JP2005500052A5 - - Google Patents
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Description
(実施例V)
(他のタンパク質へのHBDの付加はその活性を増加させる)
図8Aで図解的に示した、erbB4(EGFのチロシンキナーゼレセプター)の細胞外ドメインと融合したN−HBDの融合タンパク質を、標準的な組換えDNA方法によって産生した。この産物は「HBDB4HA」と呼ばれ、そして市販で入手可能なエピトープタグ(血球凝集素、「HA」)を含む。この構築物を、erbB4のTyrのNRG誘導リン酸化を阻害するその能力に関して試験した。コントロールアンタゴニストは、erbB4の細胞外ドメインおよびHAタグの融合物であった。タグは、精製中の転換の簡便さのために含まれた。
(他のタンパク質へのHBDの付加はその活性を増加させる)
図8Aで図解的に示した、erbB4(EGFのチロシンキナーゼレセプター)の細胞外ドメインと融合したN−HBDの融合タンパク質を、標準的な組換えDNA方法によって産生した。この産物は「HBDB4HA」と呼ばれ、そして市販で入手可能なエピトープタグ(血球凝集素、「HA」)を含む。この構築物を、erbB4のTyrのNRG誘導リン酸化を阻害するその能力に関して試験した。コントロールアンタゴニストは、erbB4の細胞外ドメインおよびHAタグの融合物であった。タグは、精製中の転換の簡便さのために含まれた。
これらのアンタゴニストを、2つのNRG形態:HBDを含むIG−EGF、およびそれを含まないEGFドメインによって誘導されたアゴニスト誘導チロシンリン酸化を阻害するその能力に関して試験した。アゴニストまたはアゴニストおよびアンタゴニストの混合物を、L6筋細胞と共に40分間インキュベートし、その後細胞を溶解し、そして、溶解物を5%のSDSゲルに流した。ゲルを市販の抗リン酸化Tyr抗体で染色した。これは実施例IおよびIIで記載される。実施例IIで述べたように、erbBレセプター複合体は、リン酸化チロシンウェスタンブロットで、erbB2、erbB3、およびerbB4のリン酸化形態を含む、「p185」と呼ばれる約185kDaの拡散したバンドとして現れた。そのウェスタンブロットを図8Cで示し、そしてリン酸化Tyrの相対量を、図8Bのグラフで示す。
その結果は、HBDの融合物は、HBDを欠く構築物(B4HA)と比較して、NRGにより誘導されるerbBレセプターのチロシンリン酸化の阻害において、erbB4タンパク質(HBDB4HAグループ)に、増加したアンタゴニスト活性を与えることを示す。これは、2つの形態のNRG:HBDを含むもの(「IG−EGF」)およびHBDを含まないもの(EGF)を用いて観察された。従って、N−HBDを他のタンパク質と組み合せることによって、そのタンパク質の結合活性および生物学的効果を増加させることが可能である。
Claims (51)
- 別のポリペプチドに融合した、ニューレグリンヘパリン結合ドメインポリペプチド(N−HBD)を含むハイブリッド融合ポリペプチドをコードするハイブリッド核酸分子であって、該分子は、以下:
(a)約100ヌクレオチドより長くない第一の核酸配列であって、該第一の核酸配列は、動物N−HBDポリペプチドまたは該ポリペプチドのヘパリン結合誘導体もしくはヘパリン結合ホモログをコードし、該N−HBDポリペプチドまたは誘導体は、以下:
(i)免疫グロブリンスーパーファミリーのC2サブファミリーのメンバーであるが、同じ動物種由来の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のC2ドメインに対して約40%未満の配列同一性を有し;そして
(ii)従来のヘパリン結合アッセイまたはヘパラン硫酸結合アッセイにおいて測定される場合、10 −5 M以下のK d でヘパリンおよびヘパラン硫酸のプロテオグリカンに結合する
ことを特徴とする、第一の核酸;
(b)必要に応じて、該第一の核酸配列とインフレームで融合された、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列;ならびに
(c)(i)該第一の核酸配列または該リンカー核酸配列にインフレームで連結しており、そして(ii)第二のポリペプチドPtrgをコードする第二の核酸配列、
を含む、ハイブリッド核酸分子。 - 別のポリペプチドに融合した、ニューレグリンヘパリン結合ドメインポリペプチド(N−HBD)を含むハイブリッド融合ポリペプチドをコードするハイブリッド核酸分子であって、該分子は、以下:
(a)以下:
(i)GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPQNIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG;
(ii)GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPENIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG;
(iii)以下の配列:
ggt cag aag cta gtg cta agg tgt gaa acc act tca gag tac cct gcg ctc aga ttc aaa tgg tta aag aac ggg aag gaa ata acg aaa aaa aac aga ccc gaa aat gtc aag atc ccc aaa aag caa aag aaa tac tct gag ctt cat att tat aga gcc acg ttg gct gac gct ggg gaa tac gca tgc aga gtg agc agc aaa cta ggg
によってコードされるポリペプチド;
(iv)(i)〜(iii)のいずれか1つのヘパリン結合誘導体もしくはヘパリン結合ホモログ
から選択される第一のポリペプチドをコードする、第1の核酸配列;
(b)必要に応じて、該第一の核酸配列とインフレームで融合された、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列;および
(c)(i)該第一の核酸配列または該リンカー核酸配列にインフレームで連結しており、そして、(ii)第二のポリペプチドP trg をコードする第二の核酸配列、
を含む、ハイブリッド核酸分子。 - 前記第一の核酸配列が、以下の配列:
GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPQNIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG
を有する第一のポリペプチドをコードする、請求項2に記載のハイブリッド核酸分子。 - 前記第一の核酸(a)が、以下の配列:
(a)ggt tcc aaa cta gtc ctt cgg tgt gaa acc agt tct gaa tac tcc tct ctc aga ttc aag tgg ttc aag aat ggg aat gaa ttg aat cga aaa aac aaa cca caa aat atc aag ata caa aaa aag cca ggg aag tca gaa ctt cgc att aac aaa gca tca ctg gct gat tct gga gag tat atg tgc aaa gtg atc agc aaa tta gga;
(b)以下のポリペプチド:
GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPENIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG
をコードする核酸配列;
(c)ggt cag aag cta gtg cta agg tgt gaa acc act tca gag tac cct gcg ctc aga ttc aaa tgg tta aag aac ggg aag gaa ata acg aaa aaa aac aga ccc gaa aat gtc aag atc ccc aaa aag caa aag aaa tac tct gag ctt cat att tat aga gcc acg ttg gct gac gct ggg gaa tac gca tgc aga gtg agc agc aaa cta ggg
のうちの1つから選択される、請求項2に記載のハイブリッド核酸分子。 - 前記第一の核酸が、以下:
ggt tcc aaa cta gtc ctt cgg tgt gaa acc agt tct gaa tac tcc tct ctc aga ttc aag tgg ttc aag aat ggg aat gaa ttg aat cga aaa aac aaa cca caa aat atc aag ata caa aaa aag cca ggg aag tca gaa ctt cgc att aac aaa gca tca ctg gct gat tct gga gag tat atg tgc aaa gtg atc agc aaa tta gga
である、請求項4に記載のハイブリッド核酸分子。 - ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項1〜5のいずれかに記載の第一の核酸分子とハイブリダイズする、約100ヌクレオチドより長くない、単離された核酸分子。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸分子であって、前記第二のポリペプチドPtrgは、
(a)可溶性形態の細胞表面レセプターであって、該細胞表面レセプターが、前記融合ポリペプチドの一部として、該レセプターに対するリガンドに結合することにより、該レセプターのリガンド活性化に対するアンタゴニストとして作用する能力を有する、細胞表面レセプター;または
(b)細胞表面レセプターに対するリガンドであって、該リガンドが、該融合ポリペプチドの一部として、該レセプターに結合することより、該レセプターでのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用する能力を有する、リガンド、
である、核酸分子。 - 前記レセプターが、チロシンキナーゼレセプター、Gタンパク質共役レセプターまたは抗体である、請求項7に記載の核酸分子。
- 前記レセプターがチロシンキナーゼレセプターである、請求項8に記載の核酸分子。
- 前記チロシンキナーゼレセプターが、上皮増殖因子レセプターである、請求項9に記載の核酸分子。
- 前記リガンドが、サイトカインまたは増殖因子である、請求項7〜9のいずれかに記載の核酸分子。
- 前記リガンドが、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経栄養因子、血管内皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、ネトリン(netrin)またはエフリン(ephrin)である、請求項11に記載の核酸分子。
- 前記リガンドが上皮増殖因子である、請求項12に記載の核酸分子。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が、以下:
(a)プロモーター、および
(b)必要に応じて、真核生物細胞における該核酸の発現を調節する、さらなる調節配列、
に作動可能に連結されており、該ベクターが、細胞へのインビトロまたはインビボでの送達の後に、該細胞中で発現され得る、発現ベクター。 - プラスミドである、請求項14に記載の発現ベクター。
- ウイルスベクターである、請求項14に記載の発現ベクター。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
- 請求項14〜16のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項17または18に記載の細胞。
- ヒト細胞である、請求項19に記載の細胞。
- 単離された哺乳動物細胞であって、該単離された哺乳動物細胞は、別のポリペプチドに融合された、哺乳動物ニューレグリンヘパリン結合ドメインポリペプチド(N−HBD)を含むハイブリッド融合ポリペプチドが、該細胞により発現されるように、該ハイブリッド融合ポリペプチドをコードする外因性の核酸分子でトランスフェクトされており、該ハイブリッド融合ポリペプチドのN−HBDポリペプチドは、
(a)免疫グロブリンスーパーファミリーのC2サブファミリーのメンバーであるが、同じ動物種由来の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のC2ドメインに対して約40%未満の配列同一性を有し;そして
(b)従来のヘパリン結合アッセイまたはヘパラン硫酸結合アッセイにおいて測定される場合、10−5M以下のKdでヘパリンおよびヘパラン硫酸のプロテオグリカンに結合する、細胞。 - 前記外因性核酸分子が、
(a)ggt tcc aaa cta gtc ctt cgg tgt gaa acc agt tct gaa tac tcc tct ctc aga ttc aag tgg ttc aag aat ggg aat gaa ttg aat cga aaa aac aaa cca caa aat atc aag ata caa aaa aag cca ggg aag tca gaa ctt cgc att aac aaa gca tca ctg gct gat tct gga gag tat atg tgc aaa gtg atc agc aaa tta gga;
(b)以下のポリペプチド:
GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPENIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG
をコードする核酸配列;または
(c)ggt cag aag cta gtg cta agg tgt gaa acc act tca gag tac cct gcg ctc aga ttc aaa tgg tta aag aac ggg aag gaa ata acg aaa aaa aac aga ccc gaa aat gtc aag atc ccc aaa aag caa aag aaa tac tct gag ctt cat att tat aga gcc acg ttg gct gac gct ggg gaa tac gca tgc aga gtg agc agc aaa cta ggg
から選択される配列、またはヘパリン結合ポリペプチドをコードする、それらのホモログもしくは誘導体を含む、請求項21に記載の細胞。 - 前記外因性核酸分子が、以下:
ggt tcc aaa cta gtc ctt cgg tgt gaa acc agt tct gaa tac tcc tct ctc aga ttc aag tgg ttc aag aat ggg aat gaa ttg aat cga aaa aac aaa cca caa aat atc aag ata caa aaa aag cca ggg aag tca gaa ctt cgc att aac aaa gca tca ctg gct gat tct gga gag tat atg tgc aaa gtg atc agc aaa tta gga
を含む、請求項22に記載の細胞。 - 別のポリペプチドに融合されたヘパリン結合ドメインポリペプチドを含む、ハイブリッド融合ポリペプチドであって、該ハイブリッド融合ポリペプチドは、以下:
(a)第一の標的化ポリペプチドであって、該第一の標的化ポリペプチドは、該融合ポリペプチドが細胞または組織に接触し得る場合に、ヘパラン硫酸を結合することより、該ヘパラン硫酸に富んだ細胞または組織の表面に、該融合ポリペプチドを局在化し、
ここで、該ハイブリッド融合ポリペプチドは、従来のヘパリン結合アッセイまたはヘパラン硫酸結合アッセイにおいて測定される場合、10−5M以下のKdでヘパリンまたはヘパラン硫酸のプロテオグリカンに結合する、
第一の標的化ポリペプチド;ならびに
(b)該ヘパラン硫酸に富んだ細胞または組織の表面に標的化または局在化されるべき、第二の標的化されるポリペプチドPtrg;を含み、
ここで、該ハイブリッド融合ポリペプチドは、該Ptrgの作用を介して、標的レセプターの刺激またはブロックにおいて、ネイティブのPtrgまたは該標的化ポリペプチドに融合されていないPtrgと比較して増強された生物学的活性を有する、
ハイブリッド融合ポリペプチド。 - 請求項24に記載のハイブリッド融合ポリペプチドであって、ここで、前記第一の標的化ポリペプチドが、ニューレグリンヘパリン結合ドメイン(N−HBD)またはN−HBDのヘパリン結合ホモログまたはヘパリン結合誘導体の全てまたは一部を含み、ここで、
(i)前記第一のポリペプチドが、前記第二のポリペプチドに直接的に融合されているか、または
(ii)必要に応じて、該第一のポリペプチドが、該第二のポリペプチドに融合されたリンカーペプチド配列に融合されている、
ハイブリッド融合ポリペプチド。 - 請求項1〜13のいずれかに記載の核酸分子、または該核酸分子のフラグメント、もしくはホモログによりコードされる、請求項24または請求項25に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 請求項14〜16のいずれかに記載の発現ベクターの組換え発現により産生される、請求項24または25に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 請求項24〜27のいずれかに記載のハイブリッド融合ポリペプチドであって、ここで、前記第一のポリペプチドのアミノ酸配列が、以下:
(a)GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPQNIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG;
(b)GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPENIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG;
(c)以下の配列:
ggt cag aag cta gtg cta agg tgt gaa acc act tca gag tac cct gcg ctc aga ttc aaa tgg tta aag aac ggg aag gaa ata acg aaa aaa aac aga ccc gaa aat gtc aag atc ccc aaa aag caa aag aaa tac tct gag ctt cat att tat aga gcc acg ttg gct gac gct ggg gaa tac gca tgc aga gtg agc agc aaa cta ggg
によりコードされるポリペプチド;または
(d)(a)、(b)または(c)のヘパリン結合ホモログもしくはヘパリン結合誘導体の配列、
から選択される、ハイブリッド融合ポリペプチド。 - 前記第一のポリペプチドのアミノ酸配列が、以下:
GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPQNIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG
である、請求項28に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。 - 前記(d)のホモログもしくは誘導体が、以下の配列:
KWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGK;
KWFKNGNELNRKNKPENIKIQKKPGK;または
KWLKNGKEITKKNRPENVKIPKKQKK
を有する、請求項28に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。 - 請求項25に記載のハイブリッド融合ポリペプチドであって、ここで、前記(d)のホモログまたは誘導体が、以下の配列:
K−x−x−K−x−x−x−x−x−x−R−K−x−K−x−x−x−x−K−x−x−K−K−x−x−K
であって、ここで、xが任意のアミノ酸である、配列、または少なくとも6つのLys残基またはArg残基を有する該配列のフラグメントを有する、ハイブリッド融合ポリペプチド。 - 前記リンカーを含み、該リンカーが、プロテアーゼにより切断可能である、請求項25〜31のいずれかに記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 前記リンカーが、配列VPRGSDまたは配列DDKDWHを含むペプチドである、請求項32に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 直線状多量体であって、前記第一の標的化ポリペプチドの2つ以上の単量体リピートを含み、該単量体リピートは、(i)直接、または(ii)該単量体リピートの間に存在するリンカー配列によって端と端をあわせて結合している、請求項24〜31のいずれかに記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 請求項24〜33のいずれかに記載のハイブリッド融合ポリペプチドの、タンデムに連結された二量体または三量体。
- 請求項24〜35のいずれかに記載のハイブリッド融合ポリペプチドであって、ここで、前記第二のポリペプチドPtrgは:
(a)可溶性形態の細胞表面レセプターであって、該融合ポリペプチドの一部として、前記レセプターに対するリガンドに結合し、それにより該レセプターのリガンド活性化に対するアンタゴニストとして作用する能力を有する、レセプター;または
(b)細胞表面レセプターに対するリガンドであって、該融合ポリペプチドの一部として、該レセプターに結合し、それにより、該レセプターでのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用する能力を有する、リガンド、
である、ハイブリッド融合ポリペプチド。 - 前記レセプターが、チロシンキナーゼレセプター、Gタンパク質共役レセプターまたは抗体である、請求項36に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 前記チロシンキナーゼレセプターが、上皮増殖因子レセプターである、請求項37に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 前記リガンドが、サイトカインまたは増殖因子である、請求項36または請求項37に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 前記リガンドが、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経栄養因子、血管内皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、ネトリンまたはエフリンである、請求項39に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 前記神経栄養因子が、脳由来の神経栄養因子、神経膠由来の神経栄養因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、および神経増殖因子からなる群より選択される、請求項40に記載のハイブリッド融合ポリペプチド。
- 標的化されるポリペプチドを細胞または組織の表面に送達するためおよび該標的化されるポリペプチドの生物学的活性を増強するために有用な薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、以下:
(a)請求項24〜41のいずれかに記載のハイブリッド融合ポリペプチド;および
(b)薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、薬学的組成物。 - 哺乳動物細胞であって、請求項24〜41のいずれかに記載のハイブリッド融合ポリペプチドをその表面上で発現するかまたは分泌する、哺乳動物細胞。
- ヒト細胞である、請求項43に記載の哺乳動物細胞。
- 標的化されるポリペプチドを、細胞または組織の表面に送達するのに有用である薬学的組成物であって、該ポリペプチドは、組換え細胞の表面上で発現される形態であるか、または組換え細胞により分泌される形態であり、該組成物は、以下:
(a)請求項17〜23、43または44のいずれかに記載の細胞;および
(b)薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、薬学的組成物。 - ヘパラン硫酸に富んだ細胞または組織の表面に、標的化されるポリペプチドを局在化し、それにより該表面でのその生物学的活性を増強するためのインビトロの方法であって、該方法は、請求項24〜41のいずれかに記載のハイブリッド融合ポリペプチドを該表面に提供する工程を包含し、それにより該融合ポリペプチドのPtrgは、該表面に局在化され、その結果、該Ptrgの生物学的活性が、ネイティブのPtrgまたは該標的化ポリペプチドに融合されていないPtrg の活性と比較して増加する、方法。
- Ptrgの作用により処置可能である被験体における疾患または状態を処置するための組成物の製造のための、請求項24〜41のいずれか1項に記載のハイブリッド融合ポリペプチドの使用であって、該組成物により、前記融合ポリペプチドのPtrgの生物学的活性が、ネイティブのPtrgまたは該標的化ポリペプチドに融合されていないPtrg の活性と比較して増加し、そして、該疾患または状態が、腫瘍、癌または神経学的障害である、使用。
- Ptrgの作用により処置可能である被験体における疾患または状態を処置するための組成物の製造のための、請求項17〜23、43または44のいずれか1項に記載の細胞の使用であって、それにより、P trg を有するかもしくはP trg を分泌する細胞が、該細胞または組織の表面において利用可能となり、そして、前記融合ポリペプチドのPtrgの生物学的活性が、ネイティブのPtrgまたは該標的化ポリペプチドに融合されていないPtrg の活性と比較して増加し、そして、該疾患または状態が、腫瘍、癌または神経学的障害である、使用。
- 前記神経学的障害が、神経変性障害、多発性硬化症、発作、癲癇または外傷性脳傷害、外傷性脊髄傷害もしくは外傷性末梢神経傷害である、請求項47または48に記載の使用。
- 前記神経学的障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症から選択される神経変性疾患である、請求項49に記載の使用。
- 実施例に記載の、ハイブリッド融合ポリペプチド。
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