DD230560A3

DD230560A3 - Verfahren zur isolierung und partiellen reinigung von rna

Info

Publication number: DD230560A3
Application number: DD25636183A
Authority: DD
Inventors: Robert-Matthias Leiser
Original assignee: Leiser Robert Matthias
Priority date: 1983-11-07
Filing date: 1983-11-07
Publication date: 1985-12-04

Abstract

Das Verfahren findet Anwendung bei der Isolierung und partiellen Reinigung von niedermolekularer RNA, z. B. Viroid-RNA, aus pflanzlichem Material, um diese RNA im weiteren entsprechend ihrer Molekuelmasse (elektrophoretische Methoden) oder Sequenz (Hybridisierungstechniken) naeher zu charakterisieren. Mit diesem Verfahren ist es moeglich, eine hohe Zahl von Parallelproben in kurzer Zeit aufzuarbeiten. Das Verfahren ist billig und kommt mit geringen Mengen pflanzlichen Ausgangsmaterials aus. Das Wesen besteht darin, dass unmittelbar nach der Phenolextraktion bzw. erster Ethanolpraezipitation ein Verfahrensschritt zur Faellung von Nukleinsaeuren bzw. abzutrennender Pflanzenzellbestandteile durch Bindung an Ionenaustauscher oder Adsorbentien oder durch Ueberfuehrung der Nukleinsaeure in unloesliche Erdalkalimetallsalze eingefuegt wird. Anschliessend wird die Nukleinsaeure durch geeignete Behandlungen wieder in Loesung gebracht bzw. von den ausgefaellten Zellbestandteilen getrennt und abschliessend durch Ethanolpraezipitation und -waschung konzentriert und entsalzt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Das Verfahren findet Anwendung

a) Bei Untersuchungen niedermolekularer RNA, ζ. B. Viroid-RNA, aus pflanzlichen Gewerben und ist Voraussetzung und Vorbereitung von Expressanalysen dieser Gewebe mittels Polyacrylamidgelelektrophorese und/oder Bindung von RNA zwecks nachfolgender Analyse durch Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-Molekülen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Für die Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA wurden wiederholt Methoden und deren Modifikationen beschrieben (Morris und Smith, 1977; Mosch u.a., 1978; Horst und Kawamoto, 1980; Niblett u.a., 1980; Randies u.a., 1980). Insbesondere in den beiden erstgenannten Publikationen Verfahren beschrieben, die als Expressmethoden zur Analyse von Viroid-RNA vorgeschlagen werden. Diese Methoden beruhen auf einer oder wiederholter Phenolextraktion unter Zusatz von hochmolarem Puffer, der selektiven Präzipitation bestimmter Nukleinsäurefraktionen durch LiCI-Aussalzungen und partiellen Reinigung durch Dialyse und wiederholte Ethanolpräzipitation. Die anschließende RNA-Analyse erfolgt durch Elektrophorese in Polyacrylamidgel. Der Nachteil der beschriebenen Lösungen besteht in erster Linie in dem notwendigen Arbeitsaufwand (60 Stunden bzw. 24 Arbeitsstunden) bei der Isolierung und Reinigung der RNA, wodurch die Anzahl der Analysenproben beschränkt ist. Ein weiterer Nachteil besteht in den relativ hohen Kosten für Reagentien sowie der notwendigen Menge an pflanzlichem Ausgangsmaterial. Für die Analyse von Nukleinsäuren mittels komplementärer Nukleinsäurestränge sind bisher stets relativ aufwendige Verfahren zur Isolierung der zu analysierenden Proben beschrieben und angewendet worden, wodurch die Potenzen der Analysemethode, eine Vielzahl von Parallelproben zu bearbeiten, nicht ausgeschöpft werden konnten (Allen und Dale, 1981; Palukaitis u.a., 1981; Harrison u.a., 1983).

Ziel der Erfindung

Durch die Anwendung der vorgelegten Erfindung ist es möglich, die Isolierung und elektrophoretische Analyse z.B. von Viroid-innerhalb von sechs Stunden zu beenden, wobei die Isolierungskosten deutlich unter denen liegen, die bei Anwendung bekannter Methoden anfallen. Es sind mit einer Arbeitskraft jährlich bis zu 10000 Isolierungen und Analysen durchführbar. Das pflanzliche Ausgangsmaterial kann pro Probe auf 0,1 bis 0,2 g Frischmasse verringert werden. Bei Kombination der Erfindung mit Hybridisierungsanalysen ist der Probenumfang erheblich erweiterungsfähig und die erforderliche Gewebemenge weiterhin reduzierbar.

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Bei den von Morris und Smith (1977) als auch Horst und Kawamoto (1980) beschriebenen Isolierungsverfahren für Viroid-RNA mußten für eine sichere Analyse mehrere Verfahrensschritte der Trennung niedermolekularer RNA, darunter Viroid-RNA von hochmolekularer RNA sowie Polysacchariden, DNA, Farbstoffen etc. durchgeführt werden, wobei sich insbesondere Dialyseschritte ungünstig auf eine breite Anwendung der Verfahren auswirkten. Bei der Isolierung von RNA-Proben für Hybridisierungsanalysen zeichnten sich die Methoden in der Regel durch einen noch höheren Aufwand aus. Die vorgelegte Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß unmittelbar nach der Phenolextraktion des Pflanzenmaterials oder erster Ethanolpräzipitation der Nukleinsäuren ein Verfahrensschritt zur Trennung von Nukleinsäuren von anderen Zeil bestandteilen eingeschoben wird, wofür Ionenaustauscher oder Adsorbentien verwendet bzw. die Nukleinsäuren in unlösliche Erdalkalimetallsalze überführt werden, wodurch sich das gesamte Isolierungs- und Reinigungsverfahren soweit vereinfachen läßt, daß der Arbeitsaufwand erheblich reduziert werden kann. Nach der oben geschilderten Behandlung des Pflanzenextraktes mit Ionenaustauschern, Adsorbentjeruxier Erdalkalimetallsalzen wird die RNA von anderen Zellbestandteilen durch Zentrifugation getrennt. Erfolgt bei letzterem die Überführung der RNA in das Zentrifugationssediment, wird sie nach Abtrennung des Überstandes durch geeignete Mittel wieder in Lösung gebracht und weiterverarbeitet. Im entgegengesetzten Falle wird der RNA-haltige Überstand vom Zentrifugationssediment getrennt und weiterverarbeitet. Die Weiterverarbeitung besteht in der Regel in Ethanolpräzipitation und -waschung

Das Verfahren gliedert sich in folgende Schritte:

Extraktion: Die Extraktion kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden. Um die Menge an Ausgangsmaterial zu reduzieren und möglichst viele Parallelproben vorbereiten zu können, ist es günstig, in Mikrohomogenisatoren zu extrahieren oder den Pflanzenpreßsaft durch eine Motorwalzenpresse zu gewinnen. Im ersteren Falle wird direkt im Phenol-Chloroform-Puffer-Gemisch homogenisiert, im zweiten Falle werden die Pflanzensafttropfen in mit Phenol-Chloroform-Gemisch gefüllten Röhrchen gesammelt und anschließend durch Schütteln emulgiert.

Zur Brechung der Emulsion wird kurzzeitig zentrifugiert. In einigen Verfahrensvarianten ist es günstig, vor der weiteren Verarbeitung die Nukleinsäuren durch seine erste Ethanolpräzipitation und Resuspension zu konzentrieren. Die Nukleinsäuren werden durch Ionenaustauscher, Adsorbentien oder Erdalkalimetallsalze gefällt (oder im umgekehrten Falle die abzutrennenden Ballaststoffe gefällt) und durch Zentrifugation abgetrennt.

Durch geeignete Elutionsmittel oder Komplexone (Chelate) werden die Nukleinsäuren in Lösung gebracht bzw. der nukleinsäurehaltige Zentrifugationsüberstand gewonnen.

Die Nukleinsäuren werden durch Zugabe von Ethanol präzipitiert, durch Ethanolwaschungen entsalzt und abschließend in geeigneten Puffern oder in Wasser gelöst. Die Ethanolpräzipitation wird zweckmäßigerweise in Trockeneis-Alkohol-Bad durchgeführt, um die Bearbeitungszeit weiterhin zu verkürzen.

Ausführungsbeispiele

Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA unter Einsatz von DEAE-Cellulose

(1) Das Blattmaterial (in diesem Falle wurde mit dem chrysanthemum stunt viroid-infizierten Chrysanthemenmaterial gearbeitet) wird im Gemisch aus 0,1 M Tris-HCI pH7,5 mit 1 M NaCI, wassergesättigtem Phenol mit 0,1 % 8-Hydroxychinolin und Chloroform (1 g : 5ml : 5ml : 5ml) unter Kühlung homogenisiert.

(2) Die Emulsion wird durch Zentrifugation 5 bis 20min bei 6000 bis 1 500xg gebrochen, die wäßrige Phase abgesaugt und

(3) aus ihr die Nukleinsäuren durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol und einstündige Inkubation bei —20°C (oder zehnminütige Inkubation bei —70°C) präzipitiert.

(4) Das durch Zentrifugation (10min bei 12000xg) abgetrennte Präzipat wird in 0,1 M Tris-HCI pH7,5 suspendiert (je g Blattmaterial 1 ml) und hierzu ca. 1 g gequollene DEAE-Cellulose gegeben.

(5) Nach 10- bis 20minütigem Rühren wird die DEAE-Cellulose abzentrifugiert und der Überstand verworfen.

(6) Die Cellulose wird in 0,1 Tris-HCI pH7,5 mit 1,5M NaCI aufgeschwemmt und wiederum gerührt und sedimentiert.

(7) Der Überstand wird mit 2 Volumen Ethanol versetzt und bei -20°C 60min bzw. bei -70⁰C 10min inkubiert.

(8) Das Nukleinsäurepräzipitatwird durch Zentrifugation gesammelt, mit70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in Aqua dest. gelöst.

Bei bestimmten Pflanzenherkünften ist eine vereinfachte Variante möglich: Nach Schritt (3) wird das Präzipitat in 0,1 M Tris-HCI pH 7,5 mit 1 M NaCI suspendiert und die DEAE-Cellulose in gleichem Puffer vorher äquilibriert. Im Schritt (5) wird statt des Überstandes das Sediment verworfen und der Überstand entsprechend der Schritte (7) und (8) weiterbehandelt. Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA unter Einsatz von Aluminiumphosphat-Gel.

Aus 16% Na₃PO₄ · 12H₂O und äquivalenter Menge von AICI₃ 6H₂O wird nach Millerund Schlesinger (1955) Aluminiumphosphat-Gel hergestellt und zweifach mit 0,01 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH6 gewaschen.

Nach Homogenisation und Nukleinsäurepräzipitation (in diesem Falle wurde Blattmaterial wie unter 6.1 beschrieben sowie Citrus exocortis viroid-befallene Citrusblätter verwendet) entsprechend der Punkt (1) bis (3) unter 6.1. wird (4) das Präzipitat in 2 ml/g Blattmasse von 0,01 M Phosphatpuffer pH 6 gelöst und mit ca. 2 g Aluminiumphosphat-Gel 10 min gerührt. Nach Zentrifugation (10 min bei 6000xg) werden aus dem Überstand die Nukleinsäuren präzipitiert wie in Schritten (7) und (8) unter 6.1.

Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA unter Einsatz von Aluminiumhydroxid-Gel.

Diese Variante wurde am gleichen Blattmaterial geprüft wie unter 6.2. Nach Homogenisation und Nukleinsäurepräzipitation entsprechend der Schritte (1) bis (3) unter 6.1 wird (4) das Präzipitat in 4ml je g Blattmasse Aqua dest. aufgenommen, 100μΙ einer 1%igen Silicagel-Suspension in Wasser, 6,5ml einer 1%igen AI₂(SO₄J₃ · 18H₂O-Lösung und 1,5ml einer 0,1 M NaHCO₃-Lösung zugegeben, 10min gerührt und 5min bei 4000xg zentrifugiert. Das Sediment wird mit 0,1 M Na₂CO₃/NaHCO₃pH8,0 aufgeschwemmt und durch Zentrifugation abgetrennt. Aus diesem Überstand werden die Nukleinsäuren entsprechend der Schritte (7) und (8) unter 6.1 präzipitiert.

Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA unter Einsatz von Calciumchlorid.

In diesem Ausführungsbeispiel wird die Möglichkeit einer extremen Senkung von Bearbeitungszeit und einzusetzendem Material aufgezeigt. Das Ausgangsmaterial war das gleiche wie unter 6.2.

In Mikrozentrifugenröhrchen werden jeweils 400μΙ wassergesättigten Phenols und Chloroforms vorgelegt und aus frischen oder gefrorenen Blättern mittels Walzenpresse oder Preßzange der Pflanzensaft gewonnen und unter tropfenweisem Zusatz von 0,1 M Tris-HCI pH7,5 mit 1 M NaCI die Röhrchen gefüllt (Füllvolumen 1,5ml). Bei Verwendung von jungen Chrysanthemenblättem sind 0,2 bis 0,4g Frischmasse optimal). Es folgt ein 5minütiges Schütteln (maschinell) und kurzzeitiges Zentrifugieren (5min bis 4000 bis 12000xg). 500μ.Ι des wäßrigen Überstandes werden abgenommen, in ein neues Röhrchen überführt und mit 50μΙ 2M CaCI₂ versetzt. Nach kurzem Schütteln (wenige Sekunden) wird 5min zentrifugiert (s.o.) und der Überstand verworfen. Zum Sediment werden 50μΙ 0,5M Dinatriumhydrogenethylendiamintetraacetat-2-hydrat (Na₂EDTA, Chelaplex III) pH 8,0 gegeben und nach Lösen des Sedimentes mit Aqua dest. auf 350μΙ verdünnt. Es folgt die Ethanolpräzipitation der Nukleinsäuren entsprechend der Schritte (7) und (8) unter 6.1.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Isolierung und partiellen Reinigung von RNA, insbesondere Viroid-RNA, aus pflanzlichem Ausgangsmaterial durch Homogenisieren des Materials in Puffer-Phenol-Chloroform-Gemisch, Brechen der Emulsion durch Zentrifugieren, Präzipitieren und Waschen der Nukleinsäuren mittels Ethanol, dadurch gekennzeichnet, daß entweder unmittelbar nach der Phenolextraktion oder nach erster Ethanolpräzipitation die RNA durch Verwendung von Ionenaustauschern oder Adsorbentien oder durch Überführen in unlöslichen Erdalkalimetallsalze von anderen Zellbestandteilen getrennt werden.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß DEAE-Ionenaustauscher verwendet wird.
3. Verfahren gemäß Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Nukleinsäuren an DEAE-Ionenaustauscher gebunden und durch Puffer höherer lonenstärke wieder eluiert werden.
4. Verfahren gemäß Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher so voräquilibriert wird, daß die Nukleinsäuren in der freien Phase bleiben und abzutrennende Blattsaftkomponenten an den Ionenaustauscher gebunden werden.
5. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Adsorptionsmittel Aluminiumphosphat-Gel verwendet wird.
6. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Adsorptionsmittel Aluminiumhydroxid-Gel verwendet wird.
7. Verfahren gemäß Punkt 5 oder 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Nukleinsäuren an das Adsorptionsmittel gebunden werden und nach Abtrennung von nicht gebundenen Komponenten durch Puffer veränderter lonenstärke und/oder pH wieder eluiert werden.
8. Verfahren gemäß Punkt 5 oder 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Nukleinsäuren in der freien Phase bleiben und abzutrennende Blattsaftkomponenten an das Adsorptionsmittel gebunden werden.
9. Verfahren gemäß Punkt 7 oder 8, gekennzeichnet dadurch, daß das Adsorptionsmittel erst beim Mischen der Ausgangssubstanzen mit der Nukleinsäurepräparation geliert und dabei die abzutrennenden Stoffe adsorbiert.
10. Verfahren gemäß Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß als Adsorptionsmittel Aluminiumhydroxid-Gel verwendet wird.
11. Verfahren gemäß Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß als Adsorptionsmittel Aluminiumphosphat-Gel verwendet wird.
12. Verfahren gemäß Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß als Adsorptionsmittel Aluminiumhydroxid-Gel verwendet wird.·
13. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Nukleinsäuren als Erdalkalimetall-Nukleat ausgefällt werden und anschließend durch Komplexone wieder in Lösung gebracht werden.
14. Verfahren gemäß Punkt 13, gekennzeichnet dadurch, daß das zur Nukleinsäurefällung benutzte Erdalkalimetallsalz Calciumchlorid ist.
15. Verfahren gemäß Punkt 13, gekennzeichnet dadurch, daß zur Lösung des unlöslichen Nukleates als Komplexon Dinatriumdihydrogenethylendiamintetraacetat-2-hydrat verwendet wird.
16. Verfahren gemäß Punkt 14, das gekennzeichnet ist dadurch, daß zur Lösung des unlöslichen Nukleates als Komplexon Dinatriumhydrogenethylendiamintetraacetat-2-hydrat verwendet wird.