JPH07507804A - 予備標的化方法及び化合物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

予備標的化方法及び化合物 技術分野 本発明は、リガンド／抗リガンド対の一方のメンバーに複合する標的とする成分 を標的部位に与えるのに有用な方法、化合物、組成物及びキットに関する。標的 とする成分複合体の局在化及び清澄化の後に、診断または治療剤複合体の標的部 位に対する直接または間接の結合が起こる。ビオチンの放射性金属による標識化 方法及びビオチンの改良された放射性ハロゲン化方法、並びに関連する化合物に ついてもまた開示されている。また、清澄剤（浄化剤）、抗リガンド−標的成分 複合体、標的細胞保持増大成分及び付加的な方法が記載さ従来の癌治療は二つの 問題により妨げられている。一般に達成可能な標的比（血液中で循環する投与量 に対する腫瘍に対して局在化する投与量の比、または骨髄に移動する投与量に対 する腫瘍に対して局在化する投与量の比）は低い。また、腫瘍に対して与えられ た放射線または治療剤の絶対量は、多くの場合、注目に値する腫瘍応答を引き出 すには不十分である。腫瘍に対する標的比または絶対容量の改良がめられて本発 明は、診断及び治療用予備標的方法、それに有用な成分及びそれらの成分を製造 する方法に関する。そのような予備標的方法は、従来の癌治療法と比較して、標 的細胞部位に対する標的比の改良または絶対容量の増大により特徴付けら本発明 は、診断及び治療用予備標的方法に有用なキレート−ビオチン化合物及び放射性 ハロゲン化ビオチン化合物について記載する。本発明は、また、ビオチンのよう な、標的成分−リガントの、診断及び治療用予備標的方法に有用な化合物を提供 する。成分及び（例えば、化学療法薬剤の）インターナリゼーションを増大させ るためまたは（例えば、放射性核種の）標的細胞表面での保持を増大させるため に使用される方法論の選択についてもまた議論される。 更に、本発明は、アビジンまたはストレプトアビジンのような、標的成分−抗リ ガントの、診断及び治療用予備標的方法に有用な化合物を提供する。亜鉛フィン ガータンパク質−ｄｓＤＮ＾フラグメントが結合した対を含む他のリガンド−抗 リガンドシステムについてもまた考察される。そのような抗リガンド−標的成分 化合物の製造及び精製についても議論される。 本発明は、また、哺乳動物受容体から循環する標的成分−リガント（２段階）ま たは標的成分−抗リガント（２段階）または抗リガンド（３段階）の除去を容易 にするための清澄剤を提供する。好ましい清澄剤は、ガラクトース基のものと非 ガラクトース基のものに分類することができる。夫々のカテゴリー内において、 好ましい清澄剤は、重合性またはタンパク質基のものである。粒状剤、肉体各工 程及び生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）装置もまた、本発明の実施に使用するために 考察される。 また、本発明は、標的細胞部位での放射性核種の保持を増大するための抗リガン ドとしてのストレプトアビジンを使用する方法、及びそのような方法の一つを構 成する予備標的プロトコールに関する。更に詳しくは、本発明のそれらの実施ｆ ｌ　様１：　Ｇ；ｉ、（１）標的成分−ストレプトアビジン−放射性核種（及び 直接またはキレート若しくはリンカ−を介してストレプトアビジンと結合した放 射性核種）、並びに（２）ストレプトアビジン−放射性核種に先立って標的成分 −ビオチンを投与するか、または（３）分子を含有する予備標的ストレプトアビ ジンに結合したビオチン−放射性核種の何れかが含有される。 本発明は、更に、その動脈に供給された標的細胞集団へのより効果的な局在化を 達成するために、治療成分を含有する分子の動脈内または他の局所投与を採用す る予備標的法を提供する。本発明の他の方法は、放射性核種−リガント分子また は放射性核種−抗リガント分子の投与に先立って、短期間の骨髄保護剤または血 管浸透性増大剤を投与することを含む。 更に、ＦマまたはＦａｂ抗体フラグメント等の一価の標的成分は、本発明の予備 標的法に有用である。本発明の予備標的法を使用した、標的細胞への、化学療法 薬剤、抗腫瘍剤（例えば、サイトカイン等）及び毒素等の他の非放射能治療剤の 送達についても記載されている。 図面の簡単な説明 第１図は、アビジンの静脈内投与に続くビオチン化抗体の血液浄化を示す。 第２図は、放射標識化抗体（キレート化放射性レニウムと共有結合した抗体を含 む従来法）の投与と比較して、３段階の予備標的プロトコールでの放射性レニウ ムの腫瘍への取り込みを示す。 第３図は、天然のＮＲ−ＬＵ−１０全抗体の対照プロフィールと比較したＮＲ− Ｌｔｌ−１０−ストレプトアビジン複合体（ＬＵ−１０づ

【「＾マ）の腫瘍への 取り込みプロフィールを示す。 第４図は、ＮＲ−ＬＵ−１０−ストレプトアビジン複合体の腫瘍の取り込み及び 血液の清澄化プロフィールを示す。 第５図は、ｌ−１２５−標識化タンパク質の注入量を百分率で示した、オロソム コイドと比較した、アシアロオロソムコイドの血液からの急速な清澄化を示す。 第６図は、ｌ−１２５−標識化タンパク質の注入量を百分率で示した、オロソム コイドと比較した、アシアロオロソムコイドの５分間での限定された生物分布を 示す。 第７図は、複合体投与後２５時間での、３種の対照（○、・。 閣）及び２種の投与量の清澄剤（×９口）の投与によるＮＲ−ＬＵ−１０−スト レプトアビジン複合体の血液清澄化を示す。 第８図は、清澄剤投与後２時間での、３種の対照（グループ１．２及び５）及び ２種の投与量の清澄剤（グループ３及び４）の投与によるＬＵ−１０−３ｌｒＡ ｖ　複合体についての限定された生物分布データを示す。 第９図は、清澄剤投与後２時間での、ＮＲ−ＬＵ−１０−ストレプトアビジン複 合体血清の、ビオチン結合能力を示す。 第１０図は、複合体投与後２４時間での、対照（○）及び３種の投与量の清澄剤 （△９口）の投与によるＮＲ−ＬＵ−１０−ストレブトアビジン複合体の血液清 澄化に要する時間を示す。 第１１Ａ図は、複合体投与後２時間での、対照（ＰＢＳ　）および３種の投与量 （５０，２０及びｌＯμｇ）の清澄剤の投与によるＬＵ−１０−３ＩＴ＾マ複合 体の血液清澄化を示す。 第１１Ｂ図は、複合体投与後２時間での、対照（ＰＢＳ　）及び３種の投与量（ ５０，２０及び１０μｇ）の清澄剤の投与によるＬＵ−１０−３ｉｒ＾マ複合体 血液ビオチン結合能力を示す。 第１２図は、時間に関するＮＲ−Ｌｔｌ−１ｎ−ストレプトアビジン複合体（ム ）のＮＲ−Ｌｉｔ−１０全抗体（△）に対する腫瘍での延長された保持を示す。 第１３図は、ストレプトアビジン（・、　ＰＩＦ−１−１３１標識化）で複合化 されたＮＲ−１，Ｕ−１０−ビオチン（○、　ｌ−１２５で標識化したクロラミ ンＴ）の予備形成複合体の肝臓での延長された保持を示す。 第１４図は、ストレプトアビジン−ＮＲ−ＬＵ−１０−（ＰＩＦ−１−１２５＞ 標識に対するビオチン−ＰＩＦ−１−１３１１識の肝臓での延長された保持を示 す。 第１５Δ図は、％ｌ　Ｄ／Ｇ単位でのＰＩＰ−ビオシチンの増大した量の腫瘍で の取り込みを示す。 第１５Ｂ図は、ｐｌ、ｌｏｌ、／Ｇ小単位の時間に関するＰＩＦ−ビオシチンの 増大した量の腫瘍での取り込みを示す。 第１６Ａ図は、％Ｉ　Ｄ／Ｇ単位でのＰＩＦ−ビオシチンの０５μｇ量での血液 の局在化に対する腫瘍を示す。 第１６Ｂ図は、％１０単位でのＰＩＰ−ビオシチンの０．５μｇ量での血液の局 在化に対する腫瘍を示す。 第１７Ａ図は、％ｌ　Ｄ／Ｇ単位での時間に関するＬＵ−１ｎづ【「＾マ及びＰ ＩＰ−ビオシチンの腫瘍での取り込みを示す。 第１７Ｂ図は、％ｌ　Ｄ／Ｇ単位での時間に関するＬＵ−！０−３ｌ＋＾マ及び ＰＩＰ−ビオシチンの腫瘍での取り込みを示す。 第１８図は、腫瘍及び血液中での時間に関するＰＩＦ−ビオシチン：　ＬＵ−１ ０−３ｌ＋ＡＶ比を示す。 発明の詳細な説明 本発明を記載する前に、開示の中で使用するある語についての定義を記載してお くことが有用であろう。 標的成分、定義された集団の細胞に結合する分子。標的成分は、受容体、オリゴ ヌクレオチド、酵素的基質、抗原決定基、または他の標的細胞集団上またはその 中に存在する結合部位に結合する。抗体は、明細書を通して、標的成分の模範例 として使用される。腫瘍は、本発明を記載する際に、標的の模範例として使用さ れる。 リガンド／抗すガンド対ニ一般に相対的に高い親和性の特異的結合を示す相補／ 抗相補セットの分子。リガンド／抗リガンド対の例としては、亜鉛フィンガータ ンパク質／ｄｓＤＮ＾フラグメント、酵素／阻害剤、）＼ブテン／抗体、レクチ ン／炭水化物、リガンド／受容体、及びビオチン／アビジンが挙げられる。ビオ チン／アビジンは、明細書を通してリガンド／抗リガンド対の模範例として使用 される。 抗リガンド・ここで定義するように、「抗リガンド」は、高親和性を示し、そし て好ましくは、相補リガンドと多価結合する。好ましくは、抗リガンドは、急速 な腎臓浄化値（クリアランス）を避けるのに十分な程大きく、そして標的成分− リガントの複合体の架橋及び凝集を達成するための十分な多価性を有している。 −価の抗リガンドもまた、本発明により意図される。本発明の抗リガンドは、例 えば、直接肝臓から摂取されるガラクトース成分のような、それらの直接の取り 込みという構造的な特徴を示すか、或いは示すことが期待されるものである。ア ビジン及びストレプトアビジンは、ここでは抗リガンドの模範例として使用され る。 アビジン・ここで定義するように、「アビジン」としては、アビジン、ストレプ トアビジン及び高親和性で、多価または一価てビオチンに結合する、それらの誘 導体及び類縁物が挙小さく、動物またはヒトに静脈投与した場合に、血清、血液 及び／または全身の急速な清澄化を示す溶解性の分子である。 ビオチンは、模範的リガンドとして使用される。 活性剤：放射性核種、薬剤、抗腫瘍剤、毒素等を含有する、診断または治療剤（ 「ペイロード（弾頭）」）。放射性核種治療剤は、模範的活性剤として使用され る。 ＮアＳ、キレート・ここで定義するように、ｒＮ、Ｓ、キレート」という語は、 （＋）金属または放射性金属と配位結合し、（２）標的成分、リガンドまたは抗 リガンドに共有結合により付着することが可能な、二官能性キレート剤を含有す る。特に好ましいＮ、Ｓアキレートは、Ｎ２５２及びＮ。 Ｓ核を有する。Ｎ、Ｓ、キレートの例としては、例えば、フイッツバーグ外（Ｆ ＋１ｔｒｂｅ＋ｇ　ｅｌ　ａｔ）　、米国ブロク、ナショナルアカデミ−サイエ ンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８５：４０２４−２ ９　、　＋９８８　；ウニバー外（Ｗｅｂｅｒ　ｒｔ　ａｌ）、生物結合化学（ Ｂｉｏｃｏｎｉ、Ｃｈｅｍ、）　Ｉ：４３１−３７．１９９（１；及びそこに記 載された引例等に記載されている。 予備標的化：ここで定義するように、予備標的化は、リガンド／抗リガンド対の 一方のメンバーと接合する標的成分の標的点の局在化を含み；この標的成分接合 の最適な標的対非標的蓄積のための十分な時間の後、リガンド／抗リガンド対の 反対のメンバーと接合する活性剤を投与し、標的成分複合体の標的部位（２段階 予備標的）に結合（直接または間接）する。３段階またはここに記載した他の関 連する方法もまた、包含される。 清澄剤：受容体の循環中に存在する投与された成分（例えば、標的成分−リガン ト、標的成分−抗リガントまたは抗リガンドのみ）と結合、複合、または、さも なければ会合することが可能で、それにより受容体の体内から循環する成分を除 去、血液循環系からの除去または循環系内でそれらを不活性化するのを容易にす る試薬。 清澄剤は、好ましくは、清澄剤として同一の処理プロトコールで使用される標的 成分により認識される標的細胞の集団に清澄剤が近づくのを妨げる、大きさ、電 荷、立体配置またはそれらの組合せ等の物理的性質により特徴付けられる。 標的細胞保持：放射性核種または他の治療剤が標的細胞表面または標的細胞内に 残存する時間の量。そのような治療剤を含有する複合体または分子の異化作用は 、標的細胞保持の損失に主として関係しているように思われる。 複合体：複合体は、化学的複合体（共有または非共有結合した）、融合タンパク 質等が包含される。 られる標的部位での透過性を増大することが可能な試薬。例示透過性増大成分は 、−若しくはそれ以上の以下の機構により機能する：ボスト毛管ベッドの作用に より小静脈の内皮中に間隙を誘起する；全体の毛管ベッド上の作用によりそのよ うな間隙を誘起する；細胞−細胞間の結合を粉砕する：標的細胞の炎症性反応を 伝達する；等。 細胞間接合部・隣接する形質膜と相互作用する領域。細胞間接合部は、機能的に 　（１）細胞をしっかりと一緒に結合する接着接合部（例えば、デスモソーム（ 癒着部））；（２）細胞をしっかりと一緒に結合し、且つ細胞間の分子の漏出を 防止する不透過性接合部（即ち、密着帯）、及び（３）隣接する細胞間に小さい 分子の通過を取り持つ伝達接合部（例えば、細隙結合）に分類することができる 。 免疫原：適当な条件下において、特異的免疫反応を誘起し、その反応（例えば、 特異的抗体、特異的に増感された１９２８球またはその両者）の生成物と反応す ることが可能な物質。 ハプテン免疫原：抗体の特異的結合基または１９２８球の認識部位と相互作用す ることができるような化学的立体配置を有しているが、抗原決定基とは異なり、 それ自身は免疫反応（例えば、検出可能なＴ細胞反応または検出可能量の抗原の 生成）を誘起しない、特異的な、タンノ（り質を含有しな０物質。担体タンパク 質と結合した場合、それは免疫反応を誘り質仲介物で、一方において、リンパ球 幼若化、マクロファージ活性化または他の細胞に対する細胞毒性等の、他の細胞 誘起免疫機能を調節することができる。 観念または治療のための標的成分−放射性同位元素複合体の生体内（ｉｎ　ｖｉ ｖｏ　）投与と結合した認識されている欠点は、付着した放射性試薬の非標的及 び標的部位の両者での局在化である。投与された放射標識化複合体が循環系から 除去されるまで、正常な器官及び組織は一時的に付着した放射性試薬にさらされ る。例えば、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）に投与された、放射標識化された総て の抗体は、比較的遅い血液の清浄化を示し、標的部位の最大の局在化は、一般に 投与後、１〜３日で生ずる。一般に、循環系からの複合体の浄化時間が長くなれ ばなるほど、非標的器官の放射能暴露が大きくなる。 それらの特性は、ヒトの免疫治療に特に問題である。ヒトの臨床試験において、 全抗体に結合した放射性同位体の長０循環半減期は、相対的に多い量の放射能を 全身に行き渡らせることになる。特に、非常に放射能感受性の骨髄は、非特異的 毒性の投与量限定器官である。 非標的組織を放射性同位体にさらすのを減少させるため、強力な標的成分は、一 般に、標的に対する特異性及び反応性を保持しながら、最小の非標的反応性を示 すものを特定するために篩分けられる。非標的に対する暴露（及び逆の非標的局 在化及び／または毒性）を減少するために、放射性治療用複合体の量を増加して 投与してもよく、更に、放射性診断用複合体の非標的への蓄積の減少は、ノく・ ツクグラウンドと標的の間のコントラストを改良することになる。 単独または標的化複合体として投与された治療薬剤は、同様の不利益を伴ってい る。更にまた、ゴールは、受容不能な正常器官の毒性（非標的組織の暴露による ）の域値よりも低く保ちながら、最高の可能な濃度の薬剤を投与することである （標的とする組織の暴露を最大にする）。然しながら、放射性同位体とは異なり 、治療薬剤は、細胞毒性の効果を及ぼすために、標的細胞中に取り込まれる必要 がある。標的成分−治療薬剤複合体の場合、標的成分の相対標的特異性と、標的 成分−薬剤複合体の増大された標的細胞の内在化のための手段を組み合わせるこ とは有益であろう。 それとは逆に、増大された標的細胞の内在化は、若し、ヒトが診断試薬−標的成 分複合体を服用した場合には、有益ではない。診断性複合体の内在化は、細胞の 異化及び複合体の分解を招く。分解により、診断試薬の小さな付加物または診断 試薬それ自身が細胞から放出され、従−フて、複合体を標識−特異的仕様で検出 する能力を取り除く。 非標的組織を診断または治療薬にさらすことを減少させるための一つの方法は、 標的部位の標的成分を「予備標的化」し、次いで、標的部位において、「予備標 的化」された成分と結合することが可能な、急速に浄化する診断または治療剤複 合体を続いて投与する。予備標的化技術の幾つかの態様についての記載は、米国 特許第４．８６３．７１３号（Ｇｏｏｄｗｉｎ　ｅｌ　ａｌ、）に見出される。 典型的な予備標的化のアプローチ（「３段階」）は、以下のように模式的に図示 される。 ★抗リガンド 簡単には、この３段階予備標的化プロトコルは、標的部位において局在化し、循 環系中で希釈することを許容する抗体−リガント複合体の投与を特徴とする。 次いて、投与された抗リガンドは抗体−リガント複合体に結合し、そして血液か ら結合していない抗体−リガント複合体を片付ける。好ましい抗リガンドは大き く、そして循環する抗体−リガント複合体の架橋及び凝集を行うための十分な多 価性を有している。抗リガンドによる浄化は、恐らく、血液中で循環する抗リガ ンド架橋体及び／または抗体−リガント複合体に起因し、それは、受容体のＲＥ Ｓ　（細網内皮系）による複合体／′凝集体の浄化に導く。この種の抗リガンド 浄化は、好ましくは多価の分子により達成されるが、それ自身のＲＥＳにより浄 化されるのに十分な大きさの一価の分子もまた使用することができる。一方、受 容体に基づく浄化機構、例えば、Ａｓｈｖｅｌｌ受容体ヘキソース、例えば、ガ ラクトース、マンノース等、残基認識機構は、抗リガンド浄化に原因があるかも しれない。そのような浄化機構は、ＲＥＳ錯体／凝集体浄化機構よりも、リガン ドに関し、抗リガンドの価数にあまり依存しない。リガンド−抗リガンド対が比 較的高い親和性の結合を示すことが好ましい。 次いで、急速な全身浄化を示す診断または治療剤−リガント複合体が投与される 。循環系が、標的細胞に結合した抗体−リガント−抗リガンド錯体に近似する活 性剤−リガント複合体を育らず場合、抗リガンドは、活性剤−リガント複合体と 結合し、そして標的部位において抗体−リガント：抗リガンド：リガンド−活性 剤の「サンドウィッヂＪを形成する。 診断または治療剤は、（抗体、抗体フラグメントまたは他のゆっくりと浄化する 標的成分よりも寧ろ）速やかに浄化するリガンドに付加するので、この技術は、 活性剤に対し、非標的物をさらすことを減少することを約束する。 代りの予備標的化方法は、抗リガンド浄化剤を非経口投与する工程を除去する。 それらの「２段階」工程は、標的成分−リガントまたは標的成分−抗リガントを 投与し、次いでリガンド−抗リガンド対の反対のメンバーに対し共役する活性剤 を投与することを特徴とする。本発明の２段階予備標的法の付加的の工程ｒ１． ５Ｊとして、清澄剤（好ましくはリガンドまたは抗リガンドのみ以外）を、循環 する標的成分を含有する複合体の浄化を容易にするために投与する。 ２段階予備標的化のアプローチにおいて、清澄剤は好ましくは標的細胞集団に対 し、直接または先に投与し、そして標的とする成分−抗リガント、または標的と する成分−リガント複合体に結合した標的細胞を介しても、結合を生じないもの である。２段階予備標的の例としては、ビオチン化ヒトトランスフェリンをアビ ジン−標的成分複合体の清澄剤として使用するものが含まれ、ここで清澄剤の大 きさは、トランスフェリン−ビオチン−循環アビジン−標的成分複合体の肝臓清 澄を結果し、標的細胞部位で結合したアビジン−標的成分複合体との会合を妨げ る。グツドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）、Ｄ、＾、。 ２段階予備標的化アプローチは、３段階予備標的プロトコールでの清澄剤と結び ついたある欠点を克服する。より具体的には、動物実験により得られたデータは 、生体内（ｉｎマ１マ０）において、予備標的化標的成分−リガント複合体に結 合する抗リガンド（即ち、細胞結合複合体）は、標的細胞からの標的成分−リガ ント複合体を除去することを示している。観察された現象についての一つの説明 は、多価の抗リガンドが細胞表面において標的成分−リガント複合体と架橋し、 それにより得られる錯体の内在化を開始または容易にすることである。細胞から の標的成分−リガントの見かけ損失は、複合体の内部分解及び／または複合体か らの活性剤の放出（細胞表面または細胞内の何れか）の結果であろう。観察され た現象のもう一つの説明は、標的細胞の膜内での浸透性の変化が、如何なる分子 も標的細胞内へ受動拡散するのを増大させる。又、標的成分−リガントの幾つか の損失は、他の分子の標的成分−リガントに対する引き続く結合による親和性の 変化により引き起こされ、例えば、抗イデイオタイプモノクローナル抗体結合が 、腫瘍結合モノクローナル抗体の除去を引き起こす。 本発明は、この現象（標的細胞からの標的成分−リガントの見かけ損失）が、一 般に治療剤の生体内に配布することについて、または特に薬剤配布について、有 用に使用されることが認められている。例えば、標的成分は、リガンド及び治療 剤の両者に共有結合し、受容体に投与してもよい。抗リガンドの引き続く投与は 、表面に結合する標的成分−リガント−治療剤三部分複合体と架橋し、三部分複 合体（及び従って活性剤）の内在化を誘発する。一方、標的成分−リガントは、 標的細胞表面に配布され、次いで、抗リガンド−治療剤を投与してもよい。 本発明の一つの側面において、標的成分−抗リガント複合体は、生体内に投与さ れ、標的成分−抗リガント複合体（即ち、及びこの複合体の循環系からの除去に より）の標的への局在化により、活性剤−リガント複合体を非経口投与される。 この方法は、標的細胞での標的成分−抗リガント複合体：リガンド−活性剤錯体 （標的成分−リガント：抗リガンド：リガンド−活性剤錯体及び標的成分−リガ ント：抗リガンド−活性剤錯体と比較して）の保持を増大する。種々のリガンド ／抗リガンド対が、請求した発明内での使用に適しているけれども、好ましいリ ガンド／抗リガンド対は、ビオチン／アビジンである。 本発明の第二の側面において、放射性ヨウ素処理ビオチン及び関連する方法が開 示される。以前は、放射性ヨウ素処理ビオチン誘導体は、高分子量であり、特徴 づけることか困難である。ここで記載される放射性ヨウ素処理ビオチンは、容易 に且つ良く特徴づけられる、低分子量の化合物である。 本発明の第三の側面において、標的成分−リガント複合体は、生体内に投与され 、標的成分−抗リガント複合体（即ち、及びこの複合体の循環系からの除去によ り）の標的への局在化により、薬剤−抗リガント複合体を非経口投与される。 この２段階法は、標的残基複合体の予備標的法を提供するのみならず、引き続く 標的成分−リガント−抗リガンド−薬剤錯体の標的細胞内への内在化を誘起する 。一方、他の実施態様では、表面において標的成分−リガント：抗リガンド・リ ガンド−薬剤錯体を生ずる３段階プロトコールを提供し、リガント−薬剤複合体 が同時にまたは抗リガンドの投与後、短時間内に投与される（即ち、標的成分− リガント−抗リガンド錯体が標的細胞表面から除去される前に）。付加的な内在 化の方法論が本発明により考察され、ここで議論される。 本発明の第四の側面において、テクネシウム−９９ｍ１　レニウム−１８６及び レニウム−１８８によるビオチンの放射標識化の方法が開示される。先には、ビ オチン誘導体は、予備標的化免疫シンチフォトグラフィー（例えば、ヴアージ他 （Ｙｉ＋ｒｉ　ｅｌｏｓ　ｅｔ　ａｔ、）による開示、ジュー。二二一クレアり ディカルに使用するにはインジウム−１１１で放射標識化されていた。しかしな がら、９９１ＮＴｃは、免疫シンチフォトグラフィーには、（１）低コストであ ること、（ｉｉ）供給が便利であること及び（ｉｉｉ）好ましい核的性質を有し ていることから、特に好ましい放射性核種である。レニウム−１８６は９９″７ Ｃと非常によく似たキレート化学を示し、優れた治療放射性核種（即ち、３．７ 日の半減期及び１．Ｇ７ＭｃＶの最大粒子であり、これは１３１１　と類似する ）であると考えられている。それ故、ビオチンのテクネシウムとレニウムによる 放射標識化の請求した方法は、多くの利点を提供する。 本発明は、又、イツトリウム−９０、ルテニウム−１７７、サマリウム−１５３ 、及び他の適当な＋３金属による放射標識化に関する。Ｙ−９０は、治療に特に 好ましい放射性核種である。何故なら、それは、高い特異活性、組織内での輻射 の寄与に関し長い通路長、高い平衡線量定数及び好ましい半減期性能を含む好ま しい核性能を示すからである。より具体的には、Ｙ−９０のβ放射（β、、・０ ．９３７　ＭｅＶ）は、総てのβ放射の中で最も強力なものである。Ｙ−９０の Ｘ９ｏ値は５．３４ｍ＋ｎ　（即ち、点源から放射されたエネルギーの９０％が ５．３４ｎ＋ｍ半径の球体に吸収される）である。Ｙ−９０は、高い平衡線量定 数、即ち平均エネルギー／核遷移、δ＝　１．９９ラドグラム／μｃ−ｈで、標 的治療に適した６４時間の半減期を有する。Ｙ−９０は、高い特異活性で製造で き、発電機生成物として有用である。Ｙ−９０の特異的利点は、（１）それが、 予備標的化標的成分−リガントまたは標的成分−抗リガント複合体により直接標 的としたものではない、近隣の標的細胞を殺す能力があり、（２）低い平均粒子 エネルギー（但し、十分に大きい標的容積には有用である）の他のβ放射器より も、局在化し、たμＣ当たりのより大きな輻射線を放射することである。 Ｌｕ−１７７は、標的とする核種治療に特に好ましい放射性核種である。何故な ら、それは、中庸のエネルギーβ放射（β、。 ・０署４０　Ｍｅｎ）を有しており、高い特異活性に有用であり、２ｇの理想的 なエネルギー及びイメージ化のための存在量（２０８ｋｅＶ　、　１１％及び１ １３　ｋｅｙ、　７％）を放射し、そしてそれは比較的長い半減期（１６１時間 ）を有するからである。Ｌｕ−１７７のＸ、ｏは、０．３１ｍｍ、即ち、点源か ら放射されたエネルギーの９０％がＯＪＩｍｍ半径の球体に吸収される。Ｌｔｌ −１７７は、平衡線量定数、即ち平均エネルギー／核遷移が０．３Ｉラドグラム ／μｃ−ｈ及び標的治療放射性核種として機能するに適正な半減期を有する。Ｌ ｕ−１７７の特異的利点は、（１）その放射されたエネルギーは、転移性腫瘍病 巣または複雑なリンパ節のような、標的とする腫瘍容積が小さいものにも十分吸 収され、（２）その長い物理的半減期は、予備標的配布方法の、腫瘍保持性能を 最適に使用することである。 本発明の「標的成分」は、腫瘍成分等の、定義した標的細胞集団と結合する。こ の点に関し有用な好ましい標的成分は、抗体及び抗体フラグメント、ペプチド、 及びホルモンである。 細胞表面受容体（低密度リポタンパク質、トランスフェリン及びインシュリンを 含む）、繊維素溶解酵素、抗ＨＥＲ２、アネキシン等の血小板結合タンパク質、 及び生物学的応答修飾因子（インターロイキン、インターフェロン、エリスロポ エチン及びコロニー刺激因子を含む）もまた好ましい標的成分である。また、受 容体に対する結合に引き続いて内在化し、そしである度合いで核と交渉を持つ、 抗ＥＧＦ受容体抗体が、オーガー（Ａｕｇｅ＋　）放射体及び核結合薬剤の標的 細胞核に対する配布を容易にするための、本発明において使用される標的成分と して好ま１７い。例えば、標的細胞核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の部分を捕捉す るアンチセンスオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドは、本発明の実施行 為において、標的成分としてもまた有用である。細胞表面に結合するオリゴヌク レオチドもまた有用である。定義した標的細胞集団に対し結合する能力を保持し ている上記した標的成分の類縁物もまた請求した発明の範囲内で使用してもよい 。更に、合成標的成分も示される。 一］二記（７た分子の機能的等偽物は、本発明の標的成分としてもまた有用であ る。一つの標的成分機能的等偽物は、「模擬」化合物、正確な立体配置を模造し た及び／または標的成分−標的細胞結合の配向を示した有機化学構造物である。 他の標的成分機能的等価物は、「微小の」ポリペプチドとして示した短いポリペ プチドであり、これは、コンピュータに支援された分子モデル及び結合親和性が 変更された変異株を用いて構築されたものであり、その微小のポリペプチドは標 的成分の結合親和性を示す。 本発明の好ましい標的成分は、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、 ペプチド、オリゴヌクレオチド等である。本発明の実施行為において有用である ポリクローナル抗体は、ポリクローナル（ミシガン大学、メディカル、プル。 ローナルまたはそのフラグメント、チャオ他による開示「化学病理学的及び化学 薬品」におけるＲｅｓ、’Ｃｏｍｍ、　（Ｃｈａｏ　ｅｌ　ｔｌ、）、Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍ、ｉｎ　Ｃｈｅｍ、Ｐｌｔｈ、　＆　Ｐｈａ＋ｍ、）　、９　ニア４９ −６１．１９７４゜本発明の実施行為において有用であるモノクローナル抗体に は、全抗体及びそのフラグメントが含まれる。そのようなモノクローナル抗体及 びフラグメントは、ハイブリドーマ合成、組み換えＤＮＡ技術及びタンパク質合 成のような従来の技術に従って、製造することができる。有益なモノクローナル 抗体及びフラグメントは、如何なる種（ヒトを含む）から誘導されてもよく、一 種以上の種からの配列を使用したキメラタンパク質として形成されてもよい。一 般に、コーラ−アンドマイルスタイン、ネイチャー誌（にｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　 Ｍｉｌｓｌｅｉｎ、　Ｎａヒトモノクローナル抗体または「ヒト化した」マウス 抗体を、本発明の標的成分として有効である。例えば、マウスモノクローナル抗 体は、マウスＦマ領域（即ち、抗原結合部位を含む）をコード化したヌクレオチ ド配列またはその補足的に決定する領域を、ヒト定常領域部及びＦｅ領域をコー ド化するヌクレオチド配列で、例えば、ヨーロッパ特許出願第０．４１１゜８９ ３＾２に開示されているのと同様の方法で、遺伝子的に組み換えることにより、 「ヒト化コしてもよい。幾つかのマウス残基は、また、適正な標的部位結合特性 を守るために、ヒト可変領域フレームワーク領域内で保持されてもよい。ヒト化 された標的成分は、ホスト受容体の抗体またはポリペプチドの免疫反応性を減少 させることが認められており、半減期の増大及び逆の免疫反応の可能性を減少さ せることを許容する。 本発明の他の好ましい標的成分は、アネキシン及び、ＰＡＰ−１（胎盤抗凝血タ ンパク質またはアネキシン■）等の他の血小板結合タンパク質である。アネキシ ンは（アネキシン１１を除き）、約３６キロダルトンの、一本鎖の非グリコジル 化タンパク質である。アネキシンは、カルシウムイオン結合の原理に基づく多く の生物学的性質を有している。研究は、アネキシンが、ミクロモル量のカルシウ ムの存在下に膜脂質と高い親和性で結合することを示している。カルシウムの存 在下、それらのタンパク質は、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノ シン等の負に荷電した燐脂質との特に高い親和性を有している。 アネキシンは、抗凝固効果を及ぼず。抗炎症機構と類似の仕方で、凝固阻害は負 に荷電した燐脂質表面（即ち、血小板に対シフ）にアネキシンが結合することに より伝達され、その結合は、そのような負に荷電した表面燐脂質により凝固因子 の活性化を遮断する。アネキシンは、速やかに、即ち、数分内の出来事で、標的 部位に局在化するが、長い時間の間、血清中に循環して残存する。 それらの性質の結果、アネキシンは、血液凝固の診断のための２段階または３段 階予備標的化プロトコール、またはＤＶＴ　（深部静脈血栓症）　、ＰＥ　（肺 動脈塞栓症）、心臓発作、卒中等の兆候と結合した血液凝固の処理に使用される 。２段階予備標的化アプローチを使用する診断及び治療プロトコールの例は、本 発明のこの側面を更に明らかにするために、以下に記載する。 多くの病理学上の条件と結びついた血液凝固の視覚化のために、化学的複合体ま たはアネキシンとアビジンまたはストレプトアビジンとの融合タンパク質を、そ のような診断を所望する受容体に投与する。複合体のアネキシンタンパク質は、 血液凝固物等の、負に荷電した表面燐脂質により特徴付けられる標的部位に速や かに局在化する。速やかな標的部位の取り込みの結果として、ここで議論したよ うな、清澄剤を短時間（約５分〜約１一時間で、約１５分以内が好ましい）の経 過の後に投与してもよい。清澄剤は、アネキシンー抗リガンド複合体の血清レベ ルを急速に減少させるのに役に立つ。次に、例えばＴｃ−９９ｍ等の映像化放射 性核種で標識化したビオチンを投与する。非標識結合放射標識化ビオチンは、受 容体から急速に除去される。 従って、標的部位の映像化は、非標的部位に放射線を最小限の暴露で進められる 。このアプローチは、速度、肺血餅等の映像化が困難なのを容易にし、そして血 餅の血液に対する比の改良という利点を提供する。 数多くの病理学」二の条件と結びついた血液の凝固を含む治療学の応用のために 、化学的複合体またはアネキシンとアビジンまたはストレプトアビジンとの融合 タンパク質を、そのような診断を所望する受容体に投与する。ここで議論したよ うな、清澄剤を、アネキシンー抗リガンド複合体の血清レベルを減少させるため に、短時間（約５分〜約１時間で、約１５分以内が好ましい）の経過の後に投与 してもよい。繊維素分解試薬、組織プラスミノゲン活性剤、血栓溶解剤（例えば 、ストレプトキナーゼ、アニフィル化プラスミノゲンストレプトキナーゼ活性剤 錯体）等の治療剤と複合したビオチンは、この方法で配布できる。そのような用 量の養生法を、例えば、受容者の生理的条件に応じて、１−目１回、数週間に亘 って繰り返す。かくして、治療剤の標的部位への配布は、その試薬の非標的部位 への最小の暴露で進められる。 本発明の実施に有用なアネキシンの例は、Ｂｏｈｎにより１９７９年に、アネキ シンの豊富な源である、ヒト胎盤から単離された、胎盤タンパク質４　（ＰＰ４ 　）と名付けられた、アネキシン■である。アネキシンＶは、４つの領域から成 り、夫々が５つのαラセンから形成され、そのαラセンは領域の間の接続要素と して機能する。側面から、分子は、その凹状表面の５個のカルシウム結合部位が ある、王冠のように見え、それによりアネキシンー燐脂質相互作用が育らされる 。上記した特性を有する他のアネキシンもまた、本発明の実施において有用であ る。アネキシン■は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ、）により発現される。 ここで有用な活性剤（診断または治療）のタイプには、毒素、抗腫瘍剤、薬剤及 び放射性核種が含まれる。本発明内において有用である数種の有効な毒素は、Ａ 及びＢ鎖から成る。 Ａ鎖は、細胞毒の部分であり、そしてＢ鎖は、完全な毒素分子（ホロトキシン） の受容体−結合部位である。毒素Ｂ鎖は、非標的細胞との結合を育らすかもしれ ないので、毒素Ａ鎖のみを標的成分に複合することが、屡々有利である。然しな 力くら、毒素Ｂ鎖の除去は、非特異的細胞毒性を減少させる力（、それは、相当 するヘロトキシンー標的成分複合体と比較して、一般に毒素Δ鎖−標的タン、＜ り質複合体の強度を減少させることにもまたつながる。 この点に関する好ましい毒素には、アブリン、リシチン、セデシン、シュードモ ナスエキソトキシンＡ１ジフテソ１トキ：／ン、百甲整トキシン及び志賀トキシ ン等のホロトキシン；リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、’／ｘ−＝ 」ｊ＋スゴキキンキシ・ンＡの酵素部分、’）　７９　’Ｊ　７トキシンＡ鎖、 百日咳トキ泥／の酵素部分、志賀トキシンの酵素部分、ゲロニン、ア５メリ力や まごぼう抗生タンｌくり質、サボリン、Ｉ−ＩＪチン、ヤバネオオｌえギトキシ ン及びヘビ毒△ミプチド等のＡ鎖または「Ａ鎖様」分子が含まれる。リポソーム 不活性化タン・バク質（Ｒ１１’ｓ）　、転移及び細胞結合能力が欠如しても） る自然に生ずるり：／バク質合成阻害剤もまたここでの使用に適している。 ここでの使用に適している薬剤には、ビンブラスチン、ドキソルビシン、ブエオ マイシン、メトトレキセ−１・、５−フルオロウラシル、６−チオグアニン、シ タラビン、シクロホスフ？ミド及びシスブラチナム等の従来の化学療法剤、並び に庖腫瘍学の原理と実行、第２版、ペンシルヴアニア州、フィラデルフィア、ジ エイ、ビー、リッピンコット社、ニス、エイ。 ローゼンバーグ、ニス、ヘイマン、ブイ−。ティー、デヴイＳ、＾、Ｒｏｓｅｎ ｂｅｒｇ、Ｊ、Ｂ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｌ　Ｃｏ、、Ｐｈ１ｌｘｄｅｌｐｈｉｘ 、Ｐ＾。 １９８５、Ｃｈａｐｔｅｒ　１４．）に記載されているような他の従来の化学療 法剤も含まれる。本発明の範囲内の特に好まし７い薬剤は、トリコテセンである 。 トリコテセンは、クラスファンギーインパーフェクティ（Ｆｕｎｇｉ　ｉｍｐｅ ＋Ｉｅｃｌｉ）の土壌微生物により製造されるか、バカラスメガポタミカ（Ｂａ ｃｃｈａ＋ｕｓ　ｍｅｇａｐｏｊａｍｉｃｘ）　（Ｂａ＋ｎｂｏ＋ｇ　、　Ｉ。 Ｒ，Ｐ＋ｏｃ、　Ｍｏ１ｅｃ、５ｕｂｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、８　：４１−１１０ ．　１９８３；ｊａ＋ｖｉｓ　＆Ｍａｚｚｏｌａ、Ａｃｃ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、 １５：　３３８−３９５．　１９８２に開示）から単離される。それらは最も毒 性が高い分子のように見え、炭素、水素及び酸素のみを含む（Ｔｕｎｍ、　Ｃ， Ｆｏｌｃｃ）ｕ、　Ｃｈｅｍ、　Ｏ「ｇ。 Ｎａ１ｕ＋ｓ１．　３１：６１−１１７．１９７４参照）。それらは、開始、成 長または停市相においてタンパク質合成の阻害剤と１７でのリポソームのレベル で機能することが総て報告されている。 トリコテセンには二つの大きな分類があり、中央セスキテルペノイド構造のみを 有するもの及び付加的巨大環状環（夫々、単環及び巨大環トリコテセン）を有す るものである。 単環１リコデセンは、米国特許第４．７４４．９８１号及び第４．９０６゜４５ ２号（ここに参照として導入される）に記載されて０るように、３一つのグルー プ（即ち、グル・−ブΔ、Ｂ及びＣ）＋こａｌ１分類される。７グループＡの単 環トリコテセンの代表的な例としては、スキルペ：ノ、フリジンＣ１ジヒドロト リコテセン、スキルベン−４，８−ジオール、ベルルカロール、スキルペントリ オール、Ｔ−２テトラオール、ペンタヒドロキシスキルペン、４−デアセチルネ オソラニオール、トリコデＪレミン、・ｆアセチルカロネクトリン、カロネクト リン、ジアセチルベルルカロール、４−モノアセトギシスキルペノール、４．１ ５−　ジアセトキシスヤルベノール、７−ヒトロキシジアセトキシスキルベノー ル、８−化ド１−フキシジアセトキシスキルペノール（ネオソラニオール）、７ ．８−シヒドロキシジアセトキシスキジレベノール、７−ヒドロヤジー８−アセ チルジアセトキシスキルペノール、８−アセチルネオソラニオール、ＮＴ−１、 ＮＴ−２、ＩＩＴ−２、Ｔ−２、及びア七デルτ−２トキシンが挙げられる。 グループＢの単環トリコテセンの代表的な例としては、トリコテセン、トリコテ セン、デオキシニノくレノール、３−アセトキシデオキシニバレノール、５−ア セチルデオキシニノくレノール、３．１５−ジアセチルデオキシニバレノール、 二ノくレノール、４−アセチルニバレノール（フサレノン−Ｘ）、４．１５−イ ドアセチルニバレノール、４，７．１５−トリアチルニノくレノ−／ｌ、、及び テトラアセチルニバレノールが挙げられる。 グループＣの単環トリコテセンの代表的な例としては、クロトコール及びクロト シンが挙げられる。巨大環状トリコテ−センの代表的な例としては、ベルルカリ ンＡ１ベルルカリンＢ１ベルルカリンＪ（サトラトキシンＣ）、ロワジンＡ１０ リジンＤ１０リジンＥ（サトラトキシンＤ）、ロリンン阻すトラトキシンＦ１サ トラトシキンＧ１サトラトキシン■１１ベルチスボリン、マイトキシンＡ１マイ トキシンＣ１マイト・キシンＢ１ミロトドキシンＡ１ミロトドキシンＢ１ミロト ドキシンＣ１ミロトドキシンＤ１０リドキシンＡ１０リドキシンＢ及びロリドキ シンＤが挙げられる。更に、一般の「トリコテセン」セスキテルペノイド環構造 は、高等植物のＢａｃｃｈａ＋ｉｓ　ｍｅｇａｐｏｌａ訓Ｃａから単離される「 バツカリン」と呼ばれる化合物にもまた存在し、そしてそれらは、例えば、ジャ ーヴイス他（Ｊａｒｖｉｓ　ｅｌ　ａｌ、）によるアレオパシイの化学、米国化 学会シンポジウム第２６８回二編集者エイ、シー、トンプソン。 １９８４年、　＋４９−１５９頁（ＣｈｅｍｉｓｔＢ　ｏｆ＾１ｌｅｏｐａｔｈ ７　、％ＡＣ３Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、２６８：　ｃｄ、＾ 、Ｃ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　、　１９８４、ｐｐ、１４９−１５９参照）により開 示されているように、文献にも記載されている。 メルカプトプリン、Ｎ−メチルホルムアミド、２−アミノ−１，３，４−チアジ アゾール、メルフアラン、ヘキサメチルメラミン、硝酸ガリウム、３％チミジン 、ジクロロメトトレキセート、ミドグアシン、メラミン、ブロモデオキシウリジ ン、ヨードデオキシウリジン、セフ１スチン、Ｉ−（２−クロロエチル）−３− （２，６−ジオキソ−３〜ピペリジル）−１−ニトロソウレア、Ｎ、Ｎ’−ヘキ サメチレン−ビス−アセトアミド、アザシチジン、ジブロモグルシトール、エル ヴイニア・アスパラギナーゼ、イフォスアミド、２−メルカプトエタンスルホネ ート、テニボシド、タキ゛へ・−ル、３−デアザウリジン、溶解性ベーカーズ・ アンチフォール、ホモハリングトニン、シクロシチジン、アシビシン、ＩｃＲＦ −１８７、スピロムスチン、レバミゾール、クロロシトシン、アジリジニルベン ゾキノン、スピロゲルマニウム、アクラルビシン、ペントラチン、ＰＡＬ＾、カ ルポプラチン、アムサクリン、カラセミド、イブロプラチン、ミソニダゾール、 ジヒドロ−５−アザシチジン、４′−デオキシ−ドキソルビシン、メノガリル、 燐酸トリシリビン、ファザラビン、チアシフリン、テロキジロン、エシオホス、 Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ニトロ−ＩＨ−イミダゾール−１−アセト アミド、ミドキサントロン、アコダゾール、アモナフィド、フルダラビン、燐酸 塩、ピベンジモール、ジデミンＢ１メルバロン、ジヒドロレンペロン、フラボン −８−酢酸、オキサントラゾール、イミダゾール、トリメトレキセート、デオキ シスペルグアリン、エキノマイシン、及びジデオキシシチジンＭＣＩ捜査薬剤、 薬物データ１９８７年、　ＮＩＨ刊行物、第８８−２１４１号、　１９８７年改 訂版（ＮＣＩ　Ｉｎｖｅｓｌｉｇａｔｉｏｎａｌ　Ｄｒｕｇｓ　、　Ｐｈａ＋ｍ ａｃｅｕｌｉｃｘｌ　Ｄｉｌａ　１９８７、ＮＩＩｆ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ 　Ｎｏ、　８８−２１４１、Ｒｅｙｉｓｅｄ　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９１１７参 照）等の実験的薬剤もまた好ましい。 本発明内で有用な放射性核種には、γ−放射装置、陽電子放射装置、オーガー（ ＾ｕｇｕ　）電子放射装置、Ｘ線放射装置及び蛍光放射装置が挙げられ、β及び α−放射装置が治療用途には好ましい。放射性核種は当業界において広く知られ ており、そして、 ＋２３１．　１２５１．　１３０５　１３１１．　１３３５　１３５１％７３ｃ 、７２＾ｓ、　７２Ｓｅ。 ９０Ｙ、　ｓａｙ　、　”ｈ、１００ｐＬ　＋０１ｍ１ｌｌ、ｌ＋９５ｂ、１２ １１ｇ、。 ＋９７Ｈｇ、２１１人（２１２３ｉ、＋５３５．　＋６９Ｅ、２１２ｐｂ、１１ １０ｐ、Ｌｌｌｌｌ、６７Ｇ、６８Ｇａ、６７Ｃｏ、”［ｌ＋、７６Ｂ「、　７ ７Ｂ＋、　９９ｍ７ｃ。 ＩＩＣ，１３Ｎ、　＋５Ｑ、及び　１８Ｆを含む。好ましい放射性核種には、　 ＩｆｌＦｌｌｉ、＋８Ｊ、２０３ｐｉ、、２１２ｐｌ、２＋２１１ｉ、１０９ｐ ｄ。 ６４Ｃ，”Ｃｕ、　９ｏｙ、１２５５　１３１５７７Ｂ「、２１１＾ｔ、　９７ Ｒｕ　、Ｉ　Ｏ’３　Ｒｈ。 １９８＾υ、及び１９９＾ｇ、又は　＋７７Ｌ、が含まれる。 他の抗腫瘍剤は、本発明に従い投与される。抗腫瘍剤の例としては、ＩＬ−２、 腫瘍壊死因子等のサイトカイン、し−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレク チン等のレクチン炎症応答促進因子（セレクチン）及び同様の分子が挙げられる 。 本発明内での使用に適したリガンドとしては、ビオチン、ハブテン、レクチン、 エピトープ、ｄｓＤＮ人フラグメント、酵素阻害剤、及びそれらの類縁物並びに 誘導体が挙げられる。 有用な補完抗リガンドとしては、アビジン（ビオチンに対して）、炭水化物（レ クチンに対して）、抗体、フラグメントまたは、模擬物質（ハブテン及びエピト ープに対して）及び亜鉛フィンガータンパク質（ｄｓＤＮＡに対して）並びに酵 素（酵素阻害剤に対して）を含む、それらの類縁物が挙げられる。好ましいリガ ンド及び抗リガンドは、少なくとも約ＫＤ≧Ｉｎ−ｏＭの親和性でお互いに結合 する。 上記したように、亜鉛フィンガータンパク質／ｄｓＤＮＡは、本発明によって考 慮されているりガント／抗リガンド対である。 亜鉛フィンガータンパク質は、転写中のｄｓＤＮＡ及び助剤の特異的促進因子領 域と結合する、約３０のアミノ酸の繰り返しサブユニットを含むタンパク質のク ラスである。それらのタンパク質は、また、ｄｓＤＮＡと未知の機構により結き することができる。抗体と同様に、亜鉛フィンガータンパク質は、可変で、保護 された領域から成るタンパク質の一族である。クラスとしての亜鉛フィンガータ ンパク質は、約２〜約３９の繰り返しサブユニット（フィンガー）を含有し、夫 々のフィンガーは、特異的ヌクレオチド配列と結合することが可能である。 夫々のフィンガーは、ヌクレオチド配列に依存するｄｓＤＮ入構造の形状中の「 裂は目（ｃｌｅｆｔ　）　Ｊと結合可能なものである。 本発明者らは、多くの数のサブユニットがより大きい親和性と特異性に相当する と仮定している。加えて、亜鉛はタンパク質の夫々のサブユニット内に導入され ており、ｄｓＤＮＡ結合、のための適正な形状を維持するのに重要である。 亜鉛フィンガータンパク質／ｄｓＤＮ＾結合対の予備標的プロトコールへの使用 を記載するために、２段階アプローチを以下に記載する。このリガンド−抗リガ ンド結合対は、本発明の３段階予備標的プロト・コールにおいてもまた使用され る。２段階予備標的については、亜鉛フィンガータンパク質またはｄｓＤＮ＾フ ラグメントは、例えば、ここで記載する複合方法を含む、それについての如何な る便利な方法によっても、標的成分と複合化する。 ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドとタンパク質を複合させるための幾つかの方法 が開発されている。一つの簡単２な方法は、ＤＮＡの糖成分の酸化である。得ら れるアルデヒド基は、タンバク買上のアミンとの反応に有用である。そのような 反応により生ずるアミンは、次いで、ＮＩＣＮＢ）＋４等の還元剤との反応によ り還元され、より適当なアミン結合を形成する。 他のタンパク質−オリゴヌクレオチド複合化方法には、Ｎａ１０４等の酸化剤を 使用するＤＮＡの糖残基の初期酸化が含まれる。形成されたジアルデヒドは、塩 酸５−ピリジルシスタミン及びＮａＣＮＢＩＩｑにより処理される。このンチオ ピリジン誘導体は、次いで、トリブチルホスフィンと反応され、チオール付加物 を生ずる。遊離チオールを有するＤＮＡ付加物のマレイミド誘導タンパク質との 反応は、チオエーテルオリゴヌクレオチド−タンパク質複合体を生ずる。例えば 、キュイユパース他の著書“放射性標識ラベル付き抗感覚ヌクレオチドによる抗 体−オリゴヌク１ノチド結合の特異認識、癌の二段階放射免疫治療の新規な方法 ″（Ｋｕｉｊｐｅ＋ｕｌ　ｉｌ　、’５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｒｅｃｏｇｎｉｌｉｏ ｎ　ｏｌ＾ｎｌｉｂｏｄ７−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｌｉｄｅ　Ｃｏｎｊｕｇａ ｔｅｓ　ｂｙ　Ｒａｄｉｏｌｘｂｅｌｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅｓ：　Ａ　Ｎｏｖｅｌ＾ｐｐ＋ｏａｃｈ　ｌｏｔ　Ｔｗ。 −３ｔｅｐ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅ＋ａｐｙ　ｏｆ　Ｃａｎｃｕ、’Ｂ ｉｏｃｏｎｉｕｇａｌｅハ町、４　：９４−１０２　（１９９３））参照。 複合体は、思考の肉体的状態及び判っているまたは予期される病状を勘案して選 択される経路により受容者に投与される。投与した複合体の標的部位への局在化 （またはここで記載する清澄剤処理）に続いて、治療剤（例えば、放射性核種、 薬剤または抗腫瘍剤）に対するリガンド対複合体の他のメンバーの投与が行われ る。 投与した治療剤含有複合体は、複合体を含む先に局在化された標的試薬と結合す る。標的部位では結合しない治療剤含有複合体は、モノクローナル抗体−治療剤 複合体が除去されるよりも非常に速い速度で受容体の体から除去される。更に、 そのような治療剤含有複合体は、より速やかな排泄のために、化学的に変換させ られ、必要に応じて、治療剤の非標的部への暴露を減少させる。 投与した化合物及びモノクローナル抗体−亜鉛フィンガータンパク質／ｄｓＤＮ Ａ−治療剤の２段階予備標的プロトコールについての最終の生体内で生成した「 サンドウィッチ」の図を以下に示す。 モノクローナル抗体 モノクローナル抗体 亜鉛フィンガータンパク質／ｄｓＤＮ人フラグメント　リガンド／抗リガンド結 合対の使用は、免疫原性に関し利点を提供する。予備標的プロトコールにおいて 使用される標的試薬は、ヒトまたはヒト化されたもので、池の投与される成分の 総て（治療剤を除き）は、ヒト起源のものである。このアプローチの付加的な利 点は、亜鉛フィンガータンパク質が、合成しまたはクローン化したｄｓＤＮＡフ ラグメントとの特異的で高い親和性相互作用を調節して処理できることであり、 それにより投与された成分の、正常な組織との非特異的相互作用が除去される。 本発明のこの観点での一つの実施態様には、二重螺旋のＤＮＡそれ自身を標的と した予備標的アプローチの使用が含まれる。本発明のそのようなプロトコールは 、例えば、遺伝子治療、腫瘍抑制性ＤＮＡの配布、欠失遺伝子等が有用である。 より具体的には、標的成分−亜鉛フィンガータンパク質は、標的部位に対し、予 備標的化される。次いで、亜鉛フィンガータンパク質に対して補完的なｄｓＤＮ Ａフラグメントを注入し、局在化した亜鉛フィンガータンパク質に結合させる。 何故なら、亜鉛フィンガータンパク質−ＤＮＡ相互作用は、通常細胞の生理的機 構であり、ＤＮＡは、細胞周囲に、妨害する化学物質からは自由に配布される。 ｄｓＤＮ＾は、次いで、標的細胞により、それについての通常の機構を介して、 即ち、エンドサイト−シス（飲食作用）を介して、内在化される。 ビオチン−アビジンリガンド−抗リガンド系を含む、好ましい２段階予備標的に おいて投与される一つの成分は、標的成分−アビジンまたは標的成分−ストレプ トアビジン複合体である。本発明のそれらの実施態様において有用な好まし、い 標的成分は、モノクローナル抗体である。タンパク質−タンパク質複合体は、一 般に、高分子量で架橋した種を含む、望ましくない副生成物を形成するが故に、 一般的に云って問題である。ビオチン化抗体とストレプトアビジンの反応を含む 非共有結合合成技術は、かなりの副生成物を形成することが報告されている。ま た、ストレプトアビジン上の４つのビオチン結合部位の少なくとも−・っは、抗 体及びストレプトアビジンが結合するために使用されるが、他のそのような結合 部位はストレプトアビジン−抗体複合体の立体構造の故に、ビオチンの結合には 立体化学的に適していない。 従って、共有結合のストレプトアビジン−抗体複合体が好ましいが、これによれ ば、高分子量の副生成物が屡々得られる。架橋及び凝集形成の度合いは、ヘテロ ２官能性架橋試薬を使用するタンパク質誘導化のレベルを含む、幾つかの因子イ ミジル４−　（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−Ｉ−カルポジキレ−１ −（ＳＭＣＣ）−誘導抗体とイミノチオラン−誘導ス１−１７ブトアビジンを反 応させることによる共有チオエーテル複合体の製造について議論している。 ストレプトアビジン−タンパク質性標的成分複合体は、好ましくは、以下の実施 例ｘ１に記載したように製造され、その製法はＳＭＣＣ−誘導ストレプトアビジ ンの製造、　ＤＴＴ−還元タンパク質性標的成分の製造、製造した二つの成分の 複合化；及び−置換複合体の精製の工程を含む。精製した留分は、好ましくは、 次の技術により更に特徴付けられる：ＨＨ，Ｃサイズ排除、ＳＩ’１Ｓ−ＰＡＧ Ｅ、免疫反応性、ビオチン結合能力及び生体内での研究。 一方、本発明の実施に有用なチオエーテル複合体は、５ＰＤＰ。 イミノチオレート、ＳＡＴ八等の他のチオレート化試薬、または１−マレイミド ベンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル（４− ヨードアセチル）アミノベンゾエート等の他のチオ活性へテロ２官能性架橋物質 を使用して形成される。 本発明のストレプトアビジン−タンパク質性標的成分複合体は、成るタンパク質 のリシンイプシロンアミノ基と他のタンパク質のマレイミド−誘導形態の複合化 によってもまた形成することができる。例えば、ｐ）ｌ　８−１０において、リ シンイプシロンアミノ基は、例えば、タンパク質をＳＭＣＣで処理することによ り製造したタンパク質マレイミドと反応させることにより、安定なアミン共有結 合複合体を生ずる。更に、複合体は、一つのタンパク質のリシンイプシロンアミ ノ成分と、他のタンパク質のアルデヒド官能性基との反応により製造される。ア ルデヒド官能性基は、例えば、タンパク質糖残基の酸化により、またはアルデヒ ド含有へテロ２官能性架橋物質との反応により生ぜしめることが可能である。 ストレプトアビジン−標的成分複合体を形成するための他の方法には、ＳＭＣＣ −誘導ストレプトアビジンと結合する固定化されたイミノビオチンが含まれる。 この複合体／精製方法には、ストレプトアビジンに対するイミノビオチンの（固 定化された）可逆の結合特性が、複合体を未反応の標的成分から容易に分離する ために利用される。イミノビオチン結合は、低ｐＨ及び上昇されたイオン強度、 例えば、１ｌＨ２０＾ｃ、０．５ＭＮａＣｌでｐＨ４（５０ｍＭ）の条件化で可 逆化できる。 ストレプトアビジンについては、例えば、複合化／精製は、以下のように進行す る。 −ＳＭＣＣ−誘導ストレプトアビジンは、固定されたイミノビオチン、ミズーリ 州、セントルイスのピアースケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　、　Ｍｉｓｓｏｕ＋ｉ）の製品に、好ましくはカラム構 成中において、結合される；−ＤＴＴ−還元抗体（好ましくは還元剤なし）の過 剰モル（ストレプトアビジンに対し２）は、窒素で置換した、燐酸緩衝イミノビ オチンカラム、ここではＳＭＣＣ−ストレプトアビジンが結合する（ＤＴＴ−還 元抗体は結合するＳＭＣＣ−ストレプトアビジンを飽和し、カラムを通って通過 する結合していない還元した抗体は、再使用できる）、に添加される。 −カラムを遊離した過剰量の抗体で洗浄する；そして−ｐ＋＋を低下させイオン 性強度を増加させる緩衝液を、カラムに添加し、ストレプトアビジン−抗体複合 体を純粋な形で溶出させる。 上記示したように、標的成分が仲介したりガント−抗リガンド予備標的は、標的 組織において、標的成分−リガントまたは標的成分−抗リガントの何れかの局在 化を含む。屡々、そのような標的組織への取り込みのピークは、血液中の標的成 分を含有する複合体の循環レベルが、最適の標的対非標的複合体比を達成するこ とを許容するために十分低くなる前に、到達する。この問題を取り除くために、 二つのアプローチが有用である。第一のアプローチは、標的成分を含有する複合 体を、血液から「自然の」または内因的清澄機構により、取り除くことを認める 。この方法は、タンパク質の全身性浄化において変動することにより、並びに内 因的リガンドまたは抗リガンドにより複雑である。例えば、内在性ビオチンは、 ストレプトアビジン−標的成分複合体のビオチン結合部位の保護を妨害する。 標的成分−リガントまたは標的成分−抗リガント複合体の標的対血液比を改良す るための第二のアプローチは、補完抗リガンドまたはりガントを構成するか或い は含有する分子で、複合体の生体内での複合化による循環系からの複合体を「追 跡する」。ビオチン化抗体をリガンド−標的成分複合体として使用する場合、例 えば、アビジンは、循環しているビオチン化抗体との複合化により、比較的大き な凝集種を形成（７、その凝集種は、ＲＥＳの取り込みにより血液中から速やか に取り除かれる。例えば、米国特許第４．８６３．７１３号参照。この方法に関 する一つの問題は、然しなから、腫瘍結合ビオチン化抗体のアビジンによる架橋 または内在化の能力である。 アビジン−標的成分複合体を使用した場合、ポリビオチン化トランスフ１リンを 使用することにより、ＲＥＳの取り込みにより取り除かれる比較的大きな凝集種 を形成する。例えば、グ’ｙドウイン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）による、Ｉ、　Ｎｕｃ ｌ、　Ｍｅｄ−−−−−１３−」↓川。 １Ｂ＋６−１８　、＋９９２）を参照。 然しなから、ポリビオチン化トランスフェリンは、また、腫瘍−結合アビジン化 −標識成分を、架橋し、内在化するのに有効である。更に、双方の「追跡」方法 論は、中間体の凝集した成分の延長された存在を含み、寧ろ大きさよりも、サイ ズであり（それはＲＥＳの取り込みにより、大きなサイズの粒子をできるだけ早 く除去することにはならない）、それにより、引き続いて投与されるリガンド− 活性剤または抗リガンド−活性剤の血清中ての保持が得られる。そのような血清 の保持は、標的細胞体血液標的比を都合のよくない方へ押しつける。 本発明は、抗リガンド／リガンド（例えば、アビジン／ビオチン）−標的成分（ 例えば、抗体）複合体の、生体内での錯化及び血液浄化に使用するのを容易にす る物理的性質を有するタンパク質及び非タンパク質組成物の清澄剤を提供する。 それらの清澄剤は、標的成分複合体の標的：血液比を改良するのに有用である。 それらの清澄剤の他の応用には、抗体−活性剤の配布療法を使用することによる 、血液凝固等を含む病巣の映像化または治療が含まれる。例えば、効能がある抗 凝固剤は、速やかな標的の局在化及び高い標的；非標的の標的比を与える。有効 な清澄剤を使用する本発明の予備標的プロトコールにおいて投与された活性剤は 、所望の方法で標的とし、それ故、肺塞栓及び深部静脈血栓のよ・うな条件の映 像化／治療に有用である。 本発明の実施に有用な清澄剤は、好ましくは、以下の−またはそれ以上の特性を 示す。 一生体内での標的成分−リガント（または抗リガンド）複合体との、急速で、効 果的な錯化ニ ー続いて投与される補完の抗リガンドまたはりガント含有分子と結合しうる標的 成分複合体の血液からの速やかな浄化；−大鼠の標的成分複合体を浄化（または 不活性化）するための高い能力；及び −低い免疫原性。 好ま［−７い清澄剤は、ヘキソース基及び非ヘキシース基成分を含む６．ヘキソ ース基清澄剤は、アッシコウェル（＾ｓｈｗｅｌｌ）受容体により認識されたー 若しくはそれ以上のヘキソース（６個の臭素の糖残基）を導入するために誘導さ れた分子である。そのようなヘキソースの例とし５ては、ガラクトース、マシノ ース等が挙げられる。ガラクトースは、本件記載の目的のための、予備標的清澄 剤ヘキソース誘導体である。そこで、ガラクトース基及び非ガラクトース基分子 を以下において議論する。 タンパク質タイプのガラクトース基清澄剤には、内在性露出ガラクト−ス残基を 有するか、またはそのようなガラクトース残基を露出または導入することにより 誘導されるタンパク質が含まれる。露出したガラクトース残基は、それについて の特異的受容体（＾ｓｈｗｅｌｌ受容体）を介して肝臓中で飲食作用により急速 な浄化をする清澄剤を支配する。それらの受容体は、清澄剤と結合し、そして肝 細胞中での飲食作用を誘起し、リソソーム（氷解小体）との融合に導き、そして 受容体を再循環して細胞表面に戻す。この浄化機構は、高い効率、高い容量及び 急速な動力学により特徴付けられる。 タンパク質基／ガラクトースー保有種の清澄剤の例としては、ヒトα−１酸糖タ ンパク質のアシアロオルソムコイド（オロソムコイド、分子Ｊｉ＝４１．０００ ミニ４１．０００ダルトン−２，７）が挙げられる。アシアロオルソムコイドの 血液からの急速な浄化は、ギャリ他（Ｇａｌｌｉ、ｅｔ　ａｔ、）のＪ、　ｏｆ 　Ｎｕｃｌ。 Ｉｄ、＾ｆｌｉｅ−ｄ　Ｓｃｉ、３２　（２）：　１１０−ＩＳ、１９８８によ り文書化されている。 オロソムコイドをノイラミニダーゼで処理すると、シアル酸残基が除去され、そ れによりガラクトース残基が露出する。 他のそのような誘導された清澄剤としては、例えば、ガラクトシル化アルブミン 、ガラクトシル化−１ｇＭ、ガラクトシル化−ＩｇＧ、アシアロハプトグロビン 、アシアロフェツイン、アシアロセルロプラスミン等が挙げられる。 ヒト血清アルブミン（Ｈ３＾）は、例えば、次のようにして、本発明の清澄剤中 に使用されてもよい。 （ヘキソース）７−ヒト血清アルブミン（ＨＳ＾）−（すガント）１、 式中、ｎは】から約１０の整数であり、ｍは１から約２５の整数であり、そして ヘキソースはアッシュウェル（Ａｓｈｖｅｌｌ　）受容体として認識されている 。 本発明の好ましい実施態様において、リガンドはビオチンであり、ヘキソースは ガラクトースである。より好ましくは、１１ｓＡは１０〜２０のガラクト−ス残 基及び１−〜５のビオチン残基から誘導される。更により好ましくは、本発明の Ｈ５＾清澄剤は、約１２〜約１５のガラクトース及び３個のビオチンから誘導側 々の清澄剤分子が、ビオチン化レベルの範囲が列挙した全数の平均で１のビオチ ンであるようなものを製造するのに十分な方法で行われる。３個のビオチンでの 誘導化は、例えば、総てが少なくとも１個のビオチン残基を有する、個々の清澄 剤分子により形成される生成物の混合物を生ずる。１個のビオチンでの誘導化は 、個々の分子の殆どの部分がビオチンて誘導されていない清澄剤生成物の混合物 を生ずる。この記載において使用されている総ての数は、議論している清澄剤の 平均ビオチン化について言及する。 更に、ヒトタンパク質に基づく清澄剤、特に、例えば、オロソムコイド及びヒト 血清アルブミン等のヒト血清タンパクい。アシオロソルソムコイドを使用する他 の利点は、ヒトオロソムコイドが、例えば、ミズーリー州、セントルイスのシグ マケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｓｔ、１．ｏ山、Ｍｉ ｓｓｏｕｒｉ）から市販されていることである。 清澄剤が直接の錯化により標的の複合体との結合を危うくすることを防止するた めの一つの方法は、清澄剤が血管外の空間へ拡散することが殆んどなく、標的− 結合複合体と結合するに十分な大きさの清澄剤を使用することである。この戦略 は、単独でも、或いは露出したガラクトース残基が急速な肝臓での取り込みを支 配するという上記した認識と組み合わせても有用である。このサイズを除外する 戦略は、本発明の非ガラクトース基清澄剤の有効性を増大する。組合せ（露出し たガラクトース及びサイズ）の戦略は、「タンノ々り質型」または「重合体型」 ガラクトース基清澄剤の有効性を改良する。 ガラクトース基清澄剤には、ビオチン化アシアロオロソムコイド、ガラクトシル −ビオチニル−ヒト血清アルブミンまたは他の非免疫原性溶解性天然タンパク質 のガラクトシル化及びビオチン化誘導体、並びにビオチン−及びガラクトース− 誘導化ポリグルタミン酸塩、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸 塩等の、中間の分子量（約４０．０００〜約２００、０００ダルトンの範囲）の ガラクトシル化、ビオチン化タンパク質（例えば、循環するストレプトアビジン −標識成分複合体を除去するために）が含まれる。ガラクトシル−ビオチニル− １ｇＭまたはＩｇＧ　（約１５０．０００ダルトン）分子、並びにヒト血清アル ブミン、ＩｇＧ及びＩｇＭ等のガラクトース−及びビオチン−誘導化トランスフ ェリン複合体を含む、標的に対し殆んと攻撃しないことを特徴とする高分子量成 分（約２００゜０００〜約１．０（１０，０００ダルトンの範囲）もまた、本発 明において請求される清澄剤と１７で使用できる。ガラクトース−及びビオチン −誘導化デキストラン、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドポリマー、ポリビ ニルピロリドン−ポリスチレン共重合体、ジビニルエーテル−マレイン酸共重合 体、ビラン共重合体またはＰＥＧ等の、中間体または高分子量（約４０．０００ 〜約１．０００．０００ダルトンの範囲）の化学的に変性したポリマーもまた、 本発明の実施に際して清澄剤としての有用性を有している。更に、速やかに浄化 するビオチン化リポソーム（標的に対する攻撃性が低い高分子量成分）は、本発 明の実施においで使用するための清澄剤を製造するために、ガラクトース及びビ オチンから誘導することかできる。 本発明において有用な清澄剤の別の種類には、生体内ての容積の分布のように、 血管の空間に対し限定されるべき十分に極性の、ガラクトース及びビオチンに誘 導される小さい分子（約５００〜約Ｉｎ、０００ダルトン）が含まれる。より具 体的には、それらの試薬は、高度に荷電した構造を示し、そしてその結果、血管 外の容積中に容易に分散してはゆかない。何故なら、それらは血管系を画する脂 質膜を通って容易に拡散しないからである。そのような清澄剤の例としては、モ ノ−またはポリ−ビオチン−誘導化６．６’　−［（３，３’−ジメチル［１， Ｉ’　−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（アゾ）ビス［４−アミノ−５ −ヒドロキシ−１，３−ナフタレンジスルホン酸］テトラナトリウム塩、モノ− またはポリ−ビオチニル−ガラクトース−誘導化ポリ硫酸化デキストランービオ ヂン、モノ−またはポリ−ビオチニル−ガラクトース−誘導化デキストラン−ビ オチン等が挙げられる。 ガラクトース露出または一誘導化清澄剤は、好ましくは、（１）リガンド−抗リ ガンド親和性を介して相当するりガント−または抗リガンド−含有複合体を速や かに且つ効率的に錯化でき、且つ（２）一般化されたＲＥＳシステムにより吸収 される錯体中に凝集するのとは反対に、肺及び肺臓を含む、ガラクトース受容体 の、肝臓特異的分解システムを経由する血液からのそのような錯体を浄化するこ とができる。更に、リガンド−抗リガンド相互作用の親和性と結びついた、ガラ クトース−仲介肝臓摂取の速やかな動力学は、中位のまたは低分子量の担体さえ も使用することを可能にする。 血液中に局在している低または中位分子量（約４０，０００〜約２００、０００ ダルトンの範囲）の非ガラクトース残基−保有成分は、細胞外の空間と平衡状態 になり、そしてそれ故、直接、標的結合複合体２二結合し、標的の局在化を弱め る。更に、ＲＥＳシステムを介して動作する凝集−介在浄化機構は、清澄剤の化 学量論的に非常に過剰な量を用いることにより達成される。一方、本発明におい て使用されるガラクトース基清澄剤の速やかな血液浄化は、平衡化を防止し、そ して高親和性のりガント−抗すガノド結合は、低化学量論量のそのようなガラク トース基清澄剤の使用を許容する。この特徴は、標的結合複合体を折衷するガラ クトース基清澄剤の有効性を減少させる。何故なら、投与されるそのような清澄 剤の絶対量が減少するからである。 本発明のガラクトース−及びビオチン−誘導化清澄剤を含む清澄剤の評価実験を 、実施例ＸＸＩ＋に詳細に記載した。実施例ＸＸＩ＋の実験により試験をした本 発明の特異的清澄剤は、（＋）アシアロオロソノ、コ・イド−ビオチン、（２） ガラクトース及びビオチンから誘導されたヒト血清アルブミン、及び（３）ビオ チン及びガラクトースから誘導された、７０．０００ダルトンの分子量のデキス トランである。実験は、タンパク質及びポリマーが、ガラクトース及びビオチン の両者を含むように誘導されること、及び得られる誘導分子が、受容体の血清か ら循環するストレプトアビジン−タンパク質複合体を除去するのに有効であるこ とを示している。ビオチンの負荷は、循環するアビジン含有複合体の血液プール の浄化及び、ストレプトアビジン含有複合体により認識される標的部位に対する 、続いて投与されるビオチン化同位体を配布する能力の両者の効果を決定するた めに変更された。清澄剤の効率に関する投与された成分の相対投与量の効果につ いてもまた検討された。 タンパク質タイプ及びポリマータイプ非ガラクトース基清澄剤には、上記したよ うな試薬が含まれ、ガラクトースの露出または配布等はない。それらの清澄剤は 、凝集介在ＲＥＳ機構を介してふるまう。本発明のそれらの実施態様において、 使用される清澄剤は、清澄剤の接近を除外すべき標的臓器に基づいて選択される 。 例えば、高分子量（約２００．０００〜約１．０００．０００ダルトンの範囲） の清澄剤は、腫瘍標的または血餅標的が含まれる場合に使用される。 清澄剤の他のクラスには、循環するリガンドまたは抗リガンド／標的成分複合体 を除去しないが、然し代わりに、循環する複合体の相当する抗リガンドまたはリ ガンド結合部位を遮蔽することにより、「不活性化」する試薬を含む。それらの ［キャップ・タイプ、１清澄剤は、好ましくは小さく　（５００〜１０、００１ １ダルトン）高度に荷電した分子であり、それは、血漿画分のぞ１１と等量の分 配の容積を指令する（即ち、血管外液体容積中に溢れ出させない）という物理的 特性を示す。キャップ・タイプ清澄剤の例と１７では、ポリビオチーノー誘導６ ，６′［（３，３’　ジメチル［１，Ｉ’−ビフＪニル］−４，４’−ジイル） ビス（アブ）ビス［４−アミノ−５−ヒドロキシ−１，３−ナフタレンジスルホ ン酸１　テｌ−ラゾリウム塩、ポリビオチン−誘導ポリ硫酸化デキストラン−ビ オチン、モノ−またはポリ−ビオヂニルー誘導デキストランービオチン等が挙げ られる。 キャップ・タイプ清澄剤は、相当する抗リガンドまたはりガントから誘導され、 次いで、先にリガンド／または抗リガンド／標的成分複合体を投与した受容体に 投与する。清澄剤−複合体の結合は、それ故、循環する複合体の、続いて投与さ れる如何なる活性側−リガントまたは活性剤−抗すガント慢合体とも結合する能 力を減少させる。循環する複合体の活性剤と結合する能力の除去は、活性剤を標 的に対し配布する効率を増大し、そして、長く循環する血清タンパク質動態の活 性剤との結合を阻害するこ乏により、循環する活性剤に対する標的結合活性剤の 比を増大する。又、清澄剤の血漿区画性への制限は、標的−結合リガントまたは 抗リガンドの折衷物を阻害する。 本発明の清澄剤は、単一のまたは複数の用量で投与される。 ビオチン化清澄剤の単一の用量は、例えば、循環する標的成分−ストレプトアビ ジンのレベルを急速に減少させ、次いで、恐らくは、少なくとも一部における、 受容体の生理学的区画分向での標的成分−ストレプトアビジンの再平衡化により 引き起こされる、そのレベルの多少の増加を生ずる。第二のまたは追加の清澄剤 用量は、標的成分−ストレプトアビジンの補足的な浄化を与えるために、次いで 用いられる。或いは、清澄剤は、連続的な方法で、標的成分−ストレプトアビジ ンを浄化するのに十分な時間、静脈注入してもよい。 清澄剤及び浄化システムの他のタイプもまた、受容体の循環系から循環する標的 成分−リガントまたは一抗離岸度複合体を除去するために、本発明の実施をする のに有用である。 粒状物系清澄剤は、例えば、実施例１ｘで議論されている。更に、肉体外の浄化 システムが実施例１ｘで議論されている。動脈内に挿入されたタンパク様のまた は重合性多数環装置を使用する、生体内浄化プロトコールもまた、実施例１ｘに 記載されている。 速やかに活性となる清澄剤が有用である本発明の一つの実施態様は、ｌ−１２５ 、ｌ−１２３、Ｂ＋−１６５，５ｂ−１１９、）Ｉｇ−１９７、Ｒｕ−９７、丁 １−２０１及びＢ＋−７７等のオーガー−エミッター（＾ｕｇｅ＋　ｅｍｉｉｔ ｅｍｓ）による配布または標的細胞核に対する核結合薬剤においてである。それ らの本発明の実施態様において、内在化する受容体の標的細胞表面に局在化する 標的成分は、標的成分含有複合体（即ち、好ましい２段階プロトコールにおける 標的成分−抗リガント複合体）を標的細胞集団に配布するのに使用される。その ような内在化受容体は、ＥＧＦ受容体、トランスフェリン受容体、ＨＥＲ２受容 体、ＩＬ−２受容体、他のインターロイキン及びクラスター区別化受容体、ソマ トスタチン受容体、他のペプチド結合受容体等が含まれる。 複合体が標的細胞に局在化するのを達成するのに十分な間の時間であるが、受容 体が介在する場合を通して、それらの細胞によりそのような標的複合体の内在化 を誘起するには不十分な時間の経過後、速やかに活動する清澄剤を投与する。 好ましい２段階プロトコールにおいて、ビオチン−オーガー・エミッターまたは ビオチン−核活性薬剤等の活性剤含有リガンドまたは抗リガンド複合体を、清澄 剤及び活性剤の投与の間が約２４時間よりも少ない時間的ずれの間で、清澄剤が 循環する標的成分含有複合体と錯化する機会を与えられるや否や投与する。この 方法において、活性剤は、標的細胞受容体が介在する内在化をとおして、容易に 内在化される。循環するオーガー・エミッター（＾ｕｇｅ＋　ｅｍｉ日ｅｒｓ） は無毒性であると考えられるが、本発明の予備標的プロトコールにより膚らされ る、速やかで特異的な標的化は、有用且つ安定な結合が可能な、ｌ−１２３のよ うな、半減期が短いオーガー・エミッター（＾ｕｇｅ＋　ｅｍｉｔｔｅ「ｓ）の 能力を増大する。 以下に記載したＩ、　４．７．１０−テトラアサシクロドデカン−Ｎ。 ）Ｉ’、Ｎ’、Ｎ”−テトラ酢酸（ＤＯＴ＾）−ビオチン複合体（ＤＯＴ＾−Ｌ Ｃ−ビオチン）は、生体内における望ましい生物的分散を有していることか報告 されており、腎臓排泄により主として浄化される。 ＤＯＴ＾は、本発明に実施に際して、仙のリガンドまたは抗リガンドと複合して もよい。 ＤＯＴ＾はＹ−９０及び池の放射性核種と強く結合するために、放射線免疫治療 に使用することか提案されている。治療のために、放射性核種がＤＯＴ＾キレー トと安定に結合すること及びＤＯＴ人キレートかビオチンに対し安定に付着する ことが非常に重要である。それら二つの特性を示す放射標識化ＤＯＴ＾−ビオチ ン複合体のみが、放射性核種を標的に配布するのに有用である。ＤＯＴ＾キレー トからの放射性核種の放出、または血清中若しくは非標的部位てのビオチン及び Ｄ　ＯＴ　Ａ　？Ｊｔ合体成分の開裂が、複合体を治療に使用するのに適さなく させる。 上記したＤＯＴ＾−ＬＣ−ビオチン（ここで、Ｉ、Ｃは、ビオチン及びＤ　ＯＴ 　Ａ　？Ｊ！合体成分間のアミノカプロイルスペーサを含む、長鎖（’ｌｏｎｇ 　ｃｈａｉｎ’）リンカ−を言う）は、文献に良好であると報告されているが、 問題のあることが証明されている。実験により、ＤＯＴ人−ＬＣ−ビオチンか血 液から速やかに浄化され、そして断片として尿中に排泄されることが示されてお り、以下に示したように、ビオチンアミド結合がＤＯＴ＾−アミド結合よりも寧 ろ開裂する。 ＰＩＰ−ビオシチン複合体を使用した追加の実験では、以下に示したような一致 する結果が得られた。 ベンズアミドの開裂は、血清中にヨード安息香酸の検出可能な量が存在しないこ とにより証拠づけられるように、観察されなかった。 開裂は、血清ビオチニダーゼの作用から起こるように見える。ビオチニダーゼは 、ビオチニルペプチドからビオチンの開裂を触媒覆る加水分解性酵素である。 例えば、工ヴア〉シェラトス外著“ｌ−１２５−ビオチン誘導体、アヴイ１イン 、及びポリエチレングリコール試薬を使用するビオヂニダーゼ放射分析”分析生 物化学、エバンゲレイトス（Ｅｖａｎｇｅｌａｌｏｓ）　ｌ１ｔＪｌこよる（’ Ｂｉｏｌｉｎｉｄａ＋ｅ　Ｒａｄｉｏａｓｓａ７　Ｌｌｓｉｎｇ　ａｎ　ｌ−１ ２５−１’１ｉｏｌｉｎ　Ｄｅ＋１ｖａｌｉｖｅ　、＾ｖｉｄｉｎ、ａｎｄ　Ｉ ’ｏｌｙｅｌｈ７１ｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｌｓ、’　＾ｎａｌｙ ｌｉ「ａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ＋目ｙ、Ｎ９６　３８５−８９、　１９９１年。 ビオチニルペブチＦ吉構造的に類似している薬剤−ビオチン複合体は、血漿ビオ チニダーゼによる開裂の有効な基質である。それ故、生体内での乏しい安定性は 、治療用途における架剤−ビオヂ：／複合体の用途をＩ＋Ｉｊ定する。ペプチド 治療剤の乏しい安定性を克服するためのペプチド代用品の使用は、熟熱な研究努 力の領域である。例えば、スパトラ著、ペプチドバックボーン修正　アミド結合 ザＵゲートを含有するペプチドの構造−活性分析、“アミノ酸、ペプチド及び蛋 白質の化学及び生物化学、第７巻、ウニインスタイン、編集、マーセルデツカ− 、ニューヨーク、１９８３年及びキム他の著書、“新ペプチド結合すロゲート： 偽ジペプチド化学における２−・ｒソザゾリジ、テトラヘドロンレターズ、（Ｓ ｐａｌｏｌｉ、Ｐｅｐｌｉｄｅ　Ｂａｃｋｂｏｎｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ：　Ａ　Ｓｌ＋ｕｃｌｕｅ−Ａｃｌｉｖｉ１７　Ａｎｘ１７ｓｉｓ３；ｘｎｄ　 Ｋｉｍ　ｅｌ　ａｌ、、’Ａ　Ｎｅｗ　？ｐｌｉｄｅ　Ｂｏｎｄ　Ｓｕ＋ｒｏｇ ａｌｅ：　２−１１０１ＤＯＴ＾−３Ｃ−ビオチンのアミノカプロイルスペーサ ーの除去は、ＤＯＴＡ−３Ｃ−ビオチン（ここで、ＳＣは、ＤＯＴＡとビオチン 複合体の、短鎖（’　５ｈｏａｌ　ｃｈｇｉｎ’　）リンカ−を言う）を与え、 その分子を以下に示す ＤＯＴＡ−３Ｃ−ビオチンは、ＤＯＴＡ−ＬＣ−ビオチンと比較して、極めて改 良された血清安定性を示す。この結果は、ビオチニダーゼ活性に基づくたけては 説明できるようには見えない。この結論に導く実験を、以下に記載しまた表にま とめた。 ［１０ＴＡ−ビオチン複合体の時間依存性開裂３１℃での時間　％アビジン結合 Ｙ−９０−ＬＣＹ−９０−３Ｃ Ｉ’１１’−ビオノチノ　ＤＯＴＡじオチン　ＤＯＴ＾ビオチン５　分　７５％ 　５０％ １５分　５７％　１４％ ３〔〕分　３１％　１２％ ６　（］　う）　０　％　９８９６ Ｓ′）、（］時間　０％　６０％ ごこて、′−′　は値を測定していないことを示す。 ＤＯＴＡ−ＬＣ−ビオチンとＤＯＴＡづＣ−ビオチンの間の血清安定性の相違は 、Ｉ、Ｃ誘導体が脂肪族アミド結合であるのに対し、ＳＣ誘導体がη香族アミド 結合を含有しており、脂肪族アミド結合がより容易に、酵素によりその基質と認 識されるという事実により説明されるであろう。この議論は、然しなから、ビオ チニダーゼには適用できない。何故なら、ビオヂニダーゼは、非常に効率的に芳 香族アミドを開裂するからである。実際、最も簡単で、最も普通に使用されてい るビオチニダーゼ活性を測定するための方法は、Ｎ−（ｄ−ビオチニル）−４− アミノベンゾエート（ＢＩ’ＡＢ＾）を基質として使用し、ＢＩ’ＡＢへの加水 分解は、ビオチンと４−アミノベンゾニー１−　（１’ＡＢ＾）を遊離すること が認識されている。例えば、ビー、ウルツ他の著書“酵素学における方法”＋０ ３−Ｉｌｌ頁、アカデミツクブレス社、１９９０年（Ｂ、　Ｗｏｌｆ、ｅｌ　ａ ｌ、、’Ｍｅｌｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｒ７ｍｏｌｏｇ７．’　ｐｐ、１０３−Ｉ ｌｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｈｅｓ＋　Ｉｎｃ、　、１９９０１　参照。従って、 ヒトは、ＤＯＴＡ−３Ｃ−ビオチンが、そのｌ、Ｃ対応物のように、ビオチニダ ーゼ基質であろうと予測するであろう。ＤＯＴＡ−３Ｃ−ビオチンが、血清安定 性を示すので、ビオチニダーゼ活性のみでは、他はそうてないのに対し、幾つか の複合体が血清安定性である理由を適正に説明することができない。一連のＤＯ ＴＡ−ビオチン複合体が、それ故、どの構造的特徴が複合体の血清安定性に寄与 するかを決定するために、本発明者により合成された。 酵素的作用に関するペプチドの血清安定性を改良するだめの幾つかの一般的な戦 略は、次の通りである。Ｄ−アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸及びα−置換アミノ 酸の導入。 生体内で安定なビオチン−ＤＯＴＡ複合体は、本発明の実施に有用である。生体 内の安定性は、以下の利点を付与する１）より多くの放射性同位体が、先に局在 化した標的成分−ストレプトアビジンを標的とすることによる増大した腫瘍の取 り込み：及び ２）ビオチンがより安定に放射性同位体に結合した場合、増大した腫瘍の保持。 更に、ＤＯＴ＾とビオチンの間の結合は、生物学的分布（通常の臓器の取り込み 、標的の取り込み等を含む）及び薬物動力学に関し、重大な影響をも有する。 本発明のＤＯＴ＾含有分子及び複合体のデザインのための戦略は、３つの主要な 考慮すべき事を含んでいる・１）生体内での安定性（ビオチニダーゼ及び一般の ペプチド活性抵抗を含む）、初期カットて１時間、１００％の安定性：２）腎臓 排出、及び ３）合成の容易さ。 本発明のＤＯＴ＾−ビオチン複合体は、−またはそれ以上の以下の戦略の遂行を 反映する １）開裂に関わるアミ１〜窒素に隣接する炭素の置換：２）開裂に関わるアミド 窒素のアルキル化。 ３）アミトノノルボニルのアルキルアミノ基による置換。 ４）Ｄ−アミノ酸並ひにその類縁体または誘導体の導入。 ５）チオ尿素結合の導入。 本発明に係るＤＯＴ＾−ビオチン！夏合体は、一般に以下のように特徴付けられ る：その構造内でビオチンカルボキシ基を保持する複合体及びそうではないもの （即ち、ビオチンの末端カルボキシ基が還元されるが、さもなければ化学的に変 性されている。以下の一般式により示されるそのような複合体の構造を考え出し た・ 式中、Ｌは、以下の方法の−っで、ＤＯＴ＾構造の−ＣＩｌ□−Ｃ００１１分岐 の−っで相互に置換されていてもよい：　−ＣＩｌ（Ｌ）　−ＣＯＯ１１または −ＣＩ、　Ｃ００Ｌまたは−ＣＩｌ、　Ｃｏｔ、　）　。それらの代わりの構造 が使用された場合、Ｄ　ＯＴ　Ａ　ｔ１合合成式との結合のための官能基を有す るリンカ−の部分は、［ｌＯＴ＾構造の分岐部分における炭素またはカルボキシ の（ＩｉＪれがと相互作用する能力について選択され、リンカ−構造の血清安定 性を付与する部分は以下に記載したようにして選択される。 結合が上記したようにＤＯＴ＾の核で形成される場合、Ｌは以下の原理により選 択され、リン号−の部分は、アミンと結合する能力について選択される、Ｄ　Ｏ Ｔ　Ａ　？ＪＪ合体成分と結合するように計画する。 Ａ８本発明の一つの実施態様は、上記したＤＯＴ＾アニリンアミン及びビオチン カルボキシ基の間にＤ−アミノ酸スペーサーを導入するリンカ−を含む。置換ア ミノ酸は本発明のそれらの実施態様に好ましい。何故なら、α−置換はまた、酵 素的開裂への抵抗を与える。本発明のこの態様のし成分の例としては、以下に示 される： ここで、Ｒ１は、低級アルキル、親水性基で置換された低級アルキル（好ましく は、 ここでｎは１又は２である）、グルクロニド置換アミノ酸または他のグルクロニ ド誘導体から選択され：そして、Ｒ２は、水素、低級アルキル、置換低級アルキ ル（たとえば、ヒドロキシ、サルフエ−１・、ホスフェートまたは親水性基（好 ましくは０１１）から選択される。 本発明の開示の目的のために、「低級アルキル」という語は、１〜５の炭素原子 を有するアルキル基を示す。また、「置換」という語は、−若しくは幾つかの置 換基を含み、単一の置換基が好ましい。 本発明のこの態様の好ましいＬ基には、以下のものが含まれる Ｒ２＝Ｃ１ｈ及びＲ２＝ＩＩ　（Ｄ−アラニン誘導体、それの合成式は実施例Ｘ ＸＩに示した）； Ｒ２＝Ｃ１ｈ、及びＲ２＝Ｃ１ｈ　（Ｎ−メチル−Ｄ−７う＝ンＲ導体）Ｒ’　 ＝　ＣＩｌ２−０１１及びＲ２＝Ｈ（Ｄ−セリン誘導体）：Ｒ１−Ｃ１１２０Ｓ ０３及びＲ２＝Ｈ（Ｄ−ｔ　’）　：／−０−サＬ”）　ニー　ト誘導体）；及 び ９月 本発明のこの態様の他の好ましい成分は、Ｒ１が水素で、Ｒ２”’　−（ＣＨ２ ）　ｎｕｌｌまたはそのザルフェート若しくはホスフェート誘導体で、ｎは１ま たは２である分子並びにＲ２−Ｈである場合、Ｒ１が である分子が含まれる。 Ｄ−リジンのグルクロニド及びアミノピメリン酸のグルクロニドを導入する好ま しい成分は、以下のＩ及び１１で夫々示さ本発明のこの態様の特に好ましいリン カ−は、上記したＤ−アラニン誘導体である。 Ｂ、−若しくはそれ以」二のアミド窒素原子上のアルキル置換基を導入したリン カ−もまた、本発明により包含され、幾つかの態様のそのようなリンカ−は、し −アミノ酸からのものが好ましい。置換されたアミン成分を有するアミド結合は 、酵素的開裂に対し、殆と影響されない。そのようなリンカ−は以下の一般式で 示される ここで、Ｒ４は、水先、低級アルキル、ヒドロキシ、サルフェート、ホスフェー ト等で置換された低級アルキル、及びから選択され； Ｒ３は、水素、アミン；低級アルキル；アミノ−またはヒドロキシ−、サルフェ ート−またはホスフェート−置換低級アルキル：グルクロニドまたはグルクロニ ド−誘導化アミノ基から選択され；そしてｎは０〜４の範囲である。 本発明のこの態様の好ましいリンカ−は：ｎ＝４（７）場合、Ｒ３＝Ｈ及びＲ４ ＝ＣＨ，、実施例ＸＸＩ　テ議論したように合成される； ｎ　＝　Ｑ　（１）場合、Ｒ’　＝Ｈ及びＲ’　＝ＣＩ＋、　、実施例ＸＸＩ　 テ記載したようにＮ−メチル−グリシン（サルコシンという通称名を有する）か ら合成される； ｎ＝Ｑの場合、Ｒ３−旧（２及びＲ４＝ＣＩ＋３゜ｎ＝４の場合、Ｒ３＝Ｈ及び Ｒ４： （Ｈｉｓ−ＤＯＴ＾−ＬＣ−ビオチン）、実施例ＸＸＩで議論したようにブロモ ヘキサン酸から合成される：そして、ｎ＝＝０の場合、Ｒ’＝Ｈ及びＲ４− （ｂｉｓ−ＤＯＴ＾−３Ｃ−ビオチン）、イミノジ酢酸から合成される；が含ま れる。 Ｒ１が）［て、Ｒ”が−Ｃ１１２Ｃ１１□０１１で、口が０のリンカ−を含む複 合体の合成が、実施例ＸＸＩに記載されている。模式的には、■］が０、Ｒ′が １（及びＲ′か−ＣＩｌ□ＣＨ２０ｉ＋である本発明のこの態様の）Ｍ合体の合 成は、以下に示す。 ビスーＤＯＴ＾−ＬＣ−ビオチンは、例えば、次の利点を提供する二ｌ）二つの ＤＯＴ八分子分子つのビオチン成分への導入は、ビオチン複合体の総親水性を増 大し、それにより生体内での尿排出への分配を方向付け、そして ２）ビオチンのカルボキシル基に隣接するアミド窒素の置換が、ペプチド及び／ またはビオチニダーゼのその部位での開裂を阻害する。 ビスーＤＯＴ人−ＬＣ−ビオチン、グリシン基リンカ−及びＲ３＝Ｉ］、Ｒ’　 ＝ＣＨ３、ｎ＝４のＮ−メチル化リンカ−が、本発明のこの態様の特に好ましい リンカ−である。 Ｃ１他のリンカ−の態様は、その中にチオ尿素残基を導入する。本発明のチオ尿 素付加物の例は、次の一般式で示されここで、Ｒ５は水素または低級アルキルか ら選択され；Ｒ６はＨ及び親水性残基から選択され；そしてｎは０〜４の範囲で ある。 本発明のこの態様の好ましいリンカ−は、以下のとおりである： ｎ＝５の場合、Ｒ’＝Ｈ及びＲ６＝Ｈ。 ｎ　＝　５　ｃ７）場合、Ｒ’＝Ｈ及びＲ６＝Ｃ０Ｏｌ（、ソしてｎ＝５の場合 、Ｒ’＝Ｃ１１，及びＲ６＝Ｃ０Ｏ１−１０−に記した第２の好ましいリシン１ −は、Ｌ−リシンまたはＤ−リシンの何れかを用いて調製することができる。同 様に、第３の好ましいリンカ−も、Ｎ−メヂルーＤ−リシンまたはＮ−メチル− Ｌ−リジンの何れかを用いて調製することができる。 親水性を最小にした他の千オ尿素付加物は、であり、これはビオチンヒドラジド （Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。 Ｓ（、ＬａｕＩｓ　、　Ｕｓｓａｕｔｉ　から市販されている）及びＤＯＴ＾− ベンジルイソチオシアネート（００７人−アニリンから一段階で合成される公知 化合物）の付加により形成され、以下に示したようなチオ尿素含有化合物が形成 される。 Ｄ、開裂に影響されやすいアミドに隣接する炭素の置換による本発明のアミノ酸 誘導リンカ−は、以下に記載した一般ここで、Ｚは−　（Ｃ）１□）、−１便利 に合成される形態のグルタミン酸；または Ｚ　−−ＣＩ＋２−　Ｓ−Ｃ！Ｉ、〜、システィン及びヨード酢酸から合成可能 であり：または Ｚ＝−ＣＩ＋□−１便利に合成される形態のアルパラギン酸；または Ｚ　＝　−（ＣＩ＋２　）　Ｔｌ−Ｃ０−０−ＣＩ＋２−　、ここでｎは１〜４ の範囲であり、それはセリンから合成可能である。 Ｅ９本発明の他の例示リンカ−の態様は、以下に記載した一般式を有する そしてｎの範囲は１〜５である。 Ｆ、他の態様は、ジスルフィドを含むリンカ−を含有し、それは、ビオチン−Ｄ ＯＴ＾複合体の非標的保持を減するための代謝的開裂残基（−Ｓ−Ｓ−）を提供 する。このタイプの例示リンカ−は、次の式で示される： ここて、１１及びｎ゛　は好ましくはＯ及び５０間の範囲である。 条件付きて開裂するリンカ−を使用する利点は、活性剤の標的／非標的局在化の 改良である。条件付きて開裂するリンカ−には、酵素的に開裂するリンカ−１酸 性条件下で開裂するリンカ−１塩基性条件下で開裂するリンカ−等が挙げられる 。より具体的には、非標的組織に存在し、標的組織には量が減少しているか或い は欠如している、酵素により開裂するリンカ−の使用は、非標的細胞保持に比較 して、活性剤の標的細胞保持を増大することかできる。そのような条ｖ１°付き 開裂リンカ−は、例えば、治療放射性核種を標的細胞に配布する場合に有用であ る。（ＶＪ故なら、そのような活性剤は、有効性のために内在化を必要どしない からであるが、但し、リンカ−は標的細胞表面で安定であるか、または標的細胞 の分解から保護されている。 Ｇ、エーテル、千オニーチル、エステル及びチオエステルリンカ−もまた、本発 明の実施に際して有用である。何故なら、そのようなＩＪンカーは、酸で開裂し 、それ故、非標的保持を容易に改良するからである。このタイプの例示リンカ− は、次の一般式を有する： ここで、ＸはＯまたはＳであり；そしてＱは結合、メチレン基、−ＣＯ−基また は−ＣＯ−（Ｃ１１２）　、−ＮＨ−であり、そして ｎは１〜５の範囲である。 他のそのようなリンカ−は、一般式： −ＣＨ２−Ｘ−Ｑ、ここて、Ｑ及びＸは上記したのと同一である。 Ｈ，本発明の他のアミノ含有リンカ−は、次のよ・うな構造ここでＲ７は低級ア ルキル、好ましくはメチルである。 この場合、酵素的開裂に対する抵抗は、アミンでのアルキル置換により授けられ る。 ■１重合性リンカーもまた、本発明において意図されている。デキストラン及び シクロデキストランは、重合体の親水性の結果として、本発明のこの態様におけ る有用な好ましい重合体であり、それは、それを含む複合体を好ましい排出へと 導く。デキストラン重合体を使用する他の利点は、その上うな重合体が実質的に 無毒性で且つ無免疫源性であり、それらは種々の大きさで市販されており、且つ 、それらは他の相当する分子と容易に複合することである。又、デキストラン− 結合複合体は、非標的部位が、より小さい単位の分子にデキストラン重合体を開 裂する能力がある酵素である、デキストラナーゼに対し接近し易い場合、非標的 部位はそれほど接近し易くはない。 本発明の他のリンカ−は、ＤＯＴ＾との複合化の前に製造され、次いでビオチン のカルボキシ残基が還元される。本発明のそれらのリンカ−は、以下の一般式を 有する：本発明のこの観点のリンカ−の態様は、以下のものを含む・１、以下に 示したようなエーテル結合は、以下に示した工程に従い、ＤＯＴ＾−ビオチン複 合体の中で形成される。 Ｌ’　＝−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＩ４２）、。 ここで、１１は１〜５の範囲であり、】が好ましい。 このリンカ−は、ＤＯＴ＾アニリン（ＤＯＴ人−３Ｃ−ビオチンの構造における ように）に対し直接結合するたった一つのアミド基を有する。更に、エーテル結 合は、腎臓での排出を容易書こする重要な因子である親水性を付与する。 Ｋ、還元されたビオチン（ヒドロキシビオチンまた（まアミノビオチン）から形 成されるアミン結合を、例え（ｆ、実施（ＰＩＸＸ＋に記載した工程に基づき、 形成されたそのような１ノンカーを含む複合体と共に、以下に示す。 Ｌ’＝−ＮＨ− このリンカ−は、アミノ基を含有しておらず、そしてアルキル化されていないア ミンは、好ましい生物分配性能を付与するかもしれない。何故なら、アルキル化 されて０な１．Ｉ　ＤＯＴ＾−アニリンは、優れた腎臓の浄化を示１からである 。 Ｌ、アミ、バービオチン中間体を経由して複合体を形成可能な、置換アミンリン カ−を、以下に示す。 ここで、Ｒ８はＨ；　−（Ｃ１１２）　２−０１１またはそれらのサルフェ−１ ・若し、くはホスホネート誘導体であり；またはは−（Ｃ１ｌｚ　）　ｎ　Ｃ０ −Ｎｉ１−であり、ここで、ｎは０〜５の範囲てあり、好ましくは１であり、モ してｑはＯまたは１である。 それらの基は、アミドのみが直接ＤＯＴ人−アニリンに伺加し、ぞして、生体内 においてリンカ−に対し陽電倚を付、Ｃ７する非アミドアミンまたはトアルキル 化グルクロニド親水性基の何れかが、夫々、交互に好ましい腎臓排出するという 利点を示す。 Ｎ１．アミノビオチンは、次式 Ｌ’　＝−Ｎｉｌ−ＣＳ　Ｎｉｌ−のチオ尿素含有リンカ−のような、好ましい 性質を有するリンカ−により結合された複合体の製造の中間体として使用される 。 このチオ尿素を含有する複合体は、以下の利点を有する。開裂しないアミド及び 短く、かなり極性の、腎臓排出を助けるリンカ−０ 以下の式のビスーＤＯＴへ誘導体は、また、アミノ−ビオチンから形成される。 ここで、ｎは１〜５の範囲であり、■及び５が好ましい。この分子は、開裂しな いアミドの付加的な利点と共に、先に議論したビスーＤＯＴ＾誘導体の利点を提 供する。 還元されたビオチンカルボキシ基により特徴付けられる複合体の製造に使用され る本発明の付加的なリンカ−は、以下のとおりである： Ｌ　＝　（ＣＩ＋２　）　Ｊ−ＮＨ−１ここで、アミン基は、還元されたビオチ ンカルボキシ成分に相当するメチレン基に付加し、そ（７てメチレン鎖は、ＤＯ ＴＡ環の核炭素に付加する。そのようなリンカ−は、リシンから都合よく合成で きるＬ　−−（ＣＨａ　）　ｑ−ＣＯ−Ｎｌｔ−、ここで、ｑは１または２であ り、そしてアミン基は、還元されたビオチンカルボキシ成分に相当するメチレン 基に付加し、そしてメチレン基は、ＤＯＴＡ環の核炭素に付加する。この成分は 、アミンービオヂンから合成できる。 上記したリンカ−は、−若しくはそれ以上の以下の利点を有する複合体を製造す るのに台用であるニー遊離ビオヂンと同一または実質的に同様の親和性でアビジ ンまたはスト１ノブ）・アビジンと結合するニー高度な動力学的安定性で、金属 Ｍ３＋イオンと効率的に結合づる。 −１として腎臓を通して尿中に１コ１出される；一体内液体のアミダーゼに対し 安定であるニー組織を速やかに通過し、予備標的化アビジンまたはストレプトア ビジンと結合する；そして −全身での滞留半減期か約５時間未満で速やかにｔＪＩ泄される。 上記したＤＯＴＡ−ビオチン複合体の中間体への合成経路として、ニトロベンジ ル−ＤＯＴＡかｆに案されている。それらの提案された合成経路は、然しなから 、中間体化合物を最適ではない収率で製造する。例えば、レン（Ｒｅｎｎｌ及び ミアーズ（＆ｌｅｘ＋！Ｓ）の著書、「三官能キレート剤Ｑ−（ｐ−ニトロベン ジル）川、４．７．ｌｏ−−テトラアザンクロドデカン−Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’、 　Ｎ”−テトラ酢酸の巨大スケール合成、及びキラルクロマトグラフィーによる その鏡像異性純度の定量Ｊ　、Ｂｉｏｃｏｎ　ｊ、Ｃｈｅｍｏ、３：５６３−９ ．１９９２　には、低収率で進行するか、或いは煩わしい変換または生成を含む 反応工程を含む、ニトロベンジル−ＤＯＴＡの９段階の合成が記載されている。 より具体的には、第６番目の工程は、２６％だけの収率てあり、そして生成物は 分取１１　Ｐ　Ｌ　Ｃで精製した。更に第８工程は良好な収率で進行するが、こ の工程は大容量のノ（反応物を含んでいる。 先行技術の工程６−８のそれらの困難は、以下のそれらの代わりの合成経路を採 用することにより、本発明の実施に際して克服される。 以下に示したよ・）に、テトラアミンアルコールがテトラトルエンスルホンアミ ドトルエンスルポン酸塩に変換される先行技術の合成工程の第６エ程における収 率の低さは、トルエンスルホン酸塩官能性の（総てのアミン基がそれらの相当す るスルホンアミドに変換される前に）未熟な形成を引き起こそのような連続の出 来事は、保護されていないアミン基により、反応性トルエンスルホン酸塩の望ま ない分子内または分子間置換を引き起こすであろうし、それにより、多くの望ま ない副生成物を生ずる。 この問題は、テトラアミンアルコールを無水トリフルオロ酢酸と反応させること による、上記した本発明の代わりの合成式により克服される。トルエンスルホン 酸塩よりも非常に弱い脱離基である、トリフルオロ酢酸塩は、類似の副反応に対 し、攻撃を受け易くはない。実際、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びヴット（Ｗｕｌ ｓ）著、“有機合成における保護基”、ニューヨーク。 ジョンワイリー社、９４頁、　１９９１年（Ｇ＋ｅｅｎｅ　ｘｎｄ　Ｗａｔｇ、 　’Ｐ＋ｏｌｅｃｌｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏ［ｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｓ、’　Ｉｏｈｎｎ　Ｗｉｌｅ７　！ｎｄ　Ｓ。 ｎｓ、　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ、　ｐ、９４．１９９１）に報告されてい るように、トリフルオロ酢酸塩基の容易な加水分解は、総てのアミンが消費され た後、反応混合物へメタノールを添加することが、実質的に例外的な生成物とし てテトラフルオロアセトアミドアルコールを与えるということを示唆している。 テトラフルオロアセトアミドアルコールを相当するトルエンスルホン酸塩へ転換 することは、先行技術のテＩ・ラドルエンスルホンアミドトルエンスルホン酸塩 と同様に環化することが期待される。メタノール性水酸化すｌ・リウム中で、１ ５〜２５°Ｃで１時間の、テトラフルオロアセトアミドアルコールのトルエンス ルホン酸塩の環化による環状テトラアミド生成物は、実質的に例外的な生成物と してニトロベンジル−ＤＯＴ＾を与える。 その結果、トロフルオロアセトアミド保護基の使用は、大過剰駄の硫酸と共に加 熱し、次いて大容量の水酸化バリウムで中和することを含む、非常に安定なトル エンスルホンサンアミド保護基の開裂３と結びついた困難を回避する。 ニド［］］ベンジルーＤＯＴへの、他の代わりの経路を以下に示この代わりの工 程は、ジエチリルシアノホスフエート等のカップリング剤を使用するｐ−ニトロ フェニルアラニルトリグリシンの環化を含み、環状テトラアミドを与える。引き 続くボラン還元は、２−（ｐ−ニトロベンジル）　−１，４，７，１０−テトラ アザシクロドデカンを与え、これは上記したレン（Ｒｅｎ＋＋）とミアーズ（Ｍ ｅａ＋ｅｉ）の文献に含まれている、ＤＯＴ＾への公開されている経路に使用さ れる一般的な前駆体である。本発明のこの代わりの工程は、先行技術のレン（Ｒ ｅｎｎ）とミアーズ（Ｍｅａ＋ｅｓ）の文献に記載されているよりも、かなり短 い、４工程よりも寧ろ２工程を要する合成の短縮路を提供する。 （’Ｊられるキレート−ビオチン複合体は、優れた腎臓υ１出を示す。？、ｕ合 体の正味の総電荷は中性であるが、ポリカルボキシレートの分子の性質は、親水 性及び親油性の領域を生ずる。 複合体内のカルボキシル基の数と性質を変更することにより、（〕１出は、腎臓 から胃腸管経路に移動する。例えば、中性化合物は、一般に腎臓により浄化され ；アニオン性化合物は、一般に６１システムによって浄化される。 ［３，ポリリシン誘導化 ポリリシンを含有する複合体もまた、有益な生物学的分布性能をｉｊ＜−１゜全 体の抗体において、ポリリシンによる誘導化は、肝臓での取り込みに対する複合 体の生物学的分布をゆがめる。これに対し２、ポリリシンによるＦａｂフラグメ ントの誘導化は、旧識及び腎臓の両者での取り込みの低レベル化を招き、それら の複合体の血液浄化は、キレートに）（有結合したＦａｂのそれと同様である。 ポリリシンに誘導されるキレート−ピオチン複合体の例を、以下に示す。 放射性金属−キレ−１・−ビオチン複合体へのポリリシンの導入は、それ故、複 合体の良好な肝臓及び腎臓での浄化を維持しながら、ＲＥＳ金属・ｒオン封鎖を 最小限にするが、または除去するのに有用である。改良された腎臓の排出性能の ために、ポリリシン誘導体は、ビオチン化に続いて、好ましくは琥珀酸化される 。ポリリシン誘導体は、更なる利点として：（１）放射性金属−キレート−ビオ チン複合体の特異的活性を増大させ；　（２）ポリリシン重合体の分子量を変更 することにより血液浄化の速度及び経路を制御することができ；そして（３）最 適の腫瘍相互作用についての複合体の循環半減期を増大することを提供する。 ポリリシン誘導化は、標阜的な方法論により達成される。 簡単には、ポリ−し一リシンは、標邸アミノ基アシル化工程（水性重炭酸緩衝液 、ｐｌ＋３．　ビオチン−旧１ｓエステルを添加し、次いでキｔ／　−１−Ｎｌ ｌ５エステルを添加する）により、アシル化される。代え）りの方法論には、Ｄ ｌｌｌＳＯ及びトリエチルアミン中で、ニトロフェニルエステルを使用する無水 条件を含む。得られる複合体は、ＵＶ及びＮＭＲスペクトルにより特徴付けられ る。 ポリリシンに何着したビオチンの数は、１１人Ｂ八へ析により定石される。分光 光度滴定は、アミノ基誘導化の度合をＦＴ’価するために使用される。放射性金 属−キレート−ビオチン複合体は、大きさの排除により特徴付けられる。 Ｃ８開裂可能な結合 放射性金属−キレ−１−一一ビオチン慢合体のキレートとビオチンの間の部分に 開裂可能なリンカ−を挿入することにより、正常組織に対する腫瘍での複合体の 保持が増大される。より具体的には、正常細胞内に存在するが、腫瘍組織には欠 損しているかｒＹ在しない酵素により開裂されるリンカ−は、腫瘍での保持を増 大することかできる。例として、腎臓は高レベルのγ−グルタミルトランスフ上 ラーゼを有し；他の正常ＸＪｌ織は、生体内で、γ−グルタミルプロドラッグの 開裂を示す。 それに対し、腫瘍は、一般に酵素のペプチダーゼを欠いている。以下に示したグ ルタミル結合ヒオチン複合体は、正常組織内で開裂され、腫瘍内に保持される。 Ｎ、Ｓキレートの糖置換は、そのようなキレートを水溶性にする。生理的ｐｌ＋ で完全にイオン化された硫酸塩は、以下に記載したキレート−ビオチン複合体の 水溶解性を改良する。 Ｒ−リボースまたはグルコースまたは３０２０１１等の糖Ｘ＝　（ＣＩ＋２）。 またはＣＯ（ＣＩ＋２）　４この化合物は、標準反応」−程により合成される。 簡単には、ビオシチンかＮ−＋−ＢＯＣ−（０−スルホン酸塩または０−グルコ ース）セリンＮｌｌ５エステルと縮合して、Ｎ川−ＢＯＣ−（０−スルホン酸塩 または０＝グルコース）セリンビオシチンアミドを与える。引き続＜　Ｎ−１− ＢＯｃ基のＴＦ＾での開裂及び、リガンドＮＨＳエステルの、ＤμＦ中、トリエ チルアミンとの縮合は、リガンドルアミドセリン（０−スルホン酸塩または０− グルコース）ビオシチＩ’ｌＩ’−放射性ヨウ素化ビオチンの調製と特性付はポ リ−し一リジンを過剰のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、次いてポルトン−ハンターＮ −ヒドロキシスクシンイミドエステルに、ＤＭＳＯ中でさらすことにより調製し た放射性ヨウ素化ビオチンが報告されている。精製後、この生成物は、ヨード化 法（例えば、化される。得られる放射性ヨウ素化ビオチン誘導体の高分子量のた めに、生成物の限定された特性付け（即ち、放射性−ＨＩ’ＬＣ及び固定化スト レプトアビジンとの結合）のみが可能であった。 本発明による放射性ヨウ素化ビオチンの調製は、成る利点を与える。第Ｊに、放 射性ヨウ化ビオチン誘導体は、完全な化学的特性付けが行える低分子量化合物で ある。第２に、調製のために開示された方法は、単一の工程を含み、そして生成 」二程の必要性を取り除いている。 簡単には、ビオシチン（Ｒ＝　Ｃ００Ｈ）及びビオチンアミドペンチルアミン（ Ｒ＝　Ｈ）に対応するヨードベンズアミド誘導体を、以下の式により調製した。 この式において、ｒＸＪは如何なる放射性ハロゲンであってもよく、　＋２５１ 　、＋３１　ｌ、＋２３１．２１１＾（等が挙げられる。 ■の調製は、一般に、ｌ・リプチル錫中間体を使用して、ウイルバー他（Ｗｉｌ ｂａ＋　ｅｌ　ａｔ、）の開示、Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、　３０：２１６− ２６．１９８９に従う。ＮＨＳエステル１は、ＤＣｌｌと相互反応し得る混合物 を形成するので、水溶性カルボジイミドを上記した反応に使用される。ＮＨＳエ ステルは、クロマトグラフィーと適合せず：それは、有機及び水性溶媒に不溶で あり、そしてＤＭＦ中または緩衝水性アセトニトリル中でビオシチンと反応しな い。 １とビオシチンまたはそれから誘導されたものとの反応は、標的でのビオチン結 合能力となる（即ち、標的及びそれに付加したのと等量のアビジンに対する抗体 の量）。 本発明の予備標的化方法のそれらの実施態様について、変質ｒ程から得られる治 療様放射性核種を放出する粒子（非放射能キャリアー形態が存在しない）が好ま しい。放射性核種の例としては、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、＾ｌ−２１１、Ｂ１ −２１２等が挙げられる。他の反応器により製造された放射性核種は、それらが 標的に対し、治療的に有効環の放射線を照射する量で結合することが可能であれ ば、本発明のそれらの態様を実施する際に有用である。放射線の治療的に有効な 量は、核医療実務者に公知の幾つかの因子に依存し、約１５００〜約１０．００ ０　ｃＧマの範囲である。 動脈内投与予備標的は、供給血管が到達しうる臓器または組織に存在する標的に 対し供給できる。本発明の予備標的方法の動脈内配布の観点に関する応用の例に は、肝動脈投与による肝臓腫瘍、頚動脈投与による脳−成性腫瘍、気管支動脈投 与による肺癌及び腎動脈投与による腎臓癌の治療が挙げられる。動脈内投与予備 標的は、以下に記載したような、化学療法薬剤、毒物及び抗腫瘍活性剤を用いて 行うことができる。 高い効力の薬剤、ＩＬ−２等のリンフ才力イン及び腫瘍壊死因子、薬剤／リンフ 才力イン−担体−ビオチン分子、ビオチン化薬剤／リンフ才力イン、及び薬剤／ リンフ才力イン／毒物−添加、ビオチン誘導化リポソームは、本発明のこの態様 の実施に際してそれらの配布に有用な活性剤及び／または投与製剤の例を示すも のである。 固体腫瘍標的部位と結びついた問題は、例えば、治療剤の活性部位への貫通であ る。若し、そのような標的部位への均一・な貫通が達成されるならば、より有効 な治療が可能である。 標的剤と複合したリガンドまたは抗リガンド、または治療成分と複合した抗リガ ンドまたはリガンドの、標的部位への貫通を増大するために使用される一つの方 法は、血管の結合を誘起または促進し、細胞と細胞の結びつきを分解し７、また は同様に、３次元細胞配列により特徴付けられる標的部位に対し投与された複合 体のより均一な配布を容易にする透過性増大成分の投与である。好ましくは、本 発明の透過性増大成分は、それらの効果を速やかに達成する（例えば、投与後、 約３０秒から約１時間以内）、３ 本発明のこの観点の一つの例は、抗リガンド−標的化成分複合体の没り（例えば 、全身的、動脈内、導尿管による局所的等）、次いで、例えば、標的の３次元構 造を分解腰微小血管の結合を誘起する透過性増大成分（例えば、ヒスタミン、セ Ｏ１・ニンまたはブラジキニン等の、後毛管細静脈上の作用により；または細菌 性エンドトキシン等の、毛管ベッド全体の作用により、細静脈の内皮中の隙間を 誘起する試薬、等）の動脈内清流導尿管による投与をし、それにより標的部位で の高い細胞間１度を達成するために、リガンド−治療剤腹合体の同時または連続 膜ｊ−ｉを可能にする。治療剤［１合体の投与の部位特異性を達成するだめの一 つの方法は、その薬剤を導尿管を経由して投与することである。夫々の投与成分 についての、投りの最適経路は、受容体の生理的条件及び経験を有する医療実務 者により、そのために選択された特別の治療により指示されるであろう。任意に 、透過性増大成分に先立ちまたは続いて、清澄剤を投与してもよく、先の投与が 好まし本発明のこの側面の使用は、また、３次元細胞配列により特徴付けられる 標的部位に対する高分子量治療剤を有する複合体の配布を容易にする。例えば、 −若しくはそれ以上のりガントまたは抗リガンド分子並びに複数の治療剤分子は 、重合体に複合し、全体として次式を形成してもよい：治療剤１−３０ル ここで議論されるような、達成可能な（投与目的のみ）動脈の供給により特徴付 けられる標的部位に特に有用である、本発明のこの観点の特異的な実施態様には 、透過性増大成分の動脈内投与、次いて、治療剤−重合体−リガントまたは抗リ ガンド複合体のそのような投与が含まれる。そのような配布に適した複合体の例 としては、アール、ダンカン及びジエイ．コペセクによる共著、ポリマー化学の 進歩、５７：５２−１０１　（１９８４年）及びダンカン著、抗癌剤、３　：　 １７５−２１０（１９９２年）　（Ｒ２１０　（１９９２））において議論され ている、ヒドロキシ−プロピルメタクリレート−アドリアマイシンのビオチン化 誘導体である。 一方、透過性増大成分は、次いで投与される抗リガンド−またはりガント−治療 剤複合体について受容体として機能する、その投与された複合体のより均一に標 的化するのを容易にするために、標的成分−リガントまたは−抗リガント複合体 の投与に先立って投与されてもよい。更に、透過性増大成分は、また、本発明の ３段階予備標的プロトコールに使用してもよいｂ 本発明の好ましい透過性増大成分は、「特異的」または「非特異的」相互作用に より細静脈の内皮中の隙間を誘起する。この議論の目的のために、非特異的透過 性増大成分は、全体の毛管ベッドに作用するものである。非特異的タイプの透過 性増大成分の例としては、細菌性エンドトキシン、代謝阻害剤、微小糸球体また は微小管等を変質する薬剤等が挙げられる。特異的透過性増大成分は、毛管ベッ ド（例えば、後毛管細静脈、毛管等）の部分に作用する。特異的タイプの透過性 増大成分は、ヒスタミン、セレトニン、ブラジキニン等である。他の透過性増大 成分は、マンニトール、腫瘍壊死因子、五酸化二窒素、プロスタグランジンＥ２ 、ロイコトリエン、ロイコキニン等である。 代って、例えば、標的腫瘍塊への、診断または治療物質の配布の増大は、標的成 分を含Ｈする複合体、リガンド／′抗リガンド結合対のメンバー及び腫瘍塊内の 細胞と細胞の結びつきを分解することを達成するのに十分な透過性増大剤の量を 、全身に没４することにより達成することができる。そのような透過性増大成分 は、例えば、上記した局所または動脈内投与プロトコールの実施により、局部的 に投与してもよい。 本発明の透過性増大成分の例としては、３次元標的細胞配列内の細胞と細胞の結 びつきの分解が可能な如何なる物質もが含まれる。幾つかの好ましい成分として は、低分子１タンパク質合成阻害剤である、トリコテセン、イオノフオア、脱活 性化合物（特に、微小細管または微小繊維細胞重合、ポリミキシン及びポリエン 抗生物質の阻害剤）、環状トキシンペプチド、サイトカラシン及びそれらの組合 せが挙げられる。 ベルルカリンＡ１　ミクロシスチン（１兄Ｈ−ｙｓ−ｔｊ旦り！−製ｇ−ｉ−ｎ −男からの）、シクロへキンミド及びプロマイシンが、特に好ましい透過性増大 成分である。 巨大環状環、官能性エポキシド基またはそれらの両台を有する成分もまた、本発 明内において好ましい。然しなから、巨大環状環を欠いている細胞毒化合物もま た、ここで使用するのに適している。 約２．０００ダルトンよりも小さいか等１７い分子量を有する小さい透過性増大 成分は、そして特に約１．０００ダルトンよりも小さいか等しい分子量を有する ものもまた好ましい。そのような小さい透過性増大成分は、その細胞質が、隙間 を結合する錯体により結合された隣接する細胞間を自由に通過するこ七かできる 。 全身に投与する態様においては、約１．　ＯＱＯダルトンまたはそれ以下の分子 量をイ１する透過性増大成分が、標的成分（好ましくは、リガンドまたは抗リガ ンドがそれに結合している）に、選択的に開裂する共有結合を介し−Ｃ複合する 。この態様において、標的細胞を複合体に配布した後、透過性増大成分は、標的 細胞において放出され、次いて、隙間の結合を介して隣接する細胞に分配される 。放出された成分の自由な拡散は、例えば、腫瘍塊の分解の効率を増大するであ ろう。 幾つかの透過性増大成分については、複数の成分が、担体分子と選択的に開裂す る共有結合を介して複合することが有益である。ここで使用している「担体分子 」は、限定されないが、巨大タンパク質または単一の標的成分に多数の透過性増 大成分を結合されることができる重合体が含まれる。好ましい担体分子には、ア ルブミン、デキストラン、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリ孔−リシ ン及びポリグルタメートか挙げられ、これらは総て、５，０００ダルトンを超え る分子量をＦＴする。担体分子は、化学合成により、または組み換えＤＮＡ技術 を用いて製造してもよい。担体分子は、一般に、小さい選択的開裂結合基により 誘導され、それは、−若しくはそれ以上の透過性増大成分の担体への結合を可能 にする。 「透過性増大成分を付加した」担体は、次いで、標的成分に（直接またはリシン Ｊ−を介して）共有的に付加された後に、局部的または動脈内に投与されるか、 または全身に投与される。 一方、特異的標的部位の血管透過性は、標的細胞炎症応答仲介剤である透過性増 大成分の有効量を投与することにより、達成される。この種の好ましい透過性増 大成分は、標的部位への局在化か可能であり、そして患者内の標的部位での補体 依存性炎症を仲介することが可能な物質である。そのような成分は、生体内にお ける、受容体の血清との、補体依存性細胞毒性を仲介するそれらの能力により認 識される。透過性増大成分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメ ラ抗体、ヒトまたはヒト化抗体、または上記した能力を有するだの成分であって もよい。 この種の透過性増大成分は、Ｃ２から誘導される血管作動性の補体誘導ペプチド との複合体として投与されてもよい。補体誘導ペプチドは、透過性増大成分と、 不安定な結合（即ち、シッフ塩基結合）を介してのような、標的部位における補 体誘導ペプチドの放出を許容する仕方で結合される。 好ましくは、マウス抗体、ヒト／マウスキメラ抗体またはヒト化抗体等の、抗体 の部分集合は、血管の透過性における標的部位−特異的増大を誘起するために使 用される。それらのモノクローナル抗体は、標的部位−特異的血管透過性を増大 させるのに寄与する生体内での標的細胞分解及び／または標的細胞炎症応答を仲 介する。標的細胞に対する直接及び間接の作用は、補体依存性細胞毒性を仲介す ることにより達成される。生体内の補体依存性細胞毒性を仲介する能力は、生体 内での補体依存性炎症に仲介する能力を表示する。 発明は、抗体の一つの属性−イツタイブ−及び／またはザブクラス特異的機能の 所有−を利用する。例えば、マウス１ｇＧ□及びヒｈ　ｉｇＧ　＋　またはｌ　 ｇ　Ｇ　３定常部分を有するヒト／マウスキメラ抗体は、一般に、抗体依存性細 胞−仲介炎症（八〇ＣＣ）または補体依存性細胞毒性を仲介するための、マウス またはマウス／′ヒト起源の池の免疫グロブリンよりも優れていると４えられて いる。標的部位補体依存性細胞毒性を仲介するのに０効な抗体または他の成分は 、確認されたまたは有効な標的部位を有する究極の受容体が本来ｒＴする血清補 体を利用てきなければならない。従って、ヒト抗体は、ヒト血清を同州すること ができると期待される。他の種の抗体は、それ故、ヒト受容体に対する投与を考 慮した場合のこの能力について試験される。 依存細胞毒性を介在するとして知られている成分の例としては、ＮＲ−Ｃｏ−０ ４、結腸癌に対するマウスｌ　ｇ　Ｇ　＊抗体、　ＮＲ−ＬＵ−１３、ＮＲ−１ ，０−１０のヒト定常領域及びマウス可変領域を特徴とするマウス／ヒトキメラ 抗体、３７−４０キロダルトンのパンカルシノーマ（全身腫瘍）糖タンパク質に 関連する抗体、　ＮＲ−ＬＵ−０３、Ｎ１１−ＬＵ−１０との免疫化による免疫 複合体により生じたれているＧＤ３に対するＩｇＧ　、抗体；抗体３Ｆ８、ムン 他（Ｍｕｎｎ示されたＧＤ２に対するマウスＩｇＧ３　、等が挙げられる。 本発明のこの透過性増大の観点の実施に有用な幾つかの重合体は、多数の治療剤 についての担体とし７て、単独で機能する。好ましい重合体はまた、リガンドま たは抗リガンド及び、例えば、肝臓・胆嚢よりも寧ろ、肝臓からの排出をするた めに、それに重合体が結合した治療剤の生物学的分布に関する。 多数の投与治療剤（財入り、放射性核種）については、特に治療プロトコールに ついては、腎臓の排出が好ましい。 本発明の実施に使用する例示重合体は、哺乳動物の受容体に投与された場合、排 出され、またはその代謝産物が腎臓の経路を通って排出され、それは、−または それ以上の薬剤、抗腫瘍剤、ペプチド、キレート、リガンド、抗リガンドまたは 他の小さい分子と共付または非へ〇結合をすることが可能であり、結合した分子 に応して、腎臓経路の（）１出を強制する。 そのような重合体は、約３ｋＤ〜約７０ｋＤの範囲の分子量を有する極性分子を 含む）。 本発明の透過性増大の観点に有用な例示重合体は、デキストラン、カルボキシメ チルデキストランを含むデキストラン誘導体、カルボキシメチルデキストラン、 ３−メルカプト−２＝ヒドロキシプロピルデキストラン等のような、それらのア ニオン性または極性誘導体；ヒアルロン酸、イヌリン、カルボキシメチルセルロ ース；ヒドロキシ−プロピルメタクリルアミド（ＩＩＰＭ＾）重合体ニスクシニ ル化ポリリシン、ポリアスパラ銀酸塩、ポリグルタミン酸塩、ポリエチレングリ コール（１’ＥＧ）；等である。デギストラン重合体は、発明の透過性増大の観 点において使用する模範的な重合体としてここに記載さ第１る。 本発明において使用するために、デギストラン重合体は、より大きい成分を使用 してもよいか、好ましくは、約５及び約＋５ｋＤの間の範囲の大きさである。本 発明において、より大きい（約４０〜約７０ｋＤ）重合体を使用する場合、受容 体からの複合体の浄化速度は遅くなるか、υ１出のための腎臓経路は維持される 。この方法において、重合体に結合する成分は、ぞの増大した循環時間の結果と して、増大された生物学的有用性を示す。そのような結合性イは、然しながら、 腎臓排出のまま維持される。 本発明の例示デキストラン含１’−Ｔ　？Ｍ重合体、デキストラン−ビオチン複 合体である。本発明のキレート−ビオチン−デキストラン複合体は、例えば、酸 化されたデキストランからビオチンヒドラジドを複合化し、次いて、Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル等のキレート 活性エステルとの反応により形成される。一方、キレートーヒオチンーデキスト ランは、デキストランヒドラジドと、キレート−ビオシチン複合体のカルボキシ 末端とを反応させることにより形成することができる。好ましくは、カルボキシ 末端は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル等の活性エステルを形成する ために誘導される。異なる重合体に対する一般的な適用性の代わりのプロトコー ルを実施例ＸＶ１１に記載する。 リシンを固定可能なビオチン−デキストラン（ＢＤＬＦ、　ミズーリー州、セン トルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｃｍｉｃｘｌ　ＣｏｍｐａｎＹ ＳＳｔ、Ｌｏｕｉｓ　、Ｍｉｓｓｏｕ＋ｉ）から市販）は、本発明の実施に使用 する好ましい重合体−リガントである。 活性剤は、単量体、二量体、二量体または他の便利な単位の間で処理された、短 い期間の血清安定結合により特徴付けられるデキストラン重合体に結合すること ができる。そのような複合体はまた、好ましくは太きいものである（約４０〜約 ７０ｋＤの範囲の分子量を示す）。そのような重合体を使用する〜つの利点は、 それに固定された分子が、循環時間の増大並びに肝臓での取り込みの減少を示す であろうことである。より具体的には、結合した分子の循環時間は、生体内での 重合性構造の完全さの維持により、指示される。解重合は、受容体の循環系から 、好ましくは腎臓経路を経由して、それら自信速やかに浄化される、結合分子− 単量体、−二量体、−三量体または類似の成分を開放する。 解重合は、例えば、以下の方法を含む、それについての如何なる便利な方法によ っても、制御されるコールさい分子の結合（ｔｅｌ　ｚ、−！キ、１〜３時間、 予備標的及び標的化、直接標識プロ１−コールの両者における活性剤について） に対する適当な循環時間を提供するのに十分な期間の間、血清中で安定な化学２ １を含むデキストラン単位の間の結合の使用、または 一結合分子の循環時間の適当な量の通過後、酵素の投与により酵素的に開裂する デキストラン単位の間の結合の使用。 第一の研究方法において、エステル、アセタール、ジスルフィド、チオアセター ル等の基が使用される。例えば、フェニル、または活性化フェニルまたはフタリ ル（例えば、クロロ−置換、フルオロ−置換、多ハロゲン−置換、ニトロ−置換 等）のような１〜３時間の血清安定性を有するエステル結合は、デキストラン重 合体単位に付加するために使用してもよい。そのような結合は、重合体に結合し た分子の標的部位への局在化を容易にするだめの十分な時間、血清中において安 定である。 第二の研究方法は、ヒト血清中には大量には見出せない投与可能な酵素による開 裂を起こし易いデキストラン単位の使用を含む。本発明のこの観点の実施におい て有用な例示酵素には、デキストラナーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ（細 菌性α−１，６−ボリザツカリダーゼ）等が含まれる。酵素・　は、それに対す る如何なる便利な投与形態で、如何なる便利な経路によっても投与される。その ような酵素は、アルブミン、免疫グロブリンまたはそれらの部分等を含む、長く 循環するたんぽ（質との融合蛋白質として任意に複合しまたは形成されるもので ある。この方法において、投与された酵素は、重合体の解重合を行うのに十分な 時間、循環系に残存する。 先に議論したように、標的細胞表面に結合する成分の架橋は、細胞によるそれら の結合した成分の内在化を引き起こす。 この架橋現象は、本発明の２段階または３段階予備漂０′−Ｊプロトコールを使 用した幾つかの方法において利用すること力くできる。例示のピオチン／アビジ ンリガンド／抗すブｆンド女；１を使用する本発明の、架橋／内在化の観点の三 つの（ψ１示プロ］・コールは、以下のように記載することができる・１）（２ 段階）標的成分−ビオチン−治療剤複合体（またはヒオチシー挿的成分−冶療剤 複合体）の投与、及び先に局在化した複合体と架橋するためのアビジンまた（ま ストレプトアビンンの投与。このプロトコールの変種として（よ、標的成分−ビ オチン複合体を投与、腰次いで、治療剤−アビ゛ジンまたは一ストレプトアビジ ン曳合体の投与力く含まｆする。 ２）（２段階）アビジン−またはストレブトアヒ゛ジンー標的成分−治療剤１夏 合体（または治療剤−アビシン−またＣよストレプトアビジンー標的成分複合体 ：または抗体−（アビジンまたはストレプトアビジン）２または（抗体）２−ア ビ゛ジンまたは−ストレプトアビジンもまた導入した、治療剤含有複合体）の投 与；及び 先に局在化した複合体と架橋するための多価ビオチン−重合体複合体の投与。こ のプロトコールの変種としては、標的成分−アビジンまたは−ストレプトアビジ ン複合体、抗体−（アビジンまたはストシブ１−アヒジン）２または（抗体）２ −アビジンまたは−ストレプトアビジンを投与し、次いて、多価ビオチン−重合 体治療剤複合体の投与が挙げられる。 ３）（３段階）標的成分−ビオチン１夏合体の没Ｊう；アビジンまたはストレプ トアビジンの投与；先に局在化したアビジンまたはストレプトアビジンと架橋す るためまたは先に局在化したビオチン含有複合体のアビジンまたはストレブ］・ アビジン架橋の結果としての細胞内へ内在化するだめの多価ビオチン−重合体− 治療剤複合体の投与。 本発明のそれらの架橋／内在化の態様は、ビオチン／アビジンリガンド／抗リガ ンド対、モノクローナル抗体標的成分及びトリコテセン治療剤を参照して以下に 例示するが；然しなから、実施態様は、他の投与成分との使用を妨げない。 本発明のこの及び他の観点の実施に有用な、例示の簡単なトリコテセンを以下に 示す・ Ｒ４はｌ−（またはＲ１とエポキシド基を形成し；ＯＣＨ３，ＳＣＨ３，聞２． ■（０１３、Ｎ　（ＣＨ３）νＬ３．　Ｌ、。 またはＲ４とエポキシド基を形成し；そしてを表ずが、但（７、少なくとも一つ のＲ，、Ｒ，及びＲ６はＬ　ｌ　、＋７２　、Ｌｔ　、またはＲ４であり、そし て更にＲ１及びＲ３，はＩ−、またはＩｌ、２てはなく、ここで、そして、ここ で Ｙは０またはＮＨｌ Ｒ７またはＲ７／はＩ（またはＣ１１，。 Ｒ８またはＲ８／はＩ（または０Ｈ１ ｎは１〜ｌＯ；そして ｎ′　は０〜１０である。 好ましい簡単なトリコテセンは、Ｒ２及びＲ１が共に他の好ましいトリコテセン は、以下のように特徴付けられる。 （１）Ｒ＋はＬｌまたはＲ２であり、ＹはＮＲ１Ｒ２及びＲ７／は独立に■］ま たはＣＩ＋、の何れが、Ｒ８及びＲ８／は独立にＨまたはＯＨの何れか、そして ｎ／は０−１０である：更に、但しＲ２及びＲ３は共に０−監ＣＨ，、、はＨ； 及びＲ１及びＲ６ハＨ，０１１、Ｓｌｌ、０Ｃ１１３，５Ｃｆｌ　３　、Ｎ１１ ２　、ＮＨＣＨＩ　、Ｎ　（Ｃ１ｌ、）２から成る群より選ばれたものである； （２）Ｒ１はＨ，ＯｌｌまたはＳＨｌテあり；そしてＲ３及びＲ６１；ｉＨ，Ｏ ｌｌ、５ｔ（１０ＣＩ＋、、ＳＣＨ３、Ｎｌ１２　、ＮＩＩＣＨｉ　、Ｎ　（Ｃ Ｈ３）２またはり、から成る群より選ばれたものであり、ここでＲ７及びＲ，／ は独立にＨまたはｃ）１３の何れがであり、そして■１は１．〜ＩＱである； （３）Ｒ＋は■］、Ｏｌｌまたは３１１であり；そしてＲ１及びＲ６はＨｌｏｌ ｌ、ＳＨｌ　０Ｃ１１３、ＳＣＩ＋３、ＮＲ２、Ｎ１ｌＣｌ＋３　、Ｎ　（Ｃ１ ｈ　）２またはＲ４から成るｒ！ｆより選ばれたものであり、ここでｎは１〜１ ０てあり、そしてＲ７及びＲ７／は独立に１１またはＣ１１゜の何れかである； （４）Ｒ１はし、またはＲ４であり、ここでＲ７及びＲ７／は独立にＨまたはＣ Ｈ３の何れかであり、そしてｎは１〜１０であり：そして、Ｒ１及びｌく。はＨ ，０１１、Ｓｌｌ、ｏｃｌｌ、、Ｓ　Ｃ１１３、Ｎｔ５　、Ｎ１１ＣＩ＋３　、 Ｎ　（Ｃ１１３）　２から成る群より選ばれたものである。 模範的な簡単なトリコテセンは、例えば、ビオチン−ＮＲ−Ｌｌ−１Ｏモノクロ ーナル抗体−３−３−　（ＣＩ＋□）　２−ＣＯＮ）Ｉ−Ｎ・（３−ケトアング イジン）のように、上記した番号１のプロトコールに使用されてもよい、アング イジンまたはその３−ケト誘導体である。同様に、この簡単なトリコテセンは、 例えば、（ビオチン）　ＩＦＩ−２ｎ−デキストラン−アングイジンのように、 上記プロトコール番号２及び３において使用してもよい。上記記載の構造内の背 景内において、模範の簡単なトリコテセンは、以下のように特徴付けられる　Ｒ ，はＬｌであり、そしてＹはＮＨｌであり、Ｒ７及びＲ７／は几にＩ−１であり 、そしてｎ′　はＯであり；　Ｒ４、Ｒ＝、及びＲ６はＨであり：そしてＲ２及 び本発明のこの及び（１−の観点の実施に有用な、例示の大環状トリコテセンを 以下に示ず： ここで、ｎ′　は、 から成る群より選ばれたものである、但し、少なくとも一つのＲ，、Ｗ及びＺは り４、Ｒ２、Ｌｌ、またはＲ４であり、そして更にＷ及びＺは共にＬ　Ｉ　ｓ　 Ｒ２、Ｌｌ　、またはＲ４ではなく、ここで、 Ｙは０またはＮｌｌ、 Ｒ７またはＲ７はト■またはＣ１１，。 Ｒ８またはＲ８はト■または０１１、 ｎは１〜１０：そして １］゛　は０〜ｌＯである：そして更に、但し、Ｗは２′と３′の間でエポキシ ド基に成り得、そして更に但し、Ｗ及びＺがり７、Ｒ２、ｔ、、　、またはＲ４ ではない場合、Ｗ及びＺは独立にＨ。 ０１１または５＋１の何れかであり；Ｒ１がり４、Ｒ２、Ｒ３、またはり１．で はない場合、Ｒ１はＩ−１，０１１またはＮｌｌであり、そして、Ｒ２及びＲ３ ４；！Ｈ１ＯＨ１Ｓｌｌ、ＯＣＨ，、Ｓ　Ｃ１１３、Ｎ　Ｉｔ　□、Ｎ　Ｉｔ　 ＣＩｆ　ｓ、Ｎ　（ＣＨ３）２、Ｒ３またはＲ４がら成るＰ；Ｙより選ばれたも のである。 好ましい大環状トリコテセンは、Ｒ′が、である化合物である。 そのような好ましい化合物は、ロリジンＡである。この種のより好ましい大環状 トリコテセンは、以下のように特徴付けられる （１）Ｒ＋はｒ、ｌ　、Ｒ２、Ｒ３Ｎまたはり、であり、ここで、 Ｙは０またはＮｌｌ、 Ｒ７及びＲ７は独立にＨまたはＣ１１３の何れが、ＲＦｌ及びＲ８，は独立にＨ または０１１の何れが、ｎは１〜１０、 ｎ゛は０〜ｌｏてありＩＲ２及びＲ３は１イ、０１１、Ｓｌｌ、ＯＣＨ，、Ｓ山 、Ｎ１１□、ＮｌＩＣ１ｌｉ　、Ｎ　（山）２から成る群より選ばれたものであ り；そしてＷ及びＺは独立にＨＸｏｌｌまたはＮｌｌの何れかである場合； （２）Ｒ，及びＷは独立に■４．０１１またはＮｌｌの何れがであり；Ｒ２及ヒ Ｒ１１，ｔＨＳＯｌｌ、Ｓｌｌ、ＯＣＩｆ　、、Ｓ　Ｃ１１３、Ｎ　１１２　、 Ｎ　Ｉｔ　ＣＩｆ　３、Ｈ（ＣＩ＋３．　）　２から成る群より選ばれたもので あり、そしてＺはＬ＋　、Ｒ２、Ｒ３、またはり９．であり、ここでＹはＯまた はＮｌｌ、 ＲフまたはＲ７はトＩまたはＣ１１３、ＲＲまたはＲＦｌはＨまたは０１（。 ｎは１〜１０、そして ｎ゛　は０−１０である： （３）Ｒ，及びＺ　ｌ；ｋ　ＨｌＯＨまたハｓＩＩテあり；Ｒ２及びＲ３は）（ 、Ｏｌｌ、Ｓｌｌ、０ＣＩｈ、５ＣＩＩＮ　、Ｎ１１２　、Ｎ１ｌＣｌ＋３　、 Ｎ　（Ｃ１ｈ　）２から成る群より選ばれたものであり：そしてＷはＬｌ、Ｒ２ 、Ｒ３、またはり、の（１１Ｔれがであり、ここでＹはＯまたは旧１、 Ｒ７またはＲ７はＨまタハＣＩ＋　、、Ｒ８またＩｔ　Ｒ，はＨまたｉ；！０１ １．１］は１〜１０、そして ｎ”　は０〜１０である；そして （４）Ｒ，、Ｗ及びＺは独立にＮｌｌまたＬよ０１（の何れがであり；Ｒ２及び ＲｙはＨｌｏｌｌ、Ｓｌｌ、ＯＣＲ、，５ＣＩＩ、　、Ｎ１１２．　ＮｌｌＣｌ ＋、、Ｎ　（ＣＬ　）２　、Ｌ、、＊たはｌ＋　ｈら成ルｒ！Ｙより選ばれたも のであり、ここで Ｒ７またはＲ７，はＦｉまたはｃ１］、の何れが、そしてｎは１〜１０である； 但し、Ｒ２及びＲ３は共に同時にＲ３またはＲ４ではない。 模範的な大環状トリコテセンは、ロリジンＡ及び２′−オキソまたは１３゛−オ キソ誘導体のようなそれの誘導体である。それらのトリコテセンは、上記したプ ロトコール番号１に、例えば、ビオｆシーＮＵ−ＬＵ−１０モ／　りＣｌ　−ｆ −ル抗体−３−Ｓ−（Ｃ１１２）２−ＣＯＮＨ−Ｎ＝　（２’−オキソロリジン Ａ）、ビオチ＞　−Ｎｏ−Ｌυ−１０モノクローナル抗体−１−３−　（ＣＨ２ ）　２−ＣＯＮＩＩ−Ｎ＝　（１３’　−：ｔ　＋ソロリジ：／Ａ）　、’ｌ’ −オキ゛／−ＣＩリジンＡ　−３−３−（Ｃ１１２）　２−ＣＯＮＩＩ−リシン −ｔｉｌｌ−Ｌｔｌ〜１０モノクローナル抗体−ビオチン等として使用してもよ い。同様に、それらの大環状トリコテセンは、上記プロトコール番号２及び３に 、例えば、（ビオチン）　ＩＲ−２０−デキストラン−２′−オキソロリジン八 として利用してもよい。 模範的なロリジンＡ誘導体大環状トリコテセンは、以下のように特徴付けられる ・Ｒ１及びＲ２が共に１１であり；Ｒ３がＣＨ３：ＷがＬ＋　、ＹがＮ１１ＳＲ ，及びＲ７が共にＨ，ｎ’　は０；そして２は０１］； そしてＺがＬｌ、ＹがＮｌｌ、Ｒ７及びＲ７・が共にＨ，ｎ’　は０；そして Ｒ、及びＲ７が共に１１であり；Ｒ３がＣ１ｈ、ＷがＲ３、Ｒ７及びＲ７が共に Ｈ，ｎは１；そしてＺが０１１である。 酸に不安定なリンカ−の技術、例えば、ヒドラゾンリンカ−は、放出された試薬 がその治療効果（例えば、タンパク質合成の用害）を発揮することができる標的 細胞のエンドソーム及びリソソーム（ｐｌ＋３．５−５．５）内での治療剤の放 出を容易にする。ジスルフィド結合もまた、標的細胞のエンドソーム及びリゾソ ーム内での治療剤の放出を促進する。 トリフチセン−リンカ−製剤についての例示プロトコールは、実施例ＸＶＩＩ＋ において議論する。トリコテセン−抗体複合体についての例示プロトコールは、 実施例ＸＩＸ　（Δ及びＢ）に記載する。又、トリコテセン−重合体複合体の製 造についての例示プロトコールは、実施例ＸＩＸ　（Ｃ）に記載する。 放射性核種治療剤を使用する本発明の実施態様において、非標的化治療剤の速や かな浄化は、１髄等の非標的臓器に治療剤をさらずことを減少する。従って、放 射線の高い用量で、骨髄毒性の用量限定な１７に投与することがてきる。更に、 本発明の予備標的法は、ＷＲ２７２＋等の、短期間の骨髄保護剤を投与すること も任意である。その結果、たとえ、より高い用量の放射線を与えても、骨髄毒性 についＣの用Ｍ限定がない。 上記した予備標的プロトコールは、放射性核種診断または治療成分の配布と組み 合わせて主として記載したが、このプロトコールは、抗腫瘍剤、化学療法剤等を 含む、他の成分を配布するための使用にも用いられる。例えば、最も自然に生ず る組み換え体サイトカインは、生体内において短い半減期を有する。この特性は 、それらの分子の臨床的有効性を制限する。何故なら、毒性を生ずるに近い用量 が屡々必要とされるからである。ヒトにおける用量限定毒性は、例えば、ＩＬ− ２または腫瘍壊死因子の投与において、高い用量が観察されている。 ストレプトアビジン−標的成分複合体の投与、次いでビオチン化すイトカインの 投与のようなプロトコールもまた、本発明により考虜されている。そのような抗 リガンドの予備標的は、標的細胞に局在化されるサイトカインの爪を増大するこ とにより、サイトカイン治療剤の働きを改良するのに貢献する。 ストレプトアビジン−抗体複合体は、一般的に、自然の抗体と同様の薬物動態を 示し、そしてそれらの構造に基づいて、標的細胞によく局在化する。ビオチン化 すイト力インは、生体内での短い半減期を維持するが、然しなから、サイトヵイ ンは、ビオチンのアビジンについての親和性の結果として、標的に局在化されて もよい。更に、ビオチン−アビジンは、ゆっくりとした速度で起こるｐＨ一依存 性の解離を経験し、それにより、時間を超えて標的部位で、サイトカインの相対 的に定常で、持続した放出を許容する。また、ビオヂシーアビジンの会合により 標的細胞と錯化したサイトカインは、細胞媒介細胞障害に含まれる細胞による抽 出及び内在化に有用である。 予め形成された抗体−ストレブトアビジシービオチシーサイトカイン製剤もまた 、本発明のそれらの方法の実施に使用される。更に、本発明の３段階プロトコー ルもまた、ＩＬ−２等のサイトカインを標的部位に配布Ｖるのに使用される。 本発明の予備標的化技術により配布されてもよい他の抗腫瘍剤には、Ｌ−セレク チン、Ｐ−セレクチン及びＥ−セレクチンが含まれる。サイトカインの（ｆ在は 、内皮細胞等の細胞を刺激し、その表面にセレクチンを発現する。セレクチンは 、白血球細胞に結合し、白血球細胞をそれらが必要とされるところへ配布するこ とを助ける。従って、ストレプトアビジン−またはアビジン−標的成分複合体の 投与、次いて、ビオチン化セレクチンの投与のような、プロトコールもまた、木 兄化は、標的細胞に局在化されたセレクチンの量を増大させることによりセレク チン治療削の働きを改良するのに貢献する。 この方法におやで、セレクチンが発現するためのサイトヵインによる誘発の必要 性は、標的細胞集団でのセレクチンの局在化及び保持により取り除かれる。３段 階プロトコールもまた、標的部位ヘセレクチンを配布するために使用される。 化学療法薬剤もまた、一般に、治療的に有効な用量で、生体内において短い半減 期を示す。従って、本発明のプロトコールの他の例として、アビジン−標的成分 複合体の投与、次いで、薬剤−担体−ビオチン錯体等の、ビオチン−化学療法薬 剤複合体または錯体の投与が含まれる。本発明の３段階プロトコールもまた、標 的部位に対する、メトトレキセート、アドリアマイシン、高い効力のアドリアマ イシン類縁物、トリコテセン、シトキサン、ビンカアルカロイド、アドリアマイ シンＤ、タキソール、タキンテレ等の化学療法薬剤を配布するために使用される 。 本発明の付加的な観点は、哺乳動物内の標的細胞を根絶する方法であり、 １）哺乳動物からエフェクター細胞（またはその前駆体）を抽出し２； ２）エフェクター細胞成長因子及び第一の免疫原分子と共に、生体外（ｉｎマｉ ｌ＋ｏ）で抽出したエフェクター細胞を培養し、それにより第一の免疫源分子ま たはその成分を認識する感作エフェクター細胞を製造し； ３）抗体、抗原フラグメントまたは、標的細胞及びリガンド／抗リガンド対のメ ンンバーと結合する他の標的成分から成り、第一の免疫原分子と共通する少なく とも一つの成分を有する第二の免疫原分子を哺乳動物に投与し：４）工程２にお いて製造された「感作」エフェクター細胞を哺乳動物に投与し；そして ５）工程２において投与したメンバーに対し相互に補完し合うリガンＦ’　／抗 リガンド対のメンバーと結合するエフェクター細胞成長因子を投与する工程を含 むものである。 本発明のこの観点において、標的成分は、それらの標的細胞が引き続く治療にお いて十分に１免疫原性」であることを確実にする、強力な予め定められた抗原性 信号を標的細胞上に植え付けるための担体として機能する。生体内において標的 細胞に結合する処理された抗原は、続いて投与される予め感作されたエフェクタ ー細胞を、標的細胞に引き寄せる。事実上、この工程は、腫瘍−会合抗原の増幅 を構成する。リガンド／抗リガンド対複合体成分は、エフェクター細胞成長因子 を標的部位に配布するため、及び成長因子の配布からゆっくりとした標的成分の 局在化工程の結合を絶つことにより、循環するエフェクター細胞成長因子と結び ついた毒性を避けるために使用される。 哺乳動物内の標的細胞を根絶するだめの他の方法は、生体内において標的細胞と 結合する、抗体−または他の標的成分−リガント／抗リガンド対メンバー−免疫 原複合体から成る免疫原分子を哺乳動物に投与することから成る。続いて、リガ ンド／抗リガンド対の補完的メンバーを、エフェクター細胞成長因子と複合しな がら投与する。この生体内の態様は、免疫原分子が生体内で治療応答を誘起する ことが可能である場合に使用される。この場合、抗原性信号は、前もって決定さ れないが、治療的に有効な数のエフェクター細胞を標的部位に補給するのに十分 に強力である。哺乳動物内での免疫原細胞の標的細胞への結合は、標的細胞での 細胞障害性エフェクター細胞の応答を誘起する。エフェクター細胞成長因子の標 的部位への配布は、その部位でのエフェクター細胞の活性度を増大する。 本発明によれば、エフェクター細胞は、哺乳動物から抽出されるか、哺乳動物内 から補給される。それらのエフェクター細胞は、「感作」されることができる細 胞であり、その結果、「感作」されたエフェクター細胞は、特別の抗原を認識し 、そしてその抗原を有する標的細胞に対し細胞障害の効果を有する。本発明のこ の観点の実施に有用なエフェクター細胞は、ＬＡＫ細胞、ナチュラルキラー（Ｎ Ｋ）細胞並びに、「感作」される可能性がありそして同様に操作できる、他の白 血球及びマクロファージを含む、他に表示される種々の細胞障害細胞と共に、「 始動Ｔ細胞」として表示される細胞である。 本発明の好ましい実施態様において、エフェクター細胞は、細胞障害Ｔ細胞とも 呼ばれる、細胞障害Ｔリンパ球である。 エフェクター細胞は、患者からそれらの細胞を集め、そして同時に抽出される他 の細胞タイプまたは生物学的物質から所望のエフェクター細胞を分離することに よる、如何なる適当な工程によっても処理されることにより、哺乳動物から抽出 することができる。従来の細胞収集またはサイトフェレシス（例えば、ロイコフ ェレシス）工程を使用してもよく、エフェクター細胞抽出工程は、より多くの量 のエフェクター細胞を得るために繰り返してもよい。例えば、哺乳動物に対し、 −日当たり一回のロイコフェレシス工程を、−日若しくはそれ以上の日数（例え ば、Ｔ細胞のようなエフェクター細胞の多くの数を集めるために５日間）行なう 。 使用されるエフェクター細胞成長因子は、使用するエフェクター細胞のタイプに より変えてもよく、培養した細胞の増殖を刺激するか、またはその活性化を増大 する如何なる成長因子てあってもよく、それにより「感作」された細胞障害エフ ェクター細胞が製造される。それらの中で、適当な成長因子は、単核細胞につい てはモノカインであり、そしてＴリン第一の免疫原分子（それと共にエフェクタ ー細胞がインキュベートされる）は、第二の免疫原分子と同一でも異なっていて もよいが、但し、二つの免疫原分子は、少な（とも一つの共通の成分を有する。 この但し書きは、第一の免疫原分子の存在下、生体外で「感作」されたエフェタ ー細胞が、生体内で第二の免疫原分子を認識するであろうことを保証する。 標的細胞、リガンド／抗リガンド対メンバーまたはそれらの組合せが十分に免疫 原性（即ち、エフェクター細胞の感作を誘起することが可能である）である場合 、標的成分−リガント／抗リガンド対メンバー複合体は、第−並びに第二の免疫 原細胞として機能する。一方、複合体の十分に免疫原性をもつ部分は、第一の免 疫原分子として使用してもよく、全体の複合体が第二の免疫原分子として機能す る。 標的成分−リガント／抗リガンド対メンバー複合体またはその部分のどこかが、 十分に免疫原性（即ち、エフェクター細胞の感作を誘起することが可能である） がない場合、種々の化合物が、その免疫原性を増大するために、標的成分または リガンド／抗リガンド対メンバーに付着してもよい。この場合、免疫原−標的成 分−リガント／抗リガンド対メンバー複合体は、第二の免疫原分子として投与さ れる。 免疫原性を増大するだめの、標的成分またはりガント／抗リガンド対メンバーに 付着する化合物の種類の中には、意図した哺乳動物受容体（抗原、マイトジェン 、他の異物タンパク質またはその断片等、細胞障害Ｔ細胞等を活性化するペプチ ド等）にとっては「異物」である、ハブテンまたはポリペプチドがある。幾つか の環境において、免疫原の、スペーサー（即ち、成分を物理的に分離する機能を するリンカ−分子）を介しての標的成分またはリガンド／抗すガント対メンバー への付着は、結合した第一の免疫原分子の免疫原性を増大する。 本発明の実施においてＨ用であるハブテンは、ベンゾエート基、ニトロフェニル 基、酢酸及びその誘導体、ベニリシン酸及びその誘導体、スルファニル酸誘導体 、ヘキソースアミン、リボヌクレオシド、リボヌクレオシド、イソシアネート、 イソチオシアネート等の曲の小さい分子を含む。好ましいハブテンは、安息香酸 、ジニトーロクロロベンゼン、ジニトロ−フルオロベンゼン、ピクリルクロライ ド、ｐ−アミノベンゼンアルソネート、ｐ−アゾーベンゼンアルソネート、酢酸 、ジニトロフェノール、トリニトロフェノール、トリニトロフェノール−ε−ア ミノカプロン酸、３−ヨード−４−ヒドロキシ−５−二トロフェニル酢酸、ｐ− ヒドロキシフェニル酢酸、ｐ−スルファニリン酸、２，４−ジイソシアネート、 フルオレセインイソチオシアネート、Ｎ−アセチルグルコサミン等である。 本発明のこの観点の実施において有用な「異物」ポリペプチドには、フラジェリ ン、陣笠貝ヘモシアニンのフラグメント、組織適合抗原、細菌細胞表面タンパク 質、ウィルスコートタンパク質、それらのフラグメント等が挙げられる。小さい ポリペプチドフラグメントは、一般に、標的成分を含有する複合体の生物学的分 布による干渉を避けるために好ましい。 タンパク質アメリカヤマゴボウ抗ウィルス性タンパク質及びフィトヘマグルチニ ン等のＴ細胞マイトジェンもまた使用される。 本発明のこの観点の生体外での感作の態様の特別の例を、以下に記載する。 １）Ｉｌｉｆｉ乳動物からエフェクター細胞（またはその前駆体）を抽出する； ２）抽出したエフェクター細胞を、生体外において、インターロイキン−２（Ｉ Ｌ−２）及びアビジンまたはストレプトアビジンと共に培養し、それにより、ア ビジンまたはストレプトアビジンまたはその成分を認識する「感作」エフェクタ ー細胞を製造する； ３）哺乳動物に、標的成分−アビジンまたは一ストレプトアビジン複合体を投与 する； ４）工程２において製造した「感作」エフェクター細胞を、哺乳動物に投与する ：そして ５）　ＩＬ−２−ビオチン複合体を投与する。 ３段階予備標的アプローチを、本発明のこの観点の実施のために設旧してもよい 。 本発明の生体外での態様の他の特別の例は、以下の工程を含む： １）１Ｍｆｉ乳動物からエフェクター細胞（またはその前駆体）を抽出する。 ２）エフェクター細胞を、ＩＬ−２と共に培養する；３）培養したエフェクター 細胞をビオチンと複合する：４）標的成分−アビジンまたは標的成分ストレプト アビジンを哺乳動物に投与する。ここで、標的成分は、エフェクター細胞の作用 が所望である細胞に対し特異的である；そして、 ５）エフェクター細胞−ビオチン複合体を哺乳動物に投与する。 本発明のこの態様において、工程３及び４は逆の順序で行ってもよい。又、清澄 剤を、工程４及び５の間で投与してもよい。更に、３段階予備標的プロトコール を使用してもよい。 本発明のこの態様の生体内での「感作」の態様の特別の例としては、以下に記載 したようなものである。 １）Ｔｌｒｆｉ乳動物に、ハブテン−標的成分−アビジンまたは一ストレプトア ビジン複合体を、エフェクター細胞の「感作」を誘起するために投与し：そして ２）ＩＬ−２−ビオチン複合体を哺乳動物に投与する。 本発明のこの態様の実施のために、３段階予備標的プロトコールを設計してもよ い。 エフェクター細胞の「感作」の概念を採用する他のプロトコールは、臓器移植に 付随する原則を含む。クラス■及びクラス１１の抗原を含むヒトの１１１．＾シ ステムは、マウスのＭＩＩＣ複合体に相当し、例えば、自己／非自己認識の主要 な因子である。この理由のために、１（巳マツチングは、臓器移植についての候 補を選択することにより行イっれる。より類似するＩＩＬ＾（即ち、双子、兄弟 姉妹、両親等）の人々は、最も好ましい臓器移植供与体である。何故なら、供与 された臓器が受容体により、非自己として認識されることがより少ないからであ る。 幾つかのＩＩＬ＾抗原は、ヒトにおいては比較的まれである、即ち、ヒトＨＬＡ 表示において、めったに存在しない。例えば、１１Ｌ＾−８７抗原はヒトの人口 のたった５％のみに存在する。従って、ＨＬＡ−８７は９５％のヒトにおいて非 自己として認識される。 そのような相対的に稀な抗原は、それ故、抗原を発現しない個々人の中の擦的部 位に対し標的とすることができる。標的部位での抗原の存在により、標的は受容 体により非自己として認識されるであろうし、それにより標的と闘うために受容 体の免疫システムを補給する。幾つかの標的（例えば、ある腫瘍）は、殆ど非自 己として認識されないので、その部位で認識されている非自己抗原の存在は、標 的に対する受容体の免疫システムの応答を改良するであろう。 受容体に存在しないＩＩＬＡ抗原は、ここで記載した２段階または３段階予備標 的プロトコールにおいて、標的成分との融合タンパク質の一部として、またはリ ガンド若しくは抗リガンドとの？Ｕ合または融合タンパク質の一部として、標的 成分との複合により標的部位に配布される。 本発明を、以下の実施例を提供することにより、更に記載する。それらの実施例 は、例証のために提供したものであって、限定するためのものではない。 実施例Ｉ キレート−ビオチン複合体の合成 Ｎ３Ｓキレート核を含むキレート化合物を、アミド結合を介してビオチンに付着 させた。例示キレート−ビオチン複合体の放射性金属標識化を以下に図示する。 ｘ＝　（ＣＨ２）　ｏ、短鎖　Ｍ＝ＴｃまたはＲｃＸ＝■（ＣＨ２）　、Ｎ）］ 、長鎖 Ｒ＝ＨまたはＣＨ２Ｃ０２Ｈ スペーサー基ｒＸＪは、複合体のビオチン部分を立体的にアビジンとの結合に便 利なように許容する。「Ｒ１」がカルボン酸置換基（例えば、ＣＩｌ□Ｃ００Ｉ ＋　）である場合、複合体は、改良された水溶性を示し、そして更に放射性標識 化ビオチン複合体の生体内での排泄を、肝臓・胆嚢での浄化よりも寧ろ腎臓に向 ける。 簡単に名えば、Ｈ−ａ−Ｃｂｘ−Ｎ−Σ−１−［１０Ｃ保護リシンは、Ｎ）Ｉｓ 及びＤＣＣによりスクシンイミジルエステルに変換され、そして、アスパラギン 酸β−１−ブチルエステルにより次いで縮合される。得られたジペプチドは、Ｎ ｌｌ５及びＤＣＣにより活性化され、次いでグリシン１−ブチルエステルにより 縮合される。 Ｃｂｚ基は水添分解により除去され、そして７ミンはテトラヒＦロビラニルメル カブト酢酸スクシンイミジルエステルを用いてアシル化し、Ｓ−（テトラヒドロ ピラニル）−メルカプトアセチル−リシンを得る。Ｎ−１−ＢＯＣ基及びｌ−ブ チル基のトリフルオロ酢酸による開裂、次いでＬＣ−ビオチン−ＮＩＩＳエステ ルによる縮合により、（Σ−カプロイルアミドビオチン）−アルパルチルグリシ ンを得た。合成方法を以下に図示する。 １ＨＮ７４Ｒ：　（ＣＤ３０Ｄ、２００　１４＋１ｚ　Ｖａｒｉａｎｔ：　１． ２ｓ−１，りＳ　（ｍ、２４Ｈ１。 ２．１５−２．２５　（ｂｒｏａｄ　ｅ、４４（１，２，６５−１，Ｏ５（ｍ、 ４Ｈ１゜３．３０−３．４５　（ｄｄ、２Ｈ１，３，５０−３，６５（ｄｄｄ、 ２Ｈ１，１９５ｆｂｒｏａｄ　ｓ、２Ｈ１，４，００−４，１５ｆｍ、ＬＨＩ、 ４．２５−４．３５（ｍ、ＬＨＩ　、４．４５−４．５５　（ｍ、　ＬＨ）、４ ．７−５．０５　（ｍ　ＨＯＤと重複）元素分析、Ｃ３５Ｈ５７Ｎ７０１１Ｓ２ ４１２０についてのＣ，Ｈ１ｔ１計ｆｆ（ｆ（：５０．４１．’７．１．３．１ １．７６’ＪＪｌｌａ’５０．］ｊ、’７．１４，１１．’ＩＯ実施例■ テクネテウムまたはレニ実施例対標識化キレート−ビオチン複合体の調製 実施例Ｉのキレート−ビオチン複合体を、９Ｑ′Ｔｃパーテクネテートまたはｌ 　８６Ｒｅバーレネートの何れかで放射標識化した。簡単に訂えば、″”Ｔｃバ ーテクネテートをグルコン酸ナトリウムの存在化に塩化第一錫で還元し、中間体 のＴｃ−グルコネート錯体を形成する。実施例Ｉのキレートービオチン複合体を 加え、１００℃で１０分間、約１．８〜約３３のｐＨで加熱した。溶液を中和し て、約６〜約８のｐ＋＋とし、Ｎ、Ｓ−配位９９′″Ｔｃ−キレ−１・−ビオチ ン複合体を得る。１％酢酸中、５〜６０％のアセトニトリルを使用したＣ−１８ １１１’ＬＣ勾配溶出は、δ（γ光線）検出を用いて９７％よりも多い放射化学 的収率で、二つのアノマー（ａｎｏｍｅ＋ｓ）を示した。 一方　１８６　Ｒｅパーレネートは、冷アンモニウムパーレネートで固定し、塩 化第一錫で還元し、そしてクエン酸塩で錯化する。実施例Ｉのキレート−ビオチ ン複合体を加え、そして９０℃で３０分間、約２〜約３のｐＨで加熱した。溶液 を中和して、約６〜約８のｐＨとし、Ｎ５Ｓ−配位ＩＦ１６Ｒ，−キレートービ オチン複合体を得る。１％酢酸中、５〜６０％のアセトニトリルを使用したＣ− １８１１ＰＬｃ勾配溶出は、８５〜９７％の放射化学的収率を示した。引き続＜ 　Ｃ−１８逆相親油性カラムによる精製により、９９９６の純度の物質が得られ た。 実施例■ 放射性標識化キレート−ビオチン複合体の生体外分析９９”Ｔｃ−及び１Ｆ１６ Ｒｅ−キレート−ビオチン複合体の両者を生体外で測定した。過剰のアビジン（ 約１００−倍モル過剰）を結合した場合、１００％の双方の放射標識化ビオチン 複合体は、アビジンと錯化した。 ９９”Ｔｃ−ビオチン複合体を、種々の化学的対抗量の条件で処理した。簡単に 言えば、９９“Ｔｃ−キレート−ビオチン複合体を、アビジンと結合させ、５ｃ ｍの大きさの除外ゲル口過カラムを通した。放射標識化ビオチン−アビジン錯体 は、種々の化学的対抗量（第１表参照）で処理し、インキュベーション（ｉｎｃ ｕｂａｌｉｏｎ）混合物をサイズ除外フィルターを通して遠心分離した。保持さ れていた放射能（アビジン−ビオチン−結合放射標識を示す）のパーセントを、 第１表に示した。かくして、化学的対抗量にＪ−リ、放射性金属は、巨大分子錯 体と結合して残存していた。 第１表 ９９“Ｔｃ−キレート−ビオチン複合体の化学的対抗型放射能保持％ 対抗媒体　ｐｉｆ　１時間、３７℃　１８時間、室温ＰＢＳ　７．２　９９　９ ９ リン酸塩　８．０　９７　９７ １０　ｍＭシスティン　８．０　９２　９５１０ｍＭＤＴＴ）△　８．０　９９ 　９８０２ト１炭酸塩　ＩＱ、０　９７　９４更に、夫々の放射標識化ビオチン 複合体を、約５０μｇ／ｍｌで血清と共にインキコベ−１・（ｉｎｃｕｂａｔｅ ）　Ｌ、インキュベーションが終了後、試料を８０％メタノール中で、簡易薄層 クロマトグラフィー（ＩＴＬｃ）を行った。原体（即ち、タンパク質と結合した もの）においては、２〜４％のみの放射能が保持されたが、このパーセントは、 外因性ビオチンの添加によっては影響されなかった。試料をサイズ除外＋１−＋ ２　ＦＰＬＣを使用して、０、２Ｍリン酸を移動相として分析した場合、血清の 巨大分子と放射能の結合は観察されなかった。 夫々の放射標識化ビオチン複合体を、更に、競合ビオチン結合分析法を用いて試 験をした。簡単に言えば、Ｄ−ビオチンと放射標識化ビオチン複合体の比率を変 えたものを含む溶液に、制限アビジンを一定の総ビオチン・アビジン比で結合さ せた。夫々の放射標識化ビオチン複合体のアビジン結合量をＩＴＬｃにより定量 し、それを理論的最大化学量論結合量（グリーン（Ｇ＋ｅｅ＋＋）により開示の Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、９４　：　２３ｃｍ２４ｃ。 １９６５によるＨＡＢ＾分光光度分析により定量した）と比較した。 アビジンの結合における重大な相違は、夫々の放射標識化ビオチン複合体とＤ− ビオチンの間には観察されなかった。 実施例■ 抗体予備標的化後に投与した放射標識化キレート−ビオチン複合体の生体内分析 実施例■の１８６Ｒｅ−キレート−ビオチン複合体を、３段階抗体予備標的化プ ロトコールの動物モデルで研究した。一般に、このプロトコールは、（ｉ）ビオ チン化モノクローナル抗体の予備局在化；　（ｉｉ）標的部位において「サンド ウィッチ」を形成し、残留循環ビオチン化抗体の除去のためのアビジンの投与； 及び（ｉ　ｉ　ｉ）標的部位への局在化及び速やかな血液性化のための１Ｒ６Ｒ ｅ−ビオチン複合体の投与を含んでいる。 Ａ、ビオチン化抗体の調製及び特徴付はビオチン化ＮＲ−ＬＵ−１０を、以下の 工程の何れかに従い調製した。第一の工程は、リシンε−アミノ基を介しての抗 体の誘導化を含んでいる。Ｎ１１−１．Ｉｔ−１［１は、クロラミンＴ及び１２ ５１または１３１１のヨウ化ナトリウムの何れかを用いてチロシン部位で放射ヨ ウ素化した。放射ヨウ素化抗体（５〜１０　ｍｇ／ｉｆ）を、次いで、下記の式 に従い、５％のＤＭＳＯを含有するｐｌ＋８．５の炭酸塩緩衝液中で、ビオチン アミドカプロエートＮｌｌ５エステルを用いてビオチン化した。 抗体免疫反応性に対するリシンビオチン化の影響を調べた。 ビオチン；アビジンのモル供与が５：１〜４ｏ：１に増大するに従い、ビオチン の導入は予想されたように増大した（ＩＩＡＢＡ分析及びプロナーゼ消化生成物 を用いて測定した）（下記第２表）。修飾されていない抗体と比較したビオチン 化抗体の免疫反応性のパーセントは、制限抗原ＥＬＩＳＡ法で査定した。 免疫反応性のパーセントは、１１．１：１で測定した誘導化は７０％以下に落ち ていたが、然しなから、この誘導化のレベルにおいて、抗体陽性細胞結合（１， Ｓ−１８０１１ｆｆｉ瘍細胞により抗原過剰で行った）においては、欠点は何も 観察されなかった。抗体を用いた引き続く実験においてはビオチンニアビジン比 がｊＯ：１で誘導化した。 第２表 免疫反応性についてのりシンビオチン化の効果モル供与　測定した誘導化　免疫 査定（％）（ビオチン／＾ｂ）　（ビオチン／＾ｂ）　ＥＬＩＳ＾　細胞結合５ ：ｌ　３．４　８６ １０：１　８．５　７３　１００ １３：Ｉ　１１．１　６９　１０２ ２０：Ｉ　１３．４　３６　１０６ ４０：１　２３．＋　２７ 一方、ＮＲ−ＬＵ−１０を、システィンの還元により発生したチオール基を用い てビオチン化した。チオール基の誘導合成は、抗体免疫活性を殆ど毀損しないと 仮定した。ＮＲ−ＬＵ−１Ｏは、ｐ−アリール錫フエニレートＮｌｌ５エステル （Ｉ’ｌｌ’−ＮＲ５）及び１２′１または１３１１のヨウ化ナトリウムの何れ かを用いて放射ヨウ素化した。放射ヨウ素化ｆ１１！−１ｔｌ−１［１は、２５ ｍＭジチオスレイトールでインキュベートし、サイズ除外クロマトグラフィーを 用いて精製した。還元抗体（遊離チオール基を含む）は、次いで、１０−から１ ００−倍モル過剰のＮ−ヨードアセチル−ｎ′−ビオチニルへキシレンジアミン と、５％（Ｖ／Ｖ　）のＤＭＳＯを含有する、ｐＨ７，５のリン酸塩緩衝塩（Ｐ ｌｕｓ　）中で反応させた。 第３表 免疫反応性についてのチオールビオチン化の効果モル供与　測定した誘導化　免 疫査定（％）５０１６．５　＋０２　１００ １００：１　６．　＋　９５　１００ 第３表に示したように、５０：１またはそれ以上のビオチン：アビジンのモル供 与では、抗体に対し、６個のビオチンのみが導入された。免疫活性に対する重大 な影響な何も観察されなかった。 リシン−及びチオール−誘導化ビオチン化抗体（夫々、「抗体（リシン）」及び 「抗体（チオール）」）を比較した。 サイズ除外ＦＰＬＣによる分子サイジングは、双方のビオチン化プロトコールが 単分子（モノマー性）１ｇＧを生ずることを示した。ビオチン化抗体（リシン） は、＋６０ｋＤの見掛は分子量を有していたが、ビオチン化抗体（チオール）は 、１８［１ｋＤの見掛は分子量を有していた。外因性スルフヒドリル（即ち、ジ スルフィド）のチオール基への還元、次いでビオチンによる複合化は、幾分法が った巨大分子を製造する。若しそうなら、抗体（チオール）は、より大きい流体 力学半径を示し、クロマトグラフィー分析により分子量の見掛けの増大を示した 。双方のビオチン化抗体種は、固定アビジン−アガロースに９８％の特異的結合 を示した。 ビオチン化抗体種の更なる比較を、４％濃縮用ゲル及び５％分解ゲルを使用する 、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥを使用して行った。 ビオチン化試料を放射標識化するか、または標識化せずに、そして放射標識化し たまたは標識化していないアビジン、またはストレプトアビジンと結合した。試 料は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に先立ち、煮沸はしなかった。陰性抗体及びビオチ ン化抗体（リジン）は、同様の泳動を示し；ビオチン化抗体（チオール）は５０ 〜７１１ｋＩ）の範囲の２つの種を製造した。それらの種は、２つのチオールで キャップした種を表わす。それらの５ＤＳ−ＰＡＧＥ条件下において、放射標識 化ストレプトアビジンは、６０ｋＤのテトラマーとして泳動する。４００１１ｇ ／ｍｌの放射標識化ストレプトアビジンは、５０μｇ／ｍ　ｌのビオチン化抗体 （生体内でのレノ゛ンドウィッチ化」条件と類似の）と結合し、双方の抗体種は より大きい分子量の錯体を形成した。然しなから、ビオチン化抗体（チオール） −ストレプトアビジン錯体のみか濃縮用ゲルから分解ゲル中に移動し７、ビオチ ン化抗体（リシン）−ストレプトアビジン錯体に比較して減少した分子量を示す 。 １３　、ビオチン化抗体種の血液浄化 放射ヨウ素化ビオチン化ＮＲ−ＬＵ−１０（リシンまたはチオール）は、非腫瘍 ヌードマウスに１００μｇの用量で静脈内に投与した。放射ヨウ素化ビオチー・ 化ＮＲ−ＬＵ−ＩＱの投与後２４時間において、マウスに生理食塩水または４０ ０μｇのアビジンの何れかを静脈内に注射した。生理食塩水の投与により、双方 のビオチン化抗体種の血液浄化は、二相性であり、修飾していないＮＲ−１，ｔ ｌ−１０抗体の浄化と同様であった。 ２４時間でアビジンを静脈内に受けた動物において、ビオチン化抗体（リジン） は、アビジン投与（アビジン、ビオチン＝ＩＯ：１）の１５分以内に（ｎ二人し た用量の５％のレベルにまて）浄化された。ビオチン化抗体（チオール）と共に 、アビジンの投与（１０：１または２５：ｌ）は、２時間後に、注入した用量の 約３５％の循環する抗体レベルにまで減少させた。アビジン投与後の循環系での 残留放射標識化抗体活性を、固定ビオチンを使用して生体外で試験をした。この 分析により、８５％のビオチン化抗体がアビジンと錯化していることが判った。 それらのデータは、形成されたビオチン化抗体（チオール）−アビジン錯体が、 ＲＥＳによって除去されるには不十分に架橋していることを示唆している。 ビオチン化抗体（リシン）のアビジンまたは食塩水投与後２時間の、血液浄化及 び生物学的分布の研究を行った。アビジンの投与は、血液中のビオチン化抗体の レベルを非常に減少させ（第１図参照）、そして肝臓及び肺臓中のビオチン化抗 体のレベルを増大させた。ビオチン化抗体の腎臓でのレベルも同様であった。 実施例■ ３段階予備標的プロトコールでのｌ　Ｒ６１ｉ　ｅ−キレート−ビオチン複合体 の生体内での特徴付は実施例１のＩ　Ｒ６１ｉ　ｅ−キレート−ビオチン複合体 （ＭＷＷ１８Ｏ４９゜特異的活性＝１〜２ｍＣ１／ｍｇ）を、動物モデルで３段 階予備標的プロトコールにおいて試験した。より具体的には、１８〜２２ｇの雌 ヌードマウスにＬ　Ｓ　−１８０ヒト結腸腫瘍穴種移植により皮下に移植し、移 植後１０日間以内で１００〜２ＱＯｍｇの腫瘍を生した。 ＮＲ−ＬＵ−１０抗体（ＭＷユ１５０ｋＤ　）を＋２Ｊ　／クロラミンＴで放射 標識化し、モしてリシン残基を介して（上記実施例１■、＾。 に記載したように）ビオチン化した。アビジン（Ｍｗ＝６６ｋＤ）を”’Ｉ　／ Ｐ！Ｐ−Ｎ）Ｉｓ　（上記実施例ＩＶ、Ａ、ニ記載シタヨうなＮＲ−ＬＵＵＯ３ 放射ヨウ素化のように）で放射標識化した。実験プロトコールは以下のとおりで ある。 第１群：　時間０．１００μｇの１２５１−標識化ビオチン化ＮＲ−ＬＵ利０を 注入 時間２４時間、４００７１．Ｈの１３１１−標識化アビジンを注入 時間２６時間、６０μｇのＬＲＪ！−キレートービオヂンを注入 第２訂二　時間０．４００μｇの１３１１−標識化アビジンを（調整）　注入 時間２時間、６０μｇの＋８６Ｒｅ−キレート−ビオチンを注入 第３群°　時間０，６０μｇの１８６Ｒｅ−キレートービオチ（調整）　ンを注 入 このプロトコールにおいて使用された３種の放射標識は、お互いの存在下におけ る検出が可能である。３種の要素の大きさは、対数的に異なっている一抗体１５ ０．０００　；アビジン６６．０００　：そしてビオチンＩ、［１００というこ とは注目すべきことである。生物学的分布の分析は　１１！ＩＪｅ−キレート− ビオチン複合体の投与後、２．６．２４．７２及び１２０時間で行なった。 ある予備的な実験を、３段階予備標的プロトコールにおいて＋８６Ｒｅ−キレー ト−ビオチン複合体の分析に先立って、動物モデルにおいて行った。第一に、ビ オチン化抗体の、アビジンの血液浄化における効果を試験した。それらの実験は 、アビジンの浄化の速度及び度合が、ビオチン化抗体の存在または不存在に係わ らず同様であることを示した。第二に、ビオチン化抗体及びアビジンの　１８６ Ｒ，−キレート−ビオチン複合体の血液浄化に対する効果を試験し；血液浄化は ビオチン化抗体及びアビジンの存在、または不存在に係わらず同様であった。更 に、抗体免疫反応性が、試験を行ったレベルで、ビオチン化によっては譲歩しな いことが見出された。 第三に、腫瘍での取り込みを、ビオチン化抗体を投与し、時間０ての、またはア ビジンを投与し２４時間で試験した。この実験の結果を第１図に示す。２５時間 目に、約３５０　ｐｍｏｌ／ｇのビオビオチン化抗体が腫瘍に存在し；３２時間 でそのレベルは約３（ｔＯｐ＋＋＋＋＋　１７ｇであり；４８時間では約２Ｈｐ ｓ＋ｏｌ／ｇ　Ｔ：あり；そして１２０時間では約１００１００ｐ／ｇであった 。同じ時間のポイントでのアビジンの取り込みは、夫々、約２５０　、１５０． ５０及びＯｐｍｏｌ／ｇであった。同一の実験から、腫瘍の血液に対する比が、 ビオチン化抗体及びアビジンについて定量された。３２時間から１００時間にお いて、腫瘍の血液に対する比は非常に類似していた。 アビジンとの錯化による血液からのビオチン化抗体の急速で効果的な除去が観察 された。アビジン投与の２時間以内において、血液プールの抗体濃度の１０倍の 減少が観察され（第１図）、腫瘍の血液に対する鋭い増加が見られた。アビジン は、急速に除去され、投与後１時間以内に注入された用量の９０％よりも多くが 血液から浄化された。Ｒｅ１８６−ビオチンキレートもまた、非常に急速に浄化 され、投与後１時間以内に注入された用量の９９％よりも多くが血液から浄化さ れた。 ３段階予備標的プロトコール（上記した第１群について）を次いで試験した。よ り具体的には、ビオチン化抗体及びアビジンの存在下または不存在下におけるｌ １１６Ｒｅ−キレートービオヂン腹合体の腫瘍での取り込みを定量した。ビオチ ン化抗体及びアビジンの不存在下においては、　＋　８６　Ｂ　ｅ−キレート− ビオチン複合体は注入後２時間で軽いピークを示し、それは約５時間でほぼ完全 に腫瘍から除去された。 それに対し、ビオチン化抗体及びアビジン（特異的）の存在下での注入後２時間 において、　Ｉ　８６　Ｒｅ−キレート−ビオチン複合体は、ビオチン化抗体及 びアビジンの不存在下において観察されたよりも約７倍多い腫瘍中でのピークに 到達した。 更に、特異的に結合したｌ８６Ｒ，−キレート−ビオチン複合体は、５０時間を 超えても、腫瘍において注目に値するレベルを維持していた。同一の実験におい て定量した腫瘍の血液に対する比は、総ての時間で非常に増加した（即ち、３０ 時間で、Ｔ−Ｂの比はユ８；１００時間でよ１５．１４０時間で＝３５）。 ＩＲＦＩＲ，−キレート−ビオチンキレートの腫瘍での取り込みが、投与したビ オチン化抗体の用量に依存することが更に示されている。θμｇのビオチン化抗 体において、約２００　ｐｍｏｌ／ｇのｌ８６Ｒ，−キレート−ビオチン複合体 が、投与後２時間で腫瘍に存在しており；５０Ｒｇの抗体で、約５０［ｌ　ｐｍ ｏｌ／ｇの１Ｒ６Ｒｅ−キレート−ビオチン複合体が；そして１００μｇの抗体 で、約１．３００　ｐｍｏｌ／ｇのＩＲＪ、−キレート−ビオチン複合体が存在 していた。 ３段階予備標的化プロトコールによるレニウムの腫瘍での取り込みを、抗体に共 有的に付着したキレートを介して放射標識化された抗体の同一のものの腫瘍での 取り込みと比較した（従来工程）。この比較の結果を第２図に示す。血液浄化及 び腫瘍の取り込みを、キレートに直接標識化したレニウム抗体複合体について及 び３段階予備標的化サンドウィッチについて比較した。曲線の下の面積（八〇〇 ）及びＡＵＣ，、、□。。 ／＾υＣｂｌａ、、ｄの比を定量した。キレートに直接標識化したレニウム抗体 複合体について、八〇Ｃ１５、。、／＾ＵＣ，，。。６の比は、２４０５５／＋ ０２３５即ち２．３５であり、３段階予備標的化サンドウィ’７チｌコツイテハ 、ＡＵＧｌ、、ｆｆｉ、、、／Ａｔ１Ｃｂ＋６＝ｙ　□）比は、４６７６４／６ ５５５即ち７．１３てあった。 腫瘍の取り込みの結果は、血液区画を放射能にさらした場合に最もよく、それは 骨髄にさらすことに直接関連する。３段階プロトコールにおいて１００倍より多 くのレニウムを動物に投与しているという事実にも拘らず、血液からの小さい分 子（Ｒｅ−１８６−ビオチン）の非常に速やかな除去は、この方法により与えら れるＲｅ−１１１６への暴露を最小にする。同一の適合した抗体の用量フォーマ ットにおいて、直接標識化（従来工程）シたＮＲ−Ｌｌｌ−１０全抗体は、３段 階プロトコールにおいて与えた１００倍高い用量よりも、レニウムに対するより 大きい暴露を生じた。標的比（放射能に対する腫瘍の暴露：放射能に対する血液 のａ露−ＡＵＣ，。６ｏ、　・ＡＵＣ，、。。、）における明らかな増大が、直 接標識化抗体アプローチ（約２．４：１．）と比較して、３段階予備標的法（約 ７・１）について観察された。 実施例■ 改良された生物学的分布性能を有するキレート−ビオチン複合体の調製 １１１１１−標識化−ビオチン誘導体の生物学的分布は、キレート及び複合基の 構造的変化により非常に変化する。同様の構造変化が、テクネシウムー及びレニ ウム−ビオチン複合体の生物学的分布に影響する。従って、正常組織からの最適 の浄化を有するテクネシウムー及びレニウム−ビオチン複合体を製造する方法は 有益である。 Ａ、中性ＭＡＭ＾キレート／複合体 中性ＭＡＭ＾キレート−ビオチン複合体を、以下の式に従い製造した。 り　ＭＡＭ＾リガンド 得られたキレート−ビオチン複合体は、優れた腎臓排出を示す。複合体の正味の 総”ＰＨ（＝４７は中性であるが、分子のポリカルボキシレートの性質は、親水 性と親油性の領域を生成する。 複合体内のカルボキンレート基の数及び性質を変えることにより、排出は腎臓か ら胃腸管ルートにシフトする。例えば、中性化合物は、一般に腎臓で除去され； アニオン性化合物は一般に６１システムを通して除去される。 Ｂ、ポリリシン誘導化 ポリリシンを含有する複合体は、また、有益な生物学的分布性能を示す。全抗体 により、ポリリシンによる誘導化は、複合体の生物学的分布を肝臓での取り込み をゆがめる。反対に、ポリリシンによるＦａｂフラグメントの誘導化は、肝臓及 び腎臓での双方の取り込みを低いレベルとし；それらの複合□体の血液浄化は、 キレートに共有結合したＦａｂのそれと同様である。例示のポリリシン誘導化キ レート−ビオチン複合体を以下に図示する。 放射金属−キレート−ビオチン複合体へのポリリシンの導入は、それ故、良好な 肝臓及び腎臓での複合体の除去を維持しながら、ＲＥＳキレート化合物形成を最 小にするか、または除去するのに有用である。腎臓の抽出性能を改良するために 、ポリリシン誘導体は、好ましくはヒオチン化に続いてサクシニル化される。ポ リリシン誘導体は＝　（１）放射金属−キレ−１−−ビオチン複合体の特異的活 性の増大：　（２）ポリリシン重合体の分子殴を変えることによる、血液浄化の 速度及びルートの制御の許容；及び（３）最適の腫瘍相方作用のための；（合体 の循環半減期の増大　という更なる利点を提供する。 ポリリジン誘導化は、標準的方法論により達成される。筒中に言えば、ポリーＬ −リジンは、標準的なアミノ基のアシル化工程（水性重炭酸塩緩衝液、ρ１１８ ．ビオチンー旧ＩＳエステル、次いてキレートＮｌｌ５エステルを添加）に従っ てアシル化される。代イつりの方法論には、ＤＭＳＯ及びトリエチルアミン中で ニトロフェニルエステルを使用する無水条件が含まれる。 １１られる複合体は、Ｕ７及びＮＭＲスペルトルで特徴付けられる。 ポリリシンに付着したビオチンの数は、１１＾ＢＡ分析により定徹される。分光 光度滴定を、アミノ基誘導化の度合いを調べるために使用する。放射金属−キレ ート−ビオチン複合体は、サイズ除外法により特徴付けられる。 Ｃ９開裂しうる結合 放射金属−キレ−１・−ビオチン複合体のキレート及びビオチン部分の間に開裂 可能なリンカ−を挿入することにより、正常組織と比較して腫瘍での複合体の保 持が増大される。より具体的には、正常組織には存在するが、腫瘍組織には、不 足しているか欠落している酵素により、開裂するリンカ−は、腫瘍の保持を増大 することができる。例として、腎臓は高レベルのγ−グルタミルトランスフエラ ービを有し；他の正常組織は、生体内において、γ−グルタミル前駆薬剤の開裂 を示す。これに対し、腫瘍は、一般に酵素ペプチダーゼが不足している。以下に 示したグルタミル−結合ビオチン複合体は、正常組織において開裂し、そして腫 瘍中においては保持される。 Ｄ、Ｏ−極性置換基とのセリンリンカ−Ｎ、Ｓキレートの糖置換は、そのような キレートを水溶性にする。生理的ｐ旧こおいて完全にイオン化しているスルホン 酸塩は、以下に示したキレート−ビオチン複合体の水溶性を改良する。 Ｒ−リボースまたはグルコース等の糖または５ｏ２０１１Ｘ＝　（Ｃ１１２）　 ｎまタハＣＯ（Ｃ１ｌ、　）　Ｊこの化合物は、標準反応工程に従い合成される 。簡単に言えば、ビオシチンを、Ｎ−ｆ−ＢＯＣ−（０−スルホネートまたはＯ −グルコース）セリンＮＨＳエステルと縮合して、Ｎ−１−ＢＯＣ−（０−スル ホネートまたは０−グルコース）セリンビオシチンアミドを与える。Ｎ−１−１ １０ｃ基のＴＦ八との引き続く開裂、及びＤＭＦ中のりガント旧ＩＳエステルと 、トリエチルアミンとの縮合は、リガンド−アミドセリン（０−スルホネートま たはＯ−グルコース）セリンビオシチンアミドを与える。 Ｉ’ｌｌ’−放射ヨウ素化ビオチンの調製及び特徴付はポリーＬ−リシンを過剰 のＮｌｌ５−ＬＣ−ビオチンにさらし、次いでＤＬｌＳＯ中でポルトン−ハンタ ーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにさらすことにより製造された放射ヨ ウ素化ビオチン誘導体が報告されている。精製後、この生成物は、ヨードケン法 （例えば、デル　ロザリオ外（Ｄｅｌ　Ｒｏｓａ＋ｉｏ　ｅｌ　ｉｆ、）、Ｊ、 　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、３２：５．１９９１年、９９３（要約）参照）により放 射ヨウ素化される。得られる放射ヨウ素化ビオチン誘導体の高い分子量のために 、生成物の限定された特徴付け（即ち、放射−１１Ｐ　Ｌ　Ｃ及び固定ストレプ トアビジンへの結合）のみが可能であった。 本発明による放射ヨウ素化ビオチンの調製は、成る利点を提供する。第一に、放 射ヨウ素ビオチン誘導体は、化学的特徴付けを全部揃えることが可能な低分子量 化合物である。第二に、調製のための開示された方法は、単一の工程を含み、そ して精製工程の必要性を除去できる。 簡単に言えば、ビオシチン（Ｒ＝　Ｃ００Ｈ）及びビオヂンアミドペンチルアミ ン（Ｒ＝　Ｈ）に対応するヨードベンズアミド誘導体は、以下の式に従い調製さ れた。この式において、ｒＸＪは、如何なる放射性ハロゲンであってもよく、　 １２５１．１３１１、　＋２１１１　、　２＋１ＡＬ等が含まれる。 Ｊの調製は、一般に、トリブチル錫中間体を使用して、ウィルバー（１４２（Ｗ ｉｌｂｕ＋　ｃｌ　ａｌ、）の文献１．Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、３０：　２１６−２ ６．１９８９に記載の方法に従う。上記した反応には水溶性カルボジイミドが使 用される。何故なら、Ｎｌｌ５エステル１は、ＣＣＵとの相互反応しうる混合物 を形成したからである。Ｎｌｌ５エステルは、クロマトグラフィーと互換性がな く；有機及び水性溶媒に不溶であり、そして、ＤＭＦ中または緩衝水性アトニト リル中で、ビオシチンと反応しない。１とビオシチンまたは５−（ビオチンアミ ド）ペンチルアミンの反応は、塩基に対し感受性かある。１とビオシチンまたは ペンチルアミンとの反応を、トリエチルアミンの存在下、熱いＤＭＳＯ中で行わ れ、−若しくはそれ以上のビオチン化生成物が形成される。一方、反応は、１及 びビオシチン（４ｍｇ／ｍｌ　）またはペンチルアミン（４ｍｇ／ｍｌ　）をＤ ＭＳＯ中、１１７℃で約５〜約１０分加熱した場合、極めて清浄で完全であった 。生成した１７５１−ビオチン誘導体は、９４％の放射化学的収率で得られた。 任意に、放射ヨウ素化生成物は、Ｃ−１８１１ＰＬＣ及び逆相親油性カラムを用 いて精製してもよい。以後、得られた放射ヨウ素化生成物２を、ＰＩＰ−ビオシ チン（Ｒ二Ｃ００Ｉ＋　）及びＰＨ’−ペンチルアミン（Ｒ＝Ｈ）という。　双 方のヨードビオチン誘導体２は、９５％以上の固定アビジンに対する結合性を示 した。生成物２のマウス血清とのインキュベーション（Ｉｎｃｕｂｘｔｉｏｎ） によっても、２の固定アビジンと結合する能力は、何ら失われなかった。雄Ｂ＾ ＬＢ／ｃマウス中ての２の生物学的分配の研究により、血液からの急速な除去が 示された（上記した１８６Ｒ，−キレート−ビオチン複合体と同様）。放射ヨー ドビオチン２は、　１８６Ｒｅ−キレートルピオチン複合体と比較して肝臓胆嚢 での排出が減少しており、ＩＦ１６Ｒｅ−キレート−ビオチン複合体と比較して 尿からの排出が増大していた。放射ヨードビチオン２の尿での代謝産物の分析は 、脱ヨウ素及びビオチンアミド結合の開裂そ示し；代謝産物は、固定アビジンと 全く結合していないことを示した。一方、　ｌｌ’１６Ｒｅ−キレート−ビオチ ン複合体の代謝産物は、不変のビオチン複合体として尿中に排泄されるように思 われる。２の腸での取り込みは１Ｆ１６Ｒ，−キレートービオヂン複合体のそれ の５０％未満である。２のそれらの生物学的分配性能は、放射性同位体の全身か らの浄化の増大を提供１７、予備標的プロトコールでの２の使用の利点を示す。 ”’Ｉ−１’ｌ＋’−ビオシチンを、腫瘍を有するマウスで、２段階予備標的工 程において調べた。簡単に場えば、雌ヌードマウスにＬＳ−１８０腫瘍細胞を皮 下注射し；７「１後、マウスには５０〜１００ｍｇの腫瘍異種移植片が見出され た。ｔ＝Ｑにおいて、マウスニ、Ｉ’ＩＰ−ＮＩＩＳ　（実施例ＩＶ、Ａ、参照 ）を用いて１２５１　テ標識した２００μｇのＮＲ−ＬＵ−１０−アビジン複合 体を注射した。 ｔ−３６時間において、マウスに４２μｇの＋３’　Ｉ−１’ｌＩ’−ビオシチ ンを与えた。データは、アビジン分子力たり、１．５　＋３Ｊ−ＰＩＰ−ビオシ チン分子に相当する、速やかで、特異的腫瘍局在化を示した。 記載した放射ハロゲン化ビオチン化合物は、　Ｉ　Ｒ６Ｒｅ−キレ−・トービオ チン複合体についての」二記実施例ｖ１に記載した、同じタイプの変性に従う。 特に、以下のＩ’ｌ＋’−ポリリシン−ビオチン分子は、　”’ｌＩ’ＩＰによ るポリリシンの微小量の標識化、次いでポリリシンの広範囲にわたるビオチン化 により製造される。 固定アビジンに対する＋２５１の結合の評価は、総ての放射ヨウ素化種もまた、 少なくとも当量のビオチンを含有することを確実にする。 実施例■ 内因性抗体スルフヒドリル基、または スルフヒドリル生成化合物を介しての ビオチン化抗体（チオール）の調製 酸る抗体は、内因性スルフヒドリル基の反応に有用である。 ビオチン化される抗体が内因性スルフヒドリル基を含有しているならば、そのよ うな抗体は、Ｎ−ヨードアセチル−ｎ′−ビオチニルヘキンレンジアミン（上記 実施例ＩＶ、Ａ　において記載したような）と反応する。−若しくはそれ以上の 内因性スルフヒドリル基の有用性は、ビオチン化抗体に対し他の不利益な効果を もち、ＤＴＴ等の還元剤に抗体をさらす必要性を除去できる。 一方、−若しくはそれ以上のスルフヒドリル基が、末端スルフヒドリル基を含む 化学化合物またはリンカ−の使用を介して標的部位に付着される。この目的のた めの例示化合物は、イミノヂオランである。内因性スルフヒドリル基（上記議論 （７た）により、抗体に対する還元剤の不利益な効果は、それにより避けられた 。 実施例　■ 内在化を誘発しない２段階予備標的化方法論ＮＲ−ＬＵ−１３−アビジン複合体 を、以下のようにして調製した。 最初に、アビジンをトスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ キサン−１−カルポキシレー１−　（ＳＭＣＣ）により誘導化した。ＳＭＣＣ− 誘導化アビジンは、次いで、ＮＲ−Ｌｔｌ−１３と共に、１１のモル比で、ｐｌ ＋８．５で１６時間、インキュベートした。未反応ＮＲ−Ｌｌｌ−１３及びＳＭ ＣＣ−誘導化アビジンを、混合物から分取し、サイズ除外＋１　Ｐ　Ｌ　Ｃを用 いて除去した。所望の１：Ｉ　ＮＲ−１，１１−１３−アビジン複合体を主要生 成物とし、不完全に特徴付けられた成分を微量生成物として、二つの複合体が製 造物として得られた。 ｏＱ　′Ｔｃ−キレートービオチンを、上記実施例１１のように調製した。ＮＲ −Ｌｔｌ−１３−アビジン複合体を受容体に投与し、循環系から浄化させた。放 射免疫シンチグラフィーの分野における当業者であれば、ＮＲ−ＬＵ−１３−ア ビジン複合体の腫瘍局在化及び循環系からの除去のための最適時間を決定するこ とは容易である。そのような時間において、９９ＭＴＣ−キレート−ビオチンが 受容体に投与される。″”Ｔｃ−キレート−ビオチン複合体が、１．０００の分 子量を有していることによって、ＮＲ−Ｌｔｌ−１３−アビジン分子の腫瘍細胞 表面での架橋を劇的に減少させ、または排除する。その結果、″”Ｔｃ診断薬は 、腫瘍細胞表面に、延長された期間の間保持される。従って、イメージ化技術に より診断薬の検出を最適化させ；更に、放射性同位体の低用量は、典型的な３段 階予備標的プロトコールから得られるものと同等のイメージを提供する。 任意に、循環系からのＮＲ−Ｌｔｌ−１３−アビジンの除去は、ビオチン親和性 カラムと組み合わせたプラズマフェレシス（血漿搬出法）により促進される。そ のようなカラムの使用により、循環するＮＲ−ＬＵ−１３−’アビジンは、肉体 外に保持され、そして受容体の免疫システムを巨大なタンパク質性免疫原（即ち 、アビジン）にさらすことが最小にされる。 本発明の実施において有用であるプラズマフェレシス／ツノラム精製についての 例示方法論は、米国特許第５．０７８．６７３号において、イメージ化につき、 及び腫瘍標的部位を処理するについて、放射標識化抗体力価を減少させることに 関して記載されている。簡単に言えば、本発明の目的のために、肉体外の浄化方 法論の例は、以下の工程を含む：リガンド（または抗リガンド）−標的成分複合 体を受容体に投与し； 標的部位に投与した複合体を局在化させるのに十分な時間の後、例えば、プラズ マフェレシスにより、受容体から血液を取り出し； 該血液から細胞要素を分離して血清留分を製造し、細胞要素を受容体に戻し；そ して 血清留分中の投与した複合体の力価を減少させて、精製血清を製造し； 精製した血清を受容体中に注入する。 ＮＲ−ＬＵ−１３−アビジンの浄化は、また、粒剤型清澄剤（例えば、複数のビ オチン分子が結合している重合体粒子）の投与により容易になる。そのような粒 状清澄剤は、好ましくは複数のビオチン分子が結合している生物分解性重合性担 体である。本発明の粒状清澄剤は、循環する投与された複合体と結合し、受容体 から複合体を除去する能力を示す。本発明のこの観点の粒状清澄剤は、この目的 に適合する如何なる形態であってもよい。好ましい粒状清澄剤は、−若しくはそ れ以上の以下の特性を示すニ ー微細粒状（例えば、約０．５ミクロン−約１００　ミクロンの粒径であり、よ り好ましくは約０．５　ミクロン−約２ミクロン）で、粉末構造の流動性をもた ない； −約３〜約１８０日間の間に、好ましくは約ｌθ〜約２１日間の間に生物分解す るように設計された生物分解性構造、または非生物分解性構造； 一受容体の、配布の過程中の生理、代謝及び清澄剤の排出との生体適合性、より 好ましくは生物分解性精製物との生体適合性； −及び、−若しくはそれ以上の結合成分（好ましくは、リガンド／抗リガンド対 の補体メンバー）を介しての受容体からのそれらの排出または除去を容易にする ための、−若しくはそれ以上の循環複合体と結合する能力。粒状清澄剤の総モル 結合能力は、選択された粒子径及びリガンドまたは抗リガンド置換比率に依存す る。結合成分は、個々に記載した共有または非共有形式により、粒状製剤形態の 表面構造と結合することが可能であり、先に投与した循環結合対メンバーと結合 するために近づき易いリガンドまたは抗リガンドを提供する。 本発明の好ましい粒状清澄剤は、生物分解性または非生物分解性の微細粒状物で ある。より具体的には、粒状清澄剤は、ランダム、非酵素的、加水分解による切 断により生物分解するマトリックスを含有する重合体で形成される。 α−ヒドロキシカルボン酸及び関連するラクトンの縮合から誘導される重合体は 、本発明において使用するのにより好ましい。特に好ましい成分は、熱可塑性ポ リエステル（例えば、ポリラクチドまたはポリグリコリド）の混合物、またはポ リ　（ラクチド−共−グリコリド）等のようなラクチドとグリコリド成分の共重 合体から形成される。例示構造として、ランダムポリ（ＤＬ−ラクチド−共−グ リコリド）を以下に示すが、Ｘ及びｙの値は、業界の実務者により所望の微細粒 状性能を達成するために取り扱うことができる。 本発明の粒状清澄剤を形成するのに適した池の試薬としてオルトカルボネート（ 米国特許第４．０９３．７０９号）等が挙げられる。　本発明のマトリックス粒 状物を含有する好ましい乳酸／グリコール酸重合体は、カウサー（Ｃｏｖｓａ＋ ）他による著書“ステロイドの抑制放出用ポリ（ラクチド−コバルト−グリコリ ド）マイクロカプセル“、酵素学方法　＋１２　：１０１１’１６，１９８５年 （ステロイドを微粒状体に取り込む）；エルドリッジ（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ）他に よる著書「毒性中和抗体のレベルを高めるブドウ球菌エンテロトキシンＢトキソ イドのアジュバントとしての生物分解性且つ生物両立性ポリ（ＤＬ−ラクチド− コバルト−グリコリド）ミクロ球体」、免疫及び感染、Ｕ：２９７８−２９８６ ．１９９１年（トキソイドの取り込み）；コーエン他（ｃｏｈｅｎ　ｅｌ　ａｌ 　）の著書「ポリ（乳酸／グリコール酸）ミクロ球体に基づく蛋白質の抑制放出 系」、薬学研究、Ｕ鮭ニア１３−７２０．１９９１年（酵素の取り込み）；及び サンダーズ他の（Ｓａｎｄｅｒｓ　ｅｌ　ａｌ　）著書「ポリ（Ｄ、　Ｌ−ラク チド−コバルト−グリコリド）ミクロ球体からの黄体化ホルモン−放出ホルモン 類似物の抑制放出」、文献Ｊ、薬学科学、７３（９）　：１２９４−１２９７． １９８４年（ペプチドの取り込み）に記載されているような、改質溶媒抽出工程 を構成する、乳剤系工程により調製される。 一般に、本発明の粒状清澄剤を形成する工程は、重合体をハロゲン化炭化水素溶 媒に溶解し、そしてハロゲン化炭化水素溶媒の溶剤として機能するが、重合体に 対してはそうではない添加剤を加えるものである。重合体は、重合体−ハロゲン 化炭化水素溶液から析出する。粒子の生成に続いて、それらは洗浄され、有機溶 媒で硬化される。室温、真空下での乾燥に先立ち、水洗及び水性ノニオン性界面 活性剤による洗浄工程が続く。 生物学的適合性の目的のために、粒状清澄剤は、包装、貯蔵または投与に先立ち 殺菌される。殺菌は、それについての便利な如何なる方法によっても行われる。 例えば、粒状物は、そのような放射線に対する暴露が、それに付着した結合成分 の構造または機能に逆の影響を与えない限り、γ線により照射される。若し、結 合成分が逆に影響される場合、粒状清澄剤は、殺菌条件下において製造される。 好ましいラクチド７／グリコリド構造は、哺乳動物の生理的環境において生物学 的に適合し得る。また、それらの好ましい持続した放出投与製剤は、その生物学 的分解により、共に哺乳動物の正常な代謝生成物である乳酸及びグリコール酸を 形成するという利点を有している。 結合成分−・粒状物結合に要求される官能基は、非分解性及び生物分解性重合体 単位と共に、粒状物構造中に任意に含まれる。この目的に利用できる官能基とし ては、カルボキシル基、アミン基、スルフヒドリル基等の、リガンドまたは抗リ ガンドと反応し得るものが含まれる。好ましい結合増大成分には、マトリックス 等を含む好ましい（ラクチド−グリコリド）重合体の末端カルボキシル基が挙げ られる。業界の実務者は、適当な官能基を選択すること及びそれらの官能基を含 む結合反応を監視することが可能である。 上記したタイプの粒状清澄剤を使用することにより得られた利点は、以下の通り であるニ ー「ミクロンＪサイズ領域の粒子がＲＥＳ及び肝臓中に局在化すると共に、この 可能性のためのガラクトース誘導化または電荷修飾増大法が有用で、そして、好 ましくは、浄化機能を行うに十分な時間、循環系に残存するように計画されるニ ー粒子のサイズは、中枢血管区分の保持を容易にし、抹消または血管外区分への 平衡を実質的に防止する。 −粒子に結合するリガンドまたは抗リガンドの所望の置換基が重合体構造に導入 可能である； −所望の性質（例えば、血清ビオチニダーゼ抵抗性、それにより粒子−ビオチン 清澄剤からのビオチン代謝産物の放出を減少する）リガンド−または抗リガンド −粒状物結合−循環する標的剤−リガントまたは一抗リガント複合体の最適の架 橋及び架橋種の効率的な除去を達成するために、複数のリガンドまたは抗リガン ドが粒子に結合できる。この利点は、貯蔵及び生体内での投与の際の粒子の凝集 を防止するための注意を払う際に、最もよく達成される。 ＮＲ−ＬＵ−１３−−アビジンの浄化もまた、動脈から導入したタンパク質性の または重合性のマルチループ装買により促進される。合成重合体またはビオチン により誘導されるタンパク質繊維の細い輪から成るカテーテル様装置を、主要動 脈（例えば、大腿動脈）中へＮＲ−ＬＵ−１３−アビジンを捕捉するために挿入 する。総血液容量が主要動脈を７０秒毎に通過するので、本来の場所の清浄装置 は、短時間内での循環するＮＲ−ＬＵ−１３−アビジンを減少するのに有効であ る。この装置は、ＮＲ−ＬＵ−１３−アビジンがＲＥＳにより処理されない；　 ＮＲ−Ｌｌｌ３−アビジンの除去が制御可能であり、測定可能である；そして結 合能力を減することなく最新の装置を必要に応じて挿入できるという利点を提供 する。この方法論は、また、本発明の動脈内投与の態様にイイ用である。 内在化を誘起することなく循環系からＮＲ−Ｌｌｌ−１３−アビジンを除去する ための、代わりの工程としては、リポソーム、ＩｇＭ及び腫瘍部位への速やかな 透過性から除外される大きさの他の分子等のビオチン化された、高分子量の分子 の投与が挙げられる。そのようなビオチン化された、高分子量の分子かＮＲ−Ｌ Ｕ−１３−アビジンと凝集した場合、凝集錯体はＩＩＥＳを介して循環系から容 易に除去される。 アビジン架橋を介しての治療剤の内在化の増大２乃至それ以上のビオチン分子（ またはキレート−ビオチン複合体）を架橋するための多価アビジンの能力は、治 療剤の配布を改良するために、有効に使用される。より具体的には、アビジンの 架橋は、標的細胞表面での架橋した錯体の内在化を誘起する。 ビオチン化ＮＲ−ＣＯ−０４（リシン）は、上記実施例１ｖ、＾５　に記載した 方法に従い調製した。ドキソルビシン−アビジン複合体を、標準結合化学により 調製した。ビオチン化ＮＲ−Ｃｏ−０４を受容体に投与し、そして循環系からの 浄化を行った。放射免疫治療の当業界の者は、ビオチン化ＮＲ−Ｃｏ−０４の腫 瘍への局在化及び循環系からの除去の最適時間を容易に決定することができる。 そのような時間において、ドキソルビシン−アビジン複合体を、受容体に投与す る。ドキソルビシン−アビジン複合体のアビジン部分は、ビオチン化ＮＲ−ＣＯ −０４とその表面で架橋し、錯体の内在化を誘起する。従って、ドキンルビシ： ／は、標的細胞により効率的に配布される。 第一の代替プロトコールにおいて、標準の３段階予備標的方法論は、腫瘍標的細 胞への薬剤の細胞内配布を増大するために使用される。上記記載の類似物により 、ビオチン化ＮＲ−ＣＯ−０５を投与し、次いでアビジン（血液浄化のため及び 標的細胞−結合ビオチン化抗体でサンドウィッチの中間層を形成するために）を 投与する。その後、短時間で、そして、ビオチン化ＮＲ−Ｃｏ−０５−アビジン 錯体の内在化に先立ち、メトトレキセート−ビオチン複合体を投与する。 第二の代替プロトコールにおいて、ビオチン化ＮＲ−Ｃｏ−０５を更に、メトト レキセートと共有結合させる。引き続くアビジンの投与は錯体の内在化を誘起し 、そして腫瘍標的細胞への薬剤の細胞内配布を増大する。 第三の代替プロトコールにおいて、ＮＲ−ＣＯ−０４−アビジンを受容体に投与 し、循環系から浄化させ、そして標的部位に局在化させる。その後、ポリビオチ ン化種（上記実施例ＩＶ、　Ｂ。 におけるような、ビオチン化ポリ＝し一リシン等の）を投与する。このプロトコ ールにおいて、配布されるべき薬剤は、抗体−アビジン成分またはポリビオチン 化種の何れかに共有結合していてもよい。ポリビオチン化種は、（薬剤）−抗体 −アビジン−ポリビオチン−（薬剤）錯体の内在化を誘起する。 実施例ｘ１ 生体内での２段階予備標的化のための 標的成分−抗リガント複合体 ３１ｍｇ　（０，４８μｓｏｌ　）のストレプトアビジンを９．０１のＰＢＳに 溶解して、３．５ｍｇ／ｍｌの最終溶液を調製した。溶液のｐＨを、ｐＨ８，５ の０．５Ｍ硼酸塩緩衝液を０．９ｍｌ加えることにより８．５に調整した。ＳＭ ＣＣ（３，５ｍｇ／ｍｌ）のＤＭＳＯ溶液を調製し、この溶液４７７μ＋（４， ８μｍｏｌ　）を渦動するタンパク質溶液に滴下した。３０分間の攪拌後、溶液 をＧ−２５にュージャージー州、ビスカットウェイのファーマシア社（１’ｈ＠ ＋ｍｔｃｉｌ、　Ｐｉｓｃｚｌｚｖ８マ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ７）の製品１’Ｄ −１０）カラムクロマトグラフィーにより精製し、未反応のまたは加水分解した ＳＭＣＣを除去した。 精製したＳＭＣＣ−誘導ストレプトアビジンを単離した（２８ｍｇ。 ！、６７ＩＩ１ｇ／ｆｆ１ｌ　）。 Ｂ、ＤＴＴ−還元ＮＲ−Ｌυ−１０の調製、　１５．０ｍ１ＰＢＳ中の７７ｍｇ 　ＮＲ−ＬＵ−１０（０，４２μｓｏｌ　）に、９１１１１．５の０．５Ｍ硼酸 塩緩衝液１．５ｍｌを加えた。ＤＴＴ溶液４００ｍｇ／ｍｌ　（１６５１１１） を、このタンパク質溶液に加えた。室温で３０分間攪拌した後、還元した抗体を ６−２５サイズ除外クロマトグラフイーにより精製した。精製したＤＴＴ−還元 ＮＲ−ＬＵ−１０を得た（７４ｍｇ、　２．１７ｍｇ／ｍｌ　）。 ４４．５ｍＩ　ＰＢＳで希釈した。ＳＭＣＣ−ストレプトアビジン（２８ｍｇ。 １７ｍ１．０．４２μｓｏｌ　）を、ＮＲ−ＬＵ−１０の攪拌する溶液に速やか に添加した。反応混合物中の総タンパク質濃度は、１．　Ｏｍｇ／ｍｌてあった 。反応の進行は、ｕｐｃ＋、　（（登録商標Ｚｏ＋ｂａｘ■が付されたＧＦ−２ ５０）　マツクモラド社（ＭａｃＭｏｄ）から市販）により監視した。約４５分 後、最終濃度が５ｍＭとなるように固体チオン酸ナトリウムを添加することによ り、反応を停止した。 Ｄ、　複合体の精製、小規模の反応のために、−置換複合体を、前記ｔｌＰｌ、 Ｃ（ｚｏ＋ｂａｘ）　Ｃ分取）サイズ除外クロマトグラフィーを用いて得た。所 望の一置換複合体精製物は、１４．０−１４５分（３，０ｍｌ／ｍｉｎ流速）で 溶出し、それに対し未反応ＮＲ−Ｌｔｌ−１ｏは１４．５−１５分で溶出し、ま た、未反応誘導ストレプトアビジンは＋９−２０分て溶出した。 大きな規模の結合反応のために、−置換付加物は、ＤＥＡＥイオン交換クロマト グラフィーを用いて単離可能である。粗結合混合物を濃縮した後、遊離のストレ プトアビジンを、ｐＨ８，６の硼酸ナトリウム緩衝液中２．５％キシリトールで カラムを溶出することにより、混合物から除去した。結合した未反応抗体及び所 望の複合体を、次いで、水酸化ナトリウムによりｐ）１８．６に調整した２０ｍ Ｍジェタノールアミン中、増大する塩の勾配を用いてカラムから連続的に溶出し た。 Ｅ、　複合体の特徴付け。 １、小規模の精製に関して上記したＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃサイズ除外を行った。 ２、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、非変性条件下で５％ポリアクリルアミドゲルを使 用して行った。評価すべき複合体は、ＳＤＳを含有する試料緩衝液中において、 ストレプトアビジンがその１５ＫＤのサブユニットに解離するのを避けるために 煮沸しなかった。二つの生成物のバンドが、ゲル上に観察され、それらは一また は二置換複合体に相当する。 ３、免疫反応性を、例えば、競合的結合ＥＬＩＳ＾により遊離の抗体と比較して 評価した。得られた値は、遊離の抗体のそれの１０％以内であった。 ４、ビオチン結合能力を、例えば、既知量の複合体をｐ−［＋−＋２５］　ヨー ドベンゾイルビオシチンで滴定することにより評価した。ビオチン結合部位の飽 和が、標識化ビオシチンの４当量の添加により観察された。 ５、生体内での研究は、反応生成物を特徴付けるのに有用であり、その研究には 、例えば、血清浄化プロフィール、複合体の標的抗原−陽性腫瘍に対する能力、 時間による複合体の腫瘍保持時間、及び腫瘍でのビオチン化分子のストレプトア ビジン複合体へ結合する能力が含まれる。それらのデータは、合成が、血液浄化 性能が天然のＮＲ−ＬＵ−１０全抗体と同様で、且つ腫瘍の取り込み及び保持性 能が、少なくとも天然のＮＲ−ＬＵ−１０と同等であることを示す１：１のスト レプトアビジン−ＮＲ−ＬＵ−１０全抗体複合体の形成を引き起こすことの測定 を容易にする。 例えば、第３図は、天然のＮＲ−ＬＵ−ＩＯ全抗体の対照プロフィールと比較し たＮＲ−１，Ｕ−１０−ストレプトアビジン複合体（ＬＵ−１Ｏ−３ｌｔ＾マ） の腫瘍取り込みプロフィールを示す。 ＬＵ−１ｎ−３ｌｒ＾マは、ストレプトアビジン成分のみに放射標識化されたも ので、ＬＵ−１０−８ｔｔ＾マが、ＮＲ−１，１１−１０全抗体それ自身と同じ くらい効率的に標的細胞に局在化する明らかな証拠を与生体内での２段階予備標 的化 実施例Ｉ　（ＭＩＡ’＝　１０００　；特異的活性＝　１　２　ｍＣｉ／ｍｇ） の１１１６Ｒｅ−キレート−ビオチン複合体（Ｒｅ−ＢＴ　）及び上記実施例Ｖ ｌ＋で議論したようなビオチン−ヨウ素−１３１低分子、Ｉ’ＩＰ−ビオシチン （ＰＩＰ−［ＩＴＳＭＷ約６０２に等しい；特異的活性＝０、５−１．０　ｍｃ ｉ／ｍｇ）を、上記実施例Ｖにおいて記載したように、動物モデルにより、３段 階予備標的プロトコールで試験した。 Ｒｅ−ＢＴと同じように、ＰＩＦ−ＢＴは、アビジンとよく結合する能力を有し ており、血清半減期が約５分で、速やかに血液から除去される。同等の結果が、 ここで記載した２段階予備標的実験において双方の分子について観察された。 ＮＲ−１，０−＋０抗体（ｌｌｌＷユ＋５０　ｋＤ）をストレプトアビジン（Ｍ Ｗ＝６６　ｋＤ　）と結合しく上記実施例ｘ１において記載したように）、＋２ ”Ｉ／ＰＩＰ−ＮＩＩＳ　（上記実施例ＩＶ、Ａ、　＋、：、おけルＮＲ−Ｌｌ ｌ−１０（７）放射性ヨウ素化について記載したように）で放射標識化した。実 験プロトコールは以下の通りである。 時間０２００μｇ　ＮＲ−ＬＵ−ＩＱ−３ｌｒ＾マ複合体を（静脈内に）注入； 時間２４−４８時間　６０−７［１倍モル過剰の放射標識化ビオチン化分子を（ 静脈内に）注入； そして生物学的分配を、放射性ビオチン化分子の注入後、２゜６．２４．７２． １２０時間で行った。 ＮＲ−ＬＵ−１０−ストレプトアビジンは、ｌ、Ｓ−１８０動物モデルにおける 血液浄化及び腫瘍取り込みの非常に一致した。＜ターンを示した。代表的なプロ フィールを第４図に示す。ＬＵ−ＩＱ−５ｌ＋＾マ複合体を標的細胞部位に少な くとも２４時間局在化させた後に、Ｉ’ＩＰ−ＢＴまたはＲｅ−ＢＴの何れかを 投与した場合、治療放射性核種の腫瘍での取り込みは、絶対量及び速やかさの何 れにおいても高い。Ｌｌｌ−１０−ＳＩ＋＾マ　（１−１２５）の投与に引き続 いて３７時間で投与したＩ’ｌＩ’−ＢＴについて、腫瘍の取り込みは４０時間 の時点で約５００　ｐＭＯｌ、／Ｇを超えており、ＬＵ−１０−Ｓｌｒ＾マの投 与後、４５時間て約７００　ｐＭＯＬ／Ｇのピークに達した。 抗体標識成分と共通点がある化学量論量での低分子治療剤の、腫瘍へのこの殆ん ど瞬間の取り込みは、治療放射性核種の、その最も高い特異的活性の利用を容易 にする。また、ＬＵ−１０−３ｔｒ＾マ複合体に結合していない放射性核種の速 やかな除去は、直接標識化した抗体複合体で観察されるゆっくりとした腫瘍増殖 相を除去することにより標的比（腫瘍：血液）を増大させる。放射性核種の腫瘍 での保持のパターンは、全抗体のそれであり、それは非常に安定したものである 。 ２段階予備標的アプローチ及び放射標識化ビオチン化分子の連続的に低いモル容 量を用いた実験もまた行った。約２０％Ｉ　Ｄ／Ｇの取り込み値が、担体を添加 していない（高特異的活性）用量の放射ｖｒ４識化ビオチン化分子で達成された 。飽和用量未満において、循環するｌ、１ｌ−１０−５ｉ「＾マが、血液画分中 で投与された放射標識化ビオヂン化分子と、かなりの量で結合することが確認さ れた。 実施例Ｘ１１１ アジアロオロソムコイド清澄剤及び２段階予備標的標的比（腫瘍　血液）を最大 にするために、標的部位でのそのリガンドと結合する能力を損なわずに、標的成 分−抗リガント複合体（例えば、しり−１０−５ｌ＋Ａｖ　）の血液溜りを清浄 にすることが可能な清澄剤を探査した。一つのそのような試薬である、循環する ＬＵ−１０−３Ｉ＋ＡＶと結合するための、アビジン−ビオチン相互作用を用い るビオチン化アシアロオロソムコイドについて試験した。 Ａ、オロソムコイドの誘導化、ｌ０ｍｇのヒトオロソムコイド（Ｓｉｇｍａ　Ｎ −９８８５）を、１６０ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ５，５の０．１Ｍ酢酸ナ トリウム緩衝液３．５ｍｌに溶解した。７０μｍの２％（ｗ／ｖ　）　ＣａＣｌ 脱イオン（［１，１，）水溶液を加え、そして１１μｍノノイラミニダーゼ（Ｓ ｉｇｍａ　Ｎ−７１１８５）　４．６０／ｍｌを加えた。混合物を３７℃で２時 間インキュベートし、全試料を登録商標Ｃｅｎ１＋１ｃｏｎ−１ｎ■の付された 限外濾過装置（マサチューセッツ州、ダンバーズのアミコン（＾ｍ１ｃｏｎ）社 から市販）で２容量のＰＢＳで交換した。アシアロオロソムコイド及びオロソム コイド原料を、上記実施例１■において記載したように、ｌ’ＩＰ技術を用いて ｌ−１２５により放射標識化した。 ２種の放射標識化製剤を、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０−２５ｇ）に静脈注射し 、各群３匹のマウスにより、５．ｌ０１１５及び３０分の時点で、並びに投与後 、１．２及び４時間の時点で、血液浄化を、連続レトロ−オービタル眼採血によ り評価した。この実験の結果は、第５図に示したように、アシアロオロソムコイ ドの浄化は、そのオロソムコイド相対物よりもより速やかであった。 更に、夫々の化合物を受容した２匹の動物を投与後５分で層殺し、制限生物学的 分配を行った。それらの結果を第６図に示す。それらのデータの最も驚くべき点 は、他の組織とは反対に、血液レベルの相違（オロソムコイドについては７８％ 、そしてアシアロオロソムコイドについては０．４％）及び肝臓（８６％）にお けるアシアロオロソムコイドの取り込みの特異緩衝液を２ｍｇ　（１，００ｍ１ 　ＰＢＳ中）のＰＩＦ−１２５−標識化オロソムコイド及び２ｍｇのＰＩＦ−１ ２５−標識化アシアロオロソムコイドに加えた。６０μｍの旧ＩＳ−アミノカプ ロエートビオチン１．８５ｍｇ／ｌのＤＭＳＯ溶液を、次いて夫々の化合物に加 えた。反応混合物を攪拌し、室温で４５分間放置した。物質をサイズ除外カラム クロマトグラフィー（前述のＰＤ−１０ＳＰｈｕｍａｃｉａ社）により精製し、 　ＰＢＳで溶出した。１．２ｍｌの留分を取り出し、画分４及び５に適用した放 射能の大部分（〉９５％）が含有されていた。ストレプトアビジン−アガロース ビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｓ−１６３８）または−ペレットをＰＢＳで洗浄し、２０ μｍの夫々のビオチン化放射標識化タンパク質を４Ｈμｍのビーズ及び４（１（ １μｍのＰＢＳに加え、２０秒攪拌し、１４．０００＋ｐｍで５分間遠心分離し た。 上澄みを除去し、ペレットを４００μｍのＰＢＳで洗浄した。この洗浄工程を２ 回以上繰り返し、合わせた上澄みを線量計中において、それらの夫々のペレット に対比して、それらを載置して分析した。値を以下の第４表に示す。 第４表 化合物　上澄み　ペレット オロソムコイド　９０％　１０％ ビオチンーシーソ　７．７％　９２８％アシアロオロソムコイド　９２％　８． ０％ビオチン−アシアロ　１０％　９０％ Ｃ６生体内でのタンパク質−ストレプトアビジン結合。 オチシーアシアロオロソムコイドの、生体内における循環するＬＵ−１０−３ｉ ｔ＾マ複合体と結合し、血液中からそれを取り除く能力について測定した。雌Ｂ ＡＬＢ／ｃマウス（２０−２５ｇ）に２００μｇのＬｕ−１（１−ｓｌｌ＾マ複 合体を静脈注射した。清澄剤（２００μｇ　ＰＢＳ−第１０；　４００μｇ非ビ オチン化７’ｚ７ｏオロソムコイドー第２群、４００μｇビオチン化アシアロオ ロソムコイドー第３群；及び２００μｇビオチン化アジアロオロソムコイドー第 ４群）を、複合体の投与後２５時間で投与した。 第５の群は、ビオチンの注射前に飽和された月Ｐ刊刊３ｌ−Ｌｏ−１０−３口＾ Ｖ　複合体を受容したー第５￥１．．　４００μｇの用量は、最初のＬｕ−１Ｏ −５ｌｒＡｙ複合体の用量よりも清澄剤力月０：１のモル過剰を構成し、２００ μｇの用量は、５：１のモル過剰を構成する。飽和ＰＩＦ−１−１３１−Ｌｕ− １０−Ｓｌ山複合体は、１０倍モ／［、過剰のＤ−ビオチンを２ｍｇのＬｕ−１ ０−５ｌｒＡｙに加え、次いで、Ｇ−２５ＰＤ−１０カラムによりサイズ除外精 製を行うことにより製造した。 夫々の群からの３匹のマウスを、上記したように、０．１？、１．４及び２５時 間で（清澄剤の注射前）、並びに２７．２８．４７．７０及び９０時間の時点で 連続的に採血した。夫々の群から更に２匹の動物を、清澄剤の投与後２時間で層 殺し、制限生物学的分配を行った。 血液浄化のデータを第７図に示す。それらのデータは、第３及び４群における循 環するＬｕ−１０−３ｌｒＡｙ放射能が、対照の第１，２及び５ｆｆ￥により得 られた値と比較して、急速にぞしてかなり減少することを示している。対照と比 較した場合、循環する抗体−ストレブトアビン複合体の絶対減少量は、約７５％ であった。 生物学的分配データを第８図に表の形式で記載した。生物学的分配データは、第 ３及び４群についての複合体のレベルが、肝臓、腎臓及び腸を除く総ての組織に おいて減少することを示しており、それはビオチン化アシアロオロソムコイドで 錯化した後の複合体と結合した放射標識の処理及び排泄と一致している。 更に、残留する循環複合体は、心穿刺（血清＋ＰＢＳ中で行った分析による）に よる血清試料から得られ、血清中に残存する機能性ストレプトアビジンの指示薬 である、ビオチン（アガロースビーズ上に固定されたビオチン）と結合する能力 について分析した。第１群動物血清は、複合体放射標識の約８０％が固定ビオチ ンと結合したことを示した。残留する循環放射標識値を、固定ビオチン（残存す る機能性複合体の量）に結合できる残存パーセントにより、残存する注射した用 量（清澄剤の投与後２時間）のパーセントを増幅することにより較正すると、第 ９図に示したようなグラフとなる。 ２００μｇのビオチン化アシアロオロソムコイドの投与は、血清中でビオチン結 合能力の５０倍の減少を示し、腫瘍化した動物の予備実験において、腫瘍からの 予備局在化されたＬｕ−１０−５ｌｒ＾マ複合体表の架橋及びその除去も示さな かった。標的細胞部位でのビオチン結合能力を減少させずに循環する標的成分− 抗リガントの除去は、投与した標的成分−抗リガントの量の増大により引き起こ される腫瘍に対する放射性用量の増大と結びついて、従来の放射免疫治療を用い て現在達成されていることと比較して、腫瘍への絶対放射用量の増大及び非腫瘍 細胞への毒性の減少の両者を与える。 引き続く実験は、アジアロオロソムコイドービオチンの低用量を評価するために 実施ｊ−た。同一の動物モデルにおいて、Ｌｔｌ−１０−Ｓｌ＋＾マ複合体の投 与に引き続いて２４時間後に、５０．２０及びｌ０１１ｇの用量のアシアロオロ ソムコイドービオチンを注射した。連続的に採血した動物からのデータを第１０ 図に示し、清澄剤投与後、２時間で層殺した動物からのデータを第１１Δ図（血 液浄化）及び１１１３図（血清ビオチン結合）に夫々示す。 ５０及び２０μｇの用はのアジアロオロソムコイドービオチンは、循環する１劃 −１０−Ｓｉｒ＾マ複合体レベルを約６５％（第１１Ａ図）まで効果的に減少さ せ、そして固定ビオチンに対する結合についての較正後には、ビオチン結合能力 を有するものが循環系内に注射用量の３％のみ残存しているのに対し、対照動物 （第１１Ｂ図）では注射用量の約２５％であった。たとえ低用量（循環するＬｕ −１０−３ｌ＋Ａｖ複合体と１・１の化学量論比に近づく程度の）であっても、 アシアロオロソムコイドービオチンは、ビオチン−アビジン相互作用に左右され る生体内での錯化により、循環するストレプトアビジン含有複合体の血液レベル を減少させるのに極めて効果的である。 腫瘍中のストレプトアビジン抗リガンドＬＳ−１８０ヒト結腸癌異種移植片を皮 下に移植した一群の雌ヌードマウスを、無作為に４匹／タイムポイントにグルー プ分けした。マウスに、２００ｇｇの１　：　１ｍｏｌ／ｍｏｌのストレプトア ビジン（ＭＡＲ−ＳＴＲＩ’Ｔ　）と共有結合したＮＲ−Ｌｔｌ−ＩＱモノクロ ーナル抗体を、上記実施例ｘ１に記載したようにして形成した複合体と共に注射 した。 複合体のストｌノブトアビジン部分は、上記実施例＋Ｖにおいて記載したように 、バラヨードフェニル（Ｉ’ｌ＋’　）　ｌ−１２５で放射標識化した。マウス の群を複合体注射後、２６．３０．４８．９６及び１４４時間で層殺した。組織 を分離し、秤量し、ヨウ素放射性核種の量を、それについての従来の工程を用い て計数した。 第二のＬＳ−＋８０異種移植片を移植した一群の雌ヌードマウスを、無作為に４ 匹／タイムポイントにグループ分けした。それらのマウスに、上記実施例１■に おいて記載したように、バラヨードフェニル（ＰＩＦ　）　ｌ−１３１（ＭＡＤ 　）で放射標識化した５０μｇのＮＲ−ＬＵ−１０モノクローナル抗体を静脈注 射した。マウスを放射標識化モノクローナル抗体注射後、４．２４．４８．１２ ８及び１６８時間で層殺した。組織を分離し、秤量し、ヨウ素放射性核種の量を 、それについての従来の工程を用いて旧敵した。 記載した夫々のデータについて、注射した用量の放射能基準もまた旧敵し、デー タは、組織のダラム当たりの総注射用量のパーセントに修正した。第１２図は、 時間による、ＬＳ−１８０腫瘍中のＮ１１−Ｌｔｌ−１０−ストレプトアビジン −ＰＩＦ−１−１２５及びＮＲ−ＬＵ−１０−Ｉ’ＩＰ−１−１３１の注射用量 ／グラムのパーセントを示す。 ＮＲ−ＬＵ−１０−ストレプトアビジン複合体は、ＮＲ−ＬＵ−１０単独に比較 して、高い腫瘍での取り込み及び長い保持時間を示した。 実施例ｔＶ 肝臓中のストレプトアビジン抗リガンド上記で議論したＬＳ−ＩＨ腫瘍細胞で異 種移植した雌ヌードマウスを、無作為に４匹／′タイムポイントにグループ分け した。 マウスに、３０μｇのストレプトアビジンに結合するビオチン−ストレプトアビ ジンを介して非共有的に結合（錯体を形成するために）した５０μｇのビオチン 化ＮＲ−ＬＵ−１０モノクローナル抗体を静脈注射した。生体内での錯化に先立 ち、錯体の抗体部分をクロラミンＴを用いてｌ−１２５で放射標識化し、ストレ プトアビジン部位は、バラヨードフェニル（Ｉ’ｌｌ’　）　ｌ−１１−１３１ （）で放射標識化し、両者の標識化工程は上記したようにして行った。マウスを 複合体注射後、４．２４．４８．９６及び１４４時間で層殺した。組織を分離し 、秤量し、夫々のヨウ素放射性核種の量を、それについての従来の工程を用いて 旧敵した。 夫々の錯体成分の注射した用量の放射能基準もまた計数し、データは、組織のダ ラム当たりの総注射用量のパーセントに修正した。第１３図は、時間による、肝 臓中のストレプトアビジン−ＰＩＦ−１−１３１（ＳＴＲＥＰＴ）及びＮ　Ｒ− １，ＵＮ０−ビオチン−クロラミンＴ−ＰＩＦ−１−１２５（ＭＡＲ−ＢＴ）の ダラム当たりの注射用量のパーセントを示す。 錯体は肝臓に単分子として局在化したが；然しなから、個々の成分の肝臓中での 処理は異なっていた。ｌ−１３１−ストレプトアビジン標識は、肝臓中での延長 された滞留を示したが、モノクローナル抗体標識（＋−１２５）は速やかに失わ れた。 他の肝臓での研究において、上記で議論したＬＳ−１８０腫瘍細胞で異種移植し た雌ヌードマウスに、上記実施例ｘ１に記載したようにして形成した２００ｇｇ の１　：　ｌ　ｍｏｌ／ｍｏｌのストレプトアビジンと共有結合したＮＲ−ＬＵ −１０モノクローナル抗体を注射した。複合体の抗体部分は、バラヨードフェニ ル（ＰＩＦ−＋１２５）で放射標識化した。２４時間後、マウスに０．５μｇの バラヨードフェニル（ＰＩＦ　ｌ−１３１”）ビオシチンを注射した。マウスを 複合体注射後、２８．４８、＋２０及び１６８時間で層殺した。 組織を分離し、秤量し、ヨウ素放射性核種の量を、それにっいての従来の工程を 用いて計数した。 夫々の錯体成分の注射した用量の放射能基準もまた計数し、データは、組織のダ ラム当たりの総注射用量のパーセント（％ＩＱ／Ｇ　）に修正した。第１４図は 、時間による、肝臓中のストレプトアビジン−モノクローナル抗体−ｐＨ’−１ −１２５（ＳＴＲＥＰ−ＭＡＩＩ−１−１２５）及びビオシチン−ＰＩＦ−１− １３１（訂−１−１３１）のダラム当たりの注射用暇のパーセントを示す。ビオ シチン−１’ＩＰ−１−１３１を連続的に投与した場合、肝臓中で、同一成分に 抗体結合標識（＋−１２５’）　した保持に対して、ストレプトアビジン結合ビ オチン放射標識（＋−１３１）の保持は、延長された。 実施例ＸＶ＋ ｐＨ’−ビオシチンの腫瘍取り込み 上記実施例Ｖｌ＋で調製及び記載したようにして、ＰＩＰ−ビオシチンを、生体 内でのその宿命を決定するために試験をした。 以下のデータは、実施例ｘ１において議論したように、時間０で２００ｕ１の１ −１２５標識化Ｎ１１−１．Ｕ−１０−ストレプトアビジン複合体（９５０ｐｍ ｏｌ）を受けた腫瘍化ヌードマウス（研究の７目前にｌ００ｍｇのＬＳ−１８０ 腫瘍異種移植片を皮下に移植した）による実験に基づくものである。２４時間の 時点で、マウスは、ＰＩＦ−１−１：ＩＩ−ビオシチン（４０μＣ１）及び４’ ｔｔｔ　ｇ　（６９，７６７ｐｍｏｌ）、２１μｇ　（３４，８８４ｐｍｏ１） 、５．７μｇ（９４６８ｐｍｏｌ）　、’２．８！Ｂｚｇ（４７３４ｐｍｏｌ） または０−５ｕｌ　（８３０ｐｍｏｌ　）の用量に相当する低温担体ＰＩＰ−１ −１２７ビオシチンのある量を静脈注射により受容した。腫瘍は、ＰＩＰ−ビオ シチン注射後、４時間の放射能について切り取り、計数し、腫瘍取り込みデータ を第１５Ａ図（％ｌ　Ｄ／Ｇ対用量）及び１５Ｂ図（ｐＭＯＬ／Ｇ対用量）に示 した。 ３種の最も高い用量は、約６（１（ｌｐｆｆｌｏｌ／ｇのＰＩＰ−ビオシチン腫 瘍局在化を生じた。２種の最も高い用量を受容した組織について行った組織学は 、腫瘍結合ストレプトアビジンの飽和が達成されたことを示した。５．７μｇ用 量（第１５Ｂ図）で観察された相当する腫瘍局在化は、ストレプトアビジンの飽 和もまた示している。それに対し、２種の最も低い用量は、相当するＮＲ−ＬＵ −１０−ストレプトアビジン複合体（総ての群における腫瘍は、複合体に対し平 均約４０％Ｉ　Ｄ／Ｇである）の局在化にもかかわらず、ＰＩＦ−ビオシチンの 低い絶対腫瘍局在化を示した。 最も低い用量の群（０，５μｇ）は、Ｉ’ＩＰ−１−１３１−ビオシチンの高い 効率での腫瘍への配布を示し、その効率は、第１６Ａ図に示したように、時間に より増大した。８５．０％Ｉ　Ｄ／Ｇの最も高い取り込みは、１２０時間の時点 （１’ＩＰ−ビオシチン投与後、９６時間）で観察された。また、％ＩＤ表示に よるＰＩＦ−ビオシチンの絶対量は、腫瘍内において、試料を採取した総ての時 点において連続的に増大した（第１６Ｂ図）。１６８時間の時点での％ＩＤ／Ｇ 基準（第１６Δ図）での取り込みの減少は、１２０及び１６８時間の時点の間の 腫瘍のかなりの成長ｉ已起因する。 更に、第１７Ａ図は、ＮＲ−ＬＵ−１０−ストレプトアビジン複合体（ＬＵ−１ ０−５ｌ＋Ａｖ　）及び続いて投与したｌ’ＩＰ−ビオシチンが時間を超えて同 時に腫瘍に共に局側化することを示す。ＰＩＦ−ビオシチンによる腫瘍での放射 能の局在化は、抗体−ストレプトアビジン複合体（Ｌ［ｌ−１０−３ｌｒＡマ） のそれとは異なる、取り込み及び保持のあるパターンを示した。ＬＬＩＯ−Ｈｒ ＾マは、天然のＮＲ−ＬＵ−１（ｌ抗体の歴史的研究と等価の特徴的腫瘍取り込 みパターンを示し、投与後２４及び４８時間の間にピーク値の４０％ＩＤ／Ｇに 到達した。それに対し、Ｉ’ＩＰ−ビオシチンは、腫瘍での初期における急速な 増大を示し、ＰＩＰ−ビオシチン投与後、２４時間でＬＵ−１０−ＳＩｒ＾マの それよりも多いレベルに到達する。更に、ＰＩＰ−ビオシチンの局在化は、複合 体と結合した放射能の濃度が減少し始める９６時間まで増大する。ＬＵ−１０− ５ｌｒ＾マと比較した循環するＰＩＦ−ビオシチンのそれらの時点（第１７Ｂ図 に示したように）における若干増大した量は、この現象を測定するには不十分で あるように見えた。 第１８図に明らかに示されるように、腫瘍中でのＩ’ＩＰ−ビオシチンのＬＩＩ −１１１−５ｌｒＡｙに対する比は、実験中連続的に増大したが、血液中での比 は連続的に減少した。 この観察は、ＰＩＰ−ビオシチンと複合体の、引き続く特徴ある工程と共に、血 液から腫瘍への標的成分含有複合体（それにＰＩＰ−ビオシチンが結合した）の 連続的結合を含む工程と一致する。ストレプトアビジン複合体成分（標的成分と 結合した放射標識化と比較して）、ｌ！：結合した放射標識は、代謝工程（上記 実施例ｘ１ｖ及びｘｖ）の臓器中で増大された保持を示すので、ストレプトアビ ジンと結合したＩ’ｌｌ’−ビオシチンは、腫瘍細胞により選択的に保持される ように見える。放射標識は標的細胞部位において保持されるために、それらの部 位でのより大きい放射能の累積が生ずる。 ＰＩＦ−ビオシチンについてのＡＵＧ　、□。、／＾ＵＣ，、。、、ｄは複合体 の２倍を超える（１．９５に対する４、２７．　ここでＡＵＧは「曲線下の領域 」を意味する）。更に、ＰＩＰ−ビオシチンについての絶対＾ＵＣ１゜、。、は 、複合体のそれに対し２倍に近い（４６２９に対する９２２Ｇ）。従って、腫瘍 に対する放射用量の増大が達成さ重合体−リガント複合 ポリリシン（約１０，０００ダルトンの分子量、ミズーリー州、セントルイスの シグマケミカル社（Ｓｉｇｍｇ　Ｃｈｅｍｉｃｊｔ　Ｃｏ、）がら市販）及びデ キストラン（リシン固定可能、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍｚ　Ｃｈｅｍｉｃｘ ｌ　Ｃｏ、）から市販）を５ＰＤＰで誘導化し、サイズ除外クロマトグラフィー にュージャージー州、ピスカタウエイのファーマシア社（Ｐｈｕｍｘｃ目１）か ら市販のｆ’Ｄ−１０カラムを使用）を用いて未反応５ＰＤＰから生成した。得 られたＳＩ’ＤＩ’−誘導化付加物をＤＴＴにより、ｐ１１４．７の０．２ＭＮ ａ０＾Ｃ緩衝液中で還元して、遊離反応性チオールを得た。例えば、チャールソ ン他（Ｃｈａ＋１ｓｓｏｎ　ｅｌ　ａｌ、）の著書、生物科学Ｊ、（Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、１．　）　、１７３：　７２３−７３７．１９７８に記載された、グルコ ン酸第−錫から得た還元Ｔｃ−９９ｍを添加した。９０％のＴｃ−９９ｍを導入 することにより、ＩＴＬＣによる測定により、１５分以内にポリリシン付加物が ｉ）られた。９６％の放射能か、デキストランと共にサイズ除外（１’Ｄ−１０ ’）クロマトグラフィーの使用により、溶出した。それらの結果はキレート化を 示している。 実施例ＸＶＩＩ＋ トリコテセン−結合分子の調製 Δ１−（２−ピリジニルジチオ）プロピオン酸の調製。 ３−メルカプトプロピオン酸（ウィスコンシン州、ミルウォーキーのアルドリッ チケミカル社（＾ｌｄ＋ｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の製品）　５．０ ０ｇ　（５２，２ｍｍｏｌ）の乾燥塩化メチレン７５ｍ１溶液を、メトキシカル ボニルスルフェニルクロリドにューヨーク州、ロングアイランドのアルーカケミ カ社（Ｆｌｕｋｘ　ＣｈｅＩＩＩｉｋｌ）の製品）　５．９６ｇ　（５２，２１ １０１０１）の乾燥塩化メチレン１５０１溶液に加えた。混合物を１５−２５℃ で９０分間攪拌し、次いで濃縮した。 残香を１５０ｍ１の乾燥塩化メチレンに再溶解し、２−メルカプトピリジン（ア ルドリッチケミカル社（Ａｌｄ＋ｉｃｈ　Ｃｈｅｌｉｃａｌ　Ｃｏ、）の製品） 　５．８０　ｇ　（５２，２ｍｍｏｌ）の乾燥塩化メチレン７５１溶液を滴下し た。混合物をｌ５−２５℃で１８時間攪拌し、濃縮して、１１．２ｇの生成物を 淡黄電油（９９％）として得た。 ３−（２−ピリジニルジチオ）プロピオン酸８．００ｇ　（３７，２ｍｍｏｌ） の乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ　）　１００ｍ１溶液に加えた。混合物を水 浴中で冷却し、次いでクロル蟻酸イソブチル５．０８ｇ（３７，２＋ｎｏ＋ｏｌ 　）を加えた。混合物を５−１０分間攪拌し、そしてテルトープチルカルバゼー ト４．９２ｇ　（３７，２ｍｍｏｌ）を加えた。 得られた混合物を１５−２５℃で１時間攪拌し、次いで濃縮した。 残香を２００　ｍｌの塩化メチレンで希釈し、水（２ｘｌｆｌｏ　ｍｌ）で洗浄 した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。残香を水冷トリ フルオロ酢酸（１６０ｍｌ）に溶解し、溶解が完全になった後、１０分環攪拌し た。混合物を濃縮し、そして残香をシリカゲルでクロマトグラフ（色層分析）し 、８５：１４：Ｉのクロロホルム　メタノール／水酸化アンモニウムで溶出して 、４．２５ｇの生成物を淡黄色固体（５０％）として得た：　ＴＬＣ−ＲＩ　０ ．５５　（８５：１５：ｌ　クロロホルム／メタノール／水酸化アンモニウム） 。 イクロリッター（０，７０８ｍｍｏｌ）の無水トリフルオロ酢酸を一７０°Ｃで 、１００マイクロリツターの乾燥ジメチルスルホキシド（１，４１ｍｍｏｌ　） の乾燥塩化メチレン３ｍｌ溶液に添加した。 混合物を一７０’Ｃて１０分間攪拌し、次いで、アングイジン（シグマケミカル 社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　）　７０ｍｇ　（０，１９８ｍ ｍｏｌ）の乾燥塩化メチレン２ｍｌ溶液に２−３分間で加えた。得られた混合物 を一７０°Ｃで１５分間攪拌し、次いで一７００Ｃ〜１５°Ｃて６０分間攪拌し た。得られた混合物を５０ｍ１の塩化メチレンて希釈し、ＩＮＩＩｃＩ水溶液（ ５０ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシラｊ、て乾燥し、濾過し、濃縮し て、粗３−デヒドロアンクイジンを得た。粗生成物を３ｍｌの乾燥メタノールに 溶解し、１００　ｍｇ　（０，４３６ｍｍｏｌ）の３−（２−ピリジニルジチオ ）プロピオン酸ヒドラジドで処理し、次いて、１００マイクロリツターのメタノ ール中の０．０２１ｍｍｏｌ　）ロフルオロ酢酸で処理した。混合物を１５−２ ５℃で５時間攪拌し、次いで濃縮した。残香をシリカゲルでクロマトグラフし、 ７５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して、６７ｍｇの生成物、泡状白色固体を、 ＄マｎ及び１ｎｔｉ異性体の混合物（６０％）として得た・　ＴＬＣ−Ｒ，０， ４３及び０６０（７５％酢酸エチル／ヘキサン）。 Ｄ、２′−デヒドローロリジンへのヒドラゾン誘導体の調製。 １、　１３’−０−テルトーブチルジメチルシリルーロリジンへの調製、１００ 　ｍｇ　（１，４７ｎ＋ｍｏｌ）のイミダゾールを、３　ｍ１ｃ７）乾燥ジメチ ルホルムアミド中のロリジンＡ　２３２ｍｇ　（０，４３６ｍｍｏｌ　）に加え た。混合物を一５℃に冷却し、次いて７２ｍｇ　（０，４７８＋＋＋ｍｏｌ　） のテルト−ブチルジメチルシリルクロリド（アルドリッチケミカル社（＾ｌ＋Ｉ ＋ｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の製品）を加えた。得られた混合物を一 ５℃〜５℃で４時間攪拌し、次いで濃縮した。 残香をシリカゲルでクロマトグラフし、先ず、３０％酢酸エチル／ヘキサンで溶 出し、次いて、５０％酢酸エチル／ヘキサンで、最後に７０％酢酸エチル／ヘキ サンで溶出して、１３７　ｍｇの生成物を泡状白色固体（４９％）として得た： 　ＴＬＣ−Ｒ１０，３２（３０％酢酸エチル／ヘキサン）。 ２．２′−デヒドロ−１３’−０−テルトーブチルジメチルシリルーロリジンへ の調製、−７０℃において、１５０マイクロリツタ（１，０６ｍｍｏｌ　）の無 水トリフルオロ酢酸を、３ｍｌの乾燥塩化メチレン中の乾燥ジメチルスルホキシ ド１００マイクロリツター（１，４１ｎ＋ｎ＋ｏ　Ｉ）に加えた。混合物を一７ ０℃で１５分間攪拌し、次いで２Ｉ１１１の乾燥塩化メチレン中の１３’−Ｑ− １ｅｒｌ−ブチルジメチルシリルーロリジンＡ　ｌ００ＩＩ＋ｇ　（０，１５５ ｍ５ｏｌ）を加えた。得られた混合物を一７０℃で１５分間攪拌し、次いで３０ ０マイクロリツター（２，１５ｍＩＩｌｏｌ）の乾燥チリエチルアミンを加えた 。この混合物を一７０℃で３０分間、そして−７０℃〜１５℃で３０分間攪拌し た。得られた混合物を、次いで濃縮し、残香をシリカゲルでクロマトグラフし、 ３０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出することにより、８２　ｍｇの生成物を泡状 白色固体（８２％）として得た：　ＴＬＣ−Ｒ，０，５１（３０％酢酸エチル／ ヘキサン）。 ３．２゛−デヒドローロリジンへの調製、５ｍ１の３＋１：１酢酸：ＴＨＦ：水 を１０ｍ１の丸底フラスコに入れ、５２ｍｇ（０’、　０９６　ｍｍｏｌ）の２ ′−デヒドロ−１３’−０−テルトーブチルジメチルシリルーロリジンＡを加え た。混合物を４５−５０°Ｃにおいて、４５時間攪拌し、冷却し、濃縮した。残 香をシリカゲルでクロマトグラフし、５％メタノール／塩化メチレンで溶出する ことにより、３６ｍｇの生成物を泡状白色固体（７０％）として得た：　ＴＬＣ −Ｒ，０，４８（５％メタノール／塩化メチレン）。 ４．２′−デヒドローロリジンＡ及び３−（２−ピリジニルジチオ）プロピオン 酸ヒドラジドのヒドラゾン誘導体の調製、２′−デヒドローロリジンＡ　２５＋ ｎｇ　（０，４７１ｍ１ａｌ）の乾燥メタノール２１の溶液に、３０ｍｇ　（０ ，１３１ｍｍｏｌ　）の３−（２−ピリジニルジチオ）プロピオン酸ヒドラジド を加え、次いで０．０１３ｍｇ＋ｏ　ｌのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物を １５−２５℃で４時間攪拌し、次いで濃縮した。残香をシリカゲルでクロマトグ ラフし、７５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出することにより、２５ｍｇの生成物 を、ｓ７ｎ及びｘｎｌｉ異性体の混合物（７１％）として得た：　ＴＬＣ−Ｒ， ０，２９及び０．５３（７５％酢酸エチル／ヘキ１．２’−０−アセチル−＋３ ’−０−テルトーブチルジメチルシリルーロリジンＡの調製、　＋３’−０−テ ルト−ブチルジメチルシリル　ロリジンＡ　１５９ｍｇ　（０，２４６ｍｍｏｌ 　）の乾燥塩化メチレン４ｍｌの溶液に、２００マイクロリツター（１，４３ｎ ＋ｍｏｌ）のトリエチルアミン、２ｍｇ　（０，０１９ｍｍｏｆ）のジメチルア ミノピリジン及び１２０マイクロリツター（１，２７ｍｍｏｌ）の無水酢酸を加 えた。 混合物を１５−２５℃で１６時間攪拌し、次いで濃縮した。残香をシリカゲルで クロマトグラフし、先ず、３０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出し、次いで、５０ ％酢酸エチル／ヘキサンで溶出することにより、１５６　ｍｇの生成物を泡状白 色固体（９２％）として得た：　ＴＬＣ−Ｒ，０，５０（３０％酢酸エチル／ヘ キサン）。 ２．２’−０−アセチルーロリジンへの調製、２’−０−アセチル−１３′−チ ルｉ・−ブチルジメチルシリルーロリシンＡ　１５６ｍｇ（０，２２６ｍｍｏｌ ）の乾燥ＴＨＦ３ｍｌの溶液に、１．５ｍｌの１Ｍテトラブチルアンモニウムフ ルオリドを加えた。混合物を１５−２５℃で４時間攪拌し、次いで濃縮した。残 香をシリカゲルでクロマトグラフし、５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出するこ とにより、１２５　ｍｇの生成物を泡状白色固体（９６％）として得た：　ＴＬ Ｃ−Ｒ，０，１７（５０％酢酸エチル／ヘキサン）。 ３．２’−０−アセチル−１３′−デヒドローロリジンへの調製。 乾燥ジメチルスルホキシド６２マイクロリツター（０，８７ｍｍｏｌ）の乾燥塩 化メチレン２ｍｌの溶液に、−７０℃で６２マイクロリツター（０，４３９ｍｍ ｏｌ）の無水テトラフルオロ酢酸を加えた。混合物を一７０°Ｃにおいて１０分 間攪拌し、次いで２′−〇−アセチルーロリジンＡ　２５ｍｇ　（０，０４４ｍ ｍｏｌ）の乾燥塩化メチレン１．５ｍ１溶液を２−３分の間に加えた。この混合 物を一７０℃〜５０℃において、２０分間攪拌し、次いで濃縮した。残香をシリ カゲルでクロマトグラフし、５％メタノール／塩化メチレンで溶出することによ り、２１ｍｇの生成物を泡状白色固体として得た。 ４．２’Ｏ−アセチル−１３′−デヒドローロリジンＡ及び３−（２−ピリジニ ルジチオ）プロピオン酸ヒドラジドのヒドラゾン誘導体の調製、２’−０−アセ チル−１３′−デヒドローロリジ：／Ａ　２１　ｍｇ　（０，０３７ｍｍｏｌ） の乾燥メタノール３ｍｌの溶液に、２５　ｍｇ　（０，Ｉｌｍｍｏｌ）の３−（ ２−ピリジニルジチオ）プロピオン酸ヒドラジドを加え、次いでトリフルオロ酢 酸０．０１１　ｍｍｏｌの乾燥メタノール１００マイクロリツター溶液を加えた 。混合物を１５−２５℃で３時間攪拌し、次いで濃縮した。残香をシリカゲルで クロマトグラフし、７５％酢酸エチル／ヘキサン、次いで酢酸エチルで溶出する ことにより、１８　ｍｇの生成物を、無電池（６２％）として得た：　ＴＬＣ− Ｒ，ＯＪＯ（７５％酢酸エチル１．２′−デスオキシ−２′−β−ヨード−１３ ’−０−テルトーブチルジメチルシリルーロリジンへの調製、１３’−０−テル トーブチルジメチルシリルーロリジンＡ　９９　ｍｇ　（０，１５３ｍｍｏｌ） の乾燥塩化メチレン５ｍｌの溶液に、０℃において、８０マイクロリツター（０ ，４５９＋ｙ＋ｎｏｌ）の乾燥ジイソプロピルエチルアミン、次いて５１マイク ロリツター（０，３０３ｍｍｏｌ）の無水トリフルオロメタンスルホン酸を加え た。混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いで３０ｍ１の塩化メチレンで希釈し、 ２０ｍ１のＩＮ　ＩＩｃＩ水溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥 腰濾過し、濃縮した。残香を５ｍｌのアセトンで希釈し、次いて２２５　ｍｇ　 （１７２ｍｍｏｌ）のヨウ化ナトリウムで希釈した。混合物を還流して２０分間 撹拌１７、次いて５０ｍ１の塩化メチレンで希釈し、２５ｍ１の水で洗浄した。 有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過腰濃縮しまた。残香をシリノＪゲルで クロマトグラフし、先ず、３０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出することにより、 ９５　ｍ２の生成物を泡状白色固体（８７％）として得た−　Ｔｌ、Ｃ−Ｒ＋　 ０５５　（３５％酌酸エチル／ヘキ→）′ン）。 ２．２′−デスオキシ−２′−β−ヨードーロリジンへの調製。 ２′−デスオキシ−２′−β−ヨード−１３’−０ｌｅ＋ｌ−ブチルジメチルシ リルーロリジンΔ９５　ｍｌ！　（０，１２６ｍｍｏｌ）に、５ｍｌの３．１１ 酢酸　Ｔ　ＨＩ”　：水を加えた。混合物を、６０−６５℃で４時間攪拌し、次 いで濃縮した。残香をシリカゲルでクロマトグラフし、６０％酢酸エチル／ヘキ サンで溶出することにより、６７ｍｇの生成物を泡状白色固体（８３％）として 得た。 ３．２′−デスオキシ−２′−α−チオアセチル−０リジンへの調製、２′−デ スオキシ−２′−β−ヨード−〇リジンＡ６７ｍｇ（０，Ｉ０４ｍｍｏｌ　）の 無水エタノール５＋ｎｌの溶液に、２４０　ｍｌ（２，１０ｍｍｏｌ　）のチオ 耐酸カリウムを加えた。混合物を６５−７０’Ｃにおいて５時間攪拌し、冷却し 、５０ｍ１の塩化メチレンで希釈し、５０ｍ１の水で洗浄した。有機相を硫酸マ グネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。残香をシリカゲルでクロマトグラフし 、６０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出することにより、５８　ｍｇの生成物を泡 状白色固体（９４％）として得た・ＴＬＣ−Ｒ，０，５３（６０％酢酸エチル／ ヘキサン）。 ４．２゛−デスオキシ−２′−α−メルカプチルーロリジンへの調製、２゛−デ スオキシ−２′−α−チオアセチルーロリジンＡ５７　ｍｇ　（（１，０９７ｍ ｍｏｌ）のエタノール４ｍｌの溶液に、２＋ｎｌの２８％水酸化アンモニウム水 溶液を加えた。混合物を６５−７０°Ｃにおいて６時間攪拌した。残香をシリカ ゲルでクロマトグラフし、１０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出することにより、 ２５ｍｇの中間対ジスルフィドを得た。ジスルフィドを３ｍｌの塩化メチレン及 び０．５ｍｌのメタノールで希釈し、２５マイクロリツタ（０，ＩＯｍｍｏｌ） のトリブチルフォスフインを加えた。混合物を１５−２５℃において１５分間攪 拌し、次いで濃縮した。残へをシリカゲルでクロマトグラフし、６０％酢酸エチ ル／ヘキサンで溶出することにより、２３　ｍｇの生成物を、無色浦（４３％） として得た：　ＴＬＣ−Ｒ，０，３９（６０％酢酸エチル／ヘキサン）。 ５．２゛−デスオキシ−２′−α−（３−ジチオプロピオン酸）−ロリジンへの 調製、２′デスオキシ−２′−α−メルカブチルーロリジンΔ２１　ｍｇ　（０ ，０３８ｍｍｏｌ）のエタノール３ｍｌの溶液に、２０　ｍｇ　（０，０９３ｍ ｍｏｌ）の３−（２−ピリジニルジチオ）プロピオン酸を加え、次いで２５マイ クロリツター（０，１７９ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加えた。混合物を１ ５−２５℃において３０分間攪拌（７、次いで５０ｍ１の酢酸エチルで希釈し、 ｌ０ｍ１のＩＮ塩酸水溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾 過し、濃縮した。残香をシリカゲルでクロマトグラフし、最初は０．１％酢酸／ 酢酸エチルで、次いて０．１５・９５の酢酸：メタノール：酢酸エチルで溶出す ることにより、２２ｍｇの生成物を、はぼ無色の油（８８％）として得た：　Ｔ ＬＣ−Ｒ，ＯＪ？　（０，１５９５の酢酸・メタノール：酢酸エチル）。 ６．２′−デスオキシ−２′−α−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−３−ジ チオプロピオン酸）−ロリジンへの調製、２′−デスオキシ−２′−α−（３− ジチオプロピオン酸）−ロリジンＡ２２　ｍｇ　（（１，（ｌ］３７ｍｍｏｌ） の乾燥ＴＨＦ２ｍｌの溶液に、！２　ｍｇ（０，１０４ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロ キシスクシンイミド、次いで１８ｍｇ（０，０８７ｍｍｏりのジシクロへキシル カルボジイミドを加えた。 混合物を１５−２５℃において４時間攪拌し、次いて２０マイクロリツターの酢 酸を加えた。混合物を更に３０分間攪拌し、次いで、グラスウールの栓を用いて 濾過した。固体を３ｍｌのＴＨＥで洗浄した。濾液を合わせ、濃縮した。残香を シリカゲルでクロマトグラフし、最初は０．１：５０：５Ｇの酢酸：酢酸エチル ：ヘキサンで、次いで０．１％酢酸／酢酸エチルで溶出することにより、１８　 ｍｇの生成物を白色固体（７１％）として得た：Ｔｔ、Ｃ−Ｒ，１Ｇ９　（酢酸 エチル）。 実施例ＸＩＸ トリコテセン−含有複合体の調製 明細書に記載したようなトリコテセンの複合は、二つの例示合成式の何れかによ り行うことができる＝　（１）標的成分のアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイ ミデート（ＮＨＳ　）−誘導化トリコテセンを反応させることにより、または（ ２）標的化成分の還元ジスルフィドまたは遊離スルフヒドリルと２−ピリジニル ジチオ−誘導化トリコテセンの反応。 Ａ、　Ｎ）Ｉｓ−誘導化トリコテセンの抗体複合体、この複合化は、一般に、１ ％ｗｌ／ｖｏ１．の抗体安定剤モルフゾルを含有する、６．２ｍｌのホウ酸ナト リウム緩衝液（０，５Ｍ　、ｐＨ８）巾において行われる。１００％ＤＭＳＯに 溶解したＮＨ３−誘導化トリコテセンを、最終抗体濃度が１．　Ｏｍｇ／ｍｌの 反応溶液である抗体の攪拌する溶液に滴下した。６−９７抗体のトリコテセンの 取り込みを達成するために、ＮＨ３−誘導化トリコテセンを、最終濃度が２５％ ＤＭＳＯｖｏｌ／ｖｏｌの３０・１のトリコテセン：抗体モル比で提供した。反 応混合物を、サイズ除外クロマトグラフィー、広範囲透析、膜遠心分離を介して の濃縮及び殺菌濾過により精製する前に、１時間室温で連続的に攪拌してインキ ュベートした。このようにして製造した複合体は、冷蔵（例えば、５−１０℃） して貯蔵するか、または液体窒素で急速に凍結して、次いで一７０℃で使用まで 貯蔵する）。 とりわけスクシンイミジル−２′−ロワジンＡ３−ジチオプロピオン酸塩の抗体 に対する複合について、０．４０ｍ１の６．２ｍＭホウ酸ナトナトリウム緩衝液 、５　Ｍ　、　ｐＨ８，０）及び０．２０ｍ１の１１００１１Ｉモルクゾル／ｍ ｌ　Ｈ２０を、Ｉ’ＢＳ　（牡、６．２ｍＭリン酸ナトリウム、１５０　ｍＭ　 ＮｘＣｌ　、ｐｉｔ　７．２）中、１．［１ｍｌの２．０ｍｇＮＲ−ＬＵ−１ｎ ／ｍｌ　に加えた。２９０　ミリグラムのスクシンイミジル−２′−ロリジンＡ ３−ジチオプロピオン酸を溶解した０、５０ｍ１のＤＭＳＯ（３０：Ｉのトリコ テセン　抗体モル提供比）を、１０秒間の間、攪拌しながら滴下した。得られた 生成物を精製するために、反応液の１ｍｌのアリコツトを、１％のモルフゾル（ ｗｌ／ｖｏｌ　）を含有するＩ’ＢＳ中で平衡にした、ＰＤ−１０セフアデツク スカラム（スウェーデン国、アップサラのファルマシア社（Ｐｈａ＋ｍａｃｉｘ 　）の製品）に適用した。溶出した複合体は、２．４−４．８　ｍｌの両分とし て集めた。Ｉ’Ｄ−１０で精製したアリコート（分割量）を、次いて、溜め、５ ｐｅｃｔｒａ　／ＰＯＲ分子多孔質膜管（カリフォルニア州、ロサンゼルスのス ペクトラム　メディカル　インダストリーズ社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃ ａｌＩｎｄｕｓｌｔｉｅｓ　、　Ｉｎｃ　）の製品）を用いて、１％のモルフゾ ル（Ｗ【／マｏｆ）を含有するＰＢＳに対して徹底的に透析し、Ｃｅｎｔａｉｃ ｏｎ　ＰＭ−３０ミクロ濃縮器（マサチューセッツ州、ビバリーのダブリュ、ア ール、ブレースアンドカンパニー（Ｗ、Ｒ１Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ、）のアミコンデ ィビジョン（八ｍ１ｃｏｎ　Ｄｉｖ、　）の製品）により濃縮し、そして２．２ 　ミクロンのＡｃ＋ｏｄｉｓｃ　（ミシガン州、アナボアのゲルマンサイエンセ ス社（Ｇｅｌｍｘｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　）の製品）を用いて殺菌濾過した。こ のようにして製造した複合体は、冷蔵して貯蔵するか（例えば、５−１Ｏ°Ｃ） 、または液体窒素中で速やかに凍結し、そして−７０℃で使用まで貯蔵する）。 において、ＮＲ−ＬＵ−１０ジスルフイド（５−１０＋ｎｇのＮＲ−１，１ｌ− １０）を、１０−１５ｍＭのジチオスレイトールを含有する１ｍｌのＰＢＳ中で 室温で１５分間インキュベートすることにより、先ず還元した。 還元した生成物を、０．１　Ｍ　ＮｌＣｌ、ｉ％モルクゾルｗｌ／ｖｏｌ及び０ 、２　ｍＭ　ＥＤＴ＾　（Ｎａ塩）を含有する、ｐｉｔ７．５の脱ガスした０、 １Ｍリン酸ナトリウム中で平衡化したＰＤ−１０カラムにより精製した。還元− ジスルフィドＮＲ−ＬＵ−１０精製の直後に、攪拌しながら、ＤＭＳＯ（４３２ マイクログラムの３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸ヒドラジド２′−ロ リジンＡヒドラゾンを含有する、または３３７マイクログラムの３−（２−ピリ ジルジチオ）プロピオン酸ヒドラジド３−アングイジンヒドラゾンを含有する、 または４５９マイクログラムの３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸ヒドラ ジド２′−アセチル−１３′−ロリジンＡヒドラゾンを含有する、０．４０ｍ１ のＤＭＳＯ）に溶解した２−ピリジニル−ジチオ−誘導化トリコテセンを２ｍｇ の還元ジスルフィドＮＲ−ＬＵ−１０溶液（４４：１のトリコテセン：抗体のモ ル比を与える）に滴下した。一般に、複合化を行うに際し、抗体の反応濃度は、 ０．８−１．２　ｍｇ／ｍｌであり、ＤＭＳＯは＋６−２５％ｖｏｌ／ｖｏｌで あり、抗体に対するトリコテセンのモル比は、４０・１〜５０・１（抗体当たり 、約６のトリコテセンの付加を達成するために）の範囲を提供する。室温でイン キュベーションを１時間した後、精製を、上記実施例ＸＶＩＩ　（Ａ　）に記載 した精製工程と同様にして行った。このようにして調製した複合体は、冷蔵して （例えば、５−１０℃）貯蔵するかまたは液体窒素中で急速に冷凍し、次いて使 用するまで一７０℃で貯蔵した）。 Ｃ，トリコテセン−ポリマーリガンド複合体、予備標的化アプローチにおいて、 ビオチン−デキストラン−トリコテセン複合体の使用を含む実験は、 一実施例ＸＶＩＩで議論した技術によりビオチン化した、７０、０００ダルトン のデキストラン分子を、有用なりシンの１−＋２５　ＰＩＰ　Ｎｌｌ５エステル を用いて、放射能付加デキストランビオチン（デキストラン９−ビオチンと表わ す）を生ずる放射性同位体標識化； 一残存するりシンにＮＨ３活性化トリコテセンを用いるトリコテセン薬剤の複合 化； 一薬剤一デキストラン９−ビオチン分子を固定化アビジンに結合する実証；及び 一マウスでの血清浄化の評価を含む。 ７０、０００ダルトンの分子量を有し、１８モルのそれに対するビオチン共有結 合及び１８個の付加的なリシンイプシロンアミノ基により、ビオチン化したデキ ストラン分子を、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃｉｌ　Ｃｏ、） 　（ミズーリー州、セントルイス）から購入した。この物質を放射標識化するた めに、２ｍｌガラス製小瓶のアセトニトリル中の、２２００　ｍｃｉ／ｍｍｏｌ の特異的活性を有する４ｍＣの１−１２５　ＰＩＦ　ＮＨＳエステル（マサチュ ーセッツ州、ボストンのニューイングランドニュークシア社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）の製品）を、窒素気流中で、乾燥のために排出した 。ｐ１１９．０の１．ＯＭホウ酸ナナトリウム０６５０ｍ１で再構成した１０　 ｍｇのビオチン化リシン−誘導化デキストラン凍結乾燥物を、ヨウ素化する化合 物に加え、室温で１０分間インキュベートした。反応に引き続いて、放射ヨウ素 化デキストラン成分を、１％のモルフゾル（フロリダ州、アラチュアのファーマ チック社（１’ｈｘ＋ｍｘｌｅｃ　）の製品）を含有するリン酸緩衝化生理食塩 水（即ち、６．２Ｍリン酸ナトリウム、１５０　ｍＭ　ＮａＣ１、ｐｉｔ　７． ２）中で平衡にしたＩ’Ｄ−ＩＱカラム（スウェーデン国、アップサラのファル マシア社（Ｐｈａｔｍａｃｉａ　）の製品）を用いて、サイズ除外クロマトグラ フィーにより精製した。ビオチン〜デキストラン１は、カラムから２．４−４． ８　ｍｌの留分中に、［１，２ｍｃｉ／ｍｇの特異的活性及び３．５　ｍｇ／ｍ ｌの濃度で溶出した。 ビオチン２−デキストラン°をトリコテセンで誘導化するために、０９ｍ１のビ オチン−デキストラン１を、１％モルクゾルを含有する０３　Ｍ　、　ｌ”ｈ　 ８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液１．３ｍ１で希釈し７、次いて、攪拌下、１． ２ｍｇの２゛−デスオキシ−２′−α−（トヒドロキシスクシンイミジル−３− ジチオプロピオン酸）−ロリジンΔ（即ち、２．１の薬剤対有用なりシンのモル 比）を含ｆ丁する１、２ｍｌのＤＭＳＯを加えた。室温で１．５時間インキュベ ーションた後、反応混合物の夫々の１ｍｌのアリコートを、上記したようにＩ’ ＢＳで平衡化したＩ’Ｄ−１０カラムで精製した。収率は８５％を超えていた。 ビオチン−デキストラン°−トリコテセン分子がアビジンまたはストレプトアビ ジンと結合することが可能であることを立証するために、１マイクログラムのビ オチン−デキストラン°及び１マイクログラムのビオチン−デキストラン°−ト リコテセンを、１５０　ｍＭ　ＮａＣ１を含有するｐＨ６，３の０．２　Ｍ　Ｐ ｉ緩衝ａｔ）、２ｍｌ中でアガロースビーズ（ミズーリー州、セントルイスのシ グマケミカル社（Ｓｉｇｍｘ　Ｃｈｅｍｉｃｘｌ　Ｃｏ、）の製品）上に不溶化 した１単位のアビジンと共に、室温で１５分間インキュベートした。このインキ ュベーションに引き続き、アガロースビーズに結合したパーセント放射能を、１ ．４ｍｌ緩衝液で希釈し、アガロース懸濁液を遠心分離し７、そしてベレットを １．４＋＋＋ｌの緩衝液で３回洗浄した後、測定した。ビオチン−デキストラン °及びビオチン−デキストラン１−トリコテセンについて、１００％の結合が観 察された。 ビオチン−デキストラン°及びビオチン−デキストラン９−トリコテセンの血清 浄化試験についてもまた、Ｂａ１ｂ　Ｃマウスで行った。連続的血液採取は、二 つの分子が、それらの２μＣｉの注入により実質的に同様の血清浄化を有するこ とを示した。 実施例ＸＸＩ Ｄ０Ｔ＾−ビオチン複合体の合成 Ａ、ニトロ−ベンジル−ＤＯＴへの合成。 アミノベンジル−ＤＯＴ＾の合成を、マ・ツクマリ−他（ＭｃＭｕ＋Ｂｅｌ　ａ ｌ、　）の著書、生物結合科学ｑ叩ｖｎｊｕｇａｌｅ　Ｃｈｅｎ＋、）、技術合 成の臨界工程は、１−（テルト−ブトキシカッしボニノし）−５−（４−ニトロ ベンジル’）−３，６−１１ｈリオキ゛ノー１．４．１．１ｔｌ−デトラアザシ クロドデカンを調製するための、ジスクシンイミジルト（テルト−ブトキシカル ボニル）イミノジ°ｒセテート及びト（２−アミノエチル）−４−ニトロフェニ ルアラニンアミドの間の分子間環化である。換言すれば、臨界工程（よ、環化し たドデカンをｆ”？るための、ビスーＮＩＩＳエステルとジアミンの間の分子間 環化である。マソクマリー他（ＭｃＭｕｒ［Ｙｅｌ　ｉｆ、）は、環化工程を３ ０　ｍｍｏｌの規模で、夫々の反応体を１００　ｍｌのＤＭＦに溶解し、４Ｎの ジオキサンを含有する反シシ容器（こ４８時間か（Ｊでシリンジポンプから添加 することを行って０る。 マツクマリー他（ＭｃｌＡｕ口１　ｅｌ　ａｔ、）の工程の５倍の規模拡大は、 反応容積、添加速度及び反応時間に関し、現実的で（まない。工程化学の研究は 、反応添加速度が実質的（こＪ首大し、溶媒の容積を非常に減少させることがで きたが、所望の環化生成物の収率が同程度でしか得られないことを示した。その 結果として、３０ｍｍｏｌの規模において、夫々の反応体を５（１（ｌ　ｍｌの ＤＭＦに溶解り、３Ｎのジオキサンを含有する反応容器１こ２７時間で滴下漏斗 を経由して加えた。使用した方法の添加速度は、５．１８　ｍｍｏｌ／時間の反 応速度及び０．０４７Ｍの反応濃度であった。 Ｄ−アラニン結合複合体を、先ずＤ−アラニン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の製品）をビオチン−旧ＩＳ、１ステルと結合させること により調製した。得られたビオチニル−Ｄ−アラニンを、次いで１−（３−ジメ チルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）及びＮ −ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ３）により活性化した。このＮＨＳエステル を、００１人−アニリンとその部位で反応させ、分取ＨＩ’ＬＣで精製した所望 の生成物を得た。 更に詳しくは、ＤＭＦ　（４ｍｌ　）中のＤ−アラニン（７８ｍｇ、　Ｏ，。 ｍｍｏｌ　、１．２当量）、ビオチン−旧ｌ５Ｉ−ステル（２５（１ｍｇ、　０ ．７３ｍｍｏｌ、１．０当量）、トリエチルアミン（ＯＪＯｍｌ、’ｌ、　１９ 　ｍｍｏｌ　。 ３．０当量）を１１０℃で３０分間加熱した。溶液を２３℃に冷却し、蒸発させ た。生成物固体を氷酢酸で酸性にし、再度蒸発させた。白色固体の生成物、ビオ チニル−０〜アラニンを４０ｍ１の水に懸濁させ、過剰の未反応Ｄ−アラニンを 除去し、濾過により集めた。ビオチニル−〇−アラニンを４７％の収率で白色固 体（１３０ａ＋１．０．４１ｍｍｏｌ）を得た。 ＮＨ５（１０ｍｇ、　０．０８　ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ　（１５ｍｇ、　０． ０７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ　（１ｍｌ）中のビオチニル−Ｄ−アラニン（２７ｍ ｇ、　０．０８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を２３℃で６０時間攪拌し、そ の時点におけるＴＩ、Ｃ分析では、カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイ ミジルエステルへの転化が示された。ピリジン（０，８ｍ１）を、ＤＯＴＡ−ア ニリン（２［１ｍｇ、　０．０４ｍｍｏｌ）に引き続いて加えた。 混合物を瞬間的に約１００℃に加熱し、次いで２３℃に冷却し、蒸発させた。生 成物のＤＯＴＡ−アニリノ−Ｄ−アラニル−ビオチンアミドはＨＰ　Ｌ　Ｃによ り精製した。 Ｃ，Ｎ−ヒドロキシエチル結合複合体の合成。 イミノジ酢酸ジメチルエステルをビオチン−ＮＩＩＳ−エステルと縮合させて、 ビオチニルジメチルイミノジ酢酸を得る。１当量の水酸化ナトリウムによる加水 分解により、モノメチルエステルを、加水分解生成物の精製の後に得る。カルボ シキル基をほう素により還元し、ヒドロキシエチルアミドを得る。 ヒドロキシル基は【−ブチル−ジメチル−シリルクロリドで保護される。メチル エステルを加水分解し、ＥＤＴＩで活性化し、そしてＤＯＴＡ−アニリンにより 縮合することにより最終精製物複合体を形成する。 Ｄ、　Ｎ−Ｍｅ−Ｌｃ−ＤＯＴＡ−ビオチンの合成０反応式を以下に記載６−ア ミノカプロン酸（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣＯｌ）の 製品）のエステル化を、メタノール製１１Ｃ１により行った。トリフルオロ酢酸 無水物を使用することによるアミノ基のトリフルオロアセチル化は、Ｎ−６−（ メチルカプロイル）−トリフルオロアセトアミドを与えた。アミド窒素は、テト ラヒドロフラン中の水素化ナトリウム及びヨウ化メチルを使用してメチル化した 。トリフルオロアセチル保護基を、酸性メタノール中で開裂し、メチル６−メチ ルアミノ−カプロン酸塩酸塩を得た。アミンをビオチン−ＮＨ３と縮合して、メ チルＮ−メチル−カプリルアミド−ビオチンを得た。ケン化により、ＥＤＣＩ及 びＮｌｌ５により活性化された対応する酸を得、その部位をＤＯＴＡ−アニリン で縮合して、ＤＯＴＡ−ベンジルアミド−Ｎ−メチル−カプロイルアミド−ビオ チンを得た。 １．６−アミノカプロン酸塩酸塩の調製、塩化水素（ガス）を、２〜３分間、急 激に泡立てることにより、２５１１　ｍｌメタノール中の２０．０　ｇ　（１５ ２ｍｍｏｌ）の６−アミノカプロン酸の溶液に加えた。混合物を１５−２５℃で ３時間攪拌し、次いで濃縮して２７．５ｇの生成物を白色固体（９９％）として 得た：マルチブレット）、及び　１．２３　ｐｐｍ　（２１（、マルチブレット ）。 ２、メチルＮ−６−（メチルカプロイル）−トリフルオロアセトアミドの調製、 メチル６−アミノカプロン酸塩酸塩２０．０ｇ（１１０ｍｍｏｌ）のジクロロメ タン２５０　ｍｌの溶液に、３１．０ｍ１（２２，２ｍｍｏｌ）のトリエチルア ミンを加えた。混合物を水浴で冷却し、無水トリフルオロ酢酸（１８，０ｍｌ、 １２７ｎ＋ｍｏｌ　）を１５ｍ２０分の期間で加えた。この混合物を、０−１０ ℃で１時間攪拌し、濃縮した。残香を３１１０　ｍｌの酢酸エチル及び飽和重炭 酸ナトリウム（３Ｘ　１００　ｍｌ）水溶液で希釈した。有機相を無水硫酸マグ ネシウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮して２６．５ｇの生成物を淡黄色部（１ ００％）として得た：２．３０　（２Ｈ，ｔ）、Ｌ５２　（４Ｈ，マルチブレッ ト）、及び　１．２３ＰＰｍ　（２Ｈｌマルチブレツト）。 ３、メチル６−Ｎ−メチルアミノ−カプロン酸塩酸塩の調製。 ドロー（メチルカプロイル）−トリフルオロアセトアミド７．０１ｇ　（２９， ２ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン１２５　ｍｌの溶液に、鉱物油中の６０ ％水素化ナトリウム１．７５１ｆ　（４３，ｌｌ＋ｃｍｏｌ）をゆっくりと加え た。混合物を１５−２５℃で３０分間攪拌し、次いて６、２ｇ　（４３，７ｍｍ ｏｌ）のヨウ化メチルを加えた。混合物を１５−２５℃で１７時間攪拌し、次い でセライトを通して濾過した。固体を５０ｍ１のテトラヒドロフランで洗浄した 。残香を１５０　ｍｌの酢酸エチルで希釈し、５％硫酸ナトリウム（２Ｘ　１０ ０　ｍｌ）水溶液、次いで１００　ｍｌのｉ　Ｎ塩酸水溶液で洗浄した。有機相 を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮して黄色油状残香を得た 。残香を２５０　ｍｌのメタノールで希釈し、次いて塩化水素（ガス）を混合物 中に２−３分間急激に泡立てた。 得られた混合物を１８時間還還流、冷却し、そして濃縮した。 残香を１５０　ｍｌのメタノールで希釈（７、ヘキサジ（３Ｘ　１５０　ｉｆ） で洗浄し、先に導入した鉱物油をＮ！１）で除去した。メタノール相を濃縮１７ て４９１ｇの生成物苓黄色浦（８６％）きして得た１（−）ｌＨＲ（ＤＭＳＯ） 　Ｉｌｌ、ＤＯ（２１１，ブロードｓ）、３．５０　（コＨ，ｓ）。 ２．８１　（２＋１．　マルチブレッド）、２．４［１（］１１．ｓ）、２．コ Ｏ（２ｋｌ。 ｔ）、１．５２　（４１１，ｌｋチブレット）７　及び　１．２９　ｐｐｍ　（ ２１４゜マルチブレッド）・ ４、メチル６−　（Ｎ−メチルカプロイルアミドービオチンの調製、　Ｎ−ｔニ トロキシスクシンイミジルビオチンｍｍｏｌ　）をメチル６−（トメチル）アミ ノカプロン酸塩酸塩（２５０　ｍｇ，　１．２８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ　（４．［ １ｍｌ）及びトリエチルアミン（０．Ｉ８ｍｌ、１．　２８ｍｍｏｌ）の溶液に 加えた。混合物を油浴中、１００℃で１０分間加熱した。溶液を蒸発させ、氷酢 酸で酸性とＬ２、再度蒸発させた。残香を、５０　ｇシリカにュージャージー州 、ギブスタウンのイーエムサイエンス社（ＥＭ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）の製品、粒径 ０，４０〜０．　６：１ｍｍ）を充填したエースグラス社（Ａｃｅ　ＧｌａｓＥ ）により製造された２５ｍｍのフラッシュクロマトグラフィーカラムで、１５％ ＭｅＯＨ／ＥＩＯＡｃにより溶出することによりクロマトグラフした。生成物を 黄色油（３９０　ｌＩｌｇ）として７９％の収率で得た。 ５、６−（Ｎ−メチル−Ｎ−ビオチニル）アミノカプロン酸の調製．メチル６− 　（Ｎ−メチルカプロイルアミド−ビオチン（３９１　ｌＩＩｇ，　１．　ＩＯ ｍｍｏｌ）のメタノール（２．５ｍｌ）溶液に、０，９５８　Ｎ！Ｏｉ＋溶液（ １．５ｍｌ）を加えた。この溶液を、２３℃で３時間攪拌した。溶液を、１．０ Ｍ塩酸（１．５ｍｌ）を加えることにより中和し、蒸発させた。残香を水に溶解 し、更に１，０Ｍ塩酸（０．　４　ｉｆ）で酸性とし、そして蒸発させた。ガム 状固体残香を水に懸濁させ、それが白色固体に変化するまで、へらで攪拌した。 粉末を濾過して３４０　ｍｇの収率で集めた。 ６、　ＤＯＴ＾−ベンジルアミド−Ｎ−メチル−カプロイルアミド−ビオチンの 調製．　ＤＭＦ　（０．８　１）中の６−（Ｎ−メチル−Ｎ−ビオチニル）アミ ノカプロン酸（２９ｍｇ，　０．　０８ｍｍｏｌ）及びトヒドロキシスクシンイ ミド（１０ｍｇ，　０．０９ｍｍｏｌ）懸濁液を、固体を溶解するのに必要な短 時間だけ熟読で加熱した。この加熱溶液に、ＥＤＣＩ　（１５ｍｇ，　０．０８ ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を、２３℃で２０時間攪拌した。この攪拌す る溶液に、アミノベンジル−ＤＯＴ＾（２０ｍｇ，　０．０４ｍｍｏｆ）及びピ リジン（０．８ｎ＋１）を加えた。生成物を分取ＨＰＬＣにより単離し、３ｔｎ ｇの終了を得た。 Ｅ．保存ビオチンカルボキシ基とのビスーＤＯＴＡ複合体の合１、６−ブロモカ プロン酸メチル（６−ブロモヘキサン酸メチル）の調製、塩化水素（ガス）を、 ２〜３分間、激しく泡立てることにより、２５０ｍｌ　メタノール中の５．　Ｏ ｆ　ｇ　（２５．　７ｍｍｏｌ）の６−ブロモカプロン酸の溶液に加えた。混合 物を１５−２５℃で３時間攪拌し、次いて濃縮して４．８４ｇの生成物を黄色浦 （９０％）として得た。 Ｈ−ＮＭＲ　（ＤＭＳＯＩ　１５８　（３Ｈ，　ｓｌ，　３．５１　（２８，　 ！：ｌ，　２．２９（２１Ｌ　ｌ：ｌ，　１．７０　（２Ｈ，　ｐｅｎｊｅｊｌ ，　及び　１．６２−１．２７　ｐｐｍ［４Ｈ，ｍｌ。 ２、Ｎ，Ｎ−ビス−　（メチル　６−ヘキサノイル）−アミン塩酸塩の調製．ト （メチル　６−ヘキサノイル）−トリフルオロアセトアミド（セクションＤ．２ ．において調製した）４．０１ｇ（ＩＳ．　７ｍｍｏｌ）の無水テラヒドロフラ ン１２５ｍｌの溶液に、鉱物油中の１．　Ｏｇ　（２５ｍｍｏｌ）の６０％水素 化ナトリウムに添加した。混合物を１５−２５°Ｃで１時間攪拌し、次いて６− プロモカプロン酸メチル３．５０ｇ　（１６．７ｍｍｏｌ）に加え、そして混合 物を還流するまで加熱した。混合物を還流化、２２時間攪拌した。アリコートの ＮＭＲ分析は、反応が不完全であることを示していた。その結果、６−プロモカ ブロン酸メチル１．００ｇ　（４．８ｍｍｏｌ　）を余アリコートのＮＭＲ分析 は、反応が不完全であることを示していた。更に、６−プロモカブロン酸メチル １．　０Ｇ．を余分に加え、混合物を還流下、２４時間攪拌した。アリコートの ＮＭＲ分析は、反応がほぼ完全であることを示していた。混合物を冷却し、次い でセライトを通して直接濾過した。固体を１００ｍｌのテトラヒドロフランで洗 浄した。濾液を合わせ濃縮した。残香を１００ｍ１のメタノールに溶解し、ヘキ サン（３Ｘ１００ｍ１　）で洗浄して、水素化ナトリウムと共に導入した鉱物油 を除去した。 メタノール相を６ｍｌのＩＯＮ水酸化ナトリウム水溶液で処理し、＋５−２５℃ で３時間攪拌した。混合物を濃縮した。残有を１００ｍ１の脱イオン水で希釈し 、濃塩酸でｐ１１２の酸性とした。混合物をエーテル（３Ｘ１Ｏｈ＋１　）で洗 浄した。水相を濃縮し、２００＋＋＋Ｉの乾燥メタノールで希釈し、次いで塩化 水素ガスを混合物に２−３分間泡立てて通した。混合物を１５−２５℃で３時間 攪拌し、次いで濃縮した。残有を５０ｍ１の乾燥メタノールで希釈し、無機塩を 除去するために濾過した。濾液を濃縮して９８ｇの生成物を白色固体（３８％） として得た：Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）　８．６２　（２Ｈ，ｍ）　３．５Ｂ　（ ６Ｈ，ｓ）、　２．８２（４Ｈ，ｍ）　２．３０　（４３（、ｔ）、　１．６７ −１．４５　（８Ｈ，ｍ）　ａｎｄｌ、３８−Ｃ２２ｐｐｍ　（４Ｈ，ｍｌ。 ３、Ｎ、Ｎ・ビス−（メチル　６−ヘキサノイル）−ビオチンアミドの調製、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミジルビオチン５００ｍｇ（１，４６ｍｍｏｌ）の乾燥 ジメチルホルムアミド１５ｍ１の溶液に、６００　ｌｌ１ｇ　（１，９４ｎ＋ｎ ＋ｏｌ　）のＮ、Ｎ−ビス＝　（メチル　６−ヘキサノイル）アミンを加え、次 いで１．Ｏｍｌのトリエチルアミンを加えた。混合物を８０−８５℃で３時間攪 拌し、次いで冷却し、濃縮した。残有をシリカゲルでクロマトグラフし、２０％ メタノール／酢酸エチルで溶出して、６２０ｍｇの生成物を略無色の浦（８５％ ）として得た。 ｕ−Ｎ′ＭＲ（ＣＤＣ１３）　５．７１　（ＬＨ，ｓ）　、５．２２　（ＬＨｌ ｓ）　、４−５２４、Ｎ、Ｎ−ビス−（６−ヘキサノイル）−ビオチンアミドの 調製、Ｎ、Ｎ−ビス−（メチル　６−ヘキサノイル）−ビオチンアミド６１０ｍ ｇ　（０，８１９ｍｍｏｌ　）のメタノール３５ｍ１の溶液に、５．Ｏｎ＋１の ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を加えた。混合物を１５−２５℃で４．５時間攪拌 し、次いで濃縮した。残有を５０ｍ１の脱イオン水で希釈し、４℃において、Ｉ Ｎ塩酸でｐＨ２の酸性とした。 白色固体として沈殿した生成物を、真空濾過により単離し、真空下に乾燥して、 ４８２　ｍｇ　（８４％）を得た：Ｈ−？ＪＭＲ（ＤＭＳＯ）　６．４２　（Ｉ Ｈ，Ｓ）、６．３３　（ＩＨ，ｓ）、４．２９（ＬＨ，ｍ）、４．１２　（１１ １，ｍ）、１．２９−３．０４　（５Ｈ，ｍ）、２．８２（ＩＨ，ｄｄ）、２． ５７　（ＬＨ，ｄ）、２．２１　（６Ｈ，ｍ）　及び１．７Ｏ−ＬＩＯｐｐｍ　 （１８Ｈ，ｍ）。 ５、Ｎ’、Ｎ’−ビス−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル６−ヘキサノイル） −ビオチンアミドの調製、Ｎ、Ｎ−ビス−（６−ヘキサノイル）〜ビオチンアミ ド２２０ｍｇ　（０，４６７ｍｍｏｌ　）の乾燥ジメチルホルムアミド３ｍｌの 溶液に、１６１１ｍｇ　（１，３９ｍｍｏｌ）のトヒドロキシスクシンイミドを 加え、次いテ２１０ｍｇ　（１，０２ｍｍｏｌ）のジシクロへキシル−カルボジ イミドを加えた。混合物を１５−２５°Ｃで１７時間攪拌し、次いで濃縮した。 残有をシリカゲルでクロマトグラフし、０．１：２０＋８０の酢酸／メ゛タノー ル／酢酸エチルで溶出して、１４８ｍ１ｌの生成物を泡状灰白色固体（４８％） として得た。 Ｈ−＃ｒＫＲ（ＤＭＳＯ）　６．：１９　（１１１，ｓ）、　６．３２　（ＩＨ ，ｓ）、　４，２９２．２５　（２Ｈ，ｔ）、　１．７５−１．２０　（１［］ Ｈ，ｍｌ；　ＴＬＣ−Ｒ，０，、＋７（０，１：２０・８０の酢酸／メタノール ／酢酸エチル）。 ６、Ｎ、Ｎ−ビス＝　（６−ヘキサライルアミドベンジル−ＤＯＴ＾）−ビオチ ンアミドの調製、　１．ｏｍ！乾燥ジメチメチルムアミド中の、Ｉ　５ＢｌのＤ ＯＴ＾−ベンジルアミン及び６．０ｍｇのＮ’　、　Ｎ’−ビス＝（トビドロキ シスクシンイミジル６−ヘキサノイル）−ビオチンアミドに対し、θ、５ｍ１の 乾燥ピリジンを加えた。混合物を４５−５０℃で４．５時間、及び！５−２５℃ で１２時間攪拌した。混合物を濃縮し、残有を２．１　Ｘ２．５　ｃｍのオクタ デシルシリル（ＯＤＳ　）　逆相分取ＨＰＬｃカラムチ、０．１：９５：５−ｏ 、　１：４０：６０　（７）　トリフルオロ酢酸：水ニアセトニトリルの２０分 間の勾配プロフィールで、１３ｍ１／分の速度で溶出することによりクロマトグ ラフし、所望の生成物を得た。保持時間は、上記した勾配の流速の１．Ｏｍｌ／ 分て、４．６ｍｍ　Ｘ　２５ｃｍ　ＯＤＳ分析ＩＩ　Ｉ’　Ｌ　Ｃカラムを使用 して、１５．９７分であった。 Ｆ、　Ｎ−メチル−グリシン結合複合体の合成、この合成についての反応式を以 下に示す。 Ｎ−メチルグリシン結合ＤＯＴ＾−ビオチン複合体を、ｐ−アラニン結合ＤＯＴ ＾−ビオチン複合体の製造に使用したのと類似の方法により調製した。Ｎ−メチ ル−グリシン（俗名サルコシン、シグマ　ケミカル社（Ｓｉｇｍｉ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、）から市販）を、ＤＭＦ及びトリエチルアミン中でビオチン〜Ｎ Ｈ５と縮合してＮ−メチルグリシル−ビオチンを得た。Ｎ−メチル−グリシルビ オチンを、次いでＥＤＣＩ及びＮｌｌ５で活性化した。得られたｆｉｌｌｓエス テルは、単離せずに、ＤＯＴ＾−アニリン及び過剰のピリジンで、本来の部位で 縮合した。反応液を６０℃で１０分間加熱し、次いで蒸発させた。残有を分取Ｈ ＰＬＣで精製して、［（Ｎ−メチル−Ｎ−ビオチニル）−Ｎ−グリシル］−アミ ノベンジル−ＤＯＴ＾を得１、（Ｎ−メチル）グリシルビオチンの調製、　ＤＭ Ｆ　（８，０ｍｌ　）及びトリエチルアミン（０，６１ｍ１．４．３５ｍｍｏｌ ）を、固体Ｎ−メチルグリシン（１８２ｍｇ、　２．０５ｍａ＋ｏｌ）及びＮ− ヒドロキシルスクシンイミジルビオチン（５０［ｌｌｌ１ｇ、　１．４６０１１ ＲＯ１）に加えた。混合物を油浴中で８５℃に１一時間加熱し、その間、固体を 溶解して透明で無色の溶液とした。溶媒を次いで蒸発させた。黄色油状残香を氷 酢酸で酸性とし、蒸発させ、５０ｇのシリカを充填した２７＋ｎｍのカラムで、 りｏマｌ−グラフし、３０％ｋｌｅ０１１／ＥＩＯＡｃ　１％）ｌＯＡｃで溶出 して生成物を６６％の収量で、白色固体（３８３ｍｇ　）１１−Ｎ）０１　（Ｄ ＭＳＯ）：”１．１８−１．２５　（ｍ、　６＋１．　（ＣＨ２）、）、　２． １５゜２．３５　（２ｔ’ｓ、２１．（、ＣＩらＣｏ）、２．７５　（ｍ、２＋ Ｉ、ＳＣＩら）、１２．８０．　１００　（２ｓ會ｓ、３Ｈ，ＮＣＩ！、）、コ 、Ｏ５−１１５（ｍ、ＩＯ。 ５ＣＩ（）、：３．９５．　４．０５　（２ｓ’ｓ、２１（、ＣＩ（２Ｎ）、４ ．１５．　４．３２（２ｍ’ｓ、　２Ｈ，２Ｃ１（Ｉ’ｓ）、　Ｇ、３５　（ｓ 、　ＮＩＰ）、　０．４５　（ｓ。 Ｎ１１３　。 ２、［（Ｎ−メチル−Ｎ−ビオチニル）グリシルコアミノベンジル−ＤＯＴ＾の 調製、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ　。 ０、　Ｈｍｍｏｌ）及びＥ［ｌＣＩ　（１５ｍｇ、　６．θｌｉｍｍｏｌ）をＩ ）ｌ＋ＩＦ　（１，０ｍｌ　）中の（Ｎ−メチルグリシルビオチン（２４ｍｇ、 　０．０８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を２３°Ｃで６４時間攪拌した。ピ リジン（０，８ｍ１）及ヒアミノベンジル−ＤＯＴＡ　（２０ｍｇＳＯ，［１４ ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、油浴中で６３℃にＩｎ分間加熱し、次いで２３ ℃で４時間攪拌した。溶液を蒸発させた。残香を分取Ｉｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃで精製し 、生成物を灰白色固体（８ｍｇ、　０．０１ｍｍｏりとして２７％の収量で得た 。 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２０　）　：１．３０−１．８０　（ｍ１６１１）　、２．４０ −２．５５（２白、２１１、ＣＨ２ＣＯ）　、２．７０−４．２　Ｃｆｌｉｔ体 マルチフレット）、４３５（ｍ、　ＣＩＩＮ）　、４．５５（ｍ、　ＣｔｌＮ） 　、７．３０（ｆｆｌ、２＋１、ベンゼン水素）　、７．４０　（ｍ、　２Ｈ、 ベンゼン水素）。 ビオチンカルボキシル基を、ＴＩＩＦ中のジボランで還元し、第１級アルコール を得る。アルコールの塩化トシルによるピリジン中でのトシル化は、第１級ｌ・ シレートを与える。アミノベンジルＤＯＴＡは、ピリジン中で無水トリフルオロ 酢酸でアシル化し、（Ｎ−１−リフルオロアセチル）アミノベンジル−ＤＯ丁Ａ を与える。ビオチントシレートの置換に引き続く、５．０当量の水素化ナトリウ ムによる脱プロトン化により、（Ｎ−トリフルオロアセトアミド−Ｎ−デスカル ボキシルビオチニル）アミノベンジル−ＤＯＴ＾を与える。Ｎ４リフルオロラセ トアミド基の＋ｌＣＩ（ｇ）によるメタノール中での酸性の開裂は、アミン結合 ｎＯＴへ−ビオチン複合体を与える。 実施例ＸＸＩ＋ 清澄剤測定実験 非腫瘍ｆＶ持マウスについて行なった以下の実験は、雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（２ ０−２５ｇ）を用いて行なった。腫瘍保持マウスの実験のために、雌ヌードマウ スにＬＳ−１８０腫瘍細胞を皮下注射し、７日後に、マウスは５Ｌ１００ｍｇの 腫瘍異種移植片を示した。それらの実験において使用したモノクローナル抗体は 、ＮＲ−Ｌｔｌ−ＩＯであった。放射標識化した場合、ＮＲ−ＬＵ−１０−スト レプトアビジン複合体は、ここに記載した方法を用いてｌ−１２５により放射標 識化した。放射標識化した場合、ｌ’ＩＰ−ビオチンは、ここに記載した方法を 用いてｌ−１３１またはｌ−１２５により標識化した。 付与したマウスに２００μｇのＮＲ−ＬＵ−１０抗体−ストレプトアビジン（Ｍ Ａｂ−５Ｉ＋Ａｖ　）複合体を、時間０の時点で注射し、腫瘍に対し、２２時間 予備局在化させた。その時点で、２０ｇｇのＡＯ−Ｂｌを一群の動物に投与した 。２時間後、９０ｇｇの放射性同位体−付与、リガンド含有小分子（このバート Ｂにおいて記載したように調製したＩ’ＩＰ−ビオチン−デキストラン）をこの 群のマウスに投与し、また八〇−Ｂｌを受容していない群にも投与した。放射標 識の腫瘍での取り込み及び血液からの浄化についてのこの実験の結果は、腫瘍標 的で放射標識化ビオチン含有複合体は保持されていたが、血液浄化は増大してお り、標的に配布された量／血清に局在化している量の全体的な改良に導いている 。清澄剤を使用した場合のＡＵＣ腫瘍／ＡＵＣ血液は６，８７であり、清澄剤が ない場合の＾ＵＣ腫瘍／＾ＵＣ血液は４．４５であった。循環ＭＡｂ−３ｌ＋Ａ ｙ複合体の血液浄化は、清澄剤の使用により増大された。清澄剤は、別の群の動 物で放射標識化され、非常に低いレベルで腫瘍に直接結合することが見出され（ ４８８総ｐｍｏｌ　（ＯＪ５％ｌ　Ｄ／ｇ）の用量においてＩ、　７ｐｍｏｌ／ ｇ）、その事は、腫瘍結合ＭＡｂ−Ｓｌ＋Ａマの、引き続いて投与された放射標 識リガンドに結合する能力が重大には影響されないこと３、０＋ｎｇビオチンー デキストラン、Ｑ、３ｉｌ　ＰＢＳ中の固定可能なりシン（ＢＤＬＦ、ミズーリ 州、セントルイスのシグマ社（Ｓｉｇｎ＋ｇ　Ｃｈ！ｍ１ｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｌ 、ＬｏｕｉｓＳＭｉｓｓｏｕ＋ｉ）から入手可能）約１８ビオチン／分子の７０ ．０００ダルトンの分子量）及びｐ）１９．２５の１Ｍ炭酸ナトリウム０．１５ ｍ１の溶液を、ウィルバー他（Ｗｉｌｂａ＋Ｓｅｌ　ａｔ、）の開示、Ｊ、　Ｎ ｕｃｌ、町ｔｄ、、３０：２＋６−２２６．１９８９に従って調製したＮ−スク シンイミジルｐ−１−１２５−ヨードベンゾエートの乾燥残基（１，８７ｍｃｉ ）に加えた。 Ｃ５＾０−８１の用量最適化、上記したようにＳｉｔ＾ｖ−ＭＡｂを受容した腫 瘍化マウスに、増大する量のＡＯ−８１（０マイクログラム、２０マイクログラ ム、５０マイクログラム、１００マイクログラム及び２００マイクログラム）を 注射した。腫瘍での１−１３１−ＰＩＦ−ビオシチン（５，７マイクログラム、 ＾０−８１投与後、２時間で投与）の取り込みを試験した。ＡＯ−Ｂｌの用量を 増大させても、ＭＡｂ−Ｓｌ＋Ａマの腫瘍局在化には影響がなかった。 ＡＯ−Ｂｌ投与の４４時間後に得られたデータは、同様な効果の欠如を示した。 このデータは、ＡＯ−８１用凰が、ビオチン化抗体に続いてアビジンを投与した 場合のように、腫瘍表面において架橋せず、ＭＡｂ−３ｌｒ＾マを内在化するこ とを示している。 ＰＩＦ−ビオシチン腫瘍局在化は、＾０−８１の高用量により阻害された。この 効果は、誘導化＾０−Ｂ（に対し使用するビオチンの腫瘍に対する再処理及び分 配に多く依存するものである。 腫瘍の血液に対する最適の比（放射標識化リガンドの注射された％用量／放射リ ガンドの注射された％用量で割った腫瘍のグラム重量／血液のグラム重量、が５ ０マイクログラムのへ〇−Ｂｌ用量で達成された。５０マイクログラムの＾０− ８１用量を用いたプロトコールの収量に引き続いて行った生物学的分配は、総て の非標的組織における放射標識の低い保持を示した（血液中で１．２　ｐｍｏｌ ／ｇ、尾中で３．５　ｐｍｏｌ／ｇ、肺中で１．０　ｐｍｏｌ／ｇ。 肝臓中で２．２　ｐｍｏｌ／ｇ、肺臓中で１．Ｏｐｍｏｌ／ｇ、胃中で７．Ｑｐ ｍｏｌ／ｇ、腎臓中で２．７　ｐｍｏｌ／ｇ、及び腸中で１．７　ｐｍｏｌ／ｇ ）　ｏ腫瘍中で９９．３　ｐｍｏｌ／ｇであり、それらの結果は、腫瘍以外の総 ての部位でのＭＡｂ−３ｔ＋＾マのそれからのｐＨ’−ビオシチン生物学的分配 の有効な脱結合を示す。この脱結合は、５６マイクログラムを超える清澄剤の総 ての用量において生じた。腫瘍におけるＰＩＰ−ビオシチンの局在化の減少は、 ５０マイクログラムを超える清澄剤の用量を投与する重大な結果であった。更に 、投与後４４時間での非標的組織におけるＰＩＦ−ビオシチンの量は、ＰＩＦ− ビオシチン単独の投与による結果の局在化と同等であり（ＰＩＦ−ビオシチンの みを投与した場合に見られる無視し得る増加がある、腫瘍を除いて）、有効な脱 結合を示した。 Ｄ、最適清澄剤用量の更なる研究、腫瘍化マウスに、ＭＡｂ−５ｔ＋Ａｂを上記 したように時間０で；５０マイクログラムのＡＯ−８１を２２時間で；更に５４ ５マイクロキユリーのｌ−１３１−ＰＩＦ−ビオシチンを２５時間の時点で注射 しｔ：。全身の放射性を測定し、そして清澄剤を受容していない動物のそれと比 較した。５０マイクログラムの＾０−Ｂｌは、循環するＭＡｂ−ＳｌｒＡマ複合 体に結合することにより妨げられない、動物からの注射された放射能を浄化する ことに効果的である。ｌ−１３１−ＰＩＦ−ビオシチンの腫瘍の取り込みは、５ ０マイクログラムの清澄剤用量で保持され、＾ＵＣ腫瘍／＾υＣ血液が３０；１ であり、これは、このモデルを使用した従来の抗体−放射性同位体治療において 達成されるＡＵＣ腫瘍／＾ＤＣ血液よりも約１５倍良いものであった。 で非免疫原性であるという利点を示すからである。Ｈ３＾は、ビオチン（１−約 ９ビオチン／分子）のレベルを変えることにより、＾０に関して先に記載したの と類似の化学を経由して誘導された。より具体的には、シグマ　ケミカル社（Ｓ ｉｇｍｉＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手可能な（ＰＢＳ中、５−１ｏ　ｍ ｇ／ｍｌ）のＨ５＾の溶液に対し、ｐＨ８，５のｌＯ％ｖ／ｖ　Ｏ，５Ｍホウ酸 ナトリウム緩衝液を加え、次いで、ＮＨ３−ＬＣ−ビオチン（Ｓｉｇｍｘ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌｃｏ、）のＤＭＳＯ溶液を攪拌する溶液に、所望のモルを与えるよ うに（反応体の相対モル当量）滴下した。反応混合物中の最終ＤＭＳＯパーセン トは、５％を超えるべきではない。室温で１時間攪拌した後、反応を終了した。 ＩＳＡへのビオチンについての９０％の導入効率が、一般に観察された。その結 果、若し、ＬＣ−ビオチンのＮＨＳエステルの３モル当量を導入した場合、ＩＳ Ａ分子当たり約２．７個のビオチンが得られる。未反応ビオチン試薬は、ビオチ ン−誘導化Ｉｔｓ＾から６−２５サイズ除外クロマトグラフイーを用いて除去さ れる。一方、粗生成物は、直接ガラクトシル化される。同一の化学が、非予備ビ オチン化デキストランのビオチン化に適用される。 Ｈ５＾−ビオチンは、次いで、１２〜１５個のガラクトース／分子により誘導化 される。ビオチン化８３人のガラクトース誘導化は、り一他（ＬｅｅＳｅｔ　ｓ ｌ、）の開示、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｌ「ア、１５３９５６．１９７６に従い行わ れる。より具体的には、シアノメチル−２，３，４，６−テトラ−０−アセチル 刊−チオー〇−ガラクトピラノシドのＯ，１Ｍメタノール溶液を調製し、メタノ ール中の１０％マ／マのＯ，Ｉ　Ｍ　ＮａＯＭｅと１２時間反応させ、反応性ガ ラクトシルチオイミデートを生せしめる。ビオチン化＋１ｓＡのガラクトシル化 は、最初に３００倍モル過剰の反応性チオイミデートから無水メタノールの蒸発 を始めることである。１０％マ／マの０．５Ｍホウ酸ナトリウムで緩衝された、 ＰＢＳ中のビオチン化ＩＳＡを、油状残貞に加えた。室温で２時間攪拌後、混合 物を４℃で１２時間貯蔵した。 ガラクトシル化Ｉｔｓ＾−ビオチンは、次いで、Ｇ−２５ザイズ除外クロマトグ ラフイーまたは緩衝液交換により精製し、所望の生成物を得た。同一の化学が、 ガラクトシル化デキストランにも利用できる。ＩＩｓ八へのガラクトースの導入 効率は約１０％である。 ＋２−１５個のガラクトース残基及び９個のビオチンを有する７０マイクログラ ムのガラクトース−＋１ｓ＾−ビオチン（Ｇ−１ｔｓ＾−Ｂ）を、２００マイク ログラムのＳｉｒ＾ｖ−ＭＡｂまたは２００マイクログラムのＰＢＳを２４時間 前に投与したマウスに対し、投与した。 結果は、Ｇ−Ｈ５八−Ｂが循環系からＳＩ＋＾マー１．４Ａｂを除去するのに有 効であることを示した。又、Ｇ−Ｈ３＾−Ｂの薬物動態学は、循環するＭＡｂ− ３ｌ＋Ａマの存在または非存在において、平静で且つ速１８個のビオチン／分子 で予備誘導化し、等しい数の遊離第１級アミンを有する、市販の形態のデキスト ランを研究した。 Ｈ５八−基清澄剤について議論した。それについての上記した工程に実質的に従 い、９個のガラクトース／分子のレベルで、第１級アミン基をガラクトシル化試 薬で誘導化した。ガラクトースのＩＩｓ＾に対するモル当量提供比は、約３００ ：１であり、約１／３のガラクトースが活性形態に変換された。４０マイクログ ラムのガラクトース−デキストラン−ビオチン（ＧＡＬ−ＤＥＸ−ＢＴ）を、次 いで、２００　？イクログラムのＭＡｂ−３ｌ＋＾マ複合体を２４時間前に受容 した一群のマウスに静脈注射し、８０マイクログラムのＧＡＬ−ＤＥＸ−ＢＴを 別の群のマウスに注射した。６＾Ｌ−ＤＥＸ−ＢＴは、Ｓｔｒ＾マーＭＡｂ複合 体を浄化するのに速やかで効率的であり、清澄剤投与後、４時間未満で循環する 複合体の６６％以上を除去した。等価の効果が、Ｙｒ在する循環ＳＩ＋＾マ複合 体の化学量論量の１．６　（４０マイクログラム）及び３．２　（８０マイクロ グラｌ、）倍に相当する清澄剤の双方の用−電において見らに従い用量範囲を研 究する・ ２００マイクログラムのＭＡｂ−３ｌ＋＾マ複合体を投与し；２４時間後、清澄 剤を投与し；そして ２時間後、５．７マイクログラ１１のＩ’ｌｌ’−ビオシチンを投与した。 用Ｒ範囲の研究は、Ｇ　−ＨＳ八−Ｂ清澄剤について、一分子当たり９個のビオ チン及び一分子当たり＋２−１５個のガラクトース残基を付加することから始め ることにより行った。２０．４０゜７０及び＋２０マ・イクログラムの用量を、 ２００マイクログラムの用「社のＭＡｂ−５ｌ＋Ａｖ　７３１合の後、２４時間 で投与した。清澄剤の投与は、５７マイクログラムの１−１３１−ＰＩ＋’−ビ オシチンの投与に遅れて２時間で行った。ｐＨ’−ビオシチンの腫瘍の取り込み 及び血液での保持は、その投与後４４時間で試験した（清澄剤投与後４６時間） 。結果は、４０マイクログラムのＧ−１１ＳＡ−８より多いか同等の総ての用爪 てＰＩＰ−ビオシチンの血液保持の最低値に達することを示した。Ｇ−１１ＳＡ −Ｈの夫々の増大する用量において、明瞭で、用量に依存したＰＩＰ−ビオチン の腫瘍との結合が、然しなから、存在した。腫瘍におけるＭＡｂ−３ｉ「＾Ｖ複 合体の局在化についての用量依存性の効果が観察されなかったので、このデータ は、腫瘍と結合したＭＡｂ−３ｔｒ＾マ複合体の、異化された清澄剤からのビオ チンの放出による相対的に高い遮蔽を示していると解釈される。腫瘍／血液比の 図表に関するアシアロオロソムコイド清澄剤について先に記載したものと類似の 結果が、Ｇ−Ｈ５人−Ｂにおいても見出され、血液浄化と腫瘍維持の間の最適の バランスが４０マイクログラム用量付近に生した。 清澄剤の高い用量により放出され得るビオチンの相対的に高いモル量のために、 清澄剤の有効性についてのビオチン化の低いレベルでの効果を評価するために、 研究を行った。 ９．５または２個のビオチン／分子の何れかで誘導化した、Ｇ　−ＨＳ＾−Ｂは 、清澄剤のタンパク質と同じ用量で血液から閘＾ｂ−３ｔ＋＾マを浄化すること が可能であった。ビオチン化の総てのレベルが、血液からのＭＡｂ−３ｌ＋＾マ の効果的で速やかな浄化を生じた。 それらの９−２５−及び２−ビオチン−誘導化清澄剤と単一ビオチンＧ−１ｔｓ ＾−Ｂ清澄剤の比較を、６０マイクログラム用量の夫々の清澄剤を使用して、腫 瘍化マウスについて行った。この実験は、夫々の清澄剤が、清澄剤投与後２時間 での血液浄化及びＭＡｂ−３Ｉ　ＴＡＶ複合体の腫瘍保持において、実質的に等 しい効果であることを示した。単一のビオチンとのＧ　−１１Ｓ＾−Ｂを、予備 局在化されたＭＡｂ−５ｌ＋＾マ複合体に対するＰＩＦ−ビオシチンの腫瘍との 結合を保存しながら、血液中の続いて投与されたビオチン化小分子（ＰＩＦ−ビ オシチン）の結合を減少させる能力を試験した。ｆ’ＩＰ−ビオシチン投与に引 き続いて４４時間で測定すると、ＭＡｂ−３ｌｔ＾マ複合体及びＰＩＰ−ビオシ チンの両者の腫瘍局在化は、単一ビオチン／分子（９０〜１８０マイクログラム ）でＧ　−１１３八−Ｂの広い用量範囲でよく維持されていた。ＰＩＦ−ビオシ チンの血液保持における連続的な減少は、単一ビオチンＧ−Ｈ５＾−Ｂ清澄剤の 用量を増大することにより達成されたが、腫瘍局在化は実質的に一定に維持され 、この清澄剤が、低レベルのビオチン化により、好ましいことを示している。こ れは、単一のビオチンＧ−Ｈ３＾−Ｂ清澄剤が、広い範囲の用量（最適の用量を 患者毎に滴定する必要性を除去する可能性）でＭＡｂ−５ｌ【＾マを浄化するの に有効であると共に、同じ薬剤のより高いビオチン負荷レベルである場合よりも 全身の循環系に、殆んど競合しないビオチンを放出するように見えるために、こ の好みが生ずる。 予備局在化した標的成分−ストレプトアビジン複合体に対し結合する活性剤−ビ オチン複合体に対する清澄剤−放出されたビオチンの効果を減少するための他の 方法は、タンパク質または重合体若しくは他の一次清澄剤成分を、保持リンカ− を用いてビオチンへ付着させることである。保持リンカ−は、ペプチド結合を開 裂する試薬に対して抵抗性の化学構造を有しており、随意に、リポソーム等の異 化作用空間に置かれた場合に、プロトン化されるようになる。本発明の好ましい 保持リンカ−は、上記した双方の性質を有するＤ−アミノ酸の短い一連または小 分子である。本発明の例示保持リンカ−は、塩化シアヌルであり、それは、プロ トン化された一次清澄剤のりシンのイプシロンアミノ基及び還元されそして化学 的に改変されたビオチンカルボキシ成分（先に記載している）のアミン成分との 間に介在されていてもよく、以下に記載した構造の化合物を形成する。 上記した化合物が異化作用空間において異化された場合、複素環はプロトン化さ れる。環のプロトン化は、異化代謝産物がリソソームを退去するのを防止する。 この仕様において、複素環を含有するビオチン異化代謝産物は、異化作用の部位 が限定され、そしてそれ故に、予備局在化標的成分−ストレプトアビジン標的部 位についての活性剤−ビオチン複合体と競合しない。 Ｇ−Ｈ３＾−〇用量範囲の研究において観察された、放射標識化ＰＩＦ−ビオシ チンの腫瘍／血液局在化の比較（ｉ、背景標的に対する最適化腫瘍が、広い用量 範囲（９０〜１８０マイクログラム）で達成され、たとえ、より多い用量の清澄 剤であっても、有効であろうという予測を与える結果を庚らす。用量範囲実験の 他の鍵となる結果は、一分子当たり平均たった１個のビオチンとのＧ−ＩＳＡ− Ｂは、恐らくは、アッシュウェル（＾＋ｈｖｅｌｌ　）受容体機構のみを経由し てＭＡｂ−３Ｉ＋Ａｖ複合体を浄化するのみである。何故なら、少なずぎるビオ チンは、間＾ｂ−３ｉｒ＾マ複合体の架橋及び凝集を引き起こすために存在し、 そして清澄剤はそのような凝集物と共に、細網内皮系により浄化される。 Ｈ，Ｇ−１ｔｓ＾−Ｂを用いた腫瘍標的化の測定、この実験のためのプロトコー ルは、以下の通りである：時間０：４００マイクログラムの１ＪＡｂ−ＳＩ＋Ａ マ複合体を投与し； 時間２４時間、１個のビオチン及び＋２−１５個のガラクトースを有する２４０ マイクログラムのＧ−）１ｓ＾−８を投与し；そして 時間２６時間：６マイクログラムの Ｌｕ−１７７をＤＯＴ＾キレートとそれについての公知の技術を用いて錯化した ものを投与する。 Ｌｕ−１７７−ＤＯＴ＾−ビオチン小分子の効率的な配布が観察され、腫瘍の２ ０−２５％注入量／グラムであった。それらの値は、ＭＡｂ−５ｌ＋＾マ複合体 の配布の効率と等価であった。この非最適化清澄剤用量により得られた＾υＣ腫 瘍／＾ＵＣ血液は、共通点がある直接ＭＡｂ−放射標識投与により達成されるも のよりも、３００％大きかった。更に、Ｈ５八−基清澄剤は、ヒトにおける免疫 原性が低い程度を示すことが期待される。 上記した、−若しくはそれ以上の成分を含有するキットについてもまた意図され る。例えば、放射ハロゲン化ビオチンは、予備標的工程に使用するための殺菌容 器内に供給してもよい。殺菌容器内に供給されたキレート−ビオチン複合体は、 消費者による放射金属化に適しており；そのようなキットは、予備標的プロトコ ールに使用するのに特に適しているであろう。一方、放射ハロゲン化ビオチン及 びキレート−ビオチン複合体は、研究試薬として使用するための非殺菌条件下に おいて、ガラス瓶に入れられてもよい。 上記から、例示の目的のために、本発明の特異的態様についてここに記載したけ れども、本発明の精神及び範囲から外れることなく、種々の変更が成し得ること が理解されるであろう。従って、本発明は、付加した請求の範囲によって以外に は限定されるものではない。 臼 時間（時間） 組織 時間（時間） 時間（時間） 但更丑Ｑ切１慇−よ 臼 臼 の　ト　ｔＤ　ＩＯ＋　ｎ　へ　− 州；蒙刺＼０　よ 州薯嬢嘴＼Ｑ　よ く 州薯皓−＼Ｑ　よ 投薬３１　（ｐＭＯＬ） 没薬Ｉｔ　（ｐＭＯＬ） ＋　Ｑ、５■Ｐ正−ＢＴ血液 一？−０，５ｕｇＰＩＰ−ＢＴ腫瘍 時間（時間） ＬＵ−１０５ｔｒＡｖ腫瘍 ＋　ｐｎ）−ビオシチン腫瘍 時間（時間） ０　Ｚｏｏ　２００ 時間（時間） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　５１１００ （３１）優先権主張番号　９９５，３８３（３２）優先臼　１９９２年１２月２ ３日（３３）優先権主張国　米国（Ｕ　Ｓ　）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、Ｂ Ｅ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＣＡ、ＪＰ、ＵＳＩ （７２）発明者　グスタフソン、リンダ　エム。 アメリカ合衆国、　９８１５５　ワシントン州。 シアトル、３１スト　ストリート　エヌ、イ＋、　１９８０９ （７２）発明者　レノ、ジョン　エム。 アメリカ合衆国、　９８０３６　ワシントン州。 プライア、エルム　ドライブ　２４５２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、リンカーＬは、 １）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のＤ−アミノ酸−含有リンカー； ２）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のリンカー；及び ３）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のリンカー ４）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のリンカーから成る群より選択されたものであり、ここで、Ｌ′は、 ａ）−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−；ｂ）−ＮＨ−； ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼；ｄ）−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−；及び ｅ）−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−，から成る群より選択されたものであ り、ここで、Ｒ１は水素、低級アルキル、（ＣＨ２）ｍ−ＯＨ、（ＣＨ２）ｍ− ＯＳＯ３、（ＣＨ２）ｍ−ＳＯ３、及び▲数式、化学式、表等があります▼ここ で、ｍは１または２である、 の一若しくはそれ以上の親水性基で置換された低級アルキル；グルクロニドー置 換アミノ酸；または他のグルクロニド誘導体を表わして； Ｒ２は、水素；アミノ酸；ヒドロキシ、サルフェート、及びホスホネートから成 る群より選択される一若しくはそれ以上の置換基を有する置換低級アルキル基； または、親水性基であり； Ｒ３は、水素；アミン；低級アルキル；ヒドロキシ−、サルフェートー、または ホスホネートー置換低級アルキル；グルクロニド；またはグルクロニドー誘導化 アミノ酸であり； Ｒ４は、水素；低級アルキルまたは ▲数式、化学式、表等があります▼ であり； Ｒ′は水素；−（ＣＨ２）２−ＯＨまたはサルフェートまたはそのホスホネート 誘導体；または ▲数式、化学式、表等があります▼ であり； Ｒ′は結合または−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−；そしてｎは０−５の範囲であ る、 のビオチン−ＤＯＴＡ複合体。 ２．しがＤ−アミノ酸導入した、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のリンカーである請求の範囲第１項記載のビオチン−ＤＯＴＡ複合体。 ３．Ｒ１がＣＨ３であり、Ｒ２がＨである請求の範囲第２項記載のビオチン−Ｄ ＯＴＡ複合体。 ４Ｌが、式▲数式、化学式、表等があります▼のリンかである請求の範囲第１項 記載のビオチン−ＤＯＴＡ複合体。 ５．Ｒ３が水素であり；Ｒ４がＣＨ３であり；そしてｎが４である請求の範囲第 ４項記載のビオチン−ＤＯＴＡ複合体。 ６．Ｒ３が水素であり；Ｒ４がＣＨ３であり；そしてｎが０である請求の範囲第 ４項記載のピオチン−ＤＯＴＡ複合体。 ７．Ｒ３が水素であり；Ｒ４が ▲数式、化学式、表等があります▼ であり；そしてｎが４である請求の範囲第４項記載のピオチン−ＤＯＴＡ複合体 。 ８．Ｌが、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のリンカーであり、ここでＬ′は、 ａ）−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−；ｂ）−ＮＨ−； ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼；ｄ）−ＨＨ−ＣＳ−ＮＨ−；及び ｅ）−ＨＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−またはビス−ＤＯＴＡ誘導体から成る 群より選択されたものである請求の範囲第１項記載のビオチン−ＤＯＴＡ複合体 。 ９．予備標的化法を実施するのに有用であり、以下の構造：（ヘキソース）ｍ− ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）−（リガンド）ｎ、 ここで、ｎは１〜１０の整数であり、そしてｍは１〜２５の整数であり、そして ヘキソースがアッシュウエル（Ａｓｈｗｅｌｌ）受容体により認識されるヘキソ ースである ことを特徴とする清澄剤。 １０．リガンドがビオチンであり、そしてヘキソースがガラクトースまたはマン ノースである請求の範囲第９項記載の清澄剤。 １１．ｎが１〜５の整数であり、ヘキソースがガラクトースである請求の範囲第 １０項記載の清澄剤。 １２．ｎが３であり、ヘキソースがガラクトースである請求の範囲第１０項記載 の清澄剤。 １３．ｍが１０〜１５の整数である請求の範囲第１０項記載の清澄剤。 １４．受容体に標的成分−抗リガンド複合体を投与し；標的成分−抗リガンド複 合体を腫瘍細胞に局在化するに十分な時間、時間を経過させ； その後、受容体に請求の範囲第９項記載の清澄剤を投与し、ここで、リガンドは 、標的成分−抗リガンド複合体中の抗リガンドに対し補完するものであり；そし て受容体に活性剤−リガンド複合体を引き続き投与する、ここで、活性剤−リガ ンド複合体は、標的細胞に結合した標的成分−抗リガンド複合体に局在化する、 ことから成る方法であることを特徴とする、哺乳動物の受容体の標的細胞集団に 活性剤の局在化を増大させる方法。 １５．標的成分−抗リガンド複合体が、標的成分に共有結合したアビジンまたは ストレプトアビジン抗リガンド成分から成るものである請求の範囲第１４項記載 の方法。 １６．標的成分−抗リガンド複合体が、実質的に腫瘍を飽和する用量で投与され る請求の範囲第１４項記載の方法。 １７．清澄剤の投与工程が、標的成分−抗リガンド複合体投与工程に続いて、約 ２０〜約７２時間後に行われる請求の範囲第１４項記載の方法。 １８．更に、式 （ヘキソース）ｍ−ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）−（リガンド）ｎ ここで、第二の清澄剤の投与工程は、活性剤−リガンド複合体の投与工程に先立 って起こり、二つの清澄剤投与の間に約１〜約２４時間の範囲の期間が経過して おり、そして第二の清澄剤は先に投与した清澄剤と同一でも異なっていてもよい 、 の第二の済澄剤を投与することを含む、清澄剤の第二の投与工程から成る請求の 範囲第１４項記載の方法。 １９．活性剤−リガンド複合体が放射標識化ビオチンである請求の範囲第１４項 記載の方法。 ２０．活性剤−リガンド複合体が、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒ３はＨであり；Ｒ４はＣＨ３であり、そしてｎは０である、 の活性剤−ピオチン−ＤＯＴＡ複合体である請求の範囲第１９項記載の方法。