JPH0786096B2 - 高感度発光分析方法 - Google Patents
高感度発光分析方法Info
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- JPH0786096B2 JPH0786096B2 JP2-506367A JP50636790A JPH0786096B2 JP H0786096 B2 JPH0786096 B2 JP H0786096B2 JP 50636790 A JP50636790 A JP 50636790A JP H0786096 B2 JPH0786096 B2 JP H0786096B2
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- JP
- Japan
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- hydroxybenzoxazole
- solution
- luminol
- defined above
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、臨床検査、食品検査、環境分析、動植物検
査、製造工程管理検査などの領域で、酵素反応、抗原抗
体反応、核酸ハイブリッド反応などを利用して化学発光
測定による高感度分析を行なう方法に関する。
査、製造工程管理検査などの領域で、酵素反応、抗原抗
体反応、核酸ハイブリッド反応などを利用して化学発光
測定による高感度分析を行なう方法に関する。
背景技術
ペルオキシターゼによるルミノール、イソルミノールま
たはそれらの誘導体〔以下、化学発光性DPD（2,3−ジヒ
ドロ−1,4−フタラジンジオン）と略記〕の酸化を用い
た発光反応は、ノムノアッセイ、エラスターゼの分析、
グルコースの分析、酸化剤の分析などに利用されてい
る。
たはそれらの誘導体〔以下、化学発光性DPD（2,3−ジヒ
ドロ−1,4−フタラジンジオン）と略記〕の酸化を用い
た発光反応は、ノムノアッセイ、エラスターゼの分析、
グルコースの分析、酸化剤の分析などに利用されてい
る。
上述の発光反応の発光強度を向上させるために、次のよ
うなエンハンサーを反応系に添加すれば効果があること
が知られている。
うなエンハンサーを反応系に添加すれば効果があること
が知られている。
６−ヒドロキシベンゾチアゾール
（特開昭59-500252号公報）
ある種の置換基を有するフェノール
（特開昭59-171839号公報）
ある種の芳香族アミン
（特開昭61-54453号公報）
しかしながら、上記の各エンハンサーには次のような問
題がある。
題がある。
は多くの場合、発光量が少なく、シグナル対バックグ
ラウンド比が小さい。
ラウンド比が小さい。
の代表的なエンハンサーはｐ−ヨードフェノールであ
り、その発光シグナルは高いが、バックグラウンドも高
く、シグナル対バックグラウンド比は低い。
り、その発光シグナルは高いが、バックグラウンドも高
く、シグナル対バックグラウンド比は低い。
の代表的エンハンサーN,N,N′,N′−テトラメチルベ
ンジジンの場合は、発光ピークの立ち上がりが遅く、測
定に時間がかかる。
ンジジンの場合は、発光ピークの立ち上がりが遅く、測
定に時間がかかる。
また、エンハンサー効果の反応機構に関しては、ルミノ
ールセミキノンラジカルの効率的生成の必要性〔Thorp
e,G.H.G and Kricka,L.J.:“Bioluminescence and Chem
iluminescence:New perspectives",Scholmerich,J.,And
reesn,R.,Kapp,A.,Ernst,M.and Woods,W.G.（Eds）,Joh
n Wiley,Chichester,pp.199-208,（1987）〕およびフェ
ノキシラジカルの効率的生成の必要性〔Hodgson,M.and
Jones.P:Journal of Bioluminescence and Chemilumine
scence Vol.3,pp.21-25,（1989）〕が提唱されている。
ールセミキノンラジカルの効率的生成の必要性〔Thorp
e,G.H.G and Kricka,L.J.:“Bioluminescence and Chem
iluminescence:New perspectives",Scholmerich,J.,And
reesn,R.,Kapp,A.,Ernst,M.and Woods,W.G.（Eds）,Joh
n Wiley,Chichester,pp.199-208,（1987）〕およびフェ
ノキシラジカルの効率的生成の必要性〔Hodgson,M.and
Jones.P:Journal of Bioluminescence and Chemilumine
scence Vol.3,pp.21-25,（1989）〕が提唱されている。
しかしながら、フェノール誘導体の中にもエンハンサー
効果を示さない化合物が多数あり、上記の理論だけから
有効なエンハンサーを選別することは困難である。
効果を示さない化合物が多数あり、上記の理論だけから
有効なエンハンサーを選別することは困難である。
また、病原性微生物中の遺伝子の検出、プロスタグラン
ジンなどの生理活性物質の定量、黄体化ホルモン（LH）
などの脳下垂体前葉から放出されるホルモン、インター
ロイキンなどの血中のサイトカインなどは、いずれ体液
中の僅かな量を測定する必要があり、高感度検出系が求
められ、検出感度向上のためにさらに効率の高いエンハ
ンサーが望まれていた。
ジンなどの生理活性物質の定量、黄体化ホルモン（LH）
などの脳下垂体前葉から放出されるホルモン、インター
ロイキンなどの血中のサイトカインなどは、いずれ体液
中の僅かな量を測定する必要があり、高感度検出系が求
められ、検出感度向上のためにさらに効率の高いエンハ
ンサーが望まれていた。
本発明は、新規エンハンサーの存在下に行なうことを特
徴とする高感度発光分析を行なうことを目的とする。ま
た、本発明により従来公知のエンハンサーより高効率の
エンハンサーを用いた発光分析を可能とし、さらにエン
ハンサーとして有効な新規オキサゾール誘導体をも提供
することを目的とする。
徴とする高感度発光分析を行なうことを目的とする。ま
た、本発明により従来公知のエンハンサーより高効率の
エンハンサーを用いた発光分析を可能とし、さらにエン
ハンサーとして有効な新規オキサゾール誘導体をも提供
することを目的とする。
発明の開示
本発明は、（ａ）ペルオキシダーゼまたはペルオキシダ
ーゼ誘導体、（ｂ）酸化剤および（ｃ）ルミノール、イ
ソルミノールまたはそれらの誘導体の反応により生ずる
化学発光を利用して、物質を検出または測定する方法に
おいて、誘発光反応を２−ヒドロキシ−９−フルオレノ
ン、 および一般式 〔式中、R1は水素、CnH2n+1（ここで、ｎは１〜４の正
の整数を表わす）、XCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、Brま
たはＩを表わし、ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1CO
2（ｎは前記定義に同じ）、フェニル基、ナフチル基、C
nH2n+1C6H4（ｎは前記定義に同じ）、YC6H4（ＹはＦ、C
l、Br、Ｉまたはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、
Ｙは前記定義に同じ）を表わす〕 で示される新規なオキサゾール誘導体からなる群から選
ばれる少なくとも１つの化合物の存在下に行なうことを
特徴とする高感度発光分析方法に関するものである。
ーゼ誘導体、（ｂ）酸化剤および（ｃ）ルミノール、イ
ソルミノールまたはそれらの誘導体の反応により生ずる
化学発光を利用して、物質を検出または測定する方法に
おいて、誘発光反応を２−ヒドロキシ−９−フルオレノ
ン、 および一般式 〔式中、R1は水素、CnH2n+1（ここで、ｎは１〜４の正
の整数を表わす）、XCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、Brま
たはＩを表わし、ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1CO
2（ｎは前記定義に同じ）、フェニル基、ナフチル基、C
nH2n+1C6H4（ｎは前記定義に同じ）、YC6H4（ＹはＦ、C
l、Br、Ｉまたはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、
Ｙは前記定義に同じ）を表わす〕 で示される新規なオキサゾール誘導体からなる群から選
ばれる少なくとも１つの化合物の存在下に行なうことを
特徴とする高感度発光分析方法に関するものである。
図面の簡単な説明
第１図および第２図は本発明のエンハンサーである２−
ヒドロキシ−９−フルオレノンと公知のエンハンサーを
用いて、CA15−３の分析を行なった結果を比較したもの
であり、第１図は５秒後の発光強度のSN比を、第２図は
10秒後の発光強度のSN比を各々示す。
ヒドロキシ−９−フルオレノンと公知のエンハンサーを
用いて、CA15−３の分析を行なった結果を比較したもの
であり、第１図は５秒後の発光強度のSN比を、第２図は
10秒後の発光強度のSN比を各々示す。
第３図は本発明のエンハンサーを発光系に添加した場合
としなかった場合で、CA15−３の分析を行ない、結果を
比較したものである。
としなかった場合で、CA15−３の分析を行ない、結果を
比較したものである。
第４図は実施例19で得られた２−クロロメチル−９−ヒ
ドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクトルであり、第
５図はそのNMRスペクトルである。
ドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクトルであり、第
５図はそのNMRスペクトルである。
第６図は実施例20で得られた２−エトキシカルボニル−
６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクトルであ
り、第７図はそのNMRスペクトルである。
６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクトルであ
り、第７図はそのNMRスペクトルである。
第８図は実施例21で得られた２−（３−ブロモフェニ
ル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクト
ルであり、第９図はそのNMRスペクトルである。
ル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクト
ルであり、第９図はそのNMRスペクトルである。
第10図は実施例22で得られた２−（２−メチルフェニ
ル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクト
ルであり、第11図はそのNMRスペクトルである。
ル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクト
ルであり、第11図はそのNMRスペクトルである。
第12図は実施例35で得られた２−（３−クロロフェニ
ル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクト
ルであり、第13図はそのNMRスペクトルである。
ル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクト
ルであり、第13図はそのNMRスペクトルである。
第14図は実施例36で得られた２−（４−クロロフェニ
ル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクト
ルであり、第15図はそのNMRスペクトルである。
ル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクト
ルであり、第15図はそのNMRスペクトルである。
第16図は実施例37で得られた２−（２−ナフチル）−６
−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクトルであ
り、第17図はそのNMRスペクトルである。
−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペクトルであ
り、第17図はそのNMRスペクトルである。
第18図は実施例38で得られた２−（2,4−ジクロロフェ
ニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペク
トルであり、第19図はそのNMRスペクトルである。
ニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールのIRスペク
トルであり、第19図はそのNMRスペクトルである。
第20図は実施例51および比較例22で得られたSN値を示し
たものである。
たものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のエンハンサーである２−ヒドロキシ−９−フル
オレノン、 ［４−ヒドロキシ−３−〔３−（４−ヒドロキシフェニ
ル）−１−オキソ−２−プロペニル〕−2H−１−ベンゾ
ピラン−２−オン（以下、HHBPと略す）］ または、［Ｉ］式に示すオキサゾール誘導体による化学
発光増強効果は、ペルオキシダーゼ／酸化剤／化学発光
性DPD系で得られる発光シグナル対バックグラウンド比
が、本発明のエンハンサーをその系に添加することによ
り著しく向上することで確認できる。ここで用いたバッ
クグラウンドなる用語は、ペルオキシダーゼまたはその
誘導体が存在しない場合の発光強度をいう。
オレノン、 ［４−ヒドロキシ−３−〔３−（４−ヒドロキシフェニ
ル）−１−オキソ−２−プロペニル〕−2H−１−ベンゾ
ピラン−２−オン（以下、HHBPと略す）］ または、［Ｉ］式に示すオキサゾール誘導体による化学
発光増強効果は、ペルオキシダーゼ／酸化剤／化学発光
性DPD系で得られる発光シグナル対バックグラウンド比
が、本発明のエンハンサーをその系に添加することによ
り著しく向上することで確認できる。ここで用いたバッ
クグラウンドなる用語は、ペルオキシダーゼまたはその
誘導体が存在しない場合の発光強度をいう。
本発明で用いるペルオキシターゼは特に限定されるもの
ではないが、好ましくは西洋わさびペルオキシターエな
どの植物ペルオキシターゼである。ペルオキシターゼ誘
導体としては、例えばペルオキイターゼ抗体コンジゲー
ト、ペルオキシターゼ抗原コンジュゲート、ペルオキシ
ターゼストレプトアビジンコンジュゲートおよびビオチ
ン結合ペルオキシターゼを挙げることができる。ここで
用いる抗体は特に制限はないが、例えばインタクトIg
G、IgMのほかにもFab′、F(ab)2などの部分構造も好ま
しく使用できる。また、抗原としては特に制限はなく、
例えばフルオレッセン、ステロイドホルモンのような低
分子量ハプテンもポリペプチド、タンパク質、多糖類の
ような高分子量物質も使用できる。
ではないが、好ましくは西洋わさびペルオキシターエな
どの植物ペルオキシターゼである。ペルオキシターゼ誘
導体としては、例えばペルオキイターゼ抗体コンジゲー
ト、ペルオキシターゼ抗原コンジュゲート、ペルオキシ
ターゼストレプトアビジンコンジュゲートおよびビオチ
ン結合ペルオキシターゼを挙げることができる。ここで
用いる抗体は特に制限はないが、例えばインタクトIg
G、IgMのほかにもFab′、F(ab)2などの部分構造も好ま
しく使用できる。また、抗原としては特に制限はなく、
例えばフルオレッセン、ステロイドホルモンのような低
分子量ハプテンもポリペプチド、タンパク質、多糖類の
ような高分子量物質も使用できる。
核酸ハイブリッド反応の場合には、塩基数10以上のDNA
およびRNAで直鎖でも環状でもよい。
およびRNAで直鎖でも環状でもよい。
酸化剤としては、好ましくは過酸化水素が用いられる
が、過ホウ酸塩、次亜塩素酸塩も使用できる。
が、過ホウ酸塩、次亜塩素酸塩も使用できる。
本発明の実施に使用される化学発光性DPDは、ルミノー
ル、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−
エチルイソルミノールないし、これらと結合した抗原、
抗体、核酸などであるが、特にルミノールが好ましい。
ル、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−
エチルイソルミノールないし、これらと結合した抗原、
抗体、核酸などであるが、特にルミノールが好ましい。
本発明でエンハンサーとして用いるHHBPは、例えば特開
昭50-46666号に記載のとおり、３−アセチル−４−ヒド
ロキシクマリンとパラヒドロキシベンゾアルデヒドを、
アミンの存在下に縮合させることにより製造することが
できる。
昭50-46666号に記載のとおり、３−アセチル−４−ヒド
ロキシクマリンとパラヒドロキシベンゾアルデヒドを、
アミンの存在下に縮合させることにより製造することが
できる。
一般式
〔式中、R1は水素、CnH2n+1（ここで、ｎは１〜４の正
の整数を表わす）、XCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、Brま
たはＩを表わし、ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1CO
2（ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1C6H4（ｎは前記定義
に同じ）、フェニル基、ナフチル基、YC6H4（ＹはＦ、C
l、Br、Ｉまたはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、
Ｙは前記定義に同じ）を表わす〕 で示されるオキサゾール誘導体の存在下に行なうことを
特徴とする高感度発光分析方法に関するものであり、本
発明化合物［Ｉ］のR1は、具体的には、水素、炭素数１
〜４のアルキル基として、メチル基、エチル基、プロピ
ル基（ｎ−、iso−）、ブチル基（ｎ−、iso−、sec
−、tert−）、フェニル基などが挙げられる。
の整数を表わす）、XCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、Brま
たはＩを表わし、ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1CO
2（ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1C6H4（ｎは前記定義
に同じ）、フェニル基、ナフチル基、YC6H4（ＹはＦ、C
l、Br、Ｉまたはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、
Ｙは前記定義に同じ）を表わす〕 で示されるオキサゾール誘導体の存在下に行なうことを
特徴とする高感度発光分析方法に関するものであり、本
発明化合物［Ｉ］のR1は、具体的には、水素、炭素数１
〜４のアルキル基として、メチル基、エチル基、プロピ
ル基（ｎ−、iso−）、ブチル基（ｎ−、iso−、sec
−、tert−）、フェニル基などが挙げられる。
ハロゲン化アルキル基としては、フルオロメチル基、ク
ロロメチル基、ブロモメチル基、ヨードメチル基、１−
フルオロエチル基、２−フルオロエチル基、１−クロロ
エチル基、２−クロロエチル基、１−ブロモエチル基、
２−ブロモエチル基、１−ヨードエチル基、２−ヨード
エチル基、１−フルオロプロピル基、２−フルオロプロ
ピル基、３−フルオロプロピル基、１−フルオロ−１−
メチルエチル基、２−フルオロ−１−メチルエチル基、
１−クロロプロピル基、２−クロロプロピル基、３−ク
ロロプロピル基、１−クロロ−１−メチルエチル基、２
−クロロ−１−メチルエチル基、１−ブロモプロピル
基、２−ブロモプロピル基、３−ブロモプロピル基、１
−ブロモ−１−メチルエチル基、２−ブロモ−１−メチ
ルエチル基、１−ヨードプロピル基、２−ヨードプロピ
ル基、３−ヨードプロピル基、１−ヨード−１−メチル
エチル基、２−ヨード−１−メチルエチル基、１−フル
オロブチル基、２−フルオロブチル基、３−フルオロブ
チル基、４−フルオロブチル基、１−フルオロ−１−メ
チルプロピル基、２−フルオロ−１−メチルプロピル
基、３−フルオロ−１−メチルプロピル基、１−フルオ
ロメチルプロピル基、１−フルオロ−２−メチルプロピ
ル基、２−フルオロ−２−メチルプロピル基、３−フル
オロ−２−メチルプロピル基、１−フルオロメチル−1,
1−ジメチルメチル基、１−クロロブチル基、２−クロ
ロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル
基、１−クロロ−１−メチルプロピル基、２−クロロ−
１−メチルプロピル基、３−クロロ−１−メチルプロピ
ル基、１−クロロメチルプロピル基、１−クロロ−２−
メチルプロピル基、２−クロロ−２−メチルプロピル
基、３−クロロ−２−メチルプロピル基、１−クロロメ
チル−1,1−ジメチルメチル基、１−ブロモブチル基、
２−ブロモブチル基、３−ブロモブチル基、４−ブロモ
ブチル基、１−ブロモ−１−メチルプロピル基、２−ブ
ロモ−１−メチルプロピル基、３−ブロモ−１−メチル
プロピル基、１−ブロモメチルプロピル基、１−ブロモ
−２−メチルプロピル基、２−ブロモ−２−メチルプロ
ピル基、３−ブロモ−２−メチルプロピル基、１−ブロ
モメチル−1,1−ジメチルメチル基、１−ヨードブチル
基、２−ヨードブチル基、３−ヨードブチル基、４−ヨ
ードブチル基、１−ヨード−１−メチルプロピル基、２
−ヨード−１−メチルプロピル基、３−ヨード−１−メ
チルプロピル基、１−ヨードメチルプロピル基、１−ヨ
ード−２−メチルプロピル基、２−ヨード−２−メチル
プロピル基、３−ヨード−２−メチルプロピル基、１−
ヨードメチル−1,1−ジメチルメチル基などが挙げられ
る。
ロロメチル基、ブロモメチル基、ヨードメチル基、１−
フルオロエチル基、２−フルオロエチル基、１−クロロ
エチル基、２−クロロエチル基、１−ブロモエチル基、
２−ブロモエチル基、１−ヨードエチル基、２−ヨード
エチル基、１−フルオロプロピル基、２−フルオロプロ
ピル基、３−フルオロプロピル基、１−フルオロ−１−
メチルエチル基、２−フルオロ−１−メチルエチル基、
１−クロロプロピル基、２−クロロプロピル基、３−ク
ロロプロピル基、１−クロロ−１−メチルエチル基、２
−クロロ−１−メチルエチル基、１−ブロモプロピル
基、２−ブロモプロピル基、３−ブロモプロピル基、１
−ブロモ−１−メチルエチル基、２−ブロモ−１−メチ
ルエチル基、１−ヨードプロピル基、２−ヨードプロピ
ル基、３−ヨードプロピル基、１−ヨード−１−メチル
エチル基、２−ヨード−１−メチルエチル基、１−フル
オロブチル基、２−フルオロブチル基、３−フルオロブ
チル基、４−フルオロブチル基、１−フルオロ−１−メ
チルプロピル基、２−フルオロ−１−メチルプロピル
基、３−フルオロ−１−メチルプロピル基、１−フルオ
ロメチルプロピル基、１−フルオロ−２−メチルプロピ
ル基、２−フルオロ−２−メチルプロピル基、３−フル
オロ−２−メチルプロピル基、１−フルオロメチル−1,
1−ジメチルメチル基、１−クロロブチル基、２−クロ
ロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル
基、１−クロロ−１−メチルプロピル基、２−クロロ−
１−メチルプロピル基、３−クロロ−１−メチルプロピ
ル基、１−クロロメチルプロピル基、１−クロロ−２−
メチルプロピル基、２−クロロ−２−メチルプロピル
基、３−クロロ−２−メチルプロピル基、１−クロロメ
チル−1,1−ジメチルメチル基、１−ブロモブチル基、
２−ブロモブチル基、３−ブロモブチル基、４−ブロモ
ブチル基、１−ブロモ−１−メチルプロピル基、２−ブ
ロモ−１−メチルプロピル基、３−ブロモ−１−メチル
プロピル基、１−ブロモメチルプロピル基、１−ブロモ
−２−メチルプロピル基、２−ブロモ−２−メチルプロ
ピル基、３−ブロモ−２−メチルプロピル基、１−ブロ
モメチル−1,1−ジメチルメチル基、１−ヨードブチル
基、２−ヨードブチル基、３−ヨードブチル基、４−ヨ
ードブチル基、１−ヨード−１−メチルプロピル基、２
−ヨード−１−メチルプロピル基、３−ヨード−１−メ
チルプロピル基、１−ヨードメチルプロピル基、１−ヨ
ード−２−メチルプロピル基、２−ヨード−２−メチル
プロピル基、３−ヨード−２−メチルプロピル基、１−
ヨードメチル−1,1−ジメチルメチル基などが挙げられ
る。
アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル
基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、
１−メチルエトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル
基、１−メチルプロポキシカルボニル基、２−メチルプ
ロポキシカルボニル基、1,1−ジメチルエトキシカルボ
ニル基などを挙げることができる。
基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、
１−メチルエトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル
基、１−メチルプロポキシカルボニル基、２−メチルプ
ロポキシカルボニル基、1,1−ジメチルエトキシカルボ
ニル基などを挙げることができる。
アルキル置換フェニル基としては、２−メチルフェニル
基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、２
−エチルフェニル基、３−エチルフェニル基、４−エチ
ルフェニル基、２−プロピルフェニル基、３−プロピル
フェニル基、４−プロピルフェニル基、２−（１−メチ
ルエチル）基、３−（１−メチルエチル）基、４−（１
−メチルエチル）基、２−ブチルフェニル基、３−ブチ
ルフェニル基、４−ブチルフェニル基、２−（１−メチ
ルプロピル）フェニル基、３−（１−メチルプロピル）
フェニル基、４−（１−メチルプロピル）フェニル基、
２−（２−メチルプロピル）フェニル基、３−（２−メ
チルプロピル）フェニル基、４−（２−メチルプロピ
ル）フェニル基、２−（1,1−ジメチルエチル）フェニ
ル基、３−（1,1−ジメチルエチル）フェニル基、４−
（1,1−ジメチルエチル）フェニル基などを挙げること
ができる。
基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、２
−エチルフェニル基、３−エチルフェニル基、４−エチ
ルフェニル基、２−プロピルフェニル基、３−プロピル
フェニル基、４−プロピルフェニル基、２−（１−メチ
ルエチル）基、３−（１−メチルエチル）基、４−（１
−メチルエチル）基、２−ブチルフェニル基、３−ブチ
ルフェニル基、４−ブチルフェニル基、２−（１−メチ
ルプロピル）フェニル基、３−（１−メチルプロピル）
フェニル基、４−（１−メチルプロピル）フェニル基、
２−（２−メチルプロピル）フェニル基、３−（２−メ
チルプロピル）フェニル基、４−（２−メチルプロピ
ル）フェニル基、２−（1,1−ジメチルエチル）フェニ
ル基、３−（1,1−ジメチルエチル）フェニル基、４−
（1,1−ジメチルエチル）フェニル基などを挙げること
ができる。
ハロゲン置換フェニル基としては、２−フルオロフェニ
ル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル
基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４
−クロロフェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロ
モフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−ヨードフェ
ニル基、３−ヨードフェニル基、４−ヨードフェニル基
などが挙げることができる。
ル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル
基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４
−クロロフェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロ
モフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−ヨードフェ
ニル基、３−ヨードフェニル基、４−ヨードフェニル基
などが挙げることができる。
二置換フェニル基としては、2,4−ジクロロフェニル
基、3,5−ジクロロフェニル基などを挙げることができ
る。
基、3,5−ジクロロフェニル基などを挙げることができ
る。
この中でも好ましい置換基は、水素、メチル基、フェニ
ル基、クロロメチル基、エトキシカルボニル基、２−メ
チルフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−クロロフ
ェニル基、2,4−ジクロロフェニル基である。
ル基、クロロメチル基、エトキシカルボニル基、２−メ
チルフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−クロロフ
ェニル基、2,4−ジクロロフェニル基である。
なお、上記一般式［Ｉ］の化合物のうち、
一般式
〔式中、R2はXCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、BrまたはＩ
を表わし、ｎ＝１〜４の正の整数を表わす）CnH2n+1CO2
（ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1C6H4（ｎは前記定義
に同じ）、ナフチル基、YC6H4（ＹはＦ、Cl、Br、Ｉま
たはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、Ｙは前記定義
に同じ）を表わす〕 で示させるオキサゾール誘導体は新規物質である。
を表わし、ｎ＝１〜４の正の整数を表わす）CnH2n+1CO2
（ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1C6H4（ｎは前記定義
に同じ）、ナフチル基、YC6H4（ＹはＦ、Cl、Br、Ｉま
たはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、Ｙは前記定義
に同じ）を表わす〕 で示させるオキサゾール誘導体は新規物質である。
本発明の化合物［Ｉ］は、下記の反応式（１）により合
成できる。
成できる。
すなわち、
〔式中、R1は水素、CnH2n+1（ここで、ｎは１〜４の正
の整数を表わす）、XCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、Brま
たはＩを表わし、ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1CO
2（ｎは前記定義に同じ）、フェニル基、ナフチル基、C
nH2n+1C6H4（ｎは前記定義に同じ）、YC6H4（ＹはＦ、C
l、Br、Ｉまたはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、
Ｙは前記定義に同じ）を表わし、R3はCnH2n+1（ｎは前
記定義に同じ）を表わし、ＺはＦ、Cl、BrまたはＩを表
わす〕である。
の整数を表わす）、XCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、Brま
たはＩを表わし、ｎは前記定義に同じ）、CnH2n+1CO
2（ｎは前記定義に同じ）、フェニル基、ナフチル基、C
nH2n+1C6H4（ｎは前記定義に同じ）、YC6H4（ＹはＦ、C
l、Br、Ｉまたはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、
Ｙは前記定義に同じ）を表わし、R3はCnH2n+1（ｎは前
記定義に同じ）を表わし、ＺはＦ、Cl、BrまたはＩを表
わす〕である。
ここで化合物［III］で用いられるR1は、具体的には化
合物［Ｉ］で用いられるR1と同じものである。
合物［Ｉ］で用いられるR1と同じものである。
また、R3のアルキル基としては、メチル基、エチル基、
プロピル基、１−メチルエチル基、ブチル基、１−メチ
ルプロピル基、２−メチルプロピル基、1,1−ジメチル
エチル基などを挙げることができる。
プロピル基、１−メチルエチル基、ブチル基、１−メチ
ルプロピル基、２−メチルプロピル基、1,1−ジメチル
エチル基などを挙げることができる。
本発明で使用する塩基は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水
素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの炭酸
塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ｔ−ブチル
アミンなどのアミン類、ピリジン、キノリンなどの芳香
族複素環化合物などであるが、特に炭酸水素ナトリウム
が好ましい。
素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの炭酸
塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ｔ−ブチル
アミンなどのアミン類、ピリジン、キノリンなどの芳香
族複素環化合物などであるが、特に炭酸水素ナトリウム
が好ましい。
反応は溶媒を必要とせず、20〜150℃で進行するが、目
的物の収率を上げるためには50〜120℃が好ましい。
的物の収率を上げるためには50〜120℃が好ましい。
また、オキサゾール化合物［Ｉ］のうち、R1がXCnH
2n（ＸはＦ、Cl、BrまたはＩを表わし、ｎは１〜４の正
の整数を表わす）の場合は、下記の反応式（２）によっ
ても、またR1がYC6H4（ＹはＦ、Cl、Br、Ｉまたはフェ
ニル基を表わす）の場合は、下記の反応式（３）によっ
ても製造できる。
2n（ＸはＦ、Cl、BrまたはＩを表わし、ｎは１〜４の正
の整数を表わす）の場合は、下記の反応式（２）によっ
ても、またR1がYC6H4（ＹはＦ、Cl、Br、Ｉまたはフェ
ニル基を表わす）の場合は、下記の反応式（３）によっ
ても製造できる。
〔式中、R3はCnH2n+1（ｎは１〜４の正の整数を表わ
す）を表わし、ＸおよびＺはＦ、Cl、BrまたはＩを表わ
す〕 この化合物［IV］で用いられるハロゲン化アルキル基
は、具体的には化合物［Ｉ］で用いられるハロゲン化ア
ルキル基と同じものが用いられる。また、化合物［IV］
で用いられるR3は、具体的には化合物［III］で用いら
れるR3と同じものが用いられる。
す）を表わし、ＸおよびＺはＦ、Cl、BrまたはＩを表わ
す〕 この化合物［IV］で用いられるハロゲン化アルキル基
は、具体的には化合物［Ｉ］で用いられるハロゲン化ア
ルキル基と同じものが用いられる。また、化合物［IV］
で用いられるR3は、具体的には化合物［III］で用いら
れるR3と同じものが用いられる。
本発明で使用する反応溶媒は、メタノール、エタノー
ル、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類、エ
チルエーテル、THFなどのエーテル類、DMF、DMSOなどの
非プロトン性極性溶媒などであるが、特にエタノールが
好ましい。
ル、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類、エ
チルエーテル、THFなどのエーテル類、DMF、DMSOなどの
非プロトン性極性溶媒などであるが、特にエタノールが
好ましい。
反応は、20〜150℃で進行するが、目的物の収率を上げ
るためには60〜90℃が好ましい。
るためには60〜90℃が好ましい。
〔式中、ＹはＦ、Cl、Br、Ｉまたはフェニル基を表わ
し、ＺはＦ、Cl、BrまたはＩを表わす〕 化合物［Ｖ］で用いられる置換フェニル基は、具体的に
は化合物［Ｉ］で用いられるハロゲン化フェニル基、フ
ェニルフェニル基が用いられる。
し、ＺはＦ、Cl、BrまたはＩを表わす〕 化合物［Ｖ］で用いられる置換フェニル基は、具体的に
は化合物［Ｉ］で用いられるハロゲン化フェニル基、フ
ェニルフェニル基が用いられる。
第１段の反応は、溶媒を必要とせず100〜280℃で進行す
るが、化合物［VI］の収率を上げるためには150〜250℃
が好ましい。
るが、化合物［VI］の収率を上げるためには150〜250℃
が好ましい。
化合物［VI］の加水分解反応に使用する塩基は、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムなどであ
るが、水酸化ナトリウムが特に好ましい。溶媒として
は、水、メタノール、エタノールなどのアルコール類、
THFなどのエーテル類が使用できるが、水／メタノール
の混合溶媒が特に好ましい。
ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムなどであ
るが、水酸化ナトリウムが特に好ましい。溶媒として
は、水、メタノール、エタノールなどのアルコール類、
THFなどのエーテル類が使用できるが、水／メタノール
の混合溶媒が特に好ましい。
加水分解反応は20〜50℃で進行するが、目的物の収率を
上げるためには25〜35℃が好ましい。
上げるためには25〜35℃が好ましい。
本発明のエンハンサーは、ペルオキシターゼ、化学発光
性DPD、酸化剤からなる発光反応系を利用した物質の測
定法に用いることができるが、特にエンザイムイムノア
ッセイ、DNAハイブリッド反応による測定に好ましく用
いられる。
性DPD、酸化剤からなる発光反応系を利用した物質の測
定法に用いることができるが、特にエンザイムイムノア
ッセイ、DNAハイブリッド反応による測定に好ましく用
いられる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例中の試薬および装置は次に示すものを用いた。
試薬
４−アミノレゾルシノール塩酸およびクロロアセトニト
リルはアルドリッチ社（Aldrich Co.）から、エタノー
ル、DMSO、シュウ酸ジエチル、３−ブロムベンゾイルク
ロライド、２−メチルベンゾイルクロライド、４−クロ
ロベンゾイルクロライド、2,4−ジクロロベンゾイルク
ロライド、ルミノール（５−アミノ−2,3−ジヒドロ−
1,4−フタラジンジオン）、およびイソルミノール（６
−アミノ−2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン）は
東京化成（株）から、五塩化リンおよび炭酸水素ナトリ
ウムは関東化学（株）から、塩化水素ボンベは鶴見曹達
（株）から、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイ
ソルミノール（ABEI）およびトリス〔ヒドロキシメチ
ル〕アミノメタンはシグマ社（Sigma Chemical Co.）か
ら、西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）はベーリンガ
ーマンハイム社（Boehringer Mannheim Gmbh）から、粉
末PBSは日水製薬（株）から、ウシ血清アルブミン（BS
A）は生化学工業（株）から、２−ヒドロキシ−９−フ
ルオレノンはアルドリッチケミカル社（Aldrich Chemic
al Co.）から、それぞれ購入した。
リルはアルドリッチ社（Aldrich Co.）から、エタノー
ル、DMSO、シュウ酸ジエチル、３−ブロムベンゾイルク
ロライド、２−メチルベンゾイルクロライド、４−クロ
ロベンゾイルクロライド、2,4−ジクロロベンゾイルク
ロライド、ルミノール（５−アミノ−2,3−ジヒドロ−
1,4−フタラジンジオン）、およびイソルミノール（６
−アミノ−2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン）は
東京化成（株）から、五塩化リンおよび炭酸水素ナトリ
ウムは関東化学（株）から、塩化水素ボンベは鶴見曹達
（株）から、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイ
ソルミノール（ABEI）およびトリス〔ヒドロキシメチ
ル〕アミノメタンはシグマ社（Sigma Chemical Co.）か
ら、西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）はベーリンガ
ーマンハイム社（Boehringer Mannheim Gmbh）から、粉
末PBSは日水製薬（株）から、ウシ血清アルブミン（BS
A）は生化学工業（株）から、２−ヒドロキシ−９−フ
ルオレノンはアルドリッチケミカル社（Aldrich Chemic
al Co.）から、それぞれ購入した。
HHBPは特開昭50-46666号公報に記載された方法により調
整した。
整した。
乳癌関連抗原（CA15−３）、抗CA15−３抗体（マウスモ
ノクローナル抗体）はセントコア社（Malvern,USA）か
ら入手した。西洋わさびペルオキシターゼ標識抗CA15−
３抗体はマレイミドヒンジ法〔Yoshitake,S.et al:J.Bi
ochem.,92,1413-1424（1982）〕により作成し、ヒドロ
キシアパタイトカラム（三井東圧、HCA−カラム、φ7.6
mm×L100mm）を用いたファルマシア社FPLCで分離精製し
た。
ノクローナル抗体）はセントコア社（Malvern,USA）か
ら入手した。西洋わさびペルオキシターゼ標識抗CA15−
３抗体はマレイミドヒンジ法〔Yoshitake,S.et al:J.Bi
ochem.,92,1413-1424（1982）〕により作成し、ヒドロ
キシアパタイトカラム（三井東圧、HCA−カラム、φ7.6
mm×L100mm）を用いたファルマシア社FPLCで分離精製し
た。
抗CA15−３抗体固定化ポリスチレンビーズは、直径6mm
のポリスチレンビーズ（明和フッ素商会、面粗度＃80）
を10μg/mlの抗CA15−３抗体、PBS溶液中に一晩浸して
作成した。
のポリスチレンビーズ（明和フッ素商会、面粗度＃80）
を10μg/mlの抗CA15−３抗体、PBS溶液中に一晩浸して
作成した。
分析装置
化学発光反応は、12mmφ×47mmの3ml容の使い捨てプラ
スチックチューブで行なった。発生した光は、Berthold
社製、ルミノメーター（Biolumat LB9500T）で検出し
た。
スチックチューブで行なった。発生した光は、Berthold
社製、ルミノメーター（Biolumat LB9500T）で検出し
た。
赤外吸収スベクトル（以下、IRと略記）は、日本分光工
業（株）製、FI/IR-5000で測定した。
業（株）製、FI/IR-5000で測定した。
核磁気共鳴スペクトル（以下、NMRと略記）は、日本電
子（株）製、EX90FTNMRで測定した。
子（株）製、EX90FTNMRで測定した。
質量スペクトル（以下、MSと略記）は、直接導入法によ
り行ない、日本電子（株）製、JMS D300質量分析計で測
定した。また、高分解能MSは、JMS DX-303質量分析計を
用いて測定した。
り行ない、日本電子（株）製、JMS D300質量分析計で測
定した。また、高分解能MSは、JMS DX-303質量分析計を
用いて測定した。
実施例１
ルミノールと２−ヒドロキシ−９−フルオレノンとを使
用するペルオキシダーゼの発光アッセイ 200μｌのルミノール（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と200μｌの２−ヒドロキシ
−９−フルオレノン（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と10μｌのHRP〔1111unit/m
gを1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.4）で10万倍に
希釈〕と10μｌの過酸化水素（9.1M水溶液を1000倍に希
釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボルテ
ックスミキサーで撹拌した後、10秒後の発光強度を測定
した。次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.4）10μｌ
とルミノール、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、過
酸化水素を上記の量混合撹拌し、10秒後の発光強度を測
定した。前者と後者の比をシグナル／バックグラウンド
比（SN比）として表１に示す。
用するペルオキシダーゼの発光アッセイ 200μｌのルミノール（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と200μｌの２−ヒドロキシ
−９−フルオレノン（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と10μｌのHRP〔1111unit/m
gを1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.4）で10万倍に
希釈〕と10μｌの過酸化水素（9.1M水溶液を1000倍に希
釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボルテ
ックスミキサーで撹拌した後、10秒後の発光強度を測定
した。次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.4）10μｌ
とルミノール、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、過
酸化水素を上記の量混合撹拌し、10秒後の発光強度を測
定した。前者と後者の比をシグナル／バックグラウンド
比（SN比）として表１に示す。
実施例２
実施例１の手順を反復し、ルミノールの代わりにイソル
ミノールを使用した。結果は表１に示す。
ミノールを使用した。結果は表１に示す。
実施例３
実施例１の手順を反復し、ルミノールの代わりにＮ−
（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールを使
用した。結果は表１に示す。
（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールを使
用した。結果は表１に示す。
比較例１〜３
実施例１、実施例２、実施例３の手順に従い、２−ヒド
ロキシ−９−フルオレノンを使用しなかった以外は全く
同様に操作した。結果は表１に示す。
ロキシ−９−フルオレノンを使用しなかった以外は全く
同様に操作した。結果は表１に示す。
実施例４
２−ヒドロキシ−９−フルオレノンおよび各種エンハン
サーを用いたCA15−３抗原の発光アッセイ CA15−３抗原溶液（615U/ml）をウシ血清アルブミンを
含むリン酸塩緩衝液（PBS）で希釈し、300U/ml、200U/m
l、100U/ml、50U/ml、25U/ml、0U/ml（ウシ血清アルブ
ミンを含むPBS）の濃度の溶液に調製し、各々を標準CA1
5−３溶液とした。
サーを用いたCA15−３抗原の発光アッセイ CA15−３抗原溶液（615U/ml）をウシ血清アルブミンを
含むリン酸塩緩衝液（PBS）で希釈し、300U/ml、200U/m
l、100U/ml、50U/ml、25U/ml、0U/ml（ウシ血清アルブ
ミンを含むPBS）の濃度の溶液に調製し、各々を標準CA1
5−３溶液とした。
各濃度の標準CA15−３溶液を20μｌずつ２サンプルをト
レイ（25穴）に分注した。ペルオキシダーゼ標識抗CA15
−３抗体（マウス）を300μｌずつウェルに加えた。各
ウェルに抗体不溶化ビーズを紙で付着液を吸い取った
後、ピンセットで１個ずつ加えた。
レイ（25穴）に分注した。ペルオキシダーゼ標識抗CA15
−３抗体（マウス）を300μｌずつウェルに加えた。各
ウェルに抗体不溶化ビーズを紙で付着液を吸い取った
後、ピンセットで１個ずつ加えた。
トレイカバーシールを、軽くたたいて混合した後、25℃
で２時間反応させた。反応終了後、ビーズウッシャーを
用い、生理食塩水5mlで３回洗浄した。洗浄後、トレイ
中のビーズを試験管に移し、さらにルミノメーター測定
用プラスチックキュベットに移動させた。
で２時間反応させた。反応終了後、ビーズウッシャーを
用い、生理食塩水5mlで３回洗浄した。洗浄後、トレイ
中のビーズを試験管に移し、さらにルミノメーター測定
用プラスチックキュベットに移動させた。
200μｌのルミノール（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と200μｌの２−ヒドロキシ
−９−フルオレノン（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と10μｌの過酸化水素（9.1
M水溶液を1000倍希釈）とを各々のプラスチックキュベ
ットに加え、５秒後および10秒後の発光強度を測定し
た。結果を表２−１、表２−２に示した。
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と200μｌの２−ヒドロキシ
−９−フルオレノン（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と10μｌの過酸化水素（9.1
M水溶液を1000倍希釈）とを各々のプラスチックキュベ
ットに加え、５秒後および10秒後の発光強度を測定し
た。結果を表２−１、表２−２に示した。
標準CA15−３抗原溶液（300U/ml、200U/ml、100U/ml、5
0U/ml、25U/ml）の５秒後および10秒後の発光強度と0U/
mlの５秒後および10秒後の発光強度の比（SN比）をそれ
ぞれ求め、第１図、第２図に示した。
0U/ml、25U/ml）の５秒後および10秒後の発光強度と0U/
mlの５秒後および10秒後の発光強度の比（SN比）をそれ
ぞれ求め、第１図、第２図に示した。
比較例４〜８
実施例４の手順を反復し、２−ヒドロキシ−９−フルオ
レノンの代わりに、Ｐ−ヨードフェノール、Ｐ−ヒドロ
キシケイ皮酸、Ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキ
シベンゾチアゾール、N,N,N′,N′−テトラメチルベン
ジジンを使用した。発光強度を表２−１および表２−２
に、SN比を第１図および第２図にそれぞれ示す。
レノンの代わりに、Ｐ−ヨードフェノール、Ｐ−ヒドロ
キシケイ皮酸、Ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキ
シベンゾチアゾール、N,N,N′,N′−テトラメチルベン
ジジンを使用した。発光強度を表２−１および表２−２
に、SN比を第１図および第２図にそれぞれ示す。
実施例５
ルミノールとHHBPとを使用するペルオキシダーゼの発光
アッセイ 200μｌのルミノール（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH8.5）と200μｌのHHBP（100mM DM
SO溶液10μl/10mlの0.1M−トリス塩酸緩衝液pH8.5）と1
0μｌの西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）〔1111unit
/mgを1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で10万倍
に希釈〕と10μｌの過酸化水素（9.1M水溶液を1000倍に
希釈）とをプラスチックチューブに入れ、３秒間ボルテ
ックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測定
した。
アッセイ 200μｌのルミノール（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH8.5）と200μｌのHHBP（100mM DM
SO溶液10μl/10mlの0.1M−トリス塩酸緩衝液pH8.5）と1
0μｌの西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）〔1111unit
/mgを1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で10万倍
に希釈〕と10μｌの過酸化水素（9.1M水溶液を1000倍に
希釈）とをプラスチックチューブに入れ、３秒間ボルテ
ックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測定
した。
次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.0）10μｌとルミ
ノール、HHBP過酸化水素を上記の量混合攪拌し、１分後
の発光強度を測定した。前者と後者の比をシグナル／バ
ックグラウンド比（SN比）として表３に示した。
ノール、HHBP過酸化水素を上記の量混合攪拌し、１分後
の発光強度を測定した。前者と後者の比をシグナル／バ
ックグラウンド比（SN比）として表３に示した。
実施例６、７
実施例６、７として、実施例５のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例６）、またはABEI（実施例７）
を用いる以外は実施例５と同様にして発光強度を測定
し、表３に示した。
イソルミノール（実施例６）、またはABEI（実施例７）
を用いる以外は実施例５と同様にして発光強度を測定
し、表３に示した。
比較例９〜11
実施例５〜７のHHBPを使用しなった以外は全く同様にし
て発光強度を測定し、表３に示した。
て発光強度を測定し、表３に示した。
実施例５〜７および比較例９〜11から、本発明が優れた
発光分析方法であることが明らかとなった。
発光分析方法であることが明らかとなった。
実施例８
６−ヒドロキシベンゾオキサゾールの合成
４−アミノレゾルシノール塩酸塩2.0g（12.4mmol）、オ
ルトギ酸メチル8.5ml（51.4mmol）、炭酸水素ナトリウ
ム1.07g（12.8mmol）を冷却用コンデンサーを付けた二
ッ口フラスコに入れ、アルゴン雰囲気下100℃で一昼夜
攪拌した。反応終了後、反応液で冷却してヘキサンを加
え生成物を過した。結晶を水洗して無機塩を除き、再
度過した。
ルトギ酸メチル8.5ml（51.4mmol）、炭酸水素ナトリウ
ム1.07g（12.8mmol）を冷却用コンデンサーを付けた二
ッ口フラスコに入れ、アルゴン雰囲気下100℃で一昼夜
攪拌した。反応終了後、反応液で冷却してヘキサンを加
え生成物を過した。結晶を水洗して無機塩を除き、再
度過した。
得られた結晶をアセトンに溶解し、活性炭を加え、1.5
時間加熱還流した。活性炭を除き、アセトンをエバポレ
ーターにて濃縮し、得られた結晶でアセトン−水で再結
晶した。白色粉末0.28g（2.07mmol）を得、反応率は16.
7％であった。
時間加熱還流した。活性炭を除き、アセトンをエバポレ
ーターにて濃縮し、得られた結晶でアセトン−水で再結
晶した。白色粉末0.28g（2.07mmol）を得、反応率は16.
7％であった。
m.p.:183.5〜185.2℃
IR（KBr、cm-1）：
3150、1630、1528、1489、1276、1236、1195、1104、10
85、816 NMR（δ、DMS0-d6）： 6.81（dd,1H）、7.03（d,1H）、7.53（d,1H）、8.46
（s,1H）、9.75（s,1H） MS（EI）:135（M+）、52、31 高分解能MS（EI）：C7H5O2N 計算値 135.0344 実測値 135.0332 ルミノールと６−ヒドロキシベンゾオキサゾールと使用
するペルオキシターゼの発光アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と200μｌの６−
ヒドロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10
μl/10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌ
の西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/
mgを1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍
に希釈〕と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000
倍に希釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間
ボルテックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度
を測定した。
85、816 NMR（δ、DMS0-d6）： 6.81（dd,1H）、7.03（d,1H）、7.53（d,1H）、8.46
（s,1H）、9.75（s,1H） MS（EI）:135（M+）、52、31 高分解能MS（EI）：C7H5O2N 計算値 135.0344 実測値 135.0332 ルミノールと６−ヒドロキシベンゾオキサゾールと使用
するペルオキシターゼの発光アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と200μｌの６−
ヒドロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10
μl/10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌ
の西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/
mgを1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍
に希釈〕と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000
倍に希釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間
ボルテックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度
を測定した。
次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.0）10μｌとルミ
ノール、６−ヒドロキシベンゾオキサゾール、過酸化水
素を上記量混合攪拌し、１分後の発光強度で測定した。
前者と後者の比を、シグナル／バックグラウンド比（SN
比）として表４に示した。
ノール、６−ヒドロキシベンゾオキサゾール、過酸化水
素を上記量混合攪拌し、１分後の発光強度で測定した。
前者と後者の比を、シグナル／バックグラウンド比（SN
比）として表４に示した。
実施例９、10
実施例９、10として、実施例８の発光アッセイにおいて
ルミノールの代わりにイソルミノール（実施例９）、Ｎ
−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール
（以下、ABEIと略す）（実施例10）を用いる以外は、実
施例８と同様にして発光強度を測定し、表４に示した。
ルミノールの代わりにイソルミノール（実施例９）、Ｎ
−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール
（以下、ABEIと略す）（実施例10）を用いる以外は、実
施例８と同様にして発光強度を測定し、表４に示した。
実施例11
実施例８の６−ヒドロキシベンゾオキサゾールの代わり
に２−メチル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを用
いる以外は、実施例８と同様にして発光強度を測定し、
表４に示した。
に２−メチル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを用
いる以外は、実施例８と同様にして発光強度を測定し、
表４に示した。
実施例12、13
実施例12、13として、実施例11とルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例12）、ABEI（実施例13）を用い
る以外は、実施例11と同様にして発光強度を測定し、表
４に示した。
イソルミノール（実施例12）、ABEI（実施例13）を用い
る以外は、実施例11と同様にして発光強度を測定し、表
４に示した。
実施例14
実施例８の６−ヒドロキシベンゾオキサゾールの代わり
に２−フェニル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを
用いる以外は、実施例８と同様にして発光強度を測定
し、表４に示した。
に２−フェニル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを
用いる以外は、実施例８と同様にして発光強度を測定
し、表４に示した。
実施例15、16
実施例15、16として、実施例14のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例15）、ABEI（実施例16）を用い
る以外は、実施例14と同様にして発光強度を測定し、表
５に示した。
イソルミノール（実施例15）、ABEI（実施例16）を用い
る以外は、実施例14と同様にして発光強度を測定し、表
５に示した。
比較例12〜14
比較例12〜14として、実施例８〜10の６−ヒドロキシベ
ンゾオキサゾールを使用しない以外は、全く同様にして
発光強度を測定し、表４に示した。
ンゾオキサゾールを使用しない以外は、全く同様にして
発光強度を測定し、表４に示した。
実施例17
HHBPを用いたCA15−３抗原の発光アッセイ
CA15−３抗原溶液（615U/ml）をウシ血清アルブミンを
含むリン酸塩緩衝液（PBS）で希釈し、300U/ml、200U/m
l、100U/ml、50U/ml、25U/ml、0U/ml（ウシ血清アルブ
ミンを含むPBS）の濃度の溶液に調製し、各々を標準CA1
5−３溶液とした。
含むリン酸塩緩衝液（PBS）で希釈し、300U/ml、200U/m
l、100U/ml、50U/ml、25U/ml、0U/ml（ウシ血清アルブ
ミンを含むPBS）の濃度の溶液に調製し、各々を標準CA1
5−３溶液とした。
各濃度の標準CA15−３溶液20μｌずつ２サンプルをトレ
イ（25穴）に分注した。ペルオキシダーゼ標識抗CA15−
３抗体（マウス）を300μｌずるウェルに加えた。各ウ
ェルに抗体不溶化ビーズを紙で付着液を吸い取った
後、ピンセットで各ウェルに１個ずつ加えた。
イ（25穴）に分注した。ペルオキシダーゼ標識抗CA15−
３抗体（マウス）を300μｌずるウェルに加えた。各ウ
ェルに抗体不溶化ビーズを紙で付着液を吸い取った
後、ピンセットで各ウェルに１個ずつ加えた。
トレイカバーシールを貼り、軽くたたいて混合した後、
25℃で２時間反応させた。反応終了後、ビーズウッシャ
ーを用い、生理食塩水5mlで３回洗浄した。洗浄後、ト
レイ中のビーズを試験管に移し、さらにルミノメーター
測定用プラスチックチューブに移動させた。
25℃で２時間反応させた。反応終了後、ビーズウッシャ
ーを用い、生理食塩水5mlで３回洗浄した。洗浄後、ト
レイ中のビーズを試験管に移し、さらにルミノメーター
測定用プラスチックチューブに移動させた。
200μｌのルミノール（100mM DMSO溶液10μl/10ml 0.1M
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と200μｌのHHBP（100mM DM
SO溶液10μl/10ml 0.1M−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と10
μｌの過酸化水素（9.1M水溶液を1000倍に希釈）とを各
々のプラスチックチューブに加え、10秒後の発光強度を
測定した。２サンプルの平均発光強度を表５に示した。
−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と200μｌのHHBP（100mM DM
SO溶液10μl/10ml 0.1M−トリス塩酸緩衝液pH7.5）と10
μｌの過酸化水素（9.1M水溶液を1000倍に希釈）とを各
々のプラスチックチューブに加え、10秒後の発光強度を
測定した。２サンプルの平均発光強度を表５に示した。
標準CA15−３抗原溶液（300U/ml、200U/ml、100U/ml、5
0U/ml、25U/ml）の10秒後の平均発光強度と0U/mlの10秒
後の平均発光強度の比（SN比）を求め、第３図に示し
た。
0U/ml、25U/ml）の10秒後の平均発光強度と0U/mlの10秒
後の平均発光強度の比（SN比）を求め、第３図に示し
た。
実施例18
２−メチル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを用い
たCA15−３抗原の発光アッセイ 実施例17のHHBPの代わりに２−メチル−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾールを使用した以外は、実施例17と同様
に操作し発光強度を測定し、平均発光強度を表５に、SN
比を第３図に示した。
たCA15−３抗原の発光アッセイ 実施例17のHHBPの代わりに２−メチル−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾールを使用した以外は、実施例17と同様
に操作し発光強度を測定し、平均発光強度を表５に、SN
比を第３図に示した。
比較例15
実施例17の手順に従い、HHBPおよび２−チル−６−ヒド
ロキシベンゾオキサゾールを使用しなかった以外は、全
く同様に測定を行なった。平均発光強度を表５に、SN比
を第３図に示した。
ロキシベンゾオキサゾールを使用しなかった以外は、全
く同様に測定を行なった。平均発光強度を表５に、SN比
を第３図に示した。
実施例19
２−クロロメチル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾール
の合成 攪拌羽根を付けた300ml三ッ口フラスコに、クロロアセ
トニトリル26.1g（345.7mmol）無水エタノール20ml、エ
ーテル70mlを入れ、ゆっくりと攪拌しながら、室温で約
40分間塩化水素ガスを吹き込んだ。生成した白色沈殿を
過し、エーテルで洗浄した。37.5g（237.3mol）のク
ロロメチルイミド酸エチル塩酸塩が得られ、反応収率は
68.7％であった。
の合成 攪拌羽根を付けた300ml三ッ口フラスコに、クロロアセ
トニトリル26.1g（345.7mmol）無水エタノール20ml、エ
ーテル70mlを入れ、ゆっくりと攪拌しながら、室温で約
40分間塩化水素ガスを吹き込んだ。生成した白色沈殿を
過し、エーテルで洗浄した。37.5g（237.3mol）のク
ロロメチルイミド酸エチル塩酸塩が得られ、反応収率は
68.7％であった。
上述のクロロメチルイミド酸エチル塩酸塩1.78g（11.3m
mol）、４−アミノレゾルシノール塩酸塩1.22g（7.55mm
ol）、エタノール20mlをジムロートコンデンサーを付け
た二ッ口フラスコに入れ、アルゴン雰囲気下、一昼夜加
熱還流した。反応終了後、冷却して結晶を過し、ヘキ
サンで洗浄した後、目的物を減圧感想した。0.40g（2.3
3mmol）の２−クロロメチル−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールが得られ、反応収率は30.9％であった。
mol）、４−アミノレゾルシノール塩酸塩1.22g（7.55mm
ol）、エタノール20mlをジムロートコンデンサーを付け
た二ッ口フラスコに入れ、アルゴン雰囲気下、一昼夜加
熱還流した。反応終了後、冷却して結晶を過し、ヘキ
サンで洗浄した後、目的物を減圧感想した。0.40g（2.3
3mmol）の２−クロロメチル−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールが得られ、反応収率は30.9％であった。
m.p.:148.5〜153.7℃
IR（第４図、KBr、cm-1）：
3076、1615、1572、1491、1334、1238、1141、837
NMR（第５図、DMSO-d6）：
4.97（s,2H）、6.84（dd,2H）、7.08（d,1H）、7.55
（d,1H）、9.89（s,1H） MS（EI）:183（M+）、148 高分解能MS（EI）：C8H6O2NCl 計算値 183.0015 実測値 183.0051 実施例20 ２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベンゾオキサ
ゾールの合成 攪拌羽根、冷却用コンデンサーを付けた500ml三ッ口フ
ラスコに、61.3g（420mmol）のシュウ酸ジエチルと90.2
g（433mmol）の五塩化リンを入れ、105℃で17時間加熱
攪拌した。
（d,1H）、9.89（s,1H） MS（EI）:183（M+）、148 高分解能MS（EI）：C8H6O2NCl 計算値 183.0015 実測値 183.0051 実施例20 ２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベンゾオキサ
ゾールの合成 攪拌羽根、冷却用コンデンサーを付けた500ml三ッ口フ
ラスコに、61.3g（420mmol）のシュウ酸ジエチルと90.2
g（433mmol）の五塩化リンを入れ、105℃で17時間加熱
攪拌した。
残った液体を11mmHgの減圧比、蒸留し、77〜85℃の留分
53.2g（265mmol）を集めた。ジクロロエトキシ酢酸エチ
ルの生成収率は、63.0％であった。
53.2g（265mmol）を集めた。ジクロロエトキシ酢酸エチ
ルの生成収率は、63.0％であった。
攪拌羽根、冷却用コンデンサー、滴下ロートを付けた50
0ml三ッ口フラスコに、無水エーテル85ml、無水エタノ
ール35.5ml、ジクロロエトキシ酢酸エチル53.2g（265mm
ol）をアルゴン雰囲気下入れ、攪拌しながら滴下ロート
から無水ピリジン49.5mlを１時間で滴下した。
0ml三ッ口フラスコに、無水エーテル85ml、無水エタノ
ール35.5ml、ジクロロエトキシ酢酸エチル53.2g（265mm
ol）をアルゴン雰囲気下入れ、攪拌しながら滴下ロート
から無水ピリジン49.5mlを１時間で滴下した。
２時間室温で攪拌した後、ビリジン塩酸塩を過で除
き、50mlの無水エーテルで洗浄した。液からエーテル
を留去し、残った液体を90℃で１時間半攪拌した。反応
液を冷却し、エーテルを加え、3N−硫酸、炭酸水素ナト
リウム水溶液で順次洗浄した。エーテル層を硫酸マグネ
シウムで乾燥した後、エーテルを留去し、残液を7mmHg
の減圧下、蒸留した。83〜89℃の留分40.1g（182mmol）
を集めた。生成したトリエトキシ酢酸エチルの収率は、
68.7％であった。
き、50mlの無水エーテルで洗浄した。液からエーテル
を留去し、残った液体を90℃で１時間半攪拌した。反応
液を冷却し、エーテルを加え、3N−硫酸、炭酸水素ナト
リウム水溶液で順次洗浄した。エーテル層を硫酸マグネ
シウムで乾燥した後、エーテルを留去し、残液を7mmHg
の減圧下、蒸留した。83〜89℃の留分40.1g（182mmol）
を集めた。生成したトリエトキシ酢酸エチルの収率は、
68.7％であった。
上述のトリエトキシ酢酸エチル4ml、４−アミノレンゾ
ルシノール塩酸塩1.00g（6.19mmol）、炭酸水素ナトリ
ウム505mgを冷却用コンデセンサーを付けた二ッ口フラ
スコにアルゴン雰囲気下入れ、100℃で一昼夜加熱攪拌
した。
ルシノール塩酸塩1.00g（6.19mmol）、炭酸水素ナトリ
ウム505mgを冷却用コンデセンサーを付けた二ッ口フラ
スコにアルゴン雰囲気下入れ、100℃で一昼夜加熱攪拌
した。
反応液を冷却して沈殿を生成させ、過した。沈殿はア
セトンに溶解し、活性炭を加え、1.5時間加熱還流し
た。活性炭を過で除き、液はシリカゲルカラムを通
し、濃縮した。生成した結晶を減圧乾燥して、２−エト
キシカルボニル−６−ヒドロキシベンゾオキシサゾール
1.07g（5.17mmol）を得た。反応収率は83.5％であっ
た。
セトンに溶解し、活性炭を加え、1.5時間加熱還流し
た。活性炭を過で除き、液はシリカゲルカラムを通
し、濃縮した。生成した結晶を減圧乾燥して、２−エト
キシカルボニル−６−ヒドロキシベンゾオキシサゾール
1.07g（5.17mmol）を得た。反応収率は83.5％であっ
た。
m.p.:199.5〜200.2℃
IR（第６図、KBr、cm-1）：
3278、1736、1630、1539、1489、1261、1241、1145、11
6、849 NMR（第７図、DMSO-d6）： 1.35（t,3H）、4.41（q,2H）、6.97（dd,1H）、7.14
（d,1H）、7.72（d,1H）、10.25（bs,1H） MS（EI）:207（M+）、135 高分解能MS（EI）：C10H9O4N 計算値 207.0591 実測値 207.0561 実施例21 ２−（３−ブロモフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、３−ブロモ安息香酸クロライド14.1ml（107mmo
l）と４−アミノレゾルシノール塩酸塩1.7g（10.5mmo
l）を入れ、90〜145℃に30分加熱した。残渣に水酸化ナ
トリウム水溶液とメタノールを加え、均一溶液として２
時間室温で攪拌した。反応液を酢酸エチルで２回抽出
し、IN・塩酸、飽和食塩水の順で洗浄した。過剰の酢酸
エチルを留去し、得られた沈殿をTHF/水で再結晶した。
0.68g（2.35mmol）の２−（３−ブロモフェニル）−６
−ヒドロキシベンゾオキサゾールが得られ、反応収率は
16.6％であった。
6、849 NMR（第７図、DMSO-d6）： 1.35（t,3H）、4.41（q,2H）、6.97（dd,1H）、7.14
（d,1H）、7.72（d,1H）、10.25（bs,1H） MS（EI）:207（M+）、135 高分解能MS（EI）：C10H9O4N 計算値 207.0591 実測値 207.0561 実施例21 ２−（３−ブロモフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、３−ブロモ安息香酸クロライド14.1ml（107mmo
l）と４−アミノレゾルシノール塩酸塩1.7g（10.5mmo
l）を入れ、90〜145℃に30分加熱した。残渣に水酸化ナ
トリウム水溶液とメタノールを加え、均一溶液として２
時間室温で攪拌した。反応液を酢酸エチルで２回抽出
し、IN・塩酸、飽和食塩水の順で洗浄した。過剰の酢酸
エチルを留去し、得られた沈殿をTHF/水で再結晶した。
0.68g（2.35mmol）の２−（３−ブロモフェニル）−６
−ヒドロキシベンゾオキサゾールが得られ、反応収率は
16.6％であった。
m.p.:248.0〜248.5℃
IR（第８図、KBr、cm-1）：
3190、1630、1549、1475、1325、1234、1143、1062、83
5 NMR（第９図、DMSO-d6）： 6.90（dd,1H）、7.12（d,1H）、7.66（m,2H）、7.71
（d,1H）、8.15（m,2H）、9.94（s,1H） MS（EI）:289（M+）、291（M+＋２）、210、182 高分解能MS（EI）：C13H8O2NBr 計算値 288.9738 実測値 288.9711 実施例22 ２−（２−メチルフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、２−メチル安息香酸クロライド14ml（107.3mmo
l）と４−アミノレゾルシノール塩酸塩1.7g（10.5mmo
l）を入れ、144〜215℃で１時間加熱した。過剰の酸ク
ロライドを蒸留で除き、系を１〜1.5mmHgの減圧にして8
8〜230℃の留分6.2gを集めた。
5 NMR（第９図、DMSO-d6）： 6.90（dd,1H）、7.12（d,1H）、7.66（m,2H）、7.71
（d,1H）、8.15（m,2H）、9.94（s,1H） MS（EI）:289（M+）、291（M+＋２）、210、182 高分解能MS（EI）：C13H8O2NBr 計算値 288.9738 実測値 288.9711 実施例22 ２−（２−メチルフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、２−メチル安息香酸クロライド14ml（107.3mmo
l）と４−アミノレゾルシノール塩酸塩1.7g（10.5mmo
l）を入れ、144〜215℃で１時間加熱した。過剰の酸ク
ロライドを蒸留で除き、系を１〜1.5mmHgの減圧にして8
8〜230℃の留分6.2gを集めた。
上述の留分にエタールを加え再結晶し、結晶2.32g（6.7
6mmol）を得た。結晶500mg（1.46mmol）に、KOH772mg
（13.6mmol）、THF30ml、水5ml、メタノール10mlを加
え、室温で一昼夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出
し、飽和食塩水で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去
した。残渣を真空ポンプで乾燥し、２−（２−メチルフ
ェニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾール320mg
（1.42mmol）を得た。反応収率は62.7％であった。
6mmol）を得た。結晶500mg（1.46mmol）に、KOH772mg
（13.6mmol）、THF30ml、水5ml、メタノール10mlを加
え、室温で一昼夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出
し、飽和食塩水で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去
した。残渣を真空ポンプで乾燥し、２−（２−メチルフ
ェニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾール320mg
（1.42mmol）を得た。反応収率は62.7％であった。
m.p.:133.5〜137.5℃
IR（第10図、KBr、cm-1）：
3064、1613、1489、1224、1151、729
NMR（第11図、DMSO-d6）：
2.73（s,3H）、6.87（dd,1H）、7.11（d,1H）、7.42m,3
H）、7.64（d,1H）、8.06（m,1H）、9.86（s,1H） MS（EI）:225（M+）、196、168、156、116、91、79、5
1、39 高分解能MS（EI）：C14H11O2N 計算値 225.0790 実測値 225.0764 実施例23 ルミノールと２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾールと使用するペルオキシターゼの発光
アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例３で得ら
れた200μｌの２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキ
シベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの西洋わ
さびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mgを1g/l
のBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に希釈〕
と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍に希
釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボルテ
ックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測定
した。
H）、7.64（d,1H）、8.06（m,1H）、9.86（s,1H） MS（EI）:225（M+）、196、168、156、116、91、79、5
1、39 高分解能MS（EI）：C14H11O2N 計算値 225.0790 実測値 225.0764 実施例23 ルミノールと２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾールと使用するペルオキシターゼの発光
アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例３で得ら
れた200μｌの２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキ
シベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの西洋わ
さびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mgを1g/l
のBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に希釈〕
と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍に希
釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボルテ
ックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測定
した。
次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.0）10μｌとミル
ノール、２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベン
ゾオキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の発光強度
で測定した。前者と後者の比を、シグナル／バックグラ
ウンド比（SN比）として表６に示した。
ノール、２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベン
ゾオキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の発光強度
で測定した。前者と後者の比を、シグナル／バックグラ
ウンド比（SN比）として表６に示した。
実施例24、25
実施例24、25として、実施例23のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例24）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミノール（以下、ABEIと略す）
（実施例25）を用いる以外は、実施例23と同様にして発
光強度を測定し、表６に示した。
イソルミノール（実施例24）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミノール（以下、ABEIと略す）
（実施例25）を用いる以外は、実施例23と同様にして発
光強度を測定し、表６に示した。
実施例26
２−（３−ブロモフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールを用いたペルオナシダーゼの発光アッセイ 実施例23の２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベ
ンゾオキサゾールの代わりに、実施例21で得られた２−
（３−ブロモフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサ
ゾールを用いる以外は、実施例23と同様にして発光強度
を測定し、表６に示した。
キサゾールを用いたペルオナシダーゼの発光アッセイ 実施例23の２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベ
ンゾオキサゾールの代わりに、実施例21で得られた２−
（３−ブロモフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサ
ゾールを用いる以外は、実施例23と同様にして発光強度
を測定し、表６に示した。
実施例27、28
実施例27、28として、実施例26のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例27）、ABEI（実施例28）を用い
る以外は、実施例26と同様にして発光強度を測定し、表
６に示した。
イソルミノール（実施例27）、ABEI（実施例28）を用い
る以外は、実施例26と同様にして発光強度を測定し、表
６に示した。
実施例29
実施例23の２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベ
ンゾオキサゾールの代わりに、実施例19で得られた２−
クロロメチル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを用
いる以外は、実施例23と同様にして発光強度を測定し、
表６に示した。
ンゾオキサゾールの代わりに、実施例19で得られた２−
クロロメチル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを用
いる以外は、実施例23と同様にして発光強度を測定し、
表６に示した。
実施例30、31
実施例30、31として、実施例29のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例30）、ABEI（実施例31）を用い
る以外は、実施例29と同様にして発光強度を測定し、表
６に示した。
イソルミノール（実施例30）、ABEI（実施例31）を用い
る以外は、実施例29と同様にして発光強度を測定し、表
６に示した。
実施例32
実施例20の２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベ
ンゾオキサゾールの代わりに、実施例22で得られた２−
（２−メチルフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサ
ゾールを用いる以外は、実施例23と同様にして発光強度
を測定し、表６に示した。
ンゾオキサゾールの代わりに、実施例22で得られた２−
（２−メチルフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサ
ゾールを用いる以外は、実施例23と同様にして発光強度
を測定し、表６に示した。
実施例33、34
実施例33、34として、実施例23のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例33）、ABEI（実施例34）を用い
る以外は、実施例32と同様にして発光強度を測定し、表
６に示した。
イソルミノール（実施例33）、ABEI（実施例34）を用い
る以外は、実施例32と同様にして発光強度を測定し、表
６に示した。
比較例16〜18
比較例16〜18として、実施例23〜25の２−エトキシカル
ボニル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを使用しな
い以外は、全く同様にして発光強度を測定し、表６に示
した。
ボニル−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを使用しな
い以外は、全く同様にして発光強度を測定し、表６に示
した。
実施例35
２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、３−クロロ安息香酸クロライド4.5ml（35.2mmo
l）と４−アミノレゾルシノール塩酸塩1.0g（6.19mmo
l）を入れ、170〜235℃で１時間加熱した後、過剰の酸
クロライドを蒸留で除いた。残渣に、NaOH1.5g（37.5mm
ol）、THF20ml、水20ml、メタノール10mlを加え、室温
で約２時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、飽
和食塩水で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去した。
残渣を水／メタノール/THFで再結晶した後、結晶を乾燥
し、２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロキシベン
ゾオキサゾール250mg（1.02mmol）を得た。反応収率は1
6.5％であった。
キサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、３−クロロ安息香酸クロライド4.5ml（35.2mmo
l）と４−アミノレゾルシノール塩酸塩1.0g（6.19mmo
l）を入れ、170〜235℃で１時間加熱した後、過剰の酸
クロライドを蒸留で除いた。残渣に、NaOH1.5g（37.5mm
ol）、THF20ml、水20ml、メタノール10mlを加え、室温
で約２時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、飽
和食塩水で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去した。
残渣を水／メタノール/THFで再結晶した後、結晶を乾燥
し、２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロキシベン
ゾオキサゾール250mg（1.02mmol）を得た。反応収率は1
6.5％であった。
m.p.:246.0〜247.5℃
IR（第12図、KBr、cm-1）：
3146、1630、1599、1551、1477、1328、1232、1145、10
62、835 NMR（第13図、DMSO-d6）： 6.90（dd,1H）、7.12（d,1H）、7.61（m,3H）、8.06
（m,2H）、9.94（s,1H） MS（EI）:245（M+）、247（M+＋２）、138、122、80、5
2 高分解能MS（EI）：C13H8O2NCl 計算値 245.0193 実測値 245.0218 実施例36 ２−（４−クロロフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、４−クロロ安息香酸クロライド25g（142.8mmol）
と４−アミノレゾルシノール塩酸塩3.0g（18.6mmol）を
入れ、170〜200℃で１時間加熱した後、過剰の酸クロラ
イドを蒸留で除いた。残渣に、NaOH8.4g（210mmol）、T
HF60ml、水60ml、メタノール30mlを加え、室温で約２時
間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水
で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去した。残渣を水
／メタノール/THFで再結晶した後、結晶を乾燥し、２−
（４−クロロフェニル）−６−ジヒドロキシベンゾオキ
サゾール1.24g（5.05mmol）を得た。反応収率は27.2％
であった。
62、835 NMR（第13図、DMSO-d6）： 6.90（dd,1H）、7.12（d,1H）、7.61（m,3H）、8.06
（m,2H）、9.94（s,1H） MS（EI）:245（M+）、247（M+＋２）、138、122、80、5
2 高分解能MS（EI）：C13H8O2NCl 計算値 245.0193 実測値 245.0218 実施例36 ２−（４−クロロフェニル）−６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、４−クロロ安息香酸クロライド25g（142.8mmol）
と４−アミノレゾルシノール塩酸塩3.0g（18.6mmol）を
入れ、170〜200℃で１時間加熱した後、過剰の酸クロラ
イドを蒸留で除いた。残渣に、NaOH8.4g（210mmol）、T
HF60ml、水60ml、メタノール30mlを加え、室温で約２時
間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水
で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去した。残渣を水
／メタノール/THFで再結晶した後、結晶を乾燥し、２−
（４−クロロフェニル）−６−ジヒドロキシベンゾオキ
サゾール1.24g（5.05mmol）を得た。反応収率は27.2％
であった。
m.P.:272.8〜273.5℃
IR（第14図、KBr、cm-1）：
3138、1632、1618、1485、1236、1143、832
NMR（第15図、DMSO-d6）：
6.87（dd,1H）、7.11（d,1H）、7.62（m,3H）、8.13
（d,2H）、9.90（s,1H） MS（EI）:245（M+）、247（M+＋２）、138、122 高分解能MS（EI）：C13H8O2NCl 計算値 245.0178 実測値 245.0211 実施例37 ２−（２−ナフチル）−６−ジヒドロキシベンゾオキサ
ゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、２−ナフトエ酸クロライド20g（104.9mmol）と４
−アミノレゾルシノール塩酸塩2.5g（15.5mmol）を入
れ、135〜205℃で１時間加熱した後、過剰の酸クロライ
ドを蒸留で除いた。残渣に、NaOH8.3g（207.5mmol）、T
HF60ml、水60ml、メタノール30mlを加え、室温で約２時
間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水
で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去した。残渣を水
／メタノール/THFで再結晶した後、結晶を乾燥し、２−
（２−ナフチル）−６−ジヒドロキシベンゾオキサゾー
ル1.92mg（7.36mmol）を得た。反応収率は47.5％であっ
た。
（d,2H）、9.90（s,1H） MS（EI）:245（M+）、247（M+＋２）、138、122 高分解能MS（EI）：C13H8O2NCl 計算値 245.0178 実測値 245.0211 実施例37 ２−（２−ナフチル）−６−ジヒドロキシベンゾオキサ
ゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、２−ナフトエ酸クロライド20g（104.9mmol）と４
−アミノレゾルシノール塩酸塩2.5g（15.5mmol）を入
れ、135〜205℃で１時間加熱した後、過剰の酸クロライ
ドを蒸留で除いた。残渣に、NaOH8.3g（207.5mmol）、T
HF60ml、水60ml、メタノール30mlを加え、室温で約２時
間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水
で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去した。残渣を水
／メタノール/THFで再結晶した後、結晶を乾燥し、２−
（２−ナフチル）−６−ジヒドロキシベンゾオキサゾー
ル1.92mg（7.36mmol）を得た。反応収率は47.5％であっ
た。
m.P.:226.0〜226.2℃
IR（第16図、KBr、cm-1）：
3050、1620、1485、1450、1303、1141、1116、816、752
NMR（第17図、DMSO-d6）：
6.92（dd,1H）、7.17（d,1H）、7.64（m,3H）、8.08
（m,4H）、8.74（s,1H）、9.92（s,1H） MS（EI）:261（M+）、130 高分解能MS（EI）：C17H11O2N 計算値 261.0825 実測値 261.0807 実施例38 ２−（2,4−ジクロロフェンル）−６−ジヒドロキシベ
ンゾオキサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、2,4−ジクロロ安息香酸クロライド9.9ml（70.5mm
ol）と４−アミノレゾルシノール塩酸塩2.0g（12.4mmo
l）を入れ、172〜247℃で１時間加熱した後、過剰の酸
クロライドを蒸留で除いた。残渣に、NaOH6.47g（161.8
mmol）、THF60ml、水60ml、メタノール30mlを加え、室
温で約２時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、
飽和食塩水で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去し
た。残渣を水／メタノール/THFで再結晶した後、結晶を
乾燥し、２−（2,4−ジクロロフェニル）−６−ヒドロ
キシベンゾオキサゾール915mg（3.27mmol）を得た。反
応収率は26.3％であった。
（m,4H）、8.74（s,1H）、9.92（s,1H） MS（EI）:261（M+）、130 高分解能MS（EI）：C17H11O2N 計算値 261.0825 実測値 261.0807 実施例38 ２−（2,4−ジクロロフェンル）−６−ジヒドロキシベ
ンゾオキサゾールの合成 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッ口フラス
コに、2,4−ジクロロ安息香酸クロライド9.9ml（70.5mm
ol）と４−アミノレゾルシノール塩酸塩2.0g（12.4mmo
l）を入れ、172〜247℃で１時間加熱した後、過剰の酸
クロライドを蒸留で除いた。残渣に、NaOH6.47g（161.8
mmol）、THF60ml、水60ml、メタノール30mlを加え、室
温で約２時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、
飽和食塩水で洗浄した後、過剰の酢酸エチルを留去し
た。残渣を水／メタノール/THFで再結晶した後、結晶を
乾燥し、２−（2,4−ジクロロフェニル）−６−ヒドロ
キシベンゾオキサゾール915mg（3.27mmol）を得た。反
応収率は26.3％であった。
m.P.:221.5〜212.8℃
IR（第18図、KBr、cm-1）：
3150、1638、1611、1564、1489、1464、1325、1232、10
94、822、808 NMR（第19図、DMSO-d6）： 6.92（dd,1H）、7.11（d,1H）、7.66（m,2H）、7.85（d
d,1H）、8.12（d,1H）、9.97（s,1H） MS（EI）:279（M+）、281（M+＋２）、283（M+＋４）、
172、139、108、80、52 高分解能MS（EI）：C13H7O2NCl2 計算値 278.9898 実測値 278.9876 実施例39 ルミノールと２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロ
キシベンゾオキサゾールと使用するペルオキシターゼの
発光アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例35で得ら
れた200μｌの２−（３−クロロフェニル）−６−ヒド
ロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μl/
10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの西
洋わさびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mgを
1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に希
釈〕と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍に
希釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボル
テックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測
定した。
94、822、808 NMR（第19図、DMSO-d6）： 6.92（dd,1H）、7.11（d,1H）、7.66（m,2H）、7.85（d
d,1H）、8.12（d,1H）、9.97（s,1H） MS（EI）:279（M+）、281（M+＋２）、283（M+＋４）、
172、139、108、80、52 高分解能MS（EI）：C13H7O2NCl2 計算値 278.9898 実測値 278.9876 実施例39 ルミノールと２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロ
キシベンゾオキサゾールと使用するペルオキシターゼの
発光アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例35で得ら
れた200μｌの２−（３−クロロフェニル）−６−ヒド
ロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μl/
10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの西
洋わさびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mgを
1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に希
釈〕と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍に
希釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボル
テックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測
定した。
次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.0）10μｌとルミ
ノール、２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の発光
強度で測定した。前者と後者の比を、シグナル／バック
グラウンド比（SN比）として表７に示した。
ノール、２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の発光
強度で測定した。前者と後者の比を、シグナル／バック
グラウンド比（SN比）として表７に示した。
実施例40、41
実施例40、41として、実施例39のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例40）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ABEI）（実施例41）
を用いる以外は、実施例39と同様にして発光強度を測定
し、表７に示した。
イソルミノール（実施例40）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ABEI）（実施例41）
を用いる以外は、実施例39と同様にして発光強度を測定
し、表７に示した。
実施例42
ルミノールと２−（４−クロロフェニル）−６−ヒドロ
キシベンゾオキサゾールと使用するペルオキシターゼの
発光アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例36で得ら
れた200μｌの２−（３−クロロフェニル）−６−ヒド
ロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μl/
10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの西
洋わさびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mgを
1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に希
釈〕と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍に
希釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボル
テックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測
定した。
キシベンゾオキサゾールと使用するペルオキシターゼの
発光アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例36で得ら
れた200μｌの２−（３−クロロフェニル）−６−ヒド
ロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μl/
10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの西
洋わさびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mgを
1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に希
釈〕と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍に
希釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボル
テックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測
定した。
次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.0）10μｌとルミ
ノール、２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の発光
強度で測定した。前者と後者の比を、シグナル／バック
グラウンド比（SN比）として表７に示した。
ノール、２−（３−クロロフェニル）−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の発光
強度で測定した。前者と後者の比を、シグナル／バック
グラウンド比（SN比）として表７に示した。
実施例43、44
実施例43、44として、実施例42のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例43）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ABEI）（実施例44）
を用いる以外は、実施例42と同様にして発光強度を測定
し、表７に示した。
イソルミノール（実施例43）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ABEI）（実施例44）
を用いる以外は、実施例42と同様にして発光強度を測定
し、表７に示した。
実施例45
ルミノールと２−（２−ナフチル）−６−ヒドロキシベ
ンゾオキサゾールと使用するペルオキシターゼの発光ア
ッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例37で得ら
れた200μｌの２−（２−ナフチル）−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10ml、
0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの西洋わさ
びペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mgを1g/lの
BSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に希釈〕と1
0μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍に希釈）
とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボルテック
スミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測定し
た。
ンゾオキサゾールと使用するペルオキシターゼの発光ア
ッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例37で得ら
れた200μｌの２−（２−ナフチル）−６−ヒドロキシ
ベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10ml、
0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの西洋わさ
びペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mgを1g/lの
BSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に希釈〕と1
0μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍に希釈）
とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボルテック
スミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を測定し
た。
次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.0）10μｌとルミ
ノール、２−（２−ナフチル）−６−ヒドロキシベンゾ
オキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の発光強度で
測定した。前者と後者の比を、シグナル／バックグラウ
ンド比（SN比）として表７に示した。
ノール、２−（２−ナフチル）−６−ヒドロキシベンゾ
オキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の発光強度で
測定した。前者と後者の比を、シグナル／バックグラウ
ンド比（SN比）として表７に示した。
実施例46、47
実施例46、47として、実施例45のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例46）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ABEI）（実施例47）
を用いる以外は、実施例45と同様にして発光強度を測定
し、表７に示した。
イソルミノール（実施例46）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ABEI）（実施例47）
を用いる以外は、実施例45と同様にして発光強度を測定
し、表７に示した。
実施例48
ルミノールと２−（2,4−ジクロロフェニル）−６−ヒ
ドロキシベンゾオキサゾールと使用するペルオキシター
ゼの発光アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例38で得ら
れた200μｌの２−（2,4−ジクロロフェニル）−６−ヒ
ドロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μ
l/10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの
西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mg
を1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に
希釈〕と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍
に希釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボ
ルテックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を
測定した。
ドロキシベンゾオキサゾールと使用するペルオキシター
ゼの発光アッセイ 200μｌのルミノール溶液（100mM DMSO溶液10μl/10m
l、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と実施例38で得ら
れた200μｌの２−（2,4−ジクロロフェニル）−６−ヒ
ドロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液10μ
l/10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と10μｌの
西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）溶液〔1111unit/mg
を1g/lのBSAを含有するPBS緩衝液（pH7.0）で１万倍に
希釈〕と10μｌの過酸化水素溶液（9.1M水溶液を1000倍
に希釈）とをプラスチックキュベットに入れ、３秒間ボ
ルテックスミキサーで攪拌した後、１分後の発光強度を
測定した。
次に、HRPを含まないPBS緩衝液（pH7.0）10μｌとルミ
ノール、２−（2,4−ジクロロフェニル）−６−ヒドロ
キシベンゾオキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の
発光強度で測定した。前者と後者の比を、シグナル／バ
ックグラウンド比（SN比）として表７に示した。
ノール、２−（2,4−ジクロロフェニル）−６−ヒドロ
キシベンゾオキサゾールを上記量混合攪拌し、１分後の
発光強度で測定した。前者と後者の比を、シグナル／バ
ックグラウンド比（SN比）として表７に示した。
実施例49、50
実施例49、50として、実施例48のルミノールの代わりに
イソルミノール（実施例49）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミール（ABEI）（実施例50）を
用いる以外は、実施例48と同様にして発光強度を測定
し、表７に示した。
イソルミノール（実施例49）、Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチルイソルミール（ABEI）（実施例50）を
用いる以外は、実施例48と同様にして発光強度を測定
し、表７に示した。
比較例19〜21
比較例19〜21として、実施例39〜41の２−（３−クロロ
フェニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを使用
しない以外は、全く同様にして発光強度を測定し、表７
に示した。
フェニル）−６−ヒドロキシベンゾオキサゾールを使用
しない以外は、全く同様にして発光強度を測定し、表７
に示した。
実施例51
２−エトキシカルボニル−６−ヒドロキシベンゾオキサ
ゾールを用いたCA15−３抗原の発光アッセイ CA15−３抗原溶液（615U/ml）を0.25％ウシ血清アルブ
ミンを含むリン酸塩緩衝液（PBS）で希釈し、300U/ml、
200U/ml、100U/ml、50U/ml、25U/ml、0U/ml（0.25％ウ
シ血清アルブミンを含むPBS）の濃度の溶液に調製し、
各々の標準CA15−３溶液とした。
ゾールを用いたCA15−３抗原の発光アッセイ CA15−３抗原溶液（615U/ml）を0.25％ウシ血清アルブ
ミンを含むリン酸塩緩衝液（PBS）で希釈し、300U/ml、
200U/ml、100U/ml、50U/ml、25U/ml、0U/ml（0.25％ウ
シ血清アルブミンを含むPBS）の濃度の溶液に調製し、
各々の標準CA15−３溶液とした。
各濃度の標準CA15−３溶液を20μｌずつ、トレイ（25
穴）に分注した。ペルオキシダーゼ標識抗CA15−３抗体
（マウス）を300μｌずつウェルに加えた。各ウェルに
抗体不溶化ビーズを紙で付着液を吸い取った後、ピン
セットで１個ずつ加えた。
穴）に分注した。ペルオキシダーゼ標識抗CA15−３抗体
（マウス）を300μｌずつウェルに加えた。各ウェルに
抗体不溶化ビーズを紙で付着液を吸い取った後、ピン
セットで１個ずつ加えた。
トレイカバーシールを貼り、軽くたたいて混合した後、
25℃で２時間反応させた。反応終了後、ビーズウォッシ
ャーを用い、生理食塩水5mlで３回洗浄した。洗浄後、
トレイ中のビーズを試験管に移し、さらにルミノメータ
ー測定用プラスチックキュベットに移動させた。
25℃で２時間反応させた。反応終了後、ビーズウォッシ
ャーを用い、生理食塩水5mlで３回洗浄した。洗浄後、
トレイ中のビーズを試験管に移し、さらにルミノメータ
ー測定用プラスチックキュベットに移動させた。
100μｌのルミノールNa塩溶液（12.6mM、ルミノールNa
塩/0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5の溶液を同緩衝液で
18倍に希釈）と100μｌの２−エトキシカルボニル−６
−ヒドロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液
10μl/10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と100μ
ｌの過酸化水素溶液（16.2μＭ過酸化水素/0.01Mリン酸
水素２ナトリウム・クエン酸緩衝液pH5.2を同緩衝液で1
8倍に希釈）をプラスチックバイアルに加え、37℃で10
分間加温した後、60秒間発光を測定した。50秒から60秒
の間の発光強度の積算値1/6の値を、表８に示した。
塩/0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5の溶液を同緩衝液で
18倍に希釈）と100μｌの２−エトキシカルボニル−６
−ヒドロキシベンゾオキサゾール溶液（100mM DMSO溶液
10μl/10ml、0.1M−トリス塩酸塩緩衝液pH8.5）と100μ
ｌの過酸化水素溶液（16.2μＭ過酸化水素/0.01Mリン酸
水素２ナトリウム・クエン酸緩衝液pH5.2を同緩衝液で1
8倍に希釈）をプラスチックバイアルに加え、37℃で10
分間加温した後、60秒間発光を測定した。50秒から60秒
の間の発光強度の積算値1/6の値を、表８に示した。
標準CA15−３抗原溶液（300U/ml、200U/ml、100U/ml、5
0U/ml、25U/ml）の50秒から60秒の間の発光強度の積算
値1/6の値と、0U/mlの50秒から60秒の間の発光強度の積
算値の1/6の値の比（SN比）を求め、第８表、第20図に
示した。
0U/ml、25U/ml）の50秒から60秒の間の発光強度の積算
値1/6の値と、0U/mlの50秒から60秒の間の発光強度の積
算値の1/6の値の比（SN比）を求め、第８表、第20図に
示した。
比較例22
実施例35の手順に従い、２−エトキシカルボニル−６−
ヒドロキシベンゾオキサゾールを使用しなかった以外は
全く同様に操作し、発光強度およびSN比を表８、第20図
に示した。
ヒドロキシベンゾオキサゾールを使用しなかった以外は
全く同様に操作し、発光強度およびSN比を表８、第20図
に示した。
産業上の利用可能性
以上のように本発明にかかる発光分析方法により、物質
の高感度迅速測定が可能となる。
の高感度迅速測定が可能となる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
// Ｃ０７Ｄ 311/56
Claims (4)
- 【請求項１】（ａ）ペルオキシダーゼまたはペルオキシ
ダーゼ誘導体、（ｂ）酸化剤および（ｃ）ルミノール、
イソルミノールまたはそれらの誘導体の反応により生ず
る化学発光を利用して、物質を検出または測定する方法
において、誘発光反応を２−ヒドロキシ−９−フルオレ
ノン、 および 一般式 〔式中、R1は水素、CnH2n+1（ここで、ｎは１〜４の正
の整数を表わす）、XCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、Brま
たはＩを表わし、ｎ＝１〜４の正の整数を表わす）、Cn
H2n+1CO2（ｎは前記定義に同じ）、フェニル基、ナフチ
ル基、CnH2n+1C6H4（ｎは前記定義に同じ）、YC6H4（Ｙ
はＦ、Cl、Br、Ｉまたはフェニル基を表わす）、XYC6H3
（Ｘ、Ｙは前記定義に同じ）を表わす〕 で示されるオキサゾール誘導体からなる群から選ばれる
少なくとも１つの化合物の存在下に行なうことを特徴と
する高感度発光分析方法。 - 【請求項２】一般式［Ｉ］に示される化合物のR1が水
素、メチル基、クロロメチル基、エトキシカルボニル
基、フェニル基、ブロモフェニル基、メチルフェニル
基、クロロフェニル基、ナフチル基またはジクロロフェ
ニル基である請求項１記載の高感度発光分析方法。 - 【請求項３】一般式 〔式中、R2はXCnH2n（ここで、ＸはＦ、Cl、BrまたはＩ
を表わし、ｎ＝１〜４の正の整数を表わす）、CnH2n+1C
O2（ｎは前記定義に同じ）、ナフチル基、CnH2n+1C6H4
（ｎは前記定義に同じ）、YC6H4（ＹはＦ、Cl、Br、Ｉ
またはフェニル基を表わす）、XYC6H3（Ｘ、Ｙは前記定
義に同じ）を表わす〕 で示される新規なオキサゾール誘導体。 - 【請求項４】一般式［II］に示される化合物のR2がクロ
ロメチル基、エトキシカルボニル基、ブロモフェニル
基、クロロフェニル基、ナフチル基、ジクロロフェニル
基またはメチルフェニル基である請求項３記載の新規な
オキサゾール誘導体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-506367A JPH0786096B2 (ja) | 1989-04-28 | 1990-04-27 | 高感度発光分析方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10959889 | 1989-04-28 | ||
| JP1-109598 | 1989-04-28 | ||
| JP1-229575 | 1989-09-05 | ||
| JP22957589 | 1989-09-05 | ||
| JP3799790 | 1990-02-19 | ||
| JP2-506367A JPH0786096B2 (ja) | 1989-04-28 | 1990-04-27 | 高感度発光分析方法 |
| JP2-37997 | 1990-11-09 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH0786096B2 true JPH0786096B2 (ja) | 1995-09-20 |
| JPH0786096B1 JPH0786096B1 (ja) | 1995-09-20 |
Family
ID=27289667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0422252B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0786096B2 (ja) |
| KR (1) | KR960002875B1 (ja) |
| AT (1) | ATE125573T1 (ja) |
| CA (1) | CA2032154C (ja) |
| DE (1) | DE69021161T2 (ja) |
| DK (1) | DK0422252T3 (ja) |
| ES (1) | ES2074571T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990013665A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5670644A (en) * | 1993-05-17 | 1997-09-23 | Lumigen, Inc. | Acridan compounds |
| US5523212A (en) * | 1993-05-17 | 1996-06-04 | Lumigen, Inc. | Aryl N-alkylacridanthiocarboxylate derivatives useful for chemiluminescent detection |
| US5686258A (en) * | 1993-05-17 | 1997-11-11 | Lumigen, Inc. | Chemiluminescent detection of hydrolytic enzymes using an acridan |
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| ES2113294B1 (es) * | 1995-08-01 | 1999-05-16 | Univ Malaga | Metodo para aumentar la sensibilidad de un ensayo quimioluminiscente utilizando compuestos aromaticos con grupos amino e hidroxi como intensificadores |
| FR2740219B1 (fr) * | 1995-10-20 | 1998-01-16 | Covalab | Systeme d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de preference biologiques, par chimiluminescence, amplifiee, procede et necessaire d'analyse en faisant application |
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| US7799534B2 (en) | 2006-05-09 | 2010-09-21 | Beckman Coulter, Inc. | Nonseparation assay methods |
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