DD230560A3 - METHOD OF ISOLATING AND PARTIALLY CLEANING RNA - Google Patents
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Abstract
Das Verfahren findet Anwendung bei der Isolierung und partiellen Reinigung von niedermolekularer RNA, z. B. Viroid-RNA, aus pflanzlichem Material, um diese RNA im weiteren entsprechend ihrer Molekuelmasse (elektrophoretische Methoden) oder Sequenz (Hybridisierungstechniken) naeher zu charakterisieren. Mit diesem Verfahren ist es moeglich, eine hohe Zahl von Parallelproben in kurzer Zeit aufzuarbeiten. Das Verfahren ist billig und kommt mit geringen Mengen pflanzlichen Ausgangsmaterials aus. Das Wesen besteht darin, dass unmittelbar nach der Phenolextraktion bzw. erster Ethanolpraezipitation ein Verfahrensschritt zur Faellung von Nukleinsaeuren bzw. abzutrennender Pflanzenzellbestandteile durch Bindung an Ionenaustauscher oder Adsorbentien oder durch Ueberfuehrung der Nukleinsaeure in unloesliche Erdalkalimetallsalze eingefuegt wird. Anschliessend wird die Nukleinsaeure durch geeignete Behandlungen wieder in Loesung gebracht bzw. von den ausgefaellten Zellbestandteilen getrennt und abschliessend durch Ethanolpraezipitation und -waschung konzentriert und entsalzt.The method finds application in the isolation and partial purification of low molecular weight RNA, e.g. B. Viroid RNA, from plant material to further characterize this RNA according to their molecular mass (electrophoretic methods) or sequence (hybridization techniques) closer. With this method, it is possible to process a large number of parallel samples in a short time. The method is cheap and comes with small amounts of vegetable starting material. The essence is that immediately after the phenol extraction or first ethanol precipitation, a process step for the precipitation of nucleic acids or plant cell components to be separated by binding to ion exchangers or adsorbents or by transferring the nucleic acid into non-alkaline alkaline earth metal salts is inserted. Subsequently, the nucleic acid is brought back into solution by means of suitable treatments or separated from the precipitated cell constituents and finally concentrated and desalted by ethanol precipitation and washing.
Description
Das Verfahren findet AnwendungThe method is used
a) Bei Untersuchungen niedermolekularer RNA, ζ. B. Viroid-RNA, aus pflanzlichen Gewerben und ist Voraussetzung und Vorbereitung von Expressanalysen dieser Gewebe mittels Polyacrylamidgelelektrophorese und/oder Bindung von RNA zwecks nachfolgender Analyse durch Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-Molekülen.a) In studies of low molecular weight RNA, ζ. B. Viroid RNA, from plant industries and is a prerequisite and preparation of express analyzes of these tissues by polyacrylamide gel electrophoresis and / or binding of RNA for the purpose of subsequent analysis by hybridization with complementary nucleic acid molecules.
Für die Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA wurden wiederholt Methoden und deren Modifikationen beschrieben (Morris und Smith, 1977; Mosch u.a., 1978; Horst und Kawamoto, 1980; Niblett u.a., 1980; Randies u.a., 1980). Insbesondere in den beiden erstgenannten Publikationen Verfahren beschrieben, die als Expressmethoden zur Analyse von Viroid-RNA vorgeschlagen werden. Diese Methoden beruhen auf einer oder wiederholter Phenolextraktion unter Zusatz von hochmolarem Puffer, der selektiven Präzipitation bestimmter Nukleinsäurefraktionen durch LiCI-Aussalzungen und partiellen Reinigung durch Dialyse und wiederholte Ethanolpräzipitation. Die anschließende RNA-Analyse erfolgt durch Elektrophorese in Polyacrylamidgel. Der Nachteil der beschriebenen Lösungen besteht in erster Linie in dem notwendigen Arbeitsaufwand (60 Stunden bzw. 24 Arbeitsstunden) bei der Isolierung und Reinigung der RNA, wodurch die Anzahl der Analysenproben beschränkt ist. Ein weiterer Nachteil besteht in den relativ hohen Kosten für Reagentien sowie der notwendigen Menge an pflanzlichem Ausgangsmaterial. Für die Analyse von Nukleinsäuren mittels komplementärer Nukleinsäurestränge sind bisher stets relativ aufwendige Verfahren zur Isolierung der zu analysierenden Proben beschrieben und angewendet worden, wodurch die Potenzen der Analysemethode, eine Vielzahl von Parallelproben zu bearbeiten, nicht ausgeschöpft werden konnten (Allen und Dale, 1981; Palukaitis u.a., 1981; Harrison u.a., 1983).For the isolation and partial purification of viroid RNA, methods and their modifications have been described repeatedly (Morris and Smith, 1977, Mosch et al., 1978, Horst and Kawamoto, 1980, Niblett et al., 1980, Randies et al., 1980). Especially in the first two publications described methods that are proposed as express methods for the analysis of viroid RNA. These methods are based on one or repeated phenol extraction with the addition of high molecular weight buffer, the selective precipitation of certain nucleic acid fractions by LiCI salting out and partial purification by dialysis and repeated ethanol precipitation. The subsequent RNA analysis is carried out by electrophoresis in polyacrylamide gel. The disadvantage of the described solutions consists primarily in the necessary workload (60 hours or 24 working hours) in the isolation and purification of the RNA, whereby the number of analysis samples is limited. Another disadvantage is the relatively high cost of reagents as well as the necessary amount of vegetable source material. For the analysis of nucleic acids by means of complementary nucleic acid strands, relatively expensive methods for isolating the samples to be analyzed have hitherto always been described and applied, whereby the potentials of the analytical method of processing a large number of parallel samples could not be exhausted (Allen and Dale, 1981; Palukaitis et al., 1981; Harrison et al., 1983).
Durch die Anwendung der vorgelegten Erfindung ist es möglich, die Isolierung und elektrophoretische Analyse z.B. von Viroid-innerhalb von sechs Stunden zu beenden, wobei die Isolierungskosten deutlich unter denen liegen, die bei Anwendung bekannter Methoden anfallen. Es sind mit einer Arbeitskraft jährlich bis zu 10000 Isolierungen und Analysen durchführbar. Das pflanzliche Ausgangsmaterial kann pro Probe auf 0,1 bis 0,2 g Frischmasse verringert werden. Bei Kombination der Erfindung mit Hybridisierungsanalysen ist der Probenumfang erheblich erweiterungsfähig und die erforderliche Gewebemenge weiterhin reduzierbar.By applying the present invention, it is possible to provide isolation and electrophoretic analysis e.g. Viroid-within six hours, the isolation costs are significantly lower than those incurred using known methods. Up to 10000 isolations and analyzes can be carried out each year with one manpower. The vegetable starting material can be reduced per sample to 0.1 to 0.2 g fresh mass. When combining the invention with hybridization analyzes, the sample size is considerably expandable and the required amount of tissue can still be reduced.
- 2 - ΌΟύ D I- 2 - ΌΟύ DI
Bei den von Morris und Smith (1977) als auch Horst und Kawamoto (1980) beschriebenen Isolierungsverfahren für Viroid-RNA mußten für eine sichere Analyse mehrere Verfahrensschritte der Trennung niedermolekularer RNA, darunter Viroid-RNA von hochmolekularer RNA sowie Polysacchariden, DNA, Farbstoffen etc. durchgeführt werden, wobei sich insbesondere Dialyseschritte ungünstig auf eine breite Anwendung der Verfahren auswirkten. Bei der Isolierung von RNA-Proben für Hybridisierungsanalysen zeichnten sich die Methoden in der Regel durch einen noch höheren Aufwand aus. Die vorgelegte Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß unmittelbar nach der Phenolextraktion des Pflanzenmaterials oder erster Ethanolpräzipitation der Nukleinsäuren ein Verfahrensschritt zur Trennung von Nukleinsäuren von anderen Zeil bestandteilen eingeschoben wird, wofür Ionenaustauscher oder Adsorbentien verwendet bzw. die Nukleinsäuren in unlösliche Erdalkalimetallsalze überführt werden, wodurch sich das gesamte Isolierungs- und Reinigungsverfahren soweit vereinfachen läßt, daß der Arbeitsaufwand erheblich reduziert werden kann. Nach der oben geschilderten Behandlung des Pflanzenextraktes mit Ionenaustauschern, Adsorbentjeruxier Erdalkalimetallsalzen wird die RNA von anderen Zellbestandteilen durch Zentrifugation getrennt. Erfolgt bei letzterem die Überführung der RNA in das Zentrifugationssediment, wird sie nach Abtrennung des Überstandes durch geeignete Mittel wieder in Lösung gebracht und weiterverarbeitet. Im entgegengesetzten Falle wird der RNA-haltige Überstand vom Zentrifugationssediment getrennt und weiterverarbeitet. Die Weiterverarbeitung besteht in der Regel in Ethanolpräzipitation und -waschungIn the case of viroid RNA isolation procedures described by Morris and Smith (1977) as well as Horst and Kawamoto (1980), several steps had to be taken to separate low molecular weight RNA, including viroid RNA from high molecular weight RNA and polysaccharides, DNA, dyes, etc. for safe analysis. In particular, dialysis steps had an unfavorable effect on a broad application of the method. When isolating RNA samples for hybridization analysis, the methods usually required even more effort. The submitted invention is characterized in that immediately after the phenol extraction of the plant material or first ethanol precipitation of the nucleic acids, a method step for separating nucleic acids from other Zeil components is inserted, for which ion exchangers or adsorbents used or the nucleic acids are converted into insoluble alkaline earth metal salts, whereby the simplify the entire insulation and cleaning process so far that the amount of work can be significantly reduced. After the above-described treatment of the plant extract with ion exchangers , A dsor bentjeru xier alkaline earth metal salts , the RNA is separated from other n cell constituents by centrifugation. If in the latter the transfer of the RNA into the centrifugation sediment, it is brought back into solution after separation of the supernatant by suitable means and further processed. In the opposite case, the RNA-containing supernatant is separated from the centrifugation sediment and processed further. The further processing usually consists in ethanol precipitation and washing
Das Verfahren gliedert sich in folgende Schritte: The procedure is divided into the following steps:
Extraktion: Die Extraktion kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden. Um die Menge an Ausgangsmaterial zu reduzieren und möglichst viele Parallelproben vorbereiten zu können, ist es günstig, in Mikrohomogenisatoren zu extrahieren oder den Pflanzenpreßsaft durch eine Motorwalzenpresse zu gewinnen. Im ersteren Falle wird direkt im Phenol-Chloroform-Puffer-Gemisch homogenisiert, im zweiten Falle werden die Pflanzensafttropfen in mit Phenol-Chloroform-Gemisch gefüllten Röhrchen gesammelt und anschließend durch Schütteln emulgiert.Extraction: The extraction can be done in different ways. In order to reduce the amount of starting material and to be able to prepare as many parallel samples as possible, it is advantageous to extract in microhomogenizers or to obtain the plant juice by means of a motor roller press. In the former case is homogenized directly in the phenol-chloroform-buffer mixture, in the second case, the plant juice drops are collected in phenol-chloroform-filled tubes and then emulsified by shaking.
Zur Brechung der Emulsion wird kurzzeitig zentrifugiert. In einigen Verfahrensvarianten ist es günstig, vor der weiteren Verarbeitung die Nukleinsäuren durch seine erste Ethanolpräzipitation und Resuspension zu konzentrieren. Die Nukleinsäuren werden durch Ionenaustauscher, Adsorbentien oder Erdalkalimetallsalze gefällt (oder im umgekehrten Falle die abzutrennenden Ballaststoffe gefällt) und durch Zentrifugation abgetrennt.To break the emulsion is centrifuged briefly. In some process variants it is favorable to concentrate the nucleic acids by its first ethanol precipitation and resuspension before further processing. The nucleic acids are precipitated by ion exchangers, adsorbents or alkaline earth metal salts (or in the opposite case, the fibers to be separated are precipitated) and separated by centrifugation.
Durch geeignete Elutionsmittel oder Komplexone (Chelate) werden die Nukleinsäuren in Lösung gebracht bzw. der nukleinsäurehaltige Zentrifugationsüberstand gewonnen.By means of suitable eluents or complexones (chelates), the nucleic acids are brought into solution or the nucleic acid-containing centrifugation supernatant is recovered.
Die Nukleinsäuren werden durch Zugabe von Ethanol präzipitiert, durch Ethanolwaschungen entsalzt und abschließend in geeigneten Puffern oder in Wasser gelöst. Die Ethanolpräzipitation wird zweckmäßigerweise in Trockeneis-Alkohol-Bad durchgeführt, um die Bearbeitungszeit weiterhin zu verkürzen.The nucleic acids are precipitated by addition of ethanol, desalted by ethanol washes and finally dissolved in suitable buffers or in water. The ethanol precipitation is conveniently carried out in dry ice-alcohol bath to further shorten the processing time.
Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA unter Einsatz von DEAE-CelluloseIsolation and partial purification of viroid RNA using DEAE-cellulose
(1) Das Blattmaterial (in diesem Falle wurde mit dem chrysanthemum stunt viroid-infizierten Chrysanthemenmaterial gearbeitet) wird im Gemisch aus 0,1 M Tris-HCI pH7,5 mit 1 M NaCI, wassergesättigtem Phenol mit 0,1 % 8-Hydroxychinolin und Chloroform (1 g : 5ml : 5ml : 5ml) unter Kühlung homogenisiert.(1) The leaf material (in this case worked with chrysanthemum stunt viroid-infected chrysanthemum material) is mixed in the mixture of 0.1 M Tris-HCl pH7.5 with 1 M NaCl, water-saturated phenol with 0.1% 8-hydroxyquinoline and Chloroform (1 g: 5 ml: 5 ml: 5 ml) homogenized with cooling.
(2) Die Emulsion wird durch Zentrifugation 5 bis 20min bei 6000 bis 1 500xg gebrochen, die wäßrige Phase abgesaugt und(2) The emulsion is broken by centrifugation for 5 to 20min at 6000 to 1500xg, the aqueous phase is filtered off with suction and
(3) aus ihr die Nukleinsäuren durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol und einstündige Inkubation bei —20°C (oder zehnminütige Inkubation bei —70°C) präzipitiert.(3) from which the nucleic acids are precipitated by adding 2 volumes of ethanol and incubating for 1 hour at -20 ° C (or incubation at -70 ° C for 10 minutes).
(4) Das durch Zentrifugation (10min bei 12000xg) abgetrennte Präzipat wird in 0,1 M Tris-HCI pH7,5 suspendiert (je g Blattmaterial 1 ml) und hierzu ca. 1 g gequollene DEAE-Cellulose gegeben.(4) The precipitate separated by centrifugation (10 min at 12,000 × g) is suspended in 0.1 M Tris-HCl pH7.5 (1 ml per g of leaf material) and about 1 g of swollen DEAE-cellulose is added thereto.
(5) Nach 10- bis 20minütigem Rühren wird die DEAE-Cellulose abzentrifugiert und der Überstand verworfen.(5) After stirring for 10 to 20 minutes, the DEAE-cellulose is centrifuged off and the supernatant discarded.
(6) Die Cellulose wird in 0,1 Tris-HCI pH7,5 mit 1,5M NaCI aufgeschwemmt und wiederum gerührt und sedimentiert.(6) The cellulose is suspended in 0.1% Tris-HCl pH 7.5 with 1.5M NaCl and stirred again and sedimented.
(7) Der Überstand wird mit 2 Volumen Ethanol versetzt und bei -20°C 60min bzw. bei -700C 10min inkubiert.(7) The supernatant is mixed with 2 volumes of ethanol and incubated at -20 ° C for 60min or at -70 0 C for 10min.
(8) Das Nukleinsäurepräzipitatwird durch Zentrifugation gesammelt, mit70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in Aqua dest. gelöst.(8) The nucleic acid precipitate is collected by centrifugation, washed with 70% ethanol, dried and distilled in aqua. solved.
Bei bestimmten Pflanzenherkünften ist eine vereinfachte Variante möglich: Nach Schritt (3) wird das Präzipitat in 0,1 M Tris-HCI pH 7,5 mit 1 M NaCI suspendiert und die DEAE-Cellulose in gleichem Puffer vorher äquilibriert. Im Schritt (5) wird statt des Überstandes das Sediment verworfen und der Überstand entsprechend der Schritte (7) und (8) weiterbehandelt. Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA unter Einsatz von Aluminiumphosphat-Gel.For certain plant origins, a simplified variant is possible: After step (3), the precipitate is suspended in 0.1 M Tris-HCl pH 7.5 with 1 M NaCl and the DEAE-cellulose in the same buffer previously equilibrated. In step (5), instead of the supernatant, the sediment is discarded and the supernatant treated according to steps (7) and (8). Isolation and partial purification of viroid RNA using aluminum phosphate gel.
Aus 16% Na3PO4 · 12H2O und äquivalenter Menge von AICI3 6H2O wird nach Millerund Schlesinger (1955) Aluminiumphosphat-Gel hergestellt und zweifach mit 0,01 M Na2HPO4/NaH2PO4 pH6 gewaschen.From 16% Na 3 PO 4 .12H 2 O and equivalent amount of AICI 3 6H 2 O, aluminum phosphate gel is prepared according to Miller and Schlesinger (1955) and washed twice with 0.01 M Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 pH 6.
Nach Homogenisation und Nukleinsäurepräzipitation (in diesem Falle wurde Blattmaterial wie unter 6.1 beschrieben sowie Citrus exocortis viroid-befallene Citrusblätter verwendet) entsprechend der Punkt (1) bis (3) unter 6.1. wird (4) das Präzipitat in 2 ml/g Blattmasse von 0,01 M Phosphatpuffer pH 6 gelöst und mit ca. 2 g Aluminiumphosphat-Gel 10 min gerührt. Nach Zentrifugation (10 min bei 6000xg) werden aus dem Überstand die Nukleinsäuren präzipitiert wie in Schritten (7) und (8) unter 6.1.After homogenization and nucleic acid precipitation (in this case, leaf material as described in 6.1 and Citrus exocortis viroid-infected citrus leaves was used) according to the items (1) to (3) in 6.1. (4) the precipitate is dissolved in 2 ml / g leaf mass of 0.01 M phosphate buffer pH 6 and stirred with about 2 g of aluminum phosphate gel for 10 min. After centrifugation (10 min at 6000xg), the nucleic acids are precipitated from the supernatant as in steps (7) and (8) under 6.1.
Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA unter Einsatz von Aluminiumhydroxid-Gel.Isolation and partial purification of viroid RNA using aluminum hydroxide gel.
Diese Variante wurde am gleichen Blattmaterial geprüft wie unter 6.2. Nach Homogenisation und Nukleinsäurepräzipitation entsprechend der Schritte (1) bis (3) unter 6.1 wird (4) das Präzipitat in 4ml je g Blattmasse Aqua dest. aufgenommen, 100μΙ einer 1%igen Silicagel-Suspension in Wasser, 6,5ml einer 1%igen AI2(SO4J3 · 18H2O-Lösung und 1,5ml einer 0,1 M NaHCO3-Lösung zugegeben, 10min gerührt und 5min bei 4000xg zentrifugiert. Das Sediment wird mit 0,1 M Na2CO3/NaHCO3pH8,0 aufgeschwemmt und durch Zentrifugation abgetrennt. Aus diesem Überstand werden die Nukleinsäuren entsprechend der Schritte (7) und (8) unter 6.1 präzipitiert.This variant was tested on the same leaf material as in 6.2. After homogenization and nucleic acid precipitation according to steps (1) to (3) under 6.1, (4) the precipitate is distilled in 4 ml per g leaf mass of Aqua dest. taken, 100μΙ a 1% silica gel suspension in water, 6.5 ml of a 1% AI 2 (SO 4 J 3 · 18H 2 O solution and 1.5 ml of a 0.1 M NaHCO 3 solution was added, stirred for 10 min The sediment is washed with 0.1 M Na 2 CO 3 / NaHCO 3 pH 8.0 and separated by centrifugation, from which supernatant the nucleic acids are precipitated under 6.1 according to steps (7) and (8).
Isolierung und partielle Reinigung von Viroid-RNA unter Einsatz von Calciumchlorid.Isolation and partial purification of viroid RNA using calcium chloride.
In diesem Ausführungsbeispiel wird die Möglichkeit einer extremen Senkung von Bearbeitungszeit und einzusetzendem Material aufgezeigt. Das Ausgangsmaterial war das gleiche wie unter 6.2.In this embodiment, the possibility of an extreme reduction of processing time and material to be used is shown. The starting material was the same as under 6.2.
In Mikrozentrifugenröhrchen werden jeweils 400μΙ wassergesättigten Phenols und Chloroforms vorgelegt und aus frischen oder gefrorenen Blättern mittels Walzenpresse oder Preßzange der Pflanzensaft gewonnen und unter tropfenweisem Zusatz von 0,1 M Tris-HCI pH7,5 mit 1 M NaCI die Röhrchen gefüllt (Füllvolumen 1,5ml). Bei Verwendung von jungen Chrysanthemenblättem sind 0,2 bis 0,4g Frischmasse optimal). Es folgt ein 5minütiges Schütteln (maschinell) und kurzzeitiges Zentrifugieren (5min bis 4000 bis 12000xg). 500μ.Ι des wäßrigen Überstandes werden abgenommen, in ein neues Röhrchen überführt und mit 50μΙ 2M CaCI2 versetzt. Nach kurzem Schütteln (wenige Sekunden) wird 5min zentrifugiert (s.o.) und der Überstand verworfen. Zum Sediment werden 50μΙ 0,5M Dinatriumhydrogenethylendiamintetraacetat-2-hydrat (Na2EDTA, Chelaplex III) pH 8,0 gegeben und nach Lösen des Sedimentes mit Aqua dest. auf 350μΙ verdünnt. Es folgt die Ethanolpräzipitation der Nukleinsäuren entsprechend der Schritte (7) und (8) unter 6.1.In Mikrozentrifugenröhrchen each 400μΙ water-saturated phenols and chloroform are presented and recovered from fresh or frozen leaves by means of roller press or Preßzange the plant juice and dropwise addition of 0.1 M Tris-HCl pH7.5 with 1 M NaCl filled the tubes (filling volume 1.5 ml ). When using young Chrysanthemumblättem 0.2 to 0.4 g fresh mass are optimal). This is followed by a 5 minute shaking (machine) and a brief centrifugation (5min to 4000 to 12000xg). 500μ.Ι of the aqueous supernatant are removed, transferred to a new tube and mixed with 50μΙ 2M CaCl 2 . After shaking briefly (a few seconds), it is centrifuged for 5 minutes (see above) and the supernatant discarded. To the sediment 50μΙ 0.5M Disodium Hydrogenethylendiamintetraacetat 2 hydrate (Na 2 EDTA, Chelaplex III) pH 8.0 and after dissolution of the sediment with distilled water. diluted to 350μΙ. This is followed by ethanol precipitation of the nucleic acids according to steps (7) and (8) under 6.1.
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25636183A DD230560A3 (en) | 1983-11-07 | 1983-11-07 | METHOD OF ISOLATING AND PARTIALLY CLEANING RNA |
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Publications (1)
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| DD230560A3 true DD230560A3 (en) | 1985-12-04 |
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ID=5551663
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| DD (1) | DD230560A3 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0215533A2 (en) * | 1985-01-18 | 1987-03-25 | Applied Biosystems, Inc. | A method of extracting nucleic acids from cells |
| WO1992018514A1 (en) * | 1991-04-12 | 1992-10-29 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Purification of nucleic acids using metal oxide supports |
-
1983
- 1983-11-07 DD DD25636183A patent/DD230560A3/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0215533A2 (en) * | 1985-01-18 | 1987-03-25 | Applied Biosystems, Inc. | A method of extracting nucleic acids from cells |
| EP0215533A3 (en) * | 1985-01-18 | 1988-06-22 | Applied Biosystems, Inc. | A method of extracting nucleic acids from cells |
| WO1992018514A1 (en) * | 1991-04-12 | 1992-10-29 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Purification of nucleic acids using metal oxide supports |
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