JPH04248996A - 体液中のホスホリパーゼの測定法 - Google Patents
体液中のホスホリパーゼの測定法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- G—PHYSICS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は体液、特に血清中のホス
ホリパーゼAを測定する方法に関する。
ホリパーゼAを測定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】ホスホリパーゼは種々の生物体内に遍在
的に存在している。ホスホリパーゼはハチ毒及び種々の
ヘビ毒からのものが特に知られている。
的に存在している。ホスホリパーゼはハチ毒及び種々の
ヘビ毒からのものが特に知られている。
【0003】ホスホリパーゼA(PLA)の測定は文献
によれば生命を脅やかす種々の病気の診断に利用するこ
とができる。ホスホリパーゼはレシチン分子へのその作
用位置によって分類される。ホスホリパーゼAは脂肪酸
分子とのエステル結合を分解する。すなわちホスホリパ
ーゼA1はα−位をまたホスホリパーゼA2はβ−位を
分解する。
によれば生命を脅やかす種々の病気の診断に利用するこ
とができる。ホスホリパーゼはレシチン分子へのその作
用位置によって分類される。ホスホリパーゼAは脂肪酸
分子とのエステル結合を分解する。すなわちホスホリパ
ーゼA1はα−位をまたホスホリパーゼA2はβ−位を
分解する。
【0004】PLAはヒトの膵臓で大量に形成され、十
二指腸に分泌され、そこで毎日約4gの食物レシチン及
び付加的に約10gの生体特有のレシチンを分解する。 膵PLAは約130個のアミノ酸を有する極めて小さな
酵素である。
二指腸に分泌され、そこで毎日約4gの食物レシチン及
び付加的に約10gの生体特有のレシチンを分解する。 膵PLAは約130個のアミノ酸を有する極めて小さな
酵素である。
【0005】他の膵酵素リパーゼ及びアミラーゼが有す
るように、PLAの臨床関連性に関しては早期に探求さ
れた。異なるPLA−酵素の危険性(レシチンにPLA
2が作用することにより2位での脂肪酸の分解下に高毒
性のリゾレシチンが生じる)によって、特に膵炎の重度
を鑑別する可能性が考察される。急性膵炎は比較的無害
の浮腫型又は最も危険な壊死性型として存在可能であり
、その鑑別診断は臨床的に極めて重要である。ホフマン
(Hoffmann)その他は臨床的に保障された診断
と共に約50の血清に基づき、実際に急性出血性膵炎の
場合PLA−酵素活性を介して疾病の重態経過を予知し
得ることを指摘した(“J.Clin.Chem.Cl
in.Biochim.”23(1985))。別の研
究材料によって、他の疾病もPLAの増加を伴って現わ
れることが次第に明らかになってきた。この場合にもP
LA含有量は常にその疾病の重さの指標である。これら
の疾病としては肺病、ARDS(マクガイア(MacG
uire)その他、“J.Clin.Invest”6
9(1982)、543〜553)、敗血症(ファダス
(Vadas P)、“J.Lab.Clin.Me
d.”104(1984)、873)、アレルギー性シ
ョック、進行性の慢性多発関節炎(プルザンスキ(Pr
uzanski)その他、“J.Rheumatol.
”12(1985)211)並びに気管支喘息を例示す
ることができる。
るように、PLAの臨床関連性に関しては早期に探求さ
れた。異なるPLA−酵素の危険性(レシチンにPLA
2が作用することにより2位での脂肪酸の分解下に高毒
性のリゾレシチンが生じる)によって、特に膵炎の重度
を鑑別する可能性が考察される。急性膵炎は比較的無害
の浮腫型又は最も危険な壊死性型として存在可能であり
、その鑑別診断は臨床的に極めて重要である。ホフマン
(Hoffmann)その他は臨床的に保障された診断
と共に約50の血清に基づき、実際に急性出血性膵炎の
場合PLA−酵素活性を介して疾病の重態経過を予知し
得ることを指摘した(“J.Clin.Chem.Cl
in.Biochim.”23(1985))。別の研
究材料によって、他の疾病もPLAの増加を伴って現わ
れることが次第に明らかになってきた。この場合にもP
LA含有量は常にその疾病の重さの指標である。これら
の疾病としては肺病、ARDS(マクガイア(MacG
uire)その他、“J.Clin.Invest”6
9(1982)、543〜553)、敗血症(ファダス
(Vadas P)、“J.Lab.Clin.Me
d.”104(1984)、873)、アレルギー性シ
ョック、進行性の慢性多発関節炎(プルザンスキ(Pr
uzanski)その他、“J.Rheumatol.
”12(1985)211)並びに気管支喘息を例示す
ることができる。
【0006】これらの病型の場合、その原因を膵PLA
と結び付けることができないことは容易に推測された。 進行性の慢性多発関節炎を有する患者の滑液からは、ヒ
トの膵PLAに対する抗血清と免疫学的に反応しないP
LAが分離されることは記載されている。ホフマンその
他は、このPLAがヒト血清中でヒトの膵PLAとは異
なる最適pHを有することを明らかにすることができた
(“Dt.Ges.F.Klin.Chemie e
.V.”会報5/87(1987)、226)。
と結び付けることができないことは容易に推測された。 進行性の慢性多発関節炎を有する患者の滑液からは、ヒ
トの膵PLAに対する抗血清と免疫学的に反応しないP
LAが分離されることは記載されている。ホフマンその
他は、このPLAがヒト血清中でヒトの膵PLAとは異
なる最適pHを有することを明らかにすることができた
(“Dt.Ges.F.Klin.Chemie e
.V.”会報5/87(1987)、226)。
【0007】ヒト血清中のPLAに対する最初のテスト
はチーブェ(Zieve)及びフォーゲル(Vogel
)によって1961年に発表された(“J.Lab.C
lin.Invest.”57(1961)、586)
。これは測定ごとに温度55℃での18時間の潜伏期を
必要とする滴定テストであった。その後他のPLA−測
定法、例えば放射能標識化基質での測定、生じた遊離脂
肪酸の抽出及び測定、蛍光測定等が公表された。しかし
これらの方法はすべて極端に時間がかかり、煩雑である
ことから、常用的に実施することはできなかった。
はチーブェ(Zieve)及びフォーゲル(Vogel
)によって1961年に発表された(“J.Lab.C
lin.Invest.”57(1961)、586)
。これは測定ごとに温度55℃での18時間の潜伏期を
必要とする滴定テストであった。その後他のPLA−測
定法、例えば放射能標識化基質での測定、生じた遊離脂
肪酸の抽出及び測定、蛍光測定等が公表された。しかし
これらの方法はすべて極端に時間がかかり、煩雑である
ことから、常用的に実施することはできなかった。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の課題は
、公知PLA−テストの分析上及び装置上の問題点を回
避し、また常用の実験光度計を用いて実施することので
きるPLA−テストを提供することにある。
、公知PLA−テストの分析上及び装置上の問題点を回
避し、また常用の実験光度計を用いて実施することので
きるPLA−テストを提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】この課題は、ホスホリパ
ーゼの、脂肪酸基を有する基質と、化学的に異なる少な
くとも2種の乳化剤、すなわち少なくとも1種の中性乳
化剤及び胆汁酸塩とを含む混合物で体液をインキュベー
トし、基質分解によって生じた遊離脂肪酸の量を公知方
法によって測定することよりなる、体液特に血清中のホ
スホリパーゼA(PLA)の測定法によって解決される
。本発明方法にあっては中性乳化剤は親水性又は親油性
であってよい。
ーゼの、脂肪酸基を有する基質と、化学的に異なる少な
くとも2種の乳化剤、すなわち少なくとも1種の中性乳
化剤及び胆汁酸塩とを含む混合物で体液をインキュベー
トし、基質分解によって生じた遊離脂肪酸の量を公知方
法によって測定することよりなる、体液特に血清中のホ
スホリパーゼA(PLA)の測定法によって解決される
。本発明方法にあっては中性乳化剤は親水性又は親油性
であってよい。
【0010】基質としては天然のレシチンを使用するこ
とができるが、この場合すべてのレシチンが等しく良好
に適しているわけではない。すなわちレシチン分子中に
多量の不飽和脂肪酸を含むことが、良好なテスト結果を
得るための前提であると考えられる。本発明の優れた1
実施態様では天然のレシチン基質として大豆からのレシ
チン又はリポイド(Lipoid)S20を使用する。
とができるが、この場合すべてのレシチンが等しく良好
に適しているわけではない。すなわちレシチン分子中に
多量の不飽和脂肪酸を含むことが、良好なテスト結果を
得るための前提であると考えられる。本発明の優れた1
実施態様では天然のレシチン基質として大豆からのレシ
チン又はリポイド(Lipoid)S20を使用する。
【0011】天然のレシチン以外に一般式:
【0012
】
】
【化2】
【0013】[式中R1及びR2は炭素原子数20まで
のアルキル基又は炭素原子数20までのカルボニル基を
表し、この場合双方の基の少なくとも一方はカルボニル
基であることを前提とし、R3は−SO3Hを表す]に
相応する合成基質を使用することもできる。
のアルキル基又は炭素原子数20までのカルボニル基を
表し、この場合双方の基の少なくとも一方はカルボニル
基であることを前提とし、R3は−SO3Hを表す]に
相応する合成基質を使用することもできる。
【0014】本発明の優れた1実施態様では第1乳化剤
としてアルキルグルコシド、ポリエーテル、DMSO又
はトリトン(Triton)X−100(登録商標)(
アルキルフェニルポリエチレングリコール)を使用する
。第2乳化剤としては胆汁酸塩、有利にはタウロデオキ
シコール酸塩又はデオキシコール酸塩を使用する。タウ
ロデオキシコール酸塩をオクチル−β−D−グルコピラ
ノシド、ポリオキシエチレンエーテル、DMSO又はト
リトンX−100と組み合わせて使用するのが特に有利
である。
としてアルキルグルコシド、ポリエーテル、DMSO又
はトリトン(Triton)X−100(登録商標)(
アルキルフェニルポリエチレングリコール)を使用する
。第2乳化剤としては胆汁酸塩、有利にはタウロデオキ
シコール酸塩又はデオキシコール酸塩を使用する。タウ
ロデオキシコール酸塩をオクチル−β−D−グルコピラ
ノシド、ポリオキシエチレンエーテル、DMSO又はト
リトンX−100と組み合わせて使用するのが特に有利
である。
【0015】本発明方法では凍結乾燥した基質を使用す
ることまたこれを緩衝液、特にHEPES−緩衝液に溶
解することが有利である。これにより標定した量の基質
を使用することが容易になり、この場合量の測定は特に
容易である。
ることまたこれを緩衝液、特にHEPES−緩衝液に溶
解することが有利である。これにより標定した量の基質
を使用することが容易になり、この場合量の測定は特に
容易である。
【0016】生じた遊離脂肪酸の測定は基本的には種々
の様式で行うことができる。すなわち基本的に遊離酸を
補酵素A及びATPの存在でアシル−CoA−合成酵素
によってアシル−CoA、AMP及びピロリン酸塩に変
え、生じた各成分の1つを検出することによって行う。 この場合アシル−CoAに関する測定は、アシル−Co
Aをアシル−CoA−オキシダーゼによって酸素の存在
で2,3−トランスエノイル−CoA及びH2O2に変
え、生じたH2O2を発色反応を介してペルオキシダー
ゼの存在で検出することが考えられる。別の可能性は生
じたピロリン酸塩(PPi)に関する測定である。この
場合PPiを一連の酵素触媒反応によってグルコナート
−6−ホスフェートに変える。本発明方法にとって有利
なもう1つの可能性は生じたAMPに関する測定である
。 この場合AMPをATPの存在でミオキナーゼによって
ADPに変え、これを更にホスホエノールピルビン酸塩
の存在でピルビン酸キナーゼによりATP及びピルビン
酸塩に変え、次いで生じたピルビン酸塩をNADHの存
在で乳酸デヒドロゲナーゼにより乳酸塩とNADに変え
る。測定はPLA−含有体液を、基質及び各乳化剤含有
混合物(これは有利には同時にAMPを乳酸塩に更に変
換させる試薬をも含む)に加えることによりその吸光度
の変化を測定することによって行う。既知量のPLAで
作成された較正曲線と比較して、体液中の濃度を測定す
ることができる。
の様式で行うことができる。すなわち基本的に遊離酸を
補酵素A及びATPの存在でアシル−CoA−合成酵素
によってアシル−CoA、AMP及びピロリン酸塩に変
え、生じた各成分の1つを検出することによって行う。 この場合アシル−CoAに関する測定は、アシル−Co
Aをアシル−CoA−オキシダーゼによって酸素の存在
で2,3−トランスエノイル−CoA及びH2O2に変
え、生じたH2O2を発色反応を介してペルオキシダー
ゼの存在で検出することが考えられる。別の可能性は生
じたピロリン酸塩(PPi)に関する測定である。この
場合PPiを一連の酵素触媒反応によってグルコナート
−6−ホスフェートに変える。本発明方法にとって有利
なもう1つの可能性は生じたAMPに関する測定である
。 この場合AMPをATPの存在でミオキナーゼによって
ADPに変え、これを更にホスホエノールピルビン酸塩
の存在でピルビン酸キナーゼによりATP及びピルビン
酸塩に変え、次いで生じたピルビン酸塩をNADHの存
在で乳酸デヒドロゲナーゼにより乳酸塩とNADに変え
る。測定はPLA−含有体液を、基質及び各乳化剤含有
混合物(これは有利には同時にAMPを乳酸塩に更に変
換させる試薬をも含む)に加えることによりその吸光度
の変化を測定することによって行う。既知量のPLAで
作成された較正曲線と比較して、体液中の濃度を測定す
ることができる。
【0017】本発明の他の有利な1実施態様では生じた
脂肪酸の測定をTRA−緩衝液の存在で実施する。
脂肪酸の測定をTRA−緩衝液の存在で実施する。
【0018】操作を一層容易にするには、テストを実施
するに当って、発色を妨げない明るい系を使用するのが
有利である。この方法の特に優れた1実施態様ではトリ
トンX−100を加えるが、この場合トリトンX−10
0は乳化剤としてすでに使用されていないことを前提と
する。
するに当って、発色を妨げない明るい系を使用するのが
有利である。この方法の特に優れた1実施態様ではトリ
トンX−100を加えるが、この場合トリトンX−10
0は乳化剤としてすでに使用されていないことを前提と
する。
【0019】本発明方法により、容易にまた常用的に被
検液中のPLA量を測定することができる。特にこの方
法は臨床実験での使用を極めて容易にする自動分析法で
容易に実施することを可能とする。
検液中のPLA量を測定することができる。特にこの方
法は臨床実験での使用を極めて容易にする自動分析法で
容易に実施することを可能とする。
【0020】
【実施例】本発明を以下に記載する実施例により更に詳
述する。
述する。
【0021】略号:
TRA:トリエタノールアミン−塩酸塩DMSO:ジメ
チルスルホキシド TDCh:タウロデオキシコール酸塩 PEP:ホスホエノールピルビン酸塩 PK:ピルビン酸キナーゼ LDH:乳酸デヒドロゲナーゼ ACS:アシル補酵素A−合成酵素 NaDCh:デオキシコール酸ナトリウム。
チルスルホキシド TDCh:タウロデオキシコール酸塩 PEP:ホスホエノールピルビン酸塩 PK:ピルビン酸キナーゼ LDH:乳酸デヒドロゲナーゼ ACS:アシル補酵素A−合成酵素 NaDCh:デオキシコール酸ナトリウム。
【0022】例 1
エマルジョンの製造
乳化剤
例1.1:オクチルグルコシド
大豆からのレシチン35mgをHEPES−緩衝液(p
H=7.9、100mモル/l)4.25ml、TDC
h−溶液(120mモル/l)0.250ml、Ca2
+−及びMg2+−イオンの溶液(200又は400m
モル/l)0.250ml並びにオクチルグルコシド溶
液(100mモル/l)0.250mlと一緒に約2時
間撹拌する。引続きエマルジョン2+1をオクチルグル
コシド溶液で希釈する。
H=7.9、100mモル/l)4.25ml、TDC
h−溶液(120mモル/l)0.250ml、Ca2
+−及びMg2+−イオンの溶液(200又は400m
モル/l)0.250ml並びにオクチルグルコシド溶
液(100mモル/l)0.250mlと一緒に約2時
間撹拌する。引続きエマルジョン2+1をオクチルグル
コシド溶液で希釈する。
【0023】エマルジョンの吸光度を空気に対し365
nmで測定する。これは1.456である。
nmで測定する。これは1.456である。
【0024】試験バッチ
測定は37℃で実施する。測定は空気に対し365nm
の波長で行う。上記溶液750μlにCoA−溶液(9
0mモル/l)25μl、補酵素溶液(ATP:145
mモル/l、PEP:55mモル/l、NADH:9.
4mモル/l)75μl並びに酵素溶液(ミオキナーゼ
:165kU/l、LDH:377kU/l、PK:1
41kU/l、ACS:5.6kU/l)50μlを加
える。試料としてPLA−含有ヒト血清50μlを使用
する。
の波長で行う。上記溶液750μlにCoA−溶液(9
0mモル/l)25μl、補酵素溶液(ATP:145
mモル/l、PEP:55mモル/l、NADH:9.
4mモル/l)75μl並びに酵素溶液(ミオキナーゼ
:165kU/l、LDH:377kU/l、PK:1
41kU/l、ACS:5.6kU/l)50μlを加
える。試料としてPLA−含有ヒト血清50μlを使用
する。
【0025】例1.2:ブリッジ(Brij)35(登
録商標)(ポリエチレングリコールドデシルエーテル)
レシチン35mgにタウロデオキシコール酸塩−溶液0
.250ml及びHEPES−緩衝液(pH=7.9、
100mモル/l)4.5mlを加え、僅かに加熱しな
がら撹拌する。30分後Ca2+−及びMg2+−イオ
ンの溶液(200mモル/l又は400mモル/l)0
.250ml並びにブリッジ35−溶液(200g/l
)0.250mlを加える。引続きエマルジョンをHE
PES−緩衝液で希釈する(エマルジョン2部、緩衝液
1部)。
録商標)(ポリエチレングリコールドデシルエーテル)
レシチン35mgにタウロデオキシコール酸塩−溶液0
.250ml及びHEPES−緩衝液(pH=7.9、
100mモル/l)4.5mlを加え、僅かに加熱しな
がら撹拌する。30分後Ca2+−及びMg2+−イオ
ンの溶液(200mモル/l又は400mモル/l)0
.250ml並びにブリッジ35−溶液(200g/l
)0.250mlを加える。引続きエマルジョンをHE
PES−緩衝液で希釈する(エマルジョン2部、緩衝液
1部)。
【0026】エマルジョンの吸光度は空気に対し365
nmで2.243である。
nmで2.243である。
【0027】試験バッチは例1.1に示したようにして
実施する。
実施する。
【0028】例1.3:ジメチルスルホキシド(DMS
O) レシチン35mgをHEPES−緩衝液(pH7.9、
100mモル/l)4.5ml及びタウロデオキシコー
ル酸塩0.250mlと撹拌し、引続きCa2+−及び
Mg2+−イオンの溶液(200mモル/l又は400
mモル/l)0.250mlを加える。引続きこのエマ
ルジョンにDMSO−溶液2μlを加える(エマルジョ
ン中の濃度:5mモル/l)。エマルジョンの吸光度は
空気に対し365nmで2.573である。エマルジョ
ン2mlにCaCl2・2H2O 200mモル/l
、MgCl2・6H2O 400mモル/l及びトリ
トンX−100200mモル/lの溶液0.100ml
を加える。エマルジョンの吸光度は空気に対し365n
mで1.320である。
O) レシチン35mgをHEPES−緩衝液(pH7.9、
100mモル/l)4.5ml及びタウロデオキシコー
ル酸塩0.250mlと撹拌し、引続きCa2+−及び
Mg2+−イオンの溶液(200mモル/l又は400
mモル/l)0.250mlを加える。引続きこのエマ
ルジョンにDMSO−溶液2μlを加える(エマルジョ
ン中の濃度:5mモル/l)。エマルジョンの吸光度は
空気に対し365nmで2.573である。エマルジョ
ン2mlにCaCl2・2H2O 200mモル/l
、MgCl2・6H2O 400mモル/l及びトリ
トンX−100200mモル/lの溶液0.100ml
を加える。エマルジョンの吸光度は空気に対し365n
mで1.320である。
【0029】試験バッチは例1.1に示したようにして
実施する。
実施する。
【0030】例 2
PLA−基質
例2.1:
PLA−基質:
【0031】
【化3】
【0032】エマルジョンの製造:PLA−基質にTR
IS/HCl 125mモル/l、CaCl2 4
mモル/l、マンニット50mモル/l、NaDCh
1mモル/l及びトリトンX−100 4mモル/
lの溶液1.5mlを加える。基質濃度は17mモル/
lである。エマルジョンを電磁撹拌器で室温で1時間撹
拌する。エマルジョンの吸光度は空気に対し365nm
で測定する。これは1.851である。
IS/HCl 125mモル/l、CaCl2 4
mモル/l、マンニット50mモル/l、NaDCh
1mモル/l及びトリトンX−100 4mモル/
lの溶液1.5mlを加える。基質濃度は17mモル/
lである。エマルジョンを電磁撹拌器で室温で1時間撹
拌する。エマルジョンの吸光度は空気に対し365nm
で測定する。これは1.851である。
【0033】試験バッチ:
a) インキュベーションバッチ:上記のエマルジョ
ン250μlを試料50μlとインキュベートする。5
分後又は20分後それぞれ50μlを取り出し、ストッ
プ溶液50μlにピペットで加える。インキュベートは
37℃で行う。
ン250μlを試料50μlとインキュベートする。5
分後又は20分後それぞれ50μlを取り出し、ストッ
プ溶液50μlにピペットで加える。インキュベートは
37℃で行う。
【0034】b) 測定バッチ:波長:空気に対し5
46nm、温度:37℃。
46nm、温度:37℃。
【0035】試薬溶液A(ATP、アシル−CoA−合
成酵素、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダー
ゼ、4−アミノアンチピリン)1000μlに試料10
0μlを加える。10分後これに試薬溶液B(N−エチ
ルマレインイミド、アシル−CoA−オキシダーゼ)5
0μlを加える。更に10分後その吸光度を測定する。 その差からPLA−活性が得られる。
成酵素、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダー
ゼ、4−アミノアンチピリン)1000μlに試料10
0μlを加える。10分後これに試薬溶液B(N−エチ
ルマレインイミド、アシル−CoA−オキシダーゼ)5
0μlを加える。更に10分後その吸光度を測定する。 その差からPLA−活性が得られる。
【0036】この基質ではPLA−ヒト血清中でのPL
A−活性(130%)を、基質として大豆レシチンを用
いた場合に比べて極めて良好に再発見することができる
。ブタ膵臓PLAの再発見は52.9%である。
A−活性(130%)を、基質として大豆レシチンを用
いた場合に比べて極めて良好に再発見することができる
。ブタ膵臓PLAの再発見は52.9%である。
【0037】例2.2.1
トリエタノールアミン−緩衝液の存在での測定例2.1
に記載したようにして製造したエマルジョンを凍結乾燥
し、付加的にACS2.16mg、CoA4.34mg
及びATP20.82mgを含む(5ml中に)トリエ
タノールアミン−緩衝液(100mモル/l、pH7.
8)5.0mlに溶かす。
に記載したようにして製造したエマルジョンを凍結乾燥
し、付加的にACS2.16mg、CoA4.34mg
及びATP20.82mgを含む(5ml中に)トリエ
タノールアミン−緩衝液(100mモル/l、pH7.
8)5.0mlに溶かす。
【0038】この溶液500μlに試料溶液100μl
を加え、37℃で5分間インキュベートする。引続きこ
の溶液200μlを試薬溶液A(POD、4−アミノア
ンチピリン)1ml、溶液B(N−エチルマレインイミ
ド、アシル−CoA−オキシダーゼ)50μl及びトリ
トンX100の0.5%溶液500μlに加える。吸光
度を10分後に空気に対し365nmで測定する。20
分後新たに吸光度を測定し、各吸光度の差からPLA−
活性を確認する。
を加え、37℃で5分間インキュベートする。引続きこ
の溶液200μlを試薬溶液A(POD、4−アミノア
ンチピリン)1ml、溶液B(N−エチルマレインイミ
ド、アシル−CoA−オキシダーゼ)50μl及びトリ
トンX100の0.5%溶液500μlに加える。吸光
度を10分後に空気に対し365nmで測定する。20
分後新たに吸光度を測定し、各吸光度の差からPLA−
活性を確認する。
【0039】例2.2
PLA−基質
【0040】
【化4】
【0041】エマルジョンの製造:
a) 例1に記載したと同様に行う。エマルジョンの
吸光度は空気に対し365nmで2.082である。
吸光度は空気に対し365nmで2.082である。
【0042】b) 上記の基質(最終濃度:12mモ
ル/l)にHEPES−緩衝液(100mモル/l、p
H=7.9)1.35mlを加え、引続きこれにタウロ
デオキシコール酸塩溶液(120mモル/l)0.07
5mlを加える。軽く加熱しながら電磁撹拌器で30分
間撹拌する。このエマルジョンにCaCl2・2H2O
200mモル/l、トリトンX−100 200
mモル/l及びMgCl2・6H2O 400mモル
/lの溶液0.075mlを加える。空気に対し365
nmで吸光度0.222の澄明なエマルジョンが得られ
る。
ル/l)にHEPES−緩衝液(100mモル/l、p
H=7.9)1.35mlを加え、引続きこれにタウロ
デオキシコール酸塩溶液(120mモル/l)0.07
5mlを加える。軽く加熱しながら電磁撹拌器で30分
間撹拌する。このエマルジョンにCaCl2・2H2O
200mモル/l、トリトンX−100 200
mモル/l及びMgCl2・6H2O 400mモル
/lの溶液0.075mlを加える。空気に対し365
nmで吸光度0.222の澄明なエマルジョンが得られ
る。
【0043】試験バッチ:例1に記載したと同様。この
基質はブタ膵臓−PLA及び血清−PLAを検出するの
に適している。ブタ膵臓−PLAはヒト血清−PLAよ
りも少なく再発見される。
基質はブタ膵臓−PLA及び血清−PLAを検出するの
に適している。ブタ膵臓−PLAはヒト血清−PLAよ
りも少なく再発見される。
【0044】例2.3
PLA−基質:
【0045】
【化5】
【0046】エマルジョンの製造:
a) 例1に記載したと同様。エマルジョンの吸光度
は0.605である。
は0.605である。
【0047】b) 例2のb)に記載したと同様。基
質濃度は双方の場合において12mモル/lである。
質濃度は双方の場合において12mモル/lである。
【0048】試験バッチ:例1に記載したと同様。
【0049】この基質はブタ膵臓−PLA及びヒト血清
−PLAを検出するのに適しており、この場合ブタ膵臓
−PLAは血清−PLAよりも少なく再発見される。
−PLAを検出するのに適しており、この場合ブタ膵臓
−PLAは血清−PLAよりも少なく再発見される。
【0050】例2.4
PLA−基質:
【0051】
【化6】
【0052】エマルジョンの製造:例1に記載したと同
様。
様。
【0053】試験バッチ:例1に記載したと同様。
【0054】この基質はPLA−基質として適している
。
。
【0055】例 3
レシチン
次のレシチンをPLA−基質としてのその適性に関し検
査した: −大豆からのレシチン、ロス(Roth)9812−卵
からのレシチン、メルク(Merck)5331−脳か
らのレシチン、ロス(Roth)5957−卵黄からの
レシチン、セルバ(Serva)27608 −リポイドS20。
査した: −大豆からのレシチン、ロス(Roth)9812−卵
からのレシチン、メルク(Merck)5331−脳か
らのレシチン、ロス(Roth)5957−卵黄からの
レシチン、セルバ(Serva)27608 −リポイドS20。
【0056】エマルジョンの製造:
レシチン35mgにHEPES−緩衝液(100mモル
/l、pH=7.9)4.5ml及びタウロデオキシコ
ール酸塩溶液(120mモル/l)0.250mlを加
え、軽く加熱しながら撹拌する。レシチンを乳濁させた
後(80〜110分後)、CaCl2・2H2O 2
00mモル/l、トリトンX−100 200mモル
/l及びMgCl2・6H2O 400mモル/lの
溶液0.250mlを加える。
/l、pH=7.9)4.5ml及びタウロデオキシコ
ール酸塩溶液(120mモル/l)0.250mlを加
え、軽く加熱しながら撹拌する。レシチンを乳濁させた
後(80〜110分後)、CaCl2・2H2O 2
00mモル/l、トリトンX−100 200mモル
/l及びMgCl2・6H2O 400mモル/lの
溶液0.250mlを加える。
【0057】試験バッチ:
測定を37℃で実施する。空気に対し365nmの波長
で測定する。上記エマルジョンそれぞれ750μlにC
oA−溶液(90mモル/l)25μl、補酵素溶液(
ATP:145mモル/l、PEP:55mモル/l、
NADH:9.4mモル/l)75μl並びに酵素溶液
(ミオキナーゼ:165kU/l、LDH:377kU
/l、PK:141kU/l、ACS:5.6kU/l
)50μlを加える。試料としてはPLA−含有ヒト血
清50μlを使用する。
で測定する。上記エマルジョンそれぞれ750μlにC
oA−溶液(90mモル/l)25μl、補酵素溶液(
ATP:145mモル/l、PEP:55mモル/l、
NADH:9.4mモル/l)75μl並びに酵素溶液
(ミオキナーゼ:165kU/l、LDH:377kU
/l、PK:141kU/l、ACS:5.6kU/l
)50μlを加える。試料としてはPLA−含有ヒト血
清50μlを使用する。
【0058】上記レシチンのうち次の2種を適当なもの
として指摘することができる:大豆からのレシチン(ロ
ス9812)及びリポイドS20。他のレシチンでは上
記試験バッチで血清中のPLA−活性は検出できなかっ
た。
として指摘することができる:大豆からのレシチン(ロ
ス9812)及びリポイドS20。他のレシチンでは上
記試験バッチで血清中のPLA−活性は検出できなかっ
た。
Claims (2)
- 【請求項1】 ホスホリパーゼに対する、脂肪酸基を
有する基質と、化学的に異なる種類の少なくとも2種の
乳化剤、すなわち少なくとも1種の中性乳化剤及び胆汁
酸塩とを含む混合物で体液をインキュベートし、基質分
解によって生じた遊離脂肪酸の量を公知方法により測定
することを特徴とする、体液中のホスホリパーゼAの測
定法。 - 【請求項2】 一般式: 【化1】 [式中R1及びR2は炭素原子数20までのアルキル基
又は炭素原子数20までのカルボニル基を表し、この場
合双方の基の少なくとも一方はカルボニル基であること
を前提とし、R3は−SO3Hを表す]に相応する合成
基質を使用する、請求項1記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4029845A DE4029845A1 (de) | 1990-09-20 | 1990-09-20 | Verfahren zur bestimmung von phospholipase in koerperfluessigkeiten |
DE4029845.0 | 1990-09-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04248996A true JPH04248996A (ja) | 1992-09-04 |
JPH0757199B2 JPH0757199B2 (ja) | 1995-06-21 |
Family
ID=6414643
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3240795A Expired - Fee Related JPH0757199B2 (ja) | 1990-09-20 | 1991-09-20 | 体液中のホスホリパーゼの測定法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5244789A (ja) |
EP (1) | EP0476669B1 (ja) |
JP (1) | JPH0757199B2 (ja) |
AT (1) | ATE122101T1 (ja) |
DE (2) | DE4029845A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999033791A1 (fr) * | 1997-12-26 | 1999-07-08 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Derives aliphatiques |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5767249A (en) * | 1994-06-20 | 1998-06-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoclonal antibodies against type I phospholipase A2 as a diagnostic and anti-inflammatory therapeutic agent |
CN114047150B (zh) * | 2021-11-11 | 2022-07-26 | 浙江伊利康生物技术有限公司 | 一种脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂、制备方法及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH023662A (ja) * | 1988-03-04 | 1990-01-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | ホスホリパーゼ基質、およびホスホリパーゼを光学的に定量する方法および試薬 |
JPH02243617A (ja) * | 1988-04-15 | 1990-09-27 | Iatron Lab Inc | 非水溶性物質の透明な水溶液が得られる凍結乾燥品の製造方法 |
JPH0367600A (ja) * | 1989-05-25 | 1991-03-22 | Modrovich Ivan E | リパーゼ定量用単一試薬系およびその製造方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3516001A1 (de) * | 1985-05-03 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Lipasefarbtest |
-
1990
- 1990-09-20 DE DE4029845A patent/DE4029845A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-09-09 US US07/756,712 patent/US5244789A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-19 EP EP91115973A patent/EP0476669B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-19 AT AT91115973T patent/ATE122101T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-19 DE DE59105372T patent/DE59105372D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-20 JP JP3240795A patent/JPH0757199B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH023662A (ja) * | 1988-03-04 | 1990-01-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | ホスホリパーゼ基質、およびホスホリパーゼを光学的に定量する方法および試薬 |
JPH02243617A (ja) * | 1988-04-15 | 1990-09-27 | Iatron Lab Inc | 非水溶性物質の透明な水溶液が得られる凍結乾燥品の製造方法 |
JPH0367600A (ja) * | 1989-05-25 | 1991-03-22 | Modrovich Ivan E | リパーゼ定量用単一試薬系およびその製造方法 |
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WO1999033791A1 (fr) * | 1997-12-26 | 1999-07-08 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Derives aliphatiques |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0476669B1 (de) | 1995-05-03 |
US5244789A (en) | 1993-09-14 |
EP0476669A1 (de) | 1992-03-25 |
DE4029845A1 (de) | 1992-03-26 |
DE59105372D1 (de) | 1995-06-08 |
JPH0757199B2 (ja) | 1995-06-21 |
ATE122101T1 (de) | 1995-05-15 |
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