JPH0753599A - ハンガナッツゥ・ダイヘル抗原に対するヒトモノクローナル抗体及びそれを産生する細胞株 - Google Patents
ハンガナッツゥ・ダイヘル抗原に対するヒトモノクローナル抗体及びそれを産生する細胞株Info
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- JPH0753599A JPH0753599A JP5227937A JP22793793A JPH0753599A JP H0753599 A JPH0753599 A JP H0753599A JP 5227937 A JP5227937 A JP 5227937A JP 22793793 A JP22793793 A JP 22793793A JP H0753599 A JPH0753599 A JP H0753599A
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- Japan
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- antibody
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体
を提供すること。 【構成】 ＨＤ抗原と特異的に反応する抗ＨＤ抗原ヒト
モノクローナルＩｇＧ１抗体及び該モノクローナル抗体
を産生する細胞株を提供した。
を提供すること。 【構成】 ＨＤ抗原と特異的に反応する抗ＨＤ抗原ヒト
モノクローナルＩｇＧ１抗体及び該モノクローナル抗体
を産生する細胞株を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ハンガナッツゥ・ダイ
ヘル（本明細書において「ＨＤ」という）抗原(Hanganu
tziu-Deicher抗原）と特異的に反応するヒトモノクロー
ナル抗体及びそれを産生する細胞株に関する。
ヘル（本明細書において「ＨＤ」という）抗原(Hanganu
tziu-Deicher抗原）と特異的に反応するヒトモノクロー
ナル抗体及びそれを産生する細胞株に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＤ抗原は、糖脂質であり、動物の組織
や血清中に存在するが、ヒト及びニワトリの正常組織や
正常血清中には存在しない。しかしながら、ヒトであっ
ても、癌細胞の表面や癌患者の血清中に見出される。Ｈ
Ｄ抗原には、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）におけ
る移動度の順にＨＤ３、ＨＤ５及びＨＤ７抗原がある
が、とりわけ、ＨＤ３抗原は肝臓癌、メラノーマ、レチ
ノブラストーマ等に特異的に存在する。従って、ＨＤ抗
原に特異的に反応するモノクローナル抗体が存在すれば
癌の診断及び治療に利用することができると考えられ
る。
や血清中に存在するが、ヒト及びニワトリの正常組織や
正常血清中には存在しない。しかしながら、ヒトであっ
ても、癌細胞の表面や癌患者の血清中に見出される。Ｈ
Ｄ抗原には、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）におけ
る移動度の順にＨＤ３、ＨＤ５及びＨＤ７抗原がある
が、とりわけ、ＨＤ３抗原は肝臓癌、メラノーマ、レチ
ノブラストーマ等に特異的に存在する。従って、ＨＤ抗
原に特異的に反応するモノクローナル抗体が存在すれば
癌の診断及び治療に利用することができると考えられ
る。
【０００３】通常、特定の抗原に対するモノクローナル
抗体は、該抗原でマウスやウサギのような動物を免疫
し、該動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合さ
せてハイブリドーマを得、このハイブリドーマからモノ
クローナル抗体を得ることができる。しかしながら、Ｈ
Ｄ抗原は、ヒト及びニワトリ以外の動物には存在するた
め、マウス等を用いる通常のモノクローナル抗体の生産
方法をそのまま適用して得ることはできない。
抗体は、該抗原でマウスやウサギのような動物を免疫
し、該動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合さ
せてハイブリドーマを得、このハイブリドーマからモノ
クローナル抗体を得ることができる。しかしながら、Ｈ
Ｄ抗原は、ヒト及びニワトリ以外の動物には存在するた
め、マウス等を用いる通常のモノクローナル抗体の生産
方法をそのまま適用して得ることはできない。
【０００４】抗ＨＤ抗原モノクローナル抗体としては、
ニワトリ型親株を作り、これをＨＤ抗原で免疫したニワ
トリのリンパ球と融合させて得たハイブリドーマにより
生産されるモノクローナル抗体が知られている（Ohashi
ら、Hanganutziu-Deicherheterophile antigen in huma
n retinoblastoma cells, Am. J. Ophthamol., 96:32
1）。しかしながら、ここで得られたニワトリ型ハイブ
リドーマは不安定であり、また、ニワトリ型であるため
にヒトの治療に用いることができないという欠点を有す
る。
ニワトリ型親株を作り、これをＨＤ抗原で免疫したニワ
トリのリンパ球と融合させて得たハイブリドーマにより
生産されるモノクローナル抗体が知られている（Ohashi
ら、Hanganutziu-Deicherheterophile antigen in huma
n retinoblastoma cells, Am. J. Ophthamol., 96:32
1）。しかしながら、ここで得られたニワトリ型ハイブ
リドーマは不安定であり、また、ニワトリ型であるため
にヒトの治療に用いることができないという欠点を有す
る。
【０００５】また、特開平１−２０２２９５号には、ヒ
トリンパ球をインビトロでＨＤ抗原により免疫後、融合
することにより抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナル抗体を生
産する方法が開示されている。しかしながら、このいわ
ゆるインビトロ感作法では、十分な免疫化を行なうこと
ができず、感度が低いという問題がある。また、インビ
トロ感作法で生産される抗体はＩｇＭであるが、ＩｇＭ
は不安定であり、精製が困難であるという問題点があ
る。抗体としてはＩｇＧが好ましい。中でも精製や化学
標識がやり易いという点からＩｇＧ１抗体が望ましい。
トリンパ球をインビトロでＨＤ抗原により免疫後、融合
することにより抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナル抗体を生
産する方法が開示されている。しかしながら、このいわ
ゆるインビトロ感作法では、十分な免疫化を行なうこと
ができず、感度が低いという問題がある。また、インビ
トロ感作法で生産される抗体はＩｇＭであるが、ＩｇＭ
は不安定であり、精製が困難であるという問題点があ
る。抗体としてはＩｇＧが好ましい。中でも精製や化学
標識がやり易いという点からＩｇＧ１抗体が望ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体を提供
することである。
は、抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体を提供
することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願出願人は、先に、ヒ
トリンパ球を免疫不全症動物に移植して生着させ、次い
で該動物を所望の抗原で免疫し、該抗原に対する抗体を
産生するヒトリンパ球を生成せしめた後、該リンパ球を
採取し、さらに該リンパ球をエプシュタイン−バールウ
イルス（ＥＢＶ）によるトランスフォーメーションによ
り、又は、ミエローマ細胞との融合等により不死化処理
して不死化抗体産生ヒト由来リンパ球を得、これをクロ
ーン化することによりヒトモノクローナル抗体、とりわ
け、ヒトＩｇＧ及びＩｇＡモノクローナル抗体を産生す
る方法を発明し、特許出願した（特願平４−２８４０５
２号）。
トリンパ球を免疫不全症動物に移植して生着させ、次い
で該動物を所望の抗原で免疫し、該抗原に対する抗体を
産生するヒトリンパ球を生成せしめた後、該リンパ球を
採取し、さらに該リンパ球をエプシュタイン−バールウ
イルス（ＥＢＶ）によるトランスフォーメーションによ
り、又は、ミエローマ細胞との融合等により不死化処理
して不死化抗体産生ヒト由来リンパ球を得、これをクロ
ーン化することによりヒトモノクローナル抗体、とりわ
け、ヒトＩｇＧ及びＩｇＡモノクローナル抗体を産生す
る方法を発明し、特許出願した（特願平４−２８４０５
２号）。
【０００８】本願発明者らは、この方法に基づき、抗Ｈ
Ｄ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体を得ることに成
功し、本発明を完成した。
Ｄ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体を得ることに成
功し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、ＨＤ抗原と特異的に
反応する抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体及
び該抗体を産生する細胞株を提供する。
反応する抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体及
び該抗体を産生する細胞株を提供する。
【００１０】ＩｇＧ１抗体は、プロテインＡアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより容易に精製でき、またペ
ルオキシダーゼ等による化学標識が容易であるため産業
上極めて価値が高いものである。
ィークロマトグラフィーにより容易に精製でき、またペ
ルオキシダーゼ等による化学標識が容易であるため産業
上極めて価値が高いものである。
【００１１】本発明の細胞株及びモノクローナル抗体は
次のようにして得ることができる。先ず、ヒトの末梢血
又はリンパ球を分離し、これを免疫不全症動物に生着さ
せる。本発明で用いる免疫不全症動物は、ヒトリンパ球
を移植した時、拒絶反応を起こさない動物である。この
ような動物は物理的、化学的又は生物的な処理により人
為的に作製し得る。免疫不全症動物は広く知られてお
り、医薬品の研究等で広く用いられている。免疫不全症
動物であれば、いずれのものをも用いることができる
が、入手容易性の点からＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉ
ｄマウス（Ｇ．Ｃ．Ｂｏｓｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，３０
１ ５２７（１９８３））が好ましい。ヒトリンパ球を
免疫不全症動物に生着させる方法は、単にヒトリンパ球
を該動物に投与することにより行なうことができる。投
与経路は皮下、静脈内、腹腔内等、特に限定されない
が、マウスを用いる場合は腹腔内に移植することが好都
合である。また、ヒトリンパ球の投与量も特に限定され
ないが、通常１０6 個ないし１０8 個程度である。
次のようにして得ることができる。先ず、ヒトの末梢血
又はリンパ球を分離し、これを免疫不全症動物に生着さ
せる。本発明で用いる免疫不全症動物は、ヒトリンパ球
を移植した時、拒絶反応を起こさない動物である。この
ような動物は物理的、化学的又は生物的な処理により人
為的に作製し得る。免疫不全症動物は広く知られてお
り、医薬品の研究等で広く用いられている。免疫不全症
動物であれば、いずれのものをも用いることができる
が、入手容易性の点からＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉ
ｄマウス（Ｇ．Ｃ．Ｂｏｓｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，３０
１ ５２７（１９８３））が好ましい。ヒトリンパ球を
免疫不全症動物に生着させる方法は、単にヒトリンパ球
を該動物に投与することにより行なうことができる。投
与経路は皮下、静脈内、腹腔内等、特に限定されない
が、マウスを用いる場合は腹腔内に移植することが好都
合である。また、ヒトリンパ球の投与量も特に限定され
ないが、通常１０6 個ないし１０8 個程度である。
【００１２】次いで、免疫不全症動物をＨＤ抗原で免疫
する。免疫方法自体は、モノクローナル抗体の分野にお
いて周知の方法により行なうことができ、例えば「富山
朔二・安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル 講
談社サイエンティフィック（１９８７））に記載された
方法を用いることができるが、特に好ましい態様では、
ＨＤ抗原１０〜５００μｇを２〜３週間おきにアジュバ
ントと等量混合して腹腔に接種し、さらにＨＤ抗原１０
〜５００μｇを生理食塩水に懸濁し腹腔又は静脈に投与
する。ＨＤ抗原は容易に入手することができ、例えば、
Higashi et al,Biochem. Biophys. Res. Commun., 79,
388(1977)に記載の方法によりウマ赤血球から単離精製
したＨＤ３抗原やウシ赤血球から単離精製したＨＤ５抗
原、ＨＤ７抗原を用いることができる。
する。免疫方法自体は、モノクローナル抗体の分野にお
いて周知の方法により行なうことができ、例えば「富山
朔二・安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル 講
談社サイエンティフィック（１９８７））に記載された
方法を用いることができるが、特に好ましい態様では、
ＨＤ抗原１０〜５００μｇを２〜３週間おきにアジュバ
ントと等量混合して腹腔に接種し、さらにＨＤ抗原１０
〜５００μｇを生理食塩水に懸濁し腹腔又は静脈に投与
する。ＨＤ抗原は容易に入手することができ、例えば、
Higashi et al,Biochem. Biophys. Res. Commun., 79,
388(1977)に記載の方法によりウマ赤血球から単離精製
したＨＤ３抗原やウシ赤血球から単離精製したＨＤ５抗
原、ＨＤ７抗原を用いることができる。
【００１３】免疫終了後、動物の脾臓、胸腺若しくは腸
間膜リンパ節又はその他のリンパ球組織よりヒトリンパ
球を回収する。回収は、上記した特に好ましい態様で免
疫を行なう場合、最終免疫の３〜４日後が好ましい。リ
ンパ球の回収は、例えば、先ず、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐ
ａｑｕｅ（比重１．０７７）遠心法により単核球を分離
し、さらにｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｈ付着法等で単球を
除去する。混入する動物由来細胞の除去は、この動物細
胞に特異的な抗血清を用いることにより行なうことがで
きる。この抗血清は、例えば、その動物の脾細胞を抗原
として他の動物に免疫し、免疫した動物から血清を分離
することにより得ることができる。この抗血清による処
理は、リンパ球分離のどの過程で行なっても差し支えな
い。また、細胞表面に発現しているヒト免疫グロブリン
をマーカーにした免疫学的な手法によってもヒトリンパ
球を分離することが可能である。上記方法により、ＨＤ
抗原に対する主としてＩｇＧ抗体を産生するヒト由来リ
ンパ球を得ることができる。
間膜リンパ節又はその他のリンパ球組織よりヒトリンパ
球を回収する。回収は、上記した特に好ましい態様で免
疫を行なう場合、最終免疫の３〜４日後が好ましい。リ
ンパ球の回収は、例えば、先ず、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐ
ａｑｕｅ（比重１．０７７）遠心法により単核球を分離
し、さらにｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｈ付着法等で単球を
除去する。混入する動物由来細胞の除去は、この動物細
胞に特異的な抗血清を用いることにより行なうことがで
きる。この抗血清は、例えば、その動物の脾細胞を抗原
として他の動物に免疫し、免疫した動物から血清を分離
することにより得ることができる。この抗血清による処
理は、リンパ球分離のどの過程で行なっても差し支えな
い。また、細胞表面に発現しているヒト免疫グロブリン
をマーカーにした免疫学的な手法によってもヒトリンパ
球を分離することが可能である。上記方法により、ＨＤ
抗原に対する主としてＩｇＧ抗体を産生するヒト由来リ
ンパ球を得ることができる。
【００１４】得られたヒト由来リンパ球からヒトモノク
ローナル抗体を得る場合には、先ず、該ヒト由来リンパ
球を不死化する。不死化の方法自体は公知であり、例え
ば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）を用いた
トランスフォーム法（Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、Methods in
Enzymology, 121 140 (1986))により、若しくはモノク
ローナル抗体の作製において常用されている細胞融合法
（Ｔ．Ｋｕｄｏら、Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１５４，３４５（１９８８））により、又はこれら
の組合せにより行なうことができる。あるいは、免疫終
了後に、免疫不全症動物に直接ＥＢＶを接種し、トラン
スフォームされたヒト由来リンパ球を体内から分離する
ことも可能である。特に好ましい態様は、上記トランス
フォーム法と細胞融合法を組合せた方法である。すなわ
ち、例えば、上記方法により得たリンパ球をリン酸緩衝
液で洗浄後、ＥＢＶを感染させてトランスフォームし、
培養上清中の抗体の反応性をＨＤ抗原を用いたＥＬＩＳ
Ａ法で確認し、反応性の高かったものを培養増殖させ、
ヒト又はマウス由来の親株と融合させる。親株として
は、公知のミエローマ細胞を用いることができ、例えば
ヒト由来の親株としてＫＲ−１２（J. Immunol. 133, 3
001 (1984)）及びＷ１Ｌ−２ＮＳ等（ＡＴＣＣＣＲＬ８
／５５，Cancer 22:517-524 (1968)）、マウス由来の親
株としてＳＰ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８００６、J. V
irol. 36:547-555(1980)）、Ｐ３ｘ６３（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ１５８０，J. Immunol. 123:1548-1550(1979) 及び
ＮＳ−１（ＡＴＣＣ Ｔ１Ｂ１８、Eur. J. Immunol.
6:511 (1976) ）等、ヒト／マウス雑種親株としてＳＨ
Ｍ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６８）等を挙げるこ
とができる。
ローナル抗体を得る場合には、先ず、該ヒト由来リンパ
球を不死化する。不死化の方法自体は公知であり、例え
ば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）を用いた
トランスフォーム法（Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、Methods in
Enzymology, 121 140 (1986))により、若しくはモノク
ローナル抗体の作製において常用されている細胞融合法
（Ｔ．Ｋｕｄｏら、Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１５４，３４５（１９８８））により、又はこれら
の組合せにより行なうことができる。あるいは、免疫終
了後に、免疫不全症動物に直接ＥＢＶを接種し、トラン
スフォームされたヒト由来リンパ球を体内から分離する
ことも可能である。特に好ましい態様は、上記トランス
フォーム法と細胞融合法を組合せた方法である。すなわ
ち、例えば、上記方法により得たリンパ球をリン酸緩衝
液で洗浄後、ＥＢＶを感染させてトランスフォームし、
培養上清中の抗体の反応性をＨＤ抗原を用いたＥＬＩＳ
Ａ法で確認し、反応性の高かったものを培養増殖させ、
ヒト又はマウス由来の親株と融合させる。親株として
は、公知のミエローマ細胞を用いることができ、例えば
ヒト由来の親株としてＫＲ−１２（J. Immunol. 133, 3
001 (1984)）及びＷ１Ｌ−２ＮＳ等（ＡＴＣＣＣＲＬ８
／５５，Cancer 22:517-524 (1968)）、マウス由来の親
株としてＳＰ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８００６、J. V
irol. 36:547-555(1980)）、Ｐ３ｘ６３（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ１５８０，J. Immunol. 123:1548-1550(1979) 及び
ＮＳ−１（ＡＴＣＣ Ｔ１Ｂ１８、Eur. J. Immunol.
6:511 (1976) ）等、ヒト／マウス雑種親株としてＳＨ
Ｍ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６８）等を挙げるこ
とができる。
【００１５】不死化細胞からモノクローナル抗体を回収
する方法は、モノクローナル抗体の作製において常用さ
れている周知の方法により行なうことができる。すなわ
ち、不死化したリンパ球を限界希釈法等でクローン化
し、所望の抗体を産生するものを選択し、それを培地中
又は動物の腹腔内で培養して増殖させ、その培養上清又
は腹水中から所望のモノクローナル抗体を採取すること
ができる。なお、本発明のモノクローナル抗体はヒトＩ
ｇＧ１抗体であるから、所望の抗体を産生するものを選
択する工程において、ヒトＩｇＧ１サブクラスとは反応
するが、他のヒトＩｇＧサブクラス及び他のクラスの免
疫グロブリンとは反応しない抗体を用い、該抗体と特異
的に反応するモノクローナル抗体を産生するものを選択
する。このようなヒトＩｇＧ１特異的抗体は公知であ
り、例えばザイメット社（Zymed 05-3320 ＨＲＤ−マウ
ス Anti-Human IgG1) から市販されている。
する方法は、モノクローナル抗体の作製において常用さ
れている周知の方法により行なうことができる。すなわ
ち、不死化したリンパ球を限界希釈法等でクローン化
し、所望の抗体を産生するものを選択し、それを培地中
又は動物の腹腔内で培養して増殖させ、その培養上清又
は腹水中から所望のモノクローナル抗体を採取すること
ができる。なお、本発明のモノクローナル抗体はヒトＩ
ｇＧ１抗体であるから、所望の抗体を産生するものを選
択する工程において、ヒトＩｇＧ１サブクラスとは反応
するが、他のヒトＩｇＧサブクラス及び他のクラスの免
疫グロブリンとは反応しない抗体を用い、該抗体と特異
的に反応するモノクローナル抗体を産生するものを選択
する。このようなヒトＩｇＧ１特異的抗体は公知であ
り、例えばザイメット社（Zymed 05-3320 ＨＲＤ−マウ
ス Anti-Human IgG1) から市販されている。
【００１６】本発明のモノクローナル抗体ＩｇＧ１に
は、その等価物例えば検出し得るシグナルを供すること
ができるラベルによりラベルされた該抗体やその断片あ
るいは細胞毒性を有する毒素によりラベルされた該抗体
やその断片も含まれる。これらは公知の方法によりモノ
クローナル抗体ＩｇＧ１より容易に調製できる。
は、その等価物例えば検出し得るシグナルを供すること
ができるラベルによりラベルされた該抗体やその断片あ
るいは細胞毒性を有する毒素によりラベルされた該抗体
やその断片も含まれる。これらは公知の方法によりモノ
クローナル抗体ＩｇＧ１より容易に調製できる。
【００１７】
【実施例】次いで、実施例に基づき本発明をより具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
【００１８】ヒト末梢血１０ｍｌよりリンパ球１０7 個
を分離した。これをＳＣＩＤマウス（FOX CHASE SCID
C,B-17/Icr-scid Jcl、（クレア社より購入））メス、
５週令の腹腔に移植した。ＨＤ３抗原（Higashi らの方
法（上掲）によりウマ赤血球より調製）１００μｇを
０．５ｍｌのフロイントの不完全アジュバント（ギブコ
社製）と混合し、腹腔に免疫した。２週間後、同じ操作
を繰り返した。さらに２週間後、５０μｇのＨＤ３抗原
を生理食塩水１ｍｌに懸濁し、腹腔内に投与した。３日
後にマウスを屠殺し、腸間膜リンパ球を摘出した。これ
をリン酸緩衝液にて３回洗浄後、工藤の方法（Tohoku
J. exp. Med. 154,345-355, 1988)に従いＥＢＶでトラ
ンスフォームした。トランスフォーマントの培養上清を
ＨＤ３抗原を用いて抗ＨＤ３抗原抗体産生株を取得し、
これをＳＨＭ−Ｄ３３（ヒトマウス雑種親株：ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６６８）と工藤の方法（上掲）に従い融合し
た。得られたハイブリドーマをＨＤ３抗原を用いてスク
リーニングし、反応性の高い株について限界希釈法によ
りクローニングを行ない、さらに抗ヒトＩｇＧ１特異的
抗体（入手先：ザイメッド社（米国））でスクリーニン
グし、ＩＤＨＤ−７を得た。ＩＤＨＤ−７は生命工学工
業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭＢＰ
−４３８５である。なお、ＩＤＨＤ−７を公知の細胞融
合により抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体産
生ハイブリドーマに誘導することもできる。
を分離した。これをＳＣＩＤマウス（FOX CHASE SCID
C,B-17/Icr-scid Jcl、（クレア社より購入））メス、
５週令の腹腔に移植した。ＨＤ３抗原（Higashi らの方
法（上掲）によりウマ赤血球より調製）１００μｇを
０．５ｍｌのフロイントの不完全アジュバント（ギブコ
社製）と混合し、腹腔に免疫した。２週間後、同じ操作
を繰り返した。さらに２週間後、５０μｇのＨＤ３抗原
を生理食塩水１ｍｌに懸濁し、腹腔内に投与した。３日
後にマウスを屠殺し、腸間膜リンパ球を摘出した。これ
をリン酸緩衝液にて３回洗浄後、工藤の方法（Tohoku
J. exp. Med. 154,345-355, 1988)に従いＥＢＶでトラ
ンスフォームした。トランスフォーマントの培養上清を
ＨＤ３抗原を用いて抗ＨＤ３抗原抗体産生株を取得し、
これをＳＨＭ−Ｄ３３（ヒトマウス雑種親株：ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６６８）と工藤の方法（上掲）に従い融合し
た。得られたハイブリドーマをＨＤ３抗原を用いてスク
リーニングし、反応性の高い株について限界希釈法によ
りクローニングを行ない、さらに抗ヒトＩｇＧ１特異的
抗体（入手先：ザイメッド社（米国））でスクリーニン
グし、ＩＤＨＤ−７を得た。ＩＤＨＤ−７は生命工学工
業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭＢＰ
−４３８５である。なお、ＩＤＨＤ−７を公知の細胞融
合により抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体産
生ハイブリドーマに誘導することもできる。
【００１９】ＩＤＨＤ−７株の培養上清中に生産される
モノクローナル抗体のＨＤ３抗原に対する反応性をＥＬ
ＩＳＡにより調べた。すなわち、１００μｌのＨＤ３抗
原（１μｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートのウェ
ルに入れ、抗原を固定した。次いで油分を遠心除去した
オブアルブミン１％ＰＢＳ液で非特異的吸着部位をブロ
ッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）ＰＢ
Ｓで洗浄した。次いでＩＤＨＤ−７株の培養上清又はＰ
ＢＳを用い種々の希釈率で希釈したその希釈物５０μｌ
を添加し、上記と同様に洗浄した。次いで、ペルオキシ
ダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ１を加え、上記と同様に洗
浄した。次いで、オルソフェニレンジアミン溶液を加え
て発色させ、さらに発色停止用の硫酸を加えた後、４９
２ｎｍにおける吸光度を測定した。また、対照として、
培養上清に代えて標準ＩｇＧを用いた場合も同様に測定
を行なった。結果を図１に示す。
モノクローナル抗体のＨＤ３抗原に対する反応性をＥＬ
ＩＳＡにより調べた。すなわち、１００μｌのＨＤ３抗
原（１μｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートのウェ
ルに入れ、抗原を固定した。次いで油分を遠心除去した
オブアルブミン１％ＰＢＳ液で非特異的吸着部位をブロ
ッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）ＰＢ
Ｓで洗浄した。次いでＩＤＨＤ−７株の培養上清又はＰ
ＢＳを用い種々の希釈率で希釈したその希釈物５０μｌ
を添加し、上記と同様に洗浄した。次いで、ペルオキシ
ダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ１を加え、上記と同様に洗
浄した。次いで、オルソフェニレンジアミン溶液を加え
て発色させ、さらに発色停止用の硫酸を加えた後、４９
２ｎｍにおける吸光度を測定した。また、対照として、
培養上清に代えて標準ＩｇＧを用いた場合も同様に測定
を行なった。結果を図１に示す。
【００２０】図１から明らかなように、ＩＤＨＤ−７株
培養上清のＨＤ３抗原に対する反応性は濃度に依存して
変化しており、培養上清中に抗ＨＤ３モノクローナル抗
体が生産されていることが明らかになった。
培養上清のＨＤ３抗原に対する反応性は濃度に依存して
変化しており、培養上清中に抗ＨＤ３モノクローナル抗
体が生産されていることが明らかになった。
【００２１】また、該モノクローナル抗体のクラス及び
サブクラスをオクタロニー法により調べたところ、Ｉｇ
Ｇ１であることが確認された。
サブクラスをオクタロニー法により調べたところ、Ｉｇ
Ｇ１であることが確認された。
【００２２】精製酵素標識ＩＤＨＤ−７の反応性をＴＬ
Ｃ−イムノステイニング法により調べた。すなわち、３
μｇのＨＤ３抗原をＨＰＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ社
製）で展開し、次いでプレートをポリイソブチルメタク
リレート液にて処理後、５０μｇ／ｍｌの酵素標識ＩＤ
ＨＤ−７を１％ニワトリ血清で希釈したものを１時間反
応させ、ＰＢＳで洗浄後、ジアミノベンチジン溶液を加
えて発色させた。結果を図２のｂに示す。なお、図２の
ａは同様にＴＬＣを行った後オルシノール硫酸にて糖脂
質を発色させたものである。
Ｃ−イムノステイニング法により調べた。すなわち、３
μｇのＨＤ３抗原をＨＰＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ社
製）で展開し、次いでプレートをポリイソブチルメタク
リレート液にて処理後、５０μｇ／ｍｌの酵素標識ＩＤ
ＨＤ−７を１％ニワトリ血清で希釈したものを１時間反
応させ、ＰＢＳで洗浄後、ジアミノベンチジン溶液を加
えて発色させた。結果を図２のｂに示す。なお、図２の
ａは同様にＴＬＣを行った後オルシノール硫酸にて糖脂
質を発色させたものである。
【００２３】図２から明らかなように、ＩＤＨＤ−７は
ＨＤ３に特異的に反応することが確認された。
ＨＤ３に特異的に反応することが確認された。
【００２４】ニワトリで作製した抗ＨＤポリクローナル
抗体１０μｇ／ｍｌをマイクロタイタープレートのウェ
ルに入れ、下部抗体とした。次いで、油分を超遠心除去
したオブアルブミン１％ＰＢＳにて非特異的な吸着部位
をブロッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品
名）ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＨＤ３抗原を、ＰＢＳ
を用い種々の希釈率で希釈したその希釈物及び正常ヒト
血清、肝癌患者血清をＰＢＳで希釈した希釈物を５０μ
ｌずつ添加し、上記と同様に洗浄した。次いで、ペルオ
キシダーゼ標識したＩＤＨＤ−７抗体を加え、上記と同
様に洗浄した。次いで、オルソフェニレンジアミン溶液
を加えて発色させ、さらに発色停止用硫酸を加え、４９
２ｎｍにおける吸光度を測定した。また、対照としてＨ
Ｄ３抗原に代えてＰＢＳを用いた場合も同様に測定を行
った。結果を図３及び表１に示す。
抗体１０μｇ／ｍｌをマイクロタイタープレートのウェ
ルに入れ、下部抗体とした。次いで、油分を超遠心除去
したオブアルブミン１％ＰＢＳにて非特異的な吸着部位
をブロッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品
名）ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＨＤ３抗原を、ＰＢＳ
を用い種々の希釈率で希釈したその希釈物及び正常ヒト
血清、肝癌患者血清をＰＢＳで希釈した希釈物を５０μ
ｌずつ添加し、上記と同様に洗浄した。次いで、ペルオ
キシダーゼ標識したＩＤＨＤ−７抗体を加え、上記と同
様に洗浄した。次いで、オルソフェニレンジアミン溶液
を加えて発色させ、さらに発色停止用硫酸を加え、４９
２ｎｍにおける吸光度を測定した。また、対照としてＨ
Ｄ３抗原に代えてＰＢＳを用いた場合も同様に測定を行
った。結果を図３及び表１に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】図３及び表１から明らかなように、この抗
体を用いて血中ＨＤ３抗原の定量が可能であり、かつ、
肝癌患者において有意に血中濃度の上昇がみられた。こ
れは、癌細胞の検出が可能であることを示している。
体を用いて血中ＨＤ３抗原の定量が可能であり、かつ、
肝癌患者において有意に血中濃度の上昇がみられた。こ
れは、癌細胞の検出が可能であることを示している。
【００２７】凝集したウマ膵臓及びメラノーマ切片を薄
切りし、スライドグラスに貼り付けたものを４％パラホ
ルムアルデヒドにて固定し、過酸化水素０．３％にて内
因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した後、１％トリ血清
ＰＢＳで希釈したペルオキシダーゼ標識ＩＤＨＤ−７抗
体を加え反応させた。次いで、ＰＢＳにて十分に洗浄
し、ジアミノベンチジン溶液を加えて発色させた。ま
た、対照として、ペルオキシダーゼ標識したヒトＩｇＧ
１を用いた場合も同様に測定を行った。結果を表２に示
す。
切りし、スライドグラスに貼り付けたものを４％パラホ
ルムアルデヒドにて固定し、過酸化水素０．３％にて内
因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した後、１％トリ血清
ＰＢＳで希釈したペルオキシダーゼ標識ＩＤＨＤ−７抗
体を加え反応させた。次いで、ＰＢＳにて十分に洗浄
し、ジアミノベンチジン溶液を加えて発色させた。ま
た、対照として、ペルオキシダーゼ標識したヒトＩｇＧ
１を用いた場合も同様に測定を行った。結果を表２に示
す。
【００２８】
【表２】
【００２９】表２から明らかなように、この抗体を用い
て組織中のＨＤの存在を免疫組織化学的に見ることがで
きる。また、肝癌患者切片にＨＤ抗原が発現しているこ
とがわかった。
て組織中のＨＤの存在を免疫組織化学的に見ることがで
きる。また、肝癌患者切片にＨＤ抗原が発現しているこ
とがわかった。
【００３０】
【発明の効果】本発明により、抗ＨＤ抗原ヒトモノクロ
ーナルＩｇＧ１抗体及びそれを産生する細胞株が提供さ
れた。本発明のモノクローナル抗体はＩｇＧ１であるの
で安定性が高く、また、精製も標識も容易である。ま
た、本発明のモノクローナル抗体は、生産の過程におい
て十分な免疫化を行なうことができるので、抗原に対す
る特異性が高い。
ーナルＩｇＧ１抗体及びそれを産生する細胞株が提供さ
れた。本発明のモノクローナル抗体はＩｇＧ１であるの
で安定性が高く、また、精製も標識も容易である。ま
た、本発明のモノクローナル抗体は、生産の過程におい
て十分な免疫化を行なうことができるので、抗原に対す
る特異性が高い。
【図１】ＩＤＨＤ−７株の培養上清中に生産されるモノ
クローナル抗体のＨＤ３抗原に対する反応性をＥＬＩＳ
Ａにより調べた結果を示す図である。
クローナル抗体のＨＤ３抗原に対する反応性をＥＬＩＳ
Ａにより調べた結果を示す図である。
【図２】ＩＤＨＤ−７抗体のガングリオシドＨＤ３に対
する反応性をＴＬＣイムノステイニングにより調べた結
果を示す図である。
する反応性をＴＬＣイムノステイニングにより調べた結
果を示す図である。
【図３】ＩＤＨＤ−７抗体により作成したＨＤ３抗原ア
ッセイ用検量線である。
ッセイ用検量線である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 8310−2Ｊ 33/574 Ｂ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】 ハンガナッツゥ・ダイヘル（ＨＤ）抗原
と特異的に反応する抗ＨＤ抗原ヒトモノクローナルＩｇ
Ｇ１抗体。 - 【請求項２】 前記ＨＤ抗原はＨＤ３抗原である請求項
１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生する細胞株。 - 【請求項４】 ＩＤＨＤ−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３８
５）である請求項３記載の細胞株。 - 【請求項５】 癌細胞を検出する方法であって、試料に
請求項１又は２記載のモノクローナル抗体を混合した
後、該モノクローナル抗体とＨＤ抗原との結合の存在を
検出する癌細胞検出方法。 - 【請求項６】 ＩＤＨＤ−７から誘導される、請求項１
記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5227937A JPH0753599A (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | ハンガナッツゥ・ダイヘル抗原に対するヒトモノクローナル抗体及びそれを産生する細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5227937A JPH0753599A (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | ハンガナッツゥ・ダイヘル抗原に対するヒトモノクローナル抗体及びそれを産生する細胞株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0753599A true JPH0753599A (ja) | 1995-02-28 |
Family
ID=16868625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5227937A Pending JPH0753599A (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | ハンガナッツゥ・ダイヘル抗原に対するヒトモノクローナル抗体及びそれを産生する細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0753599A (ja) |
-
1993
- 1993-08-20 JP JP5227937A patent/JPH0753599A/ja active Pending
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