JPH0815437B2 - 自動化核酸抽出方法及び装置 - Google Patents
自動化核酸抽出方法及び装置Info
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- JPH0815437B2 JPH0815437B2 JP61005181A JP518186A JPH0815437B2 JP H0815437 B2 JPH0815437 B2 JP H0815437B2 JP 61005181 A JP61005181 A JP 61005181A JP 518186 A JP518186 A JP 518186A JP H0815437 B2 JPH0815437 B2 JP H0815437B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は核酸の細胞からの単離及び精製に関し、特に
その様な単離を自動的に達成する装置に関する。
その様な単離を自動的に達成する装置に関する。
in vitroでの核酸の操作における第一の工程の一つは
それらの単離を含むものであり、例えば遺伝病の試験を
行うために比較的純粋なゲノムDNAの試料が必要とさ
れ、又、組換え技術はベクターDNA及びクローン化され
るDNAの両者の単離を必要とする。
それらの単離を含むものであり、例えば遺伝病の試験を
行うために比較的純粋なゲノムDNAの試料が必要とさ
れ、又、組換え技術はベクターDNA及びクローン化され
るDNAの両者の単離を必要とする。
一般的にDNAは細胞内に遊離分子としては存在せずDN
A,RNA及び蛋白質の複雑な会合物として存在する。これ
はDNAの細胞の遺伝的青写真としての役割の結果であ
る。遺伝情報を発現するためにDNAはメッセンジャーRNA
の産生のための鋳型として用いられこのメッセンジャー
RNAはリボゾームにより蛋白質に翻訳される。遺伝子発
現のプロセスに直接関連する蛋白質例えばRNAポリメラ
ーゼ及び正常蛋白質はDNAとin vivoで相互作用して核−
蛋白質複合体を形成する。DNAポリメラーゼ、DNAリガー
ゼ、各種巻戻し及びスーパーコイル化酸素、組換え及び
修復酵素及びDNA複製の開始或いは維持に関連する蛋白
質も又in vivoでDNAと会合し、それにより純粋DNAの単
離を複雑化している。このDNAのこれらのその他の蛋白
質及び核酸との複雑な会合のためにDNAを得るための精
製（単離）手法は一般的に次の三段階のプロセスに考え
ることができる：（１）崩壊細胞壁及び膜からの可溶性
高分子量DNAの放出、（２）蛋白質変成或いは蛋白質分
解によるDNA−蛋白質複合体の分解、及び（３）その他
の高分子からのDNAの単離。
A,RNA及び蛋白質の複雑な会合物として存在する。これ
はDNAの細胞の遺伝的青写真としての役割の結果であ
る。遺伝情報を発現するためにDNAはメッセンジャーRNA
の産生のための鋳型として用いられこのメッセンジャー
RNAはリボゾームにより蛋白質に翻訳される。遺伝子発
現のプロセスに直接関連する蛋白質例えばRNAポリメラ
ーゼ及び正常蛋白質はDNAとin vivoで相互作用して核−
蛋白質複合体を形成する。DNAポリメラーゼ、DNAリガー
ゼ、各種巻戻し及びスーパーコイル化酸素、組換え及び
修復酵素及びDNA複製の開始或いは維持に関連する蛋白
質も又in vivoでDNAと会合し、それにより純粋DNAの単
離を複雑化している。このDNAのこれらのその他の蛋白
質及び核酸との複雑な会合のためにDNAを得るための精
製（単離）手法は一般的に次の三段階のプロセスに考え
ることができる：（１）崩壊細胞壁及び膜からの可溶性
高分子量DNAの放出、（２）蛋白質変成或いは蛋白質分
解によるDNA−蛋白質複合体の分解、及び（３）その他
の高分子からのDNAの単離。
このプロセス内において、細菌起源のDNA（原核生物D
NA）はDNAが染色体であるか或いはプラスミド或いはバ
クテリオファージなどの染色体外のものであるかに応じ
て異った方法により典型的に精製される。染色体DNAの
精製においては細菌細胞壁は一般的に凍結−融解により
或いは酵素リゾチーム及びキレート化剤エチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）による処理により一般的に弱められ
る。細胞溶解は緩衝化された塩溶液中におけるドデシル
硫酸ナトリゥム（SDS）などの洗剤の添加により達成さ
れる。溶解に続き、この溶液を膵臓リボヌクレアーゼで
処理してRNAとプロテアーゼを加水分解して蛋白質を劣
化させる。残存蛋白質及びオリゴペプチドをフェノール
或いはフェノールとクロロホルムの等量混合物の有機溶
媒で抽出する。蛋白質の殆んどは変成し、有機相に入
り、有機相と水相の界面に沈澱し、この相分離は遠心分
離により達成される。その後、DNAを含む透明な粘稠水
性相を取出す。アルコールを添加するとDNAが水性相か
ら白色繊維状物質として沈澱し、ガラス棒に巻付けるこ
とができる。アルコールからの沈澱はDNA及びRNAの小さ
いオリゴヌクレオチド類及び蛋白質の除去に用いた有機
溶媒を除去しながら高分子量DNAを濃縮する役割を果た
す。残存洗剤及び塩類は再懸濁DNA溶液を所望の緩衝液
に対して透析することにより除去することができる。場
合によっては、DNAを平衡密度にセシゥムクロライド勾
配上の遠心分離或いはヒドロキシルアパタイトクロマト
グラフィーにより更に精製するのが好ましい場合があ
る。上記染色体DNAに対するプロセスにおいて典型的な
実験処方はしばしばDNA抽出及び精製のプロセスに対し
て少なくとも２日間要求する（Recombinant Technique
s.Raymond L.Rodrigues及びRobert C.Tact著、1983年16
2頁参照）。
NA）はDNAが染色体であるか或いはプラスミド或いはバ
クテリオファージなどの染色体外のものであるかに応じ
て異った方法により典型的に精製される。染色体DNAの
精製においては細菌細胞壁は一般的に凍結−融解により
或いは酵素リゾチーム及びキレート化剤エチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）による処理により一般的に弱められ
る。細胞溶解は緩衝化された塩溶液中におけるドデシル
硫酸ナトリゥム（SDS）などの洗剤の添加により達成さ
れる。溶解に続き、この溶液を膵臓リボヌクレアーゼで
処理してRNAとプロテアーゼを加水分解して蛋白質を劣
化させる。残存蛋白質及びオリゴペプチドをフェノール
或いはフェノールとクロロホルムの等量混合物の有機溶
媒で抽出する。蛋白質の殆んどは変成し、有機相に入
り、有機相と水相の界面に沈澱し、この相分離は遠心分
離により達成される。その後、DNAを含む透明な粘稠水
性相を取出す。アルコールを添加するとDNAが水性相か
ら白色繊維状物質として沈澱し、ガラス棒に巻付けるこ
とができる。アルコールからの沈澱はDNA及びRNAの小さ
いオリゴヌクレオチド類及び蛋白質の除去に用いた有機
溶媒を除去しながら高分子量DNAを濃縮する役割を果た
す。残存洗剤及び塩類は再懸濁DNA溶液を所望の緩衝液
に対して透析することにより除去することができる。場
合によっては、DNAを平衡密度にセシゥムクロライド勾
配上の遠心分離或いはヒドロキシルアパタイトクロマト
グラフィーにより更に精製するのが好ましい場合があ
る。上記染色体DNAに対するプロセスにおいて典型的な
実験処方はしばしばDNA抽出及び精製のプロセスに対し
て少なくとも２日間要求する（Recombinant Technique
s.Raymond L.Rodrigues及びRobert C.Tact著、1983年16
2頁参照）。
プラスミド及びバクテリオファージを含む原核生物DN
Aの染色体外要素の精製に際しては標本を汚染する染色
体DNAの量を最少にするのが望ましい。バクテリオファ
ージについてはこれはしばしば先ず感染細菌からのファ
ージ粒子を精製し、次いで精製ファージ粒子をプロテア
ーゼ及び／又はフェノールを用いて処理してバクテリオ
ファージDNAを放出させることにより達成されている。
更にDNAの精製は染色体DNAについて説明したのと同様な
手段により達成される。しかしながら、その大きさのた
めに沈澱バクテリオファージ及びプラスミドDNAはガラ
ス棒上には巻付けることができず従って、一般的に遠心
分離により回収されている。ここでも又全体の単離及び
精製プロセスのためには３日間が普通必要である。
Aの染色体外要素の精製に際しては標本を汚染する染色
体DNAの量を最少にするのが望ましい。バクテリオファ
ージについてはこれはしばしば先ず感染細菌からのファ
ージ粒子を精製し、次いで精製ファージ粒子をプロテア
ーゼ及び／又はフェノールを用いて処理してバクテリオ
ファージDNAを放出させることにより達成されている。
更にDNAの精製は染色体DNAについて説明したのと同様な
手段により達成される。しかしながら、その大きさのた
めに沈澱バクテリオファージ及びプラスミドDNAはガラ
ス棒上には巻付けることができず従って、一般的に遠心
分離により回収されている。ここでも又全体の単離及び
精製プロセスのためには３日間が普通必要である。
真核生物細胞については全細胞DNAの単離及び精製は
上記バクテリアについて説明した洗剤溶解方法の修正に
よりしばしば達成されている。主たる相異は典型的に細
胞溶解及び細胞蛋白質の消化が洗剤の存在下においてプ
ロティナーゼＫを用いて達成されていることである。
〔M.Gross Bellard,P.Oudet及びP.Chambon,Eur.J.Bioch
em.,36（1973）32−38;N.Blin,及びD.W.Stafford,Nuc.A
cid.Res.,3（1976）2303−2308;及びD.J.Law,P.M.Fross
ard及びD.L.Rucknagel,Gene,28（1984）153−158参
照〕。プロティナーゼＫは次いで溶解物のフェノール或
いはフェノール／クロロホルム混合物による抽出により
除去される。典型的には細菌DNAの抽出に対するような
混合操作においては溶解物／フェノール或いは溶解物／
フェノール−クロロホルムはエマルジョンを形成し、そ
の水相及び有機相は遠心分離により分離される。DNAを
含む上部の即ち水性の相を次いで注ぎ出すか或いはピペ
ットを用いて取出し、この実質的に蛋白質のない溶解物
を透析して小分子量の細胞汚染物質及び残存フェノール
を除去する。
上記バクテリアについて説明した洗剤溶解方法の修正に
よりしばしば達成されている。主たる相異は典型的に細
胞溶解及び細胞蛋白質の消化が洗剤の存在下においてプ
ロティナーゼＫを用いて達成されていることである。
〔M.Gross Bellard,P.Oudet及びP.Chambon,Eur.J.Bioch
em.,36（1973）32−38;N.Blin,及びD.W.Stafford,Nuc.A
cid.Res.,3（1976）2303−2308;及びD.J.Law,P.M.Fross
ard及びD.L.Rucknagel,Gene,28（1984）153−158参
照〕。プロティナーゼＫは次いで溶解物のフェノール或
いはフェノール／クロロホルム混合物による抽出により
除去される。典型的には細菌DNAの抽出に対するような
混合操作においては溶解物／フェノール或いは溶解物／
フェノール−クロロホルムはエマルジョンを形成し、そ
の水相及び有機相は遠心分離により分離される。DNAを
含む上部の即ち水性の相を次いで注ぎ出すか或いはピペ
ットを用いて取出し、この実質的に蛋白質のない溶解物
を透析して小分子量の細胞汚染物質及び残存フェノール
を除去する。
上記手法において、プロセスを自動化する能力を重大
に制限する抽出における主たる制限はフェノール抽出の
際に水性及び有機相を分離するための遠心分離の必要性
である。しばしば所望の純度を達成するために幾つかの
抽出が必要とされ、その各々は遠心分離を必要とする。
これらの各種遠心分離のために作業は手動で行われてお
り、従って高価である。又、これらの構成は抽出操作の
自動化を困難且つ高価にする。
に制限する抽出における主たる制限はフェノール抽出の
際に水性及び有機相を分離するための遠心分離の必要性
である。しばしば所望の純度を達成するために幾つかの
抽出が必要とされ、その各々は遠心分離を必要とする。
これらの各種遠心分離のために作業は手動で行われてお
り、従って高価である。又、これらの構成は抽出操作の
自動化を困難且つ高価にする。
発明の概要 本発明の好ましい実施態様に従えば、遠心分離を用い
ることなく細胞からの核酸の抽出及び精製の新しい方法
を実施する自動化装置が提供される。この方法におい
て、溶解物は高濃度の塩を有する溶解緩衝液の存在下に
おいてプロティナーゼＫで細胞を処理することにより形
成される。この溶解物をフェノールベース溶解系と混合
してエマルジョンを形成する。このエマルジョンを少な
くとも35℃の温度、より好ましくは45℃より大きい温度
に加熱して相分離を促進する。最適の結果のためには約
55℃の温度が好ましい。相分離の速度は又エマルジョン
の表面積を増大することにより高められる。一度相分離
が完了すると、下部の有機相を除去し、上部の水相を繰
返し所定の回数フェノールベース溶媒で溶出し、最終的
にクロロホルムを用いて抽出する。この残存水相を次い
で透析して更に核酸溶液を精製濃縮する。
ることなく細胞からの核酸の抽出及び精製の新しい方法
を実施する自動化装置が提供される。この方法におい
て、溶解物は高濃度の塩を有する溶解緩衝液の存在下に
おいてプロティナーゼＫで細胞を処理することにより形
成される。この溶解物をフェノールベース溶解系と混合
してエマルジョンを形成する。このエマルジョンを少な
くとも35℃の温度、より好ましくは45℃より大きい温度
に加熱して相分離を促進する。最適の結果のためには約
55℃の温度が好ましい。相分離の速度は又エマルジョン
の表面積を増大することにより高められる。一度相分離
が完了すると、下部の有機相を除去し、上部の水相を繰
返し所定の回数フェノールベース溶媒で溶出し、最終的
にクロロホルムを用いて抽出する。この残存水相を次い
で透析して更に核酸溶液を精製濃縮する。
この方法を実施するための装置は試料細胞を保持する
ための少なくとも一つの抽出溶液及び試薬を抽出溶液に
移送し流体を抽出容器から除去するための移送系を含
む。この相分離操作に際して抽出容器の所望温度を維持
するための加熱系がもうけられその含有される流体の混
合を得るために抽出容器を穏やかに振動するためのモー
タが使用される。このモータは又抽出容器を水平軸の周
りに回転させ、溶解物のフェノールベースの溶媒系によ
る処理により得られるエマルジョンの表面積を増大させ
る。高塩濃度と加熱及びエマルジョンの表面積の増大の
組合せの結果、相分離が２〜８分内に完了し、遠心分離
の必要性を全く除去する。
ための少なくとも一つの抽出溶液及び試薬を抽出溶液に
移送し流体を抽出容器から除去するための移送系を含
む。この相分離操作に際して抽出容器の所望温度を維持
するための加熱系がもうけられその含有される流体の混
合を得るために抽出容器を穏やかに振動するためのモー
タが使用される。このモータは又抽出容器を水平軸の周
りに回転させ、溶解物のフェノールベースの溶媒系によ
る処理により得られるエマルジョンの表面積を増大させ
る。高塩濃度と加熱及びエマルジョンの表面積の増大の
組合せの結果、相分離が２〜８分内に完了し、遠心分離
の必要性を全く除去する。
加熱系、モータ、及び移送系をコントロールするた
め、容積をコントロールするため試薬の反応容器中への
流れの時間設定のために、反応容器内の温度を追跡する
ために、及び抽出容器からの有機相の流れを追跡するた
めに、コンピュータ系が用いられる。このコンピュータ
は又相分離中にモータによる混合時間及び待時間を設定
するマスタータイマーとしても機能し、上記方法に基づ
いて設定された所定の指示に従って操作する。加圧透析
系も又装置内に含まれ、移送系により抽出容器に連結さ
れる。この透析系は透析物をし再使用し、過度の補給を
避けるために分光光度計を介して浴容器から透析物を再
循環するためのポンプ及び浴容器に戻すための濾過系を
含む。
め、容積をコントロールするため試薬の反応容器中への
流れの時間設定のために、反応容器内の温度を追跡する
ために、及び抽出容器からの有機相の流れを追跡するた
めに、コンピュータ系が用いられる。このコンピュータ
は又相分離中にモータによる混合時間及び待時間を設定
するマスタータイマーとしても機能し、上記方法に基づ
いて設定された所定の指示に従って操作する。加圧透析
系も又装置内に含まれ、移送系により抽出容器に連結さ
れる。この透析系は透析物をし再使用し、過度の補給を
避けるために分光光度計を介して浴容器から透析物を再
循環するためのポンプ及び浴容器に戻すための濾過系を
含む。
発明の具体的説明 定 義 本発明の説明の目的のために次の定義が適用される。
「エマルジョン」とは一方が他の中に懸濁して保たれ
る二つの非混和性の混合物である。細胞からの核酸の抽
出において、細胞溶解及び溶解物とフェノールベース溶
媒系との混合後にエマルジョンが形成され、その構成流
体は核酸を含有する水相及びフエノール、変成蛋白質及
び脂質類を含有する有機相である。核酸に加えて水相も
又典型的に不純物を含有し、それらは多くの状況におい
て更にin vitrotの操作が行われる前に除去されなけれ
ばならない。これらの不純物としては多くの炭水化物、
アミノ酸などの小分子量細胞構成物質及びヌクレオシド
及びヌクレオチド等のより小さな核酸（通常細胞液と称
される）が含まれる。
る二つの非混和性の混合物である。細胞からの核酸の抽
出において、細胞溶解及び溶解物とフェノールベース溶
媒系との混合後にエマルジョンが形成され、その構成流
体は核酸を含有する水相及びフエノール、変成蛋白質及
び脂質類を含有する有機相である。核酸に加えて水相も
又典型的に不純物を含有し、それらは多くの状況におい
て更にin vitrotの操作が行われる前に除去されなけれ
ばならない。これらの不純物としては多くの炭水化物、
アミノ酸などの小分子量細胞構成物質及びヌクレオシド
及びヌクレオチド等のより小さな核酸（通常細胞液と称
される）が含まれる。
「透析」とは駆動力が濃度勾配のみである場合におけ
る二つの液体を分離する多孔質の隔壁を通しての異った
大きさの溶質の輸率差に依存する分離方法である。核酸
の抽出において透析はエマルジョンの水相における不純
物を除去するためにしばしば使用される。
る二つの液体を分離する多孔質の隔壁を通しての異った
大きさの溶質の輸率差に依存する分離方法である。核酸
の抽出において透析はエマルジョンの水相における不純
物を除去するためにしばしば使用される。
「制限」とは独特の塩基配列部位におけるDNAの選択
的切断即ちエンドヌクレアーゼによる切断である。一般
的に、制限性はDNA純度に対する厳格な試験と考えられ
る。
的切断即ちエンドヌクレアーゼによる切断である。一般
的に、制限性はDNA純度に対する厳格な試験と考えられ
る。
方 法 本発明の手法は核酸抽出に際して遠心分離を用いるこ
となく有機（フェノール）及び水性（DNA及び／又はRN
A）相の分離を達成する新規方法の自動化に依存するも
のである。この使用される実験方法は哺乳動物細胞特に
末梢血管リンパ球、肝臓及び羊膜細胞などの組織からの
高分子量DNA（約108ダルトン）までの核酸の抽出に適し
たものであるが、しかし、それは又抽出が行われる前に
組織が適当に調製されるならばその他の真核生物細胞に
対しても用いることができる。この方法は下記の通りで
ある： 工程1. 核酸が抽出されるべき組織が高濃度の塩を有する溶解
緩衝液の存在下において酵素プロティナーゼＫで消化さ
れ、この塩はイオン強度を増大する。好ましい溶解緩衝
液は8M尿素、1M NaCl、１％SDS,50mM Tris−HCl及び10
mM EDTA、pH8.0である。消化は消化されるべき細胞の
性質に応じて典型的に約55℃において３〜６時間行われ
る。8M尿素の濃度はほぼ飽和に対応するものであり、従
って上限を表わす。これより幾分低い濃度も使用するこ
とができるが、最良の効率のためには8Mが好ましい。下
限は約4M尿素のように思われる。又、その他のカオトロ
ピック剤例えばグアナジン塩酸塩も尿素の代りに用いる
ことができる。洗剤SDSの濃度も又典型的に0.5％程度か
ら２％まで変えることができるが、しかし、約１％が殆
んどのタイプの哺乳動物の細胞に対してより適切である
ように思われる。その他の洗剤例えばTriton X−100
（商標）、Nonedit（商標）及びラウロイオルサルコシ
ンなども又使用される。同様に、高塩濃度も下記の工程
３における相分離を相当に遅らせる0.5Mから好ましい1M
NaCl溶液を用いた場合に得られる速度よりも相分離の
速度を余り増大させるようには思われない2Mまで変化さ
せることができる。その他の塩、例えばKClも又使用す
ることが出来、その好ましい濃度は用いられる塩のイオ
ン強度に応じて異なる。又、EDTA以外のキレート化剤例
えば８−ヒドロキシキノリンを用いてもよく、又場合に
よってはキレート化剤は省略してもよい。Tris−HClは
緩衝液として機能する。
となく有機（フェノール）及び水性（DNA及び／又はRN
A）相の分離を達成する新規方法の自動化に依存するも
のである。この使用される実験方法は哺乳動物細胞特に
末梢血管リンパ球、肝臓及び羊膜細胞などの組織からの
高分子量DNA（約108ダルトン）までの核酸の抽出に適し
たものであるが、しかし、それは又抽出が行われる前に
組織が適当に調製されるならばその他の真核生物細胞に
対しても用いることができる。この方法は下記の通りで
ある： 工程1. 核酸が抽出されるべき組織が高濃度の塩を有する溶解
緩衝液の存在下において酵素プロティナーゼＫで消化さ
れ、この塩はイオン強度を増大する。好ましい溶解緩衝
液は8M尿素、1M NaCl、１％SDS,50mM Tris−HCl及び10
mM EDTA、pH8.0である。消化は消化されるべき細胞の
性質に応じて典型的に約55℃において３〜６時間行われ
る。8M尿素の濃度はほぼ飽和に対応するものであり、従
って上限を表わす。これより幾分低い濃度も使用するこ
とができるが、最良の効率のためには8Mが好ましい。下
限は約4M尿素のように思われる。又、その他のカオトロ
ピック剤例えばグアナジン塩酸塩も尿素の代りに用いる
ことができる。洗剤SDSの濃度も又典型的に0.5％程度か
ら２％まで変えることができるが、しかし、約１％が殆
んどのタイプの哺乳動物の細胞に対してより適切である
ように思われる。その他の洗剤例えばTriton X−100
（商標）、Nonedit（商標）及びラウロイオルサルコシ
ンなども又使用される。同様に、高塩濃度も下記の工程
３における相分離を相当に遅らせる0.5Mから好ましい1M
NaCl溶液を用いた場合に得られる速度よりも相分離の
速度を余り増大させるようには思われない2Mまで変化さ
せることができる。その他の塩、例えばKClも又使用す
ることが出来、その好ましい濃度は用いられる塩のイオ
ン強度に応じて異なる。又、EDTA以外のキレート化剤例
えば８−ヒドロキシキノリンを用いてもよく、又場合に
よってはキレート化剤は省略してもよい。Tris−HClは
緩衝液として機能する。
工程2. 工程１から得られた溶解物を室温において約20分間等
容積のフェノールベース溶媒系、好ましくは約50:48:2
の比率のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ールと穏やかに混合されるがフェノールは蛋白質を変成
及び抽出し、クロロホルムは疏水性を増大し及びDNAが
水相に残るのを確実にし（工程３参照）、及びイソアミ
ルアルコールは主として抗界面活性剤（消泡剤）として
機能する。次いで混合の結果としてエマルジョンが形成
される。この有機溶媒系について例えばフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール系をTris−HCl緩衝
液、pH8.0で飽和したフェノールで置換するなどの変更
を用いてもよいが、しかし、工程３における所望の相分
離を行う際の効率のため、又緩衝液で飽和したフェノー
ルを用いた系の際に起こり得るようなDNAが有機相と水
相の間の界面において損失しないのでフェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール系が好ましい。同様
に、この好ましいフェノールベース溶媒系の正確な容量
比（即ち50:48:2）を変えることが可能であるが、クロ
ロホルムの濃度が余りに低いとしばしばDNAが水相に溜
まるよりも有機相に入ることになる。一般的に約1:1の
フェノール対クロロホルムの比が最適の性能を与えるよ
うに思われる。同様に、抗界面活性剤の濃度が余りに低
いと泡立ちが生じチューブを目詰りさせる可能性があ
る。
容積のフェノールベース溶媒系、好ましくは約50:48:2
の比率のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ールと穏やかに混合されるがフェノールは蛋白質を変成
及び抽出し、クロロホルムは疏水性を増大し及びDNAが
水相に残るのを確実にし（工程３参照）、及びイソアミ
ルアルコールは主として抗界面活性剤（消泡剤）として
機能する。次いで混合の結果としてエマルジョンが形成
される。この有機溶媒系について例えばフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール系をTris−HCl緩衝
液、pH8.0で飽和したフェノールで置換するなどの変更
を用いてもよいが、しかし、工程３における所望の相分
離を行う際の効率のため、又緩衝液で飽和したフェノー
ルを用いた系の際に起こり得るようなDNAが有機相と水
相の間の界面において損失しないのでフェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール系が好ましい。同様
に、この好ましいフェノールベース溶媒系の正確な容量
比（即ち50:48:2）を変えることが可能であるが、クロ
ロホルムの濃度が余りに低いとしばしばDNAが水相に溜
まるよりも有機相に入ることになる。一般的に約1:1の
フェノール対クロロホルムの比が最適の性能を与えるよ
うに思われる。同様に、抗界面活性剤の濃度が余りに低
いと泡立ちが生じチューブを目詰りさせる可能性があ
る。
工程3. 工程２から得られたエマルジョンの相分離は次いで好
ましくは35℃〜55℃の温度より好ましくは45℃〜55℃の
温度、最も好ましくは約55℃に加熱しながらエマルジョ
ンの表面積を増大することにより達成されるが後者の温
度はクロロホルムの沸点に近いものである。表面積の増
大はエマルジョンを含有する反応容器を溶解物と有機相
の間の界面の断面積を増大し、これらの二相の深さを減
少させる側にエマルジョンを位置することにより典型的
に行われる。この工程における高濃度の塩、大きい界面
面積及び高温の組合せはエマルジョンを二相系に２〜８
分以内に分離させ、よって遠心分離の必要性を全く除去
する。
ましくは35℃〜55℃の温度より好ましくは45℃〜55℃の
温度、最も好ましくは約55℃に加熱しながらエマルジョ
ンの表面積を増大することにより達成されるが後者の温
度はクロロホルムの沸点に近いものである。表面積の増
大はエマルジョンを含有する反応容器を溶解物と有機相
の間の界面の断面積を増大し、これらの二相の深さを減
少させる側にエマルジョンを位置することにより典型的
に行われる。この工程における高濃度の塩、大きい界面
面積及び高温の組合せはエマルジョンを二相系に２〜８
分以内に分離させ、よって遠心分離の必要性を全く除去
する。
工程4. 反応容器をゆっくり正常の真直ぐの位置に戻し、相分
離を維持する。
離を維持する。
工程5. 下部のフェノール相を抜出し、廃液に排出する。
工程6. 上記工程２〜５の抽出操作を核酸を含有する上部相が
透明になるまで繰返す。典型的にはリンパ球からの核酸
の単離には１回のみの追加の抽出が必要とされるのに対
し、その他の細胞タイプ例えば肝臓に対しては３回もの
追加の抽出が必要とされる場合がある。典型的には最終
抽出はフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル混合物を用いるよりも残存フェノールの殆んどを除去
するクロロホルムのみを用いて行われる。
透明になるまで繰返す。典型的にはリンパ球からの核酸
の単離には１回のみの追加の抽出が必要とされるのに対
し、その他の細胞タイプ例えば肝臓に対しては３回もの
追加の抽出が必要とされる場合がある。典型的には最終
抽出はフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル混合物を用いるよりも残存フェノールの殆んどを除去
するクロロホルムのみを用いて行われる。
工程7. 工程６の後に残存する水相を取出す。
工程8. 工程７において取出された溶液を典型的には加圧下に
透析し、核酸を濃縮し、残存有機分子を除去する。
透析し、核酸を濃縮し、残存有機分子を除去する。
工程9. 任意工程として工程８の後に水相をRNase或いはDNase
のいづれかで処理し、抽出工程２〜８を繰返して水相に
それぞれDNA或いはRNAのみを残すことができる。
のいづれかで処理し、抽出工程２〜８を繰返して水相に
それぞれDNA或いはRNAのみを残すことができる。
工程10. 精製試料を集める。
装 置 本発明の好ましい実施態様に従えば細胞から核酸を単
離精製するための装置が第１図、第2A及び2B図、第３図
及び第４図に図示されており、それらは各々系を通して
各種試薬及びガスを一定経路に従って運ぶための流体移
送系100、抽出操作の際に環境及び抽出容器の物理的傾
きをコントロールするための室／揺子系200、透析系300
及び自動コントロールを行うためのコンピュータ系400
を示している。
離精製するための装置が第１図、第2A及び2B図、第３図
及び第４図に図示されており、それらは各々系を通して
各種試薬及びガスを一定経路に従って運ぶための流体移
送系100、抽出操作の際に環境及び抽出容器の物理的傾
きをコントロールするための室／揺子系200、透析系300
及び自動コントロールを行うためのコンピュータ系400
を示している。
第１図に示される流体移送系100は一連の試薬容器１
〜９、各試薬容器に対して一対のバルブを配置した一連
の電気的に操作されるガスバルブ21〜38を含む。一連の
ガスバルブ21〜38の各々は試薬容器内の圧力をコントロ
ールするために圧力マニホルド40或いはベントマニホル
ド41のいづれか、及び１〜９の特別の試薬容器に接続さ
れている。その様な試薬容器はその中に含まれる試薬に
応じて典型的にはガラス或いはポリエチレンで構成され
ている。上記の抽出操作に用いられる特別の方法に対し
ては試薬としては酵素、プロティナーゼＫ、8M尿素、1M
NaCl、１％ SDS、50mM Tris−HCl、及び10mM EDT
A、pH8.0で構成される溶解緩衝液、フェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（50:48:2）の混合液、
クロロホルム、及びRNase及び／又はDNaseなどが挙げら
れる。その他の方法、例えば細菌及び酵母からの抽出の
ために使用することのできるその他の試薬としては例え
ばリゾチーム、SDS、エタノール、Tris−HCl、EDTA、各
種塩溶液、その他の緩衝液が挙げられる。
〜９、各試薬容器に対して一対のバルブを配置した一連
の電気的に操作されるガスバルブ21〜38を含む。一連の
ガスバルブ21〜38の各々は試薬容器内の圧力をコントロ
ールするために圧力マニホルド40或いはベントマニホル
ド41のいづれか、及び１〜９の特別の試薬容器に接続さ
れている。その様な試薬容器はその中に含まれる試薬に
応じて典型的にはガラス或いはポリエチレンで構成され
ている。上記の抽出操作に用いられる特別の方法に対し
ては試薬としては酵素、プロティナーゼＫ、8M尿素、1M
NaCl、１％ SDS、50mM Tris−HCl、及び10mM EDT
A、pH8.0で構成される溶解緩衝液、フェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（50:48:2）の混合液、
クロロホルム、及びRNase及び／又はDNaseなどが挙げら
れる。その他の方法、例えば細菌及び酵母からの抽出の
ために使用することのできるその他の試薬としては例え
ばリゾチーム、SDS、エタノール、Tris−HCl、EDTA、各
種塩溶液、その他の緩衝液が挙げられる。
試薬容器の各々は電気的に操作されているバルブブロ
ック50に連結されており、このバルブブロックは米国特
許4,008,736号明細書〔1977年２月22日発行、発明の名
称:VALVE ARRANGEMENT FOR DISTRIBUTING FLUIDS、ウイ
ットマン−リーボルド等（Witeman−Liebold,et al）〕
に記載されているものと同様なゼロデッド（zero dea
d）容積バルブの組立て物であり系内の全てのその他の
バルブブロックも同様である。その様な電気的に操作さ
れるバルブブロックの一例はApplied Biosystems,Inc.
部品番号600656により製造されている。もう一つの例は
同時係属中の出願“Improved Apparatus and Method fo
r the Sequential Performance of Chemical Processe
s"（L.E.Hood等によりSerial No.440,571,kで1982年11
月10日に出願され同一被譲渡人に譲渡されたもの）に記
載されている。各種試薬容器からの流体流れは適当なガ
スバルブを開け、適当な排気バルブを閉じて所望の試薬
容器内の圧力を増大させ及びバルブブロック50内の適当
なバルブを開けることによりコントロールされる。バル
ブブロック50に連結されているバルブブロック51は次い
で容器11〜15の一つである特別の抽出容器に流れを導
く。これらの抽出容器内への流れはその各々がガスマニ
ホルド72或いはベントマニホルド74のいずれかに連結さ
れている一連の電気的操作されるガスバルブの対61〜70
を介してコントロールされる。一度抽出容器内の抽出が
完了し、有機及び水相が分離されると有機相（抽出容器
の底部にある）を所望の抽出容器内の圧力を増大させ、
バルブブロック51内の対応するバルブを開けて抽出容器
11上のチューブ17のような排出チューブを通して流体を
容器の外に押出す。バルブブロック51は流れを電気伝導
度検出器55を通してもう一つのバルブブロック52及び廃
液に導く。水相はその高い塩含量のために高い電気伝導
度を有するので有機相が抜出されると大きな電気伝導度
増大が見られる。これが相界面が検出されたことを示
し、それ以上の如何なる流体の抽出容器からの除去を停
止するのに必要な信号をコンピュータ系に与える。その
信号が一度受取られるとバルブブロック52中の廃液バル
ブが閉じられ、バルブブロック51のいづれかの適当な出
入口即ち１以上の出入口80〜86が開かれ、水相を透析30
0に排出するか或いは透析出入口が閉められ流体移送ラ
イン中に残存する水相を押出してもう一つのフェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出の準備中の
適当な反応容器に戻す。ガスバルブ39を使用してTris−
HClのような緩衝液を抽出容器10からブロックバルブ52
中にバックフラッシングのために押出す。
ック50に連結されており、このバルブブロックは米国特
許4,008,736号明細書〔1977年２月22日発行、発明の名
称:VALVE ARRANGEMENT FOR DISTRIBUTING FLUIDS、ウイ
ットマン−リーボルド等（Witeman−Liebold,et al）〕
に記載されているものと同様なゼロデッド（zero dea
d）容積バルブの組立て物であり系内の全てのその他の
バルブブロックも同様である。その様な電気的に操作さ
れるバルブブロックの一例はApplied Biosystems,Inc.
部品番号600656により製造されている。もう一つの例は
同時係属中の出願“Improved Apparatus and Method fo
r the Sequential Performance of Chemical Processe
s"（L.E.Hood等によりSerial No.440,571,kで1982年11
月10日に出願され同一被譲渡人に譲渡されたもの）に記
載されている。各種試薬容器からの流体流れは適当なガ
スバルブを開け、適当な排気バルブを閉じて所望の試薬
容器内の圧力を増大させ及びバルブブロック50内の適当
なバルブを開けることによりコントロールされる。バル
ブブロック50に連結されているバルブブロック51は次い
で容器11〜15の一つである特別の抽出容器に流れを導
く。これらの抽出容器内への流れはその各々がガスマニ
ホルド72或いはベントマニホルド74のいずれかに連結さ
れている一連の電気的操作されるガスバルブの対61〜70
を介してコントロールされる。一度抽出容器内の抽出が
完了し、有機及び水相が分離されると有機相（抽出容器
の底部にある）を所望の抽出容器内の圧力を増大させ、
バルブブロック51内の対応するバルブを開けて抽出容器
11上のチューブ17のような排出チューブを通して流体を
容器の外に押出す。バルブブロック51は流れを電気伝導
度検出器55を通してもう一つのバルブブロック52及び廃
液に導く。水相はその高い塩含量のために高い電気伝導
度を有するので有機相が抜出されると大きな電気伝導度
増大が見られる。これが相界面が検出されたことを示
し、それ以上の如何なる流体の抽出容器からの除去を停
止するのに必要な信号をコンピュータ系に与える。その
信号が一度受取られるとバルブブロック52中の廃液バル
ブが閉じられ、バルブブロック51のいづれかの適当な出
入口即ち１以上の出入口80〜86が開かれ、水相を透析30
0に排出するか或いは透析出入口が閉められ流体移送ラ
イン中に残存する水相を押出してもう一つのフェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出の準備中の
適当な反応容器に戻す。ガスバルブ39を使用してTris−
HClのような緩衝液を抽出容器10からブロックバルブ52
中にバックフラッシングのために押出す。
各種容器及びバルブを接続するための上記装置におけ
るチューブ16のようなチューブは典型的にTeflon（商
標）で構成されている。系内における液体を移動するた
めの各チューブは大まかに測定された流れ抵抗を有し、
圧力マンホルドによる移動中に固定された知られた圧力
で操作される。よって、移動に必要とされる時間の長さ
は移動物質の容積に直接に対応し、コンピータ系により
コントロールされる。系内のガス流も又コンピュータ系
によりコントロールされ、ガスバルブ21〜39及び61〜70
は典型的にソレノイド操作されている。その様なバルブ
の一例はAnger,Inc.製のフルオロカーボンバルブが挙げ
られる。適当な電気伝導度検出メータ55の一例はModel2
12−100電気伝導度メータに連結されたWescon Instrume
nt Model219−200電気伝導度フローセルである。
るチューブ16のようなチューブは典型的にTeflon（商
標）で構成されている。系内における液体を移動するた
めの各チューブは大まかに測定された流れ抵抗を有し、
圧力マンホルドによる移動中に固定された知られた圧力
で操作される。よって、移動に必要とされる時間の長さ
は移動物質の容積に直接に対応し、コンピータ系により
コントロールされる。系内のガス流も又コンピュータ系
によりコントロールされ、ガスバルブ21〜39及び61〜70
は典型的にソレノイド操作されている。その様なバルブ
の一例はAnger,Inc.製のフルオロカーボンバルブが挙げ
られる。適当な電気伝導度検出メータ55の一例はModel2
12−100電気伝導度メータに連結されたWescon Instrume
nt Model219−200電気伝導度フローセルである。
第2A図及び第2Bにはモータ201、揺り子アーム203、及
びバンドヒータ221〜225（各抽出容器に対して１個づ
つ）及び対応するサーミスタ231〜235並びに抽出容器11
〜15を含む断熱室205を含む部屋／揺り子系が示されて
いる。典型的な実施態様において、室205は通常構成の
容易性及びその透明性のためにプレクシガラスで構成さ
れている長方形の平行六面体であり、この平行六面体は
約20インチ（約50.8cm）の長さL1、約14インチ（約35.6
cm）の高さH1、及び約12インチ（約30.5cm）の幅W1を有
し、又平行六面体の頂部に温度コントロールを助けるた
めの絶縁層211を有する。又、１以上のファン（図示せ
ず）を通常使用して抽出容器を冷却するために室205を
通しての排気を維持する。層211のための典型的な材料
は約1/2インチ（約1.3cm）厚のスタイロフォームであ
る。室205の上記寸法は抽出容器の所望の数及び大き
さ、及び室内に望まれる空間の量に応じて相当に変化さ
せることができ、抽出容器の操作を容易にすることがで
きる。揺り子アーム203は典型的には約1/4〜1/2インチ
（約0.1〜1.3cm）厚、及び約16インチ（約40.6cm）長、
及び約４インチ（約10.1cm）幅のプレクシガラスなどの
絶縁材料の平坦なシートである。この揺り子アーム203
には通常揺り子アームの長さに沿って典型的には金属性
であり、本質的にモータ201のための延長された駆動軸
である揺り子アーム軸213が堅く付着されている。揺り
子アーム203は典型的には抽出容器の各々を保持するた
めのねじ切された嵌め合せを堅く所定位置に貫通された
穴を有し、抽出容器は典型的にはねじ切りされた頂部を
有し、その嵌込みは容器内にガス及び液体を流入するた
めのテフロンラインに対応した三つの貫通孔を有する。
好ましい状態において、モータ201はDNAの剪断を避ける
ために混合操作中に毎秒ほぼ１回の抽出容器のゆっくり
した振動を与えるように連動されているステッパモータ
であり、その振動は典型的には50゜〜60゜の角度を介す
るものである。相分離に際し、モータ201を抽出容器に
対して完全な水平に対応する位置まで押進め、数分間保
持し、次いで通常相分離が維持されることを確実にする
ために約10秒間に亘って正常な位置（即ち、抽出容器に
対して真直ぐな容器）に戻される。その様なモータ201
の一例はピッチ直径が0.6〜3.6に定速ギヤにされたAIRP
AX Model K82821−P2である。
びバンドヒータ221〜225（各抽出容器に対して１個づ
つ）及び対応するサーミスタ231〜235並びに抽出容器11
〜15を含む断熱室205を含む部屋／揺り子系が示されて
いる。典型的な実施態様において、室205は通常構成の
容易性及びその透明性のためにプレクシガラスで構成さ
れている長方形の平行六面体であり、この平行六面体は
約20インチ（約50.8cm）の長さL1、約14インチ（約35.6
cm）の高さH1、及び約12インチ（約30.5cm）の幅W1を有
し、又平行六面体の頂部に温度コントロールを助けるた
めの絶縁層211を有する。又、１以上のファン（図示せ
ず）を通常使用して抽出容器を冷却するために室205を
通しての排気を維持する。層211のための典型的な材料
は約1/2インチ（約1.3cm）厚のスタイロフォームであ
る。室205の上記寸法は抽出容器の所望の数及び大き
さ、及び室内に望まれる空間の量に応じて相当に変化さ
せることができ、抽出容器の操作を容易にすることがで
きる。揺り子アーム203は典型的には約1/4〜1/2インチ
（約0.1〜1.3cm）厚、及び約16インチ（約40.6cm）長、
及び約４インチ（約10.1cm）幅のプレクシガラスなどの
絶縁材料の平坦なシートである。この揺り子アーム203
には通常揺り子アームの長さに沿って典型的には金属性
であり、本質的にモータ201のための延長された駆動軸
である揺り子アーム軸213が堅く付着されている。揺り
子アーム203は典型的には抽出容器の各々を保持するた
めのねじ切された嵌め合せを堅く所定位置に貫通された
穴を有し、抽出容器は典型的にはねじ切りされた頂部を
有し、その嵌込みは容器内にガス及び液体を流入するた
めのテフロンラインに対応した三つの貫通孔を有する。
好ましい状態において、モータ201はDNAの剪断を避ける
ために混合操作中に毎秒ほぼ１回の抽出容器のゆっくり
した振動を与えるように連動されているステッパモータ
であり、その振動は典型的には50゜〜60゜の角度を介す
るものである。相分離に際し、モータ201を抽出容器に
対して完全な水平に対応する位置まで押進め、数分間保
持し、次いで通常相分離が維持されることを確実にする
ために約10秒間に亘って正常な位置（即ち、抽出容器に
対して真直ぐな容器）に戻される。その様なモータ201
の一例はピッチ直径が0.6〜3.6に定速ギヤにされたAIRP
AX Model K82821−P2である。
第５図は抽出容器11〜15のための好ましい設計を図示
するものである。各容器はガラスで構成され、約150mm
の全長L2、約28mmの最大外側断面直径D1を有し、流体の
除去を容易にするために点Ｐまでテーパしている。好ま
しい態様においては、容器は目盛が付されておりねじ頂
部212の下に約40mlの容積を有する。その様な容積の一
例はCorningストック番号8082として市販されているパ
イレックス円錐ねじキャップ遠心目盛付チュープであ
る。これらの容器を揺り子アーム203の所定位置に保持
するために使用される嵌込みは典型的に三つの部品即
ち、ねじ山を切られたキャップ217、ねじ頂部212を受け
るための内部のねじ山を切られた開口部及びキャップ21
7を受ける外部のねじ山を切られた領域を有するフラン
ジ付カップリング215、及びフランジ付カップリング215
に加圧嵌込まれて抽出容器の不活性な栓としての役割を
果たすテフロンインサート219により典型的に構成され
ている。インサート219は通常必要とされる液体及びガ
スを受入れるための三つの貫通孔を有する。例えば抽出
容器11に対しては排出チューブ17、ガスマンホルド72に
連結している加圧チューブ18及びベントマンホルド74に
連結しているベントチューブ19がある。このチューブの
主たる特徴はチューブが垂直な位置から水平な位置に再
配置される際に生ずるそれが含む流体の表面積の大きな
変化であり、この表面積の変化がエマルジョンの相分離
速度を高める。この表面積の変化を達成することのでき
るその他のチューブ形状も又使用することができ、一般
的な場合においてその中に含まれる流体の表面積を増大
するために必要とされる回転角度は90゜でなくてもよ
い。
するものである。各容器はガラスで構成され、約150mm
の全長L2、約28mmの最大外側断面直径D1を有し、流体の
除去を容易にするために点Ｐまでテーパしている。好ま
しい態様においては、容器は目盛が付されておりねじ頂
部212の下に約40mlの容積を有する。その様な容積の一
例はCorningストック番号8082として市販されているパ
イレックス円錐ねじキャップ遠心目盛付チュープであ
る。これらの容器を揺り子アーム203の所定位置に保持
するために使用される嵌込みは典型的に三つの部品即
ち、ねじ山を切られたキャップ217、ねじ頂部212を受け
るための内部のねじ山を切られた開口部及びキャップ21
7を受ける外部のねじ山を切られた領域を有するフラン
ジ付カップリング215、及びフランジ付カップリング215
に加圧嵌込まれて抽出容器の不活性な栓としての役割を
果たすテフロンインサート219により典型的に構成され
ている。インサート219は通常必要とされる液体及びガ
スを受入れるための三つの貫通孔を有する。例えば抽出
容器11に対しては排出チューブ17、ガスマンホルド72に
連結している加圧チューブ18及びベントマンホルド74に
連結しているベントチューブ19がある。このチューブの
主たる特徴はチューブが垂直な位置から水平な位置に再
配置される際に生ずるそれが含む流体の表面積の大きな
変化であり、この表面積の変化がエマルジョンの相分離
速度を高める。この表面積の変化を達成することのでき
るその他のチューブ形状も又使用することができ、一般
的な場合においてその中に含まれる流体の表面積を増大
するために必要とされる回転角度は90゜でなくてもよ
い。
第３図には抽出容器11〜15から取出された核酸を更に
精製及び濃縮するために使用される加圧透析系300の概
略が示されている。系300はマンホルド収納部351及び浴
容器350を含み、これらの両者は典型的に直方体断面で
あり、浴容器は通常約８の溶解物370を含有する。浴
容器350及びマンホルド収納部351は共に透析物から異物
を排除するために使用されるカバー352に対向し、容器3
50がそれにシール353を介して密封されており、マンホ
ルド収納部351はその一方の側に蝶番354により、他方の
側において締め金355により接続されている。浴容器350
は通常周囲雰囲気に排気されている。好ましい態様にお
いて、浴容器、マンホルド収納部、及びカバーはプレキ
シガラスで構成されている。カバーに付着されその中の
孔を通して透析物中に懸架されて複数の透析バッグ311
〜315があり、それらは典型的には抽出容器11〜15とそ
れらにバルブブロック51を介して対応関係にある。マン
ホルド収納部351は収納部351が透析バッグを受入れる底
部部品356を貫通する孔を除いては閉じられた容器であ
るように底部部品356を含み、ガスチューブ323及び32
4、及び流体ライン101〜105のための孔はフィールドス
ルーにより密封されている。第６図は圧力が透析時にマ
ンホルド収納部351において維持することができるよう
な透析バッグと密封系の詳細を図示するものである。一
般的に、これらの透析バッグは透析装置とは独立にガラ
ス嵌込み部に付着される。例えば、透析バッグ311は一
端においてテーパに磨かれているガラスチューブ371の
小片の一部にかぶせて置かれている。次いでこのチュー
ブ371と透析バッグ311を対応する磨かれたガラスチュー
ブ片372中に堅く押込まれ、回転が与えられて二片のチ
ューブ間に密封が行われることによりこの透析バッグを
堅く両者の間に保持する。
精製及び濃縮するために使用される加圧透析系300の概
略が示されている。系300はマンホルド収納部351及び浴
容器350を含み、これらの両者は典型的に直方体断面で
あり、浴容器は通常約８の溶解物370を含有する。浴
容器350及びマンホルド収納部351は共に透析物から異物
を排除するために使用されるカバー352に対向し、容器3
50がそれにシール353を介して密封されており、マンホ
ルド収納部351はその一方の側に蝶番354により、他方の
側において締め金355により接続されている。浴容器350
は通常周囲雰囲気に排気されている。好ましい態様にお
いて、浴容器、マンホルド収納部、及びカバーはプレキ
シガラスで構成されている。カバーに付着されその中の
孔を通して透析物中に懸架されて複数の透析バッグ311
〜315があり、それらは典型的には抽出容器11〜15とそ
れらにバルブブロック51を介して対応関係にある。マン
ホルド収納部351は収納部351が透析バッグを受入れる底
部部品356を貫通する孔を除いては閉じられた容器であ
るように底部部品356を含み、ガスチューブ323及び32
4、及び流体ライン101〜105のための孔はフィールドス
ルーにより密封されている。第６図は圧力が透析時にマ
ンホルド収納部351において維持することができるよう
な透析バッグと密封系の詳細を図示するものである。一
般的に、これらの透析バッグは透析装置とは独立にガラ
ス嵌込み部に付着される。例えば、透析バッグ311は一
端においてテーパに磨かれているガラスチューブ371の
小片の一部にかぶせて置かれている。次いでこのチュー
ブ371と透析バッグ311を対応する磨かれたガラスチュー
ブ片372中に堅く押込まれ、回転が与えられて二片のチ
ューブ間に密封が行われることによりこの透析バッグを
堅く両者の間に保持する。
カバー352はこのより大きなチューブ372及び透析バッ
グ311に適合するようにドリル加工されており、Ｏ−リ
ングシール374に適合するようにさら孔が開けられてい
る。この透析バッグ及びチューブ371及び372で作られて
いるガラス嵌込部を次いで孔を通して置く。底部片356
はマンホルド収納部が蝶番354の周りに閉じられた位置
に回転される際にこのガラス嵌込み部と並べられる孔37
5を有する。グロメットシール376が孔375内に配置さ
れ、ガラス嵌込部とマンホルド間の密封を行うために用
いられる。
グ311に適合するようにドリル加工されており、Ｏ−リ
ングシール374に適合するようにさら孔が開けられてい
る。この透析バッグ及びチューブ371及び372で作られて
いるガラス嵌込部を次いで孔を通して置く。底部片356
はマンホルド収納部が蝶番354の周りに閉じられた位置
に回転される際にこのガラス嵌込み部と並べられる孔37
5を有する。グロメットシール376が孔375内に配置さ
れ、ガラス嵌込部とマンホルド間の密封を行うために用
いられる。
この透析系300は又透析物370を浴容器から抜出すため
の再循環チューブ336、透析物を再循環系を通してポン
プ送りするための蠕動ポンプ337、透析物の吸光度を追
跡するための分光光度計335及びフェノール及びその他
の有機物質を浄出するための二重のライン内フィルター
333を有する再循環系330をも含むものである。典型的な
実施において、フィルター333は有機物質を除去するた
めの炭素室フィルター332及び無機物質を除去するため
の混床イオン交換樹脂フィルター331を含む。又、分光
光度計335は透析物中に残存するフェノールの目安を与
える際に典型的に270nmにおける吸光度を測定する。こ
の系は吸光度（A270）が0.01以下に低下する際にフラッ
グを通常設定し、コンピュータ系に透析機能が完全であ
ることを示す。透析操作の際にマンホルド収納部351内
の圧力は窒素などの不活性ガスを用いて維持され、通常
Schleicher and Schuellから販売されている２〜8mlの
容積を有するコロジオンバッグなどの透析バッグを有す
る際には約1200mmHg（ゲージ）に維持される。ポンプ33
7は典型的には15psi（約1.1kg/cm2）のベッド及び約11/
分の流速を与える。二重蒸留水が典型的に透析物370と
して使用される。この再循環系の目的は規則的間隔で補
給される代りに透析物を再使用して更に自動的操作を容
易にすることである。
の再循環チューブ336、透析物を再循環系を通してポン
プ送りするための蠕動ポンプ337、透析物の吸光度を追
跡するための分光光度計335及びフェノール及びその他
の有機物質を浄出するための二重のライン内フィルター
333を有する再循環系330をも含むものである。典型的な
実施において、フィルター333は有機物質を除去するた
めの炭素室フィルター332及び無機物質を除去するため
の混床イオン交換樹脂フィルター331を含む。又、分光
光度計335は透析物中に残存するフェノールの目安を与
える際に典型的に270nmにおける吸光度を測定する。こ
の系は吸光度（A270）が0.01以下に低下する際にフラッ
グを通常設定し、コンピュータ系に透析機能が完全であ
ることを示す。透析操作の際にマンホルド収納部351内
の圧力は窒素などの不活性ガスを用いて維持され、通常
Schleicher and Schuellから販売されている２〜8mlの
容積を有するコロジオンバッグなどの透析バッグを有す
る際には約1200mmHg（ゲージ）に維持される。ポンプ33
7は典型的には15psi（約1.1kg/cm2）のベッド及び約11/
分の流速を与える。二重蒸留水が典型的に透析物370と
して使用される。この再循環系の目的は規則的間隔で補
給される代りに透析物を再使用して更に自動的操作を容
易にすることである。
第４図は自動的コントロールのために用いられるコン
ピュータ系400の概略図を示す。この系Hewlett−Packar
d85などのマイクロプロセッサベースのコンピュータ401
により構成されており、それは抽出時に抽出容器の加熱
をコントロールするための加熱コントローラ409を駆動
し、及びそれぞれバルブロック、ガスバルブ及び蠕動ポ
ンプ436のソレノイドをコントロールするための駆動材4
10、411、及び412に信号を入力するためにコンピュータ
401からのデジタル信号をアナログ信号に変換するため
の変換系403に連結されている。変換来403も又分光光度
計335及び電気伝導度メータ55及びサーミスター231〜23
5からの信号をコンピュータ401に与えるアナログからデ
ジタルへの変換器として作用する。その様な変換器403
の一例はHewlett−Packard3497インターフェースであ
る。このコンピュータは又混合操作の際に抽出容器を振
動させ、又相分離のために抽出容器を水平に位置させる
ために使用されるステッパーモータをコントロールする
ためのモーターコントローラ405に信号を与える。その
様なコントローラ405の典型例はSuperior Electricから
のModulynx（商標）Motion Control Interface Card、
タイプ10D005Aである。
ピュータ系400の概略図を示す。この系Hewlett−Packar
d85などのマイクロプロセッサベースのコンピュータ401
により構成されており、それは抽出時に抽出容器の加熱
をコントロールするための加熱コントローラ409を駆動
し、及びそれぞれバルブロック、ガスバルブ及び蠕動ポ
ンプ436のソレノイドをコントロールするための駆動材4
10、411、及び412に信号を入力するためにコンピュータ
401からのデジタル信号をアナログ信号に変換するため
の変換系403に連結されている。変換来403も又分光光度
計335及び電気伝導度メータ55及びサーミスター231〜23
5からの信号をコンピュータ401に与えるアナログからデ
ジタルへの変換器として作用する。その様な変換器403
の一例はHewlett−Packard3497インターフェースであ
る。このコンピュータは又混合操作の際に抽出容器を振
動させ、又相分離のために抽出容器を水平に位置させる
ために使用されるステッパーモータをコントロールする
ためのモーターコントローラ405に信号を与える。その
様なコントローラ405の典型例はSuperior Electricから
のModulynx（商標）Motion Control Interface Card、
タイプ10D005Aである。
コンピュータソフトウェア系 最も基本的レベルにおいて、抽出装置のソフトウェア
コントロールは各種物質の一つの容器からもう一つの容
器への所望の流れを達成し、必要な操作を行うために適
当な時点において、バルブを開閉し、スイッチを入れた
り切ったりする事柄である。本発明の方法が一連の工程
であるという事実はソフトウェアコントロールには便利
なものである。以下に使用することが望ましい如何なる
プログラム言語にも容易に翻訳することのできる抽出方
法の各工程に示される特別の指示事項の一例を示す。そ
れは試薬容器１が溶解緩衝液を含有し、試薬容器２がプ
ロティナーゼＫを含有し、試薬容器３がフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコールを含有し、試薬容器
４がクロロホルムを含有し、及び試薬容器５がRNaseを
含有するとの想定に基づくものである。
コントロールは各種物質の一つの容器からもう一つの容
器への所望の流れを達成し、必要な操作を行うために適
当な時点において、バルブを開閉し、スイッチを入れた
り切ったりする事柄である。本発明の方法が一連の工程
であるという事実はソフトウェアコントロールには便利
なものである。以下に使用することが望ましい如何なる
プログラム言語にも容易に翻訳することのできる抽出方
法の各工程に示される特別の指示事項の一例を示す。そ
れは試薬容器１が溶解緩衝液を含有し、試薬容器２がプ
ロティナーゼＫを含有し、試薬容器３がフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコールを含有し、試薬容器
４がクロロホルムを含有し、及び試薬容器５がRNaseを
含有するとの想定に基づくものである。
工程1:組織消化 コマンド番号 コマンド 10 バルブ22;50（出入口91）； 51（出入口80,81）;61を開ける。
コマンド10の後４分後に全てのバルブを
閉める。
閉める。
コメント：溶解緩衝液の容器１への移送が今や完了し
た。
た。
30 バルブ24;50（出入口92）； 51（出入口80,81）;61を開ける。
40 コマンド30後0.5分後に全ての バルブを閉める。
コメント：プロティナーゼＫの移送が今や完了した。
50 容器１のヒータ221のスイッチ を入れ、温度を55℃に昇げて維持する。
60 モータ201のスイッチを入れ、回転角を 一秒の周期で±60゜に設定する。
70 コマンド60後３時間後にモータ201及び ヒータチを切る。
80 消化混合物の冷却を持つ。
工程2:抽出 90 バルブ26;50（出入口93）； 51（出入口80,81）;61を開ける。
100 コマンド90後５分後にバルブ61以外の 全てのバルブを閉じる。
コメント：抽出混合物（フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール）の移送が今や完了した。
ソアミルアルコール）の移送が今や完了した。
110 モータ201のスイッチを入れ、回転角を ±60゜に設定する；周期１秒。
120 コマンド110後20分後にモータ201の スイッチを切る。
工程3:相分離 140 モータ201のスイッチを入れ、回転角を 90゜に設定する。
150 回転角が90゜に達するとモータ201の スイッチを切る。
コメント：抽出容器は今や水平位置に保持されている。
160 サーミスター231のスイッチを 入れ温度を55℃に上昇させて維持する。
170 温度がコマンド150の下に55℃に達した 後12分後にサーミスタ231のスイッチを 切る。
工程4:抽出容器の真直ぐな位置への変換 180 温度が55℃に到達後12分後にモータ201 のスイッチを入れる。
回転角を０゜に設定。降下速度は９゜／
秒に 設定。
秒に 設定。
工程5:フェノール相の抜出し 190 バルブ61を閉める。
200 バルブ62;51（出入口81）； 52（出入口71,72）を開ける。
210 電気伝導度を電気伝導度メーター55で 追跡する。
220 電気伝導度が104Mhosに到達後１秒後に 全てのバルブを閉じる。
コメント：電気伝導度が高くなった後にコマンド220に
おける１秒間の遅れはバルブブロック52への移送ライン
中に残された残存フェノールが除去されたことを確実に
するためである。
おける１秒間の遅れはバルブブロック52への移送ライン
中に残された残存フェノールが除去されたことを確実に
するためである。
230 バルブ52（出入口74）;61を開ける。
240 コマンド230後30秒後に全てのバル分を 閉じる。
250 バルブ52（出入口71,73）； 39;51（出入口81）;61を開ける。
コメント：コマンド250はバルブブロック52を逆流さ
せ、移送ライン中に残された水溶液を更に抽出或いは精
製のために抽出容器11に押戻す。
せ、移送ライン中に残された水溶液を更に抽出或いは精
製のために抽出容器11に押戻す。
260 全てのバルブを閉じる。
工程6:抽出操作の繰返し 270 コマンド90〜250をＮ回行う。
コメント：抽出が行われる数であるＮは経験及び試料組
織のタイプに応じてプログラマーにより選択される。
織のタイプに応じてプログラマーにより選択される。
280 バルブ28;50（出入口94）； 51（出入口80,81）;61を開ける。
コメント：コマンド280は最終抽出のための抽出容器11
に添加する。
に添加する。
290 バルブ61以外の全てのバルブを閉じる。
300 工程110〜26を１回繰返す。
工程7:水溶液の取出し（透析へ） 310 バルブ51（出入口81,82）； 62;321を開ける。
320 コマンド310後５分後に全てのバルブを 閉じる。
コメント：抽出容器11内の水溶液は今や透析バッグ411
内に入る。
内に入る。
工程8:水溶液の透析 330 ポンプ337のスイッチを入れる。
340 バルブ324を開ける。
350 A270を分光光度計335で追跡する。
360 A270が0.01に等しいか或いは未満に なった際に全てのバルブを閉じ、ポンプ 337のスイッチを切る。
工程9:水溶液からのRNAの取出し（任意） 370 バルブ324を開ける；バルブ51 （出入口81,82）;61を開ける。
380 コマンド370後５分後に全てのバルブを 閉じる。
コメイン：透析バッグ311中の透析された水溶液は抽出
容器11内にある。
容器11内にある。
390 バルブ30;50（出入口95）； 51（出入口80,81）;61を開ける。
400 工程90〜360を繰返す。
工程10:試料の採集 410 バルブ324;51（出入口82）； 52（出入口71,75）を開ける。
420 コマンド410の後５分後に全ての バルブを閉じる。
発明の有用性 実施例． ヒトリンパ球からのDNAの調整 リンパ球は先ず１単位の全血から洗浄し、4mlの平衡
化塩溶液中に際懸濁した。（平衡化塩溶液は１容の溶液
Ａ及び９容の溶液Ｂによりなり、溶液Ａは0.1％グルコ
ース、５×10-10M CaCl2 9.8×10-4M MgCl2、5.4×10
-3M KCl、0.145M Tris−HCl、pH7.6であり、溶液Ｂは
0.14M NaClである。）次いで0.35mlの上記リンパ球懸
濁液を4mlの溶解緩衝液（1M NaCl、１％SDS、8M尿素、
10mM EDTA、50mM Tris−HCl、pH8.0）及び0.65mlの溶
解緩衝液中の1mgのプロティナーゼＫと混合し、5mlの全
容量を得た。消化は前記円錐チューブ（抽出容器11）中
で55℃において３時間行った。約5mlのフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール50:48:2をチューブ
に添加し、２相を実験処方に従って20分間混合した。抽
出容器を次いで水平位置に55℃において10分間回転さ
せ、相を分離させた。この抽出溶液を次いでゆっくり約
10秒間に亘って垂直位置に回転して戻し、下方の有機層
を廃液に除去した。２回目の抽出をフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール混合物を用いて行い、第
３回目の抽出を5mlのクロホルムを用いて行った。クロ
ロホルムを廃液に除去し、水性DNA含有層を透析バッグ3
11のような透析バッグに圧送した。この水溶液を次いで
A270が0.01未満になるまで実験処法に従って加圧透析し
た。最終DNA溶液を次いでバッグから抜出し採集した。
化塩溶液中に際懸濁した。（平衡化塩溶液は１容の溶液
Ａ及び９容の溶液Ｂによりなり、溶液Ａは0.1％グルコ
ース、５×10-10M CaCl2 9.8×10-4M MgCl2、5.4×10
-3M KCl、0.145M Tris−HCl、pH7.6であり、溶液Ｂは
0.14M NaClである。）次いで0.35mlの上記リンパ球懸
濁液を4mlの溶解緩衝液（1M NaCl、１％SDS、8M尿素、
10mM EDTA、50mM Tris−HCl、pH8.0）及び0.65mlの溶
解緩衝液中の1mgのプロティナーゼＫと混合し、5mlの全
容量を得た。消化は前記円錐チューブ（抽出容器11）中
で55℃において３時間行った。約5mlのフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール50:48:2をチューブ
に添加し、２相を実験処方に従って20分間混合した。抽
出容器を次いで水平位置に55℃において10分間回転さ
せ、相を分離させた。この抽出溶液を次いでゆっくり約
10秒間に亘って垂直位置に回転して戻し、下方の有機層
を廃液に除去した。２回目の抽出をフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール混合物を用いて行い、第
３回目の抽出を5mlのクロホルムを用いて行った。クロ
ロホルムを廃液に除去し、水性DNA含有層を透析バッグ3
11のような透析バッグに圧送した。この水溶液を次いで
A270が0.01未満になるまで実験処法に従って加圧透析し
た。最終DNA溶液を次いでバッグから抜出し採集した。
この方法に従って約250ugのDNAを含有する約1mlのDNA
溶液が得られた。得られた溶液は0.52の吸光度比A230:A
260及び1.90の吸光度比A260:A280を有し、極めて高い純
度を示している。（完全に純粋なDNAについては吸光度
比A230:A260は0.5±0.05であり、A260:A280は1.9±0.1
である。）この試料の0.8％アガロースゲル及び標準エ
チジウムブロマイド染色技術を用いた分析は50キロベー
ス対より大きな（即ち3.5×107ダルトンより大）大きさ
の単一バンドを示す。又、最も重要なことに酵素EcoRI
を用いた消化は陽性でありDNAが純粋であり従って制限
可能であることを示しており、DNA純度に対して極めて
厳格な試験に合格している。
溶液が得られた。得られた溶液は0.52の吸光度比A230:A
260及び1.90の吸光度比A260:A280を有し、極めて高い純
度を示している。（完全に純粋なDNAについては吸光度
比A230:A260は0.5±0.05であり、A260:A280は1.9±0.1
である。）この試料の0.8％アガロースゲル及び標準エ
チジウムブロマイド染色技術を用いた分析は50キロベー
ス対より大きな（即ち3.5×107ダルトンより大）大きさ
の単一バンドを示す。又、最も重要なことに酵素EcoRI
を用いた消化は陽性でありDNAが純粋であり従って制限
可能であることを示しており、DNA純度に対して極めて
厳格な試験に合格している。
上記具体例についての変化は相分離工程を行うために
加熱及び表面積の増大の重要性を示している。例えばヒ
トリンパ球について抽出容器が加熱されず室温に維持さ
れ且つ抽出容器が水平位置に回転されないならば相分離
は典型的に60分を越える時間を必要とする。又、抽出容
器が55℃に加熱されるが、水平位置に回転されない場合
には相分離は４分間を越える時間を必要とする。55℃に
加熱して抽出容器を水平位置に回転すると相分離は典型
的には５分間を必要とするのみである。しかしながら、
これらの変更の各々において高塩濃度が相分離速度をほ
ぼ２倍の因子で高めている。
加熱及び表面積の増大の重要性を示している。例えばヒ
トリンパ球について抽出容器が加熱されず室温に維持さ
れ且つ抽出容器が水平位置に回転されないならば相分離
は典型的に60分を越える時間を必要とする。又、抽出容
器が55℃に加熱されるが、水平位置に回転されない場合
には相分離は４分間を越える時間を必要とする。55℃に
加熱して抽出容器を水平位置に回転すると相分離は典型
的には５分間を必要とするのみである。しかしながら、
これらの変更の各々において高塩濃度が相分離速度をほ
ぼ２倍の因子で高めている。
以上本発明の装置及び方法の好ましい態様を説明した
が、本発明のその広い面から離れることなく多くの変更
及び修正がなされることは当業者に明らかであろう。例
えば、抽出容器は大きな影響を有するにも拘らず必ずし
も相分離を高速化するために水平位置に回転する必要は
ない。同様に、45℃〜55℃の好ましい範囲未満の温度に
おいて相分離を行うことができるが、その場合にはより
低速で進行し、又それよりも更に低ければ速度は尚一層
遅くなる。装置に関して、本発明による自動化装置はよ
り多くの或いはより少ない抽出容器、試薬容器及び透析
バッグを用いて調整することができる。又、幾つかのバ
ルブは装置の異った場所に送るのが便利な場合があり、
例えばバルブブロック52を電気伝導度メーター55の前方
に置いてもよい。しかしながら、これは流れが停止され
た場合に水相の幾らかの損失を生ずるであろう。加え
て、自動化抽出系に含まれる各種装置の部品に選ばれる
特別のモデル数は使用され得る特別のモデルに関して限
定的なものでなく、単に例示として提供されているに過
ぎない。又、装置は液体移送系100及び透析系300に独立
した室／揺子系を提供することにより部分的にのみ自動
化されてもよいことが明らかであろう。
が、本発明のその広い面から離れることなく多くの変更
及び修正がなされることは当業者に明らかであろう。例
えば、抽出容器は大きな影響を有するにも拘らず必ずし
も相分離を高速化するために水平位置に回転する必要は
ない。同様に、45℃〜55℃の好ましい範囲未満の温度に
おいて相分離を行うことができるが、その場合にはより
低速で進行し、又それよりも更に低ければ速度は尚一層
遅くなる。装置に関して、本発明による自動化装置はよ
り多くの或いはより少ない抽出容器、試薬容器及び透析
バッグを用いて調整することができる。又、幾つかのバ
ルブは装置の異った場所に送るのが便利な場合があり、
例えばバルブブロック52を電気伝導度メーター55の前方
に置いてもよい。しかしながら、これは流れが停止され
た場合に水相の幾らかの損失を生ずるであろう。加え
て、自動化抽出系に含まれる各種装置の部品に選ばれる
特別のモデル数は使用され得る特別のモデルに関して限
定的なものでなく、単に例示として提供されているに過
ぎない。又、装置は液体移送系100及び透析系300に独立
した室／揺子系を提供することにより部分的にのみ自動
化されてもよいことが明らかであろう。
第１図は本発明による流体移送系の概略図を示す。 第2A図及び第2B図は本発明による室／揺子系の二つの図
面を示す。 第３図は本発明による加圧透析系を示す。 第４図は本発明によるコンピュータ系の概略図を示す。 第５図は抽出容器に対する好ましい設計及びその装置内
における取付けを示す。 第６図は透析系における透析バックの懸架系の詳細を示
す。
面を示す。 第３図は本発明による加圧透析系を示す。 第４図は本発明によるコンピュータ系の概略図を示す。 第５図は抽出容器に対する好ましい設計及びその装置内
における取付けを示す。 第６図は透析系における透析バックの懸架系の詳細を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノーマン エム．ウイツトニー アメリカ合衆国 カリフオルニア州 94070 サン カルロス ハイランド ア ベニユー 151
Claims (32)
- 【請求項１】下記工程を含んでなることを特徴とする細
胞から核酸を抽出する方法： （ａ）該細胞を溶解緩衝液の存在下にプロティナーゼＫ
を処理することにより溶解物を形成する工程、 （ｂ）該溶解物をフェノールベース溶媒系で混合してエ
マルジョンを形成する工程、 （ｃ）該エマルジョンを、混合及び遠心分離なしに、35
℃より高温に加熱して該核酸を含有する水相と該核酸を
含有する有機相とフェノール及び変成蛋白質を含んでな
る有機相への分離を促進する工程、及び （ｄ）該有機相を除去して該核酸を含有する残存水相を
残す工程。 - 【請求項２】工程（ｃ）における温度が45℃より大きい
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】工程（ｃ）における温度が約55℃である特
許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）が順番にＮ
回繰返され、Ｎが１より大であるか或いは等しい特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）がＮ回繰返
された後に残りの水相をクロロホルムと混合してエマル
ジョンを形成し、及び工程（ｃ）及び（ｄ）を繰返して
該核酸を含有する水相を残す特許請求の範囲第４項記載
の方法。 - 【請求項６】クロロホルムと混合後の残存水相が透析さ
れる特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】工程（ｃ）の温度が約55℃である特許請求
の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項８】該フェノールベース溶媒系がフエノール、
クロロホルム及び抗界面活性剤の混合物よりなる特許請
求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項９】フェノール対クロロホルム対イソアミルア
ルコールの比が約50:48:1である特許請求の範囲第８項
記載の方法。 - 【請求項１０】該溶解緩衝液が洗剤及び高濃度の塩を含
んでなる特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項１１】該溶解緩衝液が更にカオトロピック剤を
含んでなる特許請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項１２】該溶解緩衝液が更にキレート化剤を含ん
でなる特許請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項１３】該溶解緩衝液が更に緩衝液を含んでなる
特許請求の範囲第12項記載の方法。 - 【請求項１４】該溶解緩衝液が尿素、0.5〜２のモル濃
度を有するNacl、洗剤Tris−HCl、及びEDTAを含んでな
る特許請求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項１５】溶解緩衝液が8M尿素、1M NaCl、１％SD
S、50mM Tris−HCl、及び10mM EDTA、pH8.0を含んで
なる特許請求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項１６】更にエマルジョンの表面積を増大して更
に相分離を促進する工程（ｅ）を含み、工程（ｅ）が工
程（ｃ）の後、しかし工程（ｄ）の前に行われる特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１７】工程（ｂ），（ｃ），（ｅ）及び（ｄ）
がその順序でＮ回繰返され、Ｎが１よりも大きいか或い
は等しい数である特許請求の範囲第16項記載の方法。 - 【請求項１８】工程（ｂ），（ｃ），（ｅ）及び（ｄ）
がＮ回繰返された後に残存水相がクロロホルムと混合さ
れてエマルジョンを形成し、及び工程（ｃ），（ｅ）及
び（ｄ）がその順序で繰返されて該核酸を含有する水相
を残す特許請求の範囲第16項記載の方法。 - 【請求項１９】クロロホルムと混合後の残存水相が透析
される特許請求の範囲第16項記載の方法。 - 【請求項２０】下記装置を含んでなる細胞から核酸を抽
出するための装置： 該細胞を保持するための抽出容器、 該抽出容器に試薬を移送し及び該抽出容器から流体を除
去するための移送装置、 該抽出容器の内容物を加熱するための加熱器、 該抽出容器の内容物の温度を測定するための温度測定装
置、 該細胞から放出された該核酸が破砕されないように該抽
出容器を振動させて該細胞と該試薬を混合させるための
モータ、 該加熱器、該モータ、及び該移送装置に連結され、予め
プログラムされた１組の指令に従って操作し、溶解試薬
の該移送装置によって該抽出容器中への供給をコントロ
ールし、これによって溶解物を生成し、抽出溶媒試薬の
該移送装置によって該抽出容器への供給をコントロール
し、水性成分と有機成分と、該水性成分と有機成分の一
方に含まれる該核酸との流体エマルジョンを生成するよ
うに、該モータによる該溶離物と該抽出溶媒試薬の混合
をコントロールし、混合及び遠心分離なしに、該有機成
分と水性成分の分離を行うように、該エマルジョンを該
加熱器により予めプログラムされた温度まで予めプログ
ラムされた時間で加熱をコントロールし、該核酸を除去
するため該抽出容器から該有機成分と水性成分の一方を
該移送手段により除去することをコントロールするため
のコンピュータ。 - 【請求項２１】該エマルジョンが分離中に混合中の平均
よりも大きい表面積を有する位置であって分離中に水平
面に対して固定されている該位置まで該抽出容器を回転
させるように、該コンピュータが該モータをコントロー
ルする特許請求の範囲第20項記載の装置。 - 【請求項２２】更に、該移送装置を介して該抽出容器に
連結された透析装置を含み、該移送装置が流体を該透析
装置からおよび該透析装置へ供給する装置を含んでなる
特許請求の範囲第20項記載の方法。 - 【請求項２３】該透析装置が透析液貯蔵器、濾過器、お
よび透析中に該濾過器を通って該透析液貯蔵器に戻る透
析液を再循環させるための再循環装置を含んでなる特許
請求の範囲第22項記載の装置。 - 【請求項２４】該抽出容器が複数の独立した抽出容器を
含み、該装置が更に該抽出容器から該水性部分を透析す
るためのユニットと共に連結された独立した透析量を有
する透析カートリッジを含み、該透析カートリッジが、
各透析量が対応する抽出容器に連結されるように該抽出
容器に直接取り外し可能に連結されてなる特許請求の範
囲第20項記載の装置。 - 【請求項２５】細胞から核酸を抽出するための装置にお
いて下記装置を含んでなることを特徴とする水相と有機
相よりなるエマルジョンの相分離の速度を高めるための
装置： エマルジョンを含有するための抽出容器であって、該エ
マルジョンが溶解細胞から放出した核酸および抽出溶媒
からなり、該抽出容器が第一の断面積を該抽出容器を通
る水平面に有し、水平面に対して角度をつけて傾いた面
に第二の断面積を有し、該第二の断面積は該第一の断面
積よりも大きい、該抽出容器、 該装置をコントロールするためのコントロール装置、 該抽出容器を垂直面に対して該角度によって回転するた
め、および該角度にて静止した該抽出容器を保持するた
めの該抽出容器に連結した駆動軸を有するモータ、 該エマルジョンを少なくとも35℃まで加熱するための加
熱器、 該抽出容器を該角度にて相分離中に該抽出容器を保持
し、該加熱器が該エマルジョンを少なくとも35℃まで相
分離中に加熱するように、該モータと該加熱器をコント
ロールするためのコントロール装置。 - 【請求項２６】下記装置を含んでなることを特徴とする
細胞からの核酸の自動化抽出のための装置： 該抽出に用いられる試薬を保持するための保持装置、 該抽出をコントロールするためのコンピュータ、 該細胞を含有するための抽出容器、 複数の出入口を有する第一のバルブブロックであって、
該コンピュータからの該試薬を該抽出容器に移送するこ
とを指示するための信号に対して応答するものである該
第一のバルブブロック、 該コンピュータからの該抽出容器を加熱するための信号
に応答する加熱装置、 該試薬を該保持装置から該第一のバルブブロックに、及
び第一のバルブブロックから該抽出容器に移送するため
に該コンピュータに応答する移送装置であって、該移送
装置は又該抽出容器の底部から流体を取出すためのもの
であり、且つ該流体を該底部部分から該第一のバルブブ
ロックに移送するためのものである該移送装置、 該抽出容器をゆすってその中に含有される試薬及び細胞
を混合するために、及び該細胞から放出された該溶解物
内の核酸が破砕されないようにその中に含まれる試薬及
び溶解物を混合するために、該コンピュータからの信号
に応答するモータ、 該第一のバルブブロックに連結されてそれから流体を受
取り及び該第一のバルブブロックから受取った該流体の
電気伝導度を測定し、且つ該電気伝導度が所定の閾値を
越える場合に該コンピュータに信号を与えるための測定
装置。 - 【請求項２７】該抽出容器が第一の位置における場合に
は水平面内に第一の断面積を有し、水平軸の周りに角度
をつけて回転された面内において第一の断面積より大き
い第二の断面積を有するチューブを含んでなる特許請求
の範囲第26項記載の装置。 - 【請求項２８】該モータが該チューブを該角度だけ回転
させ、及び該チューブをそこに所定時間保持し、及び該
チューブを該第一の位置に戻すためのものである特許請
求の範囲第27項記載の装置。 - 【請求項２９】該抽出容器からの流体を受取るために連
結され、該抽出容器から受取った該流体を透析するため
の透析装置を更に含んでなる特許請求の範囲第26項記載
の装置。 - 【請求項３０】該透析装置が透析物を含有するための浴
容器、該浴容器に連結された該透析物の吸光度を測定す
るための分光光度計、該透析物を濾過するための該浴容
器に連結された濾過装置、及び透析物を該分光光度計及
び該濾過装置にポンプ送りし、及び該浴容器に戻すため
のポンプを含んでなる特許請求の範囲第29項記載の装
置。 - 【請求項３１】該透析装置が透析膜を保持するための保
持装置を更に含んでなる特許請求の範囲第30項記載の装
置。 - 【請求項３２】該透析装置が該透析膜を通して圧力差を
形成するための加圧装置を更に含んでなる特許請求の範
囲第31項記載の装置。
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