by replacing the amino acid residue at position 63 in the amino acid sequence with an arginine residue (Panayotatos et al., JBC, Vol. 268, 19000- 19003 (1993)), it is possible to obtain a variant having a specific activity higher than that of a single substitution at each site by performing substitution that combines mutations effective for increasing CNTF activity on human CNTF. it can. For example, if the amino acid residue at position 63 is also substituted in addition to position 153, both 153 and 63 are replaced with arginine, 153 is tyrosine, 63 is replaced with arginine, and 153 is tryptophan. A preferred example is the one substituted at position 63 with arginine.
[0029]
The modified protein of the present invention can be prepared by a conventional method in the field of genetic engineering. That is, when the amino acid residue corresponding to the 3rd from the N-terminal side of the D1 motif is substituted with another amino acid residue, a synthetic oligonucleotide is used as a part of the DNA-containing vector encoding the natural protein or the variant. In the amino acid sequence of the natural protein, the DNA encoding the third amino acid corresponding to the third from the N-terminal side of the D1 motif is changed to a DNA encoding another amino acid, and this is linked to an appropriate expression vector. Thus, the target variant can be produced in the transformed host introduced into the host. The details will be described below.
[0030]
For production of the modified protein of the present invention, for example, a structural gene encoding the natural protein can be used. When human CNTF is modified, the human CNTF structural gene encoding natural human CNTF has already been obtained, for example, by cloning from rabbit or human genomic DNA (KA Stockli et al., Nature, 342 , 316 (1989)., LF Lin et al., Science, 246, 1023 (1989)., P. Masiakowski et al., J. Neurochem., 57 , 1003 (1991), A. Negro et al., Eur. J. Biochem., 201, 289 (1991)., JR McDonald et al., Biochem. Biophys. Acta., 1090 , 70 (1991)., A. Lam et al., Gene, 102 271 (1991)), and its DNA and amino acid sequences are also known. Therefore, for example, the natural human CNTF gene can be cloned according to a conventional method (J. Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual). In addition, structural genes encoding LIF, OSM, and G-CSF have been obtained in the same manner (JF Moreau et al., Nature (1988) 336, 690, MNKallested et al., Mol. Cell. Biol. (1989). 9: 2847, H. Nomura et al., EMBO J. (1986) 5: 871), and these may be used in the same manner as human CNTF.
[0031]
The method of substituting a specific sequence of a natural protein structural gene cloned in a plasmid with another sequence is already generally available. In the present invention as well, the third sequence from the N-terminal side of the D1 motif is used. Amino acid residues corresponding to can be substituted. In the substitution method, DNA encoding a target substituted amino acid sequence is amplified, and the obtained DNA fragment is replaced with a sequence of a portion to be substituted in the natural protein (hereinafter abbreviated as an equivalent sequence). The replacement method is convenient.
[0032]
Specifically, for example, an oligonucleotide consisting of a substituted base sequence and an oligonucleotide corresponding to the base sequence other than the substitution site or the sequence of the vector portion in the protein sequence required for amplification, and the structure of the natural protein It is convenient to use a plasmid containing the gene as a template, amplify the region sandwiched between the two types, and replace the amplified fragment with the corresponding sequence of the natural protein. As an amplification method of a region sandwiched between two kinds of primers, for example, gene amplification method (PCR) (Gene, 77 61-68 (1989)), and a commercially available DNA automatic amplifying apparatus is effectively used for this operation. If a fragment having a restriction enzyme cleavage site convenient for replacement with the corresponding sequence of the natural protein cannot be obtained in one amplification reaction, the first gene amplification product is used in the second gene amplification reaction. It can also be used as a primer to prepare a fragment having the desired restriction enzyme cleavage site.
[0033]
FIG. 1 shows a case where human CNTF is used as an example. As shown in FIG. 1, a fragment having a restriction enzyme cleavage site which is introduced with the target substituted base sequence by performing gene amplification reaction twice and is convenient for replacement with the equivalent sequence of natural human CNTF. Can be obtained. Furthermore, when introducing substitutions into two different sites, after introducing mutations into the respective sites separately, cloning using appropriate restriction enzyme cleavage sites to construct a gene having both mutations, Alternatively, after introducing one mutation, the mutant gene can be used as a template, and further introduced with one mutation by gene amplification reaction.
[0034]
In order to confirm the DNA sequence in which the target substitution (or insertion) has been performed, the dideoxy method (Science, 214 1205 (1981)), for example, can be performed using a Sequenase DNA sequence kit (Toyobo Co., Ltd.). In addition, genetic manipulations such as DNA cleavage and deletion by restriction enzymes and separation of DNA fragments resulting from them, recovery, or ligation as described in the Examples are all known methods (T. Maniatis et al. al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. (1982)).
[0035]
The DNA containing the base sequence encoding the modified protein thus obtained is ligated to a well-known expression vector such as pKK223-4 (Pharmacia, FIG. 2) and then introduced into a suitable host. Thus, the modified protein which is the target substance of the present invention can be expressed. The host may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. For example, E. coli strains and animal cell strains are already widely used and easily available unless otherwise specified. For example, as an E. coli host, JM109 strain and the like can be mentioned. Examples of the animal cell host include COS-1 and CHO cells.
[0036]
To transform these hosts using expression vectors, the electric pulse method (Shinichiro Takayama, Cell Engineering 6, 771, 1987) or the calcium chloride method (J. Mol. Biol. 53 , 159 (1970)). Using such transformed Escherichia coli strains or animal cell strains, the modified protein is expressed according to, for example, conventional methods (T. Maniatis et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. (1982)). Can be made. Further, the obtained strain can be lysed according to a conventional method and centrifuged (10500 × g) to obtain a soluble fraction. The expressed modified protein can be purified according to a conventional method, if necessary. For example, in the case of a human CNTF variant, J. Neurochem., 57 , 1003 (1991).
[0037]
In the case of a human CNTF variant, specifically, for example, Escherichia coli after expression induction is dissolved by lysozyme treatment after collection and further subjected to ultrasonic treatment. Centrifugation (11000 × g) is performed to obtain an insoluble fraction containing the human CNTF variant, this fraction is solubilized with 6M guanidine hydrochloride solution, and then dialyzed against Tris-HCl buffer containing β mercaptoethanol. Then play it. Next, it is subjected to anion exchange column chromatography (Asahipak-502NP: manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.), and then the human CNTF variant solubilized by a NaCl linear concentration gradient is eluted. Furthermore, purified human CNTF variant can be obtained by placing the eluted soluble protein on a hydrophobic column chromatography (Ether-5PW: manufactured by Toyo Soda Co., Ltd.) and eluting with a linear ammonium sulfate concentration gradient after washing (J. Neurochem., 57 , 1004-1005 (1991), partially modified).
[0038]
Quantification of the expressed modified protein may be performed by a commonly used known method. For example, an enzyme immunoassay (ELISA) using a specific antibody obtained using a natural protein, SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), or the like can be used. In the case of ELISA, a purified product of a natural protein prepared by the same method as described above is used. For example, a conventional method (Methods in Enzymology, 73 , 46-52 (1981)), and an antiserum can be obtained by immunizing an animal [for example, New Zealand White Rabbit (♂, 1 kg), etc.]. For purification of specific antibodies from antiserum, for example, a natural protein is used as a standard sample and bound to a column carrier (for example, activated Sepharose (Pharmacia, CNBr Activated Sepharose, etc.), and column chromatography is performed using this. By performing an ELISA for the quantification of the modified protein using the specific antibody obtained by the method, sufficient quantification can be achieved even when a trace amount of the modified protein is used as a sample in an unpurified state. Can be done.
[0039]
Further, as another method for quantifying the modified protein, SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) can be used. That is, a known method (Nature, 227, 680 (1970)), and the concentration of the gel band derived from the protein was determined using an image processing software (for example, NIH Image 1.47) as in the case of enzyme immunoassay (ELISA). The modified protein can be quantified in the state.
[0040]
The biological activity of the modified protein prepared as described above is measured by a method corresponding to each protein.
For example, the biological activity of human CNTF variant protein can be determined by using a known method (Nerve Growth Factors, 31-56, (1989) by using chicken dorsal root ganglia (DRG), ciliary ganglia (CG), rat DRG, or the like. )). In addition, the biological activity of the LIF variant protein can be measured by a known method (D. Metcalf, Growth Factors (1992) 7 169) using various cells such as embryonic stem cells. The biological activity of the OSM variant protein can be measured using the growth inhibitory activity of melanoma cells and the like (D. Horn et al., Growth Factors (1990) Vol. 2, 157). The biological activity of the G-CSF variant protein is the growth promoting activity of NFS-60 cells, which are hematopoietic tumor cells (M. Tsuchiya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 7633). ) Etc. and can be measured.
[0041]
Since the modified protein such as the human CNTF variant of the present invention has a biological activity equivalent to or higher than that of the natural protein, it is expected to be a useful therapeutic agent compared to the natural protein. Furthermore, there are problems with large-scale administration, which is a problem in the development stage of natural protein as a pharmaceutical product, that is, quantitative difficulty in producing the required amount, side effects due to mixed substances, or the natural protein itself. It is considered that there is a possibility that problems such as side effects due to the appearance of antibodies against can be solved.
[0042]
For example, as a biological activity of a human CNTF variant, the amino acid residue at position 153 is substituted with a residue of alanine, valine, leucine, methionine, glutamine, asparagine, glycine, proline, or lysine, as shown in Examples described later. In this case, position 153 shows survival maintenance activity for chicken DRG neurons 2 to 3 times that of glutamic acid (natural type), and the amino acid residue at position 153 is tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine, arginine. The variant substituted with the above residues exhibits survival maintenance activity about 10 times that of native human CNTF against chicken DRG neurons, chicken CG neurons and rat DRG neurons. In addition, when the amino acid residue at position 153 is substituted with another amino acid residue (for example, arginine, tyrosine, tryptophan residue) and the amino acid residue at position 63 is substituted with an arginine residue or the like, It shows a higher specific activity on DRG neurons than each single replacement.
As described above, since the human CNTF variant of the present invention has a biological activity equivalent to or higher than that of natural human CNTF, peripheral components such as motor neurodegenerative diseases and peripheral neuropathy are similar to natural human CNTF. Neural-related diseases, Alzheimer's disease, cerebrovascular dementia, Parkinson's disease, Hunting's disease, etc. Central nervous system-related diseases, retinitis pigmentosa, glaucoma, diabetic retinopathy, retinal macular degeneration, etc. obtain. Furthermore, there are problems in the development stage of natural human CNTF as a pharmaceutical, problems due to large-scale administration, that is, quantitative difficulty in producing the required amount, side effects due to mixed substances, or human CNTF itself It is considered that there is a possibility that problems such as side effects due to the appearance of antibodies against can be solved.
[0043]
As described above, Bazaar has shown that there is an amino acid similar sequence called D1 motif in D1 cap region among α-helix-rich cytokines that are CNTF-related proteins (JF Bazan, Neuron (1991)). Vol. 7, p. 197), the present inventors for the first time revealed the role of each amino acid within the motif. Table 1 shows the amino acid sequences predicted for the D1 motif of the D1 cap region in each protein. At this time, the group of long chain structure (IA, IB) and the group of short chain structure (II) are classified and described, and for the group of long chain structure, the group (IA; CNTF) that uses gp130 as a receptor This is classified into two groups (IB) belonging to this group and other groups (IB).
Similar to human CNTF, proteins having a sequence similar to the D1 motif are many in proteins having a long chain structure, and in particular, LIF and OSM using gp130 as a receptor or G-CSF has a high similarity.
[0044]
As for cytokines rich in α-helix, many structure-activity relationship analyzes have been made so far. Regarding the results of structure-activity relationship analysis on human CNTF and proteins of a long chain structure group having a higher structural similarity, The results are summarized in FIG. It is classified into a group (A) that uses gp130 as a receptor and a group (B) other than that, and the region that is experimentally known to be important for the expression of activity is shaded. Regions that are predicted to be involved in are shown enclosed in broken lines.
[0045]
Regarding the boundary region between the CD loop containing the D1 cap and helix D, as described above, IL-6 (JPJ Brakenhoff et al., JBC (1994) 269, 86) and LIF (RC Robinson et al., Cell (1994) 77, 1101), the importance to receptor binding has been reported (however, since the amino acid sequence of the D1 cap region of IL-6 has no similarity to the D1 motif, However, although the amino acid sequence in the same region of LIF is highly similar to the D1 motif, the amino acid residues important for modification have not been identified). In addition, reports of other α-helix-rich cytokines that the region is important for activity expression have not been reported except for G-CSF described later. In addition, since the importance of the D1 cap region in human CNTF has been demonstrated this time, it is considered that gp130 is used as a receptor as one common item of proteins that use the D1 cap region for receptor binding. In addition to CNTF, LIF, OSM, IL-6, and IL-11 are known as proteins of the same group. In these proteins, amino acid residues corresponding to the D1 cap region are receptors for active expression. It is likely that they are involved in binding.
[0046]
In particular, since LIF and OSM are highly similar to the D1 motif, it is expected that the same effect as that caused by mutation in the D1 cap region in human CNTF will occur by modification of the corresponding site in each protein. . Specifically, it is expected that the activity is drastically reduced by mutation of the lysine residue at position 158 of LIF and OSM at position 163, which corresponds to the lysine residue at position 155 of human CNTF, and the position of human CNTF at position 153 The increase in activity similar to that of human CNTF is expected due to the mutation of the glutamine residue at position 156 of LIF and the position 161 of OSM corresponding to the glutamic acid residue of. Further, not only both residues but also other amino acid mutations in the D1 motif are expected to change the activity.
[0047]
Among proteins that do not use gp130 or that have not been reported to use, G-CSF has a remarkable similarity to the sequence of the D1 motif. In G-CSF, there is a report that a monoclonal antibody that recognizes the periphery of the same region neutralizes the activity of G-CSF (JE Layton et al., JBC (1991) 266, 23815), and D1 cap. Participation of the region in receptor binding is expected. That is, a mutation in the glutamine residue at position 146 of G-CSF corresponding to the glutamic acid residue at position 153 of human CNTF is expected to increase the activity similar to that of human CNTF. Changes in activity are expected to occur due to amino acid mutations. Furthermore, the same is expected for MGF, which is reported to be similar to G-CSF, and a change (or increase) in activity is expected due to mutation in the D1 cap region of MGF. In addition to proteins that use gp130 as a receptor, receptor binding at a common sequence called the D1 motif may be commonly observed.
[0048]
【Example】
Examples are shown below, but the present invention is not limited thereto. In addition, the name of the abbreviation used in a present Example is shown below.
PCR: Gene amplification method
BAP: bacterial alkaline phosphatase
IPTG: isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
PMSF: phenylmethanesulfonyl fluoride
PBS: phosphate buffered saline
BSA: bovine serum albumin
ALP: alkaline phosphatase
SA: streptoavidine
PNPP: p-nitrophenyl phosphate
DRG: dorsal root ganglion
DMEM: dulbecco's modified eagle medium
FCS: fetal calf serum
MTT: 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyltetrazolium bromide
CG: ciliary ganglion
[0049]
Example 1
Mutation introduction into natural human CNTF gene and preparation of human CNTF variant expression vector
1) Experimental materials
E. coli strain JM109 (lacI ^q : Takara Shuzo Co., Ltd.) was used as a host fungus for cloning and for expression of natural human CNTF and human CNTF variants. As a natural human CNTF expression vector (pKKCNTF), pKK223-4 (manufactured by Pharmacia, FIG. 2), an Escherichia coli expression vector having a tac promoter, a linker DNA on the 5 ′ side of the CNTF gene and the natural human CNTF gene. What was produced by inserting was used (FIG. 4).
[0050]
2) Mutation transgene amplification reaction
The introduction of random amino acid site-specific mutations utilized gene amplification (PCR). Several synthetic DNA primers were used and prepared by a two-step PCR reaction (FIG. 1). In PCR, a natural human CNTF expression vector (pKKCNTF) was used as a template, and pfu polymerase (Stratagene) having high fidelity was used as the polymerase. The sequence of the primers used is shown in FIG. As a primer for the mutation site, a human CNTF variant obtained by substituting each amino acid residue at positions 152 to 157 in the amino acid sequence of natural human CNTF with another amino acid residue (hereinafter, human CNTF substituted with, for example, position 153) In some cases, the modification is simply abbreviated as “E153 position modification.”) In the corresponding site, the first and second codons are G, A, T and C, and The third codon was prepared as a mixture of G and C at the stage of synthesis. These 32 mixed primers cover all 20 amino acids for the target site.
[0051]
When the glutamine residue at position 63 was substituted with an arginine residue, pQ63R shown in FIG. 5 was used as a single primer for the target mutation. The method, conditions, etc. for preparing the modified body are the same as above except that pQ63R is used instead of pE153 as a primer for the mutation site. Further, a CNTF variant in which the glutamine residue at position 63 is substituted with an arginine residue may be abbreviated as “Q63R variant”. The PCR reaction conditions for each step are shown in FIG.
[0052]
Specifically, first, a first PCR reaction was performed using two types of primers, a primer 1 on the 5 ′ or 3 ′ side of the structural gene and a primer 2 (pE153 or pQ63R) at the mutation site. As the primer 1, the primer closer to the mutation site (#N described in FIG. 5) was used. After amplification, the target gene was excised and purified by electrophoresis on an agarose gel. Next, using this product and #C (RV) described in FIG. 5 as a primer, a second PCR reaction was performed so as to amplify the entire human CNTF structural gene. At this stage, the product produced by the first PCR is used as a primer, but the amount used is approximately 1-2 pmol and can be amplified only in a somewhat narrow range, and the amount of product produced by the first PCR is too small. However, it was not amplified even if it was too much. The annealing temperature is suitably around 60 ° C., and the template used was prepared by digesting pKKCNTF with PvuII as linear DNA.
[0053]
3) Preparation of human CNTF variant expression vector
A natural human CNTF expression vector (pKKCNTF) was cleaved with BamHI and PstI, and the natural human CNTF structural gene portion, which was a passenger portion, was removed and used as a vector. On the other hand, the BamHI and PstI cleavage sites are also present in the structural gene in the passenger (human CNTF variant structural gene) inserted into this vector. For this reason, BamHI and PstI sites cannot be used, so the cleavage sites of Bgl II (5 'side) and EcoT22I (3' side) that generate cohesive parts are designed in the gene amplification primer. (FIG. 5), after digestion with these restriction enzymes, it was inserted into the BamHI and PstI sites of the vector. Specifically, pKKCNTF was first digested with BamHI and PstI, excised and purified after electrophoresis, and further subjected to BAP treatment. On the other hand, the passenger prepared by gene amplification was cleaved with Bgl II and EcoT22I, and ligation was performed using this passenger (about 100 ng: about 10 times the number of moles of the vector) and the above prepared vector (100 ng). The JM109 strain was transformed by the method. The nucleotide sequence of the obtained clone was determined and the mutation was identified. Sequenase DNA sequence kit (Toyobo Co., Ltd.) was used for the base sequence determination. Thus, the E153 position variant expression vector and the Q63R variant expression vector were obtained.
[0054]
4) Preparation of mutant gene and expression vector combining substitution at both sites (positions 153/63)
Similar to pKKCNTF, there are two sites cleaved by the restriction enzyme Hind III on the Q63R variant expression vector (FIG. 7). By replacing the passenger part shown in FIG. 7 with a corresponding part of the E153 variant gene, a mutant CNTF expression vector combining both substitutions (positions 153/63) was prepared. Specifically, first, the Q63R variant expression vector obtained above was digested with HindIII and ligated as it was to prepare a gene lacking the passenger gene of FIG. This gene was further digested with Hind III, and the digested DNA was purified and treated with BAP to obtain a vector portion. In addition, after digesting each expression vector of E153 modified with Hind III, the passenger part (about 400 bp) was separated and purified, ligated using the above prepared vector part, and transformed into the JM109 strain in the same manner as described below. did. The insertion of the passenger part and the insertion direction were confirmed for the obtained clone, and the mutation was reconfirmed by determining the base sequence of the clone having the target insertion.
[0055]
As a result, expression vectors expressing 51 types of human CNTF variants shown in Table 2 were obtained.
[0056]
[Table 2]

[0057]
5) Preparation of E. coli transformed with expression vector
A commercially available competent cell (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) of JM109 strain was mixed with DNA (about 100 ng) of the vector expressing human CNTF or a human CNTF variant prepared as described above, and left on ice for 30 minutes. Next, after heat treatment at 42 ° C. for 30 seconds, SOC medium (tryptone 20 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 0.585 g, potassium chloride 0.186 g, magnesium chloride 10 mM, magnesium sulfate 10 mM, glucose 20 mM per liter) 900 μL In addition, the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for about 1 hour. The LB agar medium containing ampicillin at a concentration of 50 μg / mL (tryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 5 g, agar 15 g [pH 7] per liter) was selected and transformed E. coli.
[0058]
Example 2
1) Expression of human CNTF variant by E. coli
E. coli was transformed using the human CNTF variant expression vector of the present invention obtained in Example 1, and then the human CNTF variant was expressed using the transformed E. coli. For expression, TYGPN medium (tryptone 20 g, yeast extract 10 g, glycerin 8 mL, monosodium phosphate 5 g, potassium nitrate 1 g [pH 6.1] per liter) was cultured in a small amount.
[0059]
That is, 100 μL of seed culture of the transformant of E. coli strain JM109 was added to 900 μL of TYGPN medium containing 50 μg / mL ampicillin, and the mixture was cultured with shaking at 37 ° C. After 2 hours, IPTG was added to a final concentration of 1 mM and cultured for 3 hours. After centrifugation, the following lysis operation was performed. 100 μL of lysis solution (50 mM Tris · HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, lysozyme 0.27 mg / mL, 0.13 mM PMSF, 60 U DNase I) was added to the culture pellet and digested at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, it was centrifuged (15000 rpm × 15 minutes). The supernatant of the lysate was used as a sample for concentration assay by SDS-PAGE and measurement of DRG neuron survival activity. The DRG neuron survival maintenance activity measurement sample was prepared by diluting 50 μL of the lysate supernatant into 950 μL of PBS (containing 0.1% BSA) and sterilizing by filtration.
[0060]
2) Confirmation and quantification of human CNTF variant expression by SDS-PAGE
SDS-PAGE was performed under the following conditions.
A commercially available gradient gel (manufactured by Daiichi Chemicals Co., Ltd.) having a concentration of 15% to 25% polyacrylamide was used. 4 μL of the supernatant of the lysate was placed in each well and electrophoresed at a constant current (40 mA) for 1 hour.
[0061]
FIGS. 8A and 8B show examples of electrophoretic patterns obtained by SDS-PAGE in the modified E153 position. In FIG. 8A, lane 1 is a molecular weight marker, lanes 2 and 12 are E. coli-expressed natural purified human CNTF, lane 3 is the lysate supernatant of natural human CNTF, and lanes 4 to 11 are obtained by this example. The migration pattern of the lysate supernatant (4: E153R, 5: E153K, 6: E153A, 7: E153V, 8: E153L, 9: E153G, 10: E153P, 11: E153I) of the modified E153 position obtained is shown. Similarly, in FIG. 8B, lane 1 is a molecular weight marker, lanes 2 and 12 are E. coli-expressed natural purified human CNTF, lane 3 is the lysate supernatant of natural human CNTF, and lanes 4 to 11 are the present examples. The electrophoresis pattern of the lysate supernatant (4: E153Y, 5: E153F, 6: E153W, 7: E153H, 8: E153M, 9: E153Q, 10: E153N, 11: E153D) of the E153 position variant obtained by the above Show. In addition, the position of human CNTF is indicated by ←.
[0062]
FIG. 9 shows the electrophoretic patterns of the E153-position variant, the Q63R variant and the variant obtained by combining the mutations at both sites of the present invention (E153 / Q63R) obtained by SDS-PAGE. In FIG. 9, lane 1 is E. coli-expressed natural purified human CNTF, lane 2 is the lysate supernatant of natural human CNTF, and lanes 3 to 9 are the lysate supernatants (3 of each variant obtained in this example). : Q63R, 4: E153R, 5: E153Y, 6: E153W, 7: E153R / Q63R, 8: E153Y / Q63R, 9: E153W / Q63R). In addition, the migration position of natural human CNTF is indicated by ← (1), and the migration position of the Q63R variant is indicated by ← (2).
[0063]
From this result, an electrophoretic image was captured using a scanner, and the concentration of the gel band derived from CNTF was quantified using image processing software (NIH Image 1.47). As an example, the results of quantification of natural human CNTF and human CNTF variant (E153R) were 6.4 μg / mL and 7.0 μg / mL, respectively.
[0064]
3) Quantification of human CNTF variant by ELISA
Using the purified anti-natural human CNTF antibody, the concentration of the human CNTF variant in the activity measurement sample was quantified by sandwich ELISA. That is, 50 μL of a measurement sample was placed in a 96-well plate on which an anti-natural human CNTF antibody had been immobilized in advance, and left at 4 ° C. overnight. Each well was washed with PBS (200 μL, 3 times), and biotinylated anti-natural human CNTF antibody (3% BSA / PBS / NaN) _Three 50 μL) was diluted 1000 times. After washing 3 times with 200 μL PBS, alkaline phosphatase conjugated streptavidin (3% BSA / PBS / NaN _Three (VEC) (50 μL) was added and left at room temperature for 2 hours. After washing again with 200 μL of PBS three times, it was dissolved in a 0.1 M sodium carbonate, 1 mM magnesium chloride (pH 9.8) solution containing PNPP at a concentration of 0.5 mg / mL at room temperature, and the absorbance at 415 nm was measured. The purified anti-natural human CNTF antibody was prepared by affinity chromatography using natural human CNTF as a ligand.
[0065]
The results of quantification of natural human CNTF and human CNTF variant (E153R) were 7.6 μg / mL and 7.9 μg / mL, respectively, which were almost the same as those estimated from the results of SDS-PAGE. As for other modified products, almost the same results were obtained with the quantitative values obtained from SDS-PAGE and the quantitative values obtained from the ELISA method. In FIGS. 10-17, it represents with the quantitative value calculated | required from SDS-PAGE.
[0066]
Example 3
Activity measurement of human CNTF variant
The activity of each CNTF variant obtained in Example 2 was measured using the survival maintenance activity of chicken dorsal root ganglion (DRG) neurons as an index. Specifically, DRG neurons were removed from 10-day chick embryos (E10), treated with trypsin (0.125%) and DNaseI, and then pre-cultured (37 ° C., 30 minutes) in DMEM medium containing 5% FCS. It was. Next, using a 96-well plate coated with polyornithine (0.5 mg / mL), dispersion culture (100 μL each well, 37 ° C., 72 hours) was performed in a DMEM medium containing 5% FCS. With respect to viable cells after culture, the amount of formazan produced was examined by absorbance at 570 nm using the reducing ability when 10 μg of MTT was added as an index. Each CNTF variant was added at a final concentration of 0.001 ng / mL to 100 ng / mL after pre-culture.
[0067]
Further, as a control, natural human CNTF was used to measure the survival maintenance activity against DRG neurons. In addition, the natural type human CNTF used for activity measurement and each CNTF variant sample were prepared simultaneously by the same method.
[0068]
Further, an E153R variant in which the glutamic acid residue at position 153 is substituted with an arginine residue, an E153Y variant in which a tyrosine residue is substituted, an E153H variant in which a histidine residue is substituted, an E153F variant in which a phenylalanine residue is substituted, tryptophan Regarding the E153W variant substituted with a residue, the survival maintenance activity on chicken ciliary ganglion (CG) neurons was also examined as follows. Specifically, CG neurons were removed from 8-day-old chick embryos (E8), treated with trypsin (0.125%) and DNaseI, and then precultured in DMEM medium containing 5% FCS (37 ° C., 60 minutes). It was. Next, using a 96-well plate double-coated with polyornithine (0.5 mg / mL) and laminin (5 μg / mL), dispersed culture (100 μL in each well, 37 ° C., 24 hours, in DMEM medium containing 5% FCS) ) About the viable cell after culture | cultivation, the light absorbency was measured using MTT like the case of DRG, and it was set as the parameter | index of survival maintenance activity.
[0069]
Furthermore, the E153R variant, E153Y variant, E153H variant, E153F variant, and E153W variant were also examined for survival maintenance activity on rat DRG neurons as follows. Specifically, DRG neurons were removed from 21-day-old rat embryos (E21), treated with trypsin (0.125%) and DNaseI, and then pre-cultured (37 ° C., 30 minutes) in DMEM medium containing 5% FCS. It was. Next, using a 96-well plate double-coated with polyornithine (0.5 mg / mL) and laminin (5 μg / mL), dispersed culture (100 μL per well, 37 ° C., 72 hours, in DMEM medium containing 5% FCS) ) As for the viable cells after culture, the absorbance was measured using MTT in the same manner as in the case of chicken DRG, and used as an indicator of the survival maintenance activity.
[0070]
In addition, as a part of the measurement results of the survival maintenance activity in this example, the recombinant natural human CNTF and purified natural human CNTF in the lysate supernatant dilution prepared by the same method as described above against chicken DRG neurons Survival maintenance activity (FIG. 10), survival maintenance activity of chicken ERG position variant against chicken DRG neurons (FIGS. 11-14), and variant mutant (K155 position variant) introduced with a mutation at the 155th lysine residue The survival maintenance activity with respect to a DRG neuron (FIG. 15) is shown. Furthermore, E153R variant, E153Y variant, E153H variant, E153F variant, E153W variant survival maintenance activity against chicken CG neurons (FIG. 16) and E153R variant, E153Y variant, E153H variant, E153F variant, The survival maintenance activity (FIG. 17) of the E153W variant on rat DRG neurons is also shown in the corresponding figure. 10 to 17, the vertical axis represents absorbance at 570 nm (indicating the production of formazan), and the horizontal axis represents the concentration of added CNTF.
[0071]
In addition, the survival maintenance activity of the modified chicken DRG neurons was also measured by recombinant natural human CNTF, a single substitution at positions E153 and Q63, and a combination of mutations at both sites. The results are shown in FIG. FIG. 18 shows the activity values when natural CNTF and each CNTF variant were added at a final concentration of 1 ng / mL, and the vertical axis represents the absorbance at 570 nm as the survival rate (%) of CNTF-responsive cells, 100 ng. / ML of CNTF or a modified CNTF is defined as 100% (in the case of the notation experiment, A ₅₇₀ = 0.19 is assumed to be 100%), and is expressed in% (indicating the production of formazan). As a blank test, PBS was added with PBS solution (containing 0.1% BSA) instead of CNTF, and Wild was added with natural human CNTF.
[0072]
1) Activity of recombinant natural human CNTF in diluted lysate supernatant
FIG. 10 is a comparison of the survival maintenance activity of the recombinant natural human CNTF and the purified natural human CNTF in the lysate supernatant diluted solution against chicken DRG neurons, both of which showed almost the same activity. The recombinant natural human CNTF in the lysate supernatant was quantitatively confirmed to be active.
[0073]
2) Activity of E153 position variant on chicken DRG neurons
11 to 14, when the amino acid residue at position 153 is substituted with a residue of methionine, leucine, valine, alanine, glutamine, asparagine, glycine, proline, or lysine (E153M, E153L, E153V, E153A, E153Q, E153N, E153G, E153P, E153K), the 153 position shows 2-3 times the survival maintenance activity of that of the glutamic acid (natural type), and the amino acid residue at the 153 position is arginine, histidine, tyrosine, phenylalanine, tryptophan residue When substituted with a group (E153R, E153H, E153Y, E153F, E153W), it showed about 10-fold survival maintenance activity. In addition, when the amino acid residue at position 153 was substituted with aspartic acid or isoleucine (E153D, E153I), the survival maintaining activity was comparable to that of the natural type.
[0074]
It was confirmed that the E153 position variant and the Q63R variant (each single mutation) shown in FIG. 18 showed higher survival maintaining activity than natural CNTF, and each single variant had the same specific activity. It was. Furthermore, the variant obtained by combining both mutations showed higher specific activity than that of natural variant CN, and moreover than each variant alone (FIG. 18).
[0075]
3) Activity of the K155 position variant on chicken DRG neurons
FIG. 15 shows the survival maintenance activity of the K155R variant, K155A variant, and K155M variant on chicken DRG neurons, but the mutation to a positively charged arginine residue similar to the original lysine residue. Only when the activity of natural CNTF is less than 1%, all of the mutations to other amino acid residues have lost their activity.
[0076]
4) Activity against chicken DRG neurons of a variant in which a mutation is introduced into the D1 cap region
Moreover, the survival maintenance activity with respect to a chicken DRG neuron of the variant which introduce | transduced the variation | mutation into the D1 cap area | region of human CNTF in a present Example was put together in FIG. Even in the variants other than the above-mentioned positions 153 and 155, the variation in activity due to mutation was large.
[0077]
5) Activity of E153 position variant on chicken CG neurons
In FIG. 16, when the amino acid residue at position 153 is substituted with an arginine, histidine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan residue (E153R, E153H, E153Y, E153F, E153W), the amino acid residue at position 153 is glutamic acid (natural type). On the other hand, the survival maintenance activity was nearly 10 times.
Since the variant showing high specific activity against DRG neurons showed higher survival maintenance activity against CG neurons than the natural type, the variant also maintained higher survival maintenance than other types against other neurons. It is considered to show activity.
[0078]
6) Activity of E153 position variant on rat DRG neurons
In FIG. 17, when the amino acid residue at position 153 is substituted with an arginine, histidine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan residue (E153R, E153H, E153Y, E153F, E153W), the amino acid residue at position 153 is glutamic acid (natural type). On the other hand, the survival maintenance activity was nearly 10 times.
From this result, it is considered that a variant having high specific activity against avian chicken neurons also exhibits higher survival maintenance activity against mammalian rat neurons than the natural type. Furthermore, from this result, it is expected that human neurons also exhibit higher survival maintenance activity than the natural type.
[0079]
The following was considered from these results.
When the position at position 153 is glutamic acid (natural type) or aspartic acid, the activity is low. Therefore, the presence of a negative charge at position 153 is considered to be disadvantageous for the expression of human CNTF activity. This is supported by the fact that the activity is increased by a modification that eliminates the negative charge. Furthermore, it is considered that the reason why the E153R variant showed very high activity was that arginine having a charge opposite to that of glutamic acid was introduced at position 153. In addition, when an aromatic amino acid was introduced at position 153 (E153Y, E153F, E153W, E153H), very high survival maintenance activity was shown. The reason for this is expected to be a hydrophobic interaction with the receptor side or an interaction advantageous for expression of activity with other residues in CNTF.
[0080]
For the sites identified as mutations effective in increasing the specific activity (positions E153 and Q63), an increase in additive activity was shown by combining both mutations rather than single mutations. The two sites were in three-dimensionally different positions (FIG. 20), and it was expected that the effect of modification of each site appeared even when two mutations were made in one molecule.
[0081]
In addition, when amino acid substitution is performed at position 155, a methionine residue almost the same length as the original lysine, or an alanine residue that is considered to be short in length and has no steric hindrance, is also located at position 155 Therefore, it was considered that the lysine residue at position 155 was strictly recognized by the CNTF receptor. Furthermore, although not shown as an example, the K155A variant purified protein shows almost the same circular dichroism (CD) spectrum as the native human CNTF purified protein, and therefore the K155A variant that has lost its activity is a natural type. It was thought to retain almost the same overall structure as human CNTF. Further, since this K155A variant inhibits the binding of natural human CNTF to the receptor, it was considered that the K155A variant that lost its activity retains the binding ability of CNTF to the receptor. From the above, the lysine residue at position 155 was predicted to be an amino acid residue essential for signal transduction into the cell.
[0082]
The role of the other amino acid residues in the D1 cap region cannot be considered as clearly as the aforementioned amino acids at positions 153 and 155, but the amino acid residues at least at positions 156 and 157 are D1 It was expected to be important for the formation of the active structure of the cap region. In any case, the activity cannot be expressed with a single residue, and the entire D1 cap region, which is a peripheral residue at position 155 that is strictly recognized by the CNTF receptor, forms one active structure. The importance of this area as a whole was considered.
[0083]
Assuming that the human CNTF variant of the present invention and human growth hormone (hGH) have structural homology, the mutation introduction sites (“D1 cap region” and “Q63” in the figure) are shown on the tertiary structure of hGH. 20) is shown in FIG. Each number in FIG. 20 represents a human CNTF amino acid residue number.
[0084]
【The invention's effect】
Since the modified protein predicted in the present invention has an activity equal to or higher than that of the natural protein, it can be used as a useful therapeutic agent with reduced side effects such as the appearance of autoantibodies due to large doses and other side effects. Be expected. Furthermore, it is expected that a reduction in the absolute dose will enable the reduction of harmful substances mixed in these natural proteins and the reduction of the production scale.
[0085]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 shows an outline of a method for preparing a human CNTF variant expression vector of the present invention by gene amplification (PCR).
FIG. 2 shows the structure of a vector (pKK223-4) used for preparing an expression vector for a human CNTF variant of the present invention.
FIG. 3 is a simplified diagram of known results of structure-activity relationship analysis or sites expected to be involved in activity expression for proteins belonging to the group of long-chain structures among cytokines rich in α-helices. It is shown. (A) is a group of proteins that use gp130 for signal transduction, and (B) is the other group. Regions experimentally known to be important for activity expression are shaded, and regions predicted to be involved in activity expression are surrounded by a broken line. Reports of structure-activity relationship analysis for each protein are listed below (R. Savino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 4067, C. Lutticken et al., FEBS Lett (1991) 282, 265, JPJ Brakenhoff et al., J. Immunol. (1990) 145, 561, X. Li et al., JBC (1993) 268, 22377, BC Cunningham et al., Science (1990) 247, 1461, AM Devos et al., Science (1992) 255, 306, JPJ Brakenhoff et al., JBC (1994) 269, 86, RC Robinson et al., Cell (1994) 77, 1101, JC Kallestad et al., JBC (1991) 266, 8940, I. Kawashima et al., FEBS Lett. (1991) 283 199, V. Goffin et al., Eur. J. Biochem. (1993) 214, 199, B. Lovejoy et al., J. Mol. Biol. (1993) 234, 640, D. Wen et al., JBC (1994) 269, 22839, BF Cheethan et al., Antiviral Res. (1991) 15, pp. 27).
FIG. 4 shows a construction diagram of a natural human CNTF expression vector (pKKCNTF).
FIG. 5 shows primers used in Example 1. The underlined part shows the introduced restriction enzyme recognition site! Represents a mismatch position. .. represents a mixture of G, A, T and C, and * represents a mixture of G and C.
6 shows gene amplification reaction conditions for each step by PCR used in Example 1. FIG.
FIG. 7 shows an outline of a method for preparing a human CNTF variant expression vector of the present invention in which substitutions at both sites (positions 153/63) are combined.
FIG. 8 is a photograph showing the results of electrophoresis by SDS-PAGE of a human CNTF variant. FIG. 8 (A) [lane 1: molecular weight marker, lane 2: natural purified human CNTF expressed in E. coli, lane 3: lysate supernatant of natural human CNTF, lanes 4-11: lysate supernatant of E153 position variant (4) : 153R, 5: E153K, 6: E153A, 7: E153V, 8: E153L, 9: E153G, 10: E153P, 11: E153I), lane 12: E. coli expression natural purified human CNTF], FIG. 8B [ Lane 1: Molecular weight marker, Lane 2: E. coli-expressed natural purified human CNTF, Lane 3: Natural human CNTF lysate supernatant, Lanes 4-11: E153 position modified lysate supernatant (4: 153Y, 5: E153F) 6: E153W, 7: E153H, 8: E153M, 9: E153Q, 10: E153N, 11: E153D), 12: E. coli-expressed natural purified human CNTF].
FIG. 9 is a photograph showing the results of electrophoresis by SDS-PAGE of the human CNTF variant of the present invention. In FIG. 9, lane 1 is E. coli-expressed natural purified human CNTF, lane 2 is a lysate supernatant of natural human CNTF, lanes 3 to 9 are lysate supernatants (3: Q63R) of each variant obtained in this example. 4: E153R, 5: E153Y, 6: E153W, 7: E153R / Q63R, 8: E153Y / Q63R, 9: E153W / Q63R). In addition, the migration position of natural human CNTF is represented by ← (1), and the migration position of the Q63R variant is represented by ← (2).
FIG. 10 shows the survival maintenance activity of chicken natural DRG neurons of E. coli-expressed natural purified human CNTF (◯) and recombinant natural human CNTF (•) in a diluted lysate supernatant of E. coli.
FIG. 11 shows survival maintenance activity of chicken ERG neuron of E153 position variant. In the figure, each data in (A) shows natural human CNTF (●) and E153R (◯), and each data in (B) shows natural human CNTF (●), E153H (▲), and E153Y ( (Triangle | delta), E153F ((circle)), and E153W (square) are shown.
FIG. 12 shows the survival maintenance activity of chicken ERG neuron of the E153 position variant. Each data in (C) in the figure represents natural human CNTF (●), E153A (□), E153V (■), and E153L (Δ), and each data in (D) represents natural human CNTF ( ●), E153G (□), E153P (■).
FIG. 13 shows the survival maintenance activity of chicken ERG neurons of the E153 position variant. Each data in (E) in the figure represents natural human CNTF (●), E153M (□), and E153I (Δ), and each data in (F) represents natural human CNTF (●), E153K ( □).
FIG. 14 shows the survival maintenance activity of the E153 variant on chicken DRG neurons. Each data in (G) in the figure indicates natural human CNTF (●), E153Q (◯), E153N (□), and E153D (■).
FIG. 15 shows the survival maintenance activity of the K155 position variant to chicken DRG neurons. Each data in the figure represents natural human CNTF (●), K155R (◯), K155A (Δ), and K155M (□).
FIG. 16 shows the survival maintenance activity of the E153 position variant on chicken CG neurons. Each data in (A) in the figure represents natural human CNTF (●), E153R (◯), E153Y (Δ), and E153F (□), and each data in (B) represents natural human CNTF ( ●), E153H (Δ), E153W (◯).
FIG. 17 shows the survival maintenance activity of the E153 position variant on rat DRG neurons. Each data in (A) in the figure represents natural human CNTF (●), E153R (◯), E153Y (□), and E153F (■), and each data in (B) represents natural human CNTF ( ●), E153H (Δ), E153W (▲).
FIG. 18 shows activity values when natural CNTF and each CNTF variant are added at a final concentration of 1 ng / mL. The vertical axis indicates the survival rate (%) of CNTF-responsive cells as absorbance at 570 nm (indicating the production of formazan), and 100% / mL of CNTF or CNTF variant added as 100% (in the case of the notation experiment, A ₅₇₀ = 0.19 is assumed to be 100%), and the ratio to the value is expressed.
FIG. 19 shows the survival maintenance activity of chicken DRG neurons of a variant by mutation of the D1 cap region in human CNTF. Each point (●) represents the respective variant, and expressed as a percentage of activity (%) relative to natural human CNTF by comparison of 50% effective concentration (EC50).
FIG. 20 shows a representation of mutation sites (“D1 cap region” and “Q63”) of human CNTF variants in the present invention on the tertiary structure of human growth hormone (hGH).

Claims (7)

An amino acid residue corresponding to at least position 153 of the amino acid sequence of natural human ciliary neurotrophic factor (hereinafter, ciliary neurotrophic factor is abbreviated as CNTF) is an aromatic amino acid residue or an arginine residue . A human CNTF modified protein obtained by substitution. The amino acid residue corresponding to at least position 153 of the amino acid sequence of natural human ciliary neurotrophic factor (hereinafter, abbreviated as CNTF) is an alanine residue, valine residue, or leucine residue. , Methionine residue, glutamine residue, asparagine residue, glycine residue, proline residue, tyrosine residue, phenylalanine residue, tryptophan residue, histidine residue, lysine residue or arginine residue CNTF modified protein. The modified protein according to claim 1 or 2, wherein the amino acid residue corresponding to position 63 of natural human CNTF is further substituted with another amino acid residue. The modified protein according to claim 3 , wherein the other amino acid residue is an arginine residue. DNA containing a base sequence encoding the modified protein according to any one of claims 1 to 4 . An expression vector containing the DNA according to claim 5 . An amino acid residue corresponding to at least position 153 of the amino acid sequence of natural human CNTF is an alanine residue, valine residue, leucine residue, methionine residue, glutamine residue, asparagine residue, glycine residue, proline residue, A method for producing a modified protein of human CNTF, comprising a step of substituting a tyrosine residue, a phenylalanine residue, a tryptophan residue, a histidine residue, a lysine residue or an arginine residue .

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