JPH0789908A - 二価陽イオン界面活性剤を使用する化学発光化合物からの増強された化学発光を与える方法および組成物 - Google Patents

二価陽イオン界面活性剤を使用する化学発光化合物からの増強された化学発光を与える方法および組成物

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JPH0789908A
JPH0789908A JP6141866A JP14186694A JPH0789908A JP H0789908 A JPH0789908 A JP H0789908A JP 6141866 A JP6141866 A JP 6141866A JP 14186694 A JP14186694 A JP 14186694A JP H0789908 A JPH0789908 A JP H0789908A
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【目的】 酵素を含む化学試薬等の活性化剤によってト
リガーされる化学発光化合物、特に1,2−ジオキセタ
ン類の分解によって生じる化学発光を増強する2価陽イ
オン性ホスホニウムおよびアンモニウム塩界面活性剤を
提供する。 【構成】 界面活性剤は、次式で表わされる。 X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
2 3 -(式中、Aは別個にまたは共に、リンおよび
窒素原子からなる群から選択され、Xは、陰イオン性の
対イオンであり、R1 およびR2 は、未置換および置換
の1〜20個の炭素原子を有するアルキルおよびアラル
キル基からなる群から選択され、かつR1 およびR2
少なくとも1個は異なり、並びにLinkは、4〜20
個の炭素原子を有するジアルキレンアリール、アリー
ル、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基か
らなる群から選択される炭素鎖基である) 【効果】 この増強剤は、ウエスタンおよびサザンブロ
ットアッセイに特に有用であり、検出感度の向上がもた
らされる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】発明の分野 本発明は、酵素を含む化学試薬等の活性化剤により開始
される、化学発光化合物、特には1,2−ジオキセタン
類の分解により生成される化学発光を増強する二価陽イ
オンホスホニウムおよびアンモニウム界面活性剤の種類
を記述するものである。増強剤は、化学発光化合物によ
り輻射される化学発光強度を増大する物質である。増強
剤は、光輻射種の量子収率を増大させることにより、あ
るいは電子的励起状態の生成物を生じる分子の割合を増
大させることにより作用しうる。この発明の目的のため
に、増強された化学発光は、輻射される全光量、最大光
強度および/または背景に比較しての反応の光強度の比
が、増強剤の非存在下で観測されるものより大きいこと
を意味する。
【0002】発明の背景 生物学的分子の検出および定量は、歴史的には放射標識
レポーター分子を用いてきわめて良好な感度をもってな
されてきた。近年は、放射活性物質に暴露される危険お
よび不都合を回避するために種々の非放射活性方法が開
発されている。酵素結合分析対象物に基づく方法は、基
質を触媒的に回転させて検出可能な変化を生じさせる能
力が増幅を達成させるために、最良の感度を提供する。
色、蛍光または化学発光を生じる基質が開発されてお
り、後者は、最高の感度を達成している。特に、酵素ト
リガー化学発光物質、1,2−ジオキセタン類の使用
は、酵素結合分析対象物の検出について極めて高い感度
を達成している。
【0003】アッセイ感度の更なる増大または高速化
は、少量存在する分析対象物の検出を可能とし、あるい
はアッセイを遂行するに要する時間および/または試薬
の量を減少させることによって、化学発光に基づく方法
の有用な範囲を拡大するために必要とされる。酵素的化
学発光アッセイにおける検出速度および感度を増大させ
る一方法は、光を高い効率をもって、またはより長時間
発生する試薬の使用による。その結果は、より高い固有
の化学発光効率を有する化学発光基質の使用により、ま
たは光輻射の効率を増大する増強物質の使用により得ら
れうる。
【0004】光輻射の増大に加え、増強物質は理想的に
は、使用条件下で安定でなければならない。増強剤の存
在下での化学発光反応速度は、最大光強度により、ある
いは酵素開始反応においては最大強度に達する時間によ
り表されるように相対的に速いことが好ましい。さら
に、この分野で公知の化合物を上回るこれらの性質のい
くつかを改善することは、分析において化学発光を適用
することに優位点を与えるであろう。
【0005】
【従来の技術】
1.ジオキセタン類が関与しない化学発光反応の増強剤 パーオキシダーゼ酵素の存在下で過酸化物によるルミノ
ール酸化からの化学発光出力を増強する4−置換フェノ
ール、6−ヒドロキシベンゾチアゾールおよびその誘導
体並びにいくつかの芳香族性アミンを含む種々の物質が
知られている。(ヨーロッパ特許第0087959;英
国特許出願GB2162946A;Whitehead
等、Nature,158(1983))。増強の本質
は、良くは理解されていないが、酵素反応において酸化
還元の媒介物として作用する増強物質によるものと考え
られている(G.H.G.ThorpeおよびL.J.
Krickaの“生物発光および化学発光の新たな展
望”、John Wiley& Sons、Chich
ester、199(1987))。いずれの場合にお
いても増強は、励起アミノフタレート生成物の量子収率
の増加、または化学的に生成される励起状態の収率の増
大によるものとは考えられない。
【0006】2.ジオキセタン類に関連しない化学発光
の界面活性剤による増強 ルミノールの化学発光酸化の界面活性剤による増強が報
告されている(K.D.Gundermann,生物発
光および化学発光、Academic Press,N
ew York,New York,17頁(198
7);D.I.Metelitza,A.N.Eryo
minおよびV.A.ShibaevのJ.Biolu
min.Chemilumin.,7,21(198
2))。ルシフェリンの化学酸化からの化学発光が、種
々の界面活性剤の存在下で励起状態生成物の蛍光量子収
率の増大により増強されることが見いだされた(T.G
otoおよびH.Fukatsuの、Tetrahed
ron Lett.4299(19869)。他方にお
いて、ルシフェリンの酵素酸化が、非イオン性界面活性
剤の存在下で酵素の回転速度の増大により増強されるこ
とが見いだされた(L.J.KrickaおよびM.D
eLuca,Arch.Biochem.Biophy
s.,217,674(1983))。陽イオン界面活
性剤によるアクリダンカルボキシルエステルの化学発光
酸化の増強が、競合する非−化学発光副反応の抑制によ
るものであることが報告されている(F.McCapr
a,Acc.Chem.Res.,9,201(197
6))。
【0007】3.ジオキセタンの化学的トリガー 文献中の最初の例は、2,3−ジアリール−1,4−ジ
オキセンから誘導されるヒドロキシ−置換ジオキセタン
に関連して記述されている(A.P.Schaapおよ
びS.Gagnon,J.Amer.Chem.So
c.,104,3504(1982))。しかしなが
ら、ヒドロキシ−置換ジオキセタンおよびジアリール−
1,4−ジオキセンから誘導される他のジオキセタン類
の例は、25℃において僅かに数時間の半減期を有して
比較的に不安定である。更に、これらの非−安定化ジオ
キセタン類は、共に生物学的アッセイ用の緩衝溶液の成
分である少量のアミン(T.Wilson,Int.R
ev.Sci.:Chem.,Ser.2,9,265
(1976))および金属イオン(T.Wilson,
M.E.Landis,A.L.Baumstark,
およびP.D.Bartlett,J.Amer.Ch
em.Soc.,95,4765(1973);P.
D.Bartlett,A.L.Baumstark,
およびM.E.Landis,J.Amer.Che
m.Soc.,96,5557(1974))によって
破壊される。
【0008】安定化ジオキセタンの化学的トリガーの例
は、Schapの米国特許第4,857,652号およ
び文献(A.P.Schaap,T.S.Chen,
R.S.Handley,R.DeSilvaおよび
B.P.Giri,Tetrahedron Let
t.,1155(1987))に最初に報告された。こ
れらのジオキセタンは、数年の熱的半減期を示すが、必
要とする効率的な化学発光を生成するべくトリガーされ
得る。
【0009】4.ジオキセタンの酵素的トリガー ジオキセタンの酵素的トリガーの最初の例は、米国特許
第4,857,652号および一連の文献(A.P.S
chaap,R.S.Handley,およびB.P.
Giri,Tetrahedron Lett.,93
5(1987);A.P.Schaap,M.D.Sa
ndison,およびR.S.Handley,Tet
rahedron Lett.,1159(1987)
並びにA.P.Schaap,Photochem.P
hotobiol.,47S,50S(1988))に
記述されている。保護されたフェノール置換基を有する
極めて安定なアダマンチル−置換ジオキセタンは、トリ
ガーされ、保護基を脱離する酵素作用により光輻射を伴
って分解される。次いで、フェノール基はpH>9にお
いて強い電子供与性のフェノキシド陰イオンに変換さ
れ、これは分解速度を劇的に増大する。その結果として
緩和な熱的分解から生じるより数次のオーダー程度高い
強度で化学発光が輻射される。BronsteinのP
CT8800695は、Bronsteinの米国特許
第4,978,614、4,952,707、5,03
2,381および4,931,223号と同様に酵素で
トリガーされうるジオキセタンを記述している。
【0010】5.界面活性剤の存在下でのジオキセタン
からの増強された化学発光 分離不能なジオキセタンが関与すると考えられている化
学発光反応は、ミセル溶液中で増強される(S.Shi
nkai,Y.Ishikawa,O.Manabeお
よびT.Kunitake,Chem.Lett.,1
523(1981))。増強の機構は未だ立証されない
が、著者等は励起状態生成物の収率が、水に比べて疎水
性のミセルの環境で増大するであろうことを示唆してい
る。
【0011】Schaapらは、アンモニウム界面活性
剤、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTA
B)および蛍光剤を含む水溶性物質の存在下で、安定な
1,2−ジオキセタン、4−メトキシ−4−(3−ホス
フェートフェニル)スピロ[1,2−ジオキセタン−
3,2’−アダマンタン]二ナトリウム塩(LUMIG
EN PPD,Lumigen,Inc.、South
field,MI)の酵素トリガー分解に由来する化学
発光の増強を最初に報告している。CTABおよび5−
(N−テトラデカノイル)アミノフルオレセインからな
る蛍光ミセルは、中間体ヒドロキシ−置換ジオキセタン
を捕捉し、化学発光量子収率において400倍の増大を
もたらす。増強は、近接し、かつ界面活性剤の疎水性環
境にて起こる励起状態エステルの陰イオン形態から蛍光
化合物への効率的分子間エネルギー伝達によって起こる
(A.P.Schaap,H.Akhavanおよび
L.J.Romano,Clin.Chem.35
(9),1863(1989))。
【0012】米国特許第4,959,182および5,
004,565号並びにヨーロッパ特許出願第8911
3627.7号は、アンモニウム界面活性剤および蛍光
剤の存在下での安定ジオキセタンの化学的および酵素的
トリガーからの、化学発光の増強の更なる例を記述して
いる。CTABおよび上記フルオレセイン界面活性剤ま
たは1−ヘキサデシル−6−ヒドロキシベンゾチアザミ
ドのいずれかから形成される蛍光ミセルは、ヒドロキシ
−およびアセトキシ−置換ジオキセタンの塩基−トリガ
ー分解からの化学発光を増強する。また、CTAB自体
がLUMIGEN PPDの化学発光を増強し得ること
も報告されている(米国特許第4,959,182およ
び5,004,565号)。このジオキセタンは、アル
カリホスファターゼの好感度検出に化学的に有用である
ことが証明されている。LUMIGEN PPDを含む
既製の液体調製物であるLUMI−PHOS(商標)5
30を使用する化学発光検出は、サザンブロッティング
(D.Pollard−Knight,A.C.Sim
monds,A.P.Schaap,H.Akhava
nおよびM.A.W.Brady,Anal.Bioc
hem.,195,353(1990))、マイクロタ
イタープレートによるDNAプローブサンドイッチアッ
セイ(J.M.Clyne,J.A.Running,
H.Akhavan−Tafti,A.P.Schaa
p,R.S.StephensおよびM.S.Urde
a,J.Biolumin.chemilumin.,
2,357−366(1989))並びにウエスタンブ
ロッティング(R.Oberfelder,Focu
s,13,50(1991);G.S.Sandhu,
B.W.Eckloff,B.C.Kline,Bio
Techniques 11,14(1991))にお
いて使用されている。
【0013】米国特許第4,978,614号および英
国特許出願第8914748.0号は、ポリマー性4級
アンモニウム化合物の単独またはフルオレセインとの混
合物によるジオキセタン化学発光の増強を開示してい
る。最低限の増強を与えることが報告されている別の物
質は、ウシアルブミン等の球状タンパク質、4級アンモ
ニウム化合物ベンジルジメチルセチルアンモニウム塩化
物、および窒素含有ポリマー等を含む。
【0014】ポリビニルベンジルトリアルキルホスホニ
ウム塩が、安定ジオキセタンのトリガー分解により生成
される化学発光を増強することが継続中の米国出願番号
07/855,537号に報告されている。2種以上の
ビニルベンジルトリアルキルホスホニウム塩のコポリマ
ー、および1種以上のビニルベンジルトリアルキルホス
ホニウム塩とモノマー成分の一つに結合する付属の蛍光
剤とのコポリマーも記述されている。
【0015】先行技術には、化学発光増強剤として、ビ
ス−4級アンモニウム塩、ビス−4級ホスホニウム塩、
または混合4級アンモニウム−ホスホニウム塩等の、2
種の陽イオン頭部基を有する界面活性剤の使用は開示さ
れていない。対称的に置換されたビス−トリアルキルホ
スホニウムおよびビス−トリアルキルアンモニウム界面
活性剤、すなわち、すべてのアルキル基が同じものであ
る場合が文献により知られている。発明者等が知る限り
において、混合ビス−アルキルホスホニウム−ビス−ト
リアルキルアンモニウム界面活性剤は報告されておら
ず;非対称的置換ジトリアルキルホスホニウムおよびジ
トリアルキルアンモニウム界面活性剤、すなわち3個の
アルキル基の一方の組が他方の組と異なる場合も報告さ
れていない。
【0016】1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメ
チル)−4−(トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)
ベンゼンジブロマイドは、金属イオンの抽出に使用され
た(Ide,S.,北九州工業高等専門学校研究報告,
19,45−50(1986))。
【0017】1,4−ビス(トリ−n−ブチルホスホニ
ウムメチル)ベンゼンジブロマイドは、抗菌剤として特
許中に報告されている(Legros,Alain,P
CT国際出願WO9104668A1、1991年4月
18日)。
【0018】1,4−ビス(トリ−n−ブチルホスホニ
ウムメチル)ベンゼンジクロライドは、蛍光漂白剤の製
造における合成前駆体として使用されている(Maer
ky,Michael,Helv.Chim.Act
a,64(4),957−975,(1981))。
【0019】1,4−ビス(トリ−n−ブチルホスホニ
ウムメチル)ベンゼンジナイトレート、1,4−ビス
(トリ−n−メチルホスホニウムメチル)ベンゼンジナ
イトレートおよび1,4−ビス(トリ−n−メチルアン
モニウムメチル)ベンゼンジナイトレートは、ポリ−
(p−フェニレン)のフィルムを電気化学的に生成する
ために使用された(S.Ross,米国特許第3,41
7,003号)。
【0020】1,12−ビス(トリブチルアンモニウ
ム)ドデカンジブロマイドは、その物理的性質を記述す
る文献中に報告されている(Yiv,S.,Zana,
R.,J.Colloid Interface Sc
i.77(2),449−455(1980))。
【0021】1,4−ビス(トリ−n−ブチルアンモニ
ウムメチル)ベンゼンジブロマイドは、その物理的性質
を記述する文献中に報告されている(Domer,
F.,Schueler,F.,Arch.Inter
m.Pharm.,114,217−226(195
8))。
【0022】1,4−ビス(トリ−n−ブチルアンモニ
ウムメチル)ベンゼンジクロライドは、腐食防止剤とし
て研究されている(Horner,L.,Schen
k,M.,Doms,G.,Werkst.Korro
s.,30(6),413−417(1979))。
【0023】1,4−ビス(N,N−ジエチル−N−オ
クチルアンモニウムメチル)ベンゼンジクロライドは、
繊維の染色方法について日本国特許に報告されている
(特許出願公開JP58126383A2、1983年
7月27日)。
【0024】1,4−ビス(N,N−ジメチル−N−デ
シルアンモニウムメチル)ベンゼンジクロライドは、抗
微生物剤として文献中に報告されている(Imam,
T.,Devinsky,F.,Lacko,I.,M
lynarcik,D.,Krasnec,L.,Ph
amazie,38(5),308−310(198
3))。
【0025】目的 酵素を含む化学試薬等の活性化剤によってトリガーされ
る化学発光化合物、特に1,2−ジオキセタン類の分解
によって生じる化学発光を増強する2価陽イオン性ホス
ホニウムおよびアンモニウム塩界面活性剤を提供するこ
とが、本発明の目的である。2価陽イオン性ホスホニウ
ムおよびアンモニウム塩界面活性剤の存在下で、酵素を
含む化学試薬によりトリガーされ得、増強された化学発
光を生成する安定1,2−ジオキセタンを含有する方法
および組成物を提供することが本発明の目的である。更
に、本発明は、酵素の検出のため、およびこの技術分野
で一般に知られている酵素結合核酸、抗体、および抗原
のイムノアッセイおよび検出のために使用される方法お
よび組成物に関するものである。これらのおよび他の目
的は、以下の記述および図を参照して更に明らかになる
であろう。
【0026】図の簡単な説明 図1は、0.88mM MgCl2 を含む0.2M 2
−メチル−2−アミノ−1−プロパノール(221)緩
衝溶液、pH9.6中のLUMIGEN PPDの0.
33mM溶液100μLと、1.0〜0.01mg/m
Lの範囲の種々の濃度の界面活性剤12により輻射され
る最大化学発光強度のグラフである。化学発光輻射は、
37℃において9.2X10-18 molの子牛腸アルカ
リホスファターゼの添加により開始される。相対光度単
位(RLU)における発光値は、マイクロウエルルミノ
メータにて2時間後に測定され、6個のウエルの平均値
である。光強度および背景に対するシグナルは、0.5
−0.6mg/mLの界面活性剤濃度において最適であ
る。
【0027】図2は、0.88mM MgCl2 を含む
0.2M 2−メチル−2−アミノ−1−プロパノール
(221)緩衝溶液、pH9.6中のLUMIGEN
PPDの0.33mM溶液100μLと、0.5mg/
mLの界面活性剤12により輻射される最大化学発光強
度のグラフである。化学発光輻射は、37℃において
9.2X10-18 mol/μLと9.2X10-23 mo
l/μLとの間の子牛腸アルカリホスファターゼの希釈
物10μLの添加により開始される。グラフは、0.0
09attmolのアルカリホスファターゼを検出可能
であることを示している。
【0028】図3Aおよび3Bは、PVDFウエスタン
ブロットされたヒトトランスフェリンの化学発光検出を
示すウエスタンブロットフィルムを示し、図3Aにおい
て、ヤギ抗−ヒトトランスフェリン、ウサギ抗−ヤギI
gG−アルカリホスファターゼおよび本発明の試薬(L
UMIGEN PPD、0.33mM、2−アミノ−2
−メチル−1−プロパノール緩衝液、pH9.6;Mg
2 + 、0.88mM;界面活性剤、1mg/mL)の使
用を示し、図3Bにおいて、0.75M 2−アミノ−
2−メチル−1−プロパノール緩衝液、pH9.6、M
gCl2 (0.88mM)、CTAB(1.13mM)
およびテトラデカノイルアミノ−フルオレセイン(3
7.5μM)を含むLUMI−PHOS530(Lum
igen,Inc.,Southfield,MI)の
使用を示す。各スロットに負荷されたヒトトランスフェ
リンは、(1)5000pg、(2)1000pg、
(3)200pg、(4)50pgおよび(5)20p
gであった。使用したトランスフェリン標準は、本発明
の試薬を使用して45分間のインキュベーション後、X
−線フィルムを5秒間露出して(図3A)、またLum
i−Phos530を使用して60分間のインキュベー
ションおよび30秒間の露出(図4B)で20pg/ス
ロットまで検出可能である。
【0029】図4Aおよび4Bは、ビオチン化v−mo
sプローブおよびアビジン−アルカリホスファターゼを
使用するナイロン膜上でのマウスゲノムDNA由来の単
一コピー遺伝子のサザンブロットの化学発光検出を示す
サザンブロットフィルムの図である。インキュベーショ
ンおよび露出は:図4A(図3Aにて使用されたと同様
な本発明の試薬)で35分間および25分間、図4B
(LUMI−PHOS530)で60分間および100
分間である。カラム1は、ビオチニル化ラムダDNA/
Hind III断片40ngである。カラム2および3
は、それぞれ10および5μgのEcoRI−制限マウ
スゲノムDNAである。
【0030】図5Aおよび5Bは、ビオチン化v−mo
sプローブ、アビジン−アルカリホスファターゼ、図3
Aにて使用された本発明の試薬(図5A)およびLUM
I−PHOS530(図5B)を使用するニトロセルロ
ース膜上でのマウスゲノムDNA由来の単一コピー遺伝
子の化学発光検出を示すサザンブロットフィルムの図で
ある。インキュベーションおよび露出は:図5Aで40
分間および60分間、図5Bで3時間および16時間で
ある。カラム1は、ビオチニル化ラムダDNA/Hin
d III断片40ngである。カラム2および3は、それ
ぞれ10および5μgのEcoRI−制限マウスゲノム
DNAである。
【0031】好ましい実施態様の記述 本発明は、式: X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
2 3 - 式中、AはPまたはNであってよく、Linkは、2個
以上の炭素原子を有する置換または未置換のアリール、
アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群か
ら選択される有機スペーサー基であり、Linkはヘテ
ロ原子を含んでもよく、R1 およびR2 は、1〜20個
の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
る群から選択され、Xは、ハライド陰イオンである、を
有するホスホニウムおよびアンモニウム塩2価陽イオン
性界面活性剤に関する。特定のリンまたは窒素原子上の
1 およびR2 基は、すべてが同じ基であってよく、あ
るいは2種類の異なる基であってよく、または3個すべ
てが異なる基であってもよい。同じ分子上の隣接するリ
ンまたは窒素原子上のR1 およびR2 基の組は、同じ組
であってよく、または異なる組であってもよく、ここに
おいて組は上記に従う。
【0032】本発明は、安定1,2−ジオキセタンを含
む組成物に関し、これは活性化剤によってトリガーさ
れ、2価陽イオン性ホスホニウムまたはアンモニウム塩
界面活性剤の存在下で化学発光を生じる。本発明の実施
において有用な2価陽イオン性ホスホニウムおよびアン
モニウム界面活性剤は、式: X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
2 3 - 式中、AはPまたはNであってよく、Linkは、2個
以上の炭素原子を有する置換または未置換のアリール、
アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群か
ら選択される有機スペーサー基であり、Linkはヘテ
ロ原子を含んでもよく、R1 およびR2 は、1〜20個
の炭素原子を有する低級アルキルおよびアラルキル基か
らなる群から選択され、Xは、ハライド陰イオンであ
る、を有するものであってよい。特定のリンまたは窒素
原子上のR1 およびR2 基は、すべてが同じ基であって
よく、あるいは2種類の異なる基であってよく、または
3個すべてが異なる基であってもよい。同じ分子上の隣
接するリンまたは窒素原子上のR1 およびR2 基の組
は、同じ組であってよく、または異なる組であってもよ
く、ここにおいて組は上記に従う。
【0033】本発明は、酵素を含む化学試薬によってト
リガーされ得、化学発光を生じる安定1,2−ジオキセ
タンの存在下に2価陽イオン性ホスホニウムアンモニウ
ム塩界面活性剤を含む組成物に関するものである。本発
明の実施において有用な安定ジオキセタンは、式:
【化7】 式中、R5 およびR6 は、互いに結合してもよい有機基
であり、R3 はR4 と結合してもよい有機基であり、R
4 は、X−オキシ基により置換されたアリール基であ
り、化学的に不安定な基Xを除去すべく、酸、塩基、
塩、酵素、無機および有機触媒並びに電子供与体から選
択される活性化剤によりトリガーされた場合に不安定な
オキシド中間体ジオキセタンを形成する、を有するもの
であってよい。OX基は、ヒドロキシル、トリアルキル
もしくはトリアリールシリルオキシ、無機酸素酸塩、リ
ン酸塩、硫酸塩、酸素ピラノシド、アリールおよびアル
キルカルボキシルエステルから選択されてよい。不安定
なオキシド中間体ジオキセタンは、分解し、電子的エネ
ルギーを放出して光を生じ、式:
【化8】 のカルボニル含有化合物を形成する。
【0034】あるいは、本発明の実施において有用な安
定ジオキセタンは、式:
【化9】 式中、R3 およびR5 は、互いに結合してもよい有機基
であり、R6 は有機基であり、R4 は、X−オキシ基に
より置換されたアリール基であり、化学的に不安定な基
Xを除去すべく、酸、塩基、塩、酵素、無機および有機
触媒並びに電子供与体から選択される活性化剤によりト
リガーされた場合に不安定なオキシド中間体ジオキセタ
ンを形成する、を有するものであってよい。OX基は、
ヒドロキシル、トリアルキルもしくはトリアリールシリ
ルオキシ、無機酸素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酸素ピラ
ノシド、アリールおよびアルキルカルボキシルエステル
から選択されてよい。不安定なオキシド中間体ジオキセ
タンは、分解し、電子的エネルギーを放出して光を生
じ、式:
【化10】 のジカルボニル化合物を形成する。
【0035】本発明を実施するための好適な方法は、
式:
【化11】 式中、R3 は、1〜20個の炭素原子を含み、付加的に
ヘテロ原子を含んでもよいアルキルまたはアラルキルか
ら選択され、
【化12】 6〜30個の炭素原子を含み、付加的にヘテロ原子を含
んでもよいスピロ融合環式および多環式有機基から選択
され、R4 は、置換または未置換であってよいアリー
ル、ビアリール、ヘテロアリール、融合環多環式のアリ
ールまたはヘテロアリール基から選択され、OXは、X
−オキシ基であり、化学的に不安定な基Xを除去すべ
く、酸、塩基、塩、酵素、無機および有機触媒並びに電
子供与体から選択される活性化剤によりトリガーされた
場合に不安定なオキシド中間体ジオキセタンを形成す
る、を有する安定ジオキセタンを使用する。
【0036】本発明は、2価陽イオン性ホスホニウムま
たはアンモニウム塩界面活性剤の存在下でジオキセタン
により輻射される化学発光の量が、外界面活性剤の不在
下で輻射される光量より大きい組成物に関する。増強の
程度は、リンおよび窒素原子を置換するR1 およびR2
基の性質に依存する。増強の程度は、使用する界面活性
剤の濃度にも依存する。化学発光強度の増幅は、約0.
001%から約10%までの範囲の界面活性剤濃度にお
いて起こる。界面活性剤は、好ましくは約0.01%〜
約0.5%の濃度にて使用される。
【0037】本発明は、光生成の改良方法に関し、式:
【化13】 式中、R5 およびR6 は、互いに結合してもよい有機基
であり、R3 はR4 と結合してもよい有機基であり、R
4 は、X−オキシ基により置換されたアリール基であ
り、化学的に不安定な基Xを除去すべく、酸、塩基、
塩、酵素、無機および有機触媒並びに電子供与体から選
択される活性化剤によりトリガーされた場合に不安定な
オキシド中間体ジオキセタンを形成する、を有する安定
1,2−ジオキセタンの存在下に2価陽イオン性ホスホ
ニウムまたはアンモニウム塩界面活性剤を与えることを
含む。該OX基は、ヒドロキシル、トリアルキルもしく
はトリアリールシリルオキシ、無機酸素酸塩、リン酸
塩、硫酸塩、酸素ピラノシド、アリールおよびアルキル
カルボキシエステルから選択されてもよい。不安定なオ
キシド中間体ジオキセタンは、分解し、電子的エネルギ
ーを放出して光を生じ、式:
【化14】 のカルボニル含有化合物を形成する。本発明の実施にお
いて有用な界面活性剤は、式: X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
2 3 - 式中、AはPまたはNであってよく、Linkは、2個
以上の炭素原子を有する置換または未置換のアリール、
アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群か
ら選択される有機スペーサー基であり、Linkはヘテ
ロ原子を含んでもよく、R1 およびR2 は、1〜20個
の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
る群から選択され、Xは、ハライド陰イオンである、を
有するものであってよい。特定のリンまたは窒素原子上
のR1 およびR2 基は、すべてが同じ基であってよく、
あるいは2種類の異なる基であってよく、または3個す
べてが異なる基であってもよい。同じ分子上の隣接する
リンまたは窒素原子上のR1 およびR2 基の組は、同じ
組であってよく、または異なる組であってもよく、ここ
において組は上記に従う。
【0038】ビス−4級アンモニウム塩、ビス−4級ホ
スホニウム塩、または混合4級アンモニウム−ホスホニ
ウム塩が、化学発光増強剤として有効に機能することが
見いだされた。更に予期せぬことに、式:
【化15】 式中、AはPまたはNであり、R1およびR2は同一ま
たは異なる、を有する非対称的置換ビス−トリアルキル
ホスホニウムおよびビス−トリアルキルアンモニウム界
面活性剤が、安定1,2−ジオキセタンの反応から化学
発光の優れた増強剤であることが見いだされた。
【0039】好ましい2価陽イオン性界面活性剤は、増
強のための疎水性領域を与えるアルキル基置換基R1
よびR2 、並びに充分な水溶性を与えるためのより親水
性の領域を有している。結果として、トリガー可能なジ
オキセタンの活性化剤との反応により生じる化学発光
は、界面活性剤の不在下での同じ反応により生じる量よ
りも増大する。同時に、活性化剤の不在下でジオキセタ
ンにより生じる化学発光は、界面活性剤によって有意に
増強されることがない。
【0040】至適増強の達成は、いくつかの条件を満た
した場合に本発明の化合物によってのみ起こる。基R1
およびR2 は、充分な水溶性を付与すべく浸水性部位を
有すること、および化学発光増強を与えるべく疎水性領
域を有することの相反する要求を満たさなければならな
い。これらの要求は、例えばR1 に対してより小さいア
ルキル基の組を選択し、R2 に対してより大きいアルキ
ル基の組を選択することによって満たしうる。2つの基
準の一方のみを満たす増強剤、すなわちR1 およびR2
が、同じ組である対称的化合物は、有効な増強剤でもな
くまた水溶性に乏しいものである。
【0041】トリガー可能なジオキセタンの化学発光増
強剤として使用された陽イオン性界面活性剤セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド(CTAB)(米国特許
第4,959,182および5,004,565号)
は、輻射性分子種をミセルの相対的疎水性コアに隠蔽す
ることによって、増強を奏するものと考えられた。本発
明の2価陽イオン性トリアルキルアンモニウムおよびト
リアルキルホスホニウム界面活性剤は、CTABに比較
して、トリガー可能なジオキセタンについて水性環境下
で化学発光の劇的に大きい増強を与える。先行技術は、
2価陽イオン性界面活性剤が効率的な化学発光増強を奏
すること、あるいは異なった性質を有するアルキル置換
基の特定の組み合わせが、効果的な化学発光増強のため
に2価陽イオン性トリアルキルアンモニウムおよびトリ
アルキルホスホニウムにおいて必要とされることを示唆
していない。
【0042】更に、本発明は、酸、塩基、塩、酵素、無
機および有機触媒並びに電子供与体から選択される活性
化剤によりトリガーされる安定1,2−ジオキセタンか
らの水溶液中における化学発光を検出するための改良方
法に関する。また、本発明は、酸、塩基、塩、酵素、無
機および有機触媒並びに電子供与体から選択される活性
化剤検出のための改良方法に関する。
【0043】更に、本発明は、イムノアッセイ、例えば
ELISAにおける酵素の検出、および酵素結合DNA
またはRNAプローブ検出のための方法および組成物に
関する。輻射される光の検出は、ルミノメータ、X線フ
ィルムまたはカメラと写真フィルムを使用して容易に行
える。
【0044】当業者にとっては、本発明の界面活性剤
が、他の化学発光反応の増強剤として用途が見いだされ
るであろうことは明らかであろう。包含することを意図
するものであるが限定されるものではない他の化学発光
反応の例は以下の通りである:
【0045】予め形成されるか、またはその場で生成さ
れる低安定性のジオキセタン、特にはエナミン、エノー
ルエーテルおよびビニルスルフィド;
【化16】 式中、XおよびYはN、OおよびSから選択され、Ar
ylは置換または未置換のフェニル、ナフチル、アンス
リル、ピレニルおよびヘテロアリール並びに特にはヒド
ロキシ、アルコキシおよびジアルキルアミノ等の電子供
与性置換基によって置換されたアリール環式基である、
に酸素添加して誘導されるジオキセタンの自然熱分解;
【0046】
【化17】 等のアミノ−、アルキルアミノ−およびヒドロキシ−置
換環状ジアシルヒドラジンの、化学的またはパーオキシ
ダーゼ−触媒酸化;
【0047】ビスアリーレン化合物のアルカリ性パーオ
キシドによる酸化でその第1の例は、構造:
【化18】 を有するルシゲニンであり;
【0048】一般式:
【化19】 式中、Xは−Oアルキル、−Oアリール、−Sアルキ
ル、−Sアリール、または−NRSO2 Rである、を有
するアクリジニウムエステル、チオエステル、およびス
ルホンイミドのアルカリ過酸化物による酸化;
【0049】過酸化水素と、一般式:
【化20】 式中、Xは−OAr、−NR3 + 、−NR2 +SO2
rである、を有するオキサレートエステルおよびオキサ
ミドとの反応;これらの化合物の例として、下記化合物
が含まれる:
【化21】
【0050】並びに、ルシフェリンとそれらの各ルシフ
ェラーゼとの反応であり、ルシフェリンの例としては、
ホタルおよびRenillaルシフェリン:
【化22】 が含まれる。
【0051】本発明の実施のための好ましい方法におい
て、2価陽イオン性界面活性剤は、安定でトリガー可能
なジオキセタンを供給され、ここにおいて該界面活性剤
は、式:
【化23】 式中、ベンゼン環状の置換基は、オルト−、メタ−また
はパラ−配向であってよく、Aは窒素またはリンであ
り、R1 およびR2 は、1−20個の炭素原子を有する
アルキルまたはアラルキルであり、Xは、ハライド陰イ
オンである、を有する。本発明の実施のための好ましい
方法において、安定なジオキセタンは、式:
【化24】 式中、R3 は、1〜20個の炭素原子を含み、付加的に
ヘテロ原子を含んでもよいアルキルまたはアラルキルか
ら選択され、
【化25】 6〜30個の炭素原子を含み、付加的にヘテロ原子を含
んでもよいスピロ融合環式および多環式有機基から選択
され、R4 は、置換または未置換であってよいアリー
ル、ビアリール、ヘテロアリール、融合環多環式のアリ
ールまたはヘテロアリール基から選択され、OXは、X
−オキシ基であり、化学的に不安定な基Xを除去すべ
く、酸、塩基、塩、酵素、無機および有機触媒並びに電
子供与体から選択される活性化剤によりトリガーされた
場合に不安定なオキシド中間体ジオキセタンを形成す
る、を有する。最も好ましい方法において、R3 はメチ
ルであり、R4 はメタ−フェニルであり、
【化26】 アダマンチルまたは置換アダマンチルである。
【0052】本発明の組成物において、界面活性剤のジ
オキセタンに対する重量比は、約0.1対1と100対
1との間、好ましくは約1対1と20対1との間であ
る。対イオンは、ハライド並びにナイトレート、スルフ
ェート、アルキルスルフェート、アルキルスルフォネー
ト、アリールスルフォネート、テトラフルオロボレー
ト、パークロレート、アルキルカルボキシレートおよび
アリールカルボキシレート等の任意の非干渉陰イオンで
ある。
【0053】1.ホスホニウムおよびアンモニウム塩界
面活性剤の合成 第1群の増強剤は、一般的反応:
【化27】 式中、A=NまたはP、Z=CH2 X、CH2
(R2 3 + - またはCH2N(R2 3 + - 、お
よびX=Cl、BrまたはIである、によって調製され
た。
【0054】2−(クロロメチル)ベンジルトリエチル
ホスホニウムクロライド(1) トルエン(200ml)中のα,α’−ジクロロ−o−
キシレン(15.0g、86.0mmol)の混合物
に、アルゴンガス下でトリエチルホスフィン(6.3m
l、43.0mmol)を添加した。該反応混合物を、
アルゴン下で室温にて数日間撹拌し、その後、トリエチ
ルホスホニウムクロライド塩を溶液から晶出させた。結
晶を濾過し、トルエン(3X50mL)およびペンタン
(3X50mL)にて洗浄し、乾燥させた: 1H NM
R(CDCl3 )δ 1.15−1.26(dt,9
H)、2.58−2.69(m,6H)、4.39−
4.44(d,2H)、4.87(s,2H)、7.3
1−7.34(dd,2H)、7.43−7.46(d
d,1H)、7.50−7.54(m,1H)
【0055】2−(クロロメチル)ベンジルトリ−n−
ブチルホスホニウムクロライド(2) トルエン(50mL)中のトリ−n−ブチルホスフィン
(18.9g、103.8mmol)の混合物を、トル
エン(200mL)中のα,α’−ジクロロ−o−キシ
レン(7.0g、34.6mmol)の混合物に、アル
ゴンガス下で滴々添加した。該反応混合物を、アルゴン
下で室温にて数日間撹拌し、その時点でTLC試験は、
反応の完了を示した。トルエンを減圧下で除去し、油状
の残渣を得た。該油状残渣を、トルエン/ヘキサン(5
0/50(v/v)、4X100mL)にて洗浄し、次
いで乾燥させて無色の油状物を得た。 1H NMR(C
DCl3 )δ 0.89(t,9H)、1.43(m,
12H)、2.52(m,6H)、4.41(d,2
H)、4.88(s,2H)、7.33(m,2H)、
7.45(m,1H)、7.52(m,1H)
【0056】3−(クロロメチル)ベンジルトリ−n−
ブチルホスホニウムクロライド(3) トルエン(50mL)中のトリ−n−ブチルホスフィン
(18.9g、103.8mmol)の混合物を、トル
エン(200mL)中のα,α’−ジクロロ−o−キシ
レン(7.0g、34.6mmol)の混合物に、アル
ゴンガス下で滴々添加した。該反応混合物を、アルゴン
下で室温にて数日間撹拌し、トリ−n−ブチルホスホニ
ウムクロライド塩が溶液から晶出した時点でTLC試験
は、反応の完了を示した。白色結晶を濾過し、トルエン
およびヘキサンにて数回洗浄し、次いで乾燥させた。 1
H NMR(CDCl3 )δ 0.93(t,9H)、
1.45(m,12H)、2.41(m,6H)、4.
40(d,2H)、4.57(s,2H)、7.36
(m,2H)、7.42(d,2H)
【0057】4−(クロロメチル)ベンジルトリ−n−
ブチルホスホニウムクロライド(4) トルエン(50mL)中のトリ−n−ブチルホスフィン
(7g、34.6mmol、1当量)の混合物を、トル
エン(200mL)中のα,α’−ジクロロ−p−キシ
レン(12.1g、69.2mmol、2当量)の混合
物に、アルゴンガス下で滴々添加した。該反応混合物
を、アルゴン下で室温にて12時間撹拌し、トリ−n−
ブチルホスホニウムクロライド塩が溶液から晶出した。
結晶を濾過し、トルエンおよびヘキサンにて数回洗浄
し、次いで乾燥させた。 1H NMR(CDCl3 )δ
0.92(t,9H)、1.44(m,12H)、
2.39(m,6H)、4.35−4.40(d,2
H)、4.56(s,2H)、7.36−7.39
(d,2H)、7.47−7.51(dd,2H)
【0058】4−(ブロモメチル)ベンジルトリ−n−
ブチルホスホニウムクロライド(5) トルエン(50mL)中のトリ−n−ブチルホスフィン
(5.7g、28.4mmol)の混合物を、トルエン
(200mL)中のα,α’−ジブロモ−p−キシレン
(15g、56.8mmol、2当量)の混合物に、ア
ルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、アルゴン下
で室温にて数日間撹拌し、その時点でトリ−n−ブチル
ホスホニウムブロマイド塩が溶液から晶出した。結晶を
濾過し、50mLづつのトルエンおよびヘキサンにて3
回洗浄し、次いで空気乾燥させた。 1H NMR(CD
Cl3 )δ 0.93(t,9H)、1.45(m,1
2H)、2.40(m,6H)、4.33−4.37
(d,2H)、4.47(s,2H)、7.37−7.
40(d,2H)、7.46−7.49(dd,2H)
【0059】1,2−ビス(トリ−n−ブチルホスホニ
ウムメチル)ベンゼン ジクロライド(6) 無水DMF(30mL)中のα,α’−ジクロロ−o−
キシレン(2g、11.0mmol)の混合物に、トリ
−n−ブチルホスフィン(5.6g、28.0mmo
l)を、アルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、
アルゴン下で室温にて数日間撹拌し、その時点でTLC
試験は、反応の完了を示した。DMFを減圧下で除去
し、油状残渣を得た。該油状残渣を、順次ヘキサン(4
X80mL)、トルエン(2X50mL)および更にト
ルエン(2X50mL)にて洗浄し、次いで乾燥させ
た。 1H NMR(CDCl3 )δ 0.92(t,1
8H)、1.46(m,24H)、2.52(m,12
H)、4.68−4.73(d,4H)、7.40−
7.41(d,2H)、7.68−7.69(d,2
H)
【0060】1,3−ビス(トリ−n−ブチルホスホニ
ウムメチル)ベンゼン ジクロライド(7) 無水DMF(50mL)中のα,α’−ジクロロ−m−
キシレン(12g、69.2mmol)の混合物に、ト
リ−n−ブチルホスフィン(28g、138.6mmo
l)を、アルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、
アルゴン下で室温にて数日間撹拌し、その時点でTLC
試験は、反応の完了を示した。DMFを減圧下で除去
し、油状残渣を得た。該油状残渣を、トルエン/ヘキサ
ン(50/50(v/v)、4X100mL)にて洗浄
し、次いで乾燥させて白色結晶を得た。 1H NMR
(CDCl3 )δ 0.93(t,18H)、1.48
(m,24H)、2.39(m,12H)、4.35
(d,4H)、7.38(t,2H)、7.55(d,
1H)、8.24(s,1H)
【0061】1,4−ビス(トリ−n−ブチルホスホニ
ウムメチル)ベンゼン ジクロライド(8) 無水DMF(30mL)中の4−(クロロメチル)ベン
ジルトリ−n−ブチルホスホニウムクロライド(2.5
g、6.6mmol)の混合物に、トリ−n−ブチルホ
スフィン(2g、9.9mmol)を、アルゴンガス下
で添加した。該反応混合物を、アルゴン下で室温にて数
日間撹拌し、その時点でトリ−n−ブチルホスホニウム
クロライド塩が溶液から晶出した。該結晶を濾過し、ヘ
キサン(3X30mL)にて洗浄し、次いで乾燥させて
1,4−ビス(トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)
ベンゼン ジクロライドを、白色結晶として得た: 1
NMR(CD3 OD)δ 0.98(t,18H)、
1.51(m,24H)、2.21(m,12H)、
3.80−3.85(d,4H)、7.45(s,4
H)
【0062】1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメ
チル)−2−(トリエチルホスホニウムメチル)ベンゼ
ン ジクロライド(9) DMF中の2−(クロロメチル)ベンジルトリエチルホ
スホニウムクロライド(5.0g、17.1mmol)
の混合物に、トリ−n−オクチルホスフィン(9.45
g、26.0mmol)を、アルゴンガス下で室温にて
添加した。該反応混合物を、アルゴン下で数日間撹拌
し、その時点でTLC試験は反応の完了を示した。DM
Fを減圧下で除去し、油状残渣を得た。該残渣をトルエ
ンおよびヘキサンにて数回洗浄し、乾燥させて無色油状
物を得た: 1H NMR(CDCl 3 )δ 0.87
(t,9H)、1.14−1.43(m,45H)、
2.48(m,6H)、2.62−2.69(m,6
H)、4.64−4.74(t,4H)、7.37−
7.42(m,2H)、7.53−7.55(m,
H)、7.84−7.86(m,H)
【0063】1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメ
チル)−2−(トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)
ベンゼン ジクロライド(10) DMF中の2−(クロロメチル)ベンジル トリ−n−
ブチルホスホニウムクロライド(4g、11.0mmo
l)の混合物に、トリ−n−オクチルホスフィン(5.
7g、15.4mmol)を、アルゴンガス下で室温に
て添加した。該反応混合物を、アルゴン下で室温にて数
日間撹拌し、その時点でTLC試験は反応の完了を示し
た。DMFを減圧下で除去し、油状残渣を得た。該残渣
をペンタンおよびトルエン/ペンタン(v/v、20/
80)混合物にて数回洗浄した。次いでこれを減圧下で
乾燥させて無色油状物を得た: 1H NMR(CDCl
3)δ 0.88(t,9H)、0.93(t,9
H)、1.25(br s,24H)、1.43(m,
24H)、2.53(m,12H)、4.67−4.6
9(d,2H)、4.73−4.75(d,2H)、
7.40(t,2H)、7.71(m,2H)
【0064】1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメ
チル)−3−(トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)
ベンゼン ジクロライド(11) DMF中の3−(クロロメチル)ベンジル トリ−n−
ブチルホスホニウムクロライド(2.2g、5.8mm
ol)の混合物に、トリ−n−オクチルホスフィン
(3.2g、8.7mmol)を、アルゴンガス下で室
温にて添加した。該反応混合物を、アルゴン下で室温に
て数日間撹拌し、その時点でTLC試験は反応の完了を
示した。DMFを減圧下で除去し、油状残渣を得た。こ
の無色油状物をペンタンおよびトルエン/ペンタン(v
/v、30/70)混合物にて数回洗浄し、次いで乾燥
さた: 1H NMR(CDCl3 )δ 0.88(t,
9H)、0.93(t,9H)、1.25(br s,
24H)、1.44(m,24H)、2.39(m,1
2H)、4.33−4.38(d,4H)、7.38
(t,1H)、7.51−7.61(dd,2H)、
8.24(s,1H)
【0065】1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメ
チル)−4−(トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)
ベンゼン ジクロライド(12) DMF中の4−(クロロメチル)ベンジル トリ−n−
ブチルホスホニウムクロライド(3g、7.9mmo
l)の混合物に、トリ−n−オクチルホスフィン(4.
39g、12mmol)を、アルゴンガス下で室温にて
添加した。該反応混合物を、アルゴン下で室温にて数日
間撹拌し、その時点でTLC試験は反応の完了を示し
た。DMFを減圧下で除去した。残渣をヘキサンおよび
トルエンにて数回洗浄し、次いで乾燥させて、1−(ト
リ−n−オクチルホスホニウムメチル)−4−(トリ−
n−ブチルホスホニウムメチル)ベンゼン ジクロライ
ドを白色結晶として得た: 1H NMR(CDCl3
δ 0.84(t,9H)、0.89(t,9H)、
1.22(br s,24H)、1.41(m,24
H)、2.34(m,12H)、4.35−4.40
(d,4H)、7.58(s,4H);13C NMR
(CDCl3 )δ 1.3.34、13.94、18.
33、18.62、18.92、19.21、21.7
6、21.81、23.58、23.64、23.7
8、23.98、26.10、26.65、28.8
6、30.68、30.88、31.53、129.2
2、131.22;31PNMR δ31.10、31.
94
【0066】1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメ
チル)−4−(トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)
ベンゼン ジブロマイド(13) DMF中の4−(ブロモメチル)ベンジル トリ−n−
ブチルホスホニウムブロマイド(5g、11mmol)
の混合物に、トリ−n−オクチルホスフィン(4.97
g、13mmol)を、アルゴンガス下で室温にて添加
した。該反応混合物を、アルゴン下で数日間撹拌し、そ
の時点でTLC試験は反応の完了を示した。DMFを減
圧下で除去した。残渣をトルエン中に溶解させ、結晶化
を誘発するためにペンタンを添加した。得られた結晶を
濾過し、ペンタンにて洗浄し、乾燥させて、1−(トリ
−n−オクチルホスホニウムメチル)−4−(トリ−n
−ブチルホスホニウムメチル)ベンゼン ジブロマイド
を白色結晶として得た: 1H NMR(CDCl3 )δ
0.88(t,9H)、0.92(t,9H)、1.
26(br s,24H)、1.45(m,24H)、
2.35(m,12H)、4.36−4.41(d,4
H)、7.60(s,4H)
【0067】1,4−ビス(トリ−n−オクチルホスホ
ニウムメチル)ベンゼン ジブロマイド(14) 無水DMF(50mL)中のα,α’−ジブロモ−p−
キシレン(5g、18.9mmol)の混合物に、トリ
−n−オクチルホスフィン(21g、56.7mmo
l)を、アルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、
アルゴン下で油浴中80℃にて12時間撹拌し、その時
点でTLC試験は、反応の完了を示した。DMFを減圧
下で除去し、油状残渣を得た。該油状残渣を、トルエン
/ヘキサン(30/70(v/v)、200mL)に溶
解させ、−5℃にて結晶化した。結晶を濾過し、ヘキサ
ンにて数回洗浄し、乾燥させた。 1H NMR(CDC
3)δ 0.85(t,18H)、1.32(br
d,72H)、2.33(t,12H)、4.37
(d,4H)、7.56(s,4H)
【0068】1,4−ビス(トリ−n−オクチルホスホ
ニウムメチル)ベンゼン ジクロライド(14) 無水DMF(50mL)中のα,α’−ジクロロ−p−
キシレン(5g、28.6mmol)の混合物に、トリ
−n−オクチルホスフィン(26g、70mmol)
を、アルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、アル
ゴン下で油浴中80℃にて12時間撹拌し、その時点で
TLC試験は、反応の完了を示した。DMFを減圧下で
除去し、油状残渣を得た。該油状残渣を、ヘキサン(2
00mL)に溶解させ、−5℃にて結晶化した。結晶を
濾過し、ヘキサンにて数回洗浄し、乾燥させた。 1
NMR(CDCl3 )δ 0.88(br s,18
H)、1.26および1.44(2br s,72
H)、2.36(br s,12H)、4.37(d,
4H)、7.58(s,4H)
【0069】4−(クロロメチル)ベンジルトリ−n−
ブチルアンモニウム クロライド(16) メタノール(50mL)中のトリ−n−ブチルアミン
(6g、32.2mmol)およびα,α’−ジクロロ
−p−キシレン(8.0g、46.0mmol)の混合
物を、15時間環流し、その時点でTLC試験は、反応
の完了を示した。メタノールを減圧下で除去し、油状残
渣を得た。無色油状物をトルエンおよびヘキサンにて数
回洗浄し、次いで乾燥させた。得られた生成物を更に精
製することなく使用した。
【0070】4−(ブロモメチル)ベンジルトリ−n−
ブチルアンモニウム ブロマイド(17) トルエン(200mL)中のα,α’−ジブロモ−p−
キシレン(7.0g、26.5mmol)の混合物に、
トリ−n−ブチルアミン(3.43g、18.6mmo
l)をアルゴンガス下で添加した。該反応混合物をアル
ゴン下で室温にて数日間撹拌し、その時点でトリ−n−
ブチルアンモニウム塩が溶液から晶出した。結晶を濾過
し、トルエン(3X50mL)およびヘキサン(3X5
0mL)にて洗浄し、乾燥させた: 1H NMR(CD
Cl3 )δ 0.97(t,9H)、1.39(m,6
H)、1.76(m,6H)、3.32(m,6H)、
4.47(s,2H)、4.96(s,2H)、7.4
2−7.59(dd,4H)
【0071】4−(アイオドメチル)ベンジルトリ−n
−ブチルアンモニウム アイオダイド(18) アセトン(100mL)中のα,α’−ジクロロ−p−
キシレン(50g、28.6mmol)およびヨウ化ナ
トリウム(8.6g、57mmol)の混合物に、トリ
−n−ブチルアミン(3.7g、20.0mmol)を
添加した。該反応混合物をアルゴン下で室温にて数日間
撹拌し、その時点でTLC試験は反応の完了を示した。
該反応混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去して油状残
渣を得た。残渣をペンタンにて数回洗浄し、乾燥させて
黄色固体を得た。生成物を更に精製することなく使用し
た。
【0072】1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメ
チル)−4−(トリ−n−ブチルアンモニウムメチル)
ベンゼン ジクロライド(19) DMF中の粗製の4−(クロロメチル)ベンジル トリ
−n−ブチルアンモニウムクロライド(2.5g、7.
0mmol)の混合物に、トリ−n−オクチルホスフィ
ン(3.8g、11.0mmol)を、アルゴンガス下
で室温にて添加した。該反応混合物を、アルゴン下で数
日間撹拌し、その時点でTLC試験は反応の完了を示し
た。DMFを減圧下で除去した。残渣をヘキサンおよび
トルエンにて数回洗浄し乾燥させた。: 1H NMR
(CDCl3 )δ 0.87(t,9H)、0.99
(t,9H)、1.25−1.78(m,48H)、
2.35(m,6H)、3.30(m,6H)、4.4
7−4.51(d,2H)、5.10(s,2H)、
7.68(s,4H)
【0073】1−(トリ−n−オクチルアンモニウムメ
チル)−4−(トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)
ベンゼン ジブロマイド(20) アセトニトリル中の4−(ブロモメチル)ベンジル ト
リ−n−ブチルホスホニウムブロマイド(2.5g、
5.3mmol)の混合物に、トリ−n−オクチルアミ
ン(2.85g、8mmol)を、アルゴンガス下で室
温にて添加した。該反応混合物を、数日間撹拌し、その
時点でTLC試験は反応の完了を示した。アセトニトリ
ルを減圧下で除去した。油状残渣をペンタンにて数回洗
浄し、次いで乾燥させて白色固体を得た。: 1H NM
R(CDCl3 )δ 0.88(t,9H)、0.94
(t,9H)、1.27−1.50(3br s,42
H)、1.81(m,6H)、2.39(m,6H)、
3.26(m,6H)、4.53−4.58(d,2
H)、5.09(d,2H)、5.09(s,2H)、
7.62−7.67(dd,4H)
【0074】1−(トリ−n−オクチルアンモニウムメ
チル)−4−(トリ−n−ブチルアンモニウムメチル)
ベンゼン ジブロマイド(21) DMF中の4−(ブロモメチル)ベンジル トリ−n−
ブチルアンモニウムブロマイド(2.43g、5.4m
mol)の混合物に、トリ−n−オクチルアミン(2.
0g、5.4mmol)を、アルゴンガス下で室温にて
添加した。該反応混合物を、数日間撹拌し、その時点で
TLC試験は反応の完了を示した。DMFを減圧下で除
去した。油状残渣をトルエンおよびペンタンにて数回洗
浄し、次いで乾燥させて白色固体を得た。: 1H NM
R(CDCl3 )δ 0.87(t,9H)、0.99
(t,9H)、1.26−1.44(m,36H)、
1.80(m,12H)、3.27−3.35(m,1
2H)、5.17(s,4H)、7.72(s,4H)
【0075】1−(トリ−n−オクチルアンモニウムメ
チル)−4−(トリ−n−ブチルアンモニウムメチル)
ベンゼン ジアイオダイド(22) アセトン(50mL)中の4−(アイオドメチル)ベン
ジル トリ−n−ブチルアンモニウムアイオダイド
(2.44g、4.5mmol)の混合物に、アルゴン
下で室温にてトリ−n−オクチルアミン(1.6g、
4.5mmol)を添加した。該反応混合物を、数日間
撹拌し、その時点でTLC試験は反応の完了を示した。
該混合物にペンタン(150mL)を添加し、白色結晶
の生成を誘導した。結晶を濾過し、ペンタンにて数回洗
浄し、次いで乾燥させた: 1H NMR(CDCl3
δ 0.87(t,9H)、0.99(t,9H)、
1.26−1.44(m,36H)、1.82(m,1
2H)、3.29−3.35(m,12H)、5.23
(s,4H)、7.72(s,4H)
【0076】1−(トリドデシルアンモニウムメチル)
−4−(トリ−n−ブチルアンモニウムメチル)ベンゼ
ン ジアイオダイド(23) アセトン(50mL)中の粗製の4−(アイオドメチ
ル)ベンジル トリ−n−ブチルアンモニウムアイオダ
イド(3.45g、6.3mmol)の混合物に、トリ
ドデシルアミン(3.3g、6.3mmol)を添加し
た。該反応混合物を、アルゴン下で室温にて数日間撹拌
し、その時点でTLC試験は反応の完了を示した。該混
合物にペンタン(150mL)を添加し、フラスコ底部
に油状残渣の生成を誘導した。油状残渣をヘキサンにて
数回洗浄し、次いで乾燥させた: 1H NMR(CDC
3 )δ 0.88(t,9H)、1.00(t,9
H)、1.25−1.34(m,60H)、1.82
(m,12H)、3.33(m,12H)、5.20
(s,4H)、7.72(s,4H)
【0077】第2群の増強剤は、一般的反応:
【化28】 式中、Z=CH2 X、CH2 P+R3 X−またはCH2
N+R3 X−、およびX=Cl、BrまたはIである、
に従って調製された。
【0078】1−ブロモ−12−(トリ−n−ブチルホ
スホニウム)ドデカン ブロマイド(24) トルエン(70mL)中の1,12−ジブロモドデカン
(10g、30.0mmol)の混合物に、アルゴンガ
ス下でトリ−n−ブチルホスフィン(1g、5.0mm
ol)を添加した。該反応混合物をアルゴン下で室温に
て数日間撹拌し、その時点でTLC試験は、反応の完了
を示した。トルエンを減圧下で除去し、油状残渣を得
た。該残渣をペンタンおよびヘキサンにて数回、トルエ
ン/ヘキサン(10/90(v/v)、25mL)にて
2回洗浄し、減圧下で乾燥させて無色油状物を得た。 1
H NMR(CDCl3 )δ 0.96(t,9H)、
1.24および1.50(2br s,30H)、1.
83(m,2H)、2.43(m,8H)、3.39
(m,2H)
【0079】1,12−ビス(トリ−n−ブチルホスホ
ニウム)ドデカン ジブロマイド(25) 無水DMF(15mL)中の1,12−ジブロモドデカ
ン(5g、15.0mmol)の混合物に、アルゴンガ
ス下でトリ−n−ブチルホスフィン(8g、39.0m
mol)を添加した。該反応混合物をアルゴン下で室温
にて数日間撹拌し、その時点でTLC試験は、反応の完
了を示した。DMFを減圧下で除去し、油状残渣を得
た。該残渣をペンタンおよびヘキサンにて数回洗浄し、
トルエン/ヘキサン(30/70(v/v)、200m
L)に溶解し、−5℃にて結晶化した。結晶を濾過し、
ヘキサンにて数回洗浄し、乾燥させた。 1H NMR
(CDCl3 )δ 0.97(t,18H)、1.32
および1.53(2br s,44H)、2.43
(m,16H)
【0080】1−(トリ−n−ブチルホスホニウム)−
12−(トリ−n−オクチルホスホニウム)ドデカン
ジブロマイド(26) 無水DMF(15mL)中の1−ブロモ−12−(トリ
−n−ブチルホスホニウム)ドデカンブロマイド(2
g、3.8mmol)の混合物に、アルゴンガス下でト
リ−n−オクチルホスフィン(2g、5.7mmol)
を添加した。該反応混合物をアルゴン下で室温にて数日
間撹拌し、その時点でTLC試験は、反応の完了を示し
た。DMFを減圧下で除去し、油状残渣を得た。該残渣
をペンタンおよびトルエン/ペンタン(v/v、20/
80)にて数回洗浄した。次いでこれを減圧下で乾燥さ
せて無色油状物を得た: 1H NMR(CDCl3 )δ
0.87(t,9H)、0.97(t,9H)、1.
26(br s,36H)、1.53(m,32H)、
2.43(m,16H)
【0081】1,12−ビス(トリ−n−オクチルホス
ホニウム)ドデカン ジブロマイド(27) 無水DMF(15mL)中の1,12−ジブロモドデカ
ン(5g、15.0mmol)の混合物に、アルゴンガ
ス下でトリ−n−オクチルホスフィン(15g、39.
0mmol)を添加した。該反応混合物をアルゴン下で
室温にて数日間撹拌し、その時点でTLC試験は、反応
の完了を示した。DMFを減圧下で除去し、油状残渣を
得た。該残渣をトルエンおよびヘキサンにて数回洗浄
し、トルエン/ヘキサン(30/70(v/v)、20
0mL)に溶解し、−5℃にて結晶化した。結晶を濾過
し、ヘキサンにて数回洗浄し、乾燥させた。 1H NM
R(CDCl3 )δ 0.83(t,18H)、1.2
2および1.46(2brs,92H)、2.38
(m,16H)
【0082】1から27までの構造は、次の通りであ
る:
【化29】
【0083】
【化30】
【0084】2.界面活性剤の特徴付け−表面張力低下
測定 2価陽イオン性界面活性剤化合物11−13、19、2
5および1価陽イオン性界面活性剤セチルトリメチルア
ンモニウムブロマイド(CTAB)を、デュノイのリン
グ式表面張力低下法にて評価した。重量で1%、0.1
%、および0.01%の溶液を測定し、結果を純水の表
面張力と比較した。表面張力の低下は、界面活性剤の性
質の証拠となる。表1は、いくつかの界面活性剤化合物
の水溶液のdyne/cmでの表面張力γを示す。
【0085】
【表1】 表1界面活性剤 0.01% 0.1% 1.0% CTAB 51 38 31 11 56 39 27 12 44 29 29 13 61 47 30 19 41 29 26 25 62 53 41 脱イオン水の25℃における表面張力は、71.97d
yne/cmである。
【0086】3.化学発光および蛍光スペクトル 化学発光および蛍光スペクトルを、1cm水晶キュベッ
トを使用してFluorologII蛍光測定装置(Sp
ex Ind.,Edison,NJ)にて測定した。
すべての測定は環境温度下で行った。0.88mMのM
gCl2 および0.1%の界面活性剤12を含む221
緩衝液(0.2M、pH9.6)中のLUMIGEN
PPDの溶液2mLをキュベットにいれ、アルカリホス
ファターゼ(Biozyme Laboratorie
s)の溶液5μlを注入することによって化学発光を開
始させた。光強度が一定水準に達した際のスペクトルの
走査は、化学発光輻射が470nmにて最大であること
を示した。
【0087】4.酵素アッセイにおける最適増強剤濃度
の決定 96−ウエルマイクロプレートの3個のウエルのそれぞ
れに、0.88mMのMgCl2 および1.0〜0.0
1mg/mLの範囲の種々の濃度の界面活性剤12を含
む0.2Mの2−メチル−2−アミノ−1−プロパノー
ル(221)緩衝溶液、pH9.6中のLUMIGEN
PPDの0.33mM溶液、100μlを加えた。該
プレートを37℃にてインキュベートし、9.2X10
-18 molの子牛腸アルカリホスファターゼの添加によ
り化学発光を開始させた。発光を、Luminoska
nルミノメータにて2時間測定した。示された最大発光
強度は、6個のウエルの平均である(図1)。酵素を含
まない対応するブランク溶液からの発光は、溶液の組に
亘って、本質的に一定である。光強度およびシグナル対
バックグランドは、0.5−0.6mg/mLの界面活
性剤濃度で最適である。
【0088】5.LUMIGEN(登録商標)PPD増
強剤を用いたアルカリホスファターゼ検出の直線性 96−ウエルマイクロプレートの6個のウエルのそれぞ
れに、0.88mMのMgCl2 および0.5mg/m
Lの界面活性剤12を含む0.2Mの2−メチル−2−
アミノ−1−プロパノール(221)緩衝溶液、pH
9.6中のLUMIGEN PPDの0.33mM溶
液、100μlを加えた。該プレートを37℃にてイン
キュベートし、9.2X10-18 molと9.2X10
-23 molとの間の子牛腸アルカリホスファターゼを含
む10μl希釈物の添加により化学発光を開始させた。
図2は、0.009amolのアルカリホスファターゼ
が検出可能であることを示している。このことは、界面
活性剤を用いない同様な系に比べて2000倍低い検出
限界を表す。
【0089】6.酵素的にトリガーされるLUMIGE
N PPD分解の増強 表2は、37℃において水中の5amolのアルカリホ
スファターゼ(AP)の添加によりトリガーされた場合
の、0.88mMのMgCl2 および1.0mg/mL
の増強剤を含む0.2Mの221緩衝溶液、pH9.6
中のLUMIGEN PPDの0.33mM溶液、10
0μlの分解により生じる化学発光強度を比較するもの
である。発光を、Luminoskanルミノメータに
て2時間測定し、30分における光強度シグナルを記録
した(S)。示された値は、6個の結果の平均である。
バックグランド強度(B)は、酵素不在下の光の水準で
ある。S/Bは、バックグランド光強度(B)に対する
30分での光強度(S)の比である。挿入‘CTAB
(0.41mg/mL)’は、LUMI−PHOS48
0(Lumigen,Inc.,Southfiel
d,MI)を表す。
【0090】
【表2】 表2 37℃におけるアルカリホスファターゼ−トリガーLUMIGEN PPDからの化学発光の増強 界面活性剤 B S@30分 S/B 9X10-19 molAP なし 0.135 0.731 5.43 CTAB 0.085 1.834 21.65 (0.41mg/mL) 6 0.124 0.588 4.73 7 0.123 0.619 5.05 10* 0.342 101.3 296.6 11 0.229 79.8 348.3 12 0.157 45.7 292.0 13* 0.222 101.2 456.7 19 0.145 36.35 250.3 25 0.125 0.814 6.54 26* 0.247 59.1 238.9 27* 0.399 97.24 243.8 *溶液は5%エタノールも含む。別個に、緩衝液中のL
UMIGEN PPD自体への5%エタノールの添加
は、なんらの増強も生じなかった。
【0091】7.ウエスタンブロットによるタンパク質
の化学発光検出に対する界面活性剤の適用 本発明の組成物のウエスタンブロット技術によるタンパ
ク質の化学発光検出に対する優位点を、以下の例で示
す。2価陽イオン性界面活性剤を含むウエスタンブロッ
ト用検出試薬の感度を、既知量のトランスフェリンを使
用して決定した。
【0092】方法 ウサギ抗−ヤギIgG−アルカリホスファターゼ接合体
は、Cappel Products(Durham,
NC)から入手された。ヒトトランスフェリンおよび分
画ヤギ抗−ヒトトランスフェリン血清は、Sigma
Chemical Co.から購入された。IgG試料
を、10,000gにて2分間遠心分離にかけ、上澄を
免疫反応に使用した。
【0093】SDS−PAGEを、Laemmli
(U.K.Laemmli,Nature(Londo
n),227,680(1970))により記述された
緩衝液系を使用して実施した。スタッキングゲルは、
4.38%アクリルアミド:0.12%ビスアクリルア
ミドであった。分離ゲルは、6.81%アクリルアミ
ド:0.19%ビスアクリルアミドであった。電気泳動
に続いて、ゲルを、20mMTris、153mMグリ
シンおよび20%(v/v)メタノールを含む移送用緩
衝液にて7−8分間平衡化した。Immobilon−
P移送膜(Millipore Corp.,Bedf
ord,MA)のシートと、クロマトグラフィ紙3MM
(Whatman)のシートとの間に挟んだゲルを、移
送ユニット(Bio−Rad Laboratorie
s,Richmond,CA)に置いた。ゲル中のタン
パク質を、4℃にて100Vの定電圧で、50−60分
間電気溶出した。次いで該膜を、pH7.4の50mM
Tris−HCl緩衝食塩水中に、4℃にて一夜置い
た。その後、該膜をTBSにて15分間洗浄した。
【0094】該膜を、1%脱脂粉乳(NFM)を含むp
H7.4の50mMTris−HCl緩衝食塩水(T−
TBS)中で、室温にて1時間、0.05%トゥイーン
−20にて処理した。このブロック化膜を、1%NFM
を含むT−TBSを使用して、一次抗体(ヤギ抗−ヒト
トランスフェリンIgG分画の1:500希釈)と共に
室温にて75分間インキュベートした。次いで該膜を、
T−TBSにより室温にてそれぞれ10分間、3回すす
ぎ、洗浄した。洗浄した膜を、1%NFMを含むT−T
BSを使用して、二次抗体(ウサギ抗−ヒツジIgG−
アルカリホスファターゼ接合体の1:5000希釈)と
共に室温にて1時間インキュベートした。次いで該膜
を、T−TBSにより室温にてそれぞれ10分間、4回
すすぎ、洗浄し、次いでTBSにて10分間洗浄した。
洗浄した膜を、検出試薬中でインキュベートし、排出
し、透明フィルムのシート間に挟んだ。Kodak(R
ochester,NY)のX−OMAT−AR X線
フィルムを該膜に対して5〜30秒間露出した。
【0095】分画ヤギ抗−ヒトトランスフェリン血清に
代えて正常ヤギ血清を使用した対照ブロットにおいて
は、トランスフェリンをみることができないことが示さ
れた。これらの結果は、抗−トランスフェリン血清を使
用する実験において検出されるバンドが、特異的である
ことを示している。迅速な検出は、像の強度を最適化す
るために数時間に亘って、いくつかの露出を行うことを
可能ならしめた。
【0096】本発明の界面活性剤増強剤を含む試薬
(A)、およびLUMI−PHOS530(Lumig
en, Inc.,Southfield,MI)を含
む試薬(B)を使用してウエスタンブロットされたヒト
トランスフェリンの化学発光検出を行った。前者の検出
試薬溶液の組成は、LUMIGEN PPD、0.33
mM;2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール緩衝
液、0.1M、pH9.6;Mg2+、0.88mM;界
面活性剤12、1mg/mLであった。
【0097】使用されたトランスフェリン標準は、試薬
Aを使用して45分間のインキュベーションおよび5秒
間のX線フィルム露出(図3A)、並びにLUMI−P
HOS530にて60分間のインキュベーションおよび
30分間の露出(図3B)にて、20pg/スロットま
で検出可能であった。
【0098】8.サザンブロットによるDNAの化学発
光検出への界面活性剤の適用 本発明の組成物のサザンブロット技術によるナイロン膜
上のDNAの化学発光検出に対する優位点を、以下の例
で示す。
【0099】方法 アビジン−アルカリホスファターゼ接合体を、Capp
elTM Products(Durham,NC)から
入手した。ウシ血清アルブミン(熱ショック)をSig
ma Chemical Co.(St.Louis,
MO)から、マウスゲノムDNAおよびv−mosDN
AをClontech(Palo Alto,CA)か
ら購入した。ビオチン化ラムダDNA/Hind III断
片、ビオチン−7−dATPおよびニックトランスレー
ションキットを、Life Technokogies
から、また制限酵素EcoRIをBoehringer
−Mannheim(Indianapolis,I
N)から入手した。ナイロン移送膜を、Micron
Separations(Bedford,MA)か
ら、またニトロセルロース膜をSchleicher
& Schuell Inc.(Keene,NH)か
ら入手した。アッセイ法においてKodak X−OM
AT ARX線フィルム(Rochester,NY)
を使用した。
【0100】マウスゲノムDNA(15μg)を、Ec
oRIにて完全に切断し、10μgと5μgの部分に分
けた。制限DNAを、フェノール/クロロホルム抽出お
よびエタノール沈殿によって精製した。精製DNAを、
40mmol/LTris−酢酸、2mmol/L E
DTA、pH8.0を溶出緩衝液とし、0.77%アガ
ロースゲルにて分離した。電気泳動に次いで、ゲルを水
にてすすぎ、0.25mol/L HClにて12分間
平衡化し、再度水にてすすぎ、0.5mol/L Na
OH、1.5mol/L NaClにて15分間、次い
で新たに交換した同じ溶液にて30分間インキュベート
し、水にてすすぎ、1mol/LTris、1.5mo
l/LNaCl、pH7.5を3回交換してそれぞれ1
5分間インキュベートした。
【0101】ナイロン膜を、水に2分間、および10X
SSCに5分間順次浸した。DNAを、キャピラリブロ
ティングにより、10XSSC中で一夜で膜に移した。
該膜を、10XSSC中にて室温で10分間、穏やかに
撹拌して洗浄し、Whatman 3MMブロティング
紙上で30分間空気乾燥させ、真空中で2時間、80℃
にて焼き付けた。
【0102】該膜を、6XSSPE(20X SSPE
は、3mol/L NaCl、0.2mol/L リン
酸二水素ナトリウム、20mmol/L EDTA、p
H7.4である)に浸し、次いで、プレ−ハイブリダイ
ゼーション溶液:6XSSPE、50%の新たに脱イオ
ンしたホルムアミド、濾過した5XDenhardt溶
液(50Xは、1%フィコール、1% PVP、1%B
SAの熱ショックによる最初の分画)、濾過した1%S
DS、200μg/mLの切断変性ニシン精子DNA中
で、42℃にて3時間プレ−ハイブリダイゼーションを
行った。ハイブリダイゼーションプローブ、v−mos
DNAを、製造者の指示書に従って、ニックトランスレ
ーションによりビオチン−7−dATPを用いて標識し
た。ゲノムDNAを、300μg/mLの変性ビオチン
化プローブを用いて、6XSSPE、45%ホルムアミ
ド、濾過した5XDenhardt、1%SDS中で、
42℃にて一夜ハイブリッドさせた。ビオチン化プロー
ブを、4分間煮沸して変性させ、0℃にて10分間冷却
した。該膜を、0.5XSSC、0.4%SDSにて2
5℃で5分間、2回洗浄、0.5XSSC、0.4%S
DSにて55℃で10分間3回洗浄、2XSSCにて2
5℃で5分間2回洗浄、およびTBS(50mmol/
L Tris−HCl、pH7.4、0.15mol/
LのNaCl)にて3分間、2回洗浄した。洗浄工程の
後、該膜を濾過した3%BSA、100mmol/LT
ris−HCl、pH7.4、0.15mol/L N
aCl中で、63℃にて1時間ブロックし、T−TBS
(TBS中に0.05%トゥイーン20)にて3分間洗
浄した。
【0103】ブロックした膜をT−TBS中のアビジン
−アルカリホスファターゼの1:2000希釈物中で1
2分間インキュベートし、次いで新たに4回交換したT
−TBS中で5、15、15および20分間インキュベ
ートし、更にTBSにて5分間最終洗浄した。過剰の緩
衝液を排出し、ブロットを例7に記載の検出試薬A、ま
たはLUMI−PHOS530検出試薬のいずれかに1
0分間浸した。過剰の試薬を排出し、ブロットを透明シ
ート間に挟み、X線フィルムに露出した。
【0104】v−mosの相同遺伝子に対応する単一コ
ピーの遺伝子が、該膜を検出試薬に浸し、Kodak
XAR−5フィルムに種々の長さの時間をもって露出す
ることによって、14kbpに検出された。35分間の
インキュベーション後、両分画中の単一コピー遺伝子に
対応するバンドは、本発明の試薬Aを使用してフィルム
への25分間の露出で見ることができた(図4A)。よ
り短いインキュベーション時間のものも優れた像を形成
した。複数回の露出を1日以上に亘って容易に行うこと
ができた。LUMI−PHOS530を使用して比較で
きる感度は、60分間のインキュベーションの後、10
0分間のより長い露出を必要とした。
【0105】9.ニトロセルロース膜上でのDNAの化
学発光検出 以下に例示されるように、本発明の組成物は、サザンブ
ロット技術によるニトロセルロース膜上でのDNAの化
学発光検出に特に有用である。EcoRI制限マウスD
NAのサザンブロット分析を、前述の例を1カ所修飾し
て使用して、ニトロセルロース上にブロットされた10
および5μgの試料について行った。移送に先立って、
ニトロセルロース膜を水に2分間および10XSSCに
30分間、順次浸した。移送、洗浄、ブロットおよびハ
イブリダイゼーションの工程を、上述したのと同様に行
った。単一コピーの遺伝子を、例7に記述した試薬A中
で40分間インキュベートした後、XAR−5フィルム
に60分間露出して検出した(図5A)。LUMI−P
HOS530に浸された膜は、より長い3時間のインキ
ュベーションおよび一夜の露出を必要とした(図5
B)。
【0106】10.膜の前処理による化学発光サザンブ
ロットに対する界面活性剤の適用 マウスゲノムDNAのサザンブロット分析を、修飾化学
発光検出法により実施し、ここにおいてナイロンまたは
ニトロセルロース検出膜を、検出試薬の添加に先立って
最初に2価陽イオン性界面活性剤増強剤によって処理し
た。この方法は、同じインキュベーションおよび露出時
間について、単に膜を検出試薬と接触させることによっ
て得られる結果よりも、更に強調されたシグナルを与え
る。従って、同じ感度を達成するためには、インキュベ
ーションおよび露出時間が減少するであろう。
【0107】例8および9に記述したように実施された
サザンブロット分析において、最終洗浄工程の後で膜を
検出試薬に接触させる前に、該膜を過剰の緩衝液を除去
すべく濾紙にブロットした。該膜を、0.88mM M
2+および1mg/mLの界面活性剤12を含む0.1
M 2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール緩衝
液、pH9.6からなる溶液に、10分間浸した。該膜
を、溶液から取り出し、濾紙にブロットし、例7に記述
した検出試薬溶液中に置いて1.5−2時間インキュベ
ートした。検出試薬Aによる処理に先立って、界面活性
剤増強剤によって処理した膜は、前処理を行わない膜に
比べて3−4倍速く、同程度のシグナル強度に達した。
【0108】上記の記述は、本発明を例示することを意
図するものであり、本発明は、ここに添付する特許請求
の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、0.88mM MgCl2 を含む0.
2M 2−メチル−2−アミノ−1−プロパノール(2
21)緩衝溶液、pH9.6中のLUMIGEN PP
Dの0.33mM溶液100μLと、1.0〜0.01
mg/mLの範囲の種々の濃度の界面活性剤12により
輻射される最大化学発光強度のグラフである。
【図2】図2は、0.88mM MgCl2 を含む0.
2M 2−メチル−2−アミノ−1−プロパノール(2
21)緩衝溶液、pH9.6中のLUMIGEN PP
Dの0.33mM溶液100μLと、0.5mg/mL
の界面活性剤12により輻射される最大化学発光強度の
グラフである。
【図3】クロマトグラフを示す写真であって、PVDF
ウエスタンブロットされたヒトトランスフェリンの化学
発光検出を示すウエスタンブロットフィルムを示し、図
3Aにおいて、ヤギ抗−ヒトトランスフェリン、ウサギ
抗−ヤギIgG−アルカリホスファターゼおよび本発明
の試薬(LUMIGEN PPD、0.33mM、2−
アミノ−2−メチル−1−プロパノール緩衝液、pH
9.6;Mg2+、0.88mM;界面活性剤、1mg/
mL)の使用を示し、図3Bにおいて、0.75M 2
−アミノ−2−メチル−1−プロパノール緩衝液、pH
9.6、MgCl2 (0.88mM)、CTAB(1.
13mM)およびテトラデカノイルアミノ−フルオレセ
イン(37.5μM)を含むLUMI−PHOS530
(Lumigen,Inc.,Southfield,
MI)の使用を示す。
【図4】クロマトグラフを示す写真であって、ビオチン
化v−mosプローブおよびアビジン−アルカリホスフ
ァターゼを使用するナイロン膜上でのマウスゲノムDN
A由来の単一コピー遺伝子のサザンブロットの化学発光
検出を示すサザンブロットフィルムの図である。
【図5】クロマトグラフを示す写真であって、ビオチン
化v−mosプローブ、アビジン−アルカリホスファタ
ーゼ、図3Aにて使用された本発明の試薬(図5A)お
よびLUMI−PHOS530(図5B)を使用するニ
トロセルロース膜上でのマウスゲノムDNA由来の単一
コピー遺伝子の化学発光検出を示すサザンブロットフィ
ルムの図である。

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 式: X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
    2 3 - 式中、Aは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Xは、陰イオン性の対イオンであ
    り、R1 およびR2 は、未置換および置換の1〜20個
    の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
    る群から選択され、かつR1 およびR2 の少なくとも1
    個は異なり、並びにLinkは、4〜20個の炭素原子
    を有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレ
    ン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群から
    選択される炭素鎖基である、を有する化合物。
  2. 【請求項2】 Linkが、フェニレンである請求項1
    に記載の化合物。
  3. 【請求項3】 Linkが、10個の炭素原子を含むア
    ルキレンである請求項1に記載の化合物。
  4. 【請求項4】 Linkが、アリールエンであり、R1
    がn−オクチルであり、およびR2 がn−ブチルである
    請求項1に記載の化合物。
  5. 【請求項5】 Linkが、アルキレンであり、R1
    n−オクチルであり、およびR2 がn−ブチルである請
    求項1に記載の化合物。
  6. 【請求項6】 AがPである、請求項1〜5のいずれか
    に記載の化合物。
  7. 【請求項7】 AがNである、請求項1〜5のいずれか
    に記載の化合物。
  8. 【請求項8】 該化合物が、1−(トリ−n−オクチル
    ホスホニウムメチル)−2−(トリエチルホスホニウム
    メチル)ベンゼンジクロライド、1−(トリ−n−オク
    チルホスホニウムメチル)−2−(トリ−n−ブチルホ
    スホニウムメチル)ベンゼンジクロライド、1−(トリ
    −n−オクチルホスホニウムメチル)−3−(トリ−n
    −ブチルホスホニウムメチル)ベンゼンジクロライド、
    1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメチル)−4−
    (トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)ベンゼンジク
    ロライド、1−(トリ−n−オクチルホスホニウムメチ
    ル)−4−(トリ−n−ブチルホスホニウムメチル)ベ
    ンゼンジブロマイド、1−(トリ−n−オクチルホスホ
    ニウムメチル)−4−(トリ−n−ブチルアンモニウム
    メチル)ベンゼンジクロライド、1−(トリ−n−オク
    チルアンモニウムメチル)−4−(トリ−n−ブチルホ
    スホニウムメチル)ベンゼンジブロマイド、1−(トリ
    −n−オクチルアンモニウムメチル)−4−(トリ−n
    −ブチルアンモニウムメチル)ベンゼンジクロライド、
    1−(トリ−n−オクチルアンモニウムメチル)−4−
    (トリ−n−ブチルアンモニウムメチル)ベンゼンジア
    イオダイド、1−(トリドデシルアンモニウムメチル)
    −4−(トリ−n−ブチルアンモニウムメチル)ベンゼ
    ンジアイオダイド、および1−(トリ−n−ブチルホス
    ホニウムメチル)−12−(トリ−n−オクチルホスホ
    ニウム)ドデカンジブロマイド、からなる群から選択さ
    れる請求項1に記載の化合物。
  9. 【請求項9】 光生成分子の活性化により生じる化学発
    光の増強方法であって、該分子からの化学発光を、式: X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
    2 3 - 式中、Aは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Xは、陰イオン性の対イオンであ
    り、R1 およびR2 は、未置換および置換の1〜20個
    の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
    る群から選択され、かつR1 およびR2 は同一または異
    なってよく、並びにLinkは、4〜20個の炭素原子
    を有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレ
    ン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群から
    選択される炭素鎖基である、を有する化合物の存在下で
    生じされることを含んでなる化学発光の増強方法。
  10. 【請求項10】 増強化合物塩の存在下、化学発光の生
    成をトリガー可能な安定1,2−ジオキセタンからの化
    学発光の増強方法であって: (a)溶液中または光が生成されるべき表面に、安定
    1,2−ジオキセタンおよび式: X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
    2 3 - 式中、Aは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Xは、陰イオン性の対イオンであ
    り、R1 およびR2 は、未置換および置換の1〜20個
    の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
    る群から選択され、かつR1 およびR2 は同一または異
    なってよく、並びにLinkは、4〜20個の炭素原子
    を有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレ
    ン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群から
    選択される炭素鎖基である、を有する化合物を与え;お
    よび(b)1,2−ジオキセタンを活性化剤にてトリガ
    ーして増強された化学発光を与えること、を含んでなる
    化学発光の増強方法。
  11. 【請求項11】 1,2−ジオキセタンが、式: 【化1】 式中、R5 およびR6 は、互いに結合してもよい有機基
    であり、R3 はR4 と結合してもよい有機基であり、R
    4 は、X−オキシ基により置換されたアリール基であ
    り、化学的に不安定な基Xを除去すべく、酸、塩基、
    塩、酵素、無機および有機触媒並びに電子供与体から選
    択される活性化剤によりトリガーされた場合に不安定な
    オキシド中間体ジオキセタンを形成する、を有する請求
    項20に記載の方法。
  12. 【請求項12】1,2−ジオキセタンが、式: 【化2】 式中、R3 は、1〜8個の炭素原子を含み、付加的にヘ
    テロ原子を含んでもよいアルキルまたはアラルキルから
    選択され、R5 は、6〜30個の炭素原子を含み、付加
    的にヘテロ原子を含んでもよいスピロ融合環式および多
    環式有機基から選択され、R4 は、置換または未置換で
    あってよいアリール、ビアリール、ヘテロアリール、融
    合環多環式のアリールまたはヘテロアリール基から選択
    され、OXは、X−オキシ基であり、化学的に不安定な
    基Xを除去すべく、酸、塩基、塩、酵素、無機および有
    機触媒並びに電子供与体から選択される活性化剤により
    トリガーされた場合に不安定なオキシド中間体ジオキセ
    タンを形成する、を有する請求項20に記載の方法。
  13. 【請求項13】 OX基が、ヒドロキシル、トリアルキ
    ルもしくはアリールシリルオキシ、無機オキシ酸塩、リ
    ン酸塩、硫酸塩、酸素−ピラノシド、アリールおよびア
    ルキルカルボニルエステルから選択される請求項22に
    記載の方法。
  14. 【請求項14】 R5 Cが、アダマンチルまたは置換ア
    ダマンチルからなる群から選択される請求項23に記載
    の方法。
  15. 【請求項15】 R4 が、メタ−フェニルである請求項
    23に記載の方法。
  16. 【請求項16】 R3 が、メチルである請求項23に記
    載の方法。
  17. 【請求項17】 R3 がメチルであり、R4 がメタ−フ
    ェニルであり、OXがリン酸塩であり、活性化剤がアル
    カリホスファターゼである請求項24に記載の方法。
  18. 【請求項18】 リン酸塩が、OPO3 Na2 である請
    求項27に記載の方法。
  19. 【請求項19】 Aが、両者ともにリン原子であり、L
    inkが、オルト−、メタ−またはパラ−フェニレンで
    ある請求項20〜28項のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項20】 Aが、両者ともに窒素原子であり、L
    inkが、オルト−、メタ−またはパラ−フェニレンで
    ある請求項20〜28項のいずれかに記載の方法。
  21. 【請求項21】 Aの一方がリン原子であり、他方が窒
    素原子であり、Linkが、オルト−、メタ−またはパ
    ラ−フェニレンである請求項20〜28項のいずれかに
    記載の方法。
  22. 【請求項22】 Linkが、6〜20個の炭素原子を
    有するアルキレン鎖である請求項20〜28項のいずれ
    かに記載の方法。
  23. 【請求項23】 該方法が、酵素、抗体、抗原、または
    核酸の化学発光検出のために使用される請求項19〜2
    8項のいずれか1項に記載の方法。
  24. 【請求項24】 該方法が、酵素結合イムノアッセイま
    たは酵素結合核酸アッセイにおいて使用される請求項1
    9〜28項のいずれか1項に記載の方法。
  25. 【請求項25】 該酵素が、アルカリホスファターゼま
    たはガラクトシダーゼである請求項19〜28項に記載
    の方法。
  26. 【請求項26】 化学発光がフィルムまたはイムノメー
    タにより検出される請求項19〜28項のいずれか1項
    に記載の方法。
  27. 【請求項27】 (a)化学発光を生成すべく活性化可
    能な光生成分子;および(b)式: X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
    2 3 - 式中、Aは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Xは、陰イオン性の対イオンであ
    り、R1 およびR2 は、未置換および置換の1〜20個
    の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
    る群から選択され、かつR1 およびR2 は異なり、並び
    にLinkは、4〜20個の炭素原子を有するジアルキ
    レンアリール、アリール、アルキレン、アルケニレンお
    よびアルキニレン基からなる群から選択される炭素鎖基
    である、を有する化合物である増強剤を含んでなる組成
    物。
  28. 【請求項28】 (a)安定1,2−ジオキセタン;お
    よび(b)式: X- (R1 3 + CH2 −Link−CH2 + (R
    2 3 - 式中、Aは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Xは、フルオロ、アイオド、ブロ
    モ、およびクロロからなる群から選択されるハライドイ
    オンであり、R1 およびR2 は、未置換および置換の1
    〜20個の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル
    基からなる群から選択され、かつR3 およびR4 は同一
    または異なり、並びにLinkは、4〜20個の炭素原
    子を有するアリールジアルキレン、アリーレン、アルキ
    レン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群か
    ら選択される炭素鎖基である、を有する増強化合物を含
    んでなり、充分量の化合物の存在下で溶液中または表面
    上で、該化合物の不在下に得られる化学発光に比べて増
    強された化学発光が生成される組成物。
  29. 【請求項29】 1,2−ジオキセタンが、式: 【化3】 式中、R5 およびR6 は、互いに結合してもよい有機基
    であり、R3 はR4 と結合してもよい有機基であり、R
    4 は、X−オキシ基により置換されたアリール基であ
    り、化学的に不安定な基Xを除去すべく、酸、塩基、
    塩、酵素、無機および有機触媒並びに電子供与体から選
    択される活性化剤によりトリガーされた場合に不安定な
    オキシド中間体ジオキセタンを形成する、を有する請求
    項38に記載の方法。
  30. 【請求項30】 1,2−ジオキセタンが、式: 【化4】 式中、R3 は、1〜8個の炭素原子を含み、付加的にヘ
    テロ原子を含んでもよいアルキルまたはアラルキルから
    選択され、 【化5】 は、6〜30個の炭素原子を含み、付加的にヘテロ原子
    を含んでもよいスピロ融合環式および多環式有機基から
    選択され、R4 は、置換または未置換であってよいアリ
    ール、ビアリール、ヘテロアリール、融合環多環式のア
    リールまたはヘテロアリール基から選択され、OXは、
    X−オキシ基であり、化学的に不安定な基Xを除去すべ
    く、酸、塩基、塩、酵素、無機および有機触媒並びに電
    子供与体から選択される活性化剤によりトリガーされた
    場合に不安定なオキシド中間体ジオキセタンを形成す
    る、を有する請求項38に記載の方法。
  31. 【請求項31】 OX基が、ヒドロキシル、トリアルキ
    ルもしくはアリールシリルオキシ、無機オキシ酸塩、リ
    ン酸塩、硫酸塩、酸素−ピラノシド、アリールおよびア
    ルキルカルボニルエステルから選択される請求項40に
    記載の方法。
  32. 【請求項32】 OX基が、OPO3 Na2 である請求
    項41に記載の組成物。
  33. 【請求項33】 【化6】 が、アダマンチルまたは置換アダマンチルから選択され
    る請求項42に記載の組成物。
  34. 【請求項34】 R4 が、メタ−フェニルである請求項
    42に記載の組成物。
  35. 【請求項35】 R3 が、メチルである請求項42に記
    載の組成物。
  36. 【請求項36】 R3 がメチルであり、R4 がメタ−フ
    ェニルであり、OXがリン酸塩であり、活性化剤がアル
    カリホスファターゼである請求項43に記載の組成物。
  37. 【請求項37】 リン酸塩が、OPO3 Na2 である請
    求項46に記載の組成物。
  38. 【請求項38】 Aが、両者ともにリン原子であり、L
    inkが、オルト−、メタ−またはパラ−フェニレンで
    ある請求項37〜47項のいずれかに記載の組成物。
  39. 【請求項39】 Aが、両者ともに窒素原子であり、L
    inkが、オルト−、メタ−またはパラ−フェニレンで
    ある請求項37〜47のいずれかに記載の方法。
  40. 【請求項40】 Aの一方がリン原子であり、他方が窒
    素原子であり、Linkが、オルト−、メタ−またはパ
    ラ−フェニレンである請求項37〜47項のいずれかに
    記載の方法。
  41. 【請求項41】 Linkが、6〜20個の炭素原子を
    有するアルキレン鎖である請求項37〜47項のいずれ
    かに記載の方法。
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