JPH0757199B2 - 体液中のホスホリパーゼの測定法 - Google Patents
体液中のホスホリパーゼの測定法Info
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- JPH0757199B2 JPH0757199B2 JP3240795A JP24079591A JPH0757199B2 JP H0757199 B2 JPH0757199 B2 JP H0757199B2 JP 3240795 A JP3240795 A JP 3240795A JP 24079591 A JP24079591 A JP 24079591A JP H0757199 B2 JPH0757199 B2 JP H0757199B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
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- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
- G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は体液、特に血清中のホス
ホリパーゼＡを測定する方法に関する。
ホリパーゼＡを測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ホスホリパーゼは種々の生物体内に遍在
的に存在している。ホスホリパーゼはハチ毒及び種々の
ヘビ毒からのものが特に知られている。
的に存在している。ホスホリパーゼはハチ毒及び種々の
ヘビ毒からのものが特に知られている。
【０００３】ホスホリパーゼＡ（ＰＬＡ）の測定は文献
によれば生命を脅やかす種々の病気の診断に利用するこ
とができる。ホスホリパーゼはレシチン分子へのその作
用位置によって分類される。ホスホリパーゼＡは脂肪酸
分子とのエステル結合を分解する。すなわちホスホリパ
ーゼＡ1はα−位をまたホスホリパーゼＡ2はβ−位を分
解する。
によれば生命を脅やかす種々の病気の診断に利用するこ
とができる。ホスホリパーゼはレシチン分子へのその作
用位置によって分類される。ホスホリパーゼＡは脂肪酸
分子とのエステル結合を分解する。すなわちホスホリパ
ーゼＡ1はα−位をまたホスホリパーゼＡ2はβ−位を分
解する。
【０００４】ＰＬＡはヒトの膵臓で大量に形成され、十
二指腸に分泌され、そこで毎日約４ｇの食物レシチン及
び付加的に約１０ｇの生体特有のレシチンを分解する。
膵ＰＬＡは約１３０個のアミノ酸を有する極めて小さな
酵素である。
二指腸に分泌され、そこで毎日約４ｇの食物レシチン及
び付加的に約１０ｇの生体特有のレシチンを分解する。
膵ＰＬＡは約１３０個のアミノ酸を有する極めて小さな
酵素である。
【０００５】他の膵酵素リパーゼ及びアミラーゼが有す
るように、ＰＬＡの臨床関連性に関しては早期に探求さ
れた。異なるＰＬＡ−酵素の危険性（レシチンにＰＬＡ
2が作用することにより２位での脂肪酸の分解下に高毒
性のリゾレシチンが生じる）によって、特に膵炎の重度
を鑑別する可能性が考察される。急性膵炎は比較的無害
の浮腫型又は最も危険な壊死性型として存在可能であ
り、その鑑別診断は臨床的に極めて重要である。ホフマ
ン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）その他は臨床的に保障された診
断と共に約５０の血清に基づき、実際に急性出血性膵炎
の場合ＰＬＡ−酵素活性を介して疾病の重態経過を予知
し得ることを指摘した（“Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．”２３（１９８５））。別の
研究材料によって、他の疾病もＰＬＡの増加を伴って現
われることが次第に明らかになってきた。この場合にも
ＰＬＡ含有量は常にその疾病の重さの指標である。これ
らの疾病としては肺病、ＡＲＤＳ（マクガイア（Ｍａｃ
Ｇｕｉｒｅ）その他、“Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ”
６９（１９８２）、５４３〜５５３）、敗血症（ファダ
ス（Ｖａｄａｓ Ｐ）、“Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅ
ｄ．”１０４（１９８４）、８７３）、アレルギー性シ
ョック、進行性の慢性多発関節炎（プルザンスキ（Ｐｒ
ｕｚａｎｓｋｉ）その他、“Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏ
ｌ．”１２（１９８５）２１１）並びに気管支喘息を例
示することができる。
るように、ＰＬＡの臨床関連性に関しては早期に探求さ
れた。異なるＰＬＡ−酵素の危険性（レシチンにＰＬＡ
2が作用することにより２位での脂肪酸の分解下に高毒
性のリゾレシチンが生じる）によって、特に膵炎の重度
を鑑別する可能性が考察される。急性膵炎は比較的無害
の浮腫型又は最も危険な壊死性型として存在可能であ
り、その鑑別診断は臨床的に極めて重要である。ホフマ
ン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）その他は臨床的に保障された診
断と共に約５０の血清に基づき、実際に急性出血性膵炎
の場合ＰＬＡ−酵素活性を介して疾病の重態経過を予知
し得ることを指摘した（“Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．”２３（１９８５））。別の
研究材料によって、他の疾病もＰＬＡの増加を伴って現
われることが次第に明らかになってきた。この場合にも
ＰＬＡ含有量は常にその疾病の重さの指標である。これ
らの疾病としては肺病、ＡＲＤＳ（マクガイア（Ｍａｃ
Ｇｕｉｒｅ）その他、“Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ”
６９（１９８２）、５４３〜５５３）、敗血症（ファダ
ス（Ｖａｄａｓ Ｐ）、“Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅ
ｄ．”１０４（１９８４）、８７３）、アレルギー性シ
ョック、進行性の慢性多発関節炎（プルザンスキ（Ｐｒ
ｕｚａｎｓｋｉ）その他、“Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏ
ｌ．”１２（１９８５）２１１）並びに気管支喘息を例
示することができる。
【０００６】これらの病型の場合、その原因を膵ＰＬＡ
と結び付けることができないことは容易に推測された。
進行性の慢性多発関節炎を有する患者の滑液からは、ヒ
トの膵ＰＬＡに対する抗血清と免疫学的に反応しないＰ
ＬＡが分離されることは記載されている。ホフマンその
他は、このＰＬＡがヒト血清中でヒトの膵ＰＬＡとは異
なる最適ｐＨを有することを明らかにすることができた
（“Ｄｔ．Ｇｅｓ．Ｆ．Ｋｌｉｎ．Ｃｈｅｍｉｅ ｅ．
Ｖ．”会報５／８７（１９８７）、２２６）。
と結び付けることができないことは容易に推測された。
進行性の慢性多発関節炎を有する患者の滑液からは、ヒ
トの膵ＰＬＡに対する抗血清と免疫学的に反応しないＰ
ＬＡが分離されることは記載されている。ホフマンその
他は、このＰＬＡがヒト血清中でヒトの膵ＰＬＡとは異
なる最適ｐＨを有することを明らかにすることができた
（“Ｄｔ．Ｇｅｓ．Ｆ．Ｋｌｉｎ．Ｃｈｅｍｉｅ ｅ．
Ｖ．”会報５／８７（１９８７）、２２６）。
【０００７】ヒト血清中のＰＬＡに対する最初のテスト
はチーブェ（Ｚｉｅｖｅ）及びフォーゲル（Ｖｏｇｅ
ｌ）によって１９６１年に発表された（“Ｊ．Ｌａｂ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．”５７（１９６１）、５８
６）。これは測定ごとに温度５５℃での１８時間の潜伏
期を必要とする滴定テストであった。その後他のＰＬＡ
−測定法、例えば放射能標識化基質での測定、生じた遊
離脂肪酸の抽出及び測定、蛍光測定等が公表された。し
かしこれらの方法はすべて極端に時間がかかり、煩雑で
あることから、常用的に実施することはできなかった。
はチーブェ（Ｚｉｅｖｅ）及びフォーゲル（Ｖｏｇｅ
ｌ）によって１９６１年に発表された（“Ｊ．Ｌａｂ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．”５７（１９６１）、５８
６）。これは測定ごとに温度５５℃での１８時間の潜伏
期を必要とする滴定テストであった。その後他のＰＬＡ
−測定法、例えば放射能標識化基質での測定、生じた遊
離脂肪酸の抽出及び測定、蛍光測定等が公表された。し
かしこれらの方法はすべて極端に時間がかかり、煩雑で
あることから、常用的に実施することはできなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の課題
は、公知ＰＬＡ−テストの分析上及び装置上の問題点を
回避し、また常用の実験光度計を用いて実施することの
できるＰＬＡ−テストを提供することにある。
は、公知ＰＬＡ−テストの分析上及び装置上の問題点を
回避し、また常用の実験光度計を用いて実施することの
できるＰＬＡ−テストを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この課題は、ホスホリパ
ーゼの、脂肪酸基を有する基質と、化学的に異なる少な
くとも２種の乳化剤、すなわち少なくとも１種の中性乳
化剤及び胆汁酸塩とを含む混合物で体液をインキュベー
トし、基質分解によって生じた遊離脂肪酸の量を公知方
法によって測定することよりなる、体液特に血清中のホ
スホリパーゼＡ（ＰＬＡ）の測定法によって解決され
る。本発明方法にあっては中性乳化剤は親水性又は親油
性であってよい。
ーゼの、脂肪酸基を有する基質と、化学的に異なる少な
くとも２種の乳化剤、すなわち少なくとも１種の中性乳
化剤及び胆汁酸塩とを含む混合物で体液をインキュベー
トし、基質分解によって生じた遊離脂肪酸の量を公知方
法によって測定することよりなる、体液特に血清中のホ
スホリパーゼＡ（ＰＬＡ）の測定法によって解決され
る。本発明方法にあっては中性乳化剤は親水性又は親油
性であってよい。
【００１０】基質としては天然のレシチンを使用するこ
とができるが、この場合すべてのレシチンが等しく良好
に適しているわけではない。すなわちレシチン分子中に
多量の不飽和脂肪酸を含むことが、良好なテスト結果を
得るための前提であると考えられる。本発明の優れた１
実施態様では天然のレシチン基質として大豆からのレシ
チン又はリポイド（Ｌｉｐｏｉｄ）Ｓ２０を使用する。
とができるが、この場合すべてのレシチンが等しく良好
に適しているわけではない。すなわちレシチン分子中に
多量の不飽和脂肪酸を含むことが、良好なテスト結果を
得るための前提であると考えられる。本発明の優れた１
実施態様では天然のレシチン基質として大豆からのレシ
チン又はリポイド（Ｌｉｐｏｉｄ）Ｓ２０を使用する。
【００１１】天然のレシチン以外に一般式：
【００１２】
【化２】
【００１３】［式中Ｒ1及びＲ2は炭素原子数２０までの
アルキル基又は炭素原子数２０までのカルボニル基を表
し、この場合双方の基の少なくとも一方はカルボニル基
であることを前提とし、Ｒ3は−ＳＯ3Ｈを表す］に相応
する合成基質を使用することもできる。
アルキル基又は炭素原子数２０までのカルボニル基を表
し、この場合双方の基の少なくとも一方はカルボニル基
であることを前提とし、Ｒ3は−ＳＯ3Ｈを表す］に相応
する合成基質を使用することもできる。
【００１４】本発明の優れた１実施態様では第１乳化剤
としてアルキルグルコシド、ポリエーテル、ＤＭＳＯ又
はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（登録商標）
（アルキルフェニルポリエチレングリコール）を使用す
る。第２乳化剤としては胆汁酸塩、有利にはタウロデオ
キシコール酸塩又はデオキシコール酸塩を使用する。タ
ウロデオキシコール酸塩をオクチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド、ポリオキシエチレンエーテル、ＤＭＳＯ又は
トリトンＸ−１００と組み合わせて使用するのが特に有
利である。
としてアルキルグルコシド、ポリエーテル、ＤＭＳＯ又
はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（登録商標）
（アルキルフェニルポリエチレングリコール）を使用す
る。第２乳化剤としては胆汁酸塩、有利にはタウロデオ
キシコール酸塩又はデオキシコール酸塩を使用する。タ
ウロデオキシコール酸塩をオクチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド、ポリオキシエチレンエーテル、ＤＭＳＯ又は
トリトンＸ−１００と組み合わせて使用するのが特に有
利である。
【００１５】本発明方法では凍結乾燥した基質を使用す
ることまたこれを緩衝液、特にＨＥＰＥＳ−緩衝液に溶
解することが有利である。これにより標定した量の基質
を使用することが容易になり、この場合量の測定は特に
容易である。
ることまたこれを緩衝液、特にＨＥＰＥＳ−緩衝液に溶
解することが有利である。これにより標定した量の基質
を使用することが容易になり、この場合量の測定は特に
容易である。
【００１６】生じた遊離脂肪酸の測定は基本的には種々
の様式で行うことができる。すなわち基本的に遊離酸を
補酵素Ａ及びＡＴＰの存在でアシル−ＣｏＡ−合成酵素
によってアシル−ＣｏＡ、ＡＭＰ及びピロリン酸塩に変
え、生じた各成分の１つを検出することによって行う。
この場合アシル−ＣｏＡに関する測定は、アシル−Ｃｏ
Ａをアシル−ＣｏＡ−オキシダーゼによって酸素の存在
で２，３−トランスエノイル−ＣｏＡ及びＨ2Ｏ2に変
え、生じたＨ2Ｏ2を発色反応を介してペルオキシダーゼ
の存在で検出することが考えられる。別の可能性は生じ
たピロリン酸塩（ＰＰｉ）に関する測定である。この場
合ＰＰｉを一連の酵素触媒反応によってグルコナート−
６−ホスフェートに変える。本発明方法にとって有利な
もう１つの可能性は生じたＡＭＰに関する測定である。
この場合ＡＭＰをＡＴＰの存在でミオキナーゼによって
ＡＤＰに変え、これを更にホスホエノールピルビン酸塩
の存在でピルビン酸キナーゼによりＡＴＰ及びピルビン
酸塩に変え、次いで生じたピルビン酸塩をＮＡＤＨの存
在で乳酸デヒドロゲナーゼにより乳酸塩とＮＡＤに変え
る。測定はＰＬＡ−含有体液を、基質及び各乳化剤含有
混合物（これは有利には同時にＡＭＰを乳酸塩に更に変
換させる試薬をも含む）に加えることによりその吸光度
の変化を測定することによって行う。既知量のＰＬＡで
作成された較正曲線と比較して、体液中の濃度を測定す
ることができる。
の様式で行うことができる。すなわち基本的に遊離酸を
補酵素Ａ及びＡＴＰの存在でアシル−ＣｏＡ−合成酵素
によってアシル−ＣｏＡ、ＡＭＰ及びピロリン酸塩に変
え、生じた各成分の１つを検出することによって行う。
この場合アシル−ＣｏＡに関する測定は、アシル−Ｃｏ
Ａをアシル−ＣｏＡ−オキシダーゼによって酸素の存在
で２，３−トランスエノイル−ＣｏＡ及びＨ2Ｏ2に変
え、生じたＨ2Ｏ2を発色反応を介してペルオキシダーゼ
の存在で検出することが考えられる。別の可能性は生じ
たピロリン酸塩（ＰＰｉ）に関する測定である。この場
合ＰＰｉを一連の酵素触媒反応によってグルコナート−
６−ホスフェートに変える。本発明方法にとって有利な
もう１つの可能性は生じたＡＭＰに関する測定である。
この場合ＡＭＰをＡＴＰの存在でミオキナーゼによって
ＡＤＰに変え、これを更にホスホエノールピルビン酸塩
の存在でピルビン酸キナーゼによりＡＴＰ及びピルビン
酸塩に変え、次いで生じたピルビン酸塩をＮＡＤＨの存
在で乳酸デヒドロゲナーゼにより乳酸塩とＮＡＤに変え
る。測定はＰＬＡ−含有体液を、基質及び各乳化剤含有
混合物（これは有利には同時にＡＭＰを乳酸塩に更に変
換させる試薬をも含む）に加えることによりその吸光度
の変化を測定することによって行う。既知量のＰＬＡで
作成された較正曲線と比較して、体液中の濃度を測定す
ることができる。
【００１７】本発明の他の有利な１実施態様では生じた
脂肪酸の測定をＴＲＡ−緩衝液の存在で実施する。
脂肪酸の測定をＴＲＡ−緩衝液の存在で実施する。
【００１８】操作を一層容易にするには、テストを実施
するに当って、発色を妨げない明るい系を使用するのが
有利である。この方法の特に優れた１実施態様ではトリ
トンＸ−１００を加えるが、この場合トリトンＸ−１０
０は乳化剤としてすでに使用されていないことを前提と
する。
するに当って、発色を妨げない明るい系を使用するのが
有利である。この方法の特に優れた１実施態様ではトリ
トンＸ−１００を加えるが、この場合トリトンＸ−１０
０は乳化剤としてすでに使用されていないことを前提と
する。
【００１９】本発明方法により、容易にまた常用的に被
検液中のＰＬＡ量を測定することができる。特にこの方
法は臨床実験での使用を極めて容易にする自動分析法で
容易に実施することを可能とする。
検液中のＰＬＡ量を測定することができる。特にこの方
法は臨床実験での使用を極めて容易にする自動分析法で
容易に実施することを可能とする。
【００２０】
【実施例】本発明を以下に記載する実施例により更に詳
述する。
述する。
【００２１】略号： ＴＲＡ：トリエタノールアミン−塩酸塩 ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド ＴＤＣｈ：タウロデオキシコール酸塩 ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸塩 ＰＫ：ピルビン酸キナーゼ ＬＤＨ：乳酸デヒドロゲナーゼ ＡＣＳ：アシル補酵素Ａ−合成酵素 ＮａＤＣｈ：デオキシコール酸ナトリウム。
【００２２】例 １エマルジョンの製造 乳化剤 例１.１：オクチルグルコシド 大豆からのレシチン３５ｍｇをＨＥＰＥＳ−緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．９、１００ｍモル／ｌ）４．２５ｍｌ、ＴＤＣ
ｈ−溶液（１２０ｍモル／ｌ）０．２５０ｍｌ、Ｃａ2+
−及びＭｇ2+−イオンの溶液（２００又は４００ｍモル
／ｌ）０．２５０ｍｌ並びにオクチルグルコシド溶液
（１００ｍモル／ｌ）０．２５０ｍｌと一緒に約２時間
撹拌する。引続きエマルジョン２＋１をオクチルグルコ
シド溶液で希釈する。
Ｈ＝７．９、１００ｍモル／ｌ）４．２５ｍｌ、ＴＤＣ
ｈ−溶液（１２０ｍモル／ｌ）０．２５０ｍｌ、Ｃａ2+
−及びＭｇ2+−イオンの溶液（２００又は４００ｍモル
／ｌ）０．２５０ｍｌ並びにオクチルグルコシド溶液
（１００ｍモル／ｌ）０．２５０ｍｌと一緒に約２時間
撹拌する。引続きエマルジョン２＋１をオクチルグルコ
シド溶液で希釈する。
【００２３】エマルジョンの吸光度を空気に対し３６５
ｎｍで測定する。これは１．４５６である。
ｎｍで測定する。これは１．４５６である。
【００２４】試験バッチ 測定は３７℃で実施する。測定は空気に対し３６５ｎｍ
の波長で行う。上記溶液７５０μｌにＣｏＡ−溶液（９
０ｍモル／ｌ）２５μｌ、補酵素溶液（ＡＴＰ：１４５
ｍモル／ｌ、ＰＥＰ：５５ｍモル／ｌ、ＮＡＤＨ：９．
４ｍモル／ｌ）７５μｌ並びに酵素溶液（ミオキナー
ゼ：１６５ｋＵ／ｌ、ＬＤＨ：３７７ｋＵ／ｌ、ＰＫ：
１４１ｋＵ／ｌ、ＡＣＳ：５．６ｋＵ／ｌ）５０μｌを
加える。試料としてＰＬＡ−含有ヒト血清５０μｌを使
用する。
の波長で行う。上記溶液７５０μｌにＣｏＡ−溶液（９
０ｍモル／ｌ）２５μｌ、補酵素溶液（ＡＴＰ：１４５
ｍモル／ｌ、ＰＥＰ：５５ｍモル／ｌ、ＮＡＤＨ：９．
４ｍモル／ｌ）７５μｌ並びに酵素溶液（ミオキナー
ゼ：１６５ｋＵ／ｌ、ＬＤＨ：３７７ｋＵ／ｌ、ＰＫ：
１４１ｋＵ／ｌ、ＡＣＳ：５．６ｋＵ／ｌ）５０μｌを
加える。試料としてＰＬＡ−含有ヒト血清５０μｌを使
用する。
【００２５】例１.２：ブリッジ（Ｂｒｉｊ）３５（登
録商標）（ポリエチレングリコールドデシルエーテル） レシチン３５ｍｇにタウロデオキシコール酸塩−溶液
０．２５０ｍｌ及びＨＥＰＥＳ−緩衝液（ｐＨ＝７．
９、１００ｍモル／ｌ）４．５ｍｌを加え、僅かに加熱
しながら撹拌する。３０分後Ｃａ2+−及びＭｇ2+−イオ
ンの溶液（２００ｍモル／ｌ又は４００ｍモル／ｌ）
０．２５０ｍｌ並びにブリッジ３５−溶液（２００ｇ／
ｌ）０．２５０ｍｌを加える。引続きエマルジョンをＨ
ＥＰＥＳ−緩衝液で希釈する（エマルジョン２部、緩衝
液１部）。
録商標）（ポリエチレングリコールドデシルエーテル） レシチン３５ｍｇにタウロデオキシコール酸塩−溶液
０．２５０ｍｌ及びＨＥＰＥＳ−緩衝液（ｐＨ＝７．
９、１００ｍモル／ｌ）４．５ｍｌを加え、僅かに加熱
しながら撹拌する。３０分後Ｃａ2+−及びＭｇ2+−イオ
ンの溶液（２００ｍモル／ｌ又は４００ｍモル／ｌ）
０．２５０ｍｌ並びにブリッジ３５−溶液（２００ｇ／
ｌ）０．２５０ｍｌを加える。引続きエマルジョンをＨ
ＥＰＥＳ−緩衝液で希釈する（エマルジョン２部、緩衝
液１部）。
【００２６】エマルジョンの吸光度は空気に対し３６５
ｎｍで２．２４３である。
ｎｍで２．２４３である。
【００２７】試験バッチは例１.１に示したようにして
実施する。
実施する。
【００２８】例１.３：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ） レシチン３５ｍｇをＨＥＰＥＳ−緩衝液（ｐＨ７．９、
１００ｍモル／ｌ）４．５ｍｌ及びタウロデオキシコー
ル酸塩０．２５０ｍｌと撹拌し、引続きＣａ2+−及びＭ
ｇ2+−イオンの溶液（２００ｍモル／ｌ又は４００ｍモ
ル／ｌ）０．２５０ｍｌを加える。引続きこのエマルジ
ョンにＤＭＳＯ−溶液２μｌを加える（エマルジョン中
の濃度：５ｍモル／ｌ）。エマルジョンの吸光度は空気
に対し３６５ｎｍで２．５７３である。エマルジョン２
ｍｌにＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２００ｍモル／ｌ、ＭｇＣ
ｌ2・６Ｈ2Ｏ ４００ｍモル／ｌ及びトリトンＸ−１０
０２００ｍモル／ｌの溶液０．１００ｍｌを加える。エ
マルジョンの吸光度は空気に対し３６５ｎｍで１．３２
０である。
Ｏ） レシチン３５ｍｇをＨＥＰＥＳ−緩衝液（ｐＨ７．９、
１００ｍモル／ｌ）４．５ｍｌ及びタウロデオキシコー
ル酸塩０．２５０ｍｌと撹拌し、引続きＣａ2+−及びＭ
ｇ2+−イオンの溶液（２００ｍモル／ｌ又は４００ｍモ
ル／ｌ）０．２５０ｍｌを加える。引続きこのエマルジ
ョンにＤＭＳＯ−溶液２μｌを加える（エマルジョン中
の濃度：５ｍモル／ｌ）。エマルジョンの吸光度は空気
に対し３６５ｎｍで２．５７３である。エマルジョン２
ｍｌにＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２００ｍモル／ｌ、ＭｇＣ
ｌ2・６Ｈ2Ｏ ４００ｍモル／ｌ及びトリトンＸ−１０
０２００ｍモル／ｌの溶液０．１００ｍｌを加える。エ
マルジョンの吸光度は空気に対し３６５ｎｍで１．３２
０である。
【００２９】試験バッチは例１.１に示したようにして
実施する。
実施する。
【００３０】例 ２ＰＬＡ−基質 例２.１： ＰＬＡ−基質：
【００３１】
【化３】
【００３２】エマルジョンの製造：ＰＬＡ−基質にＴＲ
ＩＳ／ＨＣｌ １２５ｍモル／ｌ、ＣａＣｌ2 ４ｍモ
ル／ｌ、マンニット５０ｍモル／ｌ、ＮａＤＣｈ １ｍ
モル／ｌ及びトリトンＸ−１００ ４ｍモル／ｌの溶液
１.５ｍｌを加える。基質濃度は１７ｍモル／ｌであ
る。エマルジョンを電磁撹拌器で室温で１時間撹拌す
る。エマルジョンの吸光度は空気に対し３６５ｎｍで測
定する。これは１．８５１である。
ＩＳ／ＨＣｌ １２５ｍモル／ｌ、ＣａＣｌ2 ４ｍモ
ル／ｌ、マンニット５０ｍモル／ｌ、ＮａＤＣｈ １ｍ
モル／ｌ及びトリトンＸ−１００ ４ｍモル／ｌの溶液
１.５ｍｌを加える。基質濃度は１７ｍモル／ｌであ
る。エマルジョンを電磁撹拌器で室温で１時間撹拌す
る。エマルジョンの吸光度は空気に対し３６５ｎｍで測
定する。これは１．８５１である。
【００３３】試験バッチ： ａ） インキュベーションバッチ：上記のエマルジョン
２５０μｌを試料５０μｌとインキュベートする。５分
後又は２０分後それぞれ５０μｌを取り出し、ストップ
溶液５０μｌにピペットで加える。インキュベートは３
７℃で行う。
２５０μｌを試料５０μｌとインキュベートする。５分
後又は２０分後それぞれ５０μｌを取り出し、ストップ
溶液５０μｌにピペットで加える。インキュベートは３
７℃で行う。
【００３４】ｂ） 測定バッチ：波長：空気に対し５４
６ｎｍ、温度：３７℃。
６ｎｍ、温度：３７℃。
【００３５】試薬溶液Ａ（ＡＴＰ、アシル−ＣｏＡ−合
成酵素、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダー
ゼ、４−アミノアンチピリン）１０００μｌに試料１０
０μｌを加える。１０分後これに試薬溶液Ｂ（Ｎ−エチ
ルマレインイミド、アシル−ＣｏＡ−オキシダーゼ）５
０μｌを加える。更に１０分後その吸光度を測定する。
その差からＰＬＡ−活性が得られる。
成酵素、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダー
ゼ、４−アミノアンチピリン）１０００μｌに試料１０
０μｌを加える。１０分後これに試薬溶液Ｂ（Ｎ−エチ
ルマレインイミド、アシル−ＣｏＡ−オキシダーゼ）５
０μｌを加える。更に１０分後その吸光度を測定する。
その差からＰＬＡ−活性が得られる。
【００３６】この基質ではＰＬＡ−ヒト血清中でのＰＬ
Ａ−活性（１３０％）を、基質として大豆レシチンを用
いた場合に比べて極めて良好に再発見することができ
る。ブタ膵臓ＰＬＡの再発見は５２．９％である。
Ａ−活性（１３０％）を、基質として大豆レシチンを用
いた場合に比べて極めて良好に再発見することができ
る。ブタ膵臓ＰＬＡの再発見は５２．９％である。
【００３７】例２．２.１ トリエタノールアミン−緩衝液の存在での測定 例２.１に記載したようにして製造したエマルジョンを
凍結乾燥し、付加的にＡＣＳ２．１６ｍｇ、ＣｏＡ４．
３４ｍｇ及びＡＴＰ２０．８２ｍｇを含む（５ｍｌ中
に）トリエタノールアミン−緩衝液（１００ｍモル／
ｌ、ｐＨ７．８）５．０ｍｌに溶かす。
凍結乾燥し、付加的にＡＣＳ２．１６ｍｇ、ＣｏＡ４．
３４ｍｇ及びＡＴＰ２０．８２ｍｇを含む（５ｍｌ中
に）トリエタノールアミン−緩衝液（１００ｍモル／
ｌ、ｐＨ７．８）５．０ｍｌに溶かす。
【００３８】この溶液５００μｌに試料溶液１００μｌ
を加え、３７℃で５分間インキュベートする。引続きこ
の溶液２００μｌを試薬溶液Ａ（ＰＯＤ、４−アミノア
ンチピリン）１ｍｌ、溶液Ｂ（Ｎ−エチルマレインイミ
ド、アシル−ＣｏＡ−オキシダーゼ）５０μｌ及びトリ
トンＸ１００の０．５％溶液５００μｌに加える。吸光
度を１０分後に空気に対し３６５ｎｍで測定する。２０
分後新たに吸光度を測定し、各吸光度の差からＰＬＡ−
活性を確認する。
を加え、３７℃で５分間インキュベートする。引続きこ
の溶液２００μｌを試薬溶液Ａ（ＰＯＤ、４−アミノア
ンチピリン）１ｍｌ、溶液Ｂ（Ｎ−エチルマレインイミ
ド、アシル−ＣｏＡ−オキシダーゼ）５０μｌ及びトリ
トンＸ１００の０．５％溶液５００μｌに加える。吸光
度を１０分後に空気に対し３６５ｎｍで測定する。２０
分後新たに吸光度を測定し、各吸光度の差からＰＬＡ−
活性を確認する。
【００３９】例２.２ ＰＬＡ−基質
【００４０】
【化４】
【００４１】エマルジョンの製造： ａ） 例１に記載したと同様に行う。エマルジョンの吸
光度は空気に対し３６５ｎｍで２．０８２である。
光度は空気に対し３６５ｎｍで２．０８２である。
【００４２】ｂ） 上記の基質（最終濃度：１２ｍモル
／ｌ）にＨＥＰＥＳ−緩衝液（１００ｍモル／ｌ、ｐＨ
＝７．９）１．３５ｍｌを加え、引続きこれにタウロデ
オキシコール酸塩溶液（１２０ｍモル／ｌ）０．０７５
ｍｌを加える。軽く加熱しながら電磁撹拌器で３０分間
撹拌する。このエマルジョンにＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２
００ｍモル／ｌ、トリトンＸ−１００ ２００ｍモル／
ｌ及びＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ４００ｍモル／ｌの溶液
０．０７５ｍｌを加える。空気に対し３６５ｎｍで吸光
度０．２２２の澄明なエマルジョンが得られる。
／ｌ）にＨＥＰＥＳ−緩衝液（１００ｍモル／ｌ、ｐＨ
＝７．９）１．３５ｍｌを加え、引続きこれにタウロデ
オキシコール酸塩溶液（１２０ｍモル／ｌ）０．０７５
ｍｌを加える。軽く加熱しながら電磁撹拌器で３０分間
撹拌する。このエマルジョンにＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２
００ｍモル／ｌ、トリトンＸ−１００ ２００ｍモル／
ｌ及びＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ４００ｍモル／ｌの溶液
０．０７５ｍｌを加える。空気に対し３６５ｎｍで吸光
度０．２２２の澄明なエマルジョンが得られる。
【００４３】試験バッチ：例１に記載したと同様。この
基質はブタ膵臓−ＰＬＡ及び血清−ＰＬＡを検出するの
に適している。ブタ膵臓−ＰＬＡはヒト血清−ＰＬＡよ
りも少なく再発見される。
基質はブタ膵臓−ＰＬＡ及び血清−ＰＬＡを検出するの
に適している。ブタ膵臓−ＰＬＡはヒト血清−ＰＬＡよ
りも少なく再発見される。
【００４４】例２.３ ＰＬＡ−基質：
【００４５】
【化５】
【００４６】エマルジョンの製造： ａ） 例１に記載したと同様。エマルジョンの吸光度は
０．６０５である。
０．６０５である。
【００４７】ｂ） 例２のｂ）に記載したと同様。基質
濃度は双方の場合において１２ｍモル／ｌである。
濃度は双方の場合において１２ｍモル／ｌである。
【００４８】試験バッチ：例１に記載したと同様。
【００４９】この基質はブタ膵臓−ＰＬＡ及びヒト血清
−ＰＬＡを検出するのに適しており、この場合ブタ膵臓
−ＰＬＡは血清−ＰＬＡよりも少なく再発見される。
−ＰＬＡを検出するのに適しており、この場合ブタ膵臓
−ＰＬＡは血清−ＰＬＡよりも少なく再発見される。
【００５０】例２.４ ＰＬＡ−基質：
【００５１】
【化６】
【００５２】エマルジョンの製造：例１に記載したと同
様。
様。
【００５３】試験バッチ：例１に記載したと同様。
【００５４】この基質はＰＬＡ−基質として適してい
る。
る。
【００５５】例 ３レシチン 次のレシチンをＰＬＡ−基質としてのその適性に関し検
査した： −大豆からのレシチン、ロス（Ｒｏｔｈ）９８１２ −卵からのレシチン、メルク（Ｍｅｒｃｋ）５３３１ −脳からのレシチン、ロス（Ｒｏｔｈ）５９５７ −卵黄からのレシチン、セルバ（Ｓｅｒｖａ）２７６０
８ −リポイドＳ２０。
査した： −大豆からのレシチン、ロス（Ｒｏｔｈ）９８１２ −卵からのレシチン、メルク（Ｍｅｒｃｋ）５３３１ −脳からのレシチン、ロス（Ｒｏｔｈ）５９５７ −卵黄からのレシチン、セルバ（Ｓｅｒｖａ）２７６０
８ −リポイドＳ２０。
【００５６】エマルジョンの製造： レシチン３５ｍｇにＨＥＰＥＳ−緩衝液（１００ｍモル
／ｌ、ｐＨ＝７．９）４．５ｍｌ及びタウロデオキシコ
ール酸塩溶液（１２０ｍモル／ｌ）０．２５０ｍｌを加
え、軽く加熱しながら撹拌する。レシチンを乳濁させた
後（８０〜１１０分後）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２００
ｍモル／ｌ、トリトンＸ−１００ ２００ｍモル／ｌ及
びＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ４００ｍモル／ｌの溶液０．２
５０ｍｌを加える。
／ｌ、ｐＨ＝７．９）４．５ｍｌ及びタウロデオキシコ
ール酸塩溶液（１２０ｍモル／ｌ）０．２５０ｍｌを加
え、軽く加熱しながら撹拌する。レシチンを乳濁させた
後（８０〜１１０分後）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２００
ｍモル／ｌ、トリトンＸ−１００ ２００ｍモル／ｌ及
びＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ４００ｍモル／ｌの溶液０．２
５０ｍｌを加える。
【００５７】試験バッチ： 測定を３７℃で実施する。空気に対し３６５ｎｍの波長
で測定する。上記エマルジョンそれぞれ７５０μｌにＣ
ｏＡ−溶液（９０ｍモル／ｌ）２５μｌ、補酵素溶液
（ＡＴＰ：１４５ｍモル／ｌ、ＰＥＰ：５５ｍモル／
ｌ、ＮＡＤＨ：９．４ｍモル／ｌ）７５μｌ並びに酵素
溶液（ミオキナーゼ：１６５ｋＵ／ｌ、ＬＤＨ：３７７
ｋＵ／ｌ、ＰＫ：１４１ｋＵ／ｌ、ＡＣＳ：５．６ｋＵ
／ｌ）５０μｌを加える。試料としてはＰＬＡ−含有ヒ
ト血清５０μｌを使用する。
で測定する。上記エマルジョンそれぞれ７５０μｌにＣ
ｏＡ−溶液（９０ｍモル／ｌ）２５μｌ、補酵素溶液
（ＡＴＰ：１４５ｍモル／ｌ、ＰＥＰ：５５ｍモル／
ｌ、ＮＡＤＨ：９．４ｍモル／ｌ）７５μｌ並びに酵素
溶液（ミオキナーゼ：１６５ｋＵ／ｌ、ＬＤＨ：３７７
ｋＵ／ｌ、ＰＫ：１４１ｋＵ／ｌ、ＡＣＳ：５．６ｋＵ
／ｌ）５０μｌを加える。試料としてはＰＬＡ−含有ヒ
ト血清５０μｌを使用する。
【００５８】上記レシチンのうち次の２種を適当なもの
として指摘することができる：大豆からのレシチン（ロ
ス９８１２）及びリポイドＳ２０。他のレシチンでは上
記試験バッチで血清中のＰＬＡ−活性は検出できなかっ
た。
として指摘することができる：大豆からのレシチン（ロ
ス９８１２）及びリポイドＳ２０。他のレシチンでは上
記試験バッチで血清中のＰＬＡ−活性は検出できなかっ
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グトルン シュミット ドイツ連邦共和国 ベルンリート アイヒ ェンシュトラーセ ４ (72)発明者 マルティナ ユニウス−コーマー ドイツ連邦共和国 イッフェルドルフ ア ム ボーデンバッハ ５ (56)参考文献 特開 平２−3662（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開337005（ＥＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ホスホリパーゼに対する、脂肪酸基を有
する基質と、化学的に異なる種類の少なくとも２種の乳
化剤、すなわち少なくとも１種の中性乳化剤及び胆汁酸
塩とを含む混合物で体液をインキュベートし、基質分解
によって生じた遊離脂肪酸の量を公知方法により測定す
ることを特徴とする、体液中のホスホリパーゼＡの測定
法。 - 【請求項２】 一般式： 【化１】 ［式中Ｒ1及びＲ2は炭素原子数２０までのアルキル基又
は炭素原子数２０までのカルボニル基を表し、この場合
双方の基の少なくとも一方はカルボニル基であることを
前提とし、Ｒ3は−ＳＯ3Ｈを表す］に相応する合成基質
を使用する、請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4029845.0 | 1990-09-20 | ||
| DE4029845A DE4029845A1 (de) | 1990-09-20 | 1990-09-20 | Verfahren zur bestimmung von phospholipase in koerperfluessigkeiten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04248996A JPH04248996A (ja) | 1992-09-04 |
| JPH0757199B2 true JPH0757199B2 (ja) | 1995-06-21 |
Family
ID=6414643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3240795A Expired - Fee Related JPH0757199B2 (ja) | 1990-09-20 | 1991-09-20 | 体液中のホスホリパーゼの測定法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5244789A (ja) |
| EP (1) | EP0476669B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0757199B2 (ja) |
| AT (1) | ATE122101T1 (ja) |
| DE (2) | DE4029845A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5767249A (en) * | 1994-06-20 | 1998-06-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoclonal antibodies against type I phospholipase A2 as a diagnostic and anti-inflammatory therapeutic agent |
| WO1999033791A1 (fr) * | 1997-12-26 | 1999-07-08 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Derives aliphatiques |
| CN114047150B (zh) * | 2021-11-11 | 2022-07-26 | 浙江伊利康生物技术有限公司 | 一种脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂、制备方法及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3516001A1 (de) * | 1985-05-03 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Lipasefarbtest |
| DE3807123A1 (de) * | 1988-03-04 | 1989-09-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Substrate fuer phospholipasen |
| JP2711332B2 (ja) * | 1988-04-15 | 1998-02-10 | 株式会社ヤトロン | 非水溶性物質の透明な水溶液が得られる凍結乾燥品の製造方法 |
| US5248598A (en) * | 1989-05-25 | 1993-09-28 | Ivan E. Modrovich | Lipase single reagent system |
-
1990
- 1990-09-20 DE DE4029845A patent/DE4029845A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-09-09 US US07/756,712 patent/US5244789A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-19 AT AT91115973T patent/ATE122101T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-19 EP EP91115973A patent/EP0476669B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-19 DE DE59105372T patent/DE59105372D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-20 JP JP3240795A patent/JPH0757199B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5244789A (en) | 1993-09-14 |
| EP0476669B1 (de) | 1995-05-03 |
| ATE122101T1 (de) | 1995-05-15 |
| JPH04248996A (ja) | 1992-09-04 |
| DE59105372D1 (de) | 1995-06-08 |
| EP0476669A1 (de) | 1992-03-25 |
| DE4029845A1 (de) | 1992-03-26 |
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