JPH0759562A - フィターゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なフィターゼ及びその製造方法を提供す
る。 【構成】 フィチン酸に対して強く作用し、フルクトー
ス−１，６−二リン酸に対してもフィチン酸のおよそ半
分の強さで作用する新規なフィターゼ、及びノイロスポ
ラ属微生物を使用したその製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ノイロスポラ（Neuros
pora) 属に属する微生物のフィターゼ、及びその製造法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】フィチン酸は、広く穀類中に存在するイ
ノシトールの６リン酸エステルである。フィチン酸は、
現在、食品中で、金属封鎖剤、栄養剤、発酵助成剤、食
品の退色防止剤として用いられている。一方、このフィ
チン酸は、Ｚｎ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｆｅなどと結合し、ミネ
ラルの吸収阻害を起こす（科学同人発行、生化学辞典）
ことが確認されており、Ｚｎ欠乏症やカルシウム不足に
よる骨軟化症などを引き起こすといった報告もある。
（A. S. Prasad「Deficiency of Zn in Man and its To
xicity」, Trace Elements in Human Health and Dise-
ase (Vol. 1)., Academic Press., 1976, ISBN 0-12-56
4201-6, C. M. Berlyne et al 「Osteomatacia due to
Ca Deprivation caused by high phytic acid Concentr
ation of unleavened bread 」, Am. J. Clin. Nutri.
26, 1973) しかしながら、最近、このフィチンの部分分
解物（イノシトールの２から５リン酸エステルカルシウ
ム塩）が、カルシウム吸収促進効果を有するといった報
告が出されている（特開平０４−２７０２９６）。

【０００３】フィターゼを作用させフィチン酸を部分分
解することによって、ミネラルの吸収阻害を防止し、家
畜などの飼料への利用が期待できる。また、上記のフィ
チンの部分分解物の製造や、イノシトールの製造への利
用が期待できる。このように有用な酵素であるフィター
ゼは、酵素自体は古くから知られており、豆（N. C. Ma
ndal, S. Burman and B. B. Biswas, Phytochemistry,
11, 495-502 (1972)) や、小麦（Y. Nagai and S. Funa
hashi, Agric. Biol. Chem., 26,794-803 (1962))など
の植物や微生物に発見されている。

【０００４】また、工業的にフィターゼを得るには、フ
ィターゼを高生産する微生物を選択し、培養によって得
るのが効率よい製造法である。現在までに、フィターゼ
を生産すると報告されている微生物は、アスペルギルス
（Aspergillus)属、ペニシリウム（Penicillium)属、ム
コール（Mucor)属のカビ（T. R. Shieh and J. H. War
e, Applied Microbiology, 16, 1348-1351 (1968)) と
細菌、酵母が知られている。

【０００５】また、ノイロスポラ（Neurospora) 属のカ
ビにおいては、報文（T. R. Shiehand J. H. Ware, App
lied Microbiology, 16, 1348-1351 (1968)) では、液
体培養上清中にフィターゼ活性がないという記述があ
り、フィターゼ活性を示唆する内容としては、別の報文
（L. F. Johnson and M. E. Tate, Ann. N. Y. Acad. S
ci., 165, 526-532 (1969)) で、ノイロスポラ・クラサ
（Neurospora crassa)の液体培養中に栄養源として添加
したフィチン酸が分解することを記述しているのみであ
る。これらのことから、液体培養によってノイロスポラ
属のカビからフィターゼを製造することは未だ完成して
いないことは明らかである。

【０００６】これら微生物の生産するフィターゼは、す
べて液体振とう培養で生産されており、その生産酵素量
は、１ユニットを１分間に、１μmol のリン酸を遊離す
る活性と定義すると、最も多く生産するアスペルギルス
・オリゼ（T. R. Shieh andJ. H. Ware, Applied Micro
biology, 16, 1348-1351 (1968)) で１．６ユニット／m
lの活性を示すのみで、アスペルギルス・フィカム（A.
H. J. Ullah and D.M. Gibson, Prep. Biochem., 17, 6
3-91 (1987))で０．６ユニット／ml、バチルス・ナット
ー（M. Shimizu, Biosci. Biotech. Biochem., 56, 126
6-1269 (1992))で０．１１ユニット／mlの活性と低い生
産性しか示さない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、より
生産性の高い微生物により効率よくフィターゼを製造す
ることができる方法を提供しようとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の問題
点を解決するために、フィターゼを高生産する微生物を
求め、種々の実験を行い鋭意検討した。その結果、特
に、固体培養において、フィターゼの生産量が増大する
ノイロスポラ属の微生物を発見し、そのフィターゼを採
取することにより本発明を完成した。

【０００９】本発明において使用するフィターゼ生産菌
は、従来よくフィターゼ生産に用いられているアスペル
ギルス属のものより強い活性を有し、ノイロスポラ属
（Neurospora) に属する微生物である。このような微生
物であればいずれもこの発明の方法において利用でき、
例えば、財団法人発酵研究所（IFO)に保存されており、
容易に入手することができるノイロスポラ・クラサIFO
6178、ノイロスポラ・シトフィラ IFO 31635、IFO 6069
などを挙げることができる。

【００１０】培養 本発明を実施するに当たっては、上記のノイロスポラ属
に属するフィターゼ生産菌を培地に培養する。培地の栄
養源は、本菌が円滑に生育する限り特に限定するもので
はなく、炭素源としては、グルコース、スクロース、糖
蜜、油脂、穀類などを挙げることができ、また、窒素源
としては、各種ペプトン、大豆粉、コーンステイープリ
カー、酵母エキス、などの同化可能なものを１つあるい
は組み合わせて用いることができる。また、Ｍｇ²⁺，Ｃ
ａ²⁺，Ｎａ⁺ などの塩類や各種ビタミン類、また培養に
即してpH調整剤を培地に添加することができる。

【００１１】本発明において、培養の形態は、例えば固
体培養で、培養温度は通常１５から４５℃、好ましくは
２５から３５℃程度で、１から２０日間、好ましくは２
から１０日間程度培養する。精製方法 ついで、このようにして得られた培養物より水、生理食
塩水、または、緩衝液などを用いて抽出をおこない、固
形分をのぞいて培養抽出液を得る。そして、このように
して得た培養抽出液からフィターゼを単離し、本発明の
フィターゼを得る。まず、培養抽出液からフィターゼを
単離精製するためには、例えば、限外ろ過濃縮、硫安分
画処理、有機溶媒分画処理、イオン交換クロマトグラフ
ィー処理、疎水クロマトグラフィー処理、ゲルろ過処
理、分取ゲル電気泳動処理などのいずれかを必要に応じ
て組み合わせた処理を行い、必要ならば、脱水あるいは
乾燥を行い目的とする酵素を製造する。

【００１２】酵素活性測定法 本発明によって得られた、新規なフィターゼ活性の測定
方法は、以下に示すとおりである。酵素溶液０．２mlを
４５℃で５分間予熱後、０．０５mlの５０mMフィチン酸
ナトリウム（pH５．７）を加え、１５分間反応させた後
に、０．２５ml３０％ＴＣＡを加えて反応を停止させ
る。この液に０．３５ml４％アンモニア、０．５ml７０
％過塩素酸、０．５mlアミドール（２０％亜硫酸水素ナ
トリウム中）、０．２５ml８．６％モリブデン酸アンモ
ニウム（２０％アンモニア中）、２．９mlイオン交換水
を順次添加した後に、室温に１５分間放置後、６５０nm
の吸光度を測定し、活性を求めた。

【００１３】１ユニットは前述の酵素活性測定条件下で
１分間に１μmol 無機リン酸を遊離させる酵素量とす
る。酵素の性質 ノイロスポラ・シトフィラ IFO 31635が生産するフィタ
ーゼの性質は、次のとおりである。

【００１４】（１）至適作用pH 本フィターゼは図１に示すようにpH３．０からpH７．５
の範囲で活性を示し、至適pHは５から６の弱酸性側であ
る。 （２）pH安定性 本フィターゼは図２に示すように５℃、２４時間でpH３
より酸性側及びpH１０よりアルカリ側で失活が起こり、
pH４からpH９の範囲で安定であった。

【００１５】（３）至適作用温度 本フィターゼは図３に示すように３０℃から６５℃の範
囲で活性を示し、至適温度は、約６０℃である。 （４）温度安定性 各温度で３０分間処理したときの残存活性は図４に示す
とおりである。本フィターゼは、５５℃まで安定であ
る。

【００１６】（５）阻害 ２価の金属イオン、阻害剤のフィターゼ活性に及ぼす影
響を、処理後の残存フィターゼ活性を測定して求めた阻
害度によって調べた。５mMのＭｎ²⁺，Ｍｇ²⁺，Ｃａ²⁺，
Ｃｏ²⁺の金属イオンとアジ化ナトリウムには阻害されな
いが、エチレンジアミン四酢酸とＺｎ²⁺には約５０％阻
害され、Ｆｅ²⁺には８５％、Ｈｇ²⁺，Ｃｕ²⁺にはほぼ１
００％阻害される。

【００１７】（６）分子量 ゲルろ過法により求めた分子量は、約６０〜８１kDa で
あった。 （７）基質特異性 本フィターゼの基質特異性は、特に、フィチン酸に対し
て高い活性を示し、また、フルクトース−１，６−二リ
ン酸に対しても活性を示した。そのほかの相対活性は次
のとおりである。

【００１８】 基質（１０mM) 相対活性 フィチン酸 １００ フルクトース−１，６−二リン酸 ４５．３ ｐ−ニトロフェニルリン酸 ２４．０ α−グリセロリン酸 ８．３ β−グリセロリン酸 １３．７ グルコース−６−リン酸 １０．２ グルコース−１−リン酸 ０ ピロリン酸 ６．３ アデノシン５′−三リン酸 ０ 本発明は、フィチン酸から脱リン酸する酵素すなわち本
フィターゼを利用し、イノシトール、イノシトールリン
酸の製造や、フィチン酸のミネラル吸収阻害を防ぐなど
の用途に用いることができる。

【００１９】実験例１．様々なカビの菌株を用いて、ノ
イロスポラ属の株と他の菌株の比較を行った。小麦ふす
ま１０ｇ、脱脂大豆１ｇ、水１０mlを混合後、５００ml
容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間殺菌を行
い、各菌株を植菌した。一週間、２５℃で培養後、１０
０mlの生理食塩水を加え、撹拌後、上清の活性を測定し
た。その結果は、次のようになった。

【００２０】 菌株 フィターゼ活性（ユニット／ml） ノイロスポラ・シトフィラ IFO 31635 1.10 ノイロスポラ・クラサ IFO 6178 0.95 リゾプス・オリゴスポラス NRRL 2710 0.19 リゾプス・オリゼー IFO 4705 0.15 リゾプス・ジャポニカス IFO 4758 0.17 アスペルギルス・ニガー IFO 4417 0.070 アスペルギルス・カワチ BA-9 0.10 アスペルギルス・オリゼー BA-8 0.016 モナスカス・ルーバー IFO 4492 0.013 モナスカス・ビトレウス IFO 4532 0.013 ペニシリウム・ログエフォルティー IFO 5459 0.001 ユーロチウム・ケバレリー IFO 4090 0.012 ユーロチウム・ルブラム IFO 6004 0 ユーロチウム・レペンス IFO 7463 0.002 ボツリヨチア・フケリアナ IFO 30915 0.010 このように、ノイロスポラ属のカビは、大量のフィター
ゼを生産した。

【００２１】実施例１．小麦ふすま９００ｇに脱脂大豆
１００ｇと水１Ｌを加え、１２０℃、２０分間処理を行
い、ノイロスポラ・シトフィラ IFO 31635を植菌した。
２５℃、４日間の培養後、８ｌの水を加え、固形物を取
り除いた。この液には、５９７０ユニットの活性があっ
た。この液を旭化成工業社製ＡＣＬ−１０１０限外膜ろ
過モジュールにより濃縮し、最終的にpH４．５の２０mM
酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液に置換した。この液の活性
は、７３３０ユニットであった。この液を同緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（トーソー社製）に付し
０から１Ｍ ＮａＣｌグラジエント溶出を行ったとこ
ろ、０．１Ｍ ＮａＣｌ濃度近辺で本フィターゼが溶出
された。この液の活性は、３０７０ユニットであった。
この画分に４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを
加え、４０％飽和硫酸アンモニウムを加えた同緩衝液で
平衡化したブチルートヨパール（トーソー社製）に付
し、４０％から０％飽和硫酸アンモニウムのグラジエン
ト溶出を行ったところ、２０％飽和硫酸アンモニウム濃
度近辺で本フィターゼが溶出された。この液の活性は、
２５５０ユニットであった。濃縮後、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌを加えた同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−１
００（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、フィター
ゼ活性画分を得た。この液の活性は、１３７０ユニット
であった。この液を同緩衝液で透析を一晩おこなった後
に、高速液体クロマトグラフィー用カラム、プロテイン
パックＤＥＡＥ ８ＨＲ（ウォーターズ社製）を用い、
０から１Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジエントで分離を行
い活性画分を得た。この液のフィターゼ活性は、１０２
０ユニットであった。濃縮後、D. E. Williamsらの方法
（D. E. Williams and R. A. Reisfeld, Ann. N. Y. A
cad. Sci., 121, 373, 1964)に基づき、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、活性画分を蒸留水で抽出し
た。この液を、蒸留水で透析後、凍結乾燥を行うことに
よって、精製酵素標品を得ることができた。上記精製課
程での比活性（mgタンパク質当たりの活性）、回収率は
それぞれ、１１１ユニット／mg、１１．１％であった。

【００２２】

【発明の効果】固体培養法を用いることと、固体培養法
に向いたノイロスポラ属のカビを用いることによって、
大量のフィターゼを容易に取得することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ノイロスポラ・シトフィラ IFO 31635
が生産するフィターゼの至適作用pHをpH５．５の活性を
１００％とした相対活性として示して有る。

【図２】図２は、同酵素のpH安定域を５℃、２４時間後
の残存活性で示している。

【図３】図３は、同酵素の至適作用温度を、６０℃の活
性を１００％として相対活性で示している。

【図４】図４は、同酵素の温度安定性を残存活性で示し
ている。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の性質： （１）作用：フィチン酸に作用し、そのリン酸基を除去
   する； （２）基質特異性：フィチン酸に対して強く作用し、フ
   ルクトース−１，６−二リン酸に対してもフィチン酸の
   およそ半分の強さで作用する； （３）至適作用pH：pH３．０〜pH７．５の範囲で活性を
   示し、そして、至適pHは、５から６にある； （４）pH安定性：５℃、２４時間でpH３より酸性側及び
   pH１０よりアルカリ側で失活が起こり、pH４からpH９の
   範囲で安定である； （５）至適作用温度：３０℃から６５℃の範囲で活性を
   示し、至適温度は、約６０℃である； （６）温度安定性：３０分間処理したとき、５５℃まで
   安定である； （７）分子量：ゲル濾過法によって測定した分子量は、
   約６０kDa 〜８１kDaである；を有するフィターゼ。
2. 【請求項２】 ノイロスポラ（Neurospora) 属に属する
   微生物により生産される請求項１に記載のフィターゼ。
3. 【請求項３】 ノイロスポラ属に属し、請求項１に記載
   のフィターゼを生産することができる微生物を固体培養
   し、培養物からフィターゼを採取することを特徴とする
   前記フィターゼの製造法。