JP2015523379A

JP2015523379A - Ｒｐｇｒｘ連鎖性網膜変性のａａｖ媒介型遺伝子治療

Info

Publication number: JP2015523379A
Application number: JP2015521593A
Authority: JP
Inventors: ベルトラン，ウイリアム・エイ; アギーレ，グスタボ・デイー; ジヤコブソン，サミユエル・ジー; シデシヤン，アーサー・ブイ; リユーイン，アルフレツド・エス; ボーイ，サンフオード・エル; ハウスワース，ウイリアム・ダブリユー; デン，ウエン−タオ
Original assignee: ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア; ユニバーシテイ・オブ・フロリダ・リサーチ・フアンデーシヨン・インコーポレーテツド
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2015-08-13
Anticipated expiration: 2033-01-23
Also published as: US9770491B2; AU2013287281A1; US10383922B2; EP2872183A4; US20180036385A1; CA2878171C; CN105120901A; EP2872183A1; CA2878171A1; EP2872183B1; AU2013287281B2; WO2014011210A1; NZ704275A; US20150202269A1; JP6199965B2

Abstract

本明細書に記載するのは、個体の網膜色素変性症およびＸ連鎖性網膜色素変性症に伴う視覚喪失および他の状態を防ぎ、進行を阻止し、または改善する方法である。この方法は、正常網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節物質（ＲＰＧＲ遺伝子）またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含む。【選択図】図１

Description

発明の背景
光受容体は網膜色素上皮（ＲＰＥ）と共同的に機能してフォトンのキャッチ（ｐｈｏｔｏｎｃａｔｃｈ）を最適化し、そしてシグナルを生成し、これがより高度な中心視野（ｖｉｓｉｏｎｃｅｎｔｅｒ）に伝えられ、そして視覚像として知覚される。網膜の光受容体における視覚過程の破壊は、失明を生じる可能性がある。網膜の遺伝子異常は、多数のメカニズムにより相当数の視力障害疾患をもたらす。

光受容体ジストロフィーの中で、網膜色素変性のＸ連鎖形（ＸＬＲＰ）は重篤な視覚喪失（ｖｉｓｉｏｎｌｏｓｓ）の最もよくある原因の一つである。２５年以上も前に、遺伝子座が同定され、そして根本にある遺伝子異常の知見が追跡された。網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節物質（ＲｅｔｉｎｉｔｉｓＰｉｇｍｅｎｔｏｓａＧＴＰａｓｅＲｅｇｕｌａｔｏｒ（ＲＰＧＲ））遺伝子における突然変異により生じるヒトＸＬＲＰは、ほとんどのＸＬＲＰの原因となる重篤な早期発生の網膜変性疾患である。網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節物質（ＲＰＧＲ）遺伝子における突然変異は、ＸＬＲＰの原因の７０％より多くを占め、ＲＰＧＲ中の突然変異多発点であるエキソンＯＲＦ１５は、患者の２２〜６０％で突然変異している。この疾患は容赦なく進行し、そして４０代の終わりまでにほとんどの患者が法的盲となる。

最近まで、突然変異からＲＰ変性を導く分子メカニズムの解明、およびＲＰＧＲ−ＸＬＲＰを含むほとんどの形態のＲＰに関する効果的処置の開発は遅々としていた。疾患に関連する動物モデルが、新たな治療の開発および確認には決定的であった。ＲＰＧＲ−ＸＬＲＰについては、マウスおよびイヌの両モデルが存在する。イヌでは、ＯＲＦ１５中の二つの自然に存在する顕著な微小欠損が、異なる疾患表現型をもたらす。Ｘ連鎖性進行性網膜萎縮症１（ＸＬＰＲＡ１；ｄｅｌ１０２８−１０３２）は、２３０残基のＣ末端先断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を有し、この疾患は若年性であるが、発症後に発達し、そして数年にわたって進行する。対照的にＸＬＰＲＡ２（ｄｅｌ１０８４−１０８５）に関連する二つのヌクレオチド欠損は、フレイムシフトおよび推定タンパク質の等電点を変える３４個の塩基性アミノ酸の包含を引き起し、そして末端の１６１残基を切断する。この疾患は早期に発症し、そして急速に進行する。両モデルがヒトＸＬＲＰの疾患スペクトラムに対応し、そして相対的重篤度に変化があるが、それらは１０代で発症するヒトの疾患に等しい。

この疾患に罹患しているヒト患者が現在利用できるＸＬＲＰの成功裏な処置はない。必要とされているのは効果的で、安全かつ長期安定性を有するＲＰＧＲ−ＸＬＲＰのための処置である。

米国特許第７，５６１，９７２号明細書米国特許第７，５６１，９７３号明細書米国特許第７，８８８，１１２号明細書国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット米国特許第７，２８２，１９９号明細書米国特許第５，４７８，７４５号明細書米国特許第７，６２９，３２２号明細書米国特許仮出願第６１／６７０，３３５号明細書

ＷｒｉｇｈｔＡＦ，ＣｈａｋａｒｏｖａＣＦ，ＡｂｄＥｌ−ＡｚｉｚＭＭ，＆ＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａＳＳ（２０１０）Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｔｒａｉｔ．ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ１１：２７３−２８４．ＢｒａｍａｌｌＡＮ，ＷｒｉｇｈｔＡＦ，ＪａｃｏｂｓｏｎＳＧ，＆ＭｃＩｎｎｅｓＲＲ（２０１０）Ｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｔｈｅｒｅｔｉｎａｉｎｉｎｈｅｒｉｔｅｄｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｈｅｓｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＡｎｎｕＲｅｖＮｅｕｒｏｓｃｉ３３：４４１−４７２．ＡｃｌａｎｄＧＭ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｒｅｓｔｏｒｅｓｖｉｓｉｏｎｉｎａｃａｎｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｃｈｉｌｄｈｏｏｄｂｌｉｎｄｎｅｓｓ．ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ２８：９２−９５．ＣｉｄｅｃｉｙａｎＡＶ（２０１０）ＬｅｂｅｒｃｏｎｇｅｎｉｔａｌａｍａｕｒｏｓｉｓｄｕｅｔｏＲＰＥ６５ｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｉｔｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ＰｒｏｇＲｅｔｉｎＥｙｅＲｅｓ２９：３９８−４２７．ＢｉｒｄＡＣ（１９７５）Ｘ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．ＢｒＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ５９：１７７−１９９．ＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａＳＳ，ｅｔａｌ．（１９８４）ＣｌｏｓｅｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｂｅｔｗｅｅｎＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａａｎｄａｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡｐｒｏｂｅＬ１．２８．Ｎａｔｕｒｅ３０９：２５３−２５５．ＭｅｉｎｄｌＡ，ｅｔａｌ．（１９９６）Ａｇｅｎｅ（ＲＰＧＲ）ｗｉｔｈｈｏｍｏｌｏｇｙｔｏｔｈｅＲＣＣ１ｇｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅｘｃｈａｎｇｅｆａｃｔｏｒｉｓｍｕｔａｔｅｄｉｎＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ（ＲＰ３）．ＮａｔＧｅｎｅｔ１３：３５−４２．ＳｃｈｗａｈｎＵ，ｅｔａｌ．（１９９８）ＰｏｓｉｔｉｏｎａｌｃｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅｇｅｎｅｆｏｒＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ２．ＮａｔＧｅｎｅｔ１９：３２７−３３２．ＢａｄｅｒＩ，ｅｔａｌ．（２００３）Ｘ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ：ＲＰＧＲｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｍｏｓｔｆａｍｉｌｉｅｓｗｉｔｈｄｅｆｉｎｉｔｅＸｌｉｎｋａｇｅａｎｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎａｓｈｏｒｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｔｒｅｔｃｈｏｆｅｘｏｎＯＲＦ１５．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：１４５８−１４６３．ＳｈａｒｏｎＤ，ｅｔａｌ．（２００３）ＲＰ２ａｎｄＲＰＧＲＭｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＸ−ＬｉｎｋｅｄＲｅｔｉｎｉｔｉｓＰｉｇｍｅｎｔｏｓａ．ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ７３：１１３１−１１４６．ＰｅｌｌｅｔｉｅｒＶ，ｅｔａｌ．（２００７）ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｓｕｒｖｅｙｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＲＰ２ａｎｄＲＰＧＲｉｎｐａｔｉｅｎｔｓａｆｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｄｉｓｔｉｎｃｔｒｅｔｉｎａｌｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ：ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓａｎｄｉｍｐａｃｔｏｎｇｅｎｅｔｉｃｃｏｕｎｓｅｌｉｎｇ．ＨｕｍＭｕｔａｔ２８：８１−９１．ＶｅｒｖｏｏｒｔＲ，ｅｔａｌ．（２０００）ＭｕｔａｔｉｏｎａｌｈｏｔｓｐｏｔｗｉｔｈｉｎａｎｅｗＲＰＧＲｅｘｏｎｉｎＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．ＮａｔＧｅｎｅｔ２５：４６２−４６６．ＢｒｅｕｅｒＤＫ，ｅｔａｌ．（２００２）ＡｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｍｕｔａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＰ２ａｎｄＲＰＧＲｉｎａＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎｃｏｈｏｒｔｏｆｆａｍｉｌｉｅｓｗｉｔｈＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ７０：１５４５−１５５４．ＪａｃｏｂｓｏｎＳＧ，ｅｔａｌ．（１９９７）ＤｉｓｅａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａｃａｕｓｅｄｂｙａｐｕｔａｔｉｖｅｎｕｌｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＲＰＧＲｇｅｎｅ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ３８：１９８３−１９９７．ＳａｎｄｂｅｒｇＭＡ，ＲｏｓｎｅｒＢ，Ｗｅｉｇｅｌ−ＤｉＦｒａｎｃｏＣ，ＤｒｙｊａＴＰ，＆ＢｅｒｓｏｎＥＬ（２００７）ＤｉｓｅａｓｅｃｏｕｒｓｅｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａｄｕｅｔｏＲＰＧＲｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ４８：１２９８−１３０４．ＡｌｅｍａｎＴＳ，ｅｔａｌ．（２００７）ＩｎｎｅｒｒｅｔｉｎａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｉｎＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａｗｉｔｈＲＰＧＲｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ４８：４７５９−４７６５．ＨｏｎｇＤＨ，ｅｔａｌ．（２０００）ＡｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａＧＴＰａｓｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＲＰＧＲ）−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｆｏｒＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ（ＲＰ３）．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７：３６４９−３６５４．ＣｈａｎｇＢ，ｅｔａｌ．（２００２）Ｒｅｔｉｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅ．ＶｉｓｉｏｎＲｅｓ４２：５１７−５２５．ＨｏｎｇＤＨ，ＰａｗｌｙｋＢＳ，ＡｄａｍｉａｎＭ，＆ＬｉＴ（２００４）Ｄｏｍｉｎａｎｔ，ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｏｆＲＰＧＲ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ４５：３６−４１．ＺｈａｎｇＱ，ｅｔａｌ．（２００２）ＤｉｆｆｅｒｅｎｔＲＰＧＲｅｘｏｎＯＲＦ１５ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＣａｎｉｄｓｐｒｏｖｉｄｅｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ１１：９９３−１００３．ＺｅｉｓｓＣＪ，ＡｃｌａｎｄＧＭ，＆ＡｇｕｉｒｒｅＧＤ（１９９９）ＲｅｔｉｎａｌｐａｔｈｏｌｏｇｙｏｆｃａｎｉｎｅＸ−ｌｉｎｋｅｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｒｅｔｉｎａｌａｔｒｏｐｈｙ，ｔｈｅｌｏｃｕｓｈｏｍｏｌｏｇｕｅｏｆＲＰ３．ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆ＶｉｓｕａｌＳｃｉｅｎｃｅ４０：３２９２−３３０４．ＢｅｌｔｒａｎＷＡ，ＨａｍｍｏｎｄＰ，ＡｃｌａｎｄＧＭ，＆ＡｇｕｉｒｒｅＧＤ（２００６）ＡｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＲＰＧＲｅｘｏｎＯＲＦ１５ｃａｕｓｅｓｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｎｅｒｒｅｔｉｎａｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎａｍｏｄｅｌｏｆＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ４７：１６６９−１６８１．ＷｒｉｇｈｔＡＦ，ｅｔａｌ．（２００４）Ｌｉｆｅｓｐａｎａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＮａｔＧｅｎｅｔ３６：１１５３−１１５８．ＪａｃｏｂｓｏｎＳＧ，ｅｔａｌ．（２０１１）ＨｕｍａｎｒｅｔｉｎａｌｄｉｓｅａｓｅｆｒｏｍＡＩＰＬ１ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｆｏｖｅａｌｃｏｎｅｌｏｓｓｗｉｔｈｍｉｎｉｍａｌｍａｃｕｌａｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｒｏｄｆｕｎｃｔｉｏｎｒｅｍａｉｎｉｎｇ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ５２：７０−７９．ＡｙｙａｇａｒｉＲ，ｅｔａｌ．（２００２）Ｘ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｃｅｓｓｉｖｅａｔｒｏｐｈｉｃｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍＲＰＧＲｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８０：１６６−１７１．ＥｂｅｎｅｚｅｒＮＤ，ｅｔａｌ．（２００５）ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌＲＰＧＲＯＲＦ１５ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＸｌｉｎｋｅｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｃｏｎｅ−ｒｏｄｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＸＬＣＯＲＤ）ｆａｍｉｌｉｅｓ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ４６：１８９１−１８９８．ＳｈｕＸ，ｅｔａｌ．（２００７）ＲＰＧＲｍｕｔａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄｉｓｅａｓｅ：ａｎｕｐｄａｔｅ．ＨｕｍＭｕｔａｔ２８：３２２−３２８．ＷａｌｉａＳ，ｅｔａｌ．（２００８）ＤｉｓｃｏｒｄａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｉｎｆｒａｔｅｒｎａｌｔｗｉｎｓｈａｖｉｎｇａｎｉｄｅｎｔｉｃａｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｅｘｏｎＯＲＦ１５ｏｆｔｈｅＲＰＧＲｇｅｎｅ．ＡｒｃｈＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ１２６：３７９−３８４．ＲｕｄｄｌｅＪＢ，ｅｔａｌ．（２００９）ＲＰＧＲＯＲＦ１５ｇｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｒｅｔｉｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎａｎＡｕｓｔｒａｌｉａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＢｒＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ９３：１１５１−１１５４．ＦａｈｉｍＡＴ，ｅｔａｌ．（２０１１）ＡｌｌｅｌｉｃｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｅｒｌｏｃｉｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｃｌｉｎｉｃａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｍａｌｅｓｗｉｔｈＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａｄｕｅｔｏＲＰＧＲｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ６：ｅ２３０２１．ＭｏｗａｔＦＭ，ｅｔａｌ．（２００８）Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｅｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｔｈｅａｒｅａｃｅｎｔｒａｌｉｓｏｆｔｈｅｃａｎｉｎｅｒｅｔｉｎａ．ＭｏｌＶｉｓ１４：２５１８−２５２７．ＡｃｌａｎｄＧＭ，ｅｔａｌ．（２００５）Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｒｏｄａｎｄｃｏｎｅｖｉｓｉｏｎｂｙｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｒＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｔｏｔｈｅｒｅｔｉｎａｉｎａｃａｎｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｃｈｉｌｄｈｏｏｄｂｌｉｎｄｎｅｓｓ．ＭｏｌＴｈｅｒ１２：１０７２−１０８２．ＫｈａｎｎａＨ，ｅｔａｌ．（２００５）ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５，ｗｈｉｃｈｉｓｍｕｔａｔｅｄｉｎｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，ａｓｓｏｃｉａｔｅｓｗｉｔｈＳＭＣ１，ＳＭＣ３，ａｎｄｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８０：３３５８０−３３５８７．ＡｄａｍｉａｎＭ，ＰａｗｌｙｋＢＳ，ＨｏｎｇＤＨ，＆ＢｅｒｓｏｎＥＬ（２００６）ＲｏｄａｎｄｃｏｎｅｏｐｓｉｎｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎａｎａｕｔｏｐｓｙｅｙｅｆｒｏｍａｃａｒｒｉｅｒｏｆＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａｗｉｔｈａＧｌｙ４３６ＡｓｐｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＲＰＧＲｇｅｎｅ．ＡｍＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ１４２：５１５−５１８．ＢｅｌｔｒａｎＷＡ，ＡｃｌａｎｄＧＭ，＆ＡｇｕｉｒｒｅＧＤ（２００９）Ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｉｓｅａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｍｏｓａｉｃｉｎｃａｒｒｉｅｒｓｏｆＲＰＧＲｅｘｏｎＯＲＦ１５ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ５０：３９８５−３９９５．ＡｇｕｉｒｒｅＧＤ，ｅｔａｌ．（２００２）ＲｅｔｉｎａｌｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙｏｆａｎＸＬＲＰｃａｒｒｉｅｒｗｉｔｈａｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＲＰＧＲｅｘｏｎＯＲＦ１５．ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ７５：４３１−４４３．ＬｉＺＹ，ＫｌｊａｖｉｎＩＪ，＆ＭｉｌａｍＡＨ（１９９５）Ｒｏｄｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｎｅｕｒｉｔｅｓｐｒｏｕｔｉｎｇｉｎｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１５：５４２９−５４３８．ＧｅｉｇｅｒＫ，ｅｔａｌ．（１９９４）ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＩＦＮ−ｇａｍｍａｉｎｔｈｅｒｅｔｉｎａｄｅｖｅｌｏｐｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｙｅａｎｄｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｌｏｓｓ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ３５：２６６７−２６８１．ＪａｃｏｂｓｏｎＳＧ＆ＣｉｄｅｃｉｙａｎＡＶ（２０１０）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓｆｏｒｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３６３：１６６９−１６７１．ＷｒｉｇｈｔＡＦ＆ＳｈｕＸ（２００７）ＦｏｃｕｓｏｎＭｏｌｅｃｕｌｅｓ：ＲＰＧＲ．ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ８５：１−２．ＳｉｍｏｎｓＤＬ，ＢｏｙｅＳＬ，ＨａｕｓｗｉｒｔｈＷＷ，＆ＷｕＳＭ（２０１１）ＧｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｐｒｅｖｅｎｔｓｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅａｔｈａｎｄｐｒｅｓｅｒｖｅｓｒｅｔｉｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａＢａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｌｓｙｎｄｒｏｍｅｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０８：６２７６−６２８１．ＧｕｙｏｎＲ，Ｐｅａｒｃｅ−ＫｅｌｌｉｎｇＳＥ，ＺｅｉｓｓＣＪ，ＡｃｌａｎｄＧＭ，＆ＡｇｕｉｒｒｅＧＤ（２００７）ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｘｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｏｄｉｆｉｅｒｓｏｆｄｉｓｅａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃａｎｉｎｅＸＬＰＲＡ１，ａｍｏｄｅｌｆｏｒｈｕｍａｎＸ−ｌｉｎｋｅｄｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ３．ＭｏｌＶｉｓ１３：１０９４−１１０５．ＤｅｍｉｒｃｉＦＹ，ｅｔａｌ．（２００２）Ｘ−ｌｉｎｋｅｄｃｏｎｅ−ｒｏｄｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ｌｏｃｕｓＣＯＤ１）：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＲＰＧＲｅｘｏｎＯＲＦ１５．ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ７０：１０４９− １０５３．ＹａｎｇＺ，ｅｔａｌ．（２００２）ＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＲＰＧＲｇｅｎｅｃａｕｓｅＸ−ｌｉｎｋｅｄｃｏｎｅｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ１１：６０５−６１１．ＤｅｍｉｒｃｉＦＹ，ｅｔａｌ．（２００５）ＨｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｓｔｕｄｙｏｆＸ−ｌｉｎｋｅｄｃｏｎｅ−ｒｏｄｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＣＯＲＤＸ１）ｃａｕｓｅｄｂｙａｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＲＰＧＲｅｘｏｎＯＲＦ１５．ＡｍＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ１３９：３８６−３８８．ＡｌｅｘａｎｄｅｒＪＪ，ｅｔａｌ．（２００７）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｅｖｉｓｉｏｎｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａ．ＮａｔＭｅｄ１３：６８５−６８７．ＫｏｍａｒｏｍｙＡＭ，ｅｔａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｒｅｓｃｕｅｓｃｏｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｃｏｎｇｅｎｉｔａｌａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ１９：２５８１−２５９３．ＭｉｃｈａｌａｋｉｓＳ，ｅｔａｌ．（２０１０）ＲｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｅｖｉｓｉｏｎｉｎｔｈｅＣＮＧＡ３−／− ｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｃｏｍｐｌｅｔｅｌａｃｋｏｆｃｏｎｅｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＭｏｌＴｈｅｒ１８：２０５７−２０６３．ＣａｒｖａｌｈｏＬＳ，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍａｎｄａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｖｉｓｕａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆＣＮＧＢ３−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａｆｏｌｌｏｗｉｎｇｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ２０：３１６１−３１７５．ＪａｃｏｂｓｏｎＳＧ，ｅｔａｌ．（２０１１）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＬｅｂｅｒＣｏｎｇｅｎｉｔａｌＡｍａｕｒｏｓｉｓＣａｕｓｅｄｂｙＲＰＥ６５Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ＳａｆｅｔｙａｎｄＥｆｆｉｃａｃｙｉｎ１５ＣｈｉｌｄｒｅｎａｎｄＡｄｕｌｔｓＦｏｌｌｏｗｅｄＵｐｔｏ３Ｙｅａｒｓ．ＡｒｃｈＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＥｐｕｂｌｉｓｈｅｄａｈｅａｄｏｆｐｒｉｎｔ．Ｐｅｔｒｓ−ＳｉｌｖａＨ，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｎｏｖｅｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｍｕｔａｎｔＡＡＶ２ｖｅｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅｒｅｔｉｎａ．ＭｏｌＴｈｅｒ１９：２９３−３０１．ＨｅＳ，ｅｔａｌ．（２００８）ＲｅｔｉｎｉｔｉｓＰｉｇｍｅｎｔｏｓａＧＴＰａｓｅＲｅｇｕｌａｔｏｒ（ＲＰＧＲ）ｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｆｏｒｍｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｒｅｔｉｎａ：ｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏＸ−ｌｉｎｋｅｄＲｅｔｉｎｉｔｉｓＰｉｇｍｅｎｔｏｓａａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｉｌｉｏｐａｔｈｉｅｓ．ＶｉｓｉｏｎＲｅｓ４８：３６６−３７６．Ｍｕｒｇａ−ＺａｍａｌｌｏａＣＡ，ＤｅｓａｉＮＪ，ＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔＦ，＆ＫｈａｎｎａＨ（２０１０）ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｃｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｔｅｉｎｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａＧＴＰａｓｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｗｉｔｈｎｅｐｈｒｏｎｏｐｈｔｈｉｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｒｅｔｉｎａｓ．ＭｏｌＶｉｓ１６：１３７３− １３８１．ＳｈｕＸ，ｅｔａｌ．（２００５）ＲＰＧＲＯＲＦ１５ｉｓｏｆｏｒｍｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｓｗｉｔｈＲＰＧＲＩＰ１ａｔｃｅｎｔｒｉｏｌｅｓａｎｄｂａｓａｌｂｏｄｉｅｓａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ１４：１１８３−１１９７．Ｍｕｒｇａ−ＺａｍａｌｌｏａＣＡ，ＡｔｋｉｎｓＳＪ，ＰｅｒａｎｅｎＪ，ＳｗａｒｏｏｐＡ，＆ＫｈａｎｎａＨ（２０１０）ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａＧＴＰａｓｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＲＰＧＲ）ｗｉｔｈＲＡＢ８ＡＧＴＰａｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｃｉｌｉａｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ１９：３５９１−３５９８．ＧｈｏｓｈＡＫ，ｅｔａｌ．（２０１０）Ｈｕｍａｎｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｉｌｉａｒｙｐｒｏｔｅｉｎＲｅｔｉｎｉｔｉｓＰｉｇｍｅｎｔｏｓａＧＴＰａｓｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｍｅｄｉａｔｅｓｃｉｌｉａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ１９：９０−９８．ＰｏｒｒｅｌｌｏＫ，ＢｈａｔＳＰ，＆ＢｏｋＤ（１９９１）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｔｉｎｏｉｄｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＲＢＰ）ｍＲＮＡｉｎｈｕｍａｎａｎｄｃｏｎｅ−ｄｏｍｉｎａｎｔｓｑｕｉｒｒｅｌｒｅｔｉｎａｓｂｙｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ３９：１７１−１７６．ＡｌｆｉｎｉｔｏＰＤ＆Ｔｏｗｎｅｓ−ＡｎｄｅｒｓｏｎＥ（２００２）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｉｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｐｓｉｎｋｉｌｌｓｒｏｄｃｅｌｌｓ：ａｎｏｖｅｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｒｏｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎｒｅｔｉｎａｌｄｉｓｅａｓｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９９：５６５５−５６６０．ＺｈａｎｇＴ，ＺｈａｎｇＮ，ＢａｅｈｒＷ，＆ＦｕＹ（２０１１）ＣｏｎｅｏｐｓｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｔｈｅｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆｃｏｎｅｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎＬｅｂｅｒｃｏｎｇｅｎｉｔａｌａｍａｕｒｏｓｉｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０８：８８７９−８８８４．ＪａｃｏｂｓｏｎＳＧ，ｅｔａｌ．（２００９）ＤｉｓｅａｓｅｂｏｕｎｄａｒｉｅｓｉｎｔｈｅｒｅｔｉｎａｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＵｓｈｅｒｓｙｎｄｒｏｍｅｃａｕｓｅｄｂｙＭＹＯ７Ａｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ５０：１８８６−１８９４．ＪａｃｏｂｓｏｎＳＧ，ｅｔａｌ．（２００８）ＰｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｌａｙｅｒｔｏｐｏｇｒａｐｈｙｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｌｅｂｅｒｃｏｎｇｅｎｉｔａｌａｍａｕｒｏｓｉｓｃａｕｓｅｄｂｙＲＰＥ６５ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ４９：４５７３−４５７７．ＢｅｌｔｒａｎＷＡ，ｅｔａｌ．（２０１０）ｒＡＡＶ２／５ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｏｒｏｄｓ：ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ１７：１１６２−１１７４．ＺｈａｎｇＱ，ｅｔａｌ．（２００２）ＤｉｆｆｅｒｅｎｔＲＰＧＲｅｘｏｎＯＲＦ１５ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＣａｎｉｄｓｐｒｏｖｉｄｅｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ１１：９９３−１００３．ＨｏｎｇＤＨ，ＰａｗｌｙｋＢＳ，ＡｄａｍｉａｎＭ，ＳａｎｄｂｅｒｇＭＡ，＆ＬｉＴ（２００５）Ａｓｉｎｇｌｅ，ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ｖａｒｉａｎｔｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｓＲＰＧＲｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ４６：４３５−４４１．ＢｅｌｔｒａｎＷＡ，ｅｔａｌ．（２０１０）ｒＡＡＶ２／５ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｏｒｏｄｓ：ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ１７：１１６２−１１７４．ＨｏｎｇａｎｄＬｉ，ＩｎｖｅｓｔＯｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙＶｉｓＳｃｉ，４３（１１）：３３７３−８２．ＶｅｒｖｏｏｒｔａｎｄＷｒｉｇｈｔ，ＨｕｍＭｕｔａｔ．２００２Ｍａｙ，１９（５）：４８６−５００．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔｅｔａｌ，ＨｕｍＭｕｔａｔ．２００７，２８（８）：７９７−８０７．Ｋｏｚａｋｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５（２０）：８１２５−８１４８．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ．Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ，１９９３Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２Ｌ．ＷａｎｇａｎｄＩ．Ｖｅｒｍａ，１９９９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：３９０６−３９１０．Ｓｈｕｅｔａｌ，ＩＯＶＳ，Ｍａｙ２１０２Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏｅｔａｌ，ＧｅｎｅＴｈｅｒ，Ｊｕｌｙ２０１１，１８（７）：６３７−４５Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙｅｔａｌ，ＢＭＣＤｅｖ，Ｂｉｏｌ，Ｊａｎ２０１１，１１：３）Ｎｉｃｏｒｄｅｔａｌ，Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ，Ｄｅｃ２００７，９（１２）：１０１５−２３Ｌａｍｂａｒｄｅｔａｌ，ＰＬｏＳＯｎｅ，Ｏｃｔ．２０１０，５（１０）：ｅ１３０２５Ｃａｉｅｔａｌ，ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ．２０１０Ａｕｇ；９１（２）：１８６−９４Ｋａｃｈｉｅｔａｌ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，２００９（２０：３１−９Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９Ｓ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ，１９８８Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３Ｓｉｅｖｉｎｇ，Ｐ．Ａ．ｅｔａｌ，２００６．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０３（１０）：３８９６−３９０１．ａｌ−ＵｂａｉｄｉＭＲ，ｅｔａｌ．（１９９２），ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１１９：１６８１−１６８７ＢｏａｔｒｉｇｈｔＪＨ，ｅｔａｌ．（１９９７）ＭｏｌＶｉｓ３：１５ＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎＳ，ｅｔａｌ．（１９９９）ＧｅｎｅＴｈｅｒ６：９７３−９８５ＫｉｊａｓＪＷ，ｅｔａｌ．（２００２）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９９：６３２８−６３３３ＢｅｌｔｒａｎＷＡ，ｅｔａｌ，（２０１２Ｊａｎ）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１０９（６）：２１３２−７（Ｂｅｌｔｒａｎ２０１２）Ｗｅｉｓｓ，Ｅ．Ｒ．ｅｔａｌ，２００１．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ２１（２３）：９１７５−９１８４

発明の概要
一つの態様では、本発明は個体の網膜色素変性に伴う視覚喪失を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞（ｏｃｕｌａｒｃｅｌｌｓ）に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含む。

別の態様では、光受容体機能の喪失を防ぎ、進行を阻止し、または光受容体機能を上げることが必要な個体の光受容体機能の喪失を防ぎ、進行を阻止し、または光受容体機能を上げる方法が提供される。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

別の態様では、本発明は光受容体構造の向上が必要な個体の光受容体構造を向上する方法を提供する。本発明は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

さらに別の態様では、個体の外網状層（ＯＰＬ）異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の外網状層（ＯＰＬ）異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法が提供される。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

別の態様では、本発明は双極細胞のデンドライト収縮を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の双極細胞のデンドライト収縮を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。この方法は正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

別の態様では、双極細胞機能の喪失を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の双極細胞機能の喪失を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法が提供される。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

さらに別の態様では、本発明はニューロフィラメントの過剰発現により特徴付けられる軸索損傷を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体のニューロフィラメントの過剰発現により特徴付けられる軸索損傷を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

別の態様では、ＸＬＲＰを発症する危険性がある個体のＸＬＲＰを防ぐ方法が提供される。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含む。

さらに別の態様では、本発明は桿体（ｒｏｄ）および／またはＲ／Ｇ錐体（ｃｏｎｅ）オプシンの誤局在化を防ぎ、阻止し、または改善することが必要な個体の桿体および／またはＲ／Ｇ錐体オプシンの誤局在化（ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を防ぎ、阻止し、または改善する方法を提供する。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

別の態様では、本発明はＸ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）に伴うＯＰＬシナプス変化、双極細胞異常または内網膜異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体のＸ連鎖性網膜色素変性症に関連するＯＰＬシナプス変化、双極細胞異常または内網膜異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

さらに別の態様では、本発明はＸＬＲＰに伴うＯＮＬ厚の増加、または保存が必要な個体のＸＬＲＰに伴うＯＮＬ厚の増加、または保存方法を提供する。この方法は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つｒＡＡＶ、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含む。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

別の態様では、ＸＬＲＰを処置または防ぐ必要がある個体のＸＬＲＰを処置または防ぐ方法が提供される。この方法は、（ａ）ＸＬＲＰに罹患しているか、またはそれを発症する危険性がある個体を同定し；（ｂ）遺伝子型分析を行い、そしてＲＰＧＲ遺伝子の突然変異を同定し；（ｃ）非侵襲的網膜撮像および機能試験を行い、そして治療の標的にでき
る保持されている光受容体の領域を同定し；そして（ｄ）正常光受容細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌｓ）特異的遺伝子をコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に該遺伝子産物を発現するプロモーター配列の制御下に持つ組換えウイルス、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を個体に投与することを含み、これによりＸＬＲＰを防ぎ、進行を阻止し、または改善する。

別の態様では、本発明は正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物を提供する。

別の態様では、本発明は正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物の発現を向けるヒトＩＲＢＰまたはヒトＧＲＫ１プロモーターの制御下に持つ組換えＡＡＶ２／５偽型アデノ随伴ウイルスを、担体および注入に適する追加成分と配合して含む組成物を提供する。別の態様では、上記の任意の方法はこの組成物を使用する。

ｈＩＲＰＢプロモーター（配列番号：２）およびｈＲＰＧＲ１−ＯＲＦ１５遺伝子を包含するＡＡＶ２／５ベクターのプラスミドマップである。このプラスミド中のＩＲＢＰプロモーターは、ヒトＩＲＢＰ遺伝子の近位プロモーター領域の２４１ｂｐフラグメントである。ｈＧＲＫ１プロモーター（配列番号：３）およびｈＲＰＧＲ１−ＯＲＦ１５遺伝子を包含するＡＡＶ２／５ベクターのプラスミドマップである。ヒトＲＰＧＲバリアント配列番号：１（下）をコードする核酸配列、およびバリアントＢＫ００５７１１（Ｗｒｉｇｈｔ）配列番号：４（上）をコードする核酸配列のアライメントである。ヒトＲＰＧＲバリアント配列番号：５（上）のアミノ酸配列およびバリアントＢＫ００５７１１（Ｗｒｉｇｈｔ）配列番号：６（下）のアミノ酸配列のアライメントである。配列番号：５のｈＲＰＧＲバリアントのアミノ酸残基ａａ８４５−１０３９と、配列番号：５のバリアントＢＫ００５７１１のアミノ酸残基８４５−１０５２と、そしてさらにコンセンサス配列配列番号：７を形成する共通のアミノ酸とのアライメントを示す。アライメント中のコンセンサス配列は、非コンセンサスアミノ酸の位置にギャップを含んで現れる。

発明の詳細な説明
本発明は、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物の発現を向ける調節配列の制御下に持つ有効濃度の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、担体および注入に適する追加成分と配合して含んでなる種々の組成物およびそれを使用した処置法に関する。処置法は、目の障害およびそれに関連する付随状態を対象とする。

他に定義しない限り、本明細書で使用する技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解され、そして本出願で使用する多くの用語に対する一般的指針
を当業者に与える公開されている教科書を参照にすることにより、一般に理解されている意味と同じ意味を有する。以下の定義は明瞭性のためにのみ提供し、請求する発明を限定することを意図していない。

用語“ａ”または“ａｎ”は、１もしくは複数を指し、例えば「遺伝子（ａｇｅｎｅ）」は、１もしくは複数のそのような遺伝子を表すと理解される。このように用語“ａ”（または“ａｎ”）、「１もしくは複数」、および「少なくとも一つ」は本明細書では互換的に使用されている。本明細書で使用する用語「約」は、他に特定しない限り、与えた引例から１０％の変動を意味する。以下の記載に関して、本明細書に記載する各組成物は、本発明の方法の別の態様で有用であることを意図している。さらにまた、本明細書のこの方法に有用と記載された各組成物は、別の態様では、それ自体が本発明の態様である。本明細書の様々な態様は、「含んでなる」という言葉を使用して表現されているが、他の状況では関連する態様が「からなる」または「から本質的になる」という言葉を使用して解釈され、そして記載されることも意図している。

Ａ．哺乳動物個体
本明細書で使用する用語「哺乳動物個体」または「個体」には、特にヒトを含めこのような処置または予防の方法が必要な任意の哺乳動物を含む。そのような処置または予防が必要な他の哺乳動物には、イヌ、ネコまたは他の飼育動物、ウマ、家畜、ヒトではない霊長類を含む実験動物等がある。個体は雄または雌でよい。一つの態様では、個体はＲＰ、そしてより特別にはＸＬＲＰを罹患しているか、または発症する危険性がある。別の態様では、個体はＸＬＲＰの「キャリアー」であり、すなわち少なくとも一つのＸ染色体に少なくとも一つのＲＰＧＲ突然変異を有する。ＸＬＲＰはＸ連鎖性疾患であるので、通常は二つのＸ染色体を有する雌はＲＰＧＲ遺伝子の特異的な突然変異について同型接合体または異型接合体であるか、または各Ｘ染色体上のＲＰＧＲ遺伝子に異なる突然変異を有する複合異型接合体であり得る。ＲＰＧＲ遺伝子に一つの突然変異を含む唯一のＸ染色体を有する正常な雄は半接合体と呼ばれる。一つの態様では、ＸＬＲＰに罹患しているか、またはそれを発症する危険性がある個体は半接合体の雄である。別の態様では、ＸＬＲＰを罹患しているか、またはそれを発症する危険性がある個体は、同型接合体の雌または異型接合体の雌である。別の態様ではＸＬＲＰを発症する危険性がある個体にはＸＬＲＰの家族歴を有する個体、ＲＰＧＲ遺伝子に１もしくは複数の確認されている突然変異を有する個体、ＲＰＧＲ突然変異の雌のキャリアー（異型接合体の雌）の子孫、または両Ｘ染色体上にＲＰＧＲ突然変異を持つ雌の子孫を含む。

別の態様では、個体はＸＬＲＰの臨床的兆候を有する。ＸＬＲＰの臨床的兆候には、限定するわけではないが、周辺視覚の低下、中心（読み取り）視覚の低下、夜間視覚の低下、色覚の喪失、視力低下、光受容体機能の低下、色素変化を含む。さらに別の態様では、個体はすでにＸＬＲＰと診断されている。別の態様では個体はＸＬＲＰの臨床的兆候を未だ示していない。

さらに別の態様では、個体は１０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。別の態様では、個体は２０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。別の態様では、個体は３０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。別の態様では、個体は４０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。別の態様では、個体は５０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。別の態様では、個体は６０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。別の態様では、個体は７０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。別の態様では、個体は８０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。別の態様では、個体は９０％以上の光受容体傷害／喪失を有する。

Ｂ．ＸＬＲＰおよびＲＰＧＲ
一つの態様では、本明細書に記載する方法は網膜色素変性症（ＲＰ）の処置または防止
に関する。一態様では網膜色素変性症は、Ｘ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）である。ＸＬＲＰはＲＰの最も重篤な形態の一つであり、若年での発症（通常、１０歳以内）、そして疾患の急速な進行を示す。この疾患はＸ連鎖性なので、同型接合体の雌は稀であり、通常は小さな隔離集団で現れるだけである。すなわちこの疾患は主に雄に発症するが、キャリアー（異型接合体）の雌にも発症し、様々なレベルの網膜変性を表す。この疾患は家族間および内で広いスペクトラムの疾患重篤度を表す。

網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節物質（ＲＰＧＲ）はＸＬＲＰに関与する８１５ａａタンパク質である（非特許文献７および非特許文献１２、これらは引用により本明細書に編入する）。ＲＰＧＲ中の２９０より多い突然変異（ｈｔｔｐ：／／ｒｐｇｒ．ｈｇｕ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ／、および「ＲＰＧＲ突然変異および多型の要約」という表題の文書、これは引用により本明細書に編入する）がＸＬＲＰ患者の７０％より多くを占める。このタンパク質は、高度に保存されたグアニンヌクレオチド交換因子の特徴であるＲＣＣ−１様ドメインを含む。１９エキソンを含むＲＰＧＲの構成的転写物は、広範な組織で発現される（非特許文献６６、引用により本明細書に編入する）。ＲＰＧＲバリアントはＲＰＧＲ遺伝子のイントロン１５で終結する。別の末端エキソンは構成的エキソン１５およびイントロン１５の一部からなり、そしてＯＲＦ１５と呼ばれている。エキソン１からＯＲＦ１５によりコードされているこのタンパク質アイソフォームが一般的に光受容体で使用され、そして多数の疾患を生じる突然変異がＯＲＦ１５中に見出された（非特許文献６７、非特許文献３６および非特許文献６８、それぞれ引用により本明細書に編入する）。

一つの態様では、この方法は正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を使用する。本明細書で使用する用語「ＲＰＧＲ」は、以下に詳細に記載するように、完全長の遺伝子自体、または機能的フラグメントを称する。正常ＲＰＧＲ遺伝子をコードする核酸配列は、自然にＲＰＧＲ遺伝子またはその相同体を発現する任意の哺乳動物に由来することができる。別の態様では、ＲＰＧＲ遺伝子配列は、組成物が処置することを意図する同じ哺乳動物に由来する。別の態様では、ＲＰＧＲはヒトに由来する。別の態様では、ＲＰＧＲ配列はエキソン１からＯＲＦ１５を含む完全長のヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５クローンの配列である（非特許文献１２、引用により本明細書に編入する）。別の態様では、ＲＰＧＲ配列は配列番号１に示す配列である。別の態様ではＲＰＧＲ配列はＲＰＧＲＯＲＦ１５クローンの機能的フラグメントである。用語「フラグメント」または「機能的フラグメント」とは、必ずしも同じレベルの発現または活性ではないが、完全長クローンの機能を保持する任意のフラグメントを意味する。例えばＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５を表すが、反復領域が６５４ｂｐ短縮されたａｃＤＮＡは、マウスでＲＰＧＲ機能を再構成することが示されている（非特許文献６４、これは引用により本明細書に編入する）。ヒトの同様な機能的フラグメント、または他のＲＰＧＲ配列は、当業者により決定され得る。別の態様では、ＲＰＧＲはイヌに由来する。別の態様では、標的細胞中での発現を強化するために、特定の修飾がＲＰＧＲ配列に作成される。そのような修飾にはコドン最適化（例えば引用により本明細書に編入する特許文献１、２および３を参照にされたい）、および翻訳開始部位を囲む配列のコンセンサスＫｏｚａｋ配列：ｇｃｃＲｃｃＡＴＧＲへの転換がある。例えば非特許文献６９を参照にされたい。

本明細書で使用する用語「眼球細胞」とは目の中の、または目の機能に関連する任意の細胞を称する。この用語は、桿体、錐体および光感受性ガングリオン細胞または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む任意の光受容細胞を指すことができる。一つの態様では、眼球細胞は光受容細胞である。

Ｃ．ＡＡＶベクターおよび組成物
本発明の特定の態様では、ＲＰＧＲ核酸配列、またはそのフラグメントがウイルスベク
ターによる処置が必要な眼球細胞に送達され、そのベクターの多くは当該技術分野で知られており、そして利用可能である。眼球細胞への送達には、治療用ベクターは非毒性、非免疫原性で、産生し易く、しかもＤＮＡの保護と標的細胞への送達が効率的であることが望ましい。一つの特定の態様では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。別の態様では、本発明はＲＰＧＲ配列を適切なプロモーターの制御下に含んでなるアデノ随伴ウイルスベクターを含んでなる治療用組成物を提供する。一つの態様では、ＲＰＧＲ配列は配列番号１によりコードされる。

３０種より多くの自然に存在するＡＡＶの血清型を利用することができる。ＡＡＶキャプシド中に多くの天然のバリアントが存在し、眼球細胞に特に適する特性を持つＡＡＶの同定および使用が可能になる。ＡＡＶウイルスは通常の分子生物学的技法により操作することができ、免疫原性を最少とし、粒子の安定性および寿命を調整し（ｔｕｎｉｎｇ）、効率的に分解し、核への正確な送達などのために、これらの粒子をＲＰＧＲ核酸配列の細胞特異的送達に最適化することが可能である。

このようにＲＰＧＲの過剰発現は、ＲＰＧＲをコードする配列を含む組換え操作したＡＡＶまたは人工ＡＡＶによる送達を介して眼球細胞で達成することができる。ＡＡＶは比較的非毒性であり、効率的な遺伝子導入を提供し、そして具体的な目的に容易に最適化できるので、ＡＡＶの使用はＤＮＡの外因性送達の一般的様式である。ヒトまたはヒトではない霊長類（ＮＨＰ）から単離され、そして十分に特性決定されたＡＡＶの血清型の中で、ヒト血清型２は遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、これは種々の標的組織および動物モデルで効率的な遺伝子導入実験に広く使用されてきた。幾つかのヒトの疾患モデルに対して、ＡＡＶ２に基づくベクターの実験的応用の臨床試験が進行中であり、そしてそれには嚢胞性線維症および血友病Ｂのような疾患を含む。他のＡＡＶ血清型には限定するわけではないが、ＡＡＶ１，ＡＡＶ３，ＡＡＶ４，ＡＡＶ５，ＡＡＶ６，ＡＡＶ７，ＡＡＶ８およびＡＡＶ９がある。例えば引用により本明細書に編入する特許文献４を参照にされたい。

ベクターに集成するために望ましいＡＡＶフラグメントには、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３および高度可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、およびこれらのタンパク質をコードする配列を含む。これらのフラグメントは、様々なベクター系および宿主細胞で容易に利用することができる。そのようなフラグメントは単独で、他のＡＡＶ血清型配列またはフラグメントと組み合わせて、または他のＡＡＶまたは非ＡＡＶウイルス配列由来の要素と組み合わせて使用することができる。本明細書で使用する人工ＡＡＶ血清型には、限定せずに自然には存在しないキャプシドタンパク質を持つＡＡＶがある。そのような人工キャプシドは、選択したＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を、異なる選択したＡＡＶ血清型から、同じＡＡＶ血清型の非連続部分から、非−ＡＡＶウイルス源から、または非−ウイルス源から得ることができるヘテロロガス配列と組み合わせて使用して任意の適切な技法により作成することができる。人工ＡＡＶ血清型は、限定するわけではないが、偽型ＡＡＶ、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化」ＡＡＶキャプシドでよい。一つのＡＡＶのキャプシドがヘテロロガスなキャプシドタンパク質に置き換えられた偽型ベクターは、本発明に有用である。説明の目的で、ＡＡＶ２／５が以下に記載する実施例では使用される。好適な態様では、ＡＡＶはＡＡＶ２／５である。別の好適な態様では、ＡＡＶはＡＡＶ２／８である。例えば上で引用したＭｕｓｓｏｌｉｎｏｅｔａｌ．を参照にされたい。

一つの態様では、本明細書に記載する組成物および方法に有用なベクターは、最低でも選択したＡＡＶ血清型のキャプシド、例えばＡＡＶ５キャプシドまたはそのフラグメントをコードする配列を含む。別の態様では、有用ベクターは最低でも選択したＡＡＶ血清型
ｒｅｐタンパク質、例えばＡＡＶ５ｒｅｐタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列を含む。場合によりそのようなベクターはＡＡＶｃａｐおよびｒｅｐタンパク質の両方を含むことができる。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐの両方が与えられたベクターでは、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ配列が両方とも一つの血清型起源、例えば全てＡＡＶ５起源であることができる。あるいはｒｅｐ配列がｃａｐ配列を提供するものとは異なるＡＡＶ血清型に由来するベクターを使用することができる。一つの態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は別の起源から発現される（例えば別のベクター、または宿主細胞およびベクター）。別の態様ではこれらのｒｅｐ配列は異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列とインフレイムに融合されてキメラＡＡＶベクター、例えば特許文献５（引用により本明細書に編入する）に記載されているＡＡＶ２／８を形成する。

適切な組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本明細書で定義するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の血清型キャプシドタンパク質、またはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；最低でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびＲＰＧＲ核酸配列からなるミニ遺伝子；およびミニ遺伝子をＡＡＶキャプシドタンパク質にパッケージングできるようにする十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することにより産生される。ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶキャプシドにパッケージングするために、宿主細胞中で培養されるために必要な成分は、宿主細胞にトランスで提供することができる。あるいは１もしくは複数の必要な成分（例えばミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）は、当該技術分野で知られている方法を使用して１もしくは複数の必要な成分を含むように操作した安定な宿主細胞により提供することができる。

そのような安定な宿主細胞は、必要な構成要素（１もしくは複数）を誘導性プロモーターの制御下に含むことが最適である。しかし必要な構成要素（１もしくは複数）は構成的プロモーターの制御下でもよい。適切な誘導性および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子、すなわちＲＰＧＲと使用するために適する調節要素についての以下の考察で本明細書に提供される。さらに別の方法では、選択した安定な宿主細胞は選択した構成要素（１もしくは複数）を構成的プロモーターの制御下に、そして他の選択した構成要素（１もしくは複数）を１もしくは複数の誘導性プロモーターの制御下に含むことができる。例えば２９３細胞（これは構成的プロモーターの制御下にＥ１ヘルパー機能を含む）に由来する安定な宿主細胞を作成することができるが、これはｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を誘導性プロモーターの制御下に含む。さらに他の安定な宿主細胞が当業者により作成され得る。

本発明のｒＡＡＶを産生するために必要なミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、遺伝子要素上の配列を導入する任意の遺伝子要素の形態でパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝要素は本明細書に記載されているような方法を含め、任意の適切な方法により送達され得る。本発明の態様を構築するために使用する方法は、核酸の操作における当業者には知られており、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を含む。例えば非特許文献７０を参照にされたい。同様にｒＡＡＶビリオンを生産する方法も周知であり、そして適切な方法の選択は本発明を限定しない。例えばとりわけ非特許文献７１、および特許文献６を参照にされたい。これらの公報は引用により本明細書に編入する。

特に明記しない限り、本明細書に記載するＡＡＶＩＴＲおよび他の選択したＡＡＶ構成要素は、限定するわけではないが、ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ＡＡＶ３，ＡＡＶ４，ＡＡＶ５，ＡＡＶ６，ＡＡＶ７，ＡＡＶ８，ＡＡＶ９または他の既知の、および未知のＡＡＶ血清型を含む任意のＡＡＶ血清型の中から容易に選択することができる。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶ構成要素は、当業者が利用可能な技術を使用してＡＡＶ血清型の中から容易に単離することができる。そのようなＡＡＶは単離でき、あるいは学術的、商業的また
は公的な供給源（例えばバージニア州、マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション）から得ることができる。あるいはＡＡＶ配列は、例えば文献またはＧｅｎｅＢａｎｋ，ＰｕｂＭｅｄ等のようなデータベースのような公開された配列を参照することにより、合成または他の適切な手段を介して得ることができる。

ミニ遺伝子は、最低でも上記のＲＰＧＲ核酸配列（導入遺伝子）、およびその調節配列、および５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）からなる。一つの望ましい態様では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかし他の適切な血清型由来のＩＴＲも選択することができる。キャプシドタンパク質にパッケージングされ、そして選択した宿主細胞に送達されるのはこのミニ遺伝子である。

調節配列には、本発明で産生したベクターでトランスフェクトした細胞、またはウイルスで感染した細胞中で転写、翻訳および／または発現を可能とする様式で、ＲＰＧＲ遺伝子に操作可能に連結される通例の制御要素を含む。本明細書で使用する「操作可能に連結される」配列には、目的遺伝子に連続する発現制御配列、およびトランスに作用するか、または目的遺伝子の制御から離れた発現制御配列の両方を含む。

発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナルのような効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を強化する配列；および所望により、コードされた産物の分泌を強化する配列を含む。プロモーターを含む膨大な数の発現制御配列が当該技術分野で知られており、そして利用することができる。

本発明の構築物に有用な調節配列は、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と遺伝子との間に配置されたイントロンを含むことができる。一つの望ましいイントロン配列は、ＳＶ−４０に由来し、そしてＳＤ−ＳＡと呼ばれている１００ｂｐのミニ−イントロンスプライスドナー／スプライスアクセプターである。別の適切な配列にはウッドチャック肝炎ウイルス転写後要素（例えば非特許文献７２を参照にされたい）がある。ＰｏｌｙＡシグナルは限定するわけではないが、ＳＶ−４０、ヒトおよびウシを含む多くの適切な種に由来することができる。

本発明の方法で有用なｒＡＡＶの別の調節構成要素は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列または他の適切な系を、一つの遺伝子転写産物から１より多くのポリペプチドを産生するために使用することができる。１より多くのポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生するために、あるいは同じ細胞から、またはその中に二つの異なるタンパク質を発現するために、ＩＲＥＳ（または他の適切な配列）を使用する。一例のＩＲＥＳはポリオウイルス内部リボソーム侵入部位配列であり、これは光受容体、ＲＰＥおよびガングリオン細胞での導入遺伝子発現を支持する。好ましくはＩＲＥＳはｒＡＡＶベクター中の導入遺伝子の３’に位置する。

ｒＡＡＶ中で使用されることになるプロモーターの選択は、選択した導入遺伝子を所望する眼球細胞内に発現できる広範な数の構成的または誘導性プロモーターの中から行うことができる。別の態様では、プロモーターは細胞−特異的である。用語「細胞−特異的」とは、組換えベクター用に選択された特定のプロモーターが、選択した導入遺伝子の発現を特定の眼球細胞型の中へ向けることができることを意味する。一つの態様では、プロモーターは光受容細胞中での導入遺伝子の発現に特異的である。別の態様では、プロモーターは桿体細胞および錐体細胞中での発現に特異的である。別の態様では、プロモーターは桿体細胞中での発現に特異的である。別の態様では、プロモーターは錐体細胞中での発現に特異的である。別の態様では、プロモーターはＲＰＥ細胞中で導入遺伝子の発現に特異
的である。別の態様では、導入遺伝子は任意の上記眼球細胞内で発現される。

プロモーターは任意の種に由来することができる。別の態様では、プロモーターはヒトＧ−タンパク質共役受容体プロテインキナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーター（Ｇｅｎｅｂａｎｋ寄託番号ＡＹ３２７５８０）である。別の態様では、プロモーターはＧＲＫ１プロモーター（配列番号：２）の２９２ｎｔフラグメント（１７９３―２０８７位）である（また非特許文献６２も参照にされたい。これは引用により本明細書に編入する）。別の好適な態様では、プロモーターはヒト光受容体間レチノイド−結合タンパク質近位（ＩＲＢＰ）プロモーターである。一つの態様ではプロモーターはｈＩＲＢＰプロモーター（配列番号：３）の２３５ｎｔフラグメントである。別の態様では、プロモーターは発現される遺伝子に自然なプロモーターである。一つの態様では、プロモーターはＲＰＧＲ近位プロモーターである（非特許文献７３、これは引用により本明細書に編入する）。本発明に有用な他のプロモーターには、限定するわけではないが、桿体オプシンプロモーター、赤−緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、ｃＧＭＰ−β−ホスホジエステラーゼプロモーター、マウスオプシンプロモーター（上記で引用した非特許文献６２）、ロドプシンプロモーター（非特許文献７４）；錐体トランスデューシンのアルファ−サブユニット（非特許文献７５）；ベータホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター；網膜色素変性（ＲＰ１）プロモーター（非特許文献７６）；ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター（非特許文献７７）；ＲＰＥ６５プロモーター；網膜変性スロー／ペリフェリン２（Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈ２）プロモーター（非特許文献７８）；およびＶＭＤ２プロモーター（非特許文献７９）がある。これらの文書は引用により本明細書に編入する。一つの態様では、プロモーターはＡＡＶベクターのサイズ限界から、１０００ｂｐ未満の小サイズのものである。別の態様では、プロモーターは４００ｂｐ未満である。

本発明に有用な構成的プロモーターの例には、限定するわけではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを含む）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＢＡプロモーターと共役する前初期ＣＭＶエンハンサー（上に引用した非特許文献６２，６５）がある。

誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能とし、そして外から供給される化合物、温度のような環境因子、または特異的な生理学的状態の存在、例えば急性期、細胞の特定の分化状態、または複製している細胞のみにより調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、限定するわけではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含む様々な商業的供給元から入手できる。多くの他の系が記載され、そして当業者により容易に選択され得る。外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系；エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン−抑制系、テトラサイクリン−誘導系、ＲＵ４８６−誘導系およびラパマイシン−誘導系がある。本内容で有用となり得る他の種類の誘導性プロモーターは、特異的な生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製している細胞のみにより調節されるものである。厳しく調節され、しかも特定の標的眼球細胞型に特異的な任意の種類の誘導性プロモーターを使用することができる。

本発明に有用な他の調節配列は、エンハンサー配列を含む。本発明に有用なエンハンサー配列には、ＩＲＢＰエンハンサー（上に引用した非特許文献７６）、前初期サイトメガロウイルスエンハンサー、免疫グロブリン遺伝子に由来するもの、またはＳＶ４０エンハ
ンサー、マウス近位プロモーターに同定されるシス―作用要素（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）などを含む。

これらおよび他の一般的ベクターおよび調節要素の選択は通例であり、そして多くのそのような配列を利用することができる。例えば非特許文献７０およびその中に引用されている文献、例えば第３．１８−３．２６および１６．１７−１６．２７ページ、および非特許文献８０を参照にされたい。もちろん全てのベクターおよび発現制御配列が本発明の全ての導入遺伝子を等しく良好に発現するように機能するわけではない。しかし当業者は本発明の範囲から逸脱せずに、これらの、そして他の発現制御配列の中から選択を行うことができる。

Ｄ．製薬学組成物および投与
上記のように、標的眼球細胞で使用するために所望の導入遺伝子および細胞―特異的プロモーターを含む組換えＡＡＶは、通例の方法によりコンタミネーションを評価し、次いで網膜下注入を意図する製薬学的組成物に配合することが好ましい。そのような製剤には製薬学的および／または生理学的に許容され得る賦形剤または担体、生理食塩水または他のバッファーのような特に例えば網膜下注入により目に投与することが適するもの、例えば適切な生理学的レベルでｐＨを維持するためにＨＥＰＥＳ、および任意に他の薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、補助剤、希釈剤等の使用が関与する。注入には、担体は典型的には液体になる。例示的な生理学的に許容され得る担体には、滅菌された、発熱物質を含まない水、および滅菌された、発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水がある。そのような様々な既知の担体が、引用により本明細書に編入する特許文献７に与えられている。一つの態様では、担体は生理食塩水である。別の態様では、担体は緩衝塩溶液である。一つの態様では、担体はｔｗｅｅｎを含む。ウイルスが長期間、保存されることになるならば、グリセロールまたはＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結してもよい。

本発明の方法の特定の態様では、上記の製薬学的組成物は網膜下注入により個体に投与される。送達の経路としての網膜下注入の使用は、硝子体内の投与が現在、同じ治療効果を可能にできないので、本方法の重要な構成要素となる。

さらに本発明の特定の態様では、治療の標的となるべき保持されている光受容体の領域を同定するために、非侵襲的な網膜撮像および機能的実験を行うことが望ましい。このような態様では、臨床的な診断試験が採用されて、１もしくは複数の網膜下注入に関する正確な位置（１もしくは複数）を決定する。これらの試験には網膜電図法（ＥＲＧ）、視野測定法、網膜の層のトポグラフィカルマッピング（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｍａｐｐｉｎｇ）そして共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）および光干渉断層計（ＯＣＴ）によるその層の厚さの測定、補償光学（ＡＯ）を介する錐体密度のトポグラフィカルマッピング、機能的な目の試験などを含むことができる。これらの、および他の望ましい試験は以下の実施例に記載される。撮像および機能的実験の視点では、本発明の幾つかの態様において、保持されている光受容体の異なる領域を標的とするために、１もしくは複数の注入が同じ目に行われる。各注入の容量およびウイルス力価は、以下にさらに記載するように個別に決定され、そして同じ目または反対の目に行われる他の注入と同じでも異なってもよい。別の態様では、目全体を処置するために単回の大容量の注入がなされる。一つの態様では、ｒＡＡＶ組成物の容量および濃度は、傷害された光受容体の領域のみに影響を及ぼすように選択される。別の態様では、ｒＡＡＶ組成物の容量および／または濃度は、傷害を受けていない光受容体を含む目の大部分に到達するためにより大量となる。

組成物は、処置すべき領域のサイズ、使用するウイルス力価、投与経路、および方法の所望する効果に依存して、間の全ての数値を含む約５０μＬ〜約１ｍＬの容量で送達することができる。一つの態様では、容量は約５０μＬである。別の態様では、容量は約７０
μＬである。別の態様では、容量は約１００μＬである。別の態様では、容量は約１２５μＬである。別の態様では、容量は約１５０μＬである。別の態様では、容量は約１７５μＬである。さらに別の態様では、容量は約２００μＬである。別の態様では、容量は約２５０μＬである。別の態様では、容量は約３００μＬである。別の態様では、容量は約４５０μＬである。別の態様では、容量は約５００μＬである。別の態様では、容量は約６００μＬである。別の態様では、容量は約７５０μＬである。別の態様では、容量は約８５０μＬである。別の態様では、容量は約１０００μＬである。所望する導入遺伝子をコードする核酸配列を、細胞−特異的プロモーター配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルスの有効濃度は、望ましくは１ミリリットルあたり約１０⁸から１０¹³のベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の間の範囲である。ｒＡＡＶ感染単位は、特許文献８１に記載されているように測定される。好ましくは、濃度は約１．５ｘ１０⁹ｖｇ／ｍＬ〜約１．５ｘ１０¹²ｖｇ／ｍＬ、そしてより好ましくは約１．５ｘ１０⁹ｖｇ／ｍＬ〜約１．５ｘ１０¹¹ｖｇ／ｍＬである。一つの態様では、有効濃度は約１．５ｘ１０¹⁰ｖｇ／ｍＬである。別の態様では、有効濃度は約１．５ｘ１０¹¹ｖｇ／ｍＬである。別の態様では、有効濃度は約２．８ｘ１０¹¹ｖｇ／ｍＬである。さらに別の態様では、有効濃度は約１．５ｘ１０¹²ｖｇ／ｍＬである。別の態様では、有効濃度は約１．５ｘ１０¹³ｖｇ／ｍＬである。毒性、網膜異形成および剥離のような望ましくない影響の危険性を下げるために、最低有効濃度のウイルスを使用することが望ましい。さらにこれらの範囲中の他の投薬用量を、個体の、好ましくは処置するヒトの身体状態、個体の年齢、特定の目の障害および進行した場合に発症する障害の程度を考慮して、担当医師が選択できる。

Ｅ．処置／予防法
本発明は、上記の目の疾患およびそれに付随する網膜の変化を防ぎ、処置し、進行を阻止し、または改善する様々な方法を提供する。一般的に、この方法にはそれらが必要な哺乳動物個体に、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の眼球細胞に遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効量を投与することを含む。

ＲＰ、より詳細にはＸＬＲＰは多くの網膜変化に関連する。これらには光受容体構造または機能の喪失；外顆粒層（ＯＮＬ）の薄化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）または肥厚化；外網状層（ＯＰＬ）の薄化または肥厚化；破壊（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に続く桿体および錐体外節の喪失；桿体および錐体内節の短縮；双極細胞デンドライトの収縮；内顆粒層、内網状層、ガングリオン細胞層および神経線維層を含む内網膜層の薄化または肥厚化；オプシンの誤局在化；ニューロフィラメントの過剰発現；ＥＲＧ機能の喪失；視力およびコントラスト感度の喪失；および視覚誘導行動の喪失がある。一つの態様では、本発明はＸＬＲＰに伴う任意の網膜変化を防ぎ、進行を阻止し、または改善する方法を提供する。結果として個体の視覚が向上し、または視覚喪失が阻止され、かつ／または改善される。

特定の態様では、本発明は個体の網膜色素変性に伴う視覚の喪失を防ぎ、進行を阻止し、または改善する方法を提供する。網膜色素変性に伴う視覚の喪失とは、周辺視覚の低下、中心（読み取り）視覚の低下、夜間視覚の低下、昼間視覚の低下、色覚の喪失、コントラスト感度の喪失、または視力の低下を指す。

別の態様では、本発明は個体の光受容体機能の喪失を防ぎ、または阻止し、あるいは光受容体機能を上げる方法を提供する。光受容体機能は上記または以下の実施例に記載する機能的実験、例えば当該技術分野では通例のＥＲＧまたは視野測定法を使用して評価することができる。本明細書で使用する「光受容体機能の喪失」とは、正常な罹患していない目、またはより早い時点の同じ目と比べて、光受容体機能の低下を意味する。本明細書で
使用する「光受容体機能を上げる」とは、罹患している目（同じ目の疾患を有する）、以前の同じ目、同じ目の未処置部分、または同じ患者の反対側の目と比較して、光受容体の機能の改善、または機能的光受容体の数または割合の上昇を意味する。

別の態様では、本発明は個体の光受容体構造を改善する方法を提供する。本明細書で使用する「光受容体構造を改善する」（処置する網膜の領域の）とは、外顆粒層（ＯＮＬ）厚の増加または低下、あるいは全網膜、または中心網膜、もしくは周辺のＯＮＬの薄化もしくは肥厚化の進行の阻止；外網状層（ＯＰＬ）厚の増加または低下、あるいは全網膜、または中心網膜、もしくは周辺のＯＰＬの薄化もしくは肥厚化の進行の阻止；桿体および錐体内節（ＩＳ）短縮の減少；外節（ＯＳ）の短縮および喪失の減少；双極細胞デンドライト収縮の減少、または双極細胞デンドライト長または量の増加；およびオプシン誤局在化の逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）の１もしくは複数を指す。

別の態様では、本発明は外網状層（ＯＰＬ）の異常を防ぎ、進行を阻止し、または改善する必要がある個体の、外網状層（ＯＰＬ）の異常を防ぎ、進行を阻止し、または改善する方法を提供する。本明細書で使用するＯＰＬの異常を改善するとは、（処置する網膜の領域の）ＯＰＬ厚を上げる、または下げること、あるいは全網膜をわたる、中心網膜の、もしくは周辺のＯＰＬ厚の変化を阻止することを意味する。別の態様では、本発明は網膜色素変性症のＸ連鎖型（ＸＬＲＰ）に伴うＯＮＬ厚を上げ、下げ、または保護することが必要な個体の網膜色素変性症のＸ連鎖型に伴うＯＮＬ厚を上げ、下げ、または保護する方法を提供する。進行性のＯＮＬ薄化は、全ての種類の表現型のＸＬＲＰに共通し、そして異常なＯＮＬ肥厚化により進行することがある。本明細書で使用する「ＯＮＬ厚を上げ、下げ、または保護する」とは、ＯＮＬ厚が標準よりも薄ければそれを上げ、もしＯＮＬ厚が標準より厚ければそれを下げ、あるいは全網膜をわたる、中心網膜、もしくは周辺のＯＮＬ薄化の進行を阻止することを意味する。別の態様では、本発明は双極細胞のデンドライト収縮を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の双極細胞のデンドライト収縮を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。ＸＬＲＰの進行の過程で、双極細胞デンドライトは収縮し、そして光受容細胞に接続できなくなる。本発明者は、上記ｒＡＡＶ−ＲＰＧＲ構築物で処置した後に、双極細胞の傷害領域が新たなデンドライトを形成し、これが光受容細胞と接続し、そして機能を改善できるという驚くべき知見を得た。このように別の態様では、本発明は双極細胞機能の喪失を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の双極細胞機能の喪失を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。また双極細胞機能の強化は、改善された暗順応（桿体媒介型）ＥＲＧ−ｂ波の増幅も導く。別の態様では、本発明はＥＲＧにより記録される桿体細胞および錐体細胞に関するレセプター後の応答（ｐｏｓｔ−ｒｅｃｅｐｔｉｏｎａｌｒｅｓｐｏｎｓｅ）を改善する方法を提供する。別の態様では、本発明はニューロフィラメントの過剰発現により特徴付けられる軸索損傷を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体のニューロフィラメントの過剰発現により特徴付けられる軸索損傷を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。

別の態様では、本発明はＸ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）を発症する危険性がある個体のＸ連鎖性網膜色素変性症を防ぐ方法を提供する。ＸＬＲＰを発症する危険性がある個体には、ＸＬＲＰの家族歴を有する個体、ＲＰＧＲ遺伝子に１もしくは複数の確認されている突然変異を有する個体、ＲＰＧＲ突然変異の雌のキャリアー（異型接合体の雌）の子孫、または両Ｘ染色体上にＲＰＧＲ突然変異を持つ雌の子孫を含む。

別の態様では、本発明は桿体および／またはＲ／Ｇ錐体オプシンの誤局在化を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の桿体および／またはＲ／Ｇ錐体オプシンの誤局在化を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。正常な目では、ロドプシンおよびＲ／Ｇ錐体オプシンは主に桿体細胞外節の膜に見出されるが、ＸＬ
ＲＰを含む多くの網膜疾患および損傷では内節、ＯＮＬおよび／またはシナプス末端に誤局在化するようになる。

別の態様では、本発明は疾患後期の網膜下空間に食細胞の増加を防ぎ、阻止し、または改善する方法を提供する。引用により本明細書に編入する非特許文献２２を参照にされたい。

別の態様では、本発明はＸＬＲＰに伴うＯＰＬシナプス変化、双極細胞異常または網膜異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体のＸＬＲＰに伴うＯＰＬシナプス変化、双極細胞異常または内網膜異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法を提供する。ＯＰＬシナプス変化には、圧縮された光受容体シナプス末端に伴うＯＰＬの狭窄化（ｎａｒｒｏｗｉｎｇ）、および桿体および錐体末端でのＣｔＢＰ２−標識シナプスリボン数の減少を含む。双極細胞異常には、双極細胞デンドライトの収縮を含む。内網膜異常には、内網膜超肥厚化（ｈｙｐｅｒｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、桿体光受容体神経突起発芽、桿体双極細胞デンドライト収縮、上昇したＧＡＢＡ−免疫反応性アマクリン細胞、およびミュラーグリア細胞反応性の変化、カルビンディン抗体で標識できる水平細胞の軸索分岐の平坦化；ＧＡＢＡ抗体で標識できる内網膜状層（ＩＰＬ）の薄化および重層化の喪失（疾患後期で）がある。引用により本明細書に編入する上記非特許文献２２および非特許文献１６を参照にされたい。

記載した各方法について、処置を使用して網膜傷害の発生を防ぐか、または軽い、もしくは進んだ疾患をもつ目を救済することができる。本明細書で使用する用語「救済」とは、疾患が全盲へ進行することを防ぎ、傷害が非損傷光受容細胞に広がることを防ぎ、または損傷した光受容細胞の傷害を改善することを意味する。このように一つの態様では、組成物が疾患の発症前に投与される。別の態様では、組成物がオプシン誤局在化の開始後に投与される。別の態様では、組成物が光受容体喪失の開始前に投与される。別の態様では、組成物が光受容体喪失の開始後に投与される。さらに別の態様では、組成物は非疾患の目と比べて９０％未満の光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。別の態様では、組成物は８０％未満の光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。別の態様では、組成物は７０％未満の光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。別の態様では、組成物は６０％未満の光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。別の態様では、組成物は５０％未満の光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。別の態様では、組成物は４０％未満の光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。別の態様では、組成物は３０％未満の光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。別の態様では、組成物は２０％未満の光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。別の態様では、組成物は１０％未満光受容体が機能しているか、または残っている場合に投与される。一つの態様では、組成物が目の１もしくは複数の領域、例えば保持された光受容体を有する領域に投与される。別の態様では、組成物が目全体に投与される。

別の態様では、ＸＬＲＰを処置または防ぐ必要がある個体のＸＬＲＰを処置または防ぐ方法が提供される。この方法は、ＸＬＲＰに罹患しているか、またはそれを発症する危険性がある個体を同定し；遺伝子型分析を行い、そしてＲＰＧＲ遺伝子に少なくとも一つの突然変異を同定し；非侵襲的網膜撮像および機能試験を行い、そして治療の標的になる保持されている光受容体の領域を同定し；そして有効濃度の組成物を個体に投与することを含んでなり、これによりＸＬＲＰが防がれ、阻止され、または改善される。組成物は、正常な光受容細胞−特異的遺伝子をコードする核酸配列を、光受容細胞に遺伝子産物を発現するプロモーター配列の制御下に持つ組換えウイルスおよび製薬学的に許容され得る担体を含む。遺伝子型分析は当該技術分野では日常的であり、そしてＲＰＧＲ遺伝子の核酸配
列中に１もしくは複数の突然変異を同定するためにＰＣＲの使用を含む。例えばそれぞれ引用により本明細書に編入する非特許文献７、１２および６７を参照にされたい。

別の態様では、任意の上記方法が、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に遺伝子産物の発現を向けるＩＲＢＰまたはＧＲＫ１プロモーターの制御下に持つ組換えＡＡＶ２／５偽型アデノ随伴ウイルスを、担体および網膜下注入に適する他の追加成分と配合して含む組成物を使用して行われる。

本発明の別の態様では、この方法は処置の効力を測定するために機能的および撮像実験を行うことを含む。これらの実験には、以下の実施例に記載するようにＥＲＧおよびインビボ網膜撮像を含む。さらに視野実験、視野測定法および微小視野測定法（ｍｉｃｒｏｐｅｒｉｍｅｔｒｙ）、運動試験、視力、色覚試験を行うことができる。

本発明のさらに別の態様では、上記の任意の方法は別の、または二次的な治療と組み合わせて行われる。この治療は、ＸＬＲＰの防止、阻止または改善に役立つか、またはそれに付随する任意の上記効果に役立つ、現在知られている任意の、または未だ知られていない治療でよい。一つの態様では、二次的治療が毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である。引用により本明細書に編入する非特許文献８２。二次的治療は、上記ｒＡＡＶの投与前、それと同時または後に投与することができる。

以下の実施例で示すように、例のｈＲＰＧＲＯＲＦ１５をインビボの実験で使用して本発明の方法および組成物の用途および効力の証拠を提供する。実施例は、ヒト網膜症の多数の動物モデルを対象として、本発明の方法による網膜機能の回復を示した。実験では、ＲＰＧＲ変異体のイヌの欠損を、例となるベクターの使用により遺伝子送達で矯正することができた。網膜機能は、この盲目の大規模動物モデルで改善した。このデータから当業者は、この方法がヒトを含む他の個体のＸＬＲＰまたは他の種類の網膜疾患を処置するために同様に使用できると容易に想定できる。

Ｆ．実施例

材料および方法
ａ．ヒト個体および網膜断層像
ＸＬＲＰおよび分子的に確認されたＲＰＧＲＯＲＦ１５の突然変異を有する患者がこの試験に含まれた。正しい情報を伝えた上で同意を得た。手順はヘルシンキ宣言のガイドラインに従い、そして治験審査委員会に承認を得た。網膜断層像はスペクトラル−ドメイン光干渉断層計（ＳＤ−ＯＣＴ，ＲＴＶｕｅ−１００；ＯｐｔｏｖｕｅＩｎｃ．、フリーモント、カリフォルニア州）で得た。記録および分析技術は以前に公開された。

ｂ．動物
ＸＬＰＲＡ１およびＸＬＰＲＡ２疾患の構造的および機能的結果を定め、そして処置および結果の評価に関する段階を設定するために、我々は野生型（ｎ＝１７，週齢７−４１６ｗｋｓ）、ＸＬＰＲＡ１（ｎ＝９，週齢７−１５６ｗｋｓ）、およびＸＬＰＲＡ２（ｎ＝６，週齢８−１４４ｗｋｓ）のイヌを、非侵襲的撮像およびＥＲＧ実験に使用した。遺伝子治療には、交配した罹患しているイヌを使用した（以下の表１および２）。動物が関与する全ての手順は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ宣言およびＩＡＣＵＣ承認に従って行った。

ｃ．ｒＡＡＶベクター産生および精製
完全長のヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５をＡＡＶ２／５ウイルスベクターにクローン化し、そしてヒトＩＲＢＰまたはＧＲＫ１プロモーターにより制御した。ベクターのｃＤＮＡは、引用により本明細書に編入するＡｌａｎＷｒｉｇｈｔａｎｄｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（ＢＫ００５７１１）による（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＫ００５７１１）に公開された配列基づき、完全長のヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５クローンであった。しかしこの構築物に使用した配列（配列番号：１）は、Ｗｒｉｇｈｔ配列よりも高い安定性を現す。この構築物はエキソン１−ＯＲＦ１５を含み、そしてヒトリンパ球由来の１５ｂのエキソン１−部分（ヌクレオチド１６９−１９９０）、およびヒトゲノムＤＮＡ由来の１９９１−３６２７を段階的に増幅することによる３−ウェイライゲーションを使用して作成した。内部制限酵素部位Ｎｄｅｌ（ＣＡＴＡＴＧ）を、残基１９９３（Ａ＞Ｔ）で部位特異的突然変異誘発法により作成した。構築物に使用したＲＰＧＲＯＲＦ１５配列は、配列番号：１に示す。ＡｌａｎＷｒｉｇｈｔａｎｄｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（ＢＫ００５７１１）により公開された核酸配列と配列番号：１のアライメントを図３に与える（二つの核酸配列によりコードされる、並べた図４のアミノ酸配列、および図５に説明する部分的コンセンサス配列も参照にされたい）。次いでこれらのフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位にクローン化し、大腸菌Ｓｔｂ１４で増殖させ、そして配列をミシガン大学ＤＮＡ配列シークエンシングコアファシリティで確認した。

ヒトＧ−タンパク質共役受容体プロテインキナーゼ１（ｈＧＲＫ１）プロモーターを使用して、主にイヌの網膜中の桿体発現を１０¹¹ｖｇ／ｍｌの治療濃度に制御した；より高濃度（１０¹³）で幾つかの錐体に発現が生じたが、網膜への悪影響があった。桿体細胞および錐体細胞の両方の発現は、マウス近位プロモーター中に同定された重要なシス作用要素を含む２３５ｂｐのヒトＩＲＢＰプロモーターにより調節された。双方とも引用により本明細書に編入する非特許文献８３および８４を参照にされたい。このプロモーターを含むベクターは、用量および時間依存的様式で桿体細胞および錐体細胞の両方の中にＧＦＰ発現を生じる（Ｂｅｌｔｒａｎ２０１２の図Ｓ４、これは特許文献８の図８で再現される）。ベクターＤＮＡ配列は、ベクター産生前に正確さを確認した。

二つのプラスミドのコ−トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法を使用してＡＡＶ２／５ベクターを産生した（引用により本明細書に編入する非特許文献８５を参照にされたい）。ウイルス粒子を滴定し、そして０．０１４％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する緩衝塩溶液（ＢＳＳ，ＡｌｃｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，フォートワース、テキサス州）に、１ｍＬあたり１．５ｘ１０¹¹ウイルスベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の濃度で再懸濁した。無菌状態およびエンドトキシンが無いことは最終産物で確認した。

ｄ．網膜下注入および処置後の管理
網膜下注入は以前公開されたように全身麻酔下で行った（例えば非特許文献６２および非特許文献４７を参照にされたい。双方とも引用により本明細書に編入する）。注入した容量は、週齢／目の寸法に依存した：週齢５および２８ｗｋｓのマウスにそれぞれ７０μＬおよび１５０μＬ、右目に治療用ベクターを注入し、そして左目にＢＳＳを注入した。注入時、網膜下ブレブの位置および広がりを底の写真または図式による底の説明に記録した：すべての場合でブレブは平らになり、そして網膜は２４時間以内に再付着した。硝子体に逆流した失敗した網膜下注入が、１匹のイヌで見出され、このイヌは実験を通して維持され、潜在的治療効力および／または硝子体内経路による目の合併症を測定した。

ｅ．臨床的評価およびインビボ網膜像
眼科的調査は、注入終了の時間間隔を通して行った。正面および網膜断層撮像を全身麻酔下で行い、そしてＳＤ−ＯＣＴで網膜断層を記載されているように分析した（非特許文
献１６，２４，６０，６１、これら全て、引用により本明細書に編入する）。正面および網膜断層像は、全身麻酔下のイヌを用いて行った。３０°および５５°の直径のレンズを用いて、近赤外線照明（８２０ｎｍ）での重複する正面像反射を得（ＨＲＡ２またはＳｐｅｃｔｒａｌｉｓＨＲＡまたはＳｐｅｃｔｒａｌｉｓＨＲＡ＋ＯＣＴ，ハイデルベルグ、ドイツ）、視神経、網膜血管、注入ブレブの境界、網膜切開部位および他の位置の変化のような眼底所見を描写した。カスタムプログラム（ＭａｔＬａｂ６．５；ＴｈｅＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ネイテック、マサチューセッツ州）を使用して、個々の写真を網膜全体像の幅にデジタル縫合した。一組の目は、短波長（４８８ｎｍ）照明を使用してタペートおよび色素沈着ＲＰＥの境界を描写した。スペクトラル−ドメイン光干渉断層測定法（ＳＤ−ＯＣＴ）は、線形およびラスター走査を用いて行った（ＲＴＶｕｅ−１００，Ｏｐｔｏｖｕｅ，Ｉｎｃ．フレモント、カリフォルニア州、またはＳｐｅｃｔｒａｌｉｓＨＲＡ＋ＯＣＴ，ハイデルベルグ、ドイツ）。

線形走査は、高度に解像された局所網膜構造を得るためにブレブ境界のような問題の領域または形体にわたって配置した。大部分の断層網膜情報は、網膜の広い領域を網羅する重複ラスター走査から得た。６ｘ６ｍｍ（各５１３の縦方向反射プロファイル（ＬＲＰ）の１０１線、平均化なし、Ｏｐｔｏｖｕｅ）、または９ｘ６（各１５３６ＬＲＰの４９線、８−１０の平均、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ）を使用した。

ＯＣＴデータの獲得後処理は、カスタムプログラム（ＭａｔＬａｂ６．５；ＴｈｅＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ネイテック、マサチューセッツ州）を用いて行った。網膜幅のトポグラフィー分析には、各ラスター走査の統合後方散乱強度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｂａｃｋｓｃａｔｔｅｒｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を使用して、ＮＩＲ反射率像により形成された網膜幅のモザイク上に見える網膜の形体に関して、その正確な位置および方向を定めた。登録された全てのラスター走査を形成する個々のＬＲＰは、視神経が中心の直交座標系で規則的に間隔を空けたビン（１°ｘ１°）に割り当てられた：各ビン中にＬＲＰを並べ、そして平均化した。組織学的に定められる層に対応する網膜内ピークおよび境界は、各ＬＲＰに沿った後方錯乱シグナルの強度および傾斜情報の両方を使用して、マニュアルオーバライドで半自動的に分割した。具体的には網膜−硝子体界面、ＯＰＬ、外境界膜（ＯＬＭ）、内／外節（ＩＳ／ＯＳ）連結部付近のシグナルピークおよびＲＰＥを定めた。イヌの上網膜では、タペートからの後方散乱が最高強度のピークを形成し、そしてＲＰＥおよびＩＳ／ＯＳピークがタペートピークに対して硝子体に位置する。ＯＮＬ厚はＯＰＬのＯＬＭへの強膜化移行から定め、そしてＯＮＬ厚のトポグラフィー分析を算出した。さらにＩＳ／ＯＳ後方散乱強度のトポグラフィー分析は、ＩＳ／ＯＳピークの±８μｍ内の平均後方散乱強度を最初に測定し、そして次にこの値を、網膜−硝子体界面に強膜化した網膜の最初の７５μｍの平均後方散乱強度により標準化した。全てのトポグラフィー分析の結果について、血管、視神経ヘッドおよびブレブ境界の位置を参考に重ねた。さらなる定量的比較は、視神経ヘッドと交差する垂直軸に沿って、１０°幅のバンドのＯＮＬ厚をサンプリングすることにより行った。

ｆ．網膜電図法
イヌは一晩、暗−順応させ、前投薬し、そして記載のように麻酔かけた（非特許文献３；非特許文献８６、双方とも引用により本明細書に編入する）。瞳孔を、アトロピン（１％）、トロピカミド（１％）およびフェニレフリン（１０％）で広げた。脈拍数、酸素飽和および体温をモニターした。全界磁（ｆｕｌｌ−ｆｉｅｌｄ）ＥＲＧをＢｕｒｉａｎ−Ａｌｌｅｎ（ＨａｎｓｅｎＯｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ，アイオワシティ、アイオワ州）コンタクトレンズ電極およびコンピューターに基づくシステムで記録した。低エネルギー（１０μｓの期間；０．４Ｌｏｇｓｃｏｔ−ｃｄ．ｓ．ｍ−２）および高エネルギー（１ｍｓの期間；３．７Ｌｏｇｓｃｏｔ−ｃｄ．ｓ．ｍ−２）のホワイトフラッシュを暗−順応および明−順応（１Ｈｚの刺激で１．５ｌｏｇｃｄ．ｍ−２、２９Ｈｚの刺激で０
．８ｌｏｇｃｄ．ｍ−２）状態下で使用した。高エネルギーフラッシュ応答の先端を、４ｍｓの固定時点で測定し（引用により本明細書に編入する非特許文献３２）、桿体光受容体により支配される網膜機能を定量し、そして２９Ｈｚでの低エネルギーフラッシュのピーク対ピーク増幅を測定して錐体光受容体により支配される網膜機能を定量した。定性的および定量的測定を使用した視覚行動の評価は、処置した動物では行わなかった。それというのも実験した疾患状態では、両突然変異種（未処置）が正常から識別できないほど十分に桿体および錐体視覚機能を保持するからである。

ｇ．組織処理および形態学的評価
イヌは安楽死溶液（Ｅｕｔｈａｓｏｌ，Ｖｉｒｂａｃ，フォートワース，テキサス州）の静脈内注射により安楽死させ、そして眼球を摘出し、固定し、そして以前に記載されたように処理した（引用により本明細書に編入する非特許文献２２）。処置および未処置領域を包含する連続した１０μｍ厚の網膜低温切片を切り取り（〜７００／網膜）、そしてサブセットをＨ＆Ｅで染色し、血管ランドマークを使用して切片を正面ｃＳＬＯ像および続いて正面ＯＮＬマップ上に配置した。隣接区分での免疫組織化学は、桿体オプシン、ヒト錐体アレスチン（ＣｈｅｒｙｌＣｒａｆｔにより提供されたＬＵＭＩｆ；１／１００００），Ｒ／Ｇ−オプシン，ＲＩＢＥＹＥ／ＣｔＢＰ２，ＰＫＣα，Ｇｏα，カルビンディン、ニューロフィラメント（ＮＦ２００ｋＤａ）、およびＧＦＡＰに対する抗体を用いて行って、処置および未処置領域の分子マーカーの発現を調べた（それぞれ引用により本明細書に編入する上記非特許文献２２、および３５）。ヒトＲＰＧＲのＣ−末端ドメインに対する抗体（引用により本明細書に編入する非特許文献３３）も使用して処置した目の中の治療用導入遺伝子を同定した。抗原−抗体複合体は、蛍光標識二次抗体（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ，１：２００；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，ユージーン、オレゴン州、米国）で視覚化し、ＤＡＰＩを用いて細胞核を標識し、そしてデジタル画像を撮り（スポット４．０カメラ、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓスターリングハイツ、ミシガン州）、そして表示のためにグラフィックプログラムに取り込んだ（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ；Ａｄｏｂｅ，マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）。

ＲＰＧＲＯＲＦ１５の突然変異は、ヒトおよびイヌの光受容体変性を導く
光受容体のトポグラフィーは、断層ＯＣＴ網膜撮像を使用して外（光受容体）顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを測定することによりＲＰＧＲ−ＸＬＲＰの患者の網膜をわたりマッピングすることができる。特許文献８の図１Ａのように再現される非特許文献８７の図１Ａに示すように、正常な目（インセット：ｉｎｓｅｔ）ではＯＮＬ厚は中心にピークがあり、そして中心窩から離れるにつれて減少する。ＯＲＦ１５の突然変異があるＸＬＲＰ患者は、異なる疾患パターンを有する。普通のパターンは、検出できるが顕著に薄くなったＯＮＬのゾーンに囲まれた錐体がリッチな中心窩領域、およびその付近に比較的高いＯＮＬ厚を保持しながら劇的な光受容体の喪失を示す（特許文献８の図１Ａのように再現される非特許文献８７の図１Ａ）。またＲＰＧＲ疾患の発現は、中心の光受容体の喪失、および罹患しているものの、それでも良く保存されている周辺の光受容体により特徴付けられる一般には少ない表現型も含む（特許文献８の図１Ａのように再現される非特許文献８７の図１Ａ）。本実施例は以前の考察を考慮して、ヒトＲＰＧＲ−ＸＬＲＰ表現型のスペクトラムが存在し得ることを示す。ＥＲＧにより、ほとんどの表現型が錐体より多くの桿体の機能不全を有する。

我々はヒト患者で使用したように、２匹のイヌのモデルもまた断層網膜撮像で実験し、そしてトポグラフィーによる光受容体マップを作成し、そして正常なデータと比較できる（特許文献８の図１Ｂのように再現される非特許文献８７の図１Ｂ）。橋渡し（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）の重要性の中で、疾患パターンのスペクトラムがイヌのモデルでも生じる。例えばＸＬＰＲＡ１のイヌは、視覚線条（ｖｉｓｕａｌｓｔｒｅａｋ）の高い
光受容体密度に対応する視神経の直ぐ上の領域が比較的保存されたＯＮＬの薄化を示すことができる。対照的にＸＬＰＲＡ２光受容体マップの例は、網膜幅のＯＮＬ薄化パターンを示すが、視覚線条に対応する中心網膜での喪失が周辺網膜より顕著である。

光受容体の変性の自然な病歴は、ＸＬＰＲＡ１およびＸＬＰＲＡ２の処置のための年齢および網膜部位を選択するために測定された（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）。光受容体変性および疾患経過の時空分布は、垂直軸に沿ったＯＮＬ厚を定量することにより測定した（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）。野生型のイヌ（ＷＴ）（ｎ＝５、週齢７−４３ｗｋｓ）は、視神経上に３５°まで傾いてわずかに高い値（平均５７μｍ）の、そして視神経下に２５°まで傾いてわずかに低い値（平均５４μｍ）の比較的均一なＯＮＬ厚を表す。より若い週齢のＸＬＰＲＡ１（ｎ＝７、週齢７−２８ｗｋｓ）は、正常限界内または付近のＯＮＬ厚を表す（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）。老化したＸＬＰＲＡ１（ｎ＝６、週齢５６−７６ｗｋｓ）は、下網膜内にＯＮＬの薄化、および視神経の直ぐ上の視覚線条領域に相対的保存を表す（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃの括弧内）。より老齢のＸＬＰＲＡ１間の目ではより大きい差が存在し、幾つかの結果は正常の下限であり、そしてその他はＷＴの５０％未満の実質的なＯＮＬ喪失を示し（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）、以前に報告されたような疾患の変動性重篤度と一致する。

調査した最も若い週齢のＸＬＰＲＡ２で（ｎ＝２，週齢８、２２ｗｋｓ）、我々は視覚線条に対応する中心網膜（ＷＴの４４％）で、周辺（ＷＴの６０％）より大きくなる傾向がある網膜幅のＯＮＬ薄化を観察した（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）。より老化したＸＬＰＲＡ２のイヌ（ｎ＝３、週齢３６−５９ｗｋｓ）は、上の周辺網膜（ＷＴの４５％）よりも高い中心および下網膜疾患（ｉｎｆｅｒｉｏｒ
ｒｅｔｉｎａｌｄｉｓｅａｓｅ）（ＷＴの３０％）の傾向がある、より多くのＯＮＬ薄化を示す（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）。最も老化したＸＬＰＲＡ１およびＸＬＰＲＡ２の目のＯＮＬ厚は実質的に低下した（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）。ＸＬＰＲＡ１およびＸＬＰＲＡ２の若いおよび老化したイヌの桿体および錐体の網膜機能は、ＥＲＧにより測定した。ＸＬＰＲＡ１およびＸＬＰＲＡ２疾患の両方が、錐体機能不全よりも桿体機能不全を有すると特徴付けることができた。より若いＸＬＰＲＡ１の目（ｎ＝６）は、異常な（４／６）桿体機能を示したが、錐体機能は正常であり（特許文献８の図１Ｄのように再現される非特許文献８７の図１Ｄ）、一方、より老化したＸＬＰＲＡ１の目（ｎ＝７）は、異常な桿体（６／７）および錐体（５／７）を示した（特許文献８の図１Ｄのように再現される非特許文献８７の１Ｄ）。より若いＸＬＰＲＡ２の目（ｎ＝３）は桿体機能が異常だが、ほとんどが（２／３）正常な錐体機能を有し、しかしより老化したＸＬＰＲＡ２の目（ｎ＝６）は異常な桿体および錐体機能を有した（特許文献８の図１Ｄのように再現される非特許文献８７の１Ｄ）。ＸＬＰＲＡ１およびＸＬＰＲＡ２疾患の構造的および機能的な自然の病歴における差異を定めることは、ＲＰＧＲ−ＸＬＰＲ患者に関連し得る処置の概念実証実験で、イヌのモデルの使用を確認するために、イヌおよびヒトでの非侵襲的実験で十分な重複を示した。

遺伝子ノックダウンおよび置換法でのＸＬＰＲＡの処置−インビボの知見
突然変異したＲＰＧＲ遺伝子の影響を克服するためには、遺伝子ノックダウンおよび置換法が必要になると予想された。すなわち短いヘアピンＲＮＡはイヌの短縮化ＲＰＧＲＯＲＦ１５ｃＤＮＡを含む構築物にコードされ、これはＯＲＦ１５の反復領域からインフレイムの７０８ｂｐが除去されていた（ｃＲＰＧＲ_short）。追加のサイレント突然変異がｃＲＰＧＲ配列に含まれて、ｓｉＲＮＡに対してこの配列を強くした（ｈａｒｄｅｎ）
。

ｈＩＲＢＰプロモーターの制御下のｃＲＰＧＲ_shortｃＤＮＡ（ＡＡＶ２／５−ｈＩＲＢＰ−ｃＲＰＧＲ_short−ｓｈＲＮＡ５）の網膜下注入は、ＸＬＰＲＡ２のイヌで行った。処置は疾患の発症後、５週間で開始した。網膜異形成の重篤な網膜病変が、網膜下注入後、１７週で観察された。救済は見られなかった（表２）。

遺伝子オーギュメンテーション治療（ｇｅｎｅａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙ）でのＸＬＰＲＡの処置−インビボの知見
ｈＩＲＢＰ（ＡＡＶ２／５−ｈＩＲＢＰ−ｈＲＰＧＲ）（図１）プロモーターの制御下の完全長ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５ｃＤＮＡの網膜下注入は、ＸＬＲＰＡ１およびＸＬＰＲＡ２の両方に行い、そしてＸＬＰＲＡ２ではｈＧＲＫ１（ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１−ｈＲＰＧＲ）（図２）プロモーターの制御下で行った（表１）。ＸＬＰＲＡ１では、処置は光受容体喪失の２８週間前に開始し、そして７７ｗｋｓまで、変性の開始後も十分にモニターした（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）。ＸＬＰＲＡ２では、注入は５週齢で行い、そして実験を３８ｗｋｓで終了した。上記で検討した処置の失敗とは対照的に、完全長のヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５（ｈＩＲＢＰまたはｈＧＲＫ１プロモーターにより駆動される）は治療に有効であった。

特許文献８の図９のように再現される非特許文献８７の図Ｓ５に示すように、ｈＩＲＢＰプロモーターを持つＡＡＶ２／５ベクターは、桿体細胞および錐体細胞への発現を標的とすることを表す。この図は、ＡＡＶ２／５−ｈＩＲＢＰ−ｈＧＦＰの網膜下注入から２および８週間後の正常なイヌの網膜に、自然なＧＦＰ蛍光（緑）を示す。２ベクター力価の１５０μｌ注入を使用した。光受容体中のＧＦＰ蛍光は２ｗｋｓまでに現れ（Ａ１．Ａ２）、そして８ｗｋｓまで増加する（Ｂ１，Ｂ２）。形質導入されたより少ない錐体細胞を生じるより低用量のベクターで処置した網膜中の錐体アレスチンとの共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）により確認されるように、発現は桿体細胞および錐体細胞の両方に見出される（Ｃ）。より多くの光受容体がより高用量で標識され、そして発現は８週間の処置期間中、持続する。

正の処置応答がインビボで検出できた。ＸＬＰＲＡ１のイヌの処置した目は、上周辺網膜、特に未処置側と比べて網膜下注入領域（ブレブ）境界の処置側に、より厚いＯＮＬを有した（特許文献８の図２Ａのように再現される非特許文献８７の図２Ａ）。さらに光受容体の内および外節（ＩＳ／ＯＳ）領域に対応するシグナルピークは、処置した側でより強く、そして良く組織化された（特許文献８の図２Ａのように再現される非特許文献８７の図２Ａ）。ＸＬＰＲＡ２のイヌの処置した目は、処置した側により厚いＯＮＬを、またはＩＳ／ＯＳのレベルでより高い強度のシグナルを示した（特許文献８の図２Ａのように再現される非特許文献８７の図２Ａ）。処置したブレブと局所網膜構造との間の関係をより良く理解するために、ＯＮＬ厚を処置した目および対照の目の広い範囲（ｅｘｐａｎｓｅ）にわたってマップした（特許文献８の図２Ｂのように再現される非特許文献８７の図２Ｂ）。ＸＬＰＲＡ１のイヌＨ４８４は７６週齢で、上周辺網膜の処置ブレブ内にＯＮＬ保持の境界画定ゾーンを明らかに有した（特許文献８の図２Ｂのように再現される非特許文献８７の図２Ｂ）。上側頭網膜中のブレブの外側にＯＮＬ変性が存在した。この週齢のＸＬＰＲＡ１のイヌの中心網膜領域は、ほぼ正常なＯＮＬ厚を保持し（特許文献８の図１Ｃのように再現される非特許文献８７の図１Ｃ）、ブレブ境界をわたる移行はほとんど検出できなかった（特許文献８の図２Ｂのように再現される非特許文献８７の図２Ｂ）。

より小さい網膜下ブレブを持つＸＬＰＲＡ１のイヌＨ４８３は、ブレブ境界の内側にＯＮＬ厚保持の局所的証拠を有する上周辺領域で類似の知見を有した。さらに中心では、処
置および未処置領域の両方が、ほぼ正常なＯＮＬ厚を保持し、そしてブレブ境界に対応するＯＮＬ厚に変化はなかった（特許文献８の図２Ｂのように再現される非特許文献８７の図２Ｂ）。ＸＬＰＲＡ２のイヌＺ４１２は、ブレブ境界に対応する保存されたＯＮＬを含む領域を示した：ＯＮＬはこの境界の外側で異常に薄化した（特許文献８の図２Ｂのように再現される非特許文献８７の図２Ｂ）。２１から３６ｗｋｓまで長期の追跡で、処置した目のブレブの外側、およびＢＳＳを注入した対照の目でＯＮＬ変性の時間経過を示した（特許文献８の図５のように再現される非特許文献８７の図Ｓ１）。ＸＬＰＲＡ２のイヌＺ４１４は、ブレブ境界にほぼ対応するわずかなＯＮＬ厚の保存領域を示した（特許文献８の図２Ｂのように再現される非特許文献８７の図２Ｂ）。

光受容体ＩＳ／ＯＳのレベルで変化を定量した。この層での後方散乱強度を分画し、そしてマップした（特許文献８の図２Ｃのように再現される非特許文献８７の図２Ｃ）。処置した３匹のイヌ（Ｈ４８４，Ｈ４８３およびＺ４１２）のＩＳ／ＯＳ強度マップは、ＯＮＬマップに類似したので、保持されたＯＮＬ領域はより高い強度に対応した。Ｚ４１４の場合、処置した領域が実質的により高い後方散乱強度をＩＳ／ＯＳ層で示し、これは個々の走査で明白なより良い層の定義と一致した（特許文献８の図２Ａのように再現される非特許文献８７の図２Ａ）。処置およびＢＳＳ−注入対照の目の比較では、処置に関連する効果を有することが明らかに描写される網膜領域を示した（特許文献８の図２Ｃのように再現される非特許文献８７の図２Ｃ、ハッシュした）。眼内の非対称性と言う意味でＥＲＧを評価した（特許文献８の図２Ｄのように再現される非特許文献８７の図２Ｄ）。桿体細胞により支配される光受容体の応答、および桿体細胞および錐体細胞の両方により媒介されるレセプター後の（ｐｏｓｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒａｌ）双極細胞応答に関する３匹のイヌ（Ｈ４８４，Ｚ４１２およびＺ４１４）の処置した目におけるシグナルは、より大きかった。Ｈ４８３は最も変性しない網膜および標準的な増幅の応答を両側に有し（特許文献８の図２Ｄおよび６のように再現される非特許文献８７の図２ＤおよびＳ２）、これらは錐体細胞には対称的で、そして桿体細胞には非対称的であり、未処置の目には好ましかった。

これらの結果を以下の表１および表２にまとめる：

脚注：
ＢＳＳ−緩衝塩溶液；ＲＥ−右目；ＬＥ−左目；ＮＤ−行わず
¹ 処置から終了までの週齢期間（週で）。
² ５週齢で７０μｌ、２８週齢で１５０μｌの容量の網膜下注入。ＡＡＶ２／５ベクター注入は、１．５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価を有した。ＤｏｇＺ４１３は７０μｌを硝子体に注入し、そして対照とした。
³ 光干渉断層計（ＯＣＴ）により測定した、ブレブの外側と比べて注入ブレブ内で保持された外顆粒層（ＯＮＬ）の領域の存在；＋＝正の処置結果、−＝処置に対する応答なし。
⁴ ＯＣＴにより測定した、ブレのブ外側と比べて注入ブレブ内でより高い内節／外節（ＩＳ／ＯＳ）反射性の領域の存在。；＋＝正の処置結果，−＝処置に対する応答なし。
⁵ 桿体−または錐体―支配型網膜電図（ＥＲＧ）の増幅の眼内非対称
⁶ 光受容体（ＰＲ）。処置対未処置領域中の桿体細胞、錐体細胞および外顆粒層の構造、および桿体および錐体オプシンの誤局在化の逆転。Ｎ＝正常、救済；Ｄ＝疾患、救済なし；Ｐ＝部分救済。
⁷ 外網状層（ＯＰＬ）。光受容体のシナプス末端および双極細胞を標識する抗体を使用した免疫組織化学（ＨＩＣ）により測定した正常な延長双極デンドライトの存在を含む前−および後−シナプス末端構造。Ｎ＝正常、救済；Ｄ＝疾患、救済なし；Ｐ＝部分救済。
⁸ 内網膜リモデリングの逆転／保護。Ｎ＝正常、救済；Ｄ＝疾患、救済なし；Ｐ＝部分救済。
⁹ Ｃ−末端抗体で測定された処置領域中のｈＲＰＧＲ発現。桿体細胞および錐体細
胞に限定された標識、そして−（標識なし），＋１（弱い），＋２（中程度），および＋３（強い）と階級付けした。
¹⁰ 硝子体内対照を表す。

脚注：
Ｃ＝イヌ；ｈ＝ヒト；ＩＶ−硝子体内対照；ｍＯＰ＝最小オプシンプロモーター；ＣＢＡ＝ニワトリベータアクチンプロモーター⁶⁵。
^**処置領域内での弱い、および非均一ｈＲＰＧＲ発現、オプシン誤局在化の部分的回復。光受容体の救済は、網膜剥離、およびこれらの合併症に次ぐ早期終了により解釈されなかった。

ＸＬＰＲＡ２について、毒性機能獲得型⁶³であるという事前の仮説は、疾患を改善するために変異体ＲＰＧＲ発現をダウンレギュレートするという試みに導いた。インビトロでイヌＲＰＧＲ発現のダウンレギュレーションに効果的な二つのＫＤ試薬、ｓｈＲＮＡ３およびｓｈＲＮＡ５を使用したが、救済されなかった。ＲＰＧＲの同時置換では、ｓｈＲＮＡ５および５’６ｘＨｉｓタグを有する耐性が省略型⁶⁴のイヌＲＰＧＲｃＤＮＡを合わせた一つのウイルス構築物を使用した。高いベクター力価での網膜下処置は効力および網膜毒性を生じなかった。同様に網膜毒性は、Ｈｉｓタグを持たない省略型のイヌＲＰＧＲｃＤＮＡを用いたオーギュメンテーションのみにより観察された。

遺伝子オーギュメンテーションは、両ＸＬＰＲＡ遺伝子型で光受容体を救済し、そして桿体および錐体オプシンの誤局在化を逆転する
ブレブ境界を含む組織切片中の網膜形態の評価は、網膜下処置領域中のＯＮＬ厚の保持および光受容体保存のインビホ撮像結果を確認した（特許文献８の図３および７のように
再現される非特許文献８７の図３およびＳ３のパネル１−５）。硝子体内ベクター投与は、処置に匹敵しなかった（表１）。ＡＡＶ２／５−ｈＩＲＢＰ−ｈＲＰＧＲで処置した３匹のイヌＨ４８４，Ｈ４８３，Ｚ４１２）では、桿体および錐体のＩＳおよびＯＳ構造がブレブ境界内で正常であった。未処置領域ではＩＳが短く、そしてＯＳがまばらで、しかも不規則であった（特許文献８の図３および７のように再現される非特許文献８７の図３およびＳ３のパネル３，４）。ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１−ｈＲＰＧＲで処置したＺ４１４では、弱いがそれでも正の光受容体救済がブレブ領域で観察された（特許文献８の図７のように再現される非特許文献８７の図Ｓ３Ｃ）。ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５に対する抗体を用いた免疫標識では、処置領域の光受容体に限定された強固なｈＲＰＧＲタンパク質発現が検出された（表１）。標識は４匹のイヌのＩＳおよびシナプス末端全体に、ならびにＨ４８４の桿体および錐体の核周囲領域に見出された（特許文献８の図３および７のように再現される非特許文献８７の図３およびＳ３のパネル６−８）。最後に、ヒト、マウスおよびイヌの疾患の特徴である桿体および錐体オプシンの誤局在化は、ＡＡＶ２／５−ｈＩＲＢＰ−ｈＲＰＧＲで処置した３匹のイヌで逆転した（特許文献８の図３および７のように再現される非特許文献８７の図３およびＳ３のパネル９，１０，１１，１２，１３）。少ないがそれでも顕著な桿体およびＲ／Ｇ錐体オプシンの誤局在化が、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１−ｈＲＰＧＲで処置したＺ４１４で明らかであった（特許文献８の図７Ｃのように再現される非特許文献８７の図Ｓ３Ｃ）。

二次的ＯＰＬ、双極細胞および内網膜疾患の防止
ＸＬＰＲＡでは、他の一次光受容体疾患のような、ＯＰＬおよび内網膜異常が一般的な二次的影響である。未処置領域ではＯＰＬの狭窄が、圧縮された光受容体シナプス末端（特許文献８の図３および７のように再現される非特許文献８７の図３およびＳ３のパネル２，５）、そして桿体および錐体末端のＣｔＢＰ２−標識シナプスリボン数の減少（特許文献８の図４および８のように再現される非特許文献８７の図４およびＳ４のパネル１、２）に関係した。同時に桿体および錐体の双極細胞デンドライトが収縮した（特許文献８の図４および８のように再現される非特許文献８７の図４およびＳ４のパネル３、４）。これらの二次的変化は処置した領域には無く、保護されたＯＰＬを生じた。対照的に、水平およびアマクリン細胞のカルビンディン標識（特許文献８の図４および８のように再現される非特許文献８７の図４およびＳ４のパネル５，６）、およびそれらの外側突起（ｌａｔｅｒａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）は正常であり、そして処置と未処置領域との間で変化しなかった。ＸＬＰＲＡにおける後期網膜リモデリングのこのような顕著な特徴が、イヌを安楽死させた週齢で存在するとは予想されなかった。

処置および未処置領域の水平細胞のデンドライト末端、ならびにガングリオン細胞のデンドライト末端、および神経線維層は、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ２００ｋＤａ）に対する抗体で標識した時に正常に現れた。しかし小さい斑点のあるＮＦ２００染色がＯＮＬに存在した。ニューロフィラメントの過剰発現は、幾つかの神経変性疾患で軸索損傷の特徴であり、そしてこの、および他の網膜疾患で起こる。この知見は全てのイヌの未処置領域に限られ、そして処置領域では存在しないか、または少なかった（特許文献８の図４および８のように再現される非特許文献８７の図４およびＳ４のパネル５，６）。ＧＦＡＰ免疫標識は、増大したミュラーグリア反応性を表す未処置領域を明らかに描き出す一方、これは処置と未処置領域の間の移行ゾーンで減り、そしてブレブ領域では存在しなかった（特許文献８の図４および８のように再現される非特許文献８７の図４およびＳ４のパネル７，８）。まとめると、内網膜の救済は４匹の処置した目の３匹で完結した（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）；救済はＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１−ｈＲＰＧＲで処置した１匹については部分的で、この場合、桿体の神経突起発芽が内網膜まで広がり（表１）、そしてＮＦ２００標識パターンは正常と疾患との間の中間であった（特許文献８の図８Ｄのように再現される非特許文献８７の図Ｓ４Ｄ）。この結果は、両ＸＬＰＲＡ１およびＸＬＰＲＡ２で
ＲＰＧＲオーギュメンテーションを光受容体に標的化することが、一次光受容体欠損を正し、そしてＯＰＬおよび内網膜異常を防ぎ、または逆転するような有利な下流の効果を有することを明らかに示している。

考察
ＲＰＥ６５の突然変異による常染色体劣性ＲＰＥ疾患であるＬＣＡ２を処置するために、遺伝子置換療法を使用した最近の成功は、他の治癒不可能なヒトの網膜症を処置するために遺伝子治療を考える道を築いた。ＸＬＲＰは家系分析、キャリアーの同定を通して医院で確認できること、あるいはＲＰの男性の間だけに高頻度でＸＬＲＰが存在し；そしてＲＰＧＲＯＲＦ１５の突然変異がＸＬＲＰ患者の約７５％を占めているという事実により、処置するための候補疾患である。ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５−ＸＬＲＰの二つの大きな動物モデルで治療効果を示す本結果は、遺伝子オーギュメンテーション法が、この光受容体の繊毛病の実行可能な選択肢となり、そしてバルデー−ビードル症候群の繊毛病のマウスモデルにおいて成功裡の桿体救済を完全にすることを強く示唆している。

しかしヒトおよび動物モデルにおけるこの疾患は複雑さが無いわけではなく、そしてヒトの疾患の将来の治療には注意して取り組む必要があろう。例えば患者およびイヌのモデルの両方で疾患の発現に影響し得るモディファイヤーが存在し、そしてＲＰＧＲＸＬＲＰ家系間およびその中、およびイヌのＸＬＰＲＡ１モデルで表現型のスペクトラムが存在する。この表現型の多様性は、患者選択の潜在的障害となり得、そして治療の候補を定めるための基準として分子診断および患者の年齢以上のものが必要になることを指摘している。遺伝子型データの支援では、詳細な非侵襲型網膜撮像および機能実験を補足しなければならない。初期のヒトの処置法では、全ての表現型および全て疾患段階に合うように処置の計画を立てる衝動は抑えられるべきである。イヌの疾患は主に桿体＞錐体変性であり、中心の網膜変性がある重篤なＸＬＰＲＡ２および中心の網膜が保護されたより軽度なＸＬＰＲＡ１の両方を、桿体細胞および錐体細胞の両方を標的とするベクターを使用して処置することに効力があった。イヌの疾患スペクトラムには含まれないが、軽度の錐体＞桿体または錐体形成異常のような特定のヒトＲＰＧＲ−ＸＬＲＰ表現型が存在する。患者の中には大変限られた、または正常でさえある桿体機能を表すことができる者もおり、そして錐体標的化法はこのようなサブタイプにも開発されなければならない。錐体の疾患を標的とした原理証明実験は、錐体の光伝達またはサイクリックＧＭＰチャンネル遺伝子に突然変異を持つマウスおよびイヌのモデルの両方で既に成功しており、臨床への橋渡しが促進されることになる。

報告された表現型の家族内変動は、参加者の全家系を排除も含みもしないが、個々の患者の表現型の完全な分類の場合に強みを増す。さらに本実験では極めて中心の網膜を標的とするための試みは無かった：イヌで使用する場合に、中心外の網膜下での取り組みは、現在の考察に基づいて早期のヒト臨床試験に助言を与えることができる方法となろう。しかし多くのＲＰＧＲ患者が持続した中心窩錐体細胞の残存、および損傷されているが有用な視力を疾患後期に示す。ベクター−遺伝子の中心窩下注入は、罹患した中心窩錐体細胞の喪失を引き起こすことが示され、治療用遺伝子送達の代替手段が考察されるべきである。外網膜を処置するために、例えば変異体ＡＡＶキャプシドベクターを使用した硝子体内送達系の進歩により、残存する中心窩錐体細胞の処置における安全性の憂慮も最終的に軽くすることができるだろう。

ＲＰＧＲ−関連疾患が一般的で、しかも概して重篤であることは明らかだが、遺伝子の機能、および突然変異と疾患との間の関係は十分に解明されていない。ＲＰＧＲは多数の組織−／細胞−特異的アイソフォームを持つ複雑なスプライシングパターンを有し、多数の毛様体タンパク質と相互作用することが知られ、小ＧＴＰａｓｅＲＡＢ８Ａのグアニン
ヌクレオチド交換因子として作用し、そして脊椎動物の発生に役割を果たすことができる。そのような複雑さが、疾患の表現型における変動性の原因の一部かもしれない。一般に、機能喪失または機能獲得のメカニズムが提案され、それぞれ異なる治療的取組を必要とすることが示唆された。我々の本実験は、疾患の原因としていずれのメカニズムも排除することはできないが、結果は、イヌのＯＲＦ１５突然変異モデルにおいて、明らかに遺伝子オーギュメンテーションが単独で疾患の防止、または進行の阻止、および変性プロセスの逆転に効果的であることを示している。このような基本的知見が、我々を橋渡し実験に向けて治療的に前進させ、同時に特異的な疾患メカニズムがさらに解明されることを待つようにする。

我々の結果は、治療を桿体および錐体の光受容体に標的化することが、ＲＰＧＲ関連網膜疾患の機能的および構造的救済に必須であると強調している。治療遺伝子の発現を調節するｈＩＲＢＰプロモーターは、両細胞型でレポーターおよび治療遺伝子の強固な発現をもたらし（特許文献８の図９，２および７のように再現される非特許文献８７のそれぞれ図Ｓ５および図３およびＳ３のパネル６−８）、そして発現は持続する。ＩＲＢＰもヒトの錐体で発現するので、我々は将来の橋渡し実験ではこのプロモーターを用いて桿体細胞および錐体細胞の効率的標的化を期待する。ｈＧＲＫ１プロモーターにより調節される場合、治療用の導入遺伝子発現は桿体細胞で低く、そして錐体細胞ではより程度が低い。残る光受容体構造は異常でも、未処置領域よりはかなり改善された。しかしＧＲＫ１はヒトの錐体細胞で発現するので、我々はＧＲＫの標的化効率はヒトで上がると期待する。例えば引用により本明細書に編入する非特許文献８８を参照にされたい。

ＸＬＰＲＡ１では、疾患発症前の処置が疾患の発症を防いだ。さらに疾患発症後、そして同時に光受容細胞の死後にＸＬＰＲＡ２の処置を進めると（ＴＵＮＥＬ標識により測定した５ｗｋｓで、細胞死が〜５０％の最大率）、疾患の進行を阻止し、そして残る光受容体の形態は正常に回復した。少なくとも実験した疾患の段階で、この治療ベクターは高度に効果的であり、そして橋渡し的応用のさらなる実験を保障する。両モデルで、ｈＩＲＰＢ−ｈＲＰＧＲ治療ベクターを用いた処置は、ヒト、マウスおよびイヌの疾患の特徴である桿体およびＲ／Ｇ錐体オプシンの誤局在化、および光受容細胞死の推定初期マーカーを防ぎ（ＸＬＰＲＡ１）または逆転した（ＸＬＰＲＡ２）。

光受容体変性の特徴的形体は、ＯＰＬ、双極細胞および内網膜層で進行的に変化する。これらは未処置領域で広がるが、特にＡＡＶ２／５−ｈＩＲＰＢ−ｈＲＰＧＲベクターが使用された場合に処置領域では正常に逆転した。リモデリングの防止は、疾患の発症前にＸＬＰＲＡ１網膜を処置すると起こり、一方、ＸＬＰＲＡ２では、初期ＯＰＬシナプス変化、双極細胞異常、および内網膜異常が処置で抑制され、そして正常な構造が続いて生じた。このように一次光受容体欠損の処置は、ＯＰＬおよび内網膜異常が防止または逆転されたように有益な下流の効果を有する。これは４匹の処置したイヌのうち３匹で記録された、改善されたレセプター後応答の理由となり得る。将来的に実験は、未処置領域の変性が、瞳孔測定および視覚誘発電位の使用、および最終的に視覚行動を用いるような視覚脳（ｖｉｓｕａｌｂｒａｉｎ）で処置の結果を試験できるようになる高齢まで処置後の追跡期間を延ばすべきである。ＸＬＰＲＡのイヌモデルを対象とした、ＡＡＶ２／５ベクターを含むＲＰＧＲＯＲＦ１５−ＸＬＲＰおよび完全長のヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５ｃＤＮＡの網膜下処置は、光受容体構造および機能の保護に効果的であった。

ＲＰＧＲ−ＸＬＲＰの矯正的遺伝子治療は中期疾患のイヌモデルを救済する
本発明者は次に、より進んだ疾患段階で送達される遺伝子治療でも正の結果を与えることができるかどうかを調査した。完全長のヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５ｃＤＮＡをｈＩＲＢＰプロモーターの制御下に持つＡＡＶ２／５ベクター構築物（力価：１．５１ｘ１０¹¹ｖ
ｇ／ｍｌ）を、３匹の１２−ｗｋ齢ＸＬＰＲＡ２のイヌに網膜下注入した。その週齢で、進行性の細胞死があり、そしてＯＮＬ厚が〜４０％まで低下する。さらに１匹のＸＬＰＲＡ２のイヌには早期疾患段階の対照として疾患の発症直後（週齢５．１ｗｋｓ）に注入した。反対側の目にはＢＳＳが注入されるか、または同様の用量のウイルス構築物を硝子体内に受けるかのいずれかであった。光受容体構造および機能は、３９および４２週齢でそれぞれ非侵襲的な網膜撮像（ｃＳＬＯ／ＳＤ−ＯＣＴ）およびＥＲＧにより評価した。

インビボ網膜撮像では、処置した網膜領域に保存されたＯＮＬ厚を示した。桿体および錐体ＥＲＧ機能は、対照よりも処置した目で高かった。両ＯＮＬ厚およびＥＲＧ応答は、１２週齢で注入した３匹のイヌよりも５．１週で処置した動物で良く保存された。

これらの結果は、光受容体構造および網膜機能に及ぼす持続的かつ有益な効果が、ＸＬＲＰ疾患の中期段階にＲＰＧＲ遺伝子オーギュメンテーションを送達した場合にも達成できることを示している。このことは患者が処置の時点でより進行した疾患を有するであろうと仮定すると、重要な橋渡し的応用を有する。

さらに説明しなくても、当業者は前述の説明および説明の実施例を使用して本発明の組成物を作成し、そして利用することができ、そして特許請求する方法を実施することができると考える。本発明を様々な具体的材料、手順および例を参照して本明細書に記載し、そして説明してきたが、本発明をその目的に選択された材料および手法の特定の組み合わせに限定することを意図しない。そのような詳細の多くの変形を当業者に想定されるように含むことができる。

非特許文献８７および特許文献８、ならびにすべての特許、特許出願および他の参考文献は、本明細書で引用する配列表を含め、それら全部、引用により本明細書に編入する。

Claims

個体の網膜色素変性症に伴う視覚喪失を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、該個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
光受容体機能の喪失を防ぎ、阻止し、または光受容体機能を上げることが必要な個体の光受容体機能の喪失を防ぎ、阻止し、または光受容体機能を上げる方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、該光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
光受容体構造の向上が必要な個体の光受容体構造を向上する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、該光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
外網状層（ＯＰＬ）異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の外網状層（ＯＰＬ）異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、該個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
双極細胞のデンドライト収縮を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の双極細胞のデンドライト収縮を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
双極細胞機能の喪失を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の双極細胞機能の喪失を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
ニューロフィラメントの過剰発現により特徴付けられる軸索損傷を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体のニューロフィラメントの過剰発現により特徴付けられる軸索損傷を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
Ｘ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）を発症する危険性がある個体のＸ連鎖性網膜色素変性症を防ぐ方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
桿体および／またはＲ／Ｇ錐体オプシンの誤局在化を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体の桿体および／またはＲ／Ｇ錐体オプシンの誤局在化を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
Ｘ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）に伴うＯＰＬシナプス変化、双極細胞異常または内網膜異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善することが必要な個体のＸ連鎖性網膜色素変性症に伴うＯＰＬシナプス変化、双極細胞異常または内網膜異常を防ぎ、その進行を阻止し、または改善する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
網膜色素変性症のＸ連鎖型（ＸＬＲＰ）に関連するＯＮＬ厚の変化を防ぎ、阻止し、または改善することが必要な個体の網膜色素変性症のＸ連鎖型に関連するＯＮＬ厚の変化を防ぎ、阻止し、または改善する方法であって、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
組成物が網膜下注入により投与される請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
核酸配列がＲＰＧＲエキソン１からＯＲＦ１５をコードする請求項１ないし１２のいずれかに記載の方法。
核酸配列が配列番号１によりコードされる請求項１ないし１３のいずれかに記載の方法。
調節配列がＩＲＢＰプロモーターを含んでなる請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。
調節配列がＧＲＫ１プロモーターを含んでなる請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。
個体が網膜色素変性症に罹患しているか、それを発症する危険性がある請求項１ないし１６のいずれかに記載の方法。
網膜色素変性症がＸ連鎖型である請求項１８に記載の方法。
ＡＡＶが偽型ＡＡＶである請求項１ないし１８のいずれかに記載の方法。
ＡＡＶがＡＡＶ２／５偽型ＡＡＶである請求項１９に記載の方法。
組成物が疾患の発症前に投与される請求項１に記載の方法。
組成物が光受容体喪失の開始後に投与される請求項１に記載の方法。
組成物が、光受容体の４０％未満が機能しているか、残っている時に投与される請求項２２に記載の方法。
有効濃度が１ミリリットルあたり１０⁹から１０¹³の間のベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）である請求項１ないし２３のいずれかに記載の方法。
有効濃度が約１．５ｘ１０¹¹ｖｇ／ｍＬである請求項２４に記載の方法。
組成物が５０μＬ〜１ｍＬの容量で投与される請求項１ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
組成物が１５０μＬの容量で投与される請求項２６に記載の方法。
組成物が４５０μＬの容量で投与される請求項２６に記載の方法。
製薬学的に許容され得る担体が生理食塩水を含んでなる請求項１ないし２８のいずれか１項に記載の方法。
製薬学的に許容され得る担体がｔｗｅｅｎを含んでなる請求項１ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
遺伝子が個体の桿体細胞で発現される請求項１ないし３０のいずれか１項に記載の方法。
遺伝子が個体の錘体細胞で発現される請求項１ないし３０のいずれか１項に記載の方法。
遺伝子が個体の桿体細胞および錘体細胞で発現される請求項１ないし３０のいずれか１項に記載の方法。
組成物が二次的治療と組み合わせて投与される請求項１ないし３３のいずれか１項に記載の方法。
二次的治療が毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である請求項３４に記載の方法。
組成物の投与が少なくとも１回、同じ目および／または反対側の目で繰り返される請求項１ないし３５のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）を処置または防ぐ必要がある個体のＸ連鎖性網膜色素変性症を処置または防ぐ方法であって：
（ａ）ＸＬＲＰを罹患しているか、またはそれを発症する危険性がある個体を同定し；
（ｂ）遺伝子型分析を行い、そして網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節物質（ＲＰＧＲ）遺伝子の突然変異を同定し；
（ｃ）非侵襲的網膜撮像および機能試験を行い、そして治療の標的にできる保持されてい
る光受容体の領域を同定し；
（ｄ）正常光受容細胞特異的遺伝子をコードする核酸配列を、該光受容細胞に該遺伝子産物を発現するプロモーター配列の制御下に持つ組換えウイルス、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物の有効濃度を該個体に投与する
ことを含んでなり、
該ＸＬＲＰが防がれ、阻止され、または改善される上記方法。
個体が半接合体の雄、同型接合体の雌および異型接合体の雌から選択される請求項１ないし３７項のいずれか１項に記載の方法。
組成物が、正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、該眼球細胞に該遺伝子産物の発現を向けるＩＲＢＰプロモーターの制御下に持つ組換えＡＡＶ２／５偽型アデノ随伴ウイルスを、担体および網膜下注入に適する他の追加成分と配合して含んでなる、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
正常ＲＰＧＲ遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸配列を、該個体の光受容細胞に該遺伝子産物を発現する調節配列の制御下に持つ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物。
核酸配列がＲＰＧＲエキソン１からＯＲＦ１５をコードする請求項４０に記載の組成物。
核酸配列が配列番号１によりコードされる請求項４０に記載の組成物。
調節配列がＩＲＢＰプロモーターを含んでなる請求項４０ないし４２のいずれか１項に記載の組成物。
調節配列がＧＲＫ１プロモーターを含んでなる請求項４０ないし４２のいずれか１項に記載の組成物。
ＡＡＶが偽型ＡＡＶである請求項４０ないし４４のいずれか１項に記載の組成物。
ＡＡＶがＡＡＶ２／５偽型ＡＡＶである請求項４５に記載の組成物。
請求項１ないし３９のいずれかに記載の方法に使用するための請求項４０ないし４６のいずれかに記載の組成物。