JPH078276A - 新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法Info
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- JPH078276A JPH078276A JP5153456A JP15345693A JPH078276A JP H078276 A JPH078276 A JP H078276A JP 5153456 A JP5153456 A JP 5153456A JP 15345693 A JP15345693 A JP 15345693A JP H078276 A JPH078276 A JP H078276A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 以下の理化学的性質を有する新規な環状イソ
マルトオリゴ糖合成酵素、 作用 デキストラン等のα−１、６結合より成るグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応により環状イソマル
トオリゴ糖を生成する。 基質特異性 α−１、６結合を主鎖とするデキストランには作用する
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で作用し、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で
安定である。バチルス属に属し、前記酵素生産能を有す
る微生物をデキストラン含有培地に培養し、培養物より
該酵素を採取する新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵
素の製造法及びこの酵素をデキストランに作用させ環状
イソマルトオリゴ糖を製造する方法。 【効果】 サイクロデキストリンとは異なった理化学的
性質を有し、サイクロデキストリンに比べて種々の長所
を有する新規な環状イソマルトオリゴ糖を極めて簡単な
操作で高純度に効率良く得ることができる。
マルトオリゴ糖合成酵素、 作用 デキストラン等のα−１、６結合より成るグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応により環状イソマル
トオリゴ糖を生成する。 基質特異性 α−１、６結合を主鎖とするデキストランには作用する
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で作用し、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で
安定である。バチルス属に属し、前記酵素生産能を有す
る微生物をデキストラン含有培地に培養し、培養物より
該酵素を採取する新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵
素の製造法及びこの酵素をデキストランに作用させ環状
イソマルトオリゴ糖を製造する方法。 【効果】 サイクロデキストリンとは異なった理化学的
性質を有し、サイクロデキストリンに比べて種々の長所
を有する新規な環状イソマルトオリゴ糖を極めて簡単な
操作で高純度に効率良く得ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、デキストランから環状
イソマルトオリゴ糖を生成する新規な環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素、その製造法及び該酵素を用いるデキス
トランからの環状イソマルトオリゴ糖の製造法に関する
ものである。
イソマルトオリゴ糖を生成する新規な環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素、その製造法及び該酵素を用いるデキス
トランからの環状イソマルトオリゴ糖の製造法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】グルコースがα−１、６結合により環状
に結合した環状イソマルトオリゴ糖は、従来全く知られ
ておらず、本発明者等が、デキストラン含有培地中で、
土壌より単離した１菌株を培養して得られる培養液より
初めて単離された新規化合物であり、既に特許出願を行
なっている。(特願平４−３４９４４４号明細書)。
に結合した環状イソマルトオリゴ糖は、従来全く知られ
ておらず、本発明者等が、デキストラン含有培地中で、
土壌より単離した１菌株を培養して得られる培養液より
初めて単離された新規化合物であり、既に特許出願を行
なっている。(特願平４−３４９４４４号明細書)。
【０００３】しかしながら、この方法は、微生物の培養液
から該オリゴ糖を分離するものであり、培地由来の不純
物が多く混在しているため精製に多大の労力を要する難
点があった。
から該オリゴ糖を分離するものであり、培地由来の不純
物が多く混在しているため精製に多大の労力を要する難
点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、該オ
リゴ糖を培養物からの分離精製法によらず、酵素法によ
り該オリゴ糖の製造を可能にする新規酵素を見出し、該
酵素を用いて、デキストランより有用性大なる該オリゴ
糖を製造する方法を提供することにある。
リゴ糖を培養物からの分離精製法によらず、酵素法によ
り該オリゴ糖の製造を可能にする新規酵素を見出し、該
酵素を用いて、デキストランより有用性大なる該オリゴ
糖を製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記の新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を得るた
めに、鋭意検討した結果、環状イソマルトオリゴ糖生産
菌であるバチルス・エスピー．Ｔ−３０４０株をデキス
トラン含有培地中で培養して得られる培養液中に、該酵
素が菌体外酵素として存在していること、また、該酵素
を培養液より分離精製し、本酵素を用いデキストランか
ら環状イソマルトオリゴ糖を生成させれば、反応液より
該オリゴ糖を効率よく採取することができる等の知見を
得、本発明を完成させた。
上記の新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を得るた
めに、鋭意検討した結果、環状イソマルトオリゴ糖生産
菌であるバチルス・エスピー．Ｔ−３０４０株をデキス
トラン含有培地中で培養して得られる培養液中に、該酵
素が菌体外酵素として存在していること、また、該酵素
を培養液より分離精製し、本酵素を用いデキストランか
ら環状イソマルトオリゴ糖を生成させれば、反応液より
該オリゴ糖を効率よく採取することができる等の知見を
得、本発明を完成させた。
【０００６】すなわち本発明は、以下の理化学的性質を
有する新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素である。 作用 デキストラン等のα−１、６結合より成るグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応により環状イソマル
トオリゴ糖を生成する。
有する新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素である。 作用 デキストラン等のα−１、６結合より成るグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応により環状イソマル
トオリゴ糖を生成する。
【０００７】基質特異性 α−１、６結合を主鎖とするデキストランには作用する
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で作用し、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で
安定である。
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で作用し、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で
安定である。
【０００８】さらに、本発明は、バチルス属に属し、前
記の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素生産能を有する微
生物をデキストラン含有培地に培養し、培養物より該酵
素を採取することを特徴とする新規な環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素の製造法であり、さらにまた、本発明
は、デキストランに前記の環状イソマルトオリゴ糖合成
酵素を作用させ環状イソマルトオリゴ糖を生成せしめる
ことを特徴とする環状イソマルトオリゴ糖の製造法であ
る。
記の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素生産能を有する微
生物をデキストラン含有培地に培養し、培養物より該酵
素を採取することを特徴とする新規な環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素の製造法であり、さらにまた、本発明
は、デキストランに前記の環状イソマルトオリゴ糖合成
酵素を作用させ環状イソマルトオリゴ糖を生成せしめる
ことを特徴とする環状イソマルトオリゴ糖の製造法であ
る。
【０００９】上記環状イソマルトオリゴ糖の製造法にお
いて、前記の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素に代え
て、バチルス属に属し前記の環状イソマルトオリゴ糖合
成酵素生産能を有する微生物をデキストラン含有培地に
培養して得られる培養液の除菌混合物を用いて同様に環
状イソマルトオリゴ糖を製造することができる。以下、
本発明を詳細に説明する。
いて、前記の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素に代え
て、バチルス属に属し前記の環状イソマルトオリゴ糖合
成酵素生産能を有する微生物をデキストラン含有培地に
培養して得られる培養液の除菌混合物を用いて同様に環
状イソマルトオリゴ糖を製造することができる。以下、
本発明を詳細に説明する。
【００１０】先ず、新規な環状イソマルトオリゴ糖（サ
イクロイソマルトヘプタオース、サイクロイソマルトオ
クタオース及びサイクロイソマルトノナオース）の理化
学的性質及びその性質に基づきこれらの物質が環状オリ
ゴ糖であることについて説明する。 １．元素分析の結果、以下のようになり各々グルコース
の環状7量体、8量体、9量体であることが判った。 サイクロイソマルトヘプタオース；Ｃ42Ｈ70Ｏ35・3H2Ｏ
として 計算値 Ｃ：42.43％ Ｈ：6.44％ 測定値 Ｃ：42.78％ Ｈ：6.33％ サイクロイソマルトオクタオース；Ｃ48Ｈ80Ｏ40・4Ｈ2
Ｏとして 計算値 Ｃ：42.11％ Ｈ：6.48％ 測定値 Ｃ：42.37％ Ｈ：6.24％ サイクロイソマルトノナオース ；Ｃ54Ｈ90Ｏ45・5Ｈ2
Ｏとして 計算値 Ｃ：41.86％ Ｈ：6.51％ 測定値 Ｃ：41.53％ Ｈ：6.18％ 2. 分子量は、日立製作社製の質量分析計 80Bにより分
析したマススペクトル分析のデータから サイクロイソマルトヘプタオース；1 1 3 4 サイクロイソマルトオクタオース；1 2 9 6 サイクロイソマルトノナオース ；1 4 5 8 であり、いずれも分子式から推定される値と一致した。
イクロイソマルトヘプタオース、サイクロイソマルトオ
クタオース及びサイクロイソマルトノナオース）の理化
学的性質及びその性質に基づきこれらの物質が環状オリ
ゴ糖であることについて説明する。 １．元素分析の結果、以下のようになり各々グルコース
の環状7量体、8量体、9量体であることが判った。 サイクロイソマルトヘプタオース；Ｃ42Ｈ70Ｏ35・3H2Ｏ
として 計算値 Ｃ：42.43％ Ｈ：6.44％ 測定値 Ｃ：42.78％ Ｈ：6.33％ サイクロイソマルトオクタオース；Ｃ48Ｈ80Ｏ40・4Ｈ2
Ｏとして 計算値 Ｃ：42.11％ Ｈ：6.48％ 測定値 Ｃ：42.37％ Ｈ：6.24％ サイクロイソマルトノナオース ；Ｃ54Ｈ90Ｏ45・5Ｈ2
Ｏとして 計算値 Ｃ：41.86％ Ｈ：6.51％ 測定値 Ｃ：41.53％ Ｈ：6.18％ 2. 分子量は、日立製作社製の質量分析計 80Bにより分
析したマススペクトル分析のデータから サイクロイソマルトヘプタオース；1 1 3 4 サイクロイソマルトオクタオース；1 2 9 6 サイクロイソマルトノナオース ；1 4 5 8 であり、いずれも分子式から推定される値と一致した。
【００１１】3. 融点は、やなぎもと社製の融点測定機
により測定した結果、明確に融解せず、下記の温度域で
変色したので、分解温度を示したが、夫々、 サイクロイソマルトヘプタオース；234〜238℃ サイクロイソマルトオクタオース；238〜241℃ サイクロイソマルトノナオース ；239〜242℃ であった。
により測定した結果、明確に融解せず、下記の温度域で
変色したので、分解温度を示したが、夫々、 サイクロイソマルトヘプタオース；234〜238℃ サイクロイソマルトオクタオース；238〜241℃ サイクロイソマルトノナオース ；239〜242℃ であった。
【００１２】4. 紫外線吸収スペクトルは、日立製作社
製の分光光度計 775で測定した結果、いずれも特徴的な
吸収は認められなかった。従ってアミノ基、カルボキシ
ル基等の官能基は持っていないことが示唆された。 5. 該物質の外赤外線吸収スペクトルを日本分光社製IR
スペクトルメーターモデルFT/IR-7300で測定した結果を
図１に示した。図１において、Ａ、Ｂ、Ｃは夫々グルコ
ースの環状7量体、8量体、9量体を示す。その結果、い
ずれもα−1、6結合に特有の917±2cm-14.1と768±1cm
-14.1に吸収ピークを示した。従って、該オリゴ糖がα
−1、6結合を有していることが示唆された。
製の分光光度計 775で測定した結果、いずれも特徴的な
吸収は認められなかった。従ってアミノ基、カルボキシ
ル基等の官能基は持っていないことが示唆された。 5. 該物質の外赤外線吸収スペクトルを日本分光社製IR
スペクトルメーターモデルFT/IR-7300で測定した結果を
図１に示した。図１において、Ａ、Ｂ、Ｃは夫々グルコ
ースの環状7量体、8量体、9量体を示す。その結果、い
ずれもα−1、6結合に特有の917±2cm-14.1と768±1cm
-14.1に吸収ピークを示した。従って、該オリゴ糖がα
−1、6結合を有していることが示唆された。
【００１３】6. 溶剤に対する溶解性は、いずれのオリ
ゴ糖も室温で最低20mg/ml以上の濃度で水に溶けた。 7. 呈色反応は、いずれのオリゴ糖もソモギ−ネルソン
法で発色しなかったことから、還元末端が存在していな
いことを強く示唆している。 8. 該物質は、いずれも中性の白色物質である。
ゴ糖も室温で最低20mg/ml以上の濃度で水に溶けた。 7. 呈色反応は、いずれのオリゴ糖もソモギ−ネルソン
法で発色しなかったことから、還元末端が存在していな
いことを強く示唆している。 8. 該物質は、いずれも中性の白色物質である。
【００１４】9. 該物質の日本電子社製のNMRスペクトル
メーターモデルNM-FX200による13C-NMR分析の結果から
いずれも、6本のシグナルが認められただけであって、
環状構造を支持していた。また、イソマルトヘプタオー
スの解析から、該物質の結合様式がα−1、6結合である
こと強く示唆された。次に、該物質の酵素的解析結果を
示す。
メーターモデルNM-FX200による13C-NMR分析の結果から
いずれも、6本のシグナルが認められただけであって、
環状構造を支持していた。また、イソマルトヘプタオー
スの解析から、該物質の結合様式がα−1、6結合である
こと強く示唆された。次に、該物質の酵素的解析結果を
示す。
【００１５】10. 図2に示したように、1％濃度の該物質
に対してエキソ型デキストラナーゼであるグルコデキス
トラナーゼを40℃で24時間作用させたが、全く水解され
なかった。なお、同条件下でイソマルトヘキサオース及
びイソマルトヘプタオースは、完全に水解された。従っ
て直鎖イソマルトオリゴ糖ではないことを示唆してい
る。
に対してエキソ型デキストラナーゼであるグルコデキス
トラナーゼを40℃で24時間作用させたが、全く水解され
なかった。なお、同条件下でイソマルトヘキサオース及
びイソマルトヘプタオースは、完全に水解された。従っ
て直鎖イソマルトオリゴ糖ではないことを示唆してい
る。
【００１６】11. １％濃度の該物質に対しエンド型デキ
ストラナーゼを作用させたところグルコース及びイソマ
ルトースにまで分解された。従って、これらのオリゴ糖
は、グルコースを唯一の構成糖としており、かつα−
1、6結合のみからなることを示唆している。 以上1.〜11.までの結果より、該物質は、いずれもグル
コース7〜9分子がα−1、6 結合した、環状オリゴ糖で
あると判断された。なお、これら環状イソマルトオリゴ
糖の構造式は、次の通りである。
ストラナーゼを作用させたところグルコース及びイソマ
ルトースにまで分解された。従って、これらのオリゴ糖
は、グルコースを唯一の構成糖としており、かつα−
1、6結合のみからなることを示唆している。 以上1.〜11.までの結果より、該物質は、いずれもグル
コース7〜9分子がα−1、6 結合した、環状オリゴ糖で
あると判断された。なお、これら環状イソマルトオリゴ
糖の構造式は、次の通りである。
【００１７】
【化１】
【００１８】以上詳述した如く、該環状オリゴ糖は、従
来公知の環状オリゴ糖とはその性質を異にし、グルコー
スのα−1、6結合からなる、環状オリゴ糖である点で全
く新しい環状オリゴ糖である。本物質は、環状構造であ
るため、包接作用を有しており、サイクロデキストリン
とは、異なったサイズの物質の安定化、可溶化等に有用
である。そして、具体的には医薬品、食品等の包接剤に
用いられる。
来公知の環状オリゴ糖とはその性質を異にし、グルコー
スのα−1、6結合からなる、環状オリゴ糖である点で全
く新しい環状オリゴ糖である。本物質は、環状構造であ
るため、包接作用を有しており、サイクロデキストリン
とは、異なったサイズの物質の安定化、可溶化等に有用
である。そして、具体的には医薬品、食品等の包接剤に
用いられる。
【００１９】次に、本発明の新規な環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素の酵素化学的性質について述べる。 作用 デキストラン等のα−１、６結合よりなるグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応によりサイクロイソ
マルトオリゴ糖を生成する。
ゴ糖合成酵素の酵素化学的性質について述べる。 作用 デキストラン等のα−１、６結合よりなるグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応によりサイクロイソ
マルトオリゴ糖を生成する。
【００２０】基質特異性 α−１、６結合を主鎖とするデキストランには作用する
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で最も良く作用し、ｐＨ４．５〜８．５
の範囲で安定である。
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で最も良く作用し、ｐＨ４．５〜８．５
の範囲で安定である。
【００２１】以上詳述した如く、本酵素は、公知の環状
オリゴ糖合成酵素であるサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ（以下、ＣＧＴａｓｅと略称す
る。；ＥＣ ２．４．１．１９）、サイクロイヌロオリ
ゴ糖合成酵素（以下、ＩＦＴａｓｅと略称する。）及び
サイクロソフォラオース合成酵素とはその性質を異に
し、デキストランよりグルコースのα−１、６結合から
なる環状オリゴ糖を生成する点で新規な酵素である。
尚、本酵素は、ＣＧＴａｓｅ及びＩＦＴａｓｅと同様に
分子内糖転移反応以外に、分子間糖転移反応により、サ
イクロイソマルトオリゴ糖と適当なＯＨアクセプターか
らＯＨアクセプターが結合したイソマルトオリゴ糖を生
成する反応（カップリング反応）及びイソマルトオリゴ
糖から種々の重合度のイソマルトオリゴ糖を生成する反
応（不均化反応）を触媒する多機能酵素である。
オリゴ糖合成酵素であるサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ（以下、ＣＧＴａｓｅと略称す
る。；ＥＣ ２．４．１．１９）、サイクロイヌロオリ
ゴ糖合成酵素（以下、ＩＦＴａｓｅと略称する。）及び
サイクロソフォラオース合成酵素とはその性質を異に
し、デキストランよりグルコースのα−１、６結合から
なる環状オリゴ糖を生成する点で新規な酵素である。
尚、本酵素は、ＣＧＴａｓｅ及びＩＦＴａｓｅと同様に
分子内糖転移反応以外に、分子間糖転移反応により、サ
イクロイソマルトオリゴ糖と適当なＯＨアクセプターか
らＯＨアクセプターが結合したイソマルトオリゴ糖を生
成する反応（カップリング反応）及びイソマルトオリゴ
糖から種々の重合度のイソマルトオリゴ糖を生成する反
応（不均化反応）を触媒する多機能酵素である。
【００２２】次に、本酵素の製造法について述べる。本
発明において使用される微生物としては、バチルス属に
属し環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を生成するもので
あれば、如何なるものでもよく、例えば、バチルス・エ
スピー．Ｔ−３０４０菌株等が挙げられる。Ｔ−３０４
０株は、土壌中から、スクリーニングして得た野性株で
あり、以下に本菌株の菌学的性質を示す。
発明において使用される微生物としては、バチルス属に
属し環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を生成するもので
あれば、如何なるものでもよく、例えば、バチルス・エ
スピー．Ｔ−３０４０菌株等が挙げられる。Ｔ−３０４
０株は、土壌中から、スクリーニングして得た野性株で
あり、以下に本菌株の菌学的性質を示す。
【００２３】 (1)形態 1.形態 桿菌 2.運動性 認められる 3.胞子 有 胞子嚢 膨出 形 楕円形 位置 中立〜亜端立 4.グラム染色性 ＋ (2)生育状態 1.肉汁寒天平板培養 平滑、色素産生せず 2.肉汁寒天斜面培養 平滑、周辺なめらか、色素産生せず (3)生理学的性質 1.硝酸塩の還元 − 2.脱窒反応 − 3.ＭＲテスト − 4.ＶＰテスト − 5.インド−ルの生成 − 6.硫化水素の生成 − 7.デンプンの加水分解 ＋ 8.クエン酸の利用 − 9.無機窒素源の利用 硝酸塩 − アンモニウム塩 ＋ 10.ウレア−ゼ − 11.オキシダ−ゼ − 21.カタラ−ゼ ＋ 13.生育の範囲 温度 １０〜３７℃ 14.酸素に対する態度 好気的 15.Ｏ−Ｆテスト − 16.糖類に対する態度 酸の生成 ガスの生成 (1)L-アラビノ−ス ＋ − (2)D-キシロ−ス − − (3)D-グルコ−ス ＋ − (4)D-マンノ−ス − − (5)D-フラクト−ス − − (6)D-ガラクト−ス ＋ − (7)麦芽糖 ＋ − (8)ショ糖 ＋ − (9)乳糖 ＋ − (10)トレハロ−ス ＋ − (11)D-ソルビット − − (12)D-マンニット − − (13)イノシット − − (14)グリセリン − − (15)デンプン ＋ − Ｔ−３０４０菌株は、胞子を形成するグラム陽性桿菌で
あることからバチルス属に属する細菌であると同定し
た。更に、種の同定のために、バージェイズ・マニュア
ル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー第２
巻に基づき、種々検討したが、種の確定までには至らな
かったため、バチルス属に属する１菌株として分類同定
し、バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０とした。 な
お、バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０は、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−４１３２とし
て寄託されている。
あることからバチルス属に属する細菌であると同定し
た。更に、種の同定のために、バージェイズ・マニュア
ル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー第２
巻に基づき、種々検討したが、種の確定までには至らな
かったため、バチルス属に属する１菌株として分類同定
し、バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０とした。 な
お、バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０は、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−４１３２とし
て寄託されている。
【００２４】本発明における微生物の培養は、一般微生
物の好気的培養で採用される方法と同じ方法が用いられ
るが、通常は、液体培地による振盪培養法あるいは通気
撹拌培養法等が用いられる。培地としては、例えば、適
当な窒素源（例えば、ペプトン、ポリペプトン、バクト
トリプトン等のカゼイン分解物あるいはソイトン等の大
豆タンパク質分解物等）、炭素源（例えばグルコース、
グリセリン等の糖質類）、そして必要に応じて、酵母エ
キス、リンボフラビン等のビタミン類及びリン酸塩、マ
グネシウム塩、塩化ナトリウム、微量金属等のミネラル
類、そして本物質の原料となるデキストラン等を含んだ
ものが用いられる。ｐＨは、本菌が成育するｐＨ領域で
あればいずれでもよく、通常は、６〜８のｐＨ領域が好
ましい。
物の好気的培養で採用される方法と同じ方法が用いられ
るが、通常は、液体培地による振盪培養法あるいは通気
撹拌培養法等が用いられる。培地としては、例えば、適
当な窒素源（例えば、ペプトン、ポリペプトン、バクト
トリプトン等のカゼイン分解物あるいはソイトン等の大
豆タンパク質分解物等）、炭素源（例えばグルコース、
グリセリン等の糖質類）、そして必要に応じて、酵母エ
キス、リンボフラビン等のビタミン類及びリン酸塩、マ
グネシウム塩、塩化ナトリウム、微量金属等のミネラル
類、そして本物質の原料となるデキストラン等を含んだ
ものが用いられる。ｐＨは、本菌が成育するｐＨ領域で
あればいずれでもよく、通常は、６〜８のｐＨ領域が好
ましい。
【００２５】培養条件は、例えば、通常２０〜４０℃、
好ましくは３０℃で、１６時間〜４日間好ましくは３日
間振盪培養または通気撹拌培養を行なう。以上のように
して得た培養物を用いて例えば、以下に示す酵素精製工
程により該環状オリゴ糖合成酵素を得る。上記培養物か
ら該酵素を分離するには遠心分離、膜濃縮等により除菌
及び濃縮するのみでよく、更に、必要に応じて、通常用
いられる酵素の精製法により上記粗酵素液から精製標品
を得る。
好ましくは３０℃で、１６時間〜４日間好ましくは３日
間振盪培養または通気撹拌培養を行なう。以上のように
して得た培養物を用いて例えば、以下に示す酵素精製工
程により該環状オリゴ糖合成酵素を得る。上記培養物か
ら該酵素を分離するには遠心分離、膜濃縮等により除菌
及び濃縮するのみでよく、更に、必要に応じて、通常用
いられる酵素の精製法により上記粗酵素液から精製標品
を得る。
【００２６】本酵素の精製法は、通常の酵素分離精製方
法であれば如何なる方法でもよく、本製造法の場合、除
菌液を後記実施例に示した精製方法に従って処理するこ
とにより、高純度の環状オリゴ糖合成酵素標品を得るこ
とが出来る。更に、本酵素をデキストランに作用させて
サイクロイソマルトオリゴ糖を製造する。
法であれば如何なる方法でもよく、本製造法の場合、除
菌液を後記実施例に示した精製方法に従って処理するこ
とにより、高純度の環状オリゴ糖合成酵素標品を得るこ
とが出来る。更に、本酵素をデキストランに作用させて
サイクロイソマルトオリゴ糖を製造する。
【００２７】反応条件は、温度１０〜６０℃、好ましく
は４０℃、ｐＨ４．５〜８．０、好ましくは５．０〜
６．５の範囲で、反応時間１０〜７２時間、好ましくは
４８時間行なう。また必要により反応液の撹拌及びメタ
ノール、エタノール等の有機溶媒の反応液への添加を行
なう。なお、本製造法の場合、精製酵素を用いずに、先
に述べた培養液の除菌濃縮液を用いても精製酵素と同等
の効率でサイクロイソマルトオリゴ糖を生成することが
できる。反応液より該オリゴ糖を採取する手段として
は、オリゴ糖精製法であれば如何なる方法でもよい。例
えば、冷却処理、有機溶媒添加処理、活性炭処理、ある
いは特異的に環状オリゴ糖を吸着するカラムクロマトグ
ラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー等の公知方
法を単独もしくは適宜組合わせて分離精製することがで
きる。
は４０℃、ｐＨ４．５〜８．０、好ましくは５．０〜
６．５の範囲で、反応時間１０〜７２時間、好ましくは
４８時間行なう。また必要により反応液の撹拌及びメタ
ノール、エタノール等の有機溶媒の反応液への添加を行
なう。なお、本製造法の場合、精製酵素を用いずに、先
に述べた培養液の除菌濃縮液を用いても精製酵素と同等
の効率でサイクロイソマルトオリゴ糖を生成することが
できる。反応液より該オリゴ糖を採取する手段として
は、オリゴ糖精製法であれば如何なる方法でもよい。例
えば、冷却処理、有機溶媒添加処理、活性炭処理、ある
いは特異的に環状オリゴ糖を吸着するカラムクロマトグ
ラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー等の公知方
法を単独もしくは適宜組合わせて分離精製することがで
きる。
【００２８】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例により限
定されるものではない。 ［実施例１］１％デキストラン４０（名糖産業社製）、
１％ペプトン（極東製薬工業社製）、０.５％ ＮａＣｌ
及び０.１％イーストエキス（ディフコ社製）からなる
液体培地（水道水使用、ｐＨ ７.０)１００ｍｌを５０
０ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間殺
菌処理を行なったものに、バチルス・エスピー．Ｔ−３
０４０菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３２)保存スラント
より１白金耳接種し、３０℃で１日間振盪培養して培養
物を得た。
に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例により限
定されるものではない。 ［実施例１］１％デキストラン４０（名糖産業社製）、
１％ペプトン（極東製薬工業社製）、０.５％ ＮａＣｌ
及び０.１％イーストエキス（ディフコ社製）からなる
液体培地（水道水使用、ｐＨ ７.０)１００ｍｌを５０
０ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間殺
菌処理を行なったものに、バチルス・エスピー．Ｔ−３
０４０菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３２)保存スラント
より１白金耳接種し、３０℃で１日間振盪培養して培養
物を得た。
【００２９】本培養液１０００ｍｌを上記と同様の培地
組成と殺滅菌条件により調製した３００ｌの培地を含有
する５００ｌ容タンクに接種し、３０℃、０.２５ｖｖ
ｍ、７０ｒｐｍの条件で３日間通気撹拌培養を行ない、
培養終了後、培養液３００ｌをマイクローザ（旭化成工
業社製、限外濾過膜、登録商標名）を用いた膜処理によ
り除菌し、得られた除菌液を更に分子量６０００カット
のフォロファイバーにより６．３ｌに迄濃縮した後、濃
縮液を９００ｍｌずつ−２０℃に凍結保存した。
組成と殺滅菌条件により調製した３００ｌの培地を含有
する５００ｌ容タンクに接種し、３０℃、０.２５ｖｖ
ｍ、７０ｒｐｍの条件で３日間通気撹拌培養を行ない、
培養終了後、培養液３００ｌをマイクローザ（旭化成工
業社製、限外濾過膜、登録商標名）を用いた膜処理によ
り除菌し、得られた除菌液を更に分子量６０００カット
のフォロファイバーにより６．３ｌに迄濃縮した後、濃
縮液を９００ｍｌずつ−２０℃に凍結保存した。
【００３０】９００ｍｌの濃縮液を用いて、環状イソマ
ルトオリゴ糖合成酵素の精製を行なった。先ず、本濃縮
液を解凍後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリン酸緩
衝液(ｐＨ７．０)に対して４℃で１晩透析処理を行なっ
た。透析物を遠心分離して不溶物を除去した後、上清液
を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥーセファロースＣＬ６
Ｂカラムにアプライした。同緩衝液で洗浄後、０〜０．
８ＭのＮａＣｌ濃度勾配により吸着蛋白質を溶出した。
集めた活性画分３２０ｍｌに対して、終濃度１．０Ｍに
なるように硫安を加え、遠心分離により不溶物を除去し
た。上清液を以下の操作による分取用ＨＰＬＣで精製し
た。上清液を１．０Ｍ硫安、１０ｍＭＥＤＴＡ含有の１
００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡化したＴＳＫ
ｇｅｌＰｈｅｎｙｌ５ＰＷカラムにアプライし、同緩衝
液で洗浄後、１．０〜０Ｍの硫安濃度勾配により吸着蛋
白質を溶出した。
ルトオリゴ糖合成酵素の精製を行なった。先ず、本濃縮
液を解凍後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリン酸緩
衝液(ｐＨ７．０)に対して４℃で１晩透析処理を行なっ
た。透析物を遠心分離して不溶物を除去した後、上清液
を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥーセファロースＣＬ６
Ｂカラムにアプライした。同緩衝液で洗浄後、０〜０．
８ＭのＮａＣｌ濃度勾配により吸着蛋白質を溶出した。
集めた活性画分３２０ｍｌに対して、終濃度１．０Ｍに
なるように硫安を加え、遠心分離により不溶物を除去し
た。上清液を以下の操作による分取用ＨＰＬＣで精製し
た。上清液を１．０Ｍ硫安、１０ｍＭＥＤＴＡ含有の１
００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡化したＴＳＫ
ｇｅｌＰｈｅｎｙｌ５ＰＷカラムにアプライし、同緩衝
液で洗浄後、１．０〜０Ｍの硫安濃度勾配により吸着蛋
白質を溶出した。
【００３１】集めた活性画分１５０ｍｌに対して、終濃
度１．０Ｍになるように硫安を添加し、遠心分離により
不溶物を除去した。上清液を再度１．０Ｍ硫安、１０ｍ
ＭＥＤＴＡ含有の１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)
で平衡化したＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌ５ＰＷカラムに
アプライし、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液中の硫安濃度
を０．３Ｍ迄下げたステップグラジエントで１度洗浄し
た後、０．３〜０Ｍの硫安濃度勾配により吸着タンパク
質を溶出した。
度１．０Ｍになるように硫安を添加し、遠心分離により
不溶物を除去した。上清液を再度１．０Ｍ硫安、１０ｍ
ＭＥＤＴＡ含有の１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)
で平衡化したＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌ５ＰＷカラムに
アプライし、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液中の硫安濃度
を０．３Ｍ迄下げたステップグラジエントで１度洗浄し
た後、０．３〜０Ｍの硫安濃度勾配により吸着タンパク
質を溶出した。
【００３２】集めた活性画分８８ｍｌを限外濾過で約１
ｍｌに濃縮した後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液(ｐＨ７．０)２０ｍｌを加えて塩濃度を稀釈
した。本溶液を１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリン酸
緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡ
Ｅ５ＰＷカラムにアプライし、同緩衝液で洗浄後、０．
１５ＭのＮａＣｌで１度洗浄した後、０．１５〜０．４
ＭのＮａＣｌ濃度勾配により吸着タンパクを溶出した。
ｍｌに濃縮した後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液(ｐＨ７．０)２０ｍｌを加えて塩濃度を稀釈
した。本溶液を１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリン酸
緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡ
Ｅ５ＰＷカラムにアプライし、同緩衝液で洗浄後、０．
１５ＭのＮａＣｌで１度洗浄した後、０．１５〜０．４
ＭのＮａＣｌ濃度勾配により吸着タンパクを溶出した。
【００３３】集めた活性画分１２ｍｌを０．９ｍｌ迄限
外濃縮した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ含有の１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡
化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、０．３
ｍｌずつ酵素溶液をアプライし、同緩衝液により溶出し
た。本操作を残り０．６ｍｌについて同様に行なった
(０．３ｍｌずつ２回)。得られた活性画分を集めてＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥに供したところ、シングルバンドを示した
ことから、他の夾雑蛋白質は除去されたと判断し精製を
終了させた。
外濃縮した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ含有の１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡
化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、０．３
ｍｌずつ酵素溶液をアプライし、同緩衝液により溶出し
た。本操作を残り０．６ｍｌについて同様に行なった
(０．３ｍｌずつ２回)。得られた活性画分を集めてＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥに供したところ、シングルバンドを示した
ことから、他の夾雑蛋白質は除去されたと判断し精製を
終了させた。
【００３４】この操作により、精製環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素１２ｍｇを得た。そして、本精製酵素の理
化学的性質は前記の通りであった。本精製酵素をデキス
トランとインキュベーションしたところ、デキストラン
から環状イソマルトオリゴ糖の生成が確認された。 ［実施例２］バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０株の培
養液３００ｌをマイクローザを用いた膜処理により除菌
し、得られた除菌液を更に分子量６０００カットのフォ
ロファイバーにより６．３ｌに迄濃縮した後、濃縮液を
９００ｍｌずつ−２０℃に凍結保存した。濃縮液の一部
を、デキストラン（名糖産業社製）１００ｇを１０ｍＭ
リン酸緩衝液(ｐＨ６．５)１０ｌに溶解した水溶液と混
合し、４０℃で４８時間インキュベーションを行なっ
た。活性炭を加えて煮沸することにより反応を停止さ
せ、かつ未反応のデキストランを吸着させた。活性炭を
除去した上清液を脱イオン水で平衡化した活性炭カラム
にアプライし、脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾
配により吸着したオリゴ糖を溶出した。環状オリゴ糖画
分を集め、濃縮した後、脱イオン水で平衡化したＯＤＳ
カラムにアプライした。脱イオン水で洗浄後、エタノー
ル濃度勾配によりオリゴ糖を溶出し、各環状イソマルト
オリゴ糖画分を集め、凍結乾燥した。
ゴ糖合成酵素１２ｍｇを得た。そして、本精製酵素の理
化学的性質は前記の通りであった。本精製酵素をデキス
トランとインキュベーションしたところ、デキストラン
から環状イソマルトオリゴ糖の生成が確認された。 ［実施例２］バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０株の培
養液３００ｌをマイクローザを用いた膜処理により除菌
し、得られた除菌液を更に分子量６０００カットのフォ
ロファイバーにより６．３ｌに迄濃縮した後、濃縮液を
９００ｍｌずつ−２０℃に凍結保存した。濃縮液の一部
を、デキストラン（名糖産業社製）１００ｇを１０ｍＭ
リン酸緩衝液(ｐＨ６．５)１０ｌに溶解した水溶液と混
合し、４０℃で４８時間インキュベーションを行なっ
た。活性炭を加えて煮沸することにより反応を停止さ
せ、かつ未反応のデキストランを吸着させた。活性炭を
除去した上清液を脱イオン水で平衡化した活性炭カラム
にアプライし、脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾
配により吸着したオリゴ糖を溶出した。環状オリゴ糖画
分を集め、濃縮した後、脱イオン水で平衡化したＯＤＳ
カラムにアプライした。脱イオン水で洗浄後、エタノー
ル濃度勾配によりオリゴ糖を溶出し、各環状イソマルト
オリゴ糖画分を集め、凍結乾燥した。
【００３５】得られた環状イソマルトオリゴ糖の重量
は、夫々サイクロイソマルトヘプタオース ２．１ｇ、
サイクロイソマルトオクタオース ４．６ｇ及びサイク
ロイソマルトノナオース １．０ｇであり環状体全体の
収率は、７．７％であった。得られた画分の純度は、Ｈ
ＰＬＣ分析からいずれも９８％以上であり、図３にこれ
らの環状体のＨＰＬＣのプロファイルを示した。
は、夫々サイクロイソマルトヘプタオース ２．１ｇ、
サイクロイソマルトオクタオース ４．６ｇ及びサイク
ロイソマルトノナオース １．０ｇであり環状体全体の
収率は、７．７％であった。得られた画分の純度は、Ｈ
ＰＬＣ分析からいずれも９８％以上であり、図３にこれ
らの環状体のＨＰＬＣのプロファイルを示した。
【００３６】ＨＰＬＣ分析は、ＴＳＫ ｇｅｌ Ａｍｉ
ｄｅ（東ソー社製、分配・吸着クロマトグラフィー用充
填カラム）を用いて行なった。Ａは、サイクロイソマル
トヘプタオース画分、Ｂは、サイクロイソマルトオクタ
オース画分、Ｃは、サイクロイソマルトノナオース画分
及びＡは、スタンダードの分析結果である。
ｄｅ（東ソー社製、分配・吸着クロマトグラフィー用充
填カラム）を用いて行なった。Ａは、サイクロイソマル
トヘプタオース画分、Ｂは、サイクロイソマルトオクタ
オース画分、Ｃは、サイクロイソマルトノナオース画分
及びＡは、スタンダードの分析結果である。
【００３７】
【発明の効果】本発明により、新規な環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素を提供した。そして、この酵素を用いて
サイクロデキストリンとは異なった理化学的性質を有
し、サイクロデキストリンに比べて種々の長所を有する
新規な環状イソマルトオリゴ糖を極めて簡単な操作で高
純度に効率良く製造することができ、本発明は、産業上
極めて有用な発明である。
リゴ糖合成酵素を提供した。そして、この酵素を用いて
サイクロデキストリンとは異なった理化学的性質を有
し、サイクロデキストリンに比べて種々の長所を有する
新規な環状イソマルトオリゴ糖を極めて簡単な操作で高
純度に効率良く製造することができ、本発明は、産業上
極めて有用な発明である。
【図１】三種の環状イソマルトオリゴ糖の赤外線吸収ス
ペクトルを示す図である。
ペクトルを示す図である。
【図２】三種の環状イソマルトオリゴ糖の酵素的解析結
果を示す図である。
果を示す図である。
【図３】三種の環状イソマルトオリゴ糖のＨＰＬＣのプ
ロファイルを示す図である。
ロファイルを示す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する新規な環状
イソマルトオリゴ糖合成酵素。 作用 デキストラン等のα−１、６結合より成るグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応により環状イソマル
トオリゴ糖を生成する。 基質特異性 α−１、６結合を主鎖とするデキストランには作用する
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で作用し、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で
安定である。 - 【請求項２】 バチルス属に属し、請求項１記載の酵素
生産能を有する微生物をデキストラン含有培地に培養
し、培養物より該酵素を採取することを特徴とする新規
な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造法。 - 【請求項３】 デキストランに、請求項１記載の酵素を
作用させ環状イソマルトオリゴ糖を生成せしめることを
特徴とする環状イソマルトオリゴ糖の製造法。 - 【請求項４】 デキストランに、バチルス属に属し請求
項１記載の酵素生産能を有する微生物をデキストラン含
有培地に培養して得られる培養液の除菌混合物を作用さ
せ環状イソマルトオリゴ糖を生成せしめることを特徴と
する環状イソマルトオリゴ糖の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05153456A JP3117328B2 (ja) | 1993-06-24 | 1993-06-24 | 新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 |
| DE69308531T DE69308531T2 (de) | 1992-12-28 | 1993-12-24 | Cycloisomaltooligosaccharide; Enzym und Verfahren zu ihrer Herstellung, und Verfahren zur Herstellung von dem Enzym |
| EP93310579A EP0608636B1 (en) | 1992-12-28 | 1993-12-24 | Cycloisomaltooligosaccharides, an enzyme and process for producing said oligosaccharides, and a process for producing said enzyme |
| US08/174,596 US5364936A (en) | 1992-12-28 | 1993-12-28 | Cycloisomaltooligosaccharides |
| US08/284,318 US5453369A (en) | 1992-12-28 | 1994-08-02 | Enzyme for producing novel cyclooisomaltooligosaccharides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05153456A JP3117328B2 (ja) | 1993-06-24 | 1993-06-24 | 新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078276A true JPH078276A (ja) | 1995-01-13 |
| JP3117328B2 JP3117328B2 (ja) | 2000-12-11 |
Family
ID=15562959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05153456A Expired - Lifetime JP3117328B2 (ja) | 1992-12-28 | 1993-06-24 | 新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3117328B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010023742A1 (ja) * | 2008-08-28 | 2010-03-04 | 株式会社シー・アイ・バイオ | 抗う蝕性組成物の製造方法 |
| JP2012140521A (ja) * | 2010-12-28 | 2012-07-26 | Osaka Prefecture Univ | α−１，３−分枝シクロデキストランの使用方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102120175B1 (ko) * | 2016-07-04 | 2020-06-08 | (주)쿠첸 | 워킹 코일 조립체 |
-
1993
- 1993-06-24 JP JP05153456A patent/JP3117328B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010023742A1 (ja) * | 2008-08-28 | 2010-03-04 | 株式会社シー・アイ・バイオ | 抗う蝕性組成物の製造方法 |
| JP2012140521A (ja) * | 2010-12-28 | 2012-07-26 | Osaka Prefecture Univ | α−１，３−分枝シクロデキストランの使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3117328B2 (ja) | 2000-12-11 |
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