JPH0789908A - 二価陽イオン界面活性剤を使用する化学発光化合物からの増強された化学発光を与える方法および組成物 - Google Patents

二価陽イオン界面活性剤を使用する化学発光化合物からの増強された化学発光を与える方法および組成物

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JPH0789908A JP6141866A JP14186694A JPH0789908A JP H0789908 A JPH0789908 A JP H0789908A JP 6141866 A JP6141866 A JP 6141866A JP 14186694 A JP14186694 A JP 14186694A JP H0789908 A JPH0789908 A JP H0789908A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 酵素を含む化学試薬等の活性化剤によってト
リガーされる化学発光化合物、特に１，２−ジオキセタ
ン類の分解によって生じる化学発光を増強する２価陽イ
オン性ホスホニウムおよびアンモニウム塩界面活性剤を
提供する。 【構成】 界面活性剤は、次式で表わされる。 Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
2 ）3 Ｘ-（式中、Ａは別個にまたは共に、リンおよび
窒素原子からなる群から選択され、Ｘは、陰イオン性の
対イオンであり、Ｒ1 およびＲ2 は、未置換および置換
の１〜２０個の炭素原子を有するアルキルおよびアラル
キル基からなる群から選択され、かつＲ1 およびＲ2 の
少なくとも１個は異なり、並びにＬｉｎｋは、４〜２０
個の炭素原子を有するジアルキレンアリール、アリー
ル、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基か
らなる群から選択される炭素鎖基である） 【効果】 この増強剤は、ウエスタンおよびサザンブロ
ットアッセイに特に有用であり、検出感度の向上がもた
らされる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】発明の分野 本発明は、酵素を含む化学試薬等の活性化剤により開始
される、化学発光化合物、特には１，２−ジオキセタン
類の分解により生成される化学発光を増強する二価陽イ
オンホスホニウムおよびアンモニウム界面活性剤の種類
を記述するものである。増強剤は、化学発光化合物によ
り輻射される化学発光強度を増大する物質である。増強
剤は、光輻射種の量子収率を増大させることにより、あ
るいは電子的励起状態の生成物を生じる分子の割合を増
大させることにより作用しうる。この発明の目的のため
に、増強された化学発光は、輻射される全光量、最大光
強度および／または背景に比較しての反応の光強度の比
が、増強剤の非存在下で観測されるものより大きいこと
を意味する。
【０００２】発明の背景 生物学的分子の検出および定量は、歴史的には放射標識
レポーター分子を用いてきわめて良好な感度をもってな
されてきた。近年は、放射活性物質に暴露される危険お
よび不都合を回避するために種々の非放射活性方法が開
発されている。酵素結合分析対象物に基づく方法は、基
質を触媒的に回転させて検出可能な変化を生じさせる能
力が増幅を達成させるために、最良の感度を提供する。
色、蛍光または化学発光を生じる基質が開発されてお
り、後者は、最高の感度を達成している。特に、酵素ト
リガー化学発光物質、１，２−ジオキセタン類の使用
は、酵素結合分析対象物の検出について極めて高い感度
を達成している。
【０００３】アッセイ感度の更なる増大または高速化
は、少量存在する分析対象物の検出を可能とし、あるい
はアッセイを遂行するに要する時間および／または試薬
の量を減少させることによって、化学発光に基づく方法
の有用な範囲を拡大するために必要とされる。酵素的化
学発光アッセイにおける検出速度および感度を増大させ
る一方法は、光を高い効率をもって、またはより長時間
発生する試薬の使用による。その結果は、より高い固有
の化学発光効率を有する化学発光基質の使用により、ま
たは光輻射の効率を増大する増強物質の使用により得ら
れうる。
【０００４】光輻射の増大に加え、増強物質は理想的に
は、使用条件下で安定でなければならない。増強剤の存
在下での化学発光反応速度は、最大光強度により、ある
いは酵素開始反応においては最大強度に達する時間によ
り表されるように相対的に速いことが好ましい。さら
に、この分野で公知の化合物を上回るこれらの性質のい
くつかを改善することは、分析において化学発光を適用
することに優位点を与えるであろう。
【０００５】
【従来の技術】
１．ジオキセタン類が関与しない化学発光反応の増強剤 パーオキシダーゼ酵素の存在下で過酸化物によるルミノ
ール酸化からの化学発光出力を増強する４−置換フェノ
ール、６−ヒドロキシベンゾチアゾールおよびその誘導
体並びにいくつかの芳香族性アミンを含む種々の物質が
知られている。（ヨーロッパ特許第００８７９５９；英
国特許出願ＧＢ２１６２９４６Ａ；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ
等、Ｎａｔｕｒｅ，１５８（１９８３））。増強の本質
は、良くは理解されていないが、酵素反応において酸化
還元の媒介物として作用する増強物質によるものと考え
られている（Ｇ．Ｈ．Ｇ．ＴｈｏｒｐｅおよびＬ．Ｊ．
Ｋｒｉｃｋａの“生物発光および化学発光の新たな展
望”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈ
ｅｓｔｅｒ、１９９（１９８７））。いずれの場合にお
いても増強は、励起アミノフタレート生成物の量子収率
の増加、または化学的に生成される励起状態の収率の増
大によるものとは考えられない。
【０００６】２．ジオキセタン類に関連しない化学発光
の界面活性剤による増強 ルミノールの化学発光酸化の界面活性剤による増強が報
告されている（Ｋ．Ｄ．Ｇｕｎｄｅｒｍａｎｎ，生物発
光および化学発光、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１７頁（１９８
７）；Ｄ．Ｉ．Ｍｅｔｅｌｉｔｚａ，Ａ．Ｎ．Ｅｒｙｏ
ｍｉｎおよびＶ．Ａ．ＳｈｉｂａｅｖのＪ．Ｂｉｏｌｕ
ｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，７，２１（１９８
２））。ルシフェリンの化学酸化からの化学発光が、種
々の界面活性剤の存在下で励起状態生成物の蛍光量子収
率の増大により増強されることが見いだされた（Ｔ．Ｇ
ｏｔｏおよびＨ．Ｆｕｋａｔｓｕの、Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４２９９（１９８６９）。他方にお
いて、ルシフェリンの酵素酸化が、非イオン性界面活性
剤の存在下で酵素の回転速度の増大により増強されるこ
とが見いだされた（Ｌ．Ｊ．ＫｒｉｃｋａおよびＭ．Ｄ
ｅＬｕｃａ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．，２１７，６７４（１９８３））。陽イオン界面活
性剤によるアクリダンカルボキシルエステルの化学発光
酸化の増強が、競合する非−化学発光副反応の抑制によ
るものであることが報告されている（Ｆ．ＭｃＣａｐｒ
ａ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，９，２０１（１９７
６））。
【０００７】３．ジオキセタンの化学的トリガー 文献中の最初の例は、２，３−ジアリール−１，４−ジ
オキセンから誘導されるヒドロキシ−置換ジオキセタン
に関連して記述されている（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐおよ
びＳ．Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，１０４，３５０４（１９８２））。しかしなが
ら、ヒドロキシ−置換ジオキセタンおよびジアリール−
１，４−ジオキセンから誘導される他のジオキセタン類
の例は、２５℃において僅かに数時間の半減期を有して
比較的に不安定である。更に、これらの非−安定化ジオ
キセタン類は、共に生物学的アッセイ用の緩衝溶液の成
分である少量のアミン（Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉｎｔ．Ｒ
ｅｖ．Ｓｃｉ．：Ｃｈｅｍ．，Ｓｅｒ．２，９，２６５
（１９７６））および金属イオン（Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｍ．Ｅ．Ｌａｎｄｉｓ，Ａ．Ｌ．Ｂａｕｍｓｔａｒｋ，
およびＰ．Ｄ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．，９５，４７６５（１９７３）；Ｐ．
Ｄ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ａ．Ｌ．Ｂａｕｍｓｔａｒｋ，
およびＭ．Ｅ．Ｌａｎｄｉｓ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，９６，５５５７（１９７４））によって
破壊される。
【０００８】安定化ジオキセタンの化学的トリガーの例
は、Ｓｃｈａｐの米国特許第４，８５７，６５２号およ
び文献（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｔ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，
Ｒ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ，Ｒ．ＤｅＳｉｌｖａおよび
Ｂ．Ｐ．Ｇｉｒｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．，１１５５（１９８７））に最初に報告された。こ
れらのジオキセタンは、数年の熱的半減期を示すが、必
要とする効率的な化学発光を生成するべくトリガーされ
得る。
【０００９】４．ジオキセタンの酵素的トリガー ジオキセタンの酵素的トリガーの最初の例は、米国特許
第４，８５７，６５２号および一連の文献（Ａ．Ｐ．Ｓ
ｃｈａａｐ，Ｒ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ，およびＢ．Ｐ．
Ｇｉｒｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，９３
５（１９８７）；Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｍ．Ｄ．Ｓａ
ｎｄｉｓｏｎ，およびＲ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ，Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１１５９（１９８７）
並びにＡ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐ
ｈｏｔｏｂｉｏｌ．，４７Ｓ，５０Ｓ（１９８８））に
記述されている。保護されたフェノール置換基を有する
極めて安定なアダマンチル−置換ジオキセタンは、トリ
ガーされ、保護基を脱離する酵素作用により光輻射を伴
って分解される。次いで、フェノール基はｐＨ＞９にお
いて強い電子供与性のフェノキシド陰イオンに変換さ
れ、これは分解速度を劇的に増大する。その結果として
緩和な熱的分解から生じるより数次のオーダー程度高い
強度で化学発光が輻射される。ＢｒｏｎｓｔｅｉｎのＰ
ＣＴ８８００６９５は、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎの米国特許
第４，９７８，６１４、４，９５２，７０７、５，０３
２，３８１および４，９３１，２２３号と同様に酵素で
トリガーされうるジオキセタンを記述している。
【００１０】５．界面活性剤の存在下でのジオキセタン
からの増強された化学発光 分離不能なジオキセタンが関与すると考えられている化
学発光反応は、ミセル溶液中で増強される（Ｓ．Ｓｈｉ
ｎｋａｉ，Ｙ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｏ．Ｍａｎａｂｅお
よびＴ．Ｋｕｎｉｔａｋｅ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１
５２３（１９８１））。増強の機構は未だ立証されない
が、著者等は励起状態生成物の収率が、水に比べて疎水
性のミセルの環境で増大するであろうことを示唆してい
る。
【００１１】Ｓｃｈａａｐらは、アンモニウム界面活性
剤、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡ
Ｂ）および蛍光剤を含む水溶性物質の存在下で、安定な
１，２−ジオキセタン、４−メトキシ−４−（３−ホス
フェートフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−
３，２’−アダマンタン］二ナトリウム塩（ＬＵＭＩＧ
ＥＮ ＰＰＤ，Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ
ｆｉｅｌｄ，ＭＩ）の酵素トリガー分解に由来する化学
発光の増強を最初に報告している。ＣＴＡＢおよび５−
（Ｎ−テトラデカノイル）アミノフルオレセインからな
る蛍光ミセルは、中間体ヒドロキシ−置換ジオキセタン
を捕捉し、化学発光量子収率において４００倍の増大を
もたらす。増強は、近接し、かつ界面活性剤の疎水性環
境にて起こる励起状態エステルの陰イオン形態から蛍光
化合物への効率的分子間エネルギー伝達によって起こる
（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｈ．Ａｋｈａｖａｎおよび
Ｌ．Ｊ．Ｒｏｍａｎｏ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５
（９），１８６３（１９８９））。
【００１２】米国特許第４，９５９，１８２および５，
００４，５６５号並びにヨーロッパ特許出願第８９１１
３６２７．７号は、アンモニウム界面活性剤および蛍光
剤の存在下での安定ジオキセタンの化学的および酵素的
トリガーからの、化学発光の増強の更なる例を記述して
いる。ＣＴＡＢおよび上記フルオレセイン界面活性剤ま
たは１−ヘキサデシル−６−ヒドロキシベンゾチアザミ
ドのいずれかから形成される蛍光ミセルは、ヒドロキシ
−およびアセトキシ−置換ジオキセタンの塩基−トリガ
ー分解からの化学発光を増強する。また、ＣＴＡＢ自体
がＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤの化学発光を増強し得ること
も報告されている（米国特許第４，９５９，１８２およ
び５，００４，５６５号）。このジオキセタンは、アル
カリホスファターゼの好感度検出に化学的に有用である
ことが証明されている。ＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤを含む
既製の液体調製物であるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（商標）５
３０を使用する化学発光検出は、サザンブロッティング
（Ｄ．Ｐｏｌｌａｒｄ−Ｋｎｉｇｈｔ，Ａ．Ｃ．Ｓｉｍ
ｍｏｎｄｓ，Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｈ．Ａｋｈａｖａ
ｎおよびＭ．Ａ．Ｗ．Ｂｒａｄｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１９５，３５３（１９９０））、マイクロタ
イタープレートによるＤＮＡプローブサンドイッチアッ
セイ（Ｊ．Ｍ．Ｃｌｙｎｅ，Ｊ．Ａ．Ｒｕｎｎｉｎｇ，
Ｈ．Ａｋｈａｖａｎ−Ｔａｆｔｉ，Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａ
ｐ，Ｒ．Ｓ．ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＭ．Ｓ．Ｕｒｄｅ
ａ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，
２，３５７−３６６（１９８９））並びにウエスタンブ
ロッティング（Ｒ．Ｏｂｅｒｆｅｌｄｅｒ，Ｆｏｃｕ
ｓ，１３，５０（１９９１）；Ｇ．Ｓ．Ｓａｎｄｈｕ，
Ｂ．Ｗ．Ｅｃｋｌｏｆｆ，Ｂ．Ｃ．Ｋｌｉｎｅ，Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１，１４（１９９１））にお
いて使用されている。
【００１３】米国特許第４，９７８，６１４号および英
国特許出願第８９１４７４８．０号は、ポリマー性４級
アンモニウム化合物の単独またはフルオレセインとの混
合物によるジオキセタン化学発光の増強を開示してい
る。最低限の増強を与えることが報告されている別の物
質は、ウシアルブミン等の球状タンパク質、４級アンモ
ニウム化合物ベンジルジメチルセチルアンモニウム塩化
物、および窒素含有ポリマー等を含む。
【００１４】ポリビニルベンジルトリアルキルホスホニ
ウム塩が、安定ジオキセタンのトリガー分解により生成
される化学発光を増強することが継続中の米国出願番号
０７／８５５，５３７号に報告されている。２種以上の
ビニルベンジルトリアルキルホスホニウム塩のコポリマ
ー、および１種以上のビニルベンジルトリアルキルホス
ホニウム塩とモノマー成分の一つに結合する付属の蛍光
剤とのコポリマーも記述されている。
【００１５】先行技術には、化学発光増強剤として、ビ
ス−４級アンモニウム塩、ビス−４級ホスホニウム塩、
または混合４級アンモニウム−ホスホニウム塩等の、２
種の陽イオン頭部基を有する界面活性剤の使用は開示さ
れていない。対称的に置換されたビス−トリアルキルホ
スホニウムおよびビス−トリアルキルアンモニウム界面
活性剤、すなわち、すべてのアルキル基が同じものであ
る場合が文献により知られている。発明者等が知る限り
において、混合ビス−アルキルホスホニウム−ビス−ト
リアルキルアンモニウム界面活性剤は報告されておら
ず；非対称的置換ジトリアルキルホスホニウムおよびジ
トリアルキルアンモニウム界面活性剤、すなわち３個の
アルキル基の一方の組が他方の組と異なる場合も報告さ
れていない。
【００１６】１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメ
チル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）
ベンゼンジブロマイドは、金属イオンの抽出に使用され
た（Ｉｄｅ，Ｓ．，北九州工業高等専門学校研究報告，
１９，４５−５０（１９８６））。
【００１７】１，４−ビス（トリ−ｎ−ブチルホスホニ
ウムメチル）ベンゼンジブロマイドは、抗菌剤として特
許中に報告されている（Ｌｅｇｒｏｓ，Ａｌａｉｎ，Ｐ
ＣＴ国際出願ＷＯ９１０４６６８Ａ１、１９９１年４月
１８日）。
【００１８】１，４−ビス（トリ−ｎ−ブチルホスホニ
ウムメチル）ベンゼンジクロライドは、蛍光漂白剤の製
造における合成前駆体として使用されている（Ｍａｅｒ
ｋｙ，Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ，６４（４），９５７−９７５，（１９８１））。
【００１９】１，４−ビス（トリ−ｎ−ブチルホスホニ
ウムメチル）ベンゼンジナイトレート、１，４−ビス
（トリ−ｎ−メチルホスホニウムメチル）ベンゼンジナ
イトレートおよび１，４−ビス（トリ−ｎ−メチルアン
モニウムメチル）ベンゼンジナイトレートは、ポリ−
（ｐ−フェニレン）のフィルムを電気化学的に生成する
ために使用された（Ｓ．Ｒｏｓｓ，米国特許第３，４１
７，００３号）。
【００２０】１，１２−ビス（トリブチルアンモニウ
ム）ドデカンジブロマイドは、その物理的性質を記述す
る文献中に報告されている（Ｙｉｖ，Ｓ．，Ｚａｎａ，
Ｒ．，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃ
ｉ．７７（２），４４９−４５５（１９８０））。
【００２１】１，４−ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニ
ウムメチル）ベンゼンジブロマイドは、その物理的性質
を記述する文献中に報告されている（Ｄｏｍｅｒ，
Ｆ．，Ｓｃｈｕｅｌｅｒ，Ｆ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒ
ｍ．Ｐｈａｒｍ．，１１４，２１７−２２６（１９５
８））。
【００２２】１，４−ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニ
ウムメチル）ベンゼンジクロライドは、腐食防止剤とし
て研究されている（Ｈｏｒｎｅｒ，Ｌ．，Ｓｃｈｅｎ
ｋ，Ｍ．，Ｄｏｍｓ，Ｇ．，Ｗｅｒｋｓｔ．Ｋｏｒｒｏ
ｓ．，３０（６），４１３−４１７（１９７９））。
【００２３】１，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−オ
クチルアンモニウムメチル）ベンゼンジクロライドは、
繊維の染色方法について日本国特許に報告されている
（特許出願公開ＪＰ５８１２６３８３Ａ２、１９８３年
７月２７日）。
【００２４】１，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−デ
シルアンモニウムメチル）ベンゼンジクロライドは、抗
微生物剤として文献中に報告されている（Ｉｍａｍ，
Ｔ．，Ｄｅｖｉｎｓｋｙ，Ｆ．，Ｌａｃｋｏ，Ｉ．，Ｍ
ｌｙｎａｒｃｉｋ，Ｄ．，Ｋｒａｓｎｅｃ，Ｌ．，Ｐｈ
ａｍａｚｉｅ，３８（５），３０８−３１０（１９８
３））。
【００２５】目的 酵素を含む化学試薬等の活性化剤によってトリガーされ
る化学発光化合物、特に１，２−ジオキセタン類の分解
によって生じる化学発光を増強する２価陽イオン性ホス
ホニウムおよびアンモニウム塩界面活性剤を提供するこ
とが、本発明の目的である。２価陽イオン性ホスホニウ
ムおよびアンモニウム塩界面活性剤の存在下で、酵素を
含む化学試薬によりトリガーされ得、増強された化学発
光を生成する安定１，２−ジオキセタンを含有する方法
および組成物を提供することが本発明の目的である。更
に、本発明は、酵素の検出のため、およびこの技術分野
で一般に知られている酵素結合核酸、抗体、および抗原
のイムノアッセイおよび検出のために使用される方法お
よび組成物に関するものである。これらのおよび他の目
的は、以下の記述および図を参照して更に明らかになる
であろう。
【００２６】図の簡単な説明 図１は、０．８８ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む０．２Ｍ ２
−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２２１）緩
衝溶液、ｐＨ９．６中のＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤの０．
３３ｍＭ溶液１００μＬと、１．０〜０．０１ｍｇ／ｍ
Ｌの範囲の種々の濃度の界面活性剤１２により輻射され
る最大化学発光強度のグラフである。化学発光輻射は、
３７℃において９．２Ｘ１０-18 ｍｏｌの子牛腸アルカ
リホスファターゼの添加により開始される。相対光度単
位（ＲＬＵ）における発光値は、マイクロウエルルミノ
メータにて２時間後に測定され、６個のウエルの平均値
である。光強度および背景に対するシグナルは、０．５
−０．６ｍｇ／ｍＬの界面活性剤濃度において最適であ
る。
【００２７】図２は、０．８８ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む
０．２Ｍ ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール
（２２１）緩衝溶液、ｐＨ９．６中のＬＵＭＩＧＥＮ
ＰＰＤの０．３３ｍＭ溶液１００μＬと、０．５ｍｇ／
ｍＬの界面活性剤１２により輻射される最大化学発光強
度のグラフである。化学発光輻射は、３７℃において
９．２Ｘ１０-18 ｍｏｌ／μＬと９．２Ｘ１０-23 ｍｏ
ｌ／μＬとの間の子牛腸アルカリホスファターゼの希釈
物１０μＬの添加により開始される。グラフは、０．０
０９ａｔｔｍｏｌのアルカリホスファターゼを検出可能
であることを示している。
【００２８】図３Ａおよび３Ｂは、ＰＶＤＦウエスタン
ブロットされたヒトトランスフェリンの化学発光検出を
示すウエスタンブロットフィルムを示し、図３Ａにおい
て、ヤギ抗−ヒトトランスフェリン、ウサギ抗−ヤギＩ
ｇＧ−アルカリホスファターゼおよび本発明の試薬（Ｌ
ＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤ、０．３３ｍＭ、２−アミノ−２
−メチル−１−プロパノール緩衝液、ｐＨ９．６；Ｍｇ
2 + 、０．８８ｍＭ；界面活性剤、１ｍｇ／ｍＬ）の使
用を示し、図３Ｂにおいて、０．７５Ｍ ２−アミノ−
２−メチル−１−プロパノール緩衝液、ｐＨ９．６、Ｍ
ｇＣｌ2 （０．８８ｍＭ）、ＣＴＡＢ（１．１３ｍＭ）
およびテトラデカノイルアミノ−フルオレセイン（３
７．５μＭ）を含むＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ５３０（Ｌｕｍ
ｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，ＭＩ）の
使用を示す。各スロットに負荷されたヒトトランスフェ
リンは、（１）５０００ｐｇ、（２）１０００ｐｇ、
（３）２００ｐｇ、（４）５０ｐｇおよび（５）２０ｐ
ｇであった。使用したトランスフェリン標準は、本発明
の試薬を使用して４５分間のインキュベーション後、Ｘ
−線フィルムを５秒間露出して（図３Ａ）、またＬｕｍ
ｉ−Ｐｈｏｓ５３０を使用して６０分間のインキュベー
ションおよび３０秒間の露出（図４Ｂ）で２０ｐｇ／ス
ロットまで検出可能である。
【００２９】図４Ａおよび４Ｂは、ビオチン化ｖ−ｍｏ
ｓプローブおよびアビジン−アルカリホスファターゼを
使用するナイロン膜上でのマウスゲノムＤＮＡ由来の単
一コピー遺伝子のサザンブロットの化学発光検出を示す
サザンブロットフィルムの図である。インキュベーショ
ンおよび露出は：図４Ａ（図３Ａにて使用されたと同様
な本発明の試薬）で３５分間および２５分間、図４Ｂ
（ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ５３０）で６０分間および１００
分間である。カラム１は、ビオチニル化ラムダＤＮＡ／
Ｈｉｎｄ III断片４０ｎｇである。カラム２および３
は、それぞれ１０および５μｇのＥｃｏＲＩ−制限マウ
スゲノムＤＮＡである。
【００３０】図５Ａおよび５Ｂは、ビオチン化ｖ−ｍｏ
ｓプローブ、アビジン−アルカリホスファターゼ、図３
Ａにて使用された本発明の試薬（図５Ａ）およびＬＵＭ
Ｉ−ＰＨＯＳ５３０（図５Ｂ）を使用するニトロセルロ
ース膜上でのマウスゲノムＤＮＡ由来の単一コピー遺伝
子の化学発光検出を示すサザンブロットフィルムの図で
ある。インキュベーションおよび露出は：図５Ａで４０
分間および６０分間、図５Ｂで３時間および１６時間で
ある。カラム１は、ビオチニル化ラムダＤＮＡ／Ｈｉｎ
ｄ III断片４０ｎｇである。カラム２および３は、それ
ぞれ１０および５μｇのＥｃｏＲＩ−制限マウスゲノム
ＤＮＡである。
【００３１】好ましい実施態様の記述 本発明は、式： Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
2 ）3 Ｘ- 式中、ＡはＰまたはＮであってよく、Ｌｉｎｋは、２個
以上の炭素原子を有する置換または未置換のアリール、
アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群か
ら選択される有機スペーサー基であり、Ｌｉｎｋはヘテ
ロ原子を含んでもよく、Ｒ1 およびＲ2 は、１〜２０個
の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
る群から選択され、Ｘは、ハライド陰イオンである、を
有するホスホニウムおよびアンモニウム塩２価陽イオン
性界面活性剤に関する。特定のリンまたは窒素原子上の
Ｒ1 およびＲ2 基は、すべてが同じ基であってよく、あ
るいは２種類の異なる基であってよく、または３個すべ
てが異なる基であってもよい。同じ分子上の隣接するリ
ンまたは窒素原子上のＲ1 およびＲ2 基の組は、同じ組
であってよく、または異なる組であってもよく、ここに
おいて組は上記に従う。
【００３２】本発明は、安定１，２−ジオキセタンを含
む組成物に関し、これは活性化剤によってトリガーさ
れ、２価陽イオン性ホスホニウムまたはアンモニウム塩
界面活性剤の存在下で化学発光を生じる。本発明の実施
において有用な２価陽イオン性ホスホニウムおよびアン
モニウム界面活性剤は、式： Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
2 ）3 Ｘ- 式中、ＡはＰまたはＮであってよく、Ｌｉｎｋは、２個
以上の炭素原子を有する置換または未置換のアリール、
アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群か
ら選択される有機スペーサー基であり、Ｌｉｎｋはヘテ
ロ原子を含んでもよく、Ｒ1 およびＲ2 は、１〜２０個
の炭素原子を有する低級アルキルおよびアラルキル基か
らなる群から選択され、Ｘは、ハライド陰イオンであ
る、を有するものであってよい。特定のリンまたは窒素
原子上のＲ1 およびＲ2 基は、すべてが同じ基であって
よく、あるいは２種類の異なる基であってよく、または
３個すべてが異なる基であってもよい。同じ分子上の隣
接するリンまたは窒素原子上のＲ1 およびＲ2 基の組
は、同じ組であってよく、または異なる組であってもよ
く、ここにおいて組は上記に従う。
【００３３】本発明は、酵素を含む化学試薬によってト
リガーされ得、化学発光を生じる安定１，２−ジオキセ
タンの存在下に２価陽イオン性ホスホニウムアンモニウ
ム塩界面活性剤を含む組成物に関するものである。本発
明の実施において有用な安定ジオキセタンは、式：
【化７】 式中、Ｒ5 およびＲ6 は、互いに結合してもよい有機基
であり、Ｒ3 はＲ4 と結合してもよい有機基であり、Ｒ
4 は、Ｘ−オキシ基により置換されたアリール基であ
り、化学的に不安定な基Ｘを除去すべく、酸、塩基、
塩、酵素、無機および有機触媒並びに電子供与体から選
択される活性化剤によりトリガーされた場合に不安定な
オキシド中間体ジオキセタンを形成する、を有するもの
であってよい。ＯＸ基は、ヒドロキシル、トリアルキル
もしくはトリアリールシリルオキシ、無機酸素酸塩、リ
ン酸塩、硫酸塩、酸素ピラノシド、アリールおよびアル
キルカルボキシルエステルから選択されてよい。不安定
なオキシド中間体ジオキセタンは、分解し、電子的エネ
ルギーを放出して光を生じ、式：
【化８】 のカルボニル含有化合物を形成する。
【００３４】あるいは、本発明の実施において有用な安
定ジオキセタンは、式：
【化９】 式中、Ｒ3 およびＲ5 は、互いに結合してもよい有機基
であり、Ｒ6 は有機基であり、Ｒ4 は、Ｘ−オキシ基に
より置換されたアリール基であり、化学的に不安定な基
Ｘを除去すべく、酸、塩基、塩、酵素、無機および有機
触媒並びに電子供与体から選択される活性化剤によりト
リガーされた場合に不安定なオキシド中間体ジオキセタ
ンを形成する、を有するものであってよい。ＯＸ基は、
ヒドロキシル、トリアルキルもしくはトリアリールシリ
ルオキシ、無機酸素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酸素ピラ
ノシド、アリールおよびアルキルカルボキシルエステル
から選択されてよい。不安定なオキシド中間体ジオキセ
タンは、分解し、電子的エネルギーを放出して光を生
じ、式：
【化１０】 のジカルボニル化合物を形成する。
【００３５】本発明を実施するための好適な方法は、
式：
【化１１】 式中、Ｒ3 は、１〜２０個の炭素原子を含み、付加的に
ヘテロ原子を含んでもよいアルキルまたはアラルキルか
ら選択され、
【化１２】 ６〜３０個の炭素原子を含み、付加的にヘテロ原子を含
んでもよいスピロ融合環式および多環式有機基から選択
され、Ｒ4 は、置換または未置換であってよいアリー
ル、ビアリール、ヘテロアリール、融合環多環式のアリ
ールまたはヘテロアリール基から選択され、ＯＸは、Ｘ
−オキシ基であり、化学的に不安定な基Ｘを除去すべ
く、酸、塩基、塩、酵素、無機および有機触媒並びに電
子供与体から選択される活性化剤によりトリガーされた
場合に不安定なオキシド中間体ジオキセタンを形成す
る、を有する安定ジオキセタンを使用する。
【００３６】本発明は、２価陽イオン性ホスホニウムま
たはアンモニウム塩界面活性剤の存在下でジオキセタン
により輻射される化学発光の量が、外界面活性剤の不在
下で輻射される光量より大きい組成物に関する。増強の
程度は、リンおよび窒素原子を置換するＲ1 およびＲ2
基の性質に依存する。増強の程度は、使用する界面活性
剤の濃度にも依存する。化学発光強度の増幅は、約０．
００１％から約１０％までの範囲の界面活性剤濃度にお
いて起こる。界面活性剤は、好ましくは約０．０１％〜
約０．５％の濃度にて使用される。
【００３７】本発明は、光生成の改良方法に関し、式：
【化１３】 式中、Ｒ5 およびＲ6 は、互いに結合してもよい有機基
であり、Ｒ3 はＲ4 と結合してもよい有機基であり、Ｒ
4 は、Ｘ−オキシ基により置換されたアリール基であ
り、化学的に不安定な基Ｘを除去すべく、酸、塩基、
塩、酵素、無機および有機触媒並びに電子供与体から選
択される活性化剤によりトリガーされた場合に不安定な
オキシド中間体ジオキセタンを形成する、を有する安定
１，２−ジオキセタンの存在下に２価陽イオン性ホスホ
ニウムまたはアンモニウム塩界面活性剤を与えることを
含む。該ＯＸ基は、ヒドロキシル、トリアルキルもしく
はトリアリールシリルオキシ、無機酸素酸塩、リン酸
塩、硫酸塩、酸素ピラノシド、アリールおよびアルキル
カルボキシエステルから選択されてもよい。不安定なオ
キシド中間体ジオキセタンは、分解し、電子的エネルギ
ーを放出して光を生じ、式：
【化１４】 のカルボニル含有化合物を形成する。本発明の実施にお
いて有用な界面活性剤は、式： Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
2 ）3 Ｘ- 式中、ＡはＰまたはＮであってよく、Ｌｉｎｋは、２個
以上の炭素原子を有する置換または未置換のアリール、
アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群か
ら選択される有機スペーサー基であり、Ｌｉｎｋはヘテ
ロ原子を含んでもよく、Ｒ1 およびＲ2 は、１〜２０個
の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
る群から選択され、Ｘは、ハライド陰イオンである、を
有するものであってよい。特定のリンまたは窒素原子上
のＲ1 およびＲ2 基は、すべてが同じ基であってよく、
あるいは２種類の異なる基であってよく、または３個す
べてが異なる基であってもよい。同じ分子上の隣接する
リンまたは窒素原子上のＲ1 およびＲ2 基の組は、同じ
組であってよく、または異なる組であってもよく、ここ
において組は上記に従う。
【００３８】ビス−４級アンモニウム塩、ビス−４級ホ
スホニウム塩、または混合４級アンモニウム−ホスホニ
ウム塩が、化学発光増強剤として有効に機能することが
見いだされた。更に予期せぬことに、式：
【化１５】 式中、ＡはＰまたはＮであり、Ｒ１およびＲ２は同一ま
たは異なる、を有する非対称的置換ビス−トリアルキル
ホスホニウムおよびビス−トリアルキルアンモニウム界
面活性剤が、安定１，２−ジオキセタンの反応から化学
発光の優れた増強剤であることが見いだされた。
【００３９】好ましい２価陽イオン性界面活性剤は、増
強のための疎水性領域を与えるアルキル基置換基Ｒ1 お
よびＲ2 、並びに充分な水溶性を与えるためのより親水
性の領域を有している。結果として、トリガー可能なジ
オキセタンの活性化剤との反応により生じる化学発光
は、界面活性剤の不在下での同じ反応により生じる量よ
りも増大する。同時に、活性化剤の不在下でジオキセタ
ンにより生じる化学発光は、界面活性剤によって有意に
増強されることがない。
【００４０】至適増強の達成は、いくつかの条件を満た
した場合に本発明の化合物によってのみ起こる。基Ｒ1
およびＲ2 は、充分な水溶性を付与すべく浸水性部位を
有すること、および化学発光増強を与えるべく疎水性領
域を有することの相反する要求を満たさなければならな
い。これらの要求は、例えばＲ1 に対してより小さいア
ルキル基の組を選択し、Ｒ2 に対してより大きいアルキ
ル基の組を選択することによって満たしうる。２つの基
準の一方のみを満たす増強剤、すなわちＲ1 およびＲ2
が、同じ組である対称的化合物は、有効な増強剤でもな
くまた水溶性に乏しいものである。
【００４１】トリガー可能なジオキセタンの化学発光増
強剤として使用された陽イオン性界面活性剤セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）（米国特許
第４，９５９，１８２および５，００４，５６５号）
は、輻射性分子種をミセルの相対的疎水性コアに隠蔽す
ることによって、増強を奏するものと考えられた。本発
明の２価陽イオン性トリアルキルアンモニウムおよびト
リアルキルホスホニウム界面活性剤は、ＣＴＡＢに比較
して、トリガー可能なジオキセタンについて水性環境下
で化学発光の劇的に大きい増強を与える。先行技術は、
２価陽イオン性界面活性剤が効率的な化学発光増強を奏
すること、あるいは異なった性質を有するアルキル置換
基の特定の組み合わせが、効果的な化学発光増強のため
に２価陽イオン性トリアルキルアンモニウムおよびトリ
アルキルホスホニウムにおいて必要とされることを示唆
していない。
【００４２】更に、本発明は、酸、塩基、塩、酵素、無
機および有機触媒並びに電子供与体から選択される活性
化剤によりトリガーされる安定１，２−ジオキセタンか
らの水溶液中における化学発光を検出するための改良方
法に関する。また、本発明は、酸、塩基、塩、酵素、無
機および有機触媒並びに電子供与体から選択される活性
化剤検出のための改良方法に関する。
【００４３】更に、本発明は、イムノアッセイ、例えば
ＥＬＩＳＡにおける酵素の検出、および酵素結合ＤＮＡ
またはＲＮＡプローブ検出のための方法および組成物に
関する。輻射される光の検出は、ルミノメータ、Ｘ線フ
ィルムまたはカメラと写真フィルムを使用して容易に行
える。
【００４４】当業者にとっては、本発明の界面活性剤
が、他の化学発光反応の増強剤として用途が見いだされ
るであろうことは明らかであろう。包含することを意図
するものであるが限定されるものではない他の化学発光
反応の例は以下の通りである：
【００４５】予め形成されるか、またはその場で生成さ
れる低安定性のジオキセタン、特にはエナミン、エノー
ルエーテルおよびビニルスルフィド；
【化１６】 式中、ＸおよびＹはＮ、ＯおよびＳから選択され、Ａｒ
ｙｌは置換または未置換のフェニル、ナフチル、アンス
リル、ピレニルおよびヘテロアリール並びに特にはヒド
ロキシ、アルコキシおよびジアルキルアミノ等の電子供
与性置換基によって置換されたアリール環式基である、
に酸素添加して誘導されるジオキセタンの自然熱分解；
【００４６】
【化１７】 等のアミノ−、アルキルアミノ−およびヒドロキシ−置
換環状ジアシルヒドラジンの、化学的またはパーオキシ
ダーゼ−触媒酸化；
【００４７】ビスアリーレン化合物のアルカリ性パーオ
キシドによる酸化でその第１の例は、構造：
【化１８】 を有するルシゲニンであり；
【００４８】一般式：
【化１９】 式中、Ｘは−Ｏアルキル、−Ｏアリール、−Ｓアルキ
ル、−Ｓアリール、または−ＮＲＳＯ2 Ｒである、を有
するアクリジニウムエステル、チオエステル、およびス
ルホンイミドのアルカリ過酸化物による酸化；
【００４９】過酸化水素と、一般式：
【化２０】 式中、Ｘは−ＯＡｒ、−ＮＲ3 + 、−ＮＲ2 ＋ＳＯ2 Ａ
ｒである、を有するオキサレートエステルおよびオキサ
ミドとの反応；これらの化合物の例として、下記化合物
が含まれる：
【化２１】
【００５０】並びに、ルシフェリンとそれらの各ルシフ
ェラーゼとの反応であり、ルシフェリンの例としては、
ホタルおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェリン：
【化２２】 が含まれる。
【００５１】本発明の実施のための好ましい方法におい
て、２価陽イオン性界面活性剤は、安定でトリガー可能
なジオキセタンを供給され、ここにおいて該界面活性剤
は、式：
【化２３】 式中、ベンゼン環状の置換基は、オルト−、メタ−また
はパラ−配向であってよく、Ａは窒素またはリンであ
り、Ｒ1 およびＲ2 は、１−２０個の炭素原子を有する
アルキルまたはアラルキルであり、Ｘは、ハライド陰イ
オンである、を有する。本発明の実施のための好ましい
方法において、安定なジオキセタンは、式：
【化２４】 式中、Ｒ3 は、１〜２０個の炭素原子を含み、付加的に
ヘテロ原子を含んでもよいアルキルまたはアラルキルか
ら選択され、
【化２５】 ６〜３０個の炭素原子を含み、付加的にヘテロ原子を含
んでもよいスピロ融合環式および多環式有機基から選択
され、Ｒ4 は、置換または未置換であってよいアリー
ル、ビアリール、ヘテロアリール、融合環多環式のアリ
ールまたはヘテロアリール基から選択され、ＯＸは、Ｘ
−オキシ基であり、化学的に不安定な基Ｘを除去すべ
く、酸、塩基、塩、酵素、無機および有機触媒並びに電
子供与体から選択される活性化剤によりトリガーされた
場合に不安定なオキシド中間体ジオキセタンを形成す
る、を有する。最も好ましい方法において、Ｒ3 はメチ
ルであり、Ｒ4 はメタ−フェニルであり、
【化２６】 アダマンチルまたは置換アダマンチルである。
【００５２】本発明の組成物において、界面活性剤のジ
オキセタンに対する重量比は、約０．１対１と１００対
１との間、好ましくは約１対１と２０対１との間であ
る。対イオンは、ハライド並びにナイトレート、スルフ
ェート、アルキルスルフェート、アルキルスルフォネー
ト、アリールスルフォネート、テトラフルオロボレー
ト、パークロレート、アルキルカルボキシレートおよび
アリールカルボキシレート等の任意の非干渉陰イオンで
ある。
【００５３】１．ホスホニウムおよびアンモニウム塩界
面活性剤の合成 第１群の増強剤は、一般的反応：
【化２７】 式中、Ａ＝ＮまたはＰ、Ｚ＝ＣＨ2 Ｘ、ＣＨ2 Ｐ
（Ｒ2 ）3 + Ｘ- またはＣＨ2Ｎ（Ｒ2 ）3 + Ｘ- 、お
よびＸ＝Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、によって調製され
た。
【００５４】２−（クロロメチル）ベンジルトリエチル
ホスホニウムクロライド（１） トルエン（２００ｍｌ）中のα，α’−ジクロロ−ｏ−
キシレン（１５．０ｇ、８６．０ｍｍｏｌ）の混合物
に、アルゴンガス下でトリエチルホスフィン（６．３ｍ
ｌ、４３．０ｍｍｏｌ）を添加した。該反応混合物を、
アルゴン下で室温にて数日間撹拌し、その後、トリエチ
ルホスホニウムクロライド塩を溶液から晶出させた。結
晶を濾過し、トルエン（３Ｘ５０ｍＬ）およびペンタン
（３Ｘ５０ｍＬ）にて洗浄し、乾燥させた： 1Ｈ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3 ）δ １．１５−１．２６（ｄｔ，９
Ｈ）、２．５８−２．６９（ｍ，６Ｈ）、４．３９−
４．４４（ｄ，２Ｈ）、４．８７（ｓ，２Ｈ）、７．３
１−７．３４（ｄｄ，２Ｈ）、７．４３−７．４６（ｄ
ｄ，１Ｈ）、７．５０−７．５４（ｍ，１Ｈ）
【００５５】２−（クロロメチル）ベンジルトリ−ｎ−
ブチルホスホニウムクロライド（２） トルエン（５０ｍＬ）中のトリ−ｎ−ブチルホスフィン
（１８．９ｇ、１０３．８ｍｍｏｌ）の混合物を、トル
エン（２００ｍＬ）中のα，α’−ジクロロ−ｏ−キシ
レン（７．０ｇ、３４．６ｍｍｏｌ）の混合物に、アル
ゴンガス下で滴々添加した。該反応混合物を、アルゴン
下で室温にて数日間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は、
反応の完了を示した。トルエンを減圧下で除去し、油状
の残渣を得た。該油状残渣を、トルエン／ヘキサン（５
０／５０（ｖ／ｖ）、４Ｘ１００ｍＬ）にて洗浄し、次
いで乾燥させて無色の油状物を得た。 1Ｈ ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3 ）δ ０．８９（ｔ，９Ｈ）、１．４３（ｍ，
１２Ｈ）、２．５２（ｍ，６Ｈ）、４．４１（ｄ，２
Ｈ）、４．８８（ｓ，２Ｈ）、７．３３（ｍ，２Ｈ）、
７．４５（ｍ，１Ｈ）、７．５２（ｍ，１Ｈ）
【００５６】３−（クロロメチル）ベンジルトリ−ｎ−
ブチルホスホニウムクロライド（３） トルエン（５０ｍＬ）中のトリ−ｎ−ブチルホスフィン
（１８．９ｇ、１０３．８ｍｍｏｌ）の混合物を、トル
エン（２００ｍＬ）中のα，α’−ジクロロ−ｏ−キシ
レン（７．０ｇ、３４．６ｍｍｏｌ）の混合物に、アル
ゴンガス下で滴々添加した。該反応混合物を、アルゴン
下で室温にて数日間撹拌し、トリ−ｎ−ブチルホスホニ
ウムクロライド塩が溶液から晶出した時点でＴＬＣ試験
は、反応の完了を示した。白色結晶を濾過し、トルエン
およびヘキサンにて数回洗浄し、次いで乾燥させた。 1
Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．９３（ｔ，９Ｈ）、
１．４５（ｍ，１２Ｈ）、２．４１（ｍ，６Ｈ）、４．
４０（ｄ，２Ｈ）、４．５７（ｓ，２Ｈ）、７．３６
（ｍ，２Ｈ）、７．４２（ｄ，２Ｈ）
【００５７】４−（クロロメチル）ベンジルトリ−ｎ−
ブチルホスホニウムクロライド（４） トルエン（５０ｍＬ）中のトリ−ｎ−ブチルホスフィン
（７ｇ、３４．６ｍｍｏｌ、１当量）の混合物を、トル
エン（２００ｍＬ）中のα，α’−ジクロロ−ｐ−キシ
レン（１２．１ｇ、６９．２ｍｍｏｌ、２当量）の混合
物に、アルゴンガス下で滴々添加した。該反応混合物
を、アルゴン下で室温にて１２時間撹拌し、トリ−ｎ−
ブチルホスホニウムクロライド塩が溶液から晶出した。
結晶を濾過し、トルエンおよびヘキサンにて数回洗浄
し、次いで乾燥させた。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ
０．９２（ｔ，９Ｈ）、１．４４（ｍ，１２Ｈ）、
２．３９（ｍ，６Ｈ）、４．３５−４．４０（ｄ，２
Ｈ）、４．５６（ｓ，２Ｈ）、７．３６−７．３９
（ｄ，２Ｈ）、７．４７−７．５１（ｄｄ，２Ｈ）
【００５８】４−（ブロモメチル）ベンジルトリ−ｎ−
ブチルホスホニウムクロライド（５） トルエン（５０ｍＬ）中のトリ−ｎ−ブチルホスフィン
（５．７ｇ、２８．４ｍｍｏｌ）の混合物を、トルエン
（２００ｍＬ）中のα，α’−ジブロモ−ｐ−キシレン
（１５ｇ、５６．８ｍｍｏｌ、２当量）の混合物に、ア
ルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、アルゴン下
で室温にて数日間撹拌し、その時点でトリ−ｎ−ブチル
ホスホニウムブロマイド塩が溶液から晶出した。結晶を
濾過し、５０ｍＬづつのトルエンおよびヘキサンにて３
回洗浄し、次いで空気乾燥させた。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3 ）δ ０．９３（ｔ，９Ｈ）、１．４５（ｍ，１
２Ｈ）、２．４０（ｍ，６Ｈ）、４．３３−４．３７
（ｄ，２Ｈ）、４．４７（ｓ，２Ｈ）、７．３７−７．
４０（ｄ，２Ｈ）、７．４６−７．４９（ｄｄ，２Ｈ）
【００５９】１，２−ビス（トリ−ｎ−ブチルホスホニ
ウムメチル）ベンゼン ジクロライド（６） 無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）中のα，α’−ジクロロ−ｏ−
キシレン（２ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の混合物に、トリ
−ｎ−ブチルホスフィン（５．６ｇ、２８．０ｍｍｏ
ｌ）を、アルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、
アルゴン下で室温にて数日間撹拌し、その時点でＴＬＣ
試験は、反応の完了を示した。ＤＭＦを減圧下で除去
し、油状残渣を得た。該油状残渣を、順次ヘキサン（４
Ｘ８０ｍＬ）、トルエン（２Ｘ５０ｍＬ）および更にト
ルエン（２Ｘ５０ｍＬ）にて洗浄し、次いで乾燥させ
た。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．９２（ｔ，１
８Ｈ）、１．４６（ｍ，２４Ｈ）、２．５２（ｍ，１２
Ｈ）、４．６８−４．７３（ｄ，４Ｈ）、７．４０−
７．４１（ｄ，２Ｈ）、７．６８−７．６９（ｄ，２
Ｈ）
【００６０】１，３−ビス（トリ−ｎ−ブチルホスホニ
ウムメチル）ベンゼン ジクロライド（７） 無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のα，α’−ジクロロ−ｍ−
キシレン（１２ｇ、６９．２ｍｍｏｌ）の混合物に、ト
リ−ｎ−ブチルホスフィン（２８ｇ、１３８．６ｍｍｏ
ｌ）を、アルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、
アルゴン下で室温にて数日間撹拌し、その時点でＴＬＣ
試験は、反応の完了を示した。ＤＭＦを減圧下で除去
し、油状残渣を得た。該油状残渣を、トルエン／ヘキサ
ン（５０／５０（ｖ／ｖ）、４Ｘ１００ｍＬ）にて洗浄
し、次いで乾燥させて白色結晶を得た。 1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．９３（ｔ，１８Ｈ）、１．４８
（ｍ，２４Ｈ）、２．３９（ｍ，１２Ｈ）、４．３５
（ｄ，４Ｈ）、７．３８（ｔ，２Ｈ）、７．５５（ｄ，
１Ｈ）、８．２４（ｓ，１Ｈ）
【００６１】１，４−ビス（トリ−ｎ−ブチルホスホニ
ウムメチル）ベンゼン ジクロライド（８） 無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の４−（クロロメチル）ベン
ジルトリ−ｎ−ブチルホスホニウムクロライド（２．５
ｇ、６．６ｍｍｏｌ）の混合物に、トリ−ｎ−ブチルホ
スフィン（２ｇ、９．９ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下
で添加した。該反応混合物を、アルゴン下で室温にて数
日間撹拌し、その時点でトリ−ｎ−ブチルホスホニウム
クロライド塩が溶液から晶出した。該結晶を濾過し、ヘ
キサン（３Ｘ３０ｍＬ）にて洗浄し、次いで乾燥させて
１，４−ビス（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）
ベンゼン ジクロライドを、白色結晶として得た： 1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ０．９８（ｔ，１８Ｈ）、
１．５１（ｍ，２４Ｈ）、２．２１（ｍ，１２Ｈ）、
３．８０−３．８５（ｄ，４Ｈ）、７．４５（ｓ，４
Ｈ）
【００６２】１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメ
チル）−２−（トリエチルホスホニウムメチル）ベンゼ
ン ジクロライド（９） ＤＭＦ中の２−（クロロメチル）ベンジルトリエチルホ
スホニウムクロライド（５．０ｇ、１７．１ｍｍｏｌ）
の混合物に、トリ−ｎ−オクチルホスフィン（９．４５
ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下で室温にて
添加した。該反応混合物を、アルゴン下で数日間撹拌
し、その時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示した。ＤＭ
Ｆを減圧下で除去し、油状残渣を得た。該残渣をトルエ
ンおよびヘキサンにて数回洗浄し、乾燥させて無色油状
物を得た： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ 3 ）δ ０．８７
（ｔ，９Ｈ）、１．１４−１．４３（ｍ，４５Ｈ）、
２．４８（ｍ，６Ｈ）、２．６２−２．６９（ｍ，６
Ｈ）、４．６４−４．７４（ｔ，４Ｈ）、７．３７−
７．４２（ｍ，２Ｈ）、７．５３−７．５５（ｍ，
Ｈ）、７．８４−７．８６（ｍ，Ｈ）
【００６３】１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメ
チル）−２−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）
ベンゼン ジクロライド（１０） ＤＭＦ中の２−（クロロメチル）ベンジル トリ−ｎ−
ブチルホスホニウムクロライド（４ｇ、１１．０ｍｍｏ
ｌ）の混合物に、トリ−ｎ−オクチルホスフィン（５．
７ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下で室温に
て添加した。該反応混合物を、アルゴン下で室温にて数
日間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示し
た。ＤＭＦを減圧下で除去し、油状残渣を得た。該残渣
をペンタンおよびトルエン／ペンタン（ｖ／ｖ、２０／
８０）混合物にて数回洗浄した。次いでこれを減圧下で
乾燥させて無色油状物を得た： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ
3）δ ０．８８（ｔ，９Ｈ）、０．９３（ｔ，９
Ｈ）、１．２５（ｂｒ ｓ，２４Ｈ）、１．４３（ｍ，
２４Ｈ）、２．５３（ｍ，１２Ｈ）、４．６７−４．６
９（ｄ，２Ｈ）、４．７３−４．７５（ｄ，２Ｈ）、
７．４０（ｔ，２Ｈ）、７．７１（ｍ，２Ｈ）
【００６４】１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメ
チル）−３−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）
ベンゼン ジクロライド（１１） ＤＭＦ中の３−（クロロメチル）ベンジル トリ−ｎ−
ブチルホスホニウムクロライド（２．２ｇ、５．８ｍｍ
ｏｌ）の混合物に、トリ−ｎ−オクチルホスフィン
（３．２ｇ、８．７ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下で室
温にて添加した。該反応混合物を、アルゴン下で室温に
て数日間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は反応の完了を
示した。ＤＭＦを減圧下で除去し、油状残渣を得た。こ
の無色油状物をペンタンおよびトルエン／ペンタン（ｖ
／ｖ、３０／７０）混合物にて数回洗浄し、次いで乾燥
さた： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．８８（ｔ，
９Ｈ）、０．９３（ｔ，９Ｈ）、１．２５（ｂｒ ｓ，
２４Ｈ）、１．４４（ｍ，２４Ｈ）、２．３９（ｍ，１
２Ｈ）、４．３３−４．３８（ｄ，４Ｈ）、７．３８
（ｔ，１Ｈ）、７．５１−７．６１（ｄｄ，２Ｈ）、
８．２４（ｓ，１Ｈ）
【００６５】１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメ
チル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）
ベンゼン ジクロライド（１２） ＤＭＦ中の４−（クロロメチル）ベンジル トリ−ｎ−
ブチルホスホニウムクロライド（３ｇ、７．９ｍｍｏ
ｌ）の混合物に、トリ−ｎ−オクチルホスフィン（４．
３９ｇ、１２ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下で室温にて
添加した。該反応混合物を、アルゴン下で室温にて数日
間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示し
た。ＤＭＦを減圧下で除去した。残渣をヘキサンおよび
トルエンにて数回洗浄し、次いで乾燥させて、１−（ト
リ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−
ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼン ジクロライ
ドを白色結晶として得た： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ ０．８４（ｔ，９Ｈ）、０．８９（ｔ，９Ｈ）、
１．２２（ｂｒ ｓ，２４Ｈ）、１．４１（ｍ，２４
Ｈ）、２．３４（ｍ，１２Ｈ）、４．３５−４．４０
（ｄ，４Ｈ）、７．５８（ｓ，４Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3 ）δ １．３．３４、１３．９４、１８．
３３、１８．６２、１８．９２、１９．２１、２１．７
６、２１．８１、２３．５８、２３．６４、２３．７
８、２３．９８、２６．１０、２６．６５、２８．８
６、３０．６８、３０．８８、３１．５３、１２９．２
２、１３１．２２；31ＰＮＭＲ δ３１．１０、３１．
９４
【００６６】１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメ
チル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）
ベンゼン ジブロマイド（１３） ＤＭＦ中の４−（ブロモメチル）ベンジル トリ−ｎ−
ブチルホスホニウムブロマイド（５ｇ、１１ｍｍｏｌ）
の混合物に、トリ−ｎ−オクチルホスフィン（４．９７
ｇ、１３ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下で室温にて添加
した。該反応混合物を、アルゴン下で数日間撹拌し、そ
の時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示した。ＤＭＦを減
圧下で除去した。残渣をトルエン中に溶解させ、結晶化
を誘発するためにペンタンを添加した。得られた結晶を
濾過し、ペンタンにて洗浄し、乾燥させて、１−（トリ
−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ
−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼン ジブロマイド
を白色結晶として得た： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ
０．８８（ｔ，９Ｈ）、０．９２（ｔ，９Ｈ）、１．
２６（ｂｒ ｓ，２４Ｈ）、１．４５（ｍ，２４Ｈ）、
２．３５（ｍ，１２Ｈ）、４．３６−４．４１（ｄ，４
Ｈ）、７．６０（ｓ，４Ｈ）
【００６７】１，４−ビス（トリ−ｎ−オクチルホスホ
ニウムメチル）ベンゼン ジブロマイド（１４） 無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のα，α’−ジブロモ−ｐ−
キシレン（５ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）の混合物に、トリ
−ｎ−オクチルホスフィン（２１ｇ、５６．７ｍｍｏ
ｌ）を、アルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、
アルゴン下で油浴中８０℃にて１２時間撹拌し、その時
点でＴＬＣ試験は、反応の完了を示した。ＤＭＦを減圧
下で除去し、油状残渣を得た。該油状残渣を、トルエン
／ヘキサン（３０／７０（ｖ／ｖ）、２００ｍＬ）に溶
解させ、−５℃にて結晶化した。結晶を濾過し、ヘキサ
ンにて数回洗浄し、乾燥させた。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）δ ０．８５（ｔ，１８Ｈ）、１．３２（ｂｒ
ｄ，７２Ｈ）、２．３３（ｔ，１２Ｈ）、４．３７
（ｄ，４Ｈ）、７．５６（ｓ，４Ｈ）
【００６８】１，４−ビス（トリ−ｎ−オクチルホスホ
ニウムメチル）ベンゼン ジクロライド（１４） 無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のα，α’−ジクロロ−ｐ−
キシレン（５ｇ、２８．６ｍｍｏｌ）の混合物に、トリ
−ｎ−オクチルホスフィン（２６ｇ、７０ｍｍｏｌ）
を、アルゴンガス下で添加した。該反応混合物を、アル
ゴン下で油浴中８０℃にて１２時間撹拌し、その時点で
ＴＬＣ試験は、反応の完了を示した。ＤＭＦを減圧下で
除去し、油状残渣を得た。該油状残渣を、ヘキサン（２
００ｍＬ）に溶解させ、−５℃にて結晶化した。結晶を
濾過し、ヘキサンにて数回洗浄し、乾燥させた。 1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．８８（ｂｒ ｓ，１８
Ｈ）、１．２６および１．４４（２ｂｒ ｓ，７２
Ｈ）、２．３６（ｂｒ ｓ，１２Ｈ）、４．３７（ｄ，
４Ｈ）、７．５８（ｓ，４Ｈ）
【００６９】４−（クロロメチル）ベンジルトリ−ｎ−
ブチルアンモニウム クロライド（１６） メタノール（５０ｍＬ）中のトリ−ｎ−ブチルアミン
（６ｇ、３２．２ｍｍｏｌ）およびα，α’−ジクロロ
−ｐ−キシレン（８．０ｇ、４６．０ｍｍｏｌ）の混合
物を、１５時間環流し、その時点でＴＬＣ試験は、反応
の完了を示した。メタノールを減圧下で除去し、油状残
渣を得た。無色油状物をトルエンおよびヘキサンにて数
回洗浄し、次いで乾燥させた。得られた生成物を更に精
製することなく使用した。
【００７０】４−（ブロモメチル）ベンジルトリ−ｎ−
ブチルアンモニウム ブロマイド（１７） トルエン（２００ｍＬ）中のα，α’−ジブロモ−ｐ−
キシレン（７．０ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）の混合物に、
トリ−ｎ−ブチルアミン（３．４３ｇ、１８．６ｍｍｏ
ｌ）をアルゴンガス下で添加した。該反応混合物をアル
ゴン下で室温にて数日間撹拌し、その時点でトリ−ｎ−
ブチルアンモニウム塩が溶液から晶出した。結晶を濾過
し、トルエン（３Ｘ５０ｍＬ）およびヘキサン（３Ｘ５
０ｍＬ）にて洗浄し、乾燥させた： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3 ）δ ０．９７（ｔ，９Ｈ）、１．３９（ｍ，６
Ｈ）、１．７６（ｍ，６Ｈ）、３．３２（ｍ，６Ｈ）、
４．４７（ｓ，２Ｈ）、４．９６（ｓ，２Ｈ）、７．４
２−７．５９（ｄｄ，４Ｈ）
【００７１】４−（アイオドメチル）ベンジルトリ−ｎ
−ブチルアンモニウム アイオダイド（１８） アセトン（１００ｍＬ）中のα，α’−ジクロロ−ｐ−
キシレン（５０ｇ、２８．６ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナ
トリウム（８．６ｇ、５７ｍｍｏｌ）の混合物に、トリ
−ｎ−ブチルアミン（３．７ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を
添加した。該反応混合物をアルゴン下で室温にて数日間
撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示した。
該反応混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去して油状残
渣を得た。残渣をペンタンにて数回洗浄し、乾燥させて
黄色固体を得た。生成物を更に精製することなく使用し
た。
【００７２】１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメ
チル）−４−（トリ−ｎ−ブチルアンモニウムメチル）
ベンゼン ジクロライド（１９） ＤＭＦ中の粗製の４−（クロロメチル）ベンジル トリ
−ｎ−ブチルアンモニウムクロライド（２．５ｇ、７．
０ｍｍｏｌ）の混合物に、トリ−ｎ−オクチルホスフィ
ン（３．８ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下
で室温にて添加した。該反応混合物を、アルゴン下で数
日間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示し
た。ＤＭＦを減圧下で除去した。残渣をヘキサンおよび
トルエンにて数回洗浄し乾燥させた。： 1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．８７（ｔ，９Ｈ）、０．９９
（ｔ，９Ｈ）、１．２５−１．７８（ｍ，４８Ｈ）、
２．３５（ｍ，６Ｈ）、３．３０（ｍ，６Ｈ）、４．４
７−４．５１（ｄ，２Ｈ）、５．１０（ｓ，２Ｈ）、
７．６８（ｓ，４Ｈ）
【００７３】１−（トリ−ｎ−オクチルアンモニウムメ
チル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）
ベンゼン ジブロマイド（２０） アセトニトリル中の４−（ブロモメチル）ベンジル ト
リ−ｎ−ブチルホスホニウムブロマイド（２．５ｇ、
５．３ｍｍｏｌ）の混合物に、トリ−ｎ−オクチルアミ
ン（２．８５ｇ、８ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下で室
温にて添加した。該反応混合物を、数日間撹拌し、その
時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示した。アセトニトリ
ルを減圧下で除去した。油状残渣をペンタンにて数回洗
浄し、次いで乾燥させて白色固体を得た。： 1Ｈ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．８８（ｔ，９Ｈ）、０．９４
（ｔ，９Ｈ）、１．２７−１．５０（３ｂｒ ｓ，４２
Ｈ）、１．８１（ｍ，６Ｈ）、２．３９（ｍ，６Ｈ）、
３．２６（ｍ，６Ｈ）、４．５３−４．５８（ｄ，２
Ｈ）、５．０９（ｄ，２Ｈ）、５．０９（ｓ，２Ｈ）、
７．６２−７．６７（ｄｄ，４Ｈ）
【００７４】１−（トリ−ｎ−オクチルアンモニウムメ
チル）−４−（トリ−ｎ−ブチルアンモニウムメチル）
ベンゼン ジブロマイド（２１） ＤＭＦ中の４−（ブロモメチル）ベンジル トリ−ｎ−
ブチルアンモニウムブロマイド（２．４３ｇ、５．４ｍ
ｍｏｌ）の混合物に、トリ−ｎ−オクチルアミン（２．
０ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス下で室温にて
添加した。該反応混合物を、数日間撹拌し、その時点で
ＴＬＣ試験は反応の完了を示した。ＤＭＦを減圧下で除
去した。油状残渣をトルエンおよびペンタンにて数回洗
浄し、次いで乾燥させて白色固体を得た。： 1Ｈ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．８７（ｔ，９Ｈ）、０．９９
（ｔ，９Ｈ）、１．２６−１．４４（ｍ，３６Ｈ）、
１．８０（ｍ，１２Ｈ）、３．２７−３．３５（ｍ，１
２Ｈ）、５．１７（ｓ，４Ｈ）、７．７２（ｓ，４Ｈ）
【００７５】１−（トリ−ｎ−オクチルアンモニウムメ
チル）−４−（トリ−ｎ−ブチルアンモニウムメチル）
ベンゼン ジアイオダイド（２２） アセトン（５０ｍＬ）中の４−（アイオドメチル）ベン
ジル トリ−ｎ−ブチルアンモニウムアイオダイド
（２．４４ｇ、４．５ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン
下で室温にてトリ−ｎ−オクチルアミン（１．６ｇ、
４．５ｍｍｏｌ）を添加した。該反応混合物を、数日間
撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示した。
該混合物にペンタン（１５０ｍＬ）を添加し、白色結晶
の生成を誘導した。結晶を濾過し、ペンタンにて数回洗
浄し、次いで乾燥させた： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ ０．８７（ｔ，９Ｈ）、０．９９（ｔ，９Ｈ）、
１．２６−１．４４（ｍ，３６Ｈ）、１．８２（ｍ，１
２Ｈ）、３．２９−３．３５（ｍ，１２Ｈ）、５．２３
（ｓ，４Ｈ）、７．７２（ｓ，４Ｈ）
【００７６】１−（トリドデシルアンモニウムメチル）
−４−（トリ−ｎ−ブチルアンモニウムメチル）ベンゼ
ン ジアイオダイド（２３） アセトン（５０ｍＬ）中の粗製の４−（アイオドメチ
ル）ベンジル トリ−ｎ−ブチルアンモニウムアイオダ
イド（３．４５ｇ、６．３ｍｍｏｌ）の混合物に、トリ
ドデシルアミン（３．３ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を添加し
た。該反応混合物を、アルゴン下で室温にて数日間撹拌
し、その時点でＴＬＣ試験は反応の完了を示した。該混
合物にペンタン（１５０ｍＬ）を添加し、フラスコ底部
に油状残渣の生成を誘導した。油状残渣をヘキサンにて
数回洗浄し、次いで乾燥させた： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3 ）δ ０．８８（ｔ，９Ｈ）、１．００（ｔ，９
Ｈ）、１．２５−１．３４（ｍ，６０Ｈ）、１．８２
（ｍ，１２Ｈ）、３．３３（ｍ，１２Ｈ）、５．２０
（ｓ，４Ｈ）、７．７２（ｓ，４Ｈ）
【００７７】第２群の増強剤は、一般的反応：
【化２８】 式中、Ｚ＝ＣＨ2 Ｘ、ＣＨ2 Ｐ＋Ｒ3 Ｘ−またはＣＨ2
Ｎ＋Ｒ3 Ｘ−、およびＸ＝Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
に従って調製された。
【００７８】１−ブロモ−１２−（トリ−ｎ−ブチルホ
スホニウム）ドデカン ブロマイド（２４） トルエン（７０ｍＬ）中の１，１２−ジブロモドデカン
（１０ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴンガ
ス下でトリ−ｎ−ブチルホスフィン（１ｇ、５．０ｍｍ
ｏｌ）を添加した。該反応混合物をアルゴン下で室温に
て数日間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は、反応の完了
を示した。トルエンを減圧下で除去し、油状残渣を得
た。該残渣をペンタンおよびヘキサンにて数回、トルエ
ン／ヘキサン（１０／９０（ｖ／ｖ）、２５ｍＬ）にて
２回洗浄し、減圧下で乾燥させて無色油状物を得た。 1
Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．９６（ｔ，９Ｈ）、
１．２４および１．５０（２ｂｒ ｓ，３０Ｈ）、１．
８３（ｍ，２Ｈ）、２．４３（ｍ，８Ｈ）、３．３９
（ｍ，２Ｈ）
【００７９】１，１２−ビス（トリ−ｎ−ブチルホスホ
ニウム）ドデカン ジブロマイド（２５） 無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の１，１２−ジブロモドデカ
ン（５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴンガ
ス下でトリ−ｎ−ブチルホスフィン（８ｇ、３９．０ｍ
ｍｏｌ）を添加した。該反応混合物をアルゴン下で室温
にて数日間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は、反応の完
了を示した。ＤＭＦを減圧下で除去し、油状残渣を得
た。該残渣をペンタンおよびヘキサンにて数回洗浄し、
トルエン／ヘキサン（３０／７０（ｖ／ｖ）、２００ｍ
Ｌ）に溶解し、−５℃にて結晶化した。結晶を濾過し、
ヘキサンにて数回洗浄し、乾燥させた。 1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．９７（ｔ，１８Ｈ）、１．３２
および１．５３（２ｂｒ ｓ，４４Ｈ）、２．４３
（ｍ，１６Ｈ）
【００８０】１−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウム）−
１２−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウム）ドデカン
ジブロマイド（２６） 無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の１−ブロモ−１２−（トリ
−ｎ−ブチルホスホニウム）ドデカンブロマイド（２
ｇ、３．８ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴンガス下でト
リ−ｎ−オクチルホスフィン（２ｇ、５．７ｍｍｏｌ）
を添加した。該反応混合物をアルゴン下で室温にて数日
間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は、反応の完了を示し
た。ＤＭＦを減圧下で除去し、油状残渣を得た。該残渣
をペンタンおよびトルエン／ペンタン（ｖ／ｖ、２０／
８０）にて数回洗浄した。次いでこれを減圧下で乾燥さ
せて無色油状物を得た： 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ
０．８７（ｔ，９Ｈ）、０．９７（ｔ，９Ｈ）、１．
２６（ｂｒ ｓ，３６Ｈ）、１．５３（ｍ，３２Ｈ）、
２．４３（ｍ，１６Ｈ）
【００８１】１，１２−ビス（トリ−ｎ−オクチルホス
ホニウム）ドデカン ジブロマイド（２７） 無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の１，１２−ジブロモドデカ
ン（５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴンガ
ス下でトリ−ｎ−オクチルホスフィン（１５ｇ、３９．
０ｍｍｏｌ）を添加した。該反応混合物をアルゴン下で
室温にて数日間撹拌し、その時点でＴＬＣ試験は、反応
の完了を示した。ＤＭＦを減圧下で除去し、油状残渣を
得た。該残渣をトルエンおよびヘキサンにて数回洗浄
し、トルエン／ヘキサン（３０／７０（ｖ／ｖ）、２０
０ｍＬ）に溶解し、−５℃にて結晶化した。結晶を濾過
し、ヘキサンにて数回洗浄し、乾燥させた。 1Ｈ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3 ）δ ０．８３（ｔ，１８Ｈ）、１．２
２および１．４６（２ｂｒｓ，９２Ｈ）、２．３８
（ｍ，１６Ｈ）
【００８２】１から２７までの構造は、次の通りであ
る：
【化２９】
【００８３】
【化３０】
【００８４】２．界面活性剤の特徴付け−表面張力低下
測定 ２価陽イオン性界面活性剤化合物１１−１３、１９、２
５および１価陽イオン性界面活性剤セチルトリメチルア
ンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）を、デュノイのリン
グ式表面張力低下法にて評価した。重量で１％、０．１
％、および０．０１％の溶液を測定し、結果を純水の表
面張力と比較した。表面張力の低下は、界面活性剤の性
質の証拠となる。表１は、いくつかの界面活性剤化合物
の水溶液のｄｙｎｅ／ｃｍでの表面張力γを示す。
【００８５】
【表１】 表１界面活性剤 ０．０１％ ０．１％ １．０％ ＣＴＡＢ ５１ ３８ ３１ １１ ５６ ３９ ２７ １２ ４４ ２９ ２９ １３ ６１ ４７ ３０ １９ ４１ ２９ ２６ ２５ ６２ ５３ ４１ 脱イオン水の２５℃における表面張力は、７１．９７ｄ
ｙｎｅ／ｃｍである。
【００８６】３．化学発光および蛍光スペクトル 化学発光および蛍光スペクトルを、１ｃｍ水晶キュベッ
トを使用してＦｌｕｏｒｏｌｏｇII蛍光測定装置（Ｓｐ
ｅｘ Ｉｎｄ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）にて測定した。
すべての測定は環境温度下で行った。０．８８ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 および０．１％の界面活性剤１２を含む２２１
緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ９．６）中のＬＵＭＩＧＥＮ
ＰＰＤの溶液２ｍＬをキュベットにいれ、アルカリホス
ファターゼ（Ｂｉｏｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）の溶液５μｌを注入することによって化学発光を開
始させた。光強度が一定水準に達した際のスペクトルの
走査は、化学発光輻射が４７０ｎｍにて最大であること
を示した。
【００８７】４．酵素アッセイにおける最適増強剤濃度
の決定 ９６−ウエルマイクロプレートの３個のウエルのそれぞ
れに、０．８８ｍＭのＭｇＣｌ2 および１．０〜０．０
１ｍｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度の界面活性剤１２を含
む０．２Ｍの２−メチル−２−アミノ−１−プロパノー
ル（２２１）緩衝溶液、ｐＨ９．６中のＬＵＭＩＧＥＮ
ＰＰＤの０．３３ｍＭ溶液、１００μｌを加えた。該
プレートを３７℃にてインキュベートし、９．２Ｘ１０
-18 ｍｏｌの子牛腸アルカリホスファターゼの添加によ
り化学発光を開始させた。発光を、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａ
ｎルミノメータにて２時間測定した。示された最大発光
強度は、６個のウエルの平均である（図１）。酵素を含
まない対応するブランク溶液からの発光は、溶液の組に
亘って、本質的に一定である。光強度およびシグナル対
バックグランドは、０．５−０．６ｍｇ／ｍＬの界面活
性剤濃度で最適である。
【００８８】５．ＬＵＭＩＧＥＮ（登録商標）ＰＰＤ増
強剤を用いたアルカリホスファターゼ検出の直線性 ９６−ウエルマイクロプレートの６個のウエルのそれぞ
れに、０．８８ｍＭのＭｇＣｌ2 および０．５ｍｇ／ｍ
Ｌの界面活性剤１２を含む０．２Ｍの２−メチル−２−
アミノ−１−プロパノール（２２１）緩衝溶液、ｐＨ
９．６中のＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤの０．３３ｍＭ溶
液、１００μｌを加えた。該プレートを３７℃にてイン
キュベートし、９．２Ｘ１０-18 ｍｏｌと９．２Ｘ１０
-23 ｍｏｌとの間の子牛腸アルカリホスファターゼを含
む１０μｌ希釈物の添加により化学発光を開始させた。
図２は、０．００９ａｍｏｌのアルカリホスファターゼ
が検出可能であることを示している。このことは、界面
活性剤を用いない同様な系に比べて２０００倍低い検出
限界を表す。
【００８９】６．酵素的にトリガーされるＬＵＭＩＧＥ
Ｎ ＰＰＤ分解の増強 表２は、３７℃において水中の５ａｍｏｌのアルカリホ
スファターゼ（ＡＰ）の添加によりトリガーされた場合
の、０．８８ｍＭのＭｇＣｌ2 および１．０ｍｇ／ｍＬ
の増強剤を含む０．２Ｍの２２１緩衝溶液、ｐＨ９．６
中のＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤの０．３３ｍＭ溶液、１０
０μｌの分解により生じる化学発光強度を比較するもの
である。発光を、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎルミノメータに
て２時間測定し、３０分における光強度シグナルを記録
した（Ｓ）。示された値は、６個の結果の平均である。
バックグランド強度（Ｂ）は、酵素不在下の光の水準で
ある。Ｓ／Ｂは、バックグランド光強度（Ｂ）に対する
３０分での光強度（Ｓ）の比である。挿入‘ＣＴＡＢ
（０．４１ｍｇ／ｍＬ）’は、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ４８
０（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌ
ｄ，ＭＩ）を表す。
【００９０】
【表２】 表２ ３７℃におけるアルカリホスファターゼ−トリガーＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤからの化学発光の増強 界面活性剤 Ｂ Ｓ＠３０分 Ｓ／Ｂ ９Ｘ１０-19 ｍｏｌＡＰ なし ０．１３５ ０．７３１ ５．４３ ＣＴＡＢ ０．０８５ １．８３４ ２１．６５ （０．４１ｍｇ／ｍＬ） ６ ０．１２４ ０．５８８ ４．７３ ７ ０．１２３ ０．６１９ ５．０５ １０＊ ０．３４２ １０１．３ ２９６．６ １１ ０．２２９ ７９．８ ３４８．３ １２ ０．１５７ ４５．７ ２９２．０ １３＊ ０．２２２ １０１．２ ４５６．７ １９ ０．１４５ ３６．３５ ２５０．３ ２５ ０．１２５ ０．８１４ ６．５４ ２６＊ ０．２４７ ５９．１ ２３８．９ ２７＊ ０．３９９ ９７．２４ ２４３．８ ＊溶液は５％エタノールも含む。別個に、緩衝液中のＬ
ＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤ自体への５％エタノールの添加
は、なんらの増強も生じなかった。
【００９１】７．ウエスタンブロットによるタンパク質
の化学発光検出に対する界面活性剤の適用 本発明の組成物のウエスタンブロット技術によるタンパ
ク質の化学発光検出に対する優位点を、以下の例で示
す。２価陽イオン性界面活性剤を含むウエスタンブロッ
ト用検出試薬の感度を、既知量のトランスフェリンを使
用して決定した。
【００９２】方法 ウサギ抗−ヤギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ接合体
は、Ｃａｐｐｅｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｄｕｒｈａｍ，
ＮＣ）から入手された。ヒトトランスフェリンおよび分
画ヤギ抗−ヒトトランスフェリン血清は、Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入された。ＩｇＧ試料
を、１０，０００ｇにて２分間遠心分離にかけ、上澄を
免疫反応に使用した。
【００９３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｌａｅｍｍｌｉ
（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ），２２７，６８０（１９７０））により記述された
緩衝液系を使用して実施した。スタッキングゲルは、
４．３８％アクリルアミド：０．１２％ビスアクリルア
ミドであった。分離ゲルは、６．８１％アクリルアミ
ド：０．１９％ビスアクリルアミドであった。電気泳動
に続いて、ゲルを、２０ｍＭＴｒｉｓ、１５３ｍＭグリ
シンおよび２０％（ｖ／ｖ）メタノールを含む移送用緩
衝液にて７−８分間平衡化した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−
Ｐ移送膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆ
ｏｒｄ，ＭＡ）のシートと、クロマトグラフィ紙３ＭＭ
（Ｗｈａｔｍａｎ）のシートとの間に挟んだゲルを、移
送ユニット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）に置いた。ゲル中のタン
パク質を、４℃にて１００Ｖの定電圧で、５０−６０分
間電気溶出した。次いで該膜を、ｐＨ７．４の５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝食塩水中に、４℃にて一夜置い
た。その後、該膜をＴＢＳにて１５分間洗浄した。
【００９４】該膜を、１％脱脂粉乳（ＮＦＭ）を含むｐ
Ｈ７．４の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝食塩水（Ｔ−
ＴＢＳ）中で、室温にて１時間、０．０５％トゥイーン
−２０にて処理した。このブロック化膜を、１％ＮＦＭ
を含むＴ−ＴＢＳを使用して、一次抗体（ヤギ抗−ヒト
トランスフェリンＩｇＧ分画の１：５００希釈）と共に
室温にて７５分間インキュベートした。次いで該膜を、
Ｔ−ＴＢＳにより室温にてそれぞれ１０分間、３回すす
ぎ、洗浄した。洗浄した膜を、１％ＮＦＭを含むＴ−Ｔ
ＢＳを使用して、二次抗体（ウサギ抗−ヒツジＩｇＧ−
アルカリホスファターゼ接合体の１：５０００希釈）と
共に室温にて１時間インキュベートした。次いで該膜
を、Ｔ−ＴＢＳにより室温にてそれぞれ１０分間、４回
すすぎ、洗浄し、次いでＴＢＳにて１０分間洗浄した。
洗浄した膜を、検出試薬中でインキュベートし、排出
し、透明フィルムのシート間に挟んだ。Ｋｏｄａｋ（Ｒ
ｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）のＸ−ＯＭＡＴ−ＡＲ Ｘ線
フィルムを該膜に対して５〜３０秒間露出した。
【００９５】分画ヤギ抗−ヒトトランスフェリン血清に
代えて正常ヤギ血清を使用した対照ブロットにおいて
は、トランスフェリンをみることができないことが示さ
れた。これらの結果は、抗−トランスフェリン血清を使
用する実験において検出されるバンドが、特異的である
ことを示している。迅速な検出は、像の強度を最適化す
るために数時間に亘って、いくつかの露出を行うことを
可能ならしめた。
【００９６】本発明の界面活性剤増強剤を含む試薬
（Ａ）、およびＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ５３０（Ｌｕｍｉｇ
ｅｎ， Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，ＭＩ）を含
む試薬（Ｂ）を使用してウエスタンブロットされたヒト
トランスフェリンの化学発光検出を行った。前者の検出
試薬溶液の組成は、ＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤ、０．３３
ｍＭ；２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝
液、０．１Ｍ、ｐＨ９．６；Ｍｇ2+、０．８８ｍＭ；界
面活性剤１２、１ｍｇ／ｍＬであった。
【００９７】使用されたトランスフェリン標準は、試薬
Ａを使用して４５分間のインキュベーションおよび５秒
間のＸ線フィルム露出（図３Ａ）、並びにＬＵＭＩ−Ｐ
ＨＯＳ５３０にて６０分間のインキュベーションおよび
３０分間の露出（図３Ｂ）にて、２０ｐｇ／スロットま
で検出可能であった。
【００９８】８．サザンブロットによるＤＮＡの化学発
光検出への界面活性剤の適用 本発明の組成物のサザンブロット技術によるナイロン膜
上のＤＮＡの化学発光検出に対する優位点を、以下の例
で示す。
【００９９】方法 アビジン−アルカリホスファターゼ接合体を、Ｃａｐｐ
ｅｌTM Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）から
入手した。ウシ血清アルブミン（熱ショック）をＳｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）から、マウスゲノムＤＮＡおよびｖ−ｍｏｓＤＮ
ＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）か
ら購入した。ビオチン化ラムダＤＮＡ／Ｈｉｎｄ III断
片、ビオチン−７−ｄＡＴＰおよびニックトランスレー
ションキットを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｋｏｇｉｅｓ
から、また制限酵素ＥｃｏＲＩをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉ
Ｎ）から入手した。ナイロン移送膜を、Ｍｉｃｒｏｎ
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）か
ら、またニトロセルロース膜をＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｉｎｃ．（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）か
ら入手した。アッセイ法においてＫｏｄａｋ Ｘ−ＯＭ
ＡＴ ＡＲＸ線フィルム（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）
を使用した。
【０１００】マウスゲノムＤＮＡ（１５μｇ）を、Ｅｃ
ｏＲＩにて完全に切断し、１０μｇと５μｇの部分に分
けた。制限ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出お
よびエタノール沈殿によって精製した。精製ＤＮＡを、
４０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−酢酸、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８．０を溶出緩衝液とし、０．７７％アガ
ロースゲルにて分離した。電気泳動に次いで、ゲルを水
にてすすぎ、０．２５ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌにて１２分間
平衡化し、再度水にてすすぎ、０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ
ＯＨ、１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌにて１５分間、次い
で新たに交換した同じ溶液にて３０分間インキュベート
し、水にてすすぎ、１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ、１．５ｍｏ
ｌ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ７．５を３回交換してそれぞれ１
５分間インキュベートした。
【０１０１】ナイロン膜を、水に２分間、および１０Ｘ
ＳＳＣに５分間順次浸した。ＤＮＡを、キャピラリブロ
ティングにより、１０ＸＳＳＣ中で一夜で膜に移した。
該膜を、１０ＸＳＳＣ中にて室温で１０分間、穏やかに
撹拌して洗浄し、Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭブロティング
紙上で３０分間空気乾燥させ、真空中で２時間、８０℃
にて焼き付けた。
【０１０２】該膜を、６ＸＳＳＰＥ（２０Ｘ ＳＳＰＥ
は、３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｍｏｌ／Ｌ リン
酸二水素ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７．４である）に浸し、次いで、プレ−ハイブリダイ
ゼーション溶液：６ＸＳＳＰＥ、５０％の新たに脱イオ
ンしたホルムアミド、濾過した５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶
液（５０Ｘは、１％フィコール、１％ ＰＶＰ、１％Ｂ
ＳＡの熱ショックによる最初の分画）、濾過した１％Ｓ
ＤＳ、２００μｇ／ｍＬの切断変性ニシン精子ＤＮＡ中
で、４２℃にて３時間プレ−ハイブリダイゼーションを
行った。ハイブリダイゼーションプローブ、ｖ−ｍｏｓ
ＤＮＡを、製造者の指示書に従って、ニックトランスレ
ーションによりビオチン−７−ｄＡＴＰを用いて標識し
た。ゲノムＤＮＡを、３００μｇ／ｍＬの変性ビオチン
化プローブを用いて、６ＸＳＳＰＥ、４５％ホルムアミ
ド、濾過した５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ、１％ＳＤＳ中で、
４２℃にて一夜ハイブリッドさせた。ビオチン化プロー
ブを、４分間煮沸して変性させ、０℃にて１０分間冷却
した。該膜を、０．５ＸＳＳＣ、０．４％ＳＤＳにて２
５℃で５分間、２回洗浄、０．５ＸＳＳＣ、０．４％Ｓ
ＤＳにて５５℃で１０分間３回洗浄、２ＸＳＳＣにて２
５℃で５分間２回洗浄、およびＴＢＳ（５０ｍｍｏｌ／
Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５ｍｏｌ／
ＬのＮａＣｌ）にて３分間、２回洗浄した。洗浄工程の
後、該膜を濾過した３％ＢＳＡ、１００ｍｍｏｌ／ＬＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５ｍｏｌ／Ｌ Ｎ
ａＣｌ中で、６３℃にて１時間ブロックし、Ｔ−ＴＢＳ
（ＴＢＳ中に０．０５％トゥイーン２０）にて３分間洗
浄した。
【０１０３】ブロックした膜をＴ−ＴＢＳ中のアビジン
−アルカリホスファターゼの１：２０００希釈物中で１
２分間インキュベートし、次いで新たに４回交換したＴ
−ＴＢＳ中で５、１５、１５および２０分間インキュベ
ートし、更にＴＢＳにて５分間最終洗浄した。過剰の緩
衝液を排出し、ブロットを例７に記載の検出試薬Ａ、ま
たはＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ５３０検出試薬のいずれかに１
０分間浸した。過剰の試薬を排出し、ブロットを透明シ
ート間に挟み、Ｘ線フィルムに露出した。
【０１０４】ｖ−ｍｏｓの相同遺伝子に対応する単一コ
ピーの遺伝子が、該膜を検出試薬に浸し、Ｋｏｄａｋ
ＸＡＲ−５フィルムに種々の長さの時間をもって露出す
ることによって、１４ｋｂｐに検出された。３５分間の
インキュベーション後、両分画中の単一コピー遺伝子に
対応するバンドは、本発明の試薬Ａを使用してフィルム
への２５分間の露出で見ることができた（図４Ａ）。よ
り短いインキュベーション時間のものも優れた像を形成
した。複数回の露出を１日以上に亘って容易に行うこと
ができた。ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ５３０を使用して比較で
きる感度は、６０分間のインキュベーションの後、１０
０分間のより長い露出を必要とした。
【０１０５】９．ニトロセルロース膜上でのＤＮＡの化
学発光検出 以下に例示されるように、本発明の組成物は、サザンブ
ロット技術によるニトロセルロース膜上でのＤＮＡの化
学発光検出に特に有用である。ＥｃｏＲＩ制限マウスＤ
ＮＡのサザンブロット分析を、前述の例を１カ所修飾し
て使用して、ニトロセルロース上にブロットされた１０
および５μｇの試料について行った。移送に先立って、
ニトロセルロース膜を水に２分間および１０ＸＳＳＣに
３０分間、順次浸した。移送、洗浄、ブロットおよびハ
イブリダイゼーションの工程を、上述したのと同様に行
った。単一コピーの遺伝子を、例７に記述した試薬Ａ中
で４０分間インキュベートした後、ＸＡＲ−５フィルム
に６０分間露出して検出した（図５Ａ）。ＬＵＭＩ−Ｐ
ＨＯＳ５３０に浸された膜は、より長い３時間のインキ
ュベーションおよび一夜の露出を必要とした（図５
Ｂ）。
【０１０６】１０．膜の前処理による化学発光サザンブ
ロットに対する界面活性剤の適用 マウスゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を、修飾化学
発光検出法により実施し、ここにおいてナイロンまたは
ニトロセルロース検出膜を、検出試薬の添加に先立って
最初に２価陽イオン性界面活性剤増強剤によって処理し
た。この方法は、同じインキュベーションおよび露出時
間について、単に膜を検出試薬と接触させることによっ
て得られる結果よりも、更に強調されたシグナルを与え
る。従って、同じ感度を達成するためには、インキュベ
ーションおよび露出時間が減少するであろう。
【０１０７】例８および９に記述したように実施された
サザンブロット分析において、最終洗浄工程の後で膜を
検出試薬に接触させる前に、該膜を過剰の緩衝液を除去
すべく濾紙にブロットした。該膜を、０．８８ｍＭ Ｍ
ｇ2+および１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤１２を含む０．１
Ｍ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝
液、ｐＨ９．６からなる溶液に、１０分間浸した。該膜
を、溶液から取り出し、濾紙にブロットし、例７に記述
した検出試薬溶液中に置いて１．５−２時間インキュベ
ートした。検出試薬Ａによる処理に先立って、界面活性
剤増強剤によって処理した膜は、前処理を行わない膜に
比べて３−４倍速く、同程度のシグナル強度に達した。
【０１０８】上記の記述は、本発明を例示することを意
図するものであり、本発明は、ここに添付する特許請求
の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０．８８ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む０．
２Ｍ ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２
２１）緩衝溶液、ｐＨ９．６中のＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰ
Ｄの０．３３ｍＭ溶液１００μＬと、１．０〜０．０１
ｍｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度の界面活性剤１２により
輻射される最大化学発光強度のグラフである。
【図２】図２は、０．８８ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む０．
２Ｍ ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２
２１）緩衝溶液、ｐＨ９．６中のＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰ
Ｄの０．３３ｍＭ溶液１００μＬと、０．５ｍｇ／ｍＬ
の界面活性剤１２により輻射される最大化学発光強度の
グラフである。
【図３】クロマトグラフを示す写真であって、ＰＶＤＦ
ウエスタンブロットされたヒトトランスフェリンの化学
発光検出を示すウエスタンブロットフィルムを示し、図
３Ａにおいて、ヤギ抗−ヒトトランスフェリン、ウサギ
抗−ヤギＩｇＧ−アルカリホスファターゼおよび本発明
の試薬（ＬＵＭＩＧＥＮ ＰＰＤ、０．３３ｍＭ、２−
アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液、ｐＨ
９．６；Ｍｇ2+、０．８８ｍＭ；界面活性剤、１ｍｇ／
ｍＬ）の使用を示し、図３Ｂにおいて、０．７５Ｍ ２
−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液、ｐＨ
９．６、ＭｇＣｌ2 （０．８８ｍＭ）、ＣＴＡＢ（１．
１３ｍＭ）およびテトラデカノイルアミノ−フルオレセ
イン（３７．５μＭ）を含むＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ５３０
（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，
ＭＩ）の使用を示す。
【図４】クロマトグラフを示す写真であって、ビオチン
化ｖ−ｍｏｓプローブおよびアビジン−アルカリホスフ
ァターゼを使用するナイロン膜上でのマウスゲノムＤＮ
Ａ由来の単一コピー遺伝子のサザンブロットの化学発光
検出を示すサザンブロットフィルムの図である。
【図５】クロマトグラフを示す写真であって、ビオチン
化ｖ−ｍｏｓプローブ、アビジン−アルカリホスファタ
ーゼ、図３Ａにて使用された本発明の試薬（図５Ａ）お
よびＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ５３０（図５Ｂ）を使用するニ
トロセルロース膜上でのマウスゲノムＤＮＡ由来の単一
コピー遺伝子の化学発光検出を示すサザンブロットフィ
ルムの図である。

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
    2 ）3 Ｘ- 式中、Ａは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Ｘは、陰イオン性の対イオンであ
    り、Ｒ1 およびＲ2 は、未置換および置換の１〜２０個
    の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
    る群から選択され、かつＲ1 およびＲ2 の少なくとも１
    個は異なり、並びにＬｉｎｋは、４〜２０個の炭素原子
    を有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレ
    ン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群から
    選択される炭素鎖基である、を有する化合物。
  2. 【請求項２】 Ｌｉｎｋが、フェニレンである請求項１
    に記載の化合物。
  3. 【請求項３】 Ｌｉｎｋが、１０個の炭素原子を含むア
    ルキレンである請求項１に記載の化合物。
  4. 【請求項４】 Ｌｉｎｋが、アリールエンであり、Ｒ1
    がｎ−オクチルであり、およびＲ2 がｎ−ブチルである
    請求項１に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 Ｌｉｎｋが、アルキレンであり、Ｒ1 が
    ｎ−オクチルであり、およびＲ2 がｎ−ブチルである請
    求項１に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 ＡがＰである、請求項１〜５のいずれか
    に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 ＡがＮである、請求項１〜５のいずれか
    に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 該化合物が、１−（トリ−ｎ−オクチル
    ホスホニウムメチル）−２−（トリエチルホスホニウム
    メチル）ベンゼンジクロライド、１−（トリ−ｎ−オク
    チルホスホニウムメチル）−２−（トリ−ｎ−ブチルホ
    スホニウムメチル）ベンゼンジクロライド、１−（トリ
    −ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−３−（トリ−ｎ
    −ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロライド、
    １−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−
    （トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジク
    ロライド、１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチ
    ル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベ
    ンゼンジブロマイド、１−（トリ−ｎ−オクチルホスホ
    ニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム
    メチル）ベンゼンジクロライド、１−（トリ−ｎ−オク
    チルアンモニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホ
    スホニウムメチル）ベンゼンジブロマイド、１−（トリ
    −ｎ−オクチルアンモニウムメチル）−４−（トリ−ｎ
    −ブチルアンモニウムメチル）ベンゼンジクロライド、
    １−（トリ−ｎ−オクチルアンモニウムメチル）−４−
    （トリ−ｎ−ブチルアンモニウムメチル）ベンゼンジア
    イオダイド、１−（トリドデシルアンモニウムメチル）
    −４−（トリ−ｎ−ブチルアンモニウムメチル）ベンゼ
    ンジアイオダイド、および１−（トリ−ｎ−ブチルホス
    ホニウムメチル）−１２−（トリ−ｎ−オクチルホスホ
    ニウム）ドデカンジブロマイド、からなる群から選択さ
    れる請求項１に記載の化合物。
  9. 【請求項９】 光生成分子の活性化により生じる化学発
    光の増強方法であって、該分子からの化学発光を、式： Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
    2 ）3 Ｘ- 式中、Ａは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Ｘは、陰イオン性の対イオンであ
    り、Ｒ1 およびＲ2 は、未置換および置換の１〜２０個
    の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
    る群から選択され、かつＲ1 およびＲ2 は同一または異
    なってよく、並びにＬｉｎｋは、４〜２０個の炭素原子
    を有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレ
    ン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群から
    選択される炭素鎖基である、を有する化合物の存在下で
    生じされることを含んでなる化学発光の増強方法。
  10. 【請求項１０】 増強化合物塩の存在下、化学発光の生
    成をトリガー可能な安定１，２−ジオキセタンからの化
    学発光の増強方法であって： （ａ）溶液中または光が生成されるべき表面に、安定
    １，２−ジオキセタンおよび式： Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
    2 ）3 Ｘ- 式中、Ａは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Ｘは、陰イオン性の対イオンであ
    り、Ｒ1 およびＲ2 は、未置換および置換の１〜２０個
    の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
    る群から選択され、かつＲ1 およびＲ2 は同一または異
    なってよく、並びにＬｉｎｋは、４〜２０個の炭素原子
    を有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレ
    ン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群から
    選択される炭素鎖基である、を有する化合物を与え；お
    よび（ｂ）１，２−ジオキセタンを活性化剤にてトリガ
    ーして増強された化学発光を与えること、を含んでなる
    化学発光の増強方法。
  11. 【請求項１１】 １，２−ジオキセタンが、式： 【化１】 式中、Ｒ5 およびＲ6 は、互いに結合してもよい有機基
    であり、Ｒ3 はＲ4 と結合してもよい有機基であり、Ｒ
    4 は、Ｘ−オキシ基により置換されたアリール基であ
    り、化学的に不安定な基Ｘを除去すべく、酸、塩基、
    塩、酵素、無機および有機触媒並びに電子供与体から選
    択される活性化剤によりトリガーされた場合に不安定な
    オキシド中間体ジオキセタンを形成する、を有する請求
    項２０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】１，２−ジオキセタンが、式： 【化２】 式中、Ｒ3 は、１〜８個の炭素原子を含み、付加的にヘ
    テロ原子を含んでもよいアルキルまたはアラルキルから
    選択され、Ｒ5 は、６〜３０個の炭素原子を含み、付加
    的にヘテロ原子を含んでもよいスピロ融合環式および多
    環式有機基から選択され、Ｒ4 は、置換または未置換で
    あってよいアリール、ビアリール、ヘテロアリール、融
    合環多環式のアリールまたはヘテロアリール基から選択
    され、ＯＸは、Ｘ−オキシ基であり、化学的に不安定な
    基Ｘを除去すべく、酸、塩基、塩、酵素、無機および有
    機触媒並びに電子供与体から選択される活性化剤により
    トリガーされた場合に不安定なオキシド中間体ジオキセ
    タンを形成する、を有する請求項２０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ＯＸ基が、ヒドロキシル、トリアルキ
    ルもしくはアリールシリルオキシ、無機オキシ酸塩、リ
    ン酸塩、硫酸塩、酸素−ピラノシド、アリールおよびア
    ルキルカルボニルエステルから選択される請求項２２に
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】 Ｒ5 Ｃが、アダマンチルまたは置換ア
    ダマンチルからなる群から選択される請求項２３に記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 Ｒ4 が、メタ−フェニルである請求項
    ２３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 Ｒ3 が、メチルである請求項２３に記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 Ｒ3 がメチルであり、Ｒ4 がメタ−フ
    ェニルであり、ＯＸがリン酸塩であり、活性化剤がアル
    カリホスファターゼである請求項２４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 リン酸塩が、ＯＰＯ3 Ｎａ2 である請
    求項２７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 Ａが、両者ともにリン原子であり、Ｌ
    ｉｎｋが、オルト−、メタ−またはパラ−フェニレンで
    ある請求項２０〜２８項のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】 Ａが、両者ともに窒素原子であり、Ｌ
    ｉｎｋが、オルト−、メタ−またはパラ−フェニレンで
    ある請求項２０〜２８項のいずれかに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 Ａの一方がリン原子であり、他方が窒
    素原子であり、Ｌｉｎｋが、オルト−、メタ−またはパ
    ラ−フェニレンである請求項２０〜２８項のいずれかに
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 Ｌｉｎｋが、６〜２０個の炭素原子を
    有するアルキレン鎖である請求項２０〜２８項のいずれ
    かに記載の方法。
  23. 【請求項２３】 該方法が、酵素、抗体、抗原、または
    核酸の化学発光検出のために使用される請求項１９〜２
    ８項のいずれか１項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 該方法が、酵素結合イムノアッセイま
    たは酵素結合核酸アッセイにおいて使用される請求項１
    ９〜２８項のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該酵素が、アルカリホスファターゼま
    たはガラクトシダーゼである請求項１９〜２８項に記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】 化学発光がフィルムまたはイムノメー
    タにより検出される請求項１９〜２８項のいずれか１項
    に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 （ａ）化学発光を生成すべく活性化可
    能な光生成分子；および（ｂ）式： Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
    2 ）3 Ｘ- 式中、Ａは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Ｘは、陰イオン性の対イオンであ
    り、Ｒ1 およびＲ2 は、未置換および置換の１〜２０個
    の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル基からな
    る群から選択され、かつＲ1 およびＲ2 は異なり、並び
    にＬｉｎｋは、４〜２０個の炭素原子を有するジアルキ
    レンアリール、アリール、アルキレン、アルケニレンお
    よびアルキニレン基からなる群から選択される炭素鎖基
    である、を有する化合物である増強剤を含んでなる組成
    物。
  28. 【請求項２８】 （ａ）安定１，２−ジオキセタン；お
    よび（ｂ）式： Ｘ- （Ｒ1 ）3 Ａ+ ＣＨ2 −Ｌｉｎｋ−ＣＨ2 Ａ+ （Ｒ
    2 ）3 Ｘ- 式中、Ａは別個にまたは共に、リンおよび窒素原子から
    なる群から選択され、Ｘは、フルオロ、アイオド、ブロ
    モ、およびクロロからなる群から選択されるハライドイ
    オンであり、Ｒ1 およびＲ2 は、未置換および置換の１
    〜２０個の炭素原子を有するアルキルおよびアラルキル
    基からなる群から選択され、かつＲ3 およびＲ4 は同一
    または異なり、並びにＬｉｎｋは、４〜２０個の炭素原
    子を有するアリールジアルキレン、アリーレン、アルキ
    レン、アルケニレンおよびアルキニレン基からなる群か
    ら選択される炭素鎖基である、を有する増強化合物を含
    んでなり、充分量の化合物の存在下で溶液中または表面
    上で、該化合物の不在下に得られる化学発光に比べて増
    強された化学発光が生成される組成物。
  29. 【請求項２９】 １，２−ジオキセタンが、式： 【化３】 式中、Ｒ5 およびＲ6 は、互いに結合してもよい有機基
    であり、Ｒ3 はＲ4 と結合してもよい有機基であり、Ｒ
    4 は、Ｘ−オキシ基により置換されたアリール基であ
    り、化学的に不安定な基Ｘを除去すべく、酸、塩基、
    塩、酵素、無機および有機触媒並びに電子供与体から選
    択される活性化剤によりトリガーされた場合に不安定な
    オキシド中間体ジオキセタンを形成する、を有する請求
    項３８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 １，２−ジオキセタンが、式： 【化４】 式中、Ｒ3 は、１〜８個の炭素原子を含み、付加的にヘ
    テロ原子を含んでもよいアルキルまたはアラルキルから
    選択され、 【化５】 は、６〜３０個の炭素原子を含み、付加的にヘテロ原子
    を含んでもよいスピロ融合環式および多環式有機基から
    選択され、Ｒ4 は、置換または未置換であってよいアリ
    ール、ビアリール、ヘテロアリール、融合環多環式のア
    リールまたはヘテロアリール基から選択され、ＯＸは、
    Ｘ−オキシ基であり、化学的に不安定な基Ｘを除去すべ
    く、酸、塩基、塩、酵素、無機および有機触媒並びに電
    子供与体から選択される活性化剤によりトリガーされた
    場合に不安定なオキシド中間体ジオキセタンを形成す
    る、を有する請求項３８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ＯＸ基が、ヒドロキシル、トリアルキ
    ルもしくはアリールシリルオキシ、無機オキシ酸塩、リ
    ン酸塩、硫酸塩、酸素−ピラノシド、アリールおよびア
    ルキルカルボニルエステルから選択される請求項４０に
    記載の方法。
  32. 【請求項３２】 ＯＸ基が、ＯＰＯ3 Ｎａ2 である請求
    項４１に記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 【化６】 が、アダマンチルまたは置換アダマンチルから選択され
    る請求項４２に記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 Ｒ4 が、メタ−フェニルである請求項
    ４２に記載の組成物。
  35. 【請求項３５】 Ｒ3 が、メチルである請求項４２に記
    載の組成物。
  36. 【請求項３６】 Ｒ3 がメチルであり、Ｒ4 がメタ−フ
    ェニルであり、ＯＸがリン酸塩であり、活性化剤がアル
    カリホスファターゼである請求項４３に記載の組成物。
  37. 【請求項３７】 リン酸塩が、ＯＰＯ3 Ｎａ2 である請
    求項４６に記載の組成物。
  38. 【請求項３８】 Ａが、両者ともにリン原子であり、Ｌ
    ｉｎｋが、オルト−、メタ−またはパラ−フェニレンで
    ある請求項３７〜４７項のいずれかに記載の組成物。
  39. 【請求項３９】 Ａが、両者ともに窒素原子であり、Ｌ
    ｉｎｋが、オルト−、メタ−またはパラ−フェニレンで
    ある請求項３７〜４７のいずれかに記載の方法。
  40. 【請求項４０】 Ａの一方がリン原子であり、他方が窒
    素原子であり、Ｌｉｎｋが、オルト−、メタ−またはパ
    ラ−フェニレンである請求項３７〜４７項のいずれかに
    記載の方法。
  41. 【請求項４１】 Ｌｉｎｋが、６〜２０個の炭素原子を
    有するアルキレン鎖である請求項３７〜４７項のいずれ
    かに記載の方法。
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