DE4221190A1 - Quick and simple recovery of ganglioside G LAC 2 from milk cream - by extn. with alkanol, concn. of anionic exchanger and chromatographic purificn., eliminating pollution of anionic solvents - Google Patents

Quick and simple recovery of ganglioside G LAC 2 from milk cream - by extn. with alkanol, concn. of anionic exchanger and chromatographic purificn., eliminating pollution of anionic solvents

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Abstract

Recovery of ganglioside Glac2 (I; (New Acoalpha)23Galbeta4Glcbeta1Cer) from milk cream comprises: (1) extracting the cream with a water-miscible extractant; (2) removal of the pptd. solid extract residue and reextn. of it with the same extractant; (3) purificn. of ganglioside from the extracts on an anion exchanger, and (4) chromatographic final purificn. of gangliosides. Pref. cream from bovine milk is used and the extractant is MeOh or EtOH, used at 2 vol. per vol. of cream. Step (4) is done on a silica gel column. Pref. insolubles in step (2) are removed by low-speed centrifugation or filtration. They are then extracted at least once more and gangliosides retained on the anion exchanger, then eluted in fractions. USE/ADVANTAGE - (I) is involved in tumour-associated phenomena and cell-cell recognition processes, and is used in research and industry (no details). Compared with known methods (which start from milk or buttermilk) this process is simpler, quicker, more economical and less polluting, partic. freeze-drying of the starting material is not necessary and expensive organic solvents are not required for 2-phase extn. Since fats remain in the pptn. during extn., the method is selective for gangliosides.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation des Gang­ liosids Glac2 (II3 NeuAC-LacCer) aus Milchprodukten.The invention relates to a method for isolating the ganglioside G lac 2 (II 3 NeuAC-LacCer) from milk products.

Glac2 (II3NeuAC-LacCer) ist ein Disialo-Glykosphingolipid und wird im folgenden kurz als "Glac2" bezeichnet. Erste Berichte über das Gangliosid Glac2 zwischen 1968 und 1970 machten bereits deutlich, daß es in vielen verschiedenen Geweben von unter­ schiedlichsten Tierarten vorkommt. Glac2 liegt nicht nur zell­ gebunden vor, sondern ist auch in Körperflüssigkeiten wie Serum und Milch zu finden. In diesen Flüssigkeiten bildet es wahr­ scheinlich ein Konjugat mit lipophilen Carrier-Proteinen (Glyco­ lipids, Elsevier-Verlag 1985, S. 199-260; European Journal Bio­ chemistry 181, S. 657-662; Biochimica Biophysica Acta 306, S. 82-84, 1973; Biochimica Biophysica Acta 833, S. 303-307, 1985).G lac 2 (II 3 NeuAC-LacCer) is a disialo-glycosphingolipid and is referred to below as "G lac 2". Initial reports on the ganglioside G lac 2 between 1968 and 1970 already made it clear that it occurs in many different tissues from a wide variety of animal species. G lac 2 is not only cell-bound, but can also be found in body fluids such as serum and milk. In these liquids it is likely to form a conjugate with lipophilic carrier proteins (Glyco lipids, Elsevier-Verlag 1985, pp. 199-260; European Journal Bio chemistry 181, pp. 657-662; Biochimica Biophysica Acta 306, pp. 82- 84, 1973; Biochimica Biophysica Acta 833, pp. 303-307, 1985).

Glac2 ist ein Disialo-Glykosphingolipid mit der Struktur (NeuAcoα)2 3Galβ 4Glcβ 1Cer. Trotz der Disialogruppe besitzt Glac 2 im Vergleich zu den höheren Gehirn-Gangliosiden eine ein­ fachere Struktur. Glac2 wird deshalb als ein Vorläufer der komp­ lexeren Sialoglykolipide betrachtet. Glac2 und Zellen, die einen Glac2-spezifischen Antikörper binden, wurden in solchen Zellty­ pen von späten embryonalen Stadien sowie in adultem Gewebe und Tumoren gefunden, die möglicherweise einen Hinweis auf eine neu­ roektodermale Assoziation dieses Gangliosids geben.G lac 2 is a disialo-glycosphingolipid with the structure (NeuAcoα) 2 3Galβ 4Glcβ 1Cer. Despite the disialog group, G lac 2 has a simpler structure than the higher brain gangliosides. G lac 2 is therefore considered a precursor to the more complex sialoglycolipids. G lac 2 and cells that bind a G lac 2 -specific antibody have been found in such late embryonic cell types as well as in adult tissues and tumors that may indicate a new roectodermal association of this ganglioside.

In verschiedenen Krebstypen wird Glac2 sowie das 9-O-Acetyl­ neuraminylderivat akkumuliert (European Journal of Biochemistry 166, S. 651-685, 1986). Diese Akkumulation ist wahrscheinlich die Folge davon, daß diese Zelltypen nicht mehr in der Lage sind, die entsprechenden höheren Ganglioside zu produzieren (Journal of Experimental Medicine 155, S. 1133-1147, 1982; Journal of Biological Chemistry 257, S. 12752, 1982; Proceedings of the National Academy of Science, USA 1981, S. 5767-5771; Journal of Biological Chemistry 259, S. 7453, 1984). Außerdem ist bekannt, daß Krebszellen tumorassoziierte Glykolipide aus­ scheiden. Dies könnte zum erhöhten Serumspiegel von Gangliosid Glac2 beitragen und führt zusätzlich möglicherweise zu einem geänderten Immunstatus bei an Krebs erkrankten Patienten.G lac 2 and the 9-O-acetyl neuraminyl derivative are accumulated in various types of cancer (European Journal of Biochemistry 166, pp. 651-685, 1986). This accumulation is probably due to the fact that these cell types are no longer able to produce the corresponding higher gangliosides (Journal of Experimental Medicine 155, pp. 1133-1147, 1982; Journal of Biological Chemistry 257, p. 12752, 1982 ; Proceedings of the National Academy of Science, USA 1981, pp. 5767-5771; Journal of Biological Chemistry 259, p. 7453, 1984). It is also known that cancer cells secrete tumor-associated glycolipids. This could contribute to the increased serum level of ganglioside G lac 2 and may also lead to a change in immune status in cancer patients.

In neuester Zeit wurde auch die Beteiligung von Glac2 bei der Oberflächeninteraktion von Zellen und bei der Zell-Zell-Adhäsion beschrieben (Developmental Biology 132, S. 212-229, 1989). Eine weitere entscheidende Rolle spielt Glac2 und seine 9-O-Acetyl­ neuraminyl- oder Lacton-Derivate bei der Entwicklung des Nerven- Systems.The involvement of G lac 2 in the surface interaction of cells and in cell-cell adhesion has also recently been described (Developmental Biology 132, pp. 212-229, 1989). G lac 2 and its 9-O-acetyl neuraminyl or lactone derivatives play a further crucial role in the development of the nervous system.

Die große Bedeutung von Glac2 z. B. in tumorassoziierten Phäno­ menen oder bei der Zell-Zell-Erkennung zeigt sehr deutlich, daß zukünftig ein sehr hoher Bedarf an Glykolipiden in Forschung und Industrie bestehen wird.The great importance of G lac 2 z. B. in tumor-associated phenomena or in cell-cell detection shows very clearly that there will be a very high demand for glycolipids in research and industry in the future.

Im Stand der Technik wird Glac2 aus Buttermilch (Journal of Bio­ logical Chemistry 261, S. 5625-5630, 1986; Lipids 24, S. 680-684, 1989) oder Milch gewonnen. In Biochimica Biophysica Acta 337, S. 255-270, 1974 wird die Isolation von Gangliosid Glac2 aus Rin­ dermilch beschrieben. Dieses Verfahren ist jedoch sehr energie- und zeitaufwendig, da eine Gefriertrocknung des Ausgangsmate­ rials vorgenommen werden muß. Außerdem ist an diesem Verfahren sehr nachteilig, daß umweltschädliche, teure organische Lösungs­ mittel eingesetzt werden müssen.In the prior art, G lac 2 is obtained from buttermilk (Journal of Bio logical Chemistry 261, pp. 5625-5630, 1986; Lipids 24, pp. 680-684, 1989) or milk. In Biochimica Biophysica Acta 337, pp. 255-270, 1974 the isolation of ganglioside G lac 2 from rinder milk is described. However, this process is very energy-intensive and time-consuming since freeze-drying of the starting material has to be carried out. In addition, this method is very disadvantageous in that environmentally harmful, expensive organic solvents have to be used.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Isolation von Glac2 bereitzustellen, das weniger aufwendig, kostengünstiger und umweltfreundlicher ist als die bereits be­ kannten Verfahren.It is the object of the present invention to provide a method for isolating G lac 2 which is less complex, less expensive and more environmentally friendly than the methods already known.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Gewinnung von Gang­ liosid Glac2 aus Milch gelöst, bei dem man als Ausgangsprodukt Milchrahm verwendet und das die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:This object is achieved by a process for obtaining ganglioside G lac 2 from milk, in which milk cream is used as the starting product and which comprises the following process steps:

  • (a) Extraktion des Ausgangsproduktes mit einem mit Wasser mischbaren Extraktionsmittel,(a) Extraction of the starting product with a water miscible extractant,
  • (b) Entfernen des ausgefällten festen Extraktionsrückstandes und Reextraktion dieses Rückstandes mit demselben, mit Wasser mischbaren Extraktionsmittel,(b) removing the precipitated solid extraction residue and re-extraction of this residue with the same, with Water-miscible extractant,
  • (c) Reinigung der Ganglioside aus dem erhaltenen Extrakt an einem Anionenaustauscher,(c) Purification of the gangliosides from the extract obtained an anion exchanger,
  • (d) chromatographische Endreinigung der gewonnenen Ganglioside.(d) final chromatographic purification of the gangliosides obtained.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das sehr energie- und zeitaufwendige Gefriertrockungsverfahren des Ausgangsmaterials umgangen. Außerdem können die teuren und umweltschädlichen Lö­ sungsmittel, die für eine Zweiphasen-Extraktion notwendig sind, vermieden werden. Das neue Verfahren ist außerdem technisch be­ sonders einfach und besonders schnell ausführbar. Da Fett bei dem Extraktionsschritt im Niederschlag verbleibt, ist das Ver­ fahren selektiv für Ganglioside.In the method according to the invention this is very energy and time-consuming freeze-drying process of the starting material bypassed. In addition, the expensive and environmentally harmful Lö agents necessary for a two-phase extraction, be avoided. The new process is also technically particularly easy and particularly quick to execute. Because fat at the extraction step remains in the precipitate, the Ver drive selectively for gangliosides.

In einer bevorzugten Ausführungsform dient als Ausgangsstoff für die Glac2-Isolation Milchrahm von Rindern. Das mit Wasser misch­ bare Extraktionsmittel ist vorzugsweise Methanol oder Ethanol.In a preferred embodiment, milk cream from cattle is used as the starting material for the G lac 2 isolation. The water-miscible extractant is preferably methanol or ethanol.

Bei der erfindungsgemäßen methanolischen Extraktion des Milch­ rahms fallen Milchrahmbestandteile als unlösliches Material aus, das durch eine einfache Zentrifugation bei niedrigen G-Zahlen oder durch Filtration oder durch andere an sich bekannte Tech­ niken entfernt wird. Der Extraktionsrückstand enthält auch noch Glac2 Ganglioside, die durch wiederholte Extraktion mit dem wasserlöslichen Lösungsmittel in Lösung gebracht werden können. Die so erhaltenen Extrakte werden über eine Anionenaustauscher­ säule gegeben, wobei die Ganglioside an das Austauschermaterial binden. Die gebundenen Ganglioside können dann durch eine nach­ folgende schrittweise Elution gewonnen werden. Glac2 wird dann in einem endgültigen Reinigungsschritt bevorzugt mittels einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel gereinigt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden etwa 100 mg reines Gangliosid Glac2 (76,9 µmol, entsprechend einer Ausbeute von 3,8 µmol/l Milch, siehe Fig. 1) von 1,43 ± 0,03 kg Milchrahm iso­ liert. Der Milchrahm wird nach einer an sich bekannten Methode durch 30minütige Zentrifugation von 20 bis 22 l frischer Milch bei 3100 (g) und 4°C gewonnen. Die gesamte Isolation benötigt etwa 9 Mann-Arbeitstage.In the inventive methanolic extraction of the milk cream, milk cream components fail as an insoluble material, which is removed by simple centrifugation at low G numbers or by filtration or by other techniques known per se. The extraction residue also contains G lac 2 gangliosides, which can be brought into solution by repeated extraction with the water-soluble solvent. The extracts obtained in this way are passed through an anion exchange column, the gangliosides binding to the exchange material. The bound gangliosides can then be obtained by a subsequent elution step by step. G lac 2 is then purified in a final purification step, preferably by means of column chromatography using silica gel. In the method according to the invention, about 100 mg of pure ganglioside G lac 2 (76.9 μmol, corresponding to a yield of 3.8 μmol / l milk, see FIG. 1) of 1.43 ± 0.03 kg milk cream is isolated. The milk cream is obtained according to a known method by centrifuging 20 to 22 l of fresh milk at 3100 (g) and 4 ° C. for 30 minutes. The entire isolation takes about 9 man working days.

BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Extraktion der GangliosideExtraction of the gangliosides

Zu 1 kg Milchrahm, der aus Rindermilch gewonnen wurde, wird das doppelte Volumen an Methanol hinzugefügt und die Mischung bei Raumtemperatur 15 min lang mechanisch gerührt. Nach einer 30- minütigen Zentriguation bei 3100 (g) und 4°C wird der klare Überstand abdekantiert und das Pellet wird zweimal unter den gleichen Bedingungen reextrahiert. Die dabei erhaltenen drei methanolischen Extrakte enthalten 32, 60 und 8% der im Ver­ fahren insgesamt extrahierten Glac2 Ganglioside. Double the volume of methanol is added to 1 kg of milk cream obtained from beef milk and the mixture is mechanically stirred at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 3100 (g) and 4 ° C for 30 minutes, the clear supernatant is decanted off and the pellet is re-extracted twice under the same conditions. The three methanolic extracts obtained contain 32, 60 and 8% of the total G lac 2 gangliosides extracted in the process.

Die drei Extrakte werden nachfolgend über eine DEAE-Sephadex A25 Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden: R = 1,75 cm, L = 25 cm, Volumen = 250 ml), die mit Methanol voreluiert wurde, gegeben. Die in den Extrakten enthaltenen Ganglioside binden unter diesen Bedingungen an das Austauschermaterial und können nachfolgend unter Standardbedingungen eluiert werden. Dazu wird die Säule nacheinander mit 2 l Methanol und 2 l 0,02 M methanolischem Ammoniumacetat eluiert. Mit dem Methanol werden die neutralen Komponenten eluiert und mit dem methanolischen Ammoniumacetat werden die Monosialo-Ganglioside und darunter als Hauptkomponen­ te Glac1 eluiert. Das Gangliosid Glac2 wird mittels 2 l 0,2 M methanolischem Ammoniumacetat von der Säule eluiert.The three extracts are subsequently passed through a DEAE-Sephadex A25 column (Pharmacia, Uppsala, Sweden: R = 1.75 cm, L = 25 cm, volume = 250 ml), which was pre-eluted with methanol. The gangliosides contained in the extracts bind to the exchange material under these conditions and can subsequently be eluted under standard conditions. For this purpose, the column is eluted successively with 2 l of methanol and 2 l of 0.02 M methanolic ammonium acetate. With the methanol the neutral components are eluted and with the methanolic ammonium acetate the monosialo gangliosides and below them as main components te G lac 1 are eluted. The ganglioside G lac 2 is eluted from the column using 2 l of 0.2 M methanolic ammonium acetate.

Beispiel 2Example 2 Endreinigung von Gangliosid Glac2Final cleaning of ganglioside G lac 2

Die Disialogangliosidfraktion, die von der Anionenaustauscher­ säule erhalten wird, wird durch Dialyse gegen Wasser entsalzt. Nachfolgend wird das Wasser durch Evaporation entfernt und der Rückstand wird in i-Propanol/Hexan/Wasser (55 : 40 : 5) aufgenommen und auf eine Kieselgelsäule (Kieselgel-60, Merck, Darmstadt; R = 1,5, L = 28 cm, Volumen = 200 ml) aufgetragen. Zur Gangliosid- Trennung wird ein schrittweise Gradient von i-Propanol/Hexan/ Wasser verwendet, der 5 bis 10% Wasser enthält. Das gereinigte Gangliosid Glac2 (Fig. 1) wird mit i-Propanol/Hexan/Wasser (55 : 35 : 10) spezifisch eluiert (Fig. 2).The disialoganglioside fraction, which is obtained from the anion exchange column, is desalted by dialysis against water. The water is subsequently removed by evaporation and the residue is taken up in i-propanol / hexane / water (55: 40: 5) and onto a silica gel column (Kieselgel-60, Merck, Darmstadt; R = 1.5, L = 28 cm , Volume = 200 ml). A gradual gradient of i-propanol / hexane / water containing 5 to 10% water is used for ganglioside separation. The purified ganglioside G lac 2 (Fig. 1) is specifically eluted with i-propanol / hexane / water (55: 35: 10) (Fig. 2).

Kurze Beschreibung der FigurenBrief description of the figures

Fig. 1 Dünnschichtchromatographie von Gangliosid Glac2, das aus Milchrahm von Rindern gewonnen wurde (O: Orcinol-H2SO4- Färbung; R: Resorcinol-HCl-Färbung; I: Jod-Färbung; ST: Standard ist ein Gemisch aus Gehirn-Gangliosiden. Fig. 1 Thin layer chromatography of ganglioside G lac 2, which was obtained from milk cream from cattle (O: Orcinol-H 2 SO 4 staining; R: Resorcinol-HCl staining; I: Iodine staining; ST: Standard is a mixture of Brain gangliosides.

Fig. 2 Dünnschichtchromatographische Analyse auf Disialo­ ganglioside aus Rindermilchrahm, die mittels einer Kieselgel­ chromatographie erhalten wurde. Die Anteile der einzelnen Kom­ ponenten in dem Elutionsmittel i-Propanol/Hexan/Wasser sind an­ gegeben. St1: Gehirnganglioside aus Vertebraten; St2: Gangliosid Gtet1. Gtet1 hat die Struktur Galβ 3GalNAcβ 4(NeuAcα 3)Galβ 4Glcβ 1Cer.Fig. 2 thin layer chromatography analysis on Disialo ganglioside from bovine milk cream, which was obtained by means of a silica gel chromatography. The proportions of the individual components in the eluent i-propanol / hexane / water are given. St1: brain gangliosides from vertebrates; St2: Ganglioside G tet 1. G tet 1 has the structure Galβ 3GalNAcβ 4 (NeuAcα 3) Galβ 4Glcβ 1Cer.

Claims (5)

1. Verfahren zur Gewinnung von Gangliosid Glac2 aus einem Milchprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Milchprodukt Milchrahm verwendet und das die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:
  • (a) Extraktion des Milchrahms mit einem mit Wasser mischbaren Extraktionsmittel,
  • (b) Entfernen des ausgefällten festen Extraktionsrückstandes und Reextraktion dieses Rückstandes mit demselben, mit Was­ ser mischbaren Extraktionsmittel,
  • c) Reinigung der Ganglioside aus dem erhaltenen Extrakt an einem Anionenaustauscher,
  • (d) chromatographische Endreinigung der gewonnenen Ganglioside.
1. A process for obtaining ganglioside G lac 2 from a milk product, characterized in that milk cream is used as the milk product and that comprises the following process steps:
  • (a) extraction of the milk cream with a water-miscible extractant,
  • (b) removal of the precipitated solid extraction residue and re-extraction of this residue with the same, water-miscible extraction agent,
  • c) purification of the gangliosides from the extract obtained on an anion exchanger,
  • (d) final chromatographic purification of the gangliosides obtained.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsprodukt Milchrahm von Rindern verwendet.2. The method according to claim 1, characterized in that one used as the starting product milk cream from cattle. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die chromatographische Reinigung der gewonnenen Ganglio­ side mittels Säulenchromatographie unter Verwendung eines Kiesel­ gels durchführt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the chromatographic purification of the ganglio obtained side using column chromatography using a pebble gels. 4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit Wasser mischbare Extraktionsmittel im Volumen­ verhältnis 2 : 1, bezogen auf die Ausgangsmenge an Milchrahm, hin­ zufügt.4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that the water-miscible extractant in volume ratio 2: 1, based on the initial amount of milk cream inflicts. 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser mischbares Extraktionsmittel Methanol oder Etha­ nol verwendet.5. The method according to claim 3, characterized in that one as a water-miscible extracting agent, methanol or etha nol used.
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