JPH07506358A - 新規な活性化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な活性化合物 技術分野 本発明は新しい種類の生物学的活性を有する化合物、その調製方法および治療に おけるその使用に関する。特に本発明は、腫瘍関連炭水化物構造体に対する、ま たは、感染性の病原体および／または感染した宿主細胞上に発現した炭水化物構 造体に対するＴ細胞免疫を発生させるために有用な免疫原性のコンジュゲートを 提供する。

従来の技術 細胞性免疫 を推動物の免疫系は侵入した微生物および悪性細胞に対して常時活性を有する。

適応免疫系は抗原への最初の遭遇と比較して２回目により大きく応答することは よく知られている。この事実はワクチンにおいて活用されており、ワクチンは免 疫記憶として知られる持続性の免疫の状態を誘導することにより機能する。免疫 記憶は感染性の病原体に対して特異的な１９７８球の活性化を必要とする。１９ ７８球は病原体に由来するペプチド断片をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して認識 することにより細胞内で感染を検知する。しかしながら、殆どの１９７８球はｒ ＭＩｌｃ拘束」されており、即ち、これらは高度に冬型性の膜蛋白に結合し、主 要組織適合性複合体（ＭｎＣ）のクラスＩおよびクラス■の遺伝子によりコード され、そして抗原がプロセシングされるような補助細胞（抗原提示細胞、＾ＰＣ と命名されている）上の表面上に提示されるペプチドの複合体のみを認識する。

１９７８球は付着受容体分子の特異性に応じてＣＤ４’″またはＣＤ８４に分類 できる。ＣＤ４付着受容体は菖１１Ｃクラス■分子を認識し、ＣＤ８はクラスＩ ｉ：Ｐｉ合する。更にＭ）Ｉｃ拘束はＴＣＲの特定の部分へのＭＨＣ分子の直接 の結合に応じて変化する（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、１９９２）。

ＣＤ４”Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）はマクロファージおよび抗体産生Ｂ細胞を活 性化し、ＣＤ８”Ｔ細胞（細胞障害性Ｔ細胞、　ＣＴＬ）はウィルスおよび細胞 内細菌に感染した細胞を殺傷する。抗原はその発生源に応じて２つの経路のうち の１つによりプロセシングされる。第１の経路では細胞外からきた外来性物質を 特殊な抗原提示細胞（多くはマクロファージまたはＢ細胞）により封じ込め、こ れがその物質を分解し、プロセシングされた抗原をクラス■のＭＨＣ分子に連結 させる。複合体は細胞表面に輸送され、ヘルパーＴ細胞に提示される。

第２の経路は一般的にウィルス感染細胞または悪性細胞内に形成された蛋白のプ ロセシングに関わるものである。これらの蛋白は細胞内でプロセシングされ、即 ち、これらはペプチド断片を形成するような部分的蛋白分解に付される。次にこ れらの断片はクラスＩ　ＩＩＩＴＩｃ分子と結合し、細胞表面に輸送されて細胞 障害性Ｔ細胞に提示される。

別の経路による抗原のプロセシングには生物学的意味がある。即ち、周囲により 捕獲された抗原は最終的にはＢ細胞をもたらし抗体を産生じ、これは、外因性の 抗原によるその後の攻撃に対抗して生物を保護することができる。一方、異常細 胞または不規則な細胞（例えばウィルス感染細胞または悪性細胞）内に形成され た異常構造の形態の抗原の場合は、免疫系にとって活性化されるのが好都合であ り、その結果最終的には不規則な細胞を殺傷することができる。

近年ＭＨＣクラス！および■の分子に結合したペプチドの分析においてかなり前 進があった（参考文献例：　Ｊａｎｅｖａｙ、　１９９１　；　ＲＱｔｚｓｃｈ ｋｅ＆　Ｆａｌｋ、１９９１　；５ｔａｕｓｓ、１９９１　；Ｔｓｏｗｉｄｅｓ 　＆　Ｅｉｓｅｎ、１９９１）。即ち、１１１’ｌｃクラスＩの分子はアミノ酸 が僅か８〜１２個の短いペプチドに結合し、菖■Ｃクラス■分子はアミノ酸約１ ０〜１７個のペプチドに結合することが解った。

更に、抗原のプロセシングから生じるペプチド断片はＭＩＩＣ分子の細胞外部上 の溝の中に結合した細胞表面に輸送されることが解った。

１１Ｈｃクラス■分子の場合は、ペプチドに沿って厳密な場所に位置する個々の アミノ酸側鎖がペプチド結合溝中に結合することが解っている（　１ｌａｄｄｅ ｎ等、１９９１）。これらのポケットの位置およびその内側にあるアミノ酸は異 なるアレレの異性体では異なっている。結果的に、異なるＭＩＩＣクラス■の分 子が異なるセットのペプチドと結合することができ、アレレ特異的なモチーフが 種々のｌｌＩＣアレレに対して発見されている（Ｖａｎ　Ｂｌｅｅｋ　＆　Ｎａ ｔｈｅｎｓｏｎ、　１９９０　；　Ｆａｌｋ等、１９９１　；。

Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ等、１．９９１）。例えばＩＩＬ＾−＾２．１に結合するペ プチドは好ましくは２位にＬまたはＭｌおよび９位、即ちＣ末端部位に■または Ｌを有する（ＲＱｔｚｓｃｈｋｅ　＆　Ｆａｌｋ、　１９９１）。

免疫系でＭＩＩＣクラス■分子に結合することのできるペプチドの例は、ＡＳＮ ＥＮＭＥＴＭおよび５ＧＰＳＮＴＰＰＥ　Ｉ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１および ２）であり、これらは共に、１ｌ−２−Ｄｂ分子により提供される。

ヒト免疫系においてＭＩＩＣクラスＩ分子に結合することのできるペプチドの１ 例はＧ　Ｉ　ＬＧＦＶＦＴＬ（ＳＥＱ　ＩＩ）Ｎｏ：　３）Ｔ、ｌ、コレハ１１ Ｌ＾−＾２．１分子により提供される（Ｆａｌｋ等、１９９１）。

ＩＩＦＩＣ（クラス■）結合ペプチド、ＤＹＧ　Ｉ　ＬＱ　ｌＮ５Ｒ（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：１９）と炭水化物４−０−α−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−ガラ クトピラノースとのコンジュゲートは、Ｅｌｏｆｓｓｏｎ等により記載されてい る（１９９１）。

１０８９１０７４４８号はＭＨＣクラス１分子に結合したペプチドと相同性を有 するペプチドを用いて宿主細胞の免疫応答を調節するための組成物を開示してい る。

Ｔ細胞特異的エピトープの担体としての合成ペプチドＣＴＬはトリニトロクロロ ベンゼン（ＴＮＰ）を塗布したマウスの肺臓から発生させることができ、そして ＴＮＰコーティング同系間の標的細　−抱の殺傷について選択できる。このよう にして発生したＣＴＬのいくつかは内部（６位）リジン残基に結合したＴＮＩ’ を有する１０個のアミノ酸の短いｌｌｌＩＣクラスＩ　（Ｋｂ）結合ペプチドを 認識することが解っている。更に、いくつかのＣＴＬ細胞は種々の担体蛋白（Ｉ ｓ＾、ＢＳ＾およびＫＬ■）に結合したプロセシングされ提供されたＴＮＰを有 する同系間の標的細胞、およびＴＮＰコーティングされた異型の標的細胞を殺傷 する（ＯｒｔＩＩｌａｎｎ等、１９９２）。

腫瘍関連抗原 腫−が免疫系により（腫瘍細胞の異常な性質に基づいて）外来物質として認識さ れる可能性は効果的な癌治療法の開発のための価値ある機会を提供する。実験的 な系において、腫瘍は高度に免疫原性であることが解っており、そして、トリガ ーされた免疫応答は腫瘍細胞を排除するのに充分であった。しかしながら、臨床 現場においては、複数の遺伝子的および適応的な変化の産物である腫瘍は、それ が医学的な問題になる時点では殆ど免疫原性を有さない。従って、真に腫瘍関連 の蛋白抗原、即ち腫瘍細胞のみで発現する抗原は殆ど見出されていない。

腫瘍関連蛋白抗原の欠如とは対照的に、種々の異常な炭水化物（ＣＩＩＯ）構造 体が腫瘍細胞上に存在している（参考文献例：　１Ｉａｋｏａ＋ｏｒｉ。

１９９１）。これらはＣＨ２鎖の組立に携わる酵素系における異常の結果として 形成される。鎖は先端部を欠くことが多（、その結果ｃｎｏ抗原決定基（正常な 細胞には存在しないか、または遮蔽されている）が腫瘍細胞上に発現する。

腫瘍細胞上の異常なＣ１１０構造は糖蛋白、糖脂質またはこれらの２つの形態の 両方の複合体の形態で存在しつる。糖蛋白はしばしば体液中に分泌されるが、糖 脂質は大部分において膜結合性である。

腫瘍関連炭水化物抗原の例はマウス黒色色素細胞腫瘍旧６細胞中に発見されてい るＧＭ３ガングリオンド（Ｎｏｔｅｓ等、１９８７）　、ヒト黒色色素細胞腫細 胞に関連するＧＤ３ガングリオシド（Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ等、１９７９） およびＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫瘍細胞中に発現するＧｂ３ガングリオシド（Ｗｉ ｅｌｓ等、１９８１　：　Ｂｒｏｄｉｎ等、１９８８）である。

感染性疾患に関わる炭水化物 感染性疾患に関わる炭水化物は感染性病原体上、またはこれらがら分泌または流 出した物質上、または、感染した宿主細胞の表面上に発現させることができる。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　（Ｒｏｂｅｒｔｓｓｏｎ等、 １９８２）　、ＬｅｉｓｈＩｌａｎｉａｍａｊｏｒ　（Ｍａｉｌ等、１９８９） 、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｓ　（Ｄｏｍｅｒ等、１９８９）および１１ｙ ｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｃｒｏｖｌｅ、　１９８８）のような感染性病原体によ り誘発された疾患に関わる確認または推定されている炭水化物特異的Ｔ細胞応答 のいくつかの例がある。

ＨＩＶ感染に関わる炭水化物抗原はｌ１ａｎｓｅｎ等（１９９０）により報告さ れている。

腫瘍に対する免疫療法は長い医学的歴史を有し、非特異的および特異的な方法で 試みられてきた。非特異的手法においては、免疫系をＢＣＧ、　ＩＬ−２などの ような種々の因子により活性化し、これにより腫瘍に対して既存のバックグラウ ンド免疫を増大させている。特異的手法においては、腫瘍細胞またはそれより銹 導した物質を用いてワクチンを構築している。

Ｔ細胞性免疫応答は抗腫瘍免疫において重要な役割りを演じる。

蛋白に対するＴ細胞の応答の活性化の機序はある程度（上記）特性化されている が、炭水化物に対してはこれらは本質的には知られていない。炭水化物抗原はｌ １ＩＣ蛋白のペプチド結合溝によりもたらされる構造的制約のため、ＭＩＩＣ分 子に提供されにくい。しかしなお、ｌ５ｈｉｏｋａ等（１９９２）によれば、Ｃ ｌｌ０部分はＴ細胞により認識される抗原決定基の重要な部分であり、ＣＩＯ特 異的Ｔ細胞応答の発生には制限があるものの、このような応答は麗肛結合ペプチ ド内の炭水化物の好ましい置換により発生されることが示唆されている。

Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒと共同研究者（１０８８１０００５３；　ｌｌｅｎｎｉ ｎｇｓｏｎ等、１９８７）は抗癌Ｔ細胞免疫の刺激のための「合成腫瘍関連糖コ ンジュゲート」（Ｓ−ＴＡＧ）の使用を記載している。これらの実験においては 、合成Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）およびＴｎ抗原、大 部分のヒト腺癌上に発現する炭水化物を担体蛋白にコンジュゲートし、これを用 いて遅延型過敏性（ＤＴＨ）エフェクター細胞が炭水化物の決定基を認識して応 答することを示している。担体（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合し 、Ｒｉｂｉアジュバント中で乳化されたＴＦ抗原よりなるＳ−ＴＡＧをＴ＾３− ｔｌａ腺癌を有するマウスに投与した。投与の前にシクロホスファミドを投与し たところ、宿主に５０〜９０％の長期生存が観察された（Ｆｕｎｇ等、１９９０ ）。

Ｔｈｕｒｉｎ等（１９９１）は（ｉ）腫瘍関連炭水化物ハブテン；　（ｉｆ）ウ ィルス性マウスヘルパーＴ細胞エピトープを有するペプチド：および（ｔｉｔ） Ｑｕｉｌ−＾グリコシド系アジュバントを含有するコンジュゲートを記載してい る。フンシュゲートで免疫化したマウスはウィルスのエピトープへのヘルパーＴ 細胞の反応性とともにハブテンに対して特異的なＩｇｌｌ応答を示した。

本発明の目的 本発明の主な目的は炭水化物構造体に対するＴ細胞免疫、特に炭水化物抗原に対 する抗腫瘍免疫を発生させるための手段を提供することである。

従来技術によれば炭水化物抗原に対する抗腫瘍免疫は合成ワクチンにより生じさ せるが、実際にはこの目的の達成は困難である。例えば、Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅ ｒの５−ＴＡＧ　（上記セクションに記載）は炭水化物構造体の担体として従来 の蛋白を利用している。このような糖蛋白は、それが細胞表面上に提供されるよ りも前に蛋白分解的に分解されるはずであり、これは、ＴＣＨに最終的に何が提 示されるかに関しては制御できないことを意味している。更に、大型の担体蛋白 はい（つかの異なるエピトープを有しており、ＴＩＩＩＭＩと競合する。

更に、多くの研究にもかかわらず、癌のための免疫療法を開発する従来の技術の 研究では満足できる結果が得られなかった。また、炭水化物関連抗原に対する免 疫応答を刺激するための従来の方法は、特に、疾患関連炭水化物構造体、例えば 腫瘍細胞上には発現するが正常細胞上には発現しないようなものに対する免疫応 答を刺激することが望まれるような場合には、満足できる成果が得られなかった 。

本発明は特に、抗腫瘍免疫を誘導するための合成ワクチンの開発において用いる ことのできる、ＭＩＩＣクラス■結合蛋白と炭水化物構造体を有する新しい種類 のコンジュゲートを提供することにより、上記従来技術を超えて進歩しているも のである。更に、本発明のコンジュゲートはヘルパーＴ細胞の代わりに細胞障害 性Ｔ細胞を発生することができ、上記した炭水化物構造体に対して応答できる。

更に、本発明のコンジュゲートは、（１）提示されたエピトープのアイデンティ ティ−に対して、そして（２）Ｔ細胞クローンが伸長するような、高水準の制御 を可能にする。

本発明の別の目的は、炭水化物特異的Ｔ細胞、即ちクラスＩ組ＩＣ結合ペプチド を用いることにより発生された細胞障害性Ｔ細胞の生産を可能にすることである 。本発明により発生された炭水化物特異的Ｔ細胞はＩＩＩ（Ｃ拘束である必要は ない。従って、１個体内で発生した細胞は、同じ種の別の個体から得られた細胞 と、または別の種の個体から得られた細胞とさえも、反応できる。

即ち、本発明の炭水化物特異的Ｔ細胞の発生は、ハブテンを担体蛋白にコンジュ ゲートすることによりハブテンに対する抗体の応答を得る場合のように発生した ヘルパーＴ細胞の応答がペプチドのエピトープに向けられるような従来の実験、 あるいは、Ｔｈｕｒｉｎ等がこの概念を定義した麗ＩＣクラス■結合ペプチドの 使用にまで延長したような従来の実験とは極めて異っている。

上記したとおり、本発明の目的は適当な炭水化物構造体にＭＩＩＣクラス■分子 を結合することのできる適当なペプチドをコンジュゲートすることにより達成さ れる。最適位置でペプチドに炭水化物をコンジュゲートすることにより、炭水化 物抗原はＴＣＨに対する高い親和性を有することができ、これが付着受容体とは 無関係の応答を与え、即ち、Ｔ細胞はＭＩＩＣ拘束ではなくなる。これにより細 胞障害性Ｔ１１１胞並びにヘルパーＴ細胞の両方からＣ１（０特異的応答を得る こと本発明のコンジュゲートは黒色色素細胞腫瘍、乳癌、肺癌および胃腸症を包 含する悪性疾患の治療のために用いることができる。これらは更に、炭水化物標 的分子の発現を誘発する感染性病原体による疾轡を治療するために用いることが できる。

本発明のコンジュゲートは腫瘍および／または感染症を除くためにｉｎ　ｖｉｖ ｏのＴ細胞応答を誘導するために用いることができる。これらはまた、患者への 活性化Ｔ細胞の後の再注入のための体外刺激法を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏのＴ細 胞応答を誘導するために用いることができる。

達成された免疫応答の型に応じて、コンジュゲートは連続的な通常の免疫化によ り１回または必要に応じて投与できる。

本発明の記述 本発明の第１の態様によれば：　（Ｉ　）ＭＩＩＣクラス■分子を結合すること のできるペプチド成分：および（ｉｉ）炭化水素構造体の免疫原的特異性を有す る炭水化物成分からなる、上記炭水化物構造体に対してＴ細胞免疫を発生させる ことのできるコンジュゲートが提供される。

本発明はさらに、本明細書に定義するコンジュゲート有効量を患者に投与するこ とからなる、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が特徴的な疾患関連炭水化物構造体を 示す細胞を破壊または減衰させる能力を有する患者における上記ＣＴＬの発生を 促進する方法を提供する。

更に本発明によれば、特徴的な疾患関連炭水化物構造体を示す疾患関連細胞を破 壊または減衰させる能力を有する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を産生ずる方法、 ただし、これは本明細書に定義するコンジュゲートに細胞集団を接触させること を包含し、細胞集団が（ａ）コンジュゲートのペプチド成分に結合できるような ＭＩＩＣクラス１分子を有する細胞、および（ｂ）ＭＩＩＣクラス■分子に結合 した上記コンジュゲートを有する細胞（ａ）との相互作用において上記能力を有 するＣＴＬに変換することのできる細胞を含有する上記方法が提供される。

ＣＴＬは動物にペプチド／炭水化物コンジュゲートを投与することによりＣＴＬ をｉｎ　ｖｉｖｏで生産させることにより、上記した方法で生産してよい。ある いは、ＣＴＬはペプチド／炭水化物コンジュゲートに動物の身体から除去してお いた細胞を接触させることにより１ｎｖｉｔｒｏで生産してよい。次にこのよう にして生産されたＣＴＬを治療計画の一部として（例えばこれらを同じまたは異 なる動物に導入することにより）投与してよい。

本発明はさらに医薬組成物の製造のための本明細書に記載したペプチド／炭水化 物コンジュゲートの使用を提供する。

特に、患者において所望の免疫状態を誘導するための医薬組成物の製造のための コンジュゲートの使用、ただし、上記免疫状態は上記コンジュゲートとＭＩＩＣ クラスＩ分子の間の相互作用により生じたものであり、これにより免疫系の細胞 成分を刺激して上記炭水化物構造体に特異的に関与する応答を誘導するような、 上記使用を提供する。

好ましくは本発明のペプチド成分および炭水化物成分および炭水化物は以下に記 載するような特徴を有する。

ペプチド成分 本発明のペプチド／炭水化物コンジュゲートの重要な特徴は、そのペプチド成分 がｌｌｌＩｃクラス１分子に結合できなければならないという点である。所定の ペプチドについて、ＭＩＩＣＭｎＣクラス１分子する能力は、種々の方法で測定 される。即ち、例えば、ペプチドは大きさや特定の部位の特定のアミノ酸残基の 存在のような特定の選択された構造的特徴を有する。あるいは、または更に、候 補となるポリペプチドがＭＩＩＣＭｎＣクラス１分子する能力は、１つ以上の免 疫学的検定を行なうことにより実験的に評価される。更にまた、本発明のペプチ ド／炭水化物コンジュゲートのペプチド成分は、ペプチドとｌｌＩｃクラス１分 子との間の天然の複合体を解離させることにより単離されたペプチド配列と実質 的に同一の配列またはモチーフを有する。ペプチドがＭＩＩＣＭｎＣクラス１分 子する能力のこれらの指標の各々は、後に詳述する。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２５７巻（１９９２年８月１４日）に記載の３つの文献（Ｆ ｒｅｍｏｎｔ等、１９９２、Ｍａｔｓａｍｕｒａ等、１９９２年および１ａｒｔ ｏｎ等）を特に参照されたい。

これらの文献はＭＩＩＣＭｎＣクラス１分子することのできるペプチドのモチー フの特徴を、特に、ネズミ組ＩＣクラス■分子１ｌ−２Ｋｂおよびヒトクラス１ 分子１１Ｌ＾−＾２に関して記載している（後者はヒト集団の約４０％に存在す る）。

特徴的に認識されるペプチドの一定範囲のものと結合する能力に関連する１ｌｌ ｆｌｃクラスＩ分子の１つの特徴は、結合することのできるペプチドの構造的要 素を収容ないしは係留する一連の一般的には６個のいわゆる「ポケット」を形成 するペプチド結合溝の存在である。

ペプチドを結合する溝または裂は目は２つのα−へリッシスにより横方向に形成 されており、その床部はβ−プリーツシートにより形成されている。

６個のポケット（通常はＡ、Ｂ、Ｃ５ＤＳＥおよびＦ）のうち、一般的に２個は それぞれ、ペプチドの−Ｎ１１２末端および−ＣＯＯＩ＋末端を収容するように 配列している。

コンジュゲートのペプチド成分は好ましくは）Ｉ）Ｉｃクラス１分子を結合する ための最適な数のアミノ酸、即ち５〜２５個のアミノ酸、特に、８〜１２個のア ミノ酸を有するようなペプチドから選択し、その大きさはペプチド結合溝中で適 切な結合ができるように選択する。

ＭｎＣクラス１分子の溝中で効果的な結合を行なうことができるためのペプチド の最適な大きさは、８〜９個のアミノ酸であり、９個のアミノ酸が特に好ましい 。

より好ましくは、本発明のコンジュゲートのペプチド成分はポケットＦ内の結合 を促進するためにＣ末端部位における疎水性アミノ酸を有する。ペプチド成分の その他のアミノ酸は好ましくは、ペプチドを結合する裂は口内の別のポケット内 に適合するように選択する。適当な、そして好ましいアミノ酸残基の選択には、 例えばＭａｓａｚｕｍｉ（１９９２）の記載するコンピューターベース分子モデ ル法を用いることができる。

ペプチドは知られた方法で合成できる。フンシュゲートのペプチド部分の免疫原 性は化学修飾により更に増強できる。このような変性ペプチドを有するコンジュ ゲートは本発明の一部である。

合成するべきペプチドは、文献記載の方法、または、知られた方法により免疫原 性を測定できるような方法から選択できる。後者の場合は、ペプチドは全細胞溶 解物または精製ｌｌＩＣ分子から単離するか、または、例えば高速液体クロマト グラフィーにより分離できる。

ペプチドとｌｌＩＣ分子の最適な結合は、抗原提示細胞の表面上でのペプチド組 ＩＣ複合体の高い安定性により反映される。

本発明はさらに、下記段階： （ａ）ペプチド合成の知られた方法でコンジュゲートのペプチド成分を合成する 、 （ｂ）炭水化物合成の知られた方法でコンジュゲートの炭水化物成分を合成する 、 （Ｃ）ペプチド成分の−ＣＯＯＩ１１−Ｏ１＋、　−Ｎｉ１．または−３１１基 の１つ以上を保護した後に、ペプチド成分を炭水化物成分に共有結合させる、（ ｄ）炭水化物成分の−０１１、−Ｃ００Ｈ１−Ｎｌｌ、、−ＣＩＩＯまたは＝Ｃ Ｏ基の１つ以上を保護した後に、炭水化物成分をペプチド成分に共有結合させる 、 （ｅ）炭水化物成分の未保護の−０１１、−Ｃ００１１、−Ｎｌ＋２、−ＣＩＩ Ｏまたは一〇〇基を活性化する、 （ｆ）ペプチド成分の未保護の−ＣＯＯＨ，−０Ｒ１−Ｎｉ１．または一５ＦＩ 基を活性化する、 （ｇ）炭水化物成分およびペプチド成分の少なくとも１つを２官能性の連結試藁 と反応させる、 （ｈ）所望のコンジュゲートを形成するように適当に保護、活性化および／また は２官能性試薬と反応している炭水化物成分およびペプチド成分を共有結合的に 反応させる、（ｉ）中間体の保護されたペプチド／炭水化物コンジュゲートを脱 保護操作に付す の１つ以上からなる上記に定義したペプチド／炭水化物コンジュゲートを生産す るための方法を提供する。

本明細書では、ｒｌｌｌｌＣクラスＩ分子に結合できる」ペプチドとは、結果的 には、更に、１ｌｌｌＣクラスＩ分子とのその複合体が抗原提示細胞の表面上で 安定であるようなペプチドとして定義される。

上記した複合体の安定性は当該分野で知られたｉｎ　ｖｉｔｒｏの検定により測 定できる。複合体の分解は遅いため、細胞表面上の長期の発現として測定できる 。高い安定性を反映する別の特徴は、ペプチド°　の極めて低い温度での相当す るＣＴＬに対する標的細胞の感作である。

安定性はまた、低いモル濃度でのｉｎ　ｖｉｔｒｏの特定の標的細胞上での相当 するクラス１分子の発現を上方調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）するペプチドの能 力としても反映される。

安定性はまた短いペプチドをマウスに直接注射した際のｉｎ　ｖｉｖ。

での高い免疫原性にも関連している。

糖ペプチドがＭＩＩＣＭｎＣクラス１分子する能力は、以下の特徴の１つ以上を 検知するように設計された免疫学的検定を実施することにより評価してよい。

（１）可溶性ＭＩＩＣ−１に糖ペプチドを結合させて例えば構造依存性モノクロ ーナル抗体によるか、または、標識β２−ミクログロブリンとの結合により、従 来の生物化学的方法により検知される複合体を形成する。

（２）糖ペプチドが突然変異宿主細胞（例えばＲＭＡ−３およびＴ２細胞）の表 面上の空のＭＩＩＣ−１分子に結合した後にＣｌｌ０部分の発現を行なう。

次ｉ：ｃｌＩＯ部分をＭＣ２１０２（Ｇａ１２特異的）のようなＣｌｌ０特異的 モノクローナル抗体で検知する。

（３）　）ＩＩＩＣ−Ｉ特異的モノクローナル抗体を用いた糖ペプチドによる相 当するＭｒｌＣ−１拘束要素の上方調節。

（４）糖ペプチドのリサイクル能力（後述するセクション３「外部４１ｃｍ■結 合ペプチドを内在化後に細胞表面にリサイクルする」を参照）。

これらの検定を実施するためには、ｌｌｌＩＣクラス１分子を検知することので きる市販の抗体並びに特定の炭水化物を検知することのできる抗体を用いてよい 。後者の特定の例は炭水化物Ｇａ１ａを検知することのできる市販のモノクロー ナル抗体ＭＣ２１０２（Ｎｅｗ　Ｂｉｏｃａｒｂ、Ｌｕｎｄ。

Ｓｗｅｄｅｎ）である。

これらの操作は、以下に記載する方法で、所定のペプチドが１ｉｌｌｃクラス■ 分子により結合される能力を評価するために用いてよい。

まず、ペプチドにＧａｌ２が共有結合しているような糖ペプチドを合成する。次 に糖ペプチドの標的抗原提示細胞上のＭＩＩＣクラスＩ分子への結合能力につい て、そして、発現すべき炭水化物部分、即ち、特定の抗体により検知できるよう な部位にＧａ１２エピトープが位置するような構造で結合した炭水化物部分につ いて試験する。更に、相当するＭＩＩＣ−１制限要素の」三方調節は、抗組ＩＣ クラス■抗体と相互作用を示す抗原提示細胞の能力を測定することにより評価し てよい。

コンジュゲートの再生能力は糖ペプチドが内在化する３７℃で細胞を（結合コン ジュゲートとともに）インキュベートすることにより評価してよい。次に温度を 低下させ、細胞を蛋白分解酵素（例えばプロナーゼ）で処理して露出したペプチ ド／炭水化物コンジュゲートを分離除去してよい。再加熱の際には、再生された フンシュゲートは抗Ｇａ１４抗体を用いてＧａｌ、エピトープに対するプローブ 操作により検知してよい。

それ以後の試験では、コンジュゲートは免疫化実験で試験することができ、モし てＣＴＬの形成を刺激する能力について評価できる。

対照実験では、発生したＣＴＬを（炭水化物成分を含まない）ペプチド成分に対 して試験することにより、観察されるＣＴＬ刺激が炭水化物に関係することを示 すことができる（後述する「実験的試験系」参照）。

炭水化物成分 コンジュゲートの炭水化物部分は知られた方法で合成してよ（、そして好ましく は以下の炭水化物構造体から選択する。

（ａ）同じ部分が常時Ｔ細胞受容体に対して外部に露出するように標的細胞上で 安定的に発現する。

（ｂ）　Ｔ細胞受容体がｌｌｌＩＣ拘束と付着受容体とが独立してトリガーする ことができるように標的細胞上に高密度を有する。

（ｃ）全循環系への分泌を回避できるように高い膜結合性を有する。

可溶性炭水化物は、対照的に、末梢抑制性Ｔ細胞の誘導および保護免疫の発生の ブロッキングのために、問題を起こし易い。

標的細胞上の高い発現を有する炭水化物を選択することのもう１つの利点は、こ のような高い発現は膜内の二次的な変性をもたらす場合があり、これが露出した ＣＨＯエピトープの標的細胞特異性を増大させる点である。

炭水化物はＴ細胞がＣ１１０エピトープを包含することができるような大きさの ものでなければならない。好ましい大きさはペプチドの半分の長さであるが、本 発明のこれに限定されない。

単一の糖部分は除外されないが、好ましくは本発明のコンジュゲートの炭水化物 成分は少なくとも２つの連結した糖部分を含み、即ち、これは三糖類またはオリ ゴ糖であってよい。連結した糖部分の厳密な数は炭水化物構造体の免疫原的特異 性によるものであるが、３．４．５またはそれ以上の連結した糖部分が存在して よい。

好ましくは炭水化物成分の大きさの上限はＴ細胞受容体が炭水化物構造のエピト ープとクラスＩ制限要素を同時に包含することができるような大きさでなければ ならないという条件により決定される。

典型的な上限は１０個より多くない糖部分、好ましくは８個より多（ない糖部分 以下、最も好ましくは５個より多くない糖部分以下である。即ち好ましい範囲は 、１〜１０個、より好ましくは１〜８個、最も好ましくは１〜５個の糖部分であ る。これらの好ましい範囲の品名について、下限１個は所望により２．３．４ま たは５個に増大してよい。

個々の糖部分は好ましくはアルドペントース類、ケトペントース類、アルドヘキ ソース類およびケトヘキソース類から選択する。これらは直鎖または環状の形態 であってよく、所望により、酸化、還元、アミノ化、アセチル化またはこれらの 組合せにより誘導されていてよい。酸化には−Ｃ１１□０１１基１つ以上の−Ｃ ＩＩＯまたは−ＣＯＯＩ＋基への変換、並びに、−Ｃ１１０１１−基の−ｃｒｔ 、−基への変換が包含される。還元は逆の変換の何れも包含する。アルドペント ース類には、Ｄ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロースおよびＤ−リキ ソース並びにこれらの池の立体異性体、即ちＬ−異性体が包含される。アルドヘ キソース類には、Ｄ−アロース、Ｄ−アルドロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マン ノース、Ｄ−グロース、Ｄ−アイドース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−クロース 並びにこれらの他の立体異性体、即ちＬ−異性体が包含される。ケトペントース 類には、Ｄ−リブロースおよびＤ−キシルロース並びにこれらの他の立体異性体 即ちＬ−異性体が包含される。ケトヘキソース類には、Ｄ−サイコース、Ｄ−フ ラクトース、Ｄ−ソルボースおよびＤ−タガトース並びにこれらの別の立体異性 体、即ちＬ−異性体が包含される。環化する場合は、糖部分はαまたはβ配置に なることができ、そして（適切な場合は）ピラノースまたはフラノース形態にな ることができる。

最も好ましくは炭水化物成分は糖脂質および糖蛋白の炭水化物部分に通常みとめ られるものから選択される糖部分１個以上を含有する。これらには、β−Ｌ−フ コース（Ｆｕｃ）、β−Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）、β−Ｄ−Ｎ−アセチルガ ラクトサミン（Ｇａｌ　ＮＡＣ）、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｇｌｃ 　ＮＡＣ）、β−Ｄ−７ンノース（Ｍａｎ）、ノイラミン酸（Ｎｅｕ）およびシ アル酸（Ｓｉａ）が包含される。

グリコペプチドのプロポ／ガングリオ系のＣ■０部分に相当する炭水化物成分１ ；！更ニ、これらが殆ど膜結合性（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ） のものであり、分泌されないことから、適当な腫瘍標的の例である（Ｏｅｔｔｇ ｅｎ、　１９８９　；第６章「腫瘍関連抗原の一般的概念・その化学的、物理的 および酵素的な基礎」を参照）。

連結する隣接糖部分の型は厳密ではなく、即ち、連結はペントースの炭素原子１ 〜５個の何れか、そしてヘキソースの炭素原子１〜６個の何れかを用いて行なう ことができる。更に、連結はαまたはβであることができる。最も好ましくは、 連結には炭素原子３個および４が含まれ、β配置であるのが好ましい。

炭水化物成分およびペプチド成分は任意の好都合な方法でコンジュゲート（また は相互に共有結合）してよい。ペプチド成分がヒドロキシル基を有するアミノ酸 （即ちセリン、スレオニンまたはチロシン）を含んでいる場合、連結はＯ−グリ コシド結合を介して行なうことができる。ペプチド成分が（アスパラギンの場合 のように）−ＮＨ，側鎖を有するアミノ酸を含む場合、連結はＮ−グリコシド結 合を介して行なうことができる。

あるいは、連結には炭水化物成分とペプチド成分との間のいわゆる「スペーサー アーム」の導入を包含することができる。即ち、例えばペプチド成分が一３ｌ＋ 側鎖を有するアミノ酸（システィン）を含む場合は、炭水化物成分はｎが〉２好 ましくは２〜４である−（Ｃｎｌ＋２．）−０−結合を介して一３１１側鎖に連 結できる。

ペプチド／炭水化物コンジュゲート上の炭水化物成分の位置は好ましくは、ＭＩ ＩＣクラス■分子に結合する際に、炭水化物成分がペプチド結合溝中のほぼ中央 の位置を占めるように、そして炭水化物成分の少なくとも１部がＣＴＬに提示す ることができるような態様で溝から突出するように選択する。

コンジュゲートに適する炭水化物の例 ヒト腫瘍または感染性疾患に関連し、コンジュゲートに適する炭水化物構造体の 例を以下の表１に示す。記載した腫瘍は本発明のコンジュゲートの処置に対して 感受性を有する癌の種類の例である。

この記載の目的のためには、「炭水化物構造体」という用語は、例えばラクトン およびラクタムのような例示した炭水化物の誘導体を包含するものと理解された い。

表１ １、ヒト腫瘍関連炭水化物 １．１腫瘍の主なもの： Ｇａｌβ４ＧＩｃβ艶「　ラクトシルセラミド１．２黒色色素細胞腫： ＮｅｕＡｃａ８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４Ｇ１ｃβＣｅｒ　ＧＤ３９−（）−＾ ｃ−ＧＤ３ ＮｅｕＡｃａ８ＮｅｕＡｃα３（ＧａｌＮＡｃβ４）Ｇａｌβ４Ｇ１ｃβＣｅｒ 　ＧＤ２９−０−＾ｃ−ＧＤ２ これらのラクトン化された形態 １．３結腸癌および他の癌： Ｇａ１ＮＡｃα−５ｅｒ（ＴｈｒＸ糖蛋白）　Ｔｎ−抗原ＮｅｕＡｃｃｒ６Ｇａ ｌＮＡｃα−３ｅｒ（Ｔｈｒ）　シアリル＝Ｔｎ−抗原ＧａＬβ３ＧｌｃＮＡｃ 　ｌ型鎖 ＮｅｕＡｃａ３Ｇａｌβ３（Ｆｕｃａ４）ＧｌｃＮＡｃβ　シアリル−ルイスａ ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ３（Ｆｕｃａ４）Ｉ：ＮｅｕＡｃα６）Ｇ１ｃＮＡｃβ 　ジシアリルールイスａＧａｌβ３（ＦＬ）Ｃ（２４）ＧＩＣＮＡＣβＧａｌβ ３（ＦＬＩＣ（！４）ＧＩＣＮ八β　へ　２量体ルイスａＮｅｕＡｃａ３Ｇａｌ β４（Ｆｕｃａ３）ＧｌｃＮ＾β　シアリル−ルイスＸＧａ１β４（ＦＬＩＣ（ ２３）ＧＩＣＮＡＣβ３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）Ｇ１ｃＮＡｃβ　２量体ルイ ７．ｘＧａｌβ４（Ｆｕｃａ３）ＧｌｃＮ＾β３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃａ３）Ｇ１ ．ｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃａ３）ＧｌｃＮＡｃβ３量体ルイスＸ ＮｅｕＡｃａ３−２量体ルイスＸ ＮｅｕＡｃ　ａ　３−３量体ルイスＸ ＮｅｕＡｃ　ａ　６−オリゴマールイスＸシアリン酸の場合はこれらのラクトン 化された形態１．４肺癌および池の癌。

Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃβＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡ ｃβ　ルイスミールイスＸＦｕｃａ２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４（ＮｃｕＡｃ α３）Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒ　Ｆｕｃ−ＧｉｌｌＦｕｃ−ＧＭ　ｌのラクト ン化された形態１．５　Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫： Ｇａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒ　Ｇｂ３１．６乳癌： Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇ１ｃβＣｅｒ　 Ｆｕｃ−グロボペンタＴｎ−抗原 シアリルーＴｎ−抗原 上記のラクトン化された形態 ＮｅｕＡｃ　ａ　３Ｇａ　１β４ＧｌｃＢＣｅｒ　ＧＭ３Ｔ１３ ９−０−＾ｃ−ＧＤ３ ＧＤ２ これらのラクトン化された形態 ２．２黒色色素細胞腫（マウス） ラクトン化されたＧＭ３ ３、感染性の病原体に関わる炭水化物 Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ由来のマンナンＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ株由来の多糖類単離物Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｍａｊｏｒ 由来のりポホスホグリカンＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来 の〇−抗原多糖類４、　ＨＴＶに関わる炭水化物 Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４（Ｆｕｃａ３）Ｇ１ｃＮＡｃβ　ルイスｙＧａｌＮＡｃａ ３（Ｆｕｃα２）Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ　血液グループＡ。

ＮｅｕＡｃａ６ＧａｌＮＡｃα−３ｅｒ（Ｔｈｒ）　シアリルＴｎ抗原Ｇａ１Ｎ Ａｃａ−３ｅｒ（Ｔｈｒ）　Ｔｎ抗原コンジュゲートの好ましい特徴 炭水化物はＮ末端またはＣ末端で担体ペプチドに結合することができ、あるいは 、内部アミノ酸に結合することもできる。記載するとおり、内部結合が好ましい 。

また、上記した通り、ＭＩＩＣ分子のポケット内で結合する特異的係留アミノ酸 は種々のＭＩＩＣ分子に結合するペプチドに関する文献に定義されている。これ らの係留アミノ酸は好ましくは炭水化物構造体とのコンジュゲートには用いては ならない。

合成炭水化物は、高い、特異性を有する炭水化物エピトープを露出させるために は、担体ペプチドにコンジュゲートされる場合は高い水準の分子安定性を有さな ければならない。Ｔ細胞の最適なトリガーを行なうためには、コンジュゲート内 の炭水化物の部位は、Ｔ細胞受容体がＣｌｌ０エピトープ基を認識できるような 部位でなければならない。

更に、Ｃ１（０の大きさおよび部位は、ＴＣＲ，特に第３相補性決定領域（ＣＤ Ｒ３）による認識のために最適なものでなければならない。好ましい部位は糖ペ プチドの中央であるが、本発明はこれに限定されない。

ＣＨ２およびペプチドは最適なリンカ−要素を介してコンジュゲートしてよい。

このようなリンカ−要素は付加的なアミノ酸、例えばシスティンまたは、他の適 当な化合物であることができる。

実験的試験系 本発明のコンジュゲートの免疫原性は当該分野で知られる免疫化実験において試 験できる。Ｃ１１０特異性は「グリスクロス（十文字）」実験により分析でき、 八がペプチドであるようなコンジュゲートｒｃ１１０−＾」に応答するＴ細胞を 、Ｃｌｌ０−＾；ペプチドへのみ、　Ｃｌｌ０−Ｂ（Ｂは八とは異なるペプチド ）およびペプチドＢのみを用いて試験する。

例えばＣｌｌ０−＾に応答するＣＴＬはＣｌｌ０−８を提供する細胞も殺傷する がペプチドのみを提供する細胞は殺傷しない場合は、応答はＣｌｌ０−特異的で あると結論できる。更に、Ｔ細胞は糖脂質の形態のＣｌｌ０部分を発現する標的 細胞に対して試験してよい。

薬学的製剤 本発明のコンジュゲートは従来の剤型で投与できる。ワクチンの形態で投与する 場合は、１つ以上の適当な助剤を含有するのが好ましい。

本発明のペプチド／炭水化物コンジュゲートの投与により、細胞表面上の空のＭ ＩＩＣ分子にコンジュゲートが結合できることが解った。

このような結合は、糖ペプチドが実際には合成により前処理されているため、即 ち、処理されるために細胞質ゾルに侵入する必要がないために、可能になる。

あるいは、）ＩＩＩｃ分子への早期の結合を達成するためには、コンジュゲート は細胞質ゾルへの輸送を促進できるような構造中に組み込むことができる。この ような構造はリポソームまたは「免疫刺激複合体Ｊ　（ｉｓｃｏｌｌ）（ＩＩｌ ｏｒｅｉｎ等、１９８４）であることができる。

以下の実施例は本発明のコンジュゲートの合成を説明するものである。

実施例 １、　糖コンジュゲートの調製 １、】糖ペプチドの合成 糖ペプチドは例えばチオール基を有するペプチドに予備生成されたスペーサーア ームグリコシドを結合することにより合成できる。

即ち、システィン部分をペプチド配列中に導入し、システィンイオウ原子の親核 性を利用してペプチドと炭水化物部分にグリコシド結合により連結した親電子性 スペーサーアームとの間にチオエーテル結合を形成した。使用したスペーサーア ームは３−ブロモ−２＝ブロモメチルプロプ−１−イル（ＤＩＲ）　（Ｍａｇｎ ｕｓｓｏｎ等、１９８２）および２−ブロモエチル（Ｄａｈｍｅｎ等、１９８３ 　ｂ）基であった。この方法により、種々のエピトープおよび抗原決定基を示す 炭水化物を同じペプチド配列に結合させることが可能であった。ペプチド配列は 標準的なペプチド合成方法により作成し、コンジュゲートの前に生物学的活性に ついて検定した。即ちペプチド合成に必要な時間を最小限に維持した。

結合反応はジメチルスルホキシドまたはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中で行な った。

結合の前に、Ｎ、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−テトラブチルアンモニウムフロリドを用い てＤＩＲ基から臭化水素を除去した（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ等、１９８２）。得ら れたアリルプロミドをシスティン含有ペプチドと反応させた。未反応のアリルフ ロリドの生成のような副反応のために、この方法では使用された炭水化物誘導体 の過剰量を回収することはできなかった。

２−ブロモエチルグリコシドを用いた場合はプロモーターとして炭酸セノウムを 使用した（　Ｄａｈｍｅｎ等、１９８３　ｂ）。

結合に必要なＮ、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−テトラブチルアンモニウム７０リドまたは 炭酸セシウムの量は、使用するペプチド中に含まれるトリフルオロ酢酸に応じて 変化した。含まれるトリフルオロ酢酸の１は、ペプチドのバッチおよび構造によ り異なった。溶媒の選択および量はペプチドの溶解度特性により決定した。

結合反応は、ＩＩＰＬＣでモニターし、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水 を添加することによりクエンチングした。得られた糖ペプチドは調製用Ｈｒ’Ｌ Ｃで生成し、生成物の分子量はＦＡＢ　ＩＩＳで確認した。

飽和およびアリルプロミドの両方が未保護のペプチド中のシスティンチオールと 反応して主要生成物としてＳ−アルキル化ペプチドを生成することが報告されて いる。

Ｙａηｇ等（１９９１）は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド／ジメチルスルホキ シド／アセトニトリルの混合物中、ｐｌ＋６〜９でファルネシルプロミドにシス ティン含有オクタ−およびペンタデカペプチドを反応させることによりファルネ シル化ペプチドを調製している。Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンをプロモ ーターとして使用している。ｐ■１０〜１２でも排他的Ｓ−アルキル化が報告さ れている。

システィン含有ペプチドの選択的Ｓ−アルキル化もまた、種々のアルキル化剤、 例えば第１ブロモプロピル誘導体を用いてメタノール性またはエタノール性のア ンモニア中で行なわれている（Ｏｒ等、１９９１）。

１．２　スペサーアームダリコンドの合成（図１および２）結合に用いるスペー サーアームグリコシドの例は、ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（３’−シア リルラクトース）のＤＩＢβ−グリコシドおよび２−プロモエチルβ−グリコシ ド、Ｇａｌα４ＧａｌおよびＧａｌ菖α４ＧａｌβＧ１ｃＧの２−ブロモエチル β−グリコシドおよび、ｒＧＩＩ３ａラクタム」の２−ブロモエチルグリコシド （それぞれ化合物９．１５．２８．４８および５５）である。

３′−シアリルラクトースのＤＩＢβ−グリコシド（９）は２−トリメチルシリ ル２，３．６−トリー〇−アセチル−４−０−（２，３，４，６−テトラ−０− アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１）　 ０ａｎｓｓｏｎ等、１９８８）から１１段階で合成した。（１）を脱アセチル化 して（２）とし、これをイソプロピリデン化してベンジル化することにより、ベ ンジル保護３’、４’−０−イソプロピリデン全体的収率５１％でグリコジル受 容体（４）を得た。グリコジル供与体としてシアル酸メチルエステルのアセチル 保護α−キサンテート（５）　（Ｍａｒｒａおよび５ｉｎａｙ、１９８９）およ びプロモーターとしてジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフルオロメタン スルホネート（ＤＩＩＴＳＴ）を用いて一２３℃でアセトニトリル中ラクトース 誘導体（４）のグリコジル化（ｌｌａｒｒａおよび５ｉｎａｙ、　Ｌ９’ＩＱ） を行なうことにより、脱ベンジル化およびアセチル化の後に、収率１７，５％で 五糖類誘導体（６）を得た。（６）の精製の容易さおよび（６）の収率は、反応 生成物の未反応のヒドロキシル基のアセチル化を行なった後にベンジルエーテル の水素化分解を行なうことにより、僅かに改善できた。２−トリメチルノリルエ チルグリコンド（６）を変換して０ａｎｓｓｏｎ等、１９８８）相当する１β− アセテート（７）とし、これを３−ブロモ−２−ブロモメチルプロパン−１−オ ールのルイス酸触媒グリコジル化におけるグリコジル供与体として用い、収率４ ６％で保護βグリコンドを得た。メタノール性ナトリウムメトキシド、次いで水 性メタノール性水酸化ナトリウムによる（８）の脱保護により３′−シアリルラ クトースのＤＩＲβ−グリコシド（９）とし、■叶を除去して相当する２−ブロ モメチルプロブ−２−エン−１−イルグリコシドとした後に、ペプチドとの結合 のために用いた。

次に３＃−シアリルラクトースの２−ブロモエチルβ−グリコシド（１５）を５ 段階の反応によりラクトースのアセチル保護２−ブロモエチｔＬｔグリコンド（ ｌＯＸＭａｇｎｕｓｓｏｎ等、１９８２）から合成した。（１０）の脱アセチル 化により（１１）とし、これをイソプロピリデン化（Ｃａｔｅｌａｎｉ。

１９８８）　して８６％収率で３’、４’−０−イソプロピリデン誘導体（１２ ）とした。−６０℃で部分的ベンゾイル化０１ｕｒａｓｅ等、１９８９）　Ｌ、 次いで３’、４’−アセチルの加水分解により、３１％収率で２．６．６’−） ジ−０−ベンゾエート（１３）を得た。ラクトース誘導体（１３）をグリコジル 供与体としてキサンテート（５）およびプロモーターとしてメチルスルホニウム トリフルオロメタンスルホネート（ＭＳＴ）を用いながら一６０℃でグリコジル 化（Ｌｏｎｎおよび５ｔｅｎｖａ１１．１９９２）することにより保護された五 糖類誘導体（１４）を収率７５％で得た。８の場合のように脱保護することによ り９６％収率で２−ブロモエチルグリコシド（１５）を得た。

１．３実験 特段の記載が無い限りＩＩｌ−および１３Ｃ−ＮＩＩＲスペクトルはＶａｒｉａ ｎＧｅｍｉｎｉ　３００分光光度計を用いてそれぞれ３００Ｍ１ｌｚおよび７５ ＭｔｌｚでＣＤＣｌ３中で記録した。未重水化された溶媒からそれぞれ７．２５ および７７．０ｐｐ＋！で得られたシグナルを内部参照シグナルとして用いた。

旋光度はＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　２４１偏光計を用いて測定した。

薄層クロマトグラフィーはＭｅｒｃｋ　ＤＣ−Ｆｅｒｔｉｇｐｌａｔｔｅｎ（シ リカゲル６０Ｆｚｓｎ　０．２５ｍｍ）上で行ない、スポットは１０％硫酸を噴 霧し、次いで高温で焼くことにより、モして／または、モリブダトリン酸／Ｃｅ ５Ｏ，／希硫酸を噴霧し、次いで加熱することにより（Ｒｃｎａｕｄおよび５ｅ ｅｂａｃｂ、１９８６）可視化した。ＭａｔｒｅｘＴＭシリカＳｔ　Ｏ，３５〜 ０．１０１１を調製用クロマトグラフィーに用いた。

ＨＰＬＣは０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル／水の混合物を 用いてＢｅｃｋｍａｎ　Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　Ｃ−１８（４，５ｘ　１５０ ＋＋＋＋）カラム上でＢｅｃｋ＋ｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄクロマトグラ フィーシステムを用いて実施した。調製用実験のためには、Ｂｅｃｋａ＋ａｎ　 Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　Ｃ−１８（１０μ。

２１、２Ｘ　１５ｔｈｍ）カラムを用いた。クロマトグラムは２１４ｎｍでモニ ターしｔこ。

２−トリメチルシリルエチル２．３．６−１−リーＯ−アセチル−４−０−（２ ，３，４，６−テトラ−０−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ −グルコピラノシド（ＩＸＪａｎｓｓｏｎ等、１９８８）　（２９，４９。

４０ミリモル）を１５時間メタノール性ナトリウムメトキシド（５，８ｍＭ。

５１５Ｉｌ＋Ｌ）中で撹拌した。酢酸で中和し、蒸発させエタノールから結晶化 させて（２）　（１４，６９，８２％）を得た。

融点：１７５〜１７７℃；〔α〕。”：＋１８．５°（ｃｌ、０．水）’）Ｉ− ＮＭＲ（ＤｚＯ，（Ｃ１ｌｓ）ｓｓｉ（ＣＤ２）ｚｃＯＯＮａ）δ：　４．５１ （ｄ、　ＩＩｌ、　Ｊ＝８１１ｚ。

Ｈ−１ｚ４１−１′）、　４．４６（ｄ、　ＩＩｌ、　Ｊ＝７．５Ｈｚ、　ＩＴ −１／）Ｉ−１’）、　４．１０−３．５０（１３１１）。

３．３０（ｔ、１８．　Ｊ＝８．５１１ｚ）、　１．０９（ｔｄ、　１ｔＬ　Ｊ ＝１３．１３および６Ｈｚ、　ＣＪＩｚＳｔ）。

０．９８（ｔｄ、ＩＩｌ、Ｊ＝１３．　［３および５．５１１ｚ、　ＣＨｚＳｉ ）、　０．０４（ｓ、（ＣＩＩ３）ｘＳｉ）ｐ− ’　”Ｃ−ＮＭＲ（Ｃ２０，（ＣＨｓ）ｓｓｉ（ＣＤｚ）、Ｃ００Ｎａ）δ：　 １０５．７（Ｃ−１／Ｃ−１’　）。

１０４．２（Ｃ−１／Ｃ−１’）、８１．２．　７ｇ、２．　７７．６．　７７ ．４．　７５．７．　７５．４．　７３．８゜７１．４．　７１．２．　６３． ８．　６２．９．　２０．４（ＣＩＩ２Ｓｉ）、　０．４（（Ｃ１ｈ）ｓｓｉ） 　ｐｐｍ２．２−ジメトキシプロパン（２５０＊ｅ）中の化合物２　（１４，５ ９，３２，９ミリモル）に、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（１，６ｇ）を添 加した。混合物を１６５分間撹拌した。次にトリエチルアミン（Ｍ）を添加し、 混合物を蒸発させた。残存物（アセクールの混合物を含有する）を水性５％酢酸 （１００＊ｅ）て５０分間処理し、次に蒸発させて、ＴＬＣによれば、１種類の 主要生成物および痕跡量の第２の成分（おそらくは４’　、　６’−アセタール ）を得た。

粗生成物（１５，５９）の一部（１１，９ｇ、　２５．３ミリモル）を窒素下乾 燥Ｎ、Ｎ−ジノチルホルムアミド中に溶解した。水素化ナトリウム（６０％。

６、１６　ｑ　、　１５４　ミリモル）を添加し、混合物を１時間撹拌した。次 にベンジルプロミド（２１＋＋／、　１７７　ミリモル）を１５分間で添加し、 撹拌を１４時間継続した。メタノール、次いで水を添加することにより混合物を 後処理し、次にジクロロメタンと水との間に分配した。水相をジクロロメタンで １回抽出し、合わせた有機相を乾燥（硫酸ナトリウム）し、濾過し、蒸発させた 。クロマトグラフィー（トルエン−酢酸エチル）によりシロップ状物として化合 物３　（１５ｖ、　７３％）を得た。

〔α〕。２２．＋１６．５°（ｃｌ、２．　クロロホルム）＋１ｌ−ＮＩＩＲδ ：　７．４５−７．２５（２５ｕ、八ｒ−１１）、　５．０−４．３（１２１１ ，アノマーおよびベンジルのシグナル）、　４．１５−３．９０（４１１）、　 ３．８５−３．３０（１０１１）、　１．４２（５，３亀　Ｃｌｌ３）、１．３ ７（Ｓ、３Ｈ，Ｃｌｌ３）、１．１４−０．９７（ｓ、２Ｈ，ＣＨ！Ｓｉ）。

０、０５（Ｓ、（Ｃｌｌ３）３３１）　ｐｐＮ＋　３Ｃ−ＮＭＲδ：　１３９． ３．　＋３９．０．　１３８．８．　１３８．７．　１３８．６．　１２８．５ −１２７゜４゜１０９．９（（ＣＨｓＯｈＣ）、１０３．３（Ｃ−１／Ｃ−１’ ）、１．０２．０（Ｃ−１／Ｃ−１’　）、８３．１゜８２．０．　８０．７． 　７９．９．　７５．４．　７５．１．　７４．９．　７３．６．　７３．４． 　７３．２．　７２．０゜６ｇ、９．　６８．３４．　６７．３．　２７．８． 　２６．２．　１８．３（ＣＩＩｉＳｉ）、−１，７（（Ｃ１１３）３Ｓｉ）２ −トリメチルシリルエチル２，３．６−）ソー０−ベンジル−４−０−（２，６ −ジーＯ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシ ド（４） ８０％水性酢酸（Ｉｆ（ｍ’）中の化合物３（１４，９９，１５，９ミリモル） を３５分間８０℃で撹拌し、次に蒸発させた。クロマトグラフィー（トルエン− 酢酸エチル、４：１）により化合物４　（１２，３ｇ、　８６％）を得た。分析 用の試料をヘプタンから再結晶させた。

融点：９１１１．８〜１００．１℃、〔α〕Ｏ”　：　＋１５．６°（ｃ　１． ４．　クロロホルム）’　Ｈ−ＮＭＲδ　７．４５−２０（２５＋１．＾ｒ−１ ｔ）、　５．０５−４．５６（７１１）、　４．５０−４．３５（５Ｈ）、　４ ．１０−３．３０（１４＋１）、　２．５３（ｂｓ、Ｉｌｌ、　０ｉｌ）、　２ ．４５（ｂｓ、　ＩＩＩ、　０１１）。

１．１３−０．９７（ｍ、　２１１．　ＣＩＩｚＳｉ）、　（１，０４（ｓ、　 （Ｃ１１３）３ｓｉ）　ｐｐＩＩ”　Ｃ−ＮＭＲδ：　１３９．４．１３’１１ ．０．１３８．６．１３８．５．１３Ｂ、２．１２８．７−１２７．４゜１０３ ．３（Ｃ−１／Ｃ−１’）、　１０２．７（Ｃ−１／Ｃ−１′）、　８２．９． ８２．６．８０．１．７６．７゜７５．２．７４．１．７４．９．７３．５．７ ３．４６．７３．２．７２．８．６８．８．６ｇ、６．６８．４゜６７、４．１ ８．３（ＣＩＩｚＳｉ）、　−！、　７（（ＣＨ１３）３Ｓｉ）　＋３ｐｆｆ１ ２−トリメチルシリルエチル２，３．６−１−クー０−アセチル−４−０−＋２ ．４．６−　）リーＯ−アセチル−３−０−（メチル（５−アセトアミド−４， ７，８，９−テトラ−０−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α− Ｄ−ガラクトー２−ノヌロピラノシル）オネート〕−β−Ｄ−ガラクトピラノシ ル）　−β−Ｄ−グルコピラノシド（６）乾燥アセトニトリル（１１４＋＋１） 中の化合物４（８，８９，９，９ミリモル）、５　（２，９３９，４，９ミリモ ル）および粉末モレキュラーシーブ（３＾、１２ｇ）を−２３℃に窒素下冷却し た。この混合物に撹拌しながら、アセトニトリル（５０＋＋１）中のジメチル（ メチルチオ）スルホニウムトリフルオロメタンスルホネート（ｌａｒｒａおよび ５ｉｎａｙ、　１９９０）　（２５，７ミリモル）の溶液（５０１ｅ）を添加し た。反応混合物を２時間−２３℃で撹拌し、次にセライトで濾過し、飽和重炭酸 ナトリウム水溶液とジクロロメタンとの間に分配した。水相を一回ジクロロメタ ンで抽出し、合わせた有機相を乾燥（硫酸ナトリウム）し、濾過し、蒸発させた 。

クロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル／メタノール、３５　：　３５：１ ）により１種類の主要成分および２種類の少量の成分を含有する両分（１，９６ ９）を得た。１２時間無水酢酸／ピリジン（１：　１）中でアセチル化し、蒸発 させた後、得られた粗生成物を触媒として１０％Ｐｄ／Ｃ（酢酸５０ｍ１．支持 体ｇ当り１０％Ｐｄ／ＣＯ，７５９）を用いながら氷酢酸中４．５時間３５ｐｓ ｉで水素化分解した。濾過、蒸発およびクロマトグラフィー（トルエン／エタノ ール６：１）により得られた主要画分を上記した通りアセチル化した。クロマト グラフィー（トルエン／エタノール、１８：１→ＩＱ：１）により不定形の化合 物６（１，０９゜１７．５％）を得た。

〔α）、　”　：　−８，８°（ｃｌ、２．　クロロホルム）’　Ｆｌ−Ｎｉｌ Ｒδ：５．５４（ｄｄｄ、Ｉｌｌ、Ｊ＝９．５．５．０および２．５１１ｚ、Ｈ −８’）−５，３８（ｄｄ、Ｉｌ、Ｊ＝９．５および２．８１１ｚ、ｌｌ−７’ ）、５．１７（ｔ、ＩＩＩ、Ｊ＝９．５＋１ｚ。

Ｉｔ−３）、５．０８（ｄ、１１１．　Ｊ＝１０．５１１ｚ、Ｎｉ１）、４．９ ７−４．８２（４１１，ＩＨ２，Ｉト２’。

ｌｌ−４’、　１１−４’）、　４．６２（（１，Ｉｌｌ、　Ｊ＝８１１２．　 Ｉｔ−１’）、　４．５４−４．３７（４１１，特にｌｌ−P゜ １１−３’）、４．１８（ｄｄ、Ｉｌｌ、Ｊ＝１２および５．５＋１ｚ）、　４ ．１−３．８（Ｌｏｌｌ）、　３．８３（ｓ、ＣＨ３０）、３．６５−３．４９ （３＋１）、　２．５８（ｄｄ、ＩＩＩ、Ｊ＝１２．５および４．５１１ｚ、　 ｌｌ−３’ｅｋｖ、）、２．２３．　２．１５．　２．０７．２．０５．２．０ ３．２．０２．　２．０および１．８４（：／ングレソト、各々３１１．　Ｃｌ １３ＣＯ）、２．０６（３，６１１，２ＸＣＩＩ３ＣＯ）、１．６７（ｔ。

ＩＩ（、Ｊ＝Ｉ２．５１１ｚ、１１−３’ａｘ、）、１．０１−０．８１（ｍ、 ２１１．　Ｃ１１２Ｓｉ）、−０，０１５（ｓ。

（Ｃ１１３）ｓｓｉ）　ｐｌ）” ＩｓＣ−ＮＭＲ６：　１７１．２．　１７０．９（２Ｃ）、１７０．１１１．　 １７０．７．　１７０．５．　１７０．１゜１７０．０．　１６９．９４．　１ ６９．８８．　１６８．３（Ｃ−１’）、１０１．１（Ｃ−１／Ｃ−１’）、１ ００．０（Ｃ−１／Ｃ−１’）、９６．８（Ｃ−２’）、７６．４．　７３．６ ．　７２．５．　７２．０．　７＋、９．　７１．４゜７０．４．　６９．９． 　６９．３．　６７．７．　６７．４．　６７．３．　６６．９．　６２．３． 　６２．２．　６１．４゜５３．０（ＣＩＩｆｆＯ）、４９．０（Ｃ−５″）、 ３７．２（Ｃ−３”）、２３．０．　２１．３．　２０．７−２０．４゜１７． ７（Ｃ１１２Ｓｉ）、−１，８（（Ｃ１１３）３Ｓｉ）　ｐｐｍ元素分析値：　 Ｃ４ｏ１１ｙ２ＮＯ□ｇＳｉ理論値：　Ｃ５０，４：　１１６．２；　Ｎ１．２ 実測値：　Ｃ５０，３；　１１６．４；　Ｎ１．２１、２．３．６−テトラ−０ −アセチル−４−０−＋２．４．６−トリー〇−アセチル−３−〔メチル（５− アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−０−アセチル−３，５−ジデオキシー Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノンル）オネート〕−β−Ｄ −ガラクトピラノシル１−β−Ｄ−グルコピラノシド（７） 化合物６　Ｃ８Ｃ８４Ｏ，０，７２ミリモル）をトルエン（５，５鳳ｌ）および 無水酢酸（１，０６＋＋／）の混合物中に溶解した。この溶液にトルエン（２， ０４寓ｌ）中の三フッ化ホウ素ニーテレ−）　（Ｑ、３６璽１．２．９１ミリモ ル）の溶液（１，４５＋＋１）を添加した。反応混合物を１４０ｍ１撹拌し、次 にジクロロメタンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間に分配することにより後 処理した。水相を一回ジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を乾燥（硫酸ナ トリウム）し、濾過し、蒸発させて粗生成物（７）（８１５１９）を得た。メタ ノールから再結晶させて化合物７　（５８６諷９）を得た。母液をクロマトグラ フィー（トルエン／エタノール２０：１→１０：１）に付して更に（７）　（１ ５４厘９）を得た。（７）の収量は７４０関ｇ（９２％）であった。

ＮＭＲによれば、化合物は結晶化のメタノールを化合物（７）のモル当りメタノ ール０．５モルのモル比で含有していた。ＮＭＲによる検知によれば１−αエピ マーの５％未満が存在していた。

〔α〕。２２．　６．２°（ｃｌ、９．　クロロホルム）’　ＴＩ−Ｎ）ＩＲδ ：　５．６７（ｄ、　ｌ）１．　Ｊ＝８．５１１ｚ、　ｌｌ−１）、　５．５１ （ｄｄｄ、　ＩＩｌ、　Ｊ＝９．５゜４．５および２．５１１ｚ、ｌｌ−８’） 、５．４０（ｄｄ、ｉｌｌ、Ｊ＝９．５Ｔｌｚおよび２．５Ｈｚ。

Ｆｌ−７’）、　５．２２（ｔ、　ＩＨ，Ｊ＝９１１ｚ、　ｌｌ−３）、　５． ０８（ｄ、、１０．　Ｊ＝１０．５１１ｚ、　ＭＷ）。

５．０４（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝９．５および８．５Ｈｚ、Ｉｔ−２）、４．９６− ４．８３（３８，Ｈ−２’。

ト４′およびＩｔ−４’）、４．６５（ｄ、ＩＩＩ、Ｊ＝８１１ｚ、Ｉｔ−１’ ）、　４．５０（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ＝ＩＯ９５および３．５１１ｚ、　ｌｌ−３’ ）、　４．４２（ｄｄ、　ＩＩＩ、　Ｊ＝１２．５および２Ｈｚ、　Ｈ−９’） 。

４゜４２（ｄｄ、　Ｉｌｌ、　Ｊ＝１２．５および＜２　＋１ｚ、　Ｈ−６／Ｈ −６’）、　４．２０（ｄｄ、　１■、　Ｊ＝１２および５ｔｌｚ、　ｔｌ−９ ″）、　４．０８−３．８０（９Ｈ）、　３．８４（ｓ、　（ＪＩｓＯ）、　３ ．７５（ｄｄｄ。

Ｉｌｌ、　Ｊ＝１０．５および２Ｈｚ、　１１−５／ｌｌ−５′）、　３．６２ （ｄｄ、　Ｉｎ、　Ｊ＝１１および３１１ｚ。

１１−６／ｌｌ−６’）、　３．４５（ｄ、　１．５Ｒ，Ｊ＝５．５１１ｚ、Ｃ １ｌ、０１１）、　２．５７（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ＝１２．５および５１１ｚ、　 １１−３’ｅｋｖ、　）、　２．２４−１．８３（ＣＩ１３ＣＯシグナル）、　 １．６７（ｔ。

１）１．　Ｊ＝１２．５Ｈｚ、　Ｔｌ−３’ａｘ、）、　１．０９（ｑ、　０． ５Ｔ１．　Ｊ＝５．５ｔｌｚ、　（Ｃ１１ｓＯＩＩ））　ｐ垂■ ”Ｃ−Ｎｌ１Ｒ（クロマトグラフィーに付されたメタノール非含有物質について 測定）δ：　１７１．２．１７０．９．１７０．７．１７０．６６、１７０．６ １．１７０．５゜１６９．９４．　１６９．９．　１６９．８．　１６９．２． 　１６８．２．　１０１．０（Ｃ−１’）、９６．８（Ｃ−２’）。

９１．６（Ｃ−１）、７５．７．　７３．５．　７３．１．　７１．９．　７１ ．３．　７０．６．　７０．４．　６９．８゜６９．２．　６７．７．　６７． ２．　６６．７．　６２．０．　６１．８．　６１．５．　５３．２（Ｃｎ３０ ）、４９．０（Ｃ−５”）、３７．２（Ｃ−３’）、２２．９．　２１．３．　 ２０．７．　２０．６．２０．５．２０．５．　２０．４ｐｐ■ ３−ブロモ−２−ブロモメチルプロブ−１−イル２．３．６−１−ジー０化合物 ７（０，９６９，０，８６ミリモル）および３−ブロモ−２−ブロモメチルプロ パン−１−オール（＾ｎ５ａｒｉ等、　１９８７）　（１，５９，６，５ミリモ ル）を乾燥ジクロロメタン（３０＊ｉ’）に溶解し、次いで０℃に冷却した。三 フッ化ホウ素エーテレート（ｌ、９厘１．１５ミリモル）を添加し、混合物を４ ０分間０℃で撹拌した。冷却バスを取り外し、撹拌を５時間継続した。次に混合 物をジクロロメタンで希釈し、水冷飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。ジ クロロメタン相を乾燥（硫酸ナトリウム）し、濾過し、蒸発させた。クロマトグ ラフィー（トルエン／エタノール２０：１→１２・１）により不定形の化合物８ 　（５１２１９゜４６％）を得た。

〔α〕。！！、Ｑ、５°ｌｒ、２．６．　クロロホルム）’ＩＩ−ＮＭＲδ：５ ．５４（ｄｄｄ、ＩＩｌ、Ｊ＝９．５．５および２．５１１ｚ、　Ｔｌ−８’） 、　５．４０（ｄｄ、ＩＩｌ、Ｊ＝９．５および３１１ｚ、　Ｉｆ−７″）、５ ．１９（ｔ、ＩＨ，Ｊ＝９．５Ｈｚ、　Ｉｆ−３）。

５．０４（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝１０ｔｌｚ、ＮＯ）、４．９７−４．８２（４８）、 ４．６７（ｄ、１１１．　Ｊ＝８Ｈｚ。

１−１’）、４．５４−４．３７（４１１）、４．１９（ｄｄ、ＩＩｌ、Ｊ＝１ ２および５．５＋１ｚ、１１−９″）。

４．１（ｈ３．８０（ＩＯＨ）、３．８４（Ｓ、　ＣＦ＋３０）、３．６６−３ ．４２（８１ｆｌ）、２．５８（ｄｄ、ＩＨ。

Ｊ＝１２．５および４．５ｒｌｚ、　Ｔｌ−３ｅｋｖ、）、　２．３８−２．２ ２（ＩＩｌ、　Ｃｌ１（ＣＦｌｚＢｒｈ）、　２．２４（ｓ、　３１１）、　２ ．１６（ｓ、　３１１）、　２．１０（ｓ、　３１１）、　２．０８（ｓ、　６ １１）、　２．０７（ｓ、　３Ｈ）B ２．０６（ｓ、　６１１）、　２．０４（ｓ、　３Ｈ）、　２．００（ｓ、　３ Ｈ）、１．８５（ｓ、　３８）、　１．６８（ｔ。

１８、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、　Ｒ−３’ａｘ、）　ｐｌ）ｍ＋３Ｃ−ＮＩＩＲ６： １７１．１．　１７０．９４．　１７０．９．　１？０．７．　１７０．６．　 １７０．６゜１７０．５．　１７０．０．　１６９．９７．　１６９．７．　１ ６９．８．　１６６．２（Ｃ−１’）、１０１．１゜１００．８．９６．８（Ｃ −２’）、　７６．２．７３．１．７２．７．７２．０．７１．６．７１．３． ７０．４゜６９．６．６９．２．６９．１．６７．７．６７．２．６６．８．６ ２．１．６１．４．５３．０（ＣＨ３０）。

４７、０（Ｃ−５″）、　４２．４（Ｃ１ｌ（ＣＨＪｒ）ｚ）、　３７．２（Ｃ −３’）、　３２．７（（ＪＩｔＢｒ）、　３１．６（Ｃ１２Ｂｒ）、　２２． ９．２１．３．２０．７．２０．５．２０．４．２０．４　ｐｐｍ３−ブロモ− ２−ブロモメチルプロピル４−０−　＋３−０−　［ナトリウム（５−アセトア ミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクトー２−ノヌロビラ ノシル）オネート〕−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）　−β−Ｄ−グルコピラノ シド（９）化合物８　（３８４１１９，０，３０ミリモル）をメタノール性のナ トリウムメト＋　シＦ　（０，０３Ｍ、　６０＊ｉ’）中に溶解し、−夜撹拌し た。水（１００μＬ）を添加し、混合物をシリカで中和し、濾過し、濃縮した。

クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／水、６５：５３：６）により 不定形の化合物９　（１８ｈｖ、　７４％）を得た。

〔α）ｏ”ニー３．４°（ｃＯ，３，メタノール）１■−ＮＭＲ（ＣＬＯＤ）δ ：　４．４４（ｄ、ｉｌｌ、　Ｊ＝８１１ｚ、　ｌｌ−１／１１−１’　）、　 ４．３１（ｄ。

１８、　Ｊ＝８１１ｚ、　ＩＴ−１／１１−１’）、　２．８６（ｄｄ、ＩＩＩ 、　Ｊ＝１２．５および３．５１’ｌｚ、　）Ｉ−３’ｅｋｖ、、　実質的に結 合）、　３．４３−２．３１（ｍ、ＩＩＩ、　Ｃｌ１（ＣＩｌｔＢｒ）ｚ）、　 ２．０２（ｓ。

３８、ＮＣ０ＣＨ５）、１．７３（ｂｔ、Ｉｌｌ、　Ｊ＝＋２．５１１ｚ、　Ｉ ｔ−３’ａｘ、、　実質的に結合）ｐｐｍ ”Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ、００）δ・１７５．５．　１７４．９．　１０５．１（Ｃ −１／Ｃ−１’）、１０４．６（Ｃ−１／Ｃ−１’）、　１０１．１（Ｃ−２’ ）、　５４．０（Ｃ−５’）、　４４．４（Ｃｌｌ（Ｃ１ｌＪｒ）ｚ）、　４２ ．１（Ｃ−３’）、３３．９（Ｃ１ｂＢｒ）、３３．７（Ｃｔ１２Ｂｒ）、２２ ．７（ＮＣＯＣＩＩｓ）　ｐ１１’Ｄａｈｍｃｎ等（１９８３，ｂ）の方法に従 って２−ブロモエチル４−〇−（２，３，４，６−テトラ−０−アセチルーβ− Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−１−ジ−０−アセチルーβ−Ｄ−グル コビラノンド（０，１７モル）を調製した。粗生成物をメタノール性ナトリウム メトキシド（１０，０１Ｍ、ＩＬ）中に溶解し、３時間撹拌した。混合物をシリ カで中和し、濾過し、濃縮した。クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノ ール／水、６５・２０：３）およびエタノールからの結晶化により化合物１１　 （３７ｇ、　５１％）を得た。

融点：　１５１〜１５２℃ 盲ＩＩ−ＮＭＲ（Ｃ２０，アセトン）δ：４．５７（ｄ、ＩＩｌ、　Ｊ＝８．０ １１ｚ、　ｌｌ−１）、４．４５（ｄ、　ＩＩｌ、　Ｊ＝８１１ｚ、　ｌｌ−１ ’）、　４．２６−４．１９（ｍ、　ＩＩＩ、　０ＣＩＩｚＣＨＪｒ）、　３． ９８（ｄｄ。

ＩＨ，Ｊ＝＋２．５およびｌ１ｌｚ、　Ｉｆ−６／Ｉｔ−６’）、　３．９３（ ｄ、　ｉｌｌ、　Ｊ＝３．５＋１ｚ、　ｎ−４’）。

３．５５（ｄｄ、ＩＩｌ、Ｊ＝１０および８１１ｚ、ｌｌ−２’　）、３．４０ −３．３０（ｍ、ＩＩｌ、Ｈ−２）００ｍ ＋３Ｃ−ＮＭＲ（Ｃ２０，アセトン）δ：１０５．７（Ｃ−１’）、１０４．９ （Ｃ−１）、　７５．５（Ｃ−２’）、　７３．７（Ｃ−２）、　７１３（Ｃ− ４’）、　６３．８（Ｃ−６／Ｃ−６’）、　６２．９（Ｃ−６／Ｃ−６’）、 　３３．９（ＣｌｌＪｒ）　ｐｐｍ２−ブロモエチル４−０−（３，４−０−イ ソプロピリデン−β−Ｄ−２．２−ジメトキシプロパン（８００冒ｌ）中の化合 物１１　（３５９，７８ミリモル）およびｐ−トルエンスルホン酸（１，５９， ８ミリモル）の混合物を１時間５０℃で、次いで一夜室温で撹拌した。トリエチ ルアミン（１２ｍｌ、　８０ミリモル）を添加し、混合物を３０分間撹拌し、濃 縮し、トルエンとともに蒸発させ過剰のトリエチルアミンを除去した。粗生成物 をメタノール／水（１０：　１．９００ｍｊりに溶解し、２時間還流下に加熱し た。飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）を添加し、混合物を濃縮した。フ ラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン、 １０・１：０．Ｏｌ）およびエタノールからの結晶化により化合物１２　（３２ ，７９，８６％）を得た。

融点：１７１〜１７２℃：〔α）、”：＋１１．１°（ｃＯ，７，クロロホルム ）’Ｈ−ＮＭＲ（ｏ２ｏ、アセトン）δ：　４．５６（ｄ、ｌｔｌ、Ｊ＝８１Ｔ ｚ、■−１）、４．４９（ｄ、　Ｉｎ、　Ｊ＝８．５Ｈｚ、　Ｉｆ−１’）、　 ４．３７（ｄｄ、　ｉｎ、　Ｊ＝５．５および１．５１１ｚ、　１１−４’）。

３．５１（ｄｄ、　ＩＦｌ、　Ｊ＝８および８．０１Ｔｚ、　Ｉｔ−２’）、　 ３．３６（ｄｄ、　Ｉｌｌ、　Ｊ＝９．０および８１１ｚ、　Ｈ−２）、　１． ５５（ｓ、　３１１．　ＣＨ３）、　１．４０（５，３ｒｌ、　ＣＩ’＋３）　 ｐｐｍ”Ｃ−Ｎ）ＩＲ（Ｃ２０，アセトン）δ：１１３．７（（Ｃ１ｌｓ）ｚｃ ）、１０４．９（Ｃ−１／Ｃ−１’）、　８１．４（Ｃ−５）、　８１．３（Ｃ −３’）、　７７．５（Ｃ）１２Ｃ１１２Ｂｒ）、　７７．０（Ｃ−３）。

７６．５（Ｃ−４’　）、　７６、２（Ｃ−５’　）、　７５．５（Ｃ−２／Ｃ −２’　）、　６３．５（Ｃ−６／Ｃ−６’　）。

６２、８（Ｃ−６／Ｃ−６’　）、　３３．８（Ｃ１ｌ、（Ｊ１２Ｂｒ）、　２ ９．９（Ｃ１１３Ｃ）、　２８．１（ＣＩＩ３Ｃ）　ｐｐｍ元素分析値：　Ｃ１ ７１１２＠Ｂｒａｔ　１理論値：　Ｃ４１，７；　ｎ　６．０ 実測値：　Ｃ４１，５；　［６，０ イル−β−Ｄ−がラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド化合物１２（ ９，０９，１８，４ミリモル）を乾燥ピリジン（６０ｍｌ）とジクロロメタン（ １５０＋＋１）の混合物に溶解し、−５０℃に冷却した。乾燥ジクロロメタン（ １５０ｗｊり中のベンゾイルクロリド（１０，５ｍ４９０．６ミリモル）を３時 間で滴下添加し、混合物を更に１時間撹拌した。次にメタノールを添加し、溶液 を濃縮した。残存物をジクロロメタン（５００，１）に溶解し、塩酸水溶液（２ Ｍ、　２５０ｓ＋ｊ’）　、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２５０＋＋１）　、 飽和塩化ナトリウム水溶液（２５０輿／）で洗浄し、乾燥（硫酸ナトリウム）し 、濃縮した。粗生成物を８０％酢酸水溶液（２５０ｍ／）に溶解し、３０分間８ ０℃で撹拌し、濃縮した。クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール、 ３０：１）により不定形の化合物１３．（４，３９，３１％）を得た。

［α］Ｏ”：＋１５．８°（ｃｌ、０．　クロロホルム）’ＩＩ−ＮＭＲδ：　 ８．２４−８．０２（ｍ、１５１１．＾ｒ−１１）、　５゜１９（ｄｄ、ＩＩＩ 、　Ｊ＝９．５および８Ｈｚ、Ｌ２）、４．８４（ｄｄ、Ｉｌｌ、Ｊ＝１２．　 Ｏおよび１．５１１ｚ、ｌｌ−６／Ｉ＋−６’　）。

４．６６（ｄｄ、ＩＩＩ、　Ｊ＝１２および３．５１１ｚ、　ｌｌ−６／Ｉｆ− ６’）、　４．６４（ｄ、Ｉｌｌ、　Ｊ＝８１１ｚ。

＋１−１）、　４．４８（ｄｄ、ＩＩＩ、　Ｊ＝１２．０および６１１Ｚ、　Ｉ ｔ−６／Ｉｔ−６’）、　４．３７（ｄｄ、ＩＨ。

Ｊ＝１２および９１１ｚ、　ｌｌ−６／ｌｌ−６’）、　４．３５（ｄ、ｌｉｔ 、　Ｊ＝８１１ｚ、　＋！−１’）　ｐｐｍ嘗３Ｃ−ＮＭＲδ：＋６６．８．＋ ６６．６．１６５．５．１０４．１（Ｃ−１’）、１０１．０（Ｃ−１）。

８１．７．７３．５．７３．２．７３．１．７３．０２．７２．９６．７０．８ ．６９．６．６ｇ、９．６４．１（Ｃ−６／　Ｃ−６’　）、６３．９（Ｃ−６ ／　Ｃ−６’　）、　２９．６（ＯＣＩＩ２ＣＩ１２Ｂｒ）　ｐｐ’元素分析値 　Ｃ３５１１１７Ｂｒ０１４　：理論値：　Ｃ５５，２：　１１４．９ 実測値・　Ｃ５５，２；　１１４．９ ２−ブロモエチル２．６−ジー〇−ベンゾイル−４−０−１６−０−ベンゾイル −３−０−［メチル（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−０−アセチ ル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクトー２−ノヌロピラノ ンル）オネート〕　−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）　−β−Ｄ−グルコピラノ シド（１４）アセトニトリルおよびジクロロメタンの混合物（９：４９，８履ｌ ）中の化合物１３　（２００Ｉｌｏ、　０．２６ミリモル）　、５　（２６３厘 ９．０．４４ミリモル）および粉末モレキュラーシーブ（３＾、　３００＋＋ｖ ）をアルゴン下で１時間撹拌した。トリフルオロメタンスルホン酸銀（１１８諺 ９．０．４５ミリモル）を添加し、反応混合物を一６０℃に冷却した。ジクロロ メタン中メチルスルフェニルプロミド（ＤａｓｇｕｐｔａおよびＧａｒｅｇｇ、 　１９８ｇ）（３，４８Ｍ、　１２６４μＬ、　０．４４ミリモル）を５分間で 滴下添加し、次いで混合物を１時間撹拌した。ジイソプロピルアミンＣ０，１ｍ １．２．６ミリモル）を添加し、撹拌を０．５時間継続した。混合物を０℃に戻 し、濾過し、濃縮した。クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール、５０ ：１）により不定形の化合物１４　（２４０ｖ、　７５％）を得た。

〔α〕ゎ”：＋１４．９°（ｃｌ、０．　クロロホルム）’　ｌ’１−ＮＩＲδ ：５．３３（ｔ　ｌ■、　ｔ＋−８’）、　５．２８（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ’８． ０１１ｚ、　ＩＩ−７’）。

５．２６（ｄｄ、ＩＩＩ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、Ｈ−２）、５．０３−４．９３（■ 、２亀　■−４’、１１−６／＋１−６’）、　４．７４（ｄｄ、　ＩＩＩ、　 Ｊ＝１２および３．５１１ｚ、　！＋−６／Ｉｔ−６’）、　４．７０（ｄ、　 ｌｔｌ。

Ｊ＝８１１ｚ、　）Ｉ−１）、　４．５９（ｄ、ＩＬ　Ｊ＝８Ｔｌｚ、　Ｈ−１ ’）、　４．５０（ｄｄ、ＩＩｌ、　Ｊ＝１２および６１１ｚ、　Ｈ−６／ｌｌ −６’）、　２．７０（ｄｄ、　ＩＩ、　Ｊ＝１３．０および４．５１１ｚ、　 Ｈ−３’ｅｋｖ、　）（ＩＩ−３，ｌｌ−２’およびＨ−４′は１４のアセチル 化後に低磁場シフトした。）”Ｃ−ＮＩＩＲδ：１７０．７．１７０．４．　Ｌ ７０．３．１７０．１．１７０．１．１６８．Ｌ（Ｃ−１’。

ＪＣ−１″−１１−３″ａｘ＝６．　ｌ１ｌｚ）、１６６、６．　＋６６、１． 　１６５．４．　１０４．４（Ｃ−１’　）。

＋０１．１（Ｃ−１）、　９７．６（Ｃ−２’）、　８２．２．７６．４．７３ ．４．７３．０．７２．９．６３．４゜６２．４（Ｃ−６，Ｃ−６’、Ｃ−６’ ）、５３．２（ＣＩ＋３０）、４９．６（Ｃ−５″）、３７．６（Ｃ−３’）。

２９．６（ＯＣｒ１２ＣＩＩＪｒ）、２３．１（ＮＣＯＣｌｌ３）、２１．０． 　２０．７．　２０．６．　２０．５　ｐｆ：Ｉｌ１元素分析値：　Ｃ５５１１ ６４ＢｒＮＯ２ｓ　：理論値：　Ｃ５３，５＋　Ｈ５，２ 実測値：　Ｃ５３，５：　ＩＩ　５．５２−ブロモエチル４−０−　＋３−０− 　（ナトリウム（５−アセトアミド−３，Ｓ−′）デオキシ−Ｄ−グリセロ−α −Ｄ−ガラクトー２−ノヌロピラノシル）オネート〕−β−Ｄ−ガラクトピラノ シル１−β−Ｄ−グルコピラノシド（１５） 化合物１４（２００ｕ、　０１１６ミリモル）をメタノール性ナトリウムメトキ シド（０，０３Ｍ、　５０ｓ＋ｅ）に溶解し、６時間撹拌した。水（５０μＬ） を添加し、混合物を５時間撹拌し、シリカで中和し、濾過し、濃縮した。

クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／水、６：４：１）により不定 形の化合物＋５　（１１８ｍ９．９６％）を得た。

〔α〕。２２．　（１９°（ε１．０．水）＋１ｌ−ＮＩＩＲ（Ｄ２０．　アセ トン）δ：４．５７（ｄ、ＩＪｌ、Ｊ＝８＋１ｚ、Ｌｌ／Ｉｔ−１’）。

４．５４（ｄ、１）１．　Ｊ＝８゜５１１ｚ、　ｌｌ−１または＋１−１’）、 　２．７７（ｄｄ、　ＩＩｌ、　］＝１２．２および４゜３１１ｚ、　ｌｌ−３ ｃ”）、　２．０３（ｓ、　３）１．　ＮＣＯＣｌｌ５）、　１．８１（ｂｔ、 　１）１．１ｌ−３ａ’）”　Ｃ−ＮＩＩＲ（Ｄ２０．　アセトン）δ：１７７ ．０．　＋７６．７．　１０５．６（Ｃ−１’）、１０５．１（Ｃ−１）、　１ ０２．８（Ｃ−２″）、　５４．７（Ｃ−５”）、　４２．７（Ｃ−３’）、　 ３４．０（ＯＣＩＩｔＣＩＩｚＢｒ）。

２５、０（ＮＣＯＣｌｌ５）　ｐｌ）ｍ２−ブロモエチル４−０−（α−Ｄ−ガ ラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２８） ２−ブロモエチル２．３．６−トリー〇−アセチル−４−０−（２，３゜４．６ −テトラ−０−アセチルーα−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラ ノシド（２７）　（Ｄａｈｍｅｎ等、１９８３　ａ、　ｐＨ６）を相当するオク タアセテート（Ｄａｌｖｅｎ等、１９８３　ｇ、　ｐＨ３）　（１，２５９，ア ノメリヅク混合物）の三フッ化ホウ素エーテレート触媒グリコシド化により調製 した。粗生成物をメタノール（２０＋＋／）に懸濁し、メタノール性ナトリウム メトキシド（０，２Ｍ、４　ｍｌ）を添加した。透明な溶液が３０分後に得られ た。反応混合物を更に３０分間撹拌し、次にシリカで中和した。濾過、蒸発およ びクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／水、６５：３５：６）によ り化合物２ｇ（３３５ｍｖ、　４１％）を得た。

〔α〕。”：＋６９°（ｃｌ、ｏ、メタノール）’ＩＴ−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ） δ：特に４．７６（ｄ、ｌｉｔ、Ｊ＝２１１ｚ、　Ｈ−１’　）、　４．１５（ ｄ。

Ｉｌｌ、　Ｊ＝７Ｈｚ、　Ｈ−１）、　４．０！１（ｂｔ、１１．　Ｊ＝６Ｈｚ ）、　３．９２（ｄｔ、　Ｊ＝１１．５および６．５Ｈｚ）　ｐｐｍ ＋３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３０口）δ：１０５．２．１０２．５．７９．２，７６． ２．７４．６．７２．７゜７１３、７１．１．７（１，７，６２，７，６１，１ ，３０，９ｐｐｍ１３Ｃ−ＮＭＲ（ｏ、ｏ、対照物質３３．１９ｐｐ鴇７七トン ）δ：　１０５．９．１０３．２゜８Ｑ、（１，７ｇ、１．７５．２．７３．８ ．７３．７．７３．１．７２．１．７２．０．７１．６．６３．５゜６３．０． ３４．　ｌ　ｐｐ＋ｅ 元素分析値：　Ｃ＋　＋２４．Ｂｒ０１１　：理論値：　Ｃ３７，４，１１５， ６ 実測値Ｉ　Ｃ３７，１；　Ｉｔ　５．９２−ブロモエチル４−０−　（４−０− α−Ｄ−ガラクトピラノシルーβ−Ｄガラクトピラノシル）β−Ｄグルコピラノ シド（４８）２−ブロモエチル２．３．６−１−リーＯ−アセチル−４−０−（ ２，３，６−トリー〇−アセチル−４−０−（２，３，４，６−テトラ−０−ア セチルーα−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−β− Ｄ−グルコピラノシド（５３）　（Ｄａｈｍｅｎ等、１９８４．３５ｍｇ）を１ ６時間０．１Ｍ、メタノール性ナトリウムメトキシド１０ｗ１中で撹拌すること により脱アセチル化した。シリカゲルで中和し、濾過し、蒸発させ、クロマトグ ラフィー（クロロホルム／メタノール／水、６５：３５：６）に付し、次いでミ クロ濾過および凍結乾燥することにより４ｇ（１ｇ、６■９．９０％）を得た。

〔α］、”　：　＋５１’　（ｃ　１．０．水）’Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ、Ｏ，参照物 質２．２４ｐｐｍアセトン）δ：４．９６（ｄ、　ｉｌｌ、　Ｊ＝４Ｈｚ、　ｌ ｌ−１’）、　４．５７（ｄ、　ＩＩｌ、　Ｊ＝８．０ｆｌｚ、　ｎ−１／Ｈ− １’）、　４．５２（ｄ、　ＩＩｌ、　Ｊ＝７．５Ｈｚ、　ｎ−１／ｌｌ−１） 、　４．３７（ｂｔ、　ＩＩＩ）、　４．２７−４．１９（ｍ、　ＩＩＩ、　Ｃ １ｌ、ＣＩ＋、Ｂｒ）。

４、０９−３゜５５（＋９１１）、　３．３６（ｂｔ、　１ｌｌ）　ｐｐＨ”Ｃ −ＮＭＲ（Ｄ２０．参照物’ｌｔ　３３．１９ｐｐ＋ｍアセトン）δ：　１．０ ６．２（Ｃ−１／ｃ−Ｄ、　＋０５．１（ｃ−１／ｃ−１’）、　１０３．３（ ｃ−１’）、　８１．６．８０．３．７ｇ、４．７７．８゜７７．３．７５．７ ．７５．１．７３．９．７３．８．７３．０．７２．１．７１．肌７１．５．６ ３．５゜６３、３．６３．０．３３．９（ＣｌｌＪｒ）　ｐｐ！１ＧＭ、ラクタ ムの２−ブロモエチルグリコシド（５５）標題化合物の相当するデカアセテート （Ｒａｙ等、　１９９２）　（４０１１９，１ａ／ｌβ、１：２．２）を７時間 室温で９．５ｍＭメタノール性ナトリウムメトキシド中脱０−アセチル化した。

シリカゲルで中和し、蒸発させ、クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノー ル／水、６５：３５：６）に付し、化合物５５　（２６ｍｇ、定量的）を得た。

’ＩＩ−ＮＭＲ（ＤｚＯ，（Ｃ１１ｓ）ｘｓｉ（ＣＤｚ）ｚｃＯＯＮａ）δ：特 に３．３７（ｂｔ、　ＬＨ）、　２．６１（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ＝１３および６Ｆ ｌｚ、　ｎ−３’ｅ）、　２．０５（ｓ、　３１１．　ＮＣ０Ｃｎ５）、　１． ７１（ｄｄ。

ＩＬ　Ｊ＝１１および１３１１ｚ、　Ｉ＋−３’ａ）　ｐｐｍセリン側鎖側でＯ −グリコジル化されたペプチドは固相ペプチド合成法により合成した。Ｇａｌα ４Ｇａｌの０−アシル化β−チオグリコシドを用いたセリン（アミノ基およびカ ルボキシ基でそれぞれ、９−フルオレニルメトキシ力ルポニルーおよびペンタフ ルオロフェニル誘導体で保護されている）をグリコジル化することにより０−グ リコジル化セリン誘導体を得た。これらの誘導体を固相ペプチド合成で用いた。

樹脂から分離しＩＩＰＬＣにより精製した後、得られたグリコペプチドはアシル 誘導体として炭水化物部分でまだ保護されていた。塩基触媒を用いて完全な脱保 護を行ない、生成物をＩＩＰＬｃで精製した。生成物のＦＡＢ−ｉｔｓデータは 理論値と合致していた。

４　ＫＩＡＳＮＥＮＭＤＡＩｉＥＳＳＴＬＥＣ（１６）　（Ｄｂ−拘束）５　Ｋ ｒＡＳＮＥＮＭＥＴＭＥ　（１７）　（Ｄｂ−拘束）６　ＫＡＳＮＥＮＭＥＴＭ Ｃ（１８）　（Ｄｂ−拘束）７　ＣＡＳＮＥＮＭＥＴＭ　（１９）　（Ｄｂ−拘 束）８　Ｃ３ＧＰＳＮＴＰＰＥＩ　（２０）　（Ｄｂ−拘束）９　５ＧＶＥＮＰ ＧＧＹＣＬＴ　（２６）　（Ｄｂ−拘束）２１　＾ＳＮＥＮｈＥＴＭ　（３２） 　（Ｄ”−拘束）２２　＾５ＮｈＮ１１ＥＴ闘　（３３）　（Ｄｂ−拘束）２３ 　５ＧＰＳＮｈｌ’ＰＥ１　（３４）　（Ｄｂ−拘束）２４　５ＧＰｈＮＴＩ’ ＰＥｌ　（３５）　（Ｄｂ−拘束）＋３　ＣＲＧＹＶＹＱＧｌ、　（３６）　（ Ｋｂ−拘束）１４　ＣＡＰＧＮＹＰＡＬ　（３７）　（Ｋｂ−拘束）２５　ＲＧ ＹｈＹＱＧＬ　（３８）　（Ｋｂ−拘束）２６　ＦＡＰＧｈＹＰＡＬ　（３９） 　（Ｋｂ−拘束）１０　ＫＱＩＡＳＮＥＮＭＥＴＩＩＥＳＣ（Ｄｂ−拘束）１１ 　ＫＧＦＳＮＴＰＰＥＩＣ（Ｄ”−拘束）１２　ＫＳＧＰＳＮＴＰＰＥＨＩＣＣ Ｄｈ−ｔｆＵ束）３　ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ　、　（ＩＩＬＡ−Ａ２−拘束）１５ 　ＭＶＶＫＬＧＥＦＹＮＱｉｌＭ　（ＩＩＬＡ−Ａ２−拘束）１６　ＣＰＴＮＱ ＱＶＶＬＥＧＴＮＫＴＤ　（ＩＩＬＡ−Ａ２−拘束）１７　ＭＱＩＲＧＦＶＹＦ ＶＥＴ　（ＩＩＬＡ−Ａ２−拘束）１８　ＬＳＰＧＭＭＭＧＭＦＮＭ　（ｌ比＾ −＾２−拘束）（ｈ＝ホモシスティン） グリコペプチドの調製のために用いる方法Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ ０μＬ）中の３−ブロモ−２〜ブロモメチルプロプ−ニーイルグリコシド（１０ マイクロモル）およびＮ、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−テトラブチルアンモニウムフロリ ド（４０−１００マイクロモル）のスラリーをアルゴン下で１０分間撹拌した。

Ｎ、Ｎ−ジメチルホルム７　ミＦ　（ＤＭＦｔ　タハシｌ　チルス／ｌｚホキシ Ｆ（ＤＩＩＳＯＸ２００−１００ｏμＬ神に溶解したペプチド（８マイクロモル ）を添加し、混合物を５分間超音波処理し、次に１．５〜２，５時間撹拌した。

反応はｌｌＩ’Ｌｃでモニターした。混合物を０．１％１−リフルオロ酢酸水溶 液で希釈し、凍結乾燥した。調製用＋１ＰＬＣ（アセトニトリル／水１０．１％ トリフルオロ酢酸）により所望のグリコペプチドを得た（表２参照）。

ペプチド（５マイクロモル）をアルゴン下Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ ０μＬ）中の２−ブロモエチルグリコシド（１０マイクロモル）および炭酸セシ ウム（２０−１００マイクロモル）のスラリーに添加した。

混合物を５分間超音波処理し、次に１〜５時間撹拌した。反応をＨＰＬＣでモニ ターし、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で希釈し、凍結乾燥した。調製用ＨＰ ＬＣ（アセトニトリル／水１０．１％トリフルオロ酢酸）により所望のグリコペ プチドを得た（表２参照）。

ペプチドおよび合成されたグリコペプチドはトリフルオロメタンスルホネー［・ 塩として存在する。

プロモーターとして炭酸セシウムを使用する方法の外に、ペプチドコンジュゲー ト２４はＯｒ等の方法でも調製した。両方の反応混合物のＩＩＰＬＣ分析によれ ば同じ保持時間を有する主要生成物のピークが認められた。しかしながら、プロ モーターとして炭酸セシウムを用いた場合、より明確な反応とより容易に精製さ れる生成物が得られた。

Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（３５μＬ）中の化合物９　（２，９ｍ９．３． ４マイクロモル）および＋１．　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−テトラブチルアンモニウムフ ロリド（９，８ｍ９．３０．６マイクロモル）のスラリーをアルゴン下１０分間 撹拌した。ジメチルスルホキシド（３５０μＬ）中に溶解したペプチド１６（８ ，１１９、２，７マイクロモル）を添加し、混合物を５分間超音波処理し、その 後１．５時間撹拌した。反応はＩＩＰＬｃ　（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液 中０〜４０％アセトニトリルの勾配、２０分間）でモニターした。混合物を０． １％トリフルオロ酢酸水溶液で希釈し、凍結乾燥した。調製用１（ＰＬＣ（０， １％トリフルオロ酢酸水溶液中１７％アセトニトリル）により化合物２１（１肩 ９，１１％）を得た。

保持時間（分析実験）・アリルプロミド（９より）：１０．７分；２１：１４． ２分；１６：１５．８分 コンジュゲート２２ Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１３０μし）中の化合物９　（１１ｍｇ、　１ ２．９マイクロモル）およびＮ、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−テトラブチルアンモニウム フロリド（３７ｍｇ、　１１６マイクロモル）のスラリーをアルゴン下１０分間 撹拌した。

ジメチルスルホキシド（７５０μＬ）中に溶解したペプチド１７　（２０ｍｐ。

１０．２マイクロモル）を添加し、混合物を５分間超音波処理し、その後２．５ 時間撹拌した。反応はＩＩＰＬｃ　（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜４ ０％アセトニトリルの勾配、２０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリ フルオロ酢酸水溶液で希釈し、凍結乾燥した。調製用１１１’ＬＣ（０，１％ト リフルオロ酢酸水溶液中１４％アセトニトリル）により化合物２２（３１１９， １０％）を得た。

保持時間（分析実験）：アリルプロミド（９より）：１０．７分；２２：１３． ０分：　１７：１４．３分 コンジュゲート２３ Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０Ｂ　Ｉ、）中のＮ、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ− テトラブチルアンモニウムフロリド（３９肩ｑ、１２４．０マイクロモル）で化 合物９（１３ｍ９．　１５．５マイクロモル）を処理し、ジメチルスルホキシド （６００μＬ）中のペプチド１８　（２０ｍｖ、　１２．０マイクロモル）を添 加し、混合物を５分間超音波処理し、その後２．５時間撹拌した。反応はＩＩＰ Ｌｃ　（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中Ｏ〜４０％アセトニトリルの勾配、 ２０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で希釈し 、凍結乾燥した。調製用１１ＰＬｃ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中１２％ アセトニトリル）により化合物２３　（８１９，２９％）を得た。

保持時間（分析実験）　＋２３：１２．２分、　１８　：　１３．５分コンジュ ゲート２４ アルゴン下、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（５５０μＬ）中の化合物１５（１ ０１１９，１３，６マイクロモル）および炭酸セシウム（１１，５麿９．３５． ２マイクロモル）のスラリーにペプチド１９（１０＋＋ｖ、　６．８マイクロモ ル）を添加した。混合物を５分間超音波処理し、その後５時間撹拌した。

反応はＩＩＰＬｃ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリ ルの勾配、３０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶 液で希釈し、凍結乾燥した。調製用＋１ＰＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶 液中１２〜１５％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物２４（８，５纏 り、５９％）を得た。

保持時間（分析実験）：１５：８．７分；　２４　：　１８分；　１９　：　１ ９．３分Ｏｒ等（１９９１）の方法によるコンジュゲート２４の調製化合物１５ 　（８ｕ、　１０．５マイクロモル）およびペプチド１９（２ｕ。

１．４マイクロモル）をアルゴン下乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（４００ μＬ）に溶解した。溶液をアンモニウムで飽和させ、１．５時間撹拌した。反応 はｌ＋１’Ｌｃ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０２６アセトニトリ ルの勾配、３０分間）でモニターしたところ、主要ピーク（５２％）が方法Ｂで 調製した化合物と同じ保持時間（１８分）に認められた。

コンジュゲート２５ アルゴン下、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（５００μＬ）中の化合物１５（９ 履ｑ、　１２．０マイクロモル）および炭酸セシウム（３９履９．１２０マイク ロモル）のスラリーにペプチド２０（＋０１１９．６．０マイクロモル）を添加 した。化合物を５分間超音波処理し、その後１時間撹拌した。反応はＩＩＰＬｃ （０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリルの勾配、３０分 間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で希釈し、凍結 乾燥した。調製用１１ｒ’Ｌｃ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中１３〜１８ ％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物２５（１４１９、６０％）を得 た。

保持時間（分析実験）：１５：８．７分、　２５　：　２０．５分：　２０　： 　２１．７分コンジュゲート２９ アルゴン下、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１，６ｍｌ、）中の化合物２８（ ３１，６属ｐ、　７０．３マイクロモル）および炭酸セシ’ｙム（１１０，３ｍ ｇ、　３３８マイクロモル）のスラリー（こペプチド２０（２０，５薦ｑ、　１ ２．３マイクロモル）を添加した。化合物を５分間超音波処理し、その後３時間 撹拌した。反応はＩＩＰＬＣ（０，１％　ｌ−リフルオロ酢酸水溶液中０〜３０ ％アセトニトリルの勾配、３０分間）でモニターし、０．１％トリフルオロ酢酸 水溶液で希釈し、凍結乾燥した。調製用＋１１’ＬＣ（０，１％トリフルオロ酢 酸水溶液中１３〜１８％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物２９（１ ７６す、７０％）を得た。

保持時間（分析実験）、２８・６．２分、２ｑ；２ｍｇ分：　２０　：　２１． ８分コンジュゲート３０ ペプチド２６　（＋０１９．６．５マイクロモル）をアルゴン下Ｎ、Ｎ−ジメチ ルホルムアミド（８０Ｔｏｌ）中に溶解した。化合物２８　（Ｉｌ、７＋＋ｇ、 　２６マイクロモル）および炭酸セシウム（２１，２＋＋ｖ、　６５マイクロモ ル）を添加した。混合物を５分間超音波処理し、そのｉ＆２時間撹拌した。反応 Ｉｔｎｒ’ＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中Ｏ〜３０％アセトニトリル の勾配、３０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液 で希釈し、凍結乾燥した。調製用＋１ＰＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液 中で１３〜１８％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物３０（１１，２ 厘９．９０％）を得た。

保持時間（分析実験、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中Ｏ〜３０％アセトニト リルの勾配、３０分間）：２８：６．２分、　３０　：　２１．５分；　２６　 ：　２４．４分 コンジュゲート３１ ペプチド１９（＋５＋＋ｖ、　１０マイクロモル）をアルゴン下Ｎ、Ｎ−ジメチ ルホルムアミド（１，２１７’）中に溶解した。化合物２ｇ　（１８ｍ９．４０ マイクロモル）および炭酸セシウム（７６，２１９，２３４マイクロモル）を添 加した。

混合物を５分間超音波処理し、その後２時間撹拌した。反応はＩＩＰＬｃ（０， １％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリルの勾配、３０分間）で モニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で希釈し、凍結乾燥し た。調製用１１ｒ’Ｌｃ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中１３〜１８％アセ トニトリルの勾配、３０分）により化合物３０（１３，８１９゜７５％）を得た 。

保持時間（分析実験）：２１１１：６．２分：　３１　：　１７．７分、　１９ 　：　１９．１分コンジュゲート４０ ペプチド３８　（］Ｏｍｙ、　７．６マイクロモル）をアルゴン下Ｎ、Ｎ−ジメ チルホルムアミド（０，８肩１）中に溶解した。化合物２８　（１３，７１９， ３０，５マイクロモル）および炭酸セシウム（２４，８１１ｇ、　フロマイクロ モル）を添加した。混合物を３０分間超音波処理し、そのｌ＆１時間撹拌した。

反応はＨＰＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中Ｏ〜４０％アセトニトリル の勾配、３０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液 （１６＠Ｉ）で希釈し、凍結乾燥した。調製用１１Ｐ１．Ｃ（０，１％トリフル オロ酢酸水溶液中１６〜２１％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物４ ０　（１６，６ｔｇ、　５２％）を得た。

保持時間（分析実験）−２８・６７分、　４０　：　１８．８分；　３８　：　 ２１分コンジュゲート４１ ペプチド３９（１０ｍｇ、８マイクロモル）をアルゴン下Ｎ、Ｎ−ジメチルホル ムアミド（０，８ｍ１）中に溶解した。化合物２８　（１４，３＋ｗｇ、　３２ マイクロモル）および炭酸セシウム（２７，６１１９，８５マイクロモル）を添 加した。混合物を１５分間超音波処理し、その後６５時間撹拌した。反応はＨＰ ＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜４０％アセトニトリルの勾配、３ ０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（ｌｆｌｕ ｌ）で希釈し、凍結乾燥した。ｍ生成物を、５ｍ＋９および６りのペプチドから 同様にして調製した２つの別のバッチと合わせた。

合わせた物質の調製用＋１ＰＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中１９〜２ ４％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物４１（２３，７■す、８５％ ）を得た。

保持時間（分析実験）：２８：６．７分；　４１　：　２２．２分；　３９　： ２４．３分コンジュゲート４２ ペプチド３６（５履ｖ、３．６マイクロモル）をアルゴン下Ｎ、Ｎ−ジメチルホ ルムアミド（０，４＊Ｉり中に溶解した。化合物２８　（６，４ｍｑ、　１４． ３マイクロモル）および炭酸セシウム（１１６冒９．３５．７マイクロモル）を 添加した。混合物を５分間超音波処理し、その後２時間撹拌した。

反応はｎＰＬｃ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中１７〜２２％アセトニトリ ルの勾配、３０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶 液（８＋ｃ／）で希釈し、凍結乾燥した。調製用＋１ＰＬｃ　（０，１％トリフ ルオロ酢酸水溶液中１７〜２２％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物 ４２（７，１籾、純度９５％＝５２％）を得た。

保持時間（分析実験）：２８：６．２分、　４２　：　２６．４分：　３６　： 　２７．６分コンジュゲート４３ ペプチド３７（１０関９．７．３５マイクロモル）をアルゴン下Ｎ、Ｎ−ジメチ ルホルムアミド（０，８ｍ／）中に溶解した。化合物２ｇ　（１３，２ｍ９．２ ９．４マイクロモル）および炭酸セシウム（２３，ｈｇ、　７３．４マイクロモ ル）を添加した。混合物をＩＩＰＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中５〜 ３５％アセトニトリルの勾配、３０分間）でモニターした。混合物を０．１％ト リフルオロ酢酸水溶液（１６＠Ｉ）で希釈し、凍結乾燥した。調製用１１ＰＬＣ （０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中１７〜２２％アセトニトリルの勾配、３０ 分）により化合物４３（９，３厘９．７３％）を得た。

保持時間（分析実験）：２８：６．２分：　４３　：　２４．６分：　３７　： 　２５．９分コンジュゲート４４ ペプチド３２（ｔｏ真９．８マイクロモル）をアルゴン下ジノチルスルホキシド ル）および炭酸セシウム（２６ｍｖ，　８０マイクロモル）を添加した。混合物 を１０分間超音波処理し、その後１時間撹拌した。反応はＨＰＬＣ（０．１％ト リフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリルの勾配、３０分間）でモニタ ーした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（　１６ｓｃ／）で希釈し、 凍結乾燥した。粗生成物をペプチド１０票９から同様に調製した別のバッチと合 わせた。合わせた物質の調製用ＨＰＬＣ（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中７ 〜１２％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物４４　（１４１９．　５ ４％）を得た。

保持時間（分析実験）　：２８：６．２分．　４２　：　１４．６分；　３２　 ：　１６．８分コンジュゲート４５ ペプチド３４　（１０１９．　６．８マイクロモル）をアルゴン下Ｎ，Ｎ−ジメ チルホルムアミド（０．　Ｔｏｅ）中に溶解した。化合物２８（１１．２ｍｇ， 　２５マイクロモル）および炭酸セシウム（２０．２＋＋ｇ．　６２マイクロモ ル）を添加した。混合物を１０分間超音波処理し、その後２時間撹拌した。反応 はＩＩＰＬＣ（０．　１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリル の勾配、３０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液 （　１６＠Ｉ）で希釈し、凍結乾燥した。調製用ｎＰＬｃ（０．　１％トリフル オロ酢酸水溶液中１３〜１８％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物４ ５（７．９籾，６３％）を得た。

保持時間（分析実験）：２８：６．２分；４５・２０．５　：３４　：　２５． ２分コンジュゲート４６ ペプチド３５　（１０＋＋ｇ．　６．７マイクロモル）をアルゴン下Ｎ，Ｎ−ジ メチルホルムアミド（０．　８＊Ｉり中に溶解した。化合物２ｇ（１２．ｂ＋ｖ ．　２７マイクロモル）および炭酸セシウム（４３．　７冨９．　１３４マイク ロモル）を添加した。混合物を２０分間超音波処理し、その後４時間撹拌した。

反応はＩＩＰＬｃ（０。１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリ ルの勾配、３０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶 液（１６＠Ｉ）で希釈し、凍結乾燥した。調製用１１ＰＬｃ（０．　１％トリフ ルオロ酢酸水溶液中１３〜１８％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物 ４６　（１７．４＋＋ｖ．　５６％）を得た。

保持時間（分析実験）　：２８：６．２分：　４６　：　２１．０分；　３５　 ：　２３．８分コンジュゲート４７ ペプチド３３　（ＩＯｍｖ．　８マイクロモル）をアルゴン下ジノチルスルホキ シド（０．８真ｌ）中に溶解した。化合物２８（１４．５＋＋ｇ．　３２マイク ロモル）および炭酸セシウム（２６１９．　８０マイクロモル）を添加した。混 合物を１０分間超音波処理し、その後１時間５５分撹拌した。反応はＩＴＰＬＣ （０．　１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリルの勾配、３０ 分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（　１６＋＋ １）で希釈し、凍結乾燥した。粗生成物を、５りおよび１０＠９のペプチドから 同様にして調製した２つの別のバッチと合わせた。

合わせた物質の調製用Ｈｒ’ＬＣ（０．　１％トリフルオロ酢酸水溶液中１０〜 １５％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物４７　（１８．ｈｇ．　５ ９％）を得た。

保持時間（分析実験）　：２８：６．２分；　４７　：　１８．３分；　３３　 ：　２０．　６分コンジュゲート４９ ペプチド２６　（１５ｕ，　９．８マイクロモル）をアルゴン下Ｎ，Ｎ−ジメチ ルホルムアミド（　１．　２１１）中に溶解した。化合物４８（２３．８＋＋ｇ ，　３９マイクロモル）および炭酸セシウム（３１．９１１９．　９８マイクロ モル）を添加した。混合物を１０分間超音波処理し、その後１時間５０分撹拌し た。

反応はＩＩＰＬＣ（０．　１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニト リルの勾配、３０分間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水 溶液（２４＠ｌ）で希釈し、凍結乾燥した。調製用＋１ＰＬＣ（０．　１％トリ フルオロ酢酸水溶液中１３〜１８％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合 物４９　（１７．８厘９．８８％）を得た。

保持時間（分析実験）　＋４８＋１０．２分：　４９　：　２１．　９分：　２ ６　：　２４分コンジュゲート５０ ペプチド３２　（１５＋＋ｇ．　２１．　１マイクロモル）をアルゴン下ジメチ ルスルホキシド（０．　６ｍ／）とＮ．Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６＋＋ １）の混合物中に溶解した。混合物を１分間超音波処理した。化合物４８（２９ ．６■９，４８マイクロモル）および炭酸セシウム（３９，４１１９，１２１マ イクロモル）を添加した。混合物を１５分間超音波処理し、その後１時間５０分 撹拌した。反応はＨＰＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセ トニトリルの勾配、３０分間）モニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢 酸水溶液（２４厘／）で希釈し、凍結乾燥した。粗生成物をペプチド５ｍｇから 同様に調製した別のバッチと合わせた。合わせた物質の調製用１１ＰＬＣ（０， １％トリフルオロ酢酸水溶液中７〜１２％アセトニトリルの勾配、３０分）によ り化合物５０（１４，３■９．７４％）を得た。

保持時間（分析実験）　：　４８：　Ｉｏ、１分：５０：　１５．２分：２６： 　１６．１１１分ペプチド１９（１５ｇｇ、　１０マイクロモル）をアルゴン下 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（０，４ｍ１）中に溶解した。化合物５５（６厘 す、８．３マイクロモル）および炭酸セシウム（５６１９，１７２マイクロモル ）を添加した。

混合物を１０分間超音波処理し、その後２時間撹拌した。反応はＨＰＬＣ（０， １％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリルの勾配、３０分間）で モニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で希釈し、凍結乾燥し た。調製用１１ＰＬｃ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中ｌＯ〜１４％アセト ニトリルの勾配、３０分）により化合物５１（８，２＋＋ｖ。

４５％）を得た。

保持時間（分析実験’）　：５５：１３．０分；　５２　：　２０．３分：　１ ９　：　２１．３分コンジュゲート５２ ペプチド２０（５１，３マイクロモル）をアルゴン下Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムア ミド（０，４厘ｌ）に溶解した。化合物５５　（４，３ｓ＋ｖ、６マイクロモル ）および炭酸セシウム＜３１ｗｑ、　１１４マイクロモル）を添加した。

混合物を５分間超音波処理し、その後３時間４５分撹拌した。反応はＦＩＰＬＣ （０，１％トリフルオロ酢酸水溶液中０〜３０％アセトニトリルの勾配、３０分 間）でモニターした。混合物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（８ｍｌ）で希 釈し、凍結乾燥した。粗生成物をペプチド５厘９から同様に調製した別のバッチ と合わせた。合わせた物質の調製用ＨＰＬＣ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液 中１３〜１８％アセトニトリルの勾配、３０分）により化合物５２（９，３１， ６５％）を得た。

保持時間（分析実験’）　：５５：１３．０分；　５２　：　２２．７分；　２ ０　：　２３．６分表　２ ９＋１６　Ａ　ＤＭＳＯ，１００ＯμＬ”、１．５ｈ　２１　１１　１ｒＰＬＣ ｃ９＋１７　＾　ＤＭＳｏ、　７５０μＬａ、　２．５ｈ　２２　１０　ｆｌＰ Ｌｃｃ９＋１８　Ａ　ＤｌｌＳｏ、５００μＬ”、２．５ｈ　２３　２９　１ｒ ｐＬｃｃ、［Ｍ＋Ｒ］＋１９４３’１５＋１９　Ｂ　ＤＭＦ、４００μＬ”、５ ｈ　２４　５９　１ＴＰＬｃｃ、［Ｍ＋ＦＩ］＋１７８８’１５＋２０　Ｂ　Ｄ ＭＦ、４００μＬｂ、Ｉｈ　２５　６０　ＨＴ’ｌｆ’、（ｌＩ＋ｌＩ］＋１７ ６１ｄ２８＋２０　Ｂ　ＤＩｌＦ、１３００．ｃｚＬｂ、３ｈ　２９　７０　Ｈ ＰＬＣｃ、（ｉｌｌ）＋１４６９’２８＋２６　Ｂ　ＤＭＦ、　６１５７ｚＬｂ 、２ｈ　３０　９０　ｒｌＰＬｃｃ、（Ｍ＋ｌｌ）＋１５６４’２８＋１９　Ｂ 　ＤＭＦ、　６００μＬｂ、３ｈ　３１　７５　１１ＰＬＣｃ、［１１＋ＩＩ） ＋１４９７’２８＋３８　８　ＤＩＩＦ、　５２５μＬｂ、１．５ｈ　４０　５ ２　１１ｒ’Ｌｃｃ、ＣＭ＋ｒｌ）＋１３４２’２ｇ＋３９　Ｂ　ＤＭＦ、５０ ０μＬｂ、１．３ｈ　４１　８６　ＨＰばΣ、〔電＋Ｆｌ）＋１３２枦２８＋３ ６　８　ＤＩＩＦ、　５６０μＬｂ、２．１ｈ　４２　９５　１ｒＰＬＣ”、Ｃ Ｍ＋Ｉｌ］＋１４２６’２８＋３７　Ｂ　ＤＭＦ、　５４５μＬｂ、　１．７５ ｈ　４３　７３　１１ＰＬＣｃ、［Ｍ＋Ｉ＋］＋１２７３’２ｇ＋３２　Ｂ　Ｄ ＭＳｏ、５００ＩＩＬｂ、１．２ｈ　４４　５４　１１ＰＬＣｃ、（Ｍ＋Ｉｌ） ＋１３８０’２８＋３４　Ｂ　ＤＭＦ、　５９０μＬｂ、２．２ｈ　４５　６３ 　ＦＬＣ’、［１１＋Ｉ＋）＋１３８２’２ｇ＋３５　８　ＤＩＩＦ、６００μ Ｌｂ、４．３ｈ　４６　５６　ｔｔＰＬｃ”、［Ｍ＋Ｈ］＋１３９６ｄ２ｇ＋３ ３　Ｂ　ＤＭＳｏ、５００μＬｂ、２．１ｈ　４７　５９　１’［ＰＬＣｃ、Ｃ Ｍ＋Ｈ）＋１３８２ｄ４８＋２６　Ｂ　ＤＭＦ、　６１２μＬｂ、２ｈ　４９　 ８８　ＨＰＬＣｃ、［ｉｌｌ＋１７２６’５５＋１９　Ｂ　Ｄ）ＩＦ、　２０（ ｌμＬｂ、２．２ｈ　５１　４５　１１ＰＬＣ’、［Ｍ＋ＩＩ］＋１７６９ｄ５ ５＋２０　Ｂ　ＤＭＦ、　６６５μＬｂ、３．８ｈ　５２６５１ｎ’Ｌｃ’、［ ｌｌ＋ｎ）＋１７４１ｄ３μＬ／１０ミリモルペプチド ５μＬ１５マイクロモルペプチド Ｃ生成物は全場合においてペプチド出発物質より早（流出し、炭水化物出発物質 より遅く流出した。

’　ＦＡＢ−ＭＳデータは理論値と一致した。

２．９量体合成ペプチドを用いた免疫化によるウィルス特異的ＣＴＬのｉｎ　ｖ ｉｖｏ−次誘導 ２．１．方法 本発明の新しいコンジュゲートを用いた免疫化による細胞障害性Ｔリンパ球（Ｃ ＴＬ）のｉｎ　ｖｉｖｏ−次誘導を、９！ｌＬ体合成ペプチドの免疫化によるウ ィルス特異的ＣＴＬのｉｎ　ｖｉｖｏ−次誘導について後述するものと同様の方 法で行った。

インフルエンザＡウィルス感染細胞中で生産された内因性９量体に相当する予備 プロセシングされた合成ペプチドによるマウスのワクチン注射により強力な一次 ＣＴＬ応答が得られた。発生したＣＴＬは効果的にウィルス感染標的細胞を殺傷 し、免疫化に用いたペプチドと同一のアミノ酸配列を有するウィルス株で特に良 好であった。−次ｉｎ　ｖｉｖｏ　ＣＴＬ応答のための最適条件は、ペプチド１ ００ｕをＩＦＡに溶解し尾部基底部に皮下注射した場合に得られた。７〜ＩＯ日 間にプライミングしておいた牌細胞を最適低ペプチド濃度（０，０５＋＋ｌｌ） を用いて５日間ｉｎ　ｖｉｔｒｏで再刺激し、ウィルス感染およびペプチド投与 された標的細胞に対して試験した。ペプチド誘導ＣＴＬは１ＩＩＩｃクラス■拘 束であり、ＣＤ８陽性であった。

ペプチド ペプチド＾ＳＮＥＮＭＥＴＭ　（ｐｅｐ９（ＰＨ１）と命名；ＳＥＱ　ＮＯ：１ ）およびＡＳＮＥＮＭＤＡｌｌ　（ｐｅｐ９（ＮＴ６０）と命名、　ＳＥＱ　Ｉ ｌｌ　ＮＯ：４の残基３〜１１）をそれぞれインフルエンザＡウィルス株Ａ　／ ＰＲ／　８　／３４およびＡ／ＮＴ／６０／６８のＮＰ３６６−３７４から得た ｏ　ｐｅｐ９（ＰＨ１）は＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａペ プチド合成器（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｎ＋ｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｆｏ ｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ＾）を用いて合成した。ｐｅｐ９（ＮＴ６０）は固相 「チーバッグＪ　（ｈｏｕｇｈｔｅｎ。

１９８５　；　Ｓａｌｌｂｅｒｇ、１９９１）を用いて合成した。全てのペプチ ドは逆相ｎＰＬにより生成し、プラズマ脱着質量分析によりアミノ酸組成を分析 した。ペプチドの貯蔵液をＰＢＳ中に調製し、−２０℃で保存した。

免疫化 尾部基底部へのＩＦＡ中に溶解した遊離の合成ペプチド各ｔｏｏｇｇの単回皮下 注射、または、ＰＢＳ中に希釈したインフルエンザＡウィルス２０１１＾Ｕの単 回静脈内注射によりマウスを免疫化し、免疫化後１〜２週間で使用した。

インフルエンザＡウィルス特異的ＣＴＬのｉｎ　ｖｉｔｒｏ発生免疫胛細胞を細 胞懸濁液に調製した。蒸留水１１当りＮｌｌ＜Ｃｊ’　８．２９９、ＫＨＣＯ， １，Ｏｑ　５ＥＤＴ＾Ｑ、　０３７２　ｑを含有する溶解緩衝液（ｐＨ７、４） を用いて赤色細胞を溶解した。ｉｎ　ｖｉｖｏ２プライミングしたマウスに由来 する５Ｘ１０＠個の応答した肺細胞を２５ＸＩＯ’照射（２０００ｒａｄ）同系 間の仲細胞とともに、インフルエンザＡウィルスに感染した状態で、または００ ５．０．５および５ｐＭのペプチドの存在下、５０ｍ１容の組織培養マウス：７ （Ｃｏｓｔａｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ＾）中で、完全培地１ｈｌととも に、５日間３７℃で、５．３％ＣＯ□を含有する湿潤空気中で同時培養した。

細胞障害性検定 前に報告されているとおり（Ｊｏｎｄａｌ、　１９７５）　、ウィルス感染した 、またはペプチドでコーティングされた標的細胞は、２　Ｘ　１０’個の細胞を ３２０１１＾Ｕウイルスに１５時間感染させることにより調製するか、または３ ７℃で１．５時間５ｈＭペプチドとともにインキュベートした。

洗浄１＆、細胞を１時間ＮＦ３２　”ＣｒＯ４１００〜１００１１Ｃｉテ標識し た。細胞を二回洗浄し、ＳｈＬ中１０４個の標的細胞を、９６穴■底プレート中 完全培地１５ｈＬ中で検定するまえに３回洗浄しておいたエフェクター細胞の種 々の数の１０ｈＬに添加し、４時間３７℃５．３％Ｃ０２でインキュベートシた 。インキュベート後、上澄み５０ＩＩＬを採取し、特異的６１（ｒ放出の比率を 以下の式：％特異的放出＝（実験−自発）／（最大−自発）ｃｐ■により計算し た。自発放出は常時１５％未満であった。

２．２．結果 ９量体による抗インフルエンザへウィルス特異的ＣＴＬの一次ｉｎ　ｖｉｖ。

Ｉ誘導 既に報告されているとおり（Ｔｏｖｎｓｅｎｄ等、　１９８５．　１９８６）　 １ｍ−２ｂマウスにおける肛インフルエンザＡウィルスで誘導したＣＴＬは主に 免疫優性ＮＰ３６５−３８０エピトープに対抗している。我々は先ず、ＰＢＳお よびＮＴ６０の両方の株から誘導されたペプチドＮＰ３６５−３８０を用いてマ ウスを免疫化し、＾１ｃｈｅｌｅ等（１９９０）の記載した方法に従ってＣＴＬ 応答を誘導した。しかしながら、ブーストを反復したにもかかわらず、ペプチド コーティングされた細胞およびウィルス感染細胞の何れに対しても殺傷活性は顕 著ではなかった。一方、より短いｐｅｐ９（ＰＢＳ）１００ｎを用いて皮下注射 を行い肺細胞をｐｅｐ９（ＰＢＳ）　５　ｐＨでｉｎ　ｖｉｔｒｏで再刺激した 場合、ウィルス感染標的細胞は殺傷されなかったものの、ｐｅｐ９（ＰＢＳ）で コーティングされたＲＮＡ（示さず）およびＥＬ４細胞に対する強いＣＴＬ応答 が見られた（表３）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏの再刺激のためにより低い濃度のｐｅｐ ９（ＰＢＳ）を用いた場合は、発生したＣＴＬはｐｅｐ９（ＰＢＳ）コーティン グされた標的細胞に対してより高い殺傷活性を有しており、そしてウィルス感染 細胞もまた溶解した（表３）。表３に示すとおり、免疫化のための最適用量は１ ０ｈｖであり、そして再刺激のためには５または０．０５ｇＭであった。１０１ １９および１１ｇを用いた免疫化では、ＣＴＬ応答の発生は低いかまたは全（無 かった。完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦ＾）またはＰＢＳに溶解したペプ チドは応答を示さなかった。

ペプチドの静脈内注射ても一次ｉｎ　ｖｉｖｏ　ＣＴＬ応答は発生しなかった（ 示さず）。

ＮＴ６０由来の別の９１体は、図３に示すとおり、より強力な抗ペプチドおよび 抗ウィルスＣＴＬ応答を示した。

ｐｅｐ９（ＰＲＹ）およびｐｅｐ９（ＮＴ６０）により誘導されたＣＴＬの特異 性上記結果に鑑みて、我々はｐｃｐ９（ｒ’Ｒ８）およびｐｅｐ９（ＮＴ６０） に関連して発生したＣＴ１．の特異性を調べた。ＣＴＬはその相当するペプチド コーティングされた細胞およびウィルス感染細胞を好ましく殺傷した（図４）。

ＣＴＬはウィルス感染標的細胞よりもペプチドコーティングされた細胞に対して より高い交叉反応性を示した。

肝ウィルスまたはペプチドに対するＣＴＬ応答マウスを肝ＰＲ８ウィルスでブラ イミングし、免疫牌細胞をウィルス感染刺激細胞（図５Ａ）または０．０５ｇＭ 　ｐｅｐ９（ＰＢＳ）の存在下正常同系間の肺細胞（図５Ｂ）の何れかで再刺激 した。肝ウィルスで１ｎｖｉｖｏブライミングされ低濃度のｐｅｐ９（ＲＰ８） で再度刺激されたＣＴＬはウィルス感染細胞およびペプチドコーティングされた 細胞の両方を認識する顕著な能力を有していた（図５Ｉ３）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ でウィルスでブライミングされたＣＴＬを刺激するためには少蚤の再刺激ペプチ ドで充分であり、ウィルス感染細胞と同様の力価を有していたことに留意しなけ ればならない。ｐｅｐ９（ＲＰ８）をｉｎ　ｖｉｖｏブライミングに、そしてウ ィルス感染細胞またはｐｅｐ９（ＲＩ’８）をｉｎ　ｖｉｔｒｏの再刺激に用い た場合（図５Ｃおよび［））　、ＣＴＬ応答はペプチドコーティングされた細胞 およびウィルス感染細胞の両方に対して発生した。肝ウィルスは遊離のペプチド よりもＣＴＬをブライミングする効果が高かった。

ｐｅｐ９（ＰＢＳ）による免疫化の後のＣＴＬ活性の経時変化ｐｅｐ９（ＰＢＳ ）での免疫化の後のＣＴＬ活性の動態を測定するために、マウスをｐｅｐ９（Ｐ ＢＳ）で−回ブライミングした。免疫化された動物の肺細胞をｐｅｐ９（ＰＢＳ ）による免疫化後２〜３０日にｉｎ　ｖｉｔｒｏで再刺激し、ＣＴＬ活性につい て検定した。ｐｅｐ９（ＰＢＳ）コーティングされたＲ１１＾標的細胞に対する ＣＴＬの活性は免疫化７日後に最高に達し、その後活性は徐々に低下した（図６ ）。ブライミング後３０日に、より低いＣＴＬ活性が依然として検知された。

ＣＤ８　’により媒介されＭＩＩＣクラス■拘束であるｉｎ　ｖｉｖｏペプチド 誘導細胞障害性 図７ａに示すとおり、ＣＤ８’Ｔ細胞を欠失しているｐｅｐ９（ＰＢＳ）誘導Ｃ ＴＬはｐｅｐ９（ＰＢＳ）コーティングされたＥＬ４細胞を溶解することができ なかった。一方ＣＤ４４丁細胞の欠失はｐｅｐ９（ＰＢＳ）コーティングされた 標的細胞に対する細胞溶解活性に影響しなかった。即ち、ｐｅｐ９（ＰＢＳ）特 異的ＣＴＬはＣＤ４−ＣＤ８’表現型を発現する。

Ｃ５７Ｂ６／Ｊ（ｆｌ−２ｂ）起源のｉｎ　ｖｉｖｏペプチドブライミングされ たＣＴＬを、インフルエンザＰＲ８株に感染した同系間のＥＬ４（ＩＩ−２ｂ） 、異系間のＰ８１５（ｎ−２’）およびＬ９２９（Ｉｆ−２’）標的細胞に対し て試験した。図７ｂに示すとおり、Ｈ−２ｂｌ的細胞に対して明らかな拘束特異 性があった。

表３ 種々の用量のペプチドでｉｎ　ｖｉｖｏブライミングおよび１００　５．００　 ４．６１　４．２１　７，００　８．５０　４３．６８３４．７３０．０５　０ ．＋２　０．５１　３０．７６　３０．０？　５９．４２　５０．７３１０　５ ．００　５．６３　４．１９　１５．０４１３．９８　２３．５４　２２．０９ ０．０５　５．７４　４．１４　３１．１９　２３．７５　４５．５２．３４． ６０１　５．００　３．３４　２，６６　６．８ｇ　５．５４　１１．８５　９ ．２ｇ０．０５　４．０ｇ　３．３２　１２．４３　１０．５０　１６．４４　 １５．５４＊　エフェクター二標的比 ３、内在化後の細胞表面への外部側１ｃｍ１結合ペプチドのリサイクルＭＩＩＣ −１に結合する外部ペプチドはＢ２−Ｍの存在下相当する拘束要素の発現を上方 調節することが知られている（Ｏｔｔｅｎ等、　１９９２）。このｉｎ　ｖｉｔ ｒｏの上方調節応答はペプチドのｉｎ　ｖｉｖｏ免疫原性に相関する。

我々がエンドソーム阻害剤クロロキンがこの上方調節を抑制することを発見した （図８）通り、この方法はペプチドの内在化および膜のリサイクルを必要とする ことが考えられる。このモデルの裏付けとして、多くの過去の試験でクラドリン コーティングピットを通るＭＩＩＣ−１の内在化およびＭＩＩＣ−１のリサイク ルが発見されている。

外部１１ＲＣ−１結合ペプチドの考えられるリサイクルを調べるために、我々は アデノウィルス由来のＥＩ＾蛋白（配列５ＧＰＳＮＴＰＰＥＩ　：ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ　：　２）上およびインフルエンザＡウィルス由来の各蛋白（ＰＨ１）　 （配列＾ＳＮＥＮＭＥＴＭ　：　ＳＥＱ　ＬＤ　Ｎｏ　：　１）上の免疫優性エ ピトープを示す２つのＤｂ結合ペプチドを合成した。システィンをＮ末端または Ｃ末端に、分子マーカーガラビオス（Ｇａｌ−Ｇａｌ）に対する生化学的結合部 位として付加し、これに対しては特定のモノクローナル抗体が入手できた（ＩＩ Ｃ２１０１）　（Ｂｒｏｄｉｎ等、　１９８ｇ）。前に報告されているとおり、 Ｎ末端へのシスティンの付加はＤｂ上方調節能力もペプチドのｉｎ　ｖｉｖｏの 免疫原性も損なわなかった（Ｚｈｏｕ等、　１９９２　ｂ）。同じ部位のガラビ オスの付加は、グリコペプチドを発生させ、これはＥＬＩＳＡ試験においてガラ ビオス特異的モノクローナル抗体１１ｃ２１０１により強力に認識された（表４ ）。Ｇａｌ！−Ｃ３ＧＩＩペプチド（コンジュゲート２９）はＧａｌ、−ＣＡＳ ＩＯペプチドよりも強力に反応した。付加的なガラビオスがＤｂ結合能力やｉｎ 　ｖｉｖｏ免疫原性を変化させなかったことを評価するため、両方のグリコペプ チドのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｄｂ上方調節および１ｎｖｉｖ□の免疫原性を調べた 。Ｄｂ上方調節はペプチド単独と比較した場合、グリコペプチドでも同様であっ た（データは示さず）。グリコペプチドのｉｎ　ｖｉｖｏ注射およびｉｎ　ｖｉ ｖｏ再刺激により発生したＣＴＬは厳密にペプチド特異的であり、十文字の態様 で別のペプチドにより提供された場合はＧａ１４を認識しなかった（図９）。こ れらの結果により、我々はグリコペプチド中のＧａ１ｌは不活性マーカーとして 作用すると結論した。

外部グリコペプチドの膜Ｄｂ分子への結合を最大にするため、突然変異ＨＭＡ− ３細胞を用いた。これらの細胞は、Ｔａｐ−２ペプチド輸送系の損失により細胞 質ゾルからＥＲコンパートメントへのプロセシングされたペプチドの輸送が遺伝 的に欠損している。その結果ＲＭ＾−８細胞は細胞表面において否突然変異細胞 よりもより高い両分の空のＤｂ分子を発現する。これらの空のＤｂ分子の発現は 更に、低温（２６℃）によっても増大することができ、３７℃でＤｂ結合ペプチ ドを添加することにより安定化される（図３）。即ち、Ｂ２−Ｍの存在下高濃度 のグリコペプチドで低温誘導Ｒ１１＾−３細胞を処理することにより、大きい両 分の膜Ｄｂ分子が同一のグリコペプチドで飽和した。このようにして処理された Ｒ１１＾−８細胞はＭＣ２１０１抗体で明らかに染色され（図１０）、恐らくは ＭＨＣ−１結合グリコペプチドの形態でのＧａ５エピトープの膜発現を示してい た。プロナーゼ処理により全てのＤｂおよびＧａ１．の発現はこれらの細胞より 排除される（図１０）。次にこれらの細胞を３７℃に移して１時間インキュベー トする場合、ＤｂおよびＧａ１２の発現は供に細胞表面に復帰する（図１０）。

Ｇａ１２エピトープの復帰はクロロキンにより抑制された（データは示さず）。

従来のＭＩＩＣ−１提供経路はＲＮＡ−３細胞において非官能性であり、その結 果細胞質ゾルのペプチドがＥＲコンパートメントに輸送されないため、結果はＤ ｂ結合グリコペプチドのエンドソームのリサイクルを強く示している。Ｇａ１４ −ＧＡＳＩＯグリコペプチドを使用した場合も同様の結果が得られた（示さず） 。

官能基のレベルでこれらの結果を評価するために、インフルエンザＡ　（ＰＨ１ ）特異的ＣＴＬを発生させ、Ｇａｌ　２−ＣＡＳＩＯグリコペプチド（コンジュ ゲート３１）中の標的エピトープに相当するペプチド（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ）を 投与したＲＮＡ−８およびＥＬ−４標的細胞に対して試験した。両方の標的細胞 は以前に報告されているとおり（Ｒｏｔｚｓｈｋｅ等、　１９９０）強力に殺傷 された（図１１）。、これらのペプチド投与標的細胞をプロナーゼ処理すること により殆どのＤｂ発現および殆どの特異的ＣＴＬへの感受性が排除された（図１ １）。プロナーゼ処理細胞を３７℃でインキュベートしてＤｂおよび関連ペプチ ドの両方を発現させたところ、ＣＴＬ殺傷への感受性が復帰した。この復帰はＥ Ｌ−４細胞と比較してＲ１ｌ＾−８細胞の場合により早くより広範囲であり、抗 Ｏｂモノクローナル抗体およびクロロキンによりブロックされた（データ示さず ）。

我々はこの結果を、Ｔ細胞における早期のエンドソームと同様の細胞内コンパー トメントを１を通ってＭＨＣ−１結合ペプチドがリサイクルすることを意味して いると解釈する。おそらくはこの機序は、膜ペプチドの発現を最適化しうるため にペプチド交換が起こることができるようにしているものと考える。Ｉｌｏｃｈ ｍａｎ等（１９９１）はクラスＩ　ｌｌｌＩＣ分子はエンドソームコンパートメ ントで構造的変化を起こし、Ｂ２−Ｍｌ）＜離れて重鎮上に位置することが示唆 されると報告している。

即ち、この作用を起こす低いｐＨはペプチドの交換ももたらすと考えられる。コ ノ考えの裏付けとして、ｌａｒｄｉｎｇ（１９９２）は、ｌｌｌＩＣ−１提供は 外因性抗原の電子穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて光熱および 弱塩基性アミンによりブロックできることを近年報告している。

ＭＨＣ−１分子は僅かに長いペプチドと比較してより高い親和性で最適な長さの ペプチドに結合することが知られており、この現象は多くのｉｎ　ｖｉｔｒｏの 検定で反映されている。これらには証■Ｃ−１膜上方調節、特異的ＣＴＬに対す る標的細胞の感作、突然変異細胞上の空のクラスＩ鎖へのペプチドの直接の結合 、突然変異細胞由来の溶解物中のペプチド誘導ＭＩＩＣ−１組立、および、組Ｉ Ｃ−１からの結合ペプチドの解離速度の測定が包含される。最適な長さのペプチ ドのこの高い親和性は、クラスＩ鎖のペプチド結合溝が両端で閉じていることが ら、この溝への厳密な適合に関わるものである（Ｍａｄｄｅｎ等、　１９９１） 。即ち、最適な大きさを有するペプチドは３Ｍ体ペプチド重鎮Ｂ２−Ｍ？！！合 体を形成し、これはより長いペプチドよりなる複合体と比較して工ンドソームか らリサイクルされる傾向が高い。

本研究で示されるとおり、標的Ｔ細胞においては最適な１ｉｌｌｃ−１結合ペプ チドのリサイクルにより相当する特異的ＣＴＬによる認識が最も効果的になる。

これまでＭｎＣ−１リサイクルの殆どの徴候はＴ細胞において得られている。し かしながら、同じ機序が特定の抗原提示細胞で機能している場合、膜レベルでの 最適なペプチドの構築もまた免疫応答の導入性のアームにおいて重要である。特 に、ｉｎ　ｖｉｖ。

およびｉｎ　ｖｉｔｒｏの両方でＣＴＬの発生に不可欠であると考えられている 樹状細胞をこの特徴について研究しなければならない。ペプチドがｉｌ　ｖｉｔ ｒｏでＩＩＨＣ−１発現を上方調節する能力とそのｉｎ　ｖｉｖｏ免疫原性との 間の既存の相関は、これが細胞応答における重要な機序であることを示唆してい る。

表４ ＥＬＩＳＡ検定におけるモノクローナル抗体ＭＣ２１０１ガラビオス　１，８６ 　０．０１　０．４１　０．０２Ｇａｌ−Ｇａｌ ＰｋＯ０２グロポトリ　０．０４　（１，（１ｇ　０．０４　０．０１アオンル Ｇａ１−Ｇａ１−Ｇｌｃ （ＣＤ７７） ペプチド（５０＋１９／翼ｌ）を００５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈し 、１００ａ１／ウエルを平底Ｃｏ５ｔａｒマイクロプレート（カタログ番号３５ ９０）に添加し、４℃で一夜インキユベートした。プレートをＰＢＳで１回洗浄 し、室温で３０分間０．５％ＰＢＳとともにインキュベートし、そしてＰＢＳｌ ｏ、　０５％ツイーン緩術液で２回洗浄した。モノクローナル抗体を０５％ゼラ チン／ＰＢＳ１０．０５％ツイーン中に希釈し、マイクロプレートに添加し、室 温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ／ツイーンで急速洗浄した。アルカリホス ファターゼコンジュゲートウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ 　ｃｏｄｅ　Ｎｏ、　Ｓ　４１４）をＰＢＳ／ツイーン中に１／１（ｔｏｏに希 釈し、１（ｌｃｌｊ６／ウェルで添加した。室温で２時間インキュベートしＰＢ Ｓ／ツイーンで４回洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質溶液１００＋＋１ を添加した。プレートは４０５ｒｖＭでの光学密度を菖ｕｌｔｉｓｋａｎ　Ｓｙ ｓｔｅｍ（Ｌａｂ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて室温２時間の後に読み取った。

４、内部免疫原部位に炭水化物部分を有するグリコペプチドを用いたワクチン接 種による炭水化物特異的ＣＴＬ応答の発生炭水化物ガラビオース（Ｇａｌ−α− ４Ｇａｌ、あるいはＧａ１ｌと表示）を、リンパ球じゅう毛髄膜炎ウィルス（Ｌ Ｃ）ＩＶ）　（Ｏｌｄｓｔｏｎｅ等、１９８ｇ）中の１１２−Ｄｂ制限免疫優性 ＣＴＬエピトープを示す１２量体のペプチド５ＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬＴ　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：９）　＋：おける内部システィン（１０位）ニ結合させた。グ リコペプチドは５ＶＧ１２−Ｇａｉｔ（コンジュゲート３０；図１２）と命名し た。結合は実施例１に記載するとおりＳ結合を用いてチオール基に対して行った 。

実施例２に記載するとおり、そしてＺｈｏｕ等（１９９２ａ）の記載に従って、 ５ＧＶ１２−Ｇａｌｚグリコペプチドでマウスを免疫化した。おなじ５ＧＶ１２ −Ｇａｌ、でｉｎ　ｖｉｖｏ再刺激した後、発生した細胞障害性Ｔ細胞を、以下 のペプチドおよびグリコペプチドでコーティングした■２−Ｄｂおよびｇｂ陽性 ＥＬ−４細胞に対して試験した。

１、５ＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬＴ　（ＳＧＶ１２：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）２、 　５ＧＶＩ２−Ｇａ１２ ３　＾ＳＮＥＮＳＥＴＭ（＾ＳＮ９；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ）　６位のＳｔ、 −Ｇａ１２が結合したもの（＾５Ｎ９−６Ｓ−Ｇａ１２） ４、＾５Ｎ９−６３ ５、　Ｃ３ＧＩＩ−Ｇａｌｔ　（実施例３および図９参照）５、　Ｃ３ＧＩ’Ｓ ＮτＰＩ”Ｅｌ（Ｃ３ＧＩＩ；ＳＥＱ　Ｉ［ｌ　ＮＯ：８）７、ＣＲＧ９１位の ＣにＧａｐ□が結合したもの（ＣＲＧ９−Ｇａｌ　２）３、ＣＲＧＹＶＹＱＧＬ 　（ＣＲＧ９：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３）ペプチド１−６は知られた変性Ｄｂ 結結合軸細胞エピトープあり、ｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｄ”上方調節により測定される とおりＲＮＡ−８細胞に結合する（データは示さず）。ペプチド７−８は知られ たＫｂエピトープ（ＲＧＹｖＹＱＧＬ：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）　テあり、 共１：　ＲＭＡＯ３ＩＩＩ胞上（７）Ｋｂヲ上方調節する（データは示さず）。

Ｇａｌ□エピトープの発現はグリコペプチドに結合していた細胞表面上のＦＡＣ ３により測定した。高いＧａ１．発現がグリコペプチド２．５および７で認めら れた（データは示さず）。

グリコペプチド３はＩ？Ｍ＾−５細胞に結合している場合は抗Ｇａ１２モノクロ ーナル抗体により認識されなかった。結論として、グリコペプチド５および７は 異なる担体ペプチド上の免疫原ＳＧＶ　１２−Ｇａ　ｌ　ｚとして同じＧａ１２ エピトープを発現した。Ｃ３ＧＩＩ−Ｇａｌ、グリコペプチドはＤｂに結合し、 ＣＲＧ９−Ｇａ１４グリコペプチドはＫｂに結合した。即ち、グリコペプチド２ ．５および７で共有する唯一のエピトープはＧａｌ□であった。

５ＧＶ１２−Ｇａ１４発生ＣＴＬを上記したペプチドおよびグリコペプチドでコ ーティングされたＥＬ−４細胞に対して試験した場合、グリコペプチド２および ５でコーティングされた標的細胞は殺傷され、そしてまた、より低い濃度で、グ リコペプチド７でコーティングされた標的細胞も殺傷された（図１３）。即ち発 生したＣＴＬ細胞はグリコペプチド（細胞表面レベルでＧａ１２エピトープを発 現しない）を含めて、担体ペプチドのみ（ＳＧＶＩ２）もその他の対照ペプチド も認識しなかった。

上記した結果から、グリコペプチド５ＧＶ１２−Ｇａｌ！による免疫化はＧａ１ ２特異的Ｔ細胞応答を発生させると結論できる。その理由は、Ｇａ１４の炭水化 物部分がＴ細胞認識のための最適な位置に向けられているためであると考えられ る。グリコペプチド５コーテイングされた標的細胞がグリコペプチド７コーテイ ングされた標的細胞と比較して高度に殺傷される理由は、グリコペプチド５がＤ ｂにより、そしてグリコペプチド７がＫｂクラス！鎖により提供されるためと考 えられる。

更に別の実験（上記したプロトコールを採用）ではマウスをグリコペプチドＲＧ Ｙ８−４ｈ−Ｇａ５　（”ＲＧＹ８”はオクタペプチドＲＧＹＶＹＱＧＬを示し ：４ｈは４位にある■がホモセリンで置換されていることを指し；Ｇａｌ、は糖 Ｇａ１２のホモセリンヒドロキシルへのコンジュゲート形成を指す）で免疫化し た。図１３を参照しながら記載した実験で示す通り、得られるＲＧＹ８１ｈ−Ｇ ａｌ　ｚ発生ＣＴＬ細胞をＲＧＹ８−４ｈ−ＧａｌｌおよびＲＧＹ３−４ｈでコ ーティングされたＥＬ−４細胞に対して試験した。

図１４（Δ）に示した結果から、ペプチドおよびグリコペプチドの両方に特異的 なＣＴＬ細胞が発現する。

この異種性のエフェクター細胞集団を、別の担体ペプチド（ＳＧＶ１２−Ｇａｌ □）上および５ＧＶ１２ペプチドそのものの上でＧａ１２でコーティングされて いるＥＬ−４細胞に対して試験したところ（図１４（Ｂ））、グリコペプチドで コーティングされた細胞のみが殺傷された。

この作用は「十文字」試験により、ＣＴＬはＧａ１４特異性を有することを証明 している（上記「実験的試験系」のセクションを参照）。

本明細書に提示したデータを以下の表５および６にまとめる。

表５ Ｋｂ結合ペプチドおよびグリコペプチドの分析Ｇａ１４−ＣＡＰ９　＋　＋　− ＋　十ＦＡＰ９−５ｈ−Ｇａ１４　＋＋＋　＋Ｇａｌ　２−ＣＲＧ９　＋　＋　 ＋　＋ＣＡＰ９　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ４）　＋ＦＡＰ９　（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：２０）　十　強力、高ＦＡＰ９−５ｈ反応性ＦＡＰ９−５ｈ　（ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：２６）　＋　やや弱、低ＦＡＰ９反応性ＣＲＧ９　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：１３）　＋ＲＧＹ８　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）　十ＲＧＹ８− 仙反応性有りＲＧＹ８−４ｈ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）　十　強力、ＲＧ Ｙ８反応性反応表有 ＥＬＩＳＡ　ＭＨＣ−１膜発現す特異性ペブチ　ド　７．４　９．６　ｕｐｒｅ ｇ　サイクル　免疫原性　Ｐ　Ｇ　ＧＰＧａ５−ＣＡＳＩＯ＋十＋＋＋十 ＧＭ３−Ｃ＾Ｓ１０− ＧＭ３−１ａｋｔａｍ−ＣＡＳＩＯｔｏｘＡＳＮ９−６ｈ−Ｇａ１４　＋　−＋ 　＋＋＋　＋＾５Ｎ９−６Ｓ−Ｇａｌｚ　＋　−− ＾５Ｎ９−４Ｓ−Ｇａ１２（＋　）　−−Ｇａ５−Ｃ３ＧＩＩ　＋　＋　＋＋　 ＋　＋ＧＭ３６１１　− ６置３−ラクタム−Ｃ３ＧＩＩ　＋　＋５ＧＰＩＯ−６ｈ−Ｇａ１４　＋　＋　 ＋　＋　＋　−３ＧＰＩＯ−６Ｓ−Ｇａｌｚ　−十　−３ＧＰＩＯ−４Ｓ−Ｇａ ｌｔ　（＋）　−ｍ−５ＧＶ１２−Ｇａ１４　＋　＋　十＋　＋　十ベ　ブチ　 ド　免疫原性 ＣＡＳＩＯ（ＳＥＱＩＤＮＯニア）　十＾ＳＮ９　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１） ＋＾５Ｎ９−６ｈ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１）＾５Ｎ９−６３　− ＾５Ｎ９−４３ Ｃ３ＧＩＩ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・８）＋５ＧＰＩＯ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ２）　＋５ＧＰＩＯ−６ｈ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２３）ＳＧＰＩＯ−６３＋ ５ＧＰＩＯ−４３ 検定（表５および６）に関する注記 ＥＬＩＳ＾ ＥＬＩＳ＾検定は表４に関して記載するとおり実施した。

麗ｎｃ−１上方調節 図８および図１０Ａに関して記載したとおり、その原理は、ペプチドが抗原提示 細胞上の細胞表面で空のＭＩＩＣ−１重鎖に結合することができ、これにより安 定化および相当するＭＩＩＣ−１鎖の上方調節が行われることによる。

一困里 グリコペプチドがＭ！ＩＣ−１に細胞表面上で結合する際、相当するＣｌｌ０部 分の発現（および接触可能性）は、図１０ＣおよびＥに関して記載したとおりＦ ＡＣ３における抗体染色により検知できる。

膜リサイクル 図１０ＤおよびＦに記載。

免疫原性 記載のとおりマウスをグリコペプチドで免疫化し、ｉｌ　ｖｉｔｒｏ再刺激ＣＴ Ｌ細胞を、種々のペプチドおよびグリコペプチドでコーティングされた標的細胞 の殺傷について試験した。特異性Ｐとは、ＣＴＬ細胞がペプチド部分のみを、Ｇ がＣ８０部分のみを、そしてＧＰがその組合せを認識することを指す。

図面の簡単な説明 図１ 「スペーサーアームグリコシドの合成」のセクションで記載した化合物１〜１５ の化学構造。

「グリコペプチドの合成」のセクションで記載したグリコペプチド生成物２１〜 ２５の化学構造。

図３ ｐｅｐ９（ＮＴ６０）により誘導されたＣＴＬは、再刺激にｐｅｐ９（ＮＴ６０ ）を５ｊＭおよび０．５μ麗を用いた場合よりも０．０５ｕＭの場合に、より効 果的にウィルス特異的ＥＬ−４細胞およびペプチドコーティングされたＥＬ−４ 細胞の両方を溶解した。ＣＴＬは１００＋１９　ｐｅｐ９（ＮＴ６０）の単回皮 下注射により発生させた。免疫牌細胞を５日間ｐｅｐ９（ＮＴ６０）、（Ａ）５ ｊＭ、（Ｂ）０、５ａＭおよび（Ｃ）０．０５ｊＭの存在下で同系間の照射稗細 部で再刺激し、未処理（Ｏ（ｌ）　、ＮＴ６０感染（ｅ−＠）　、ｐｅｐ９（Ｎ Ｔ６０）：ｚ−ティング（口Ｈコ）のＥＬ−４細胞に対して試験した。

図４ ｐｅｐ９（ＰＲ８ＸＡ　）およびｐｅｐ９（ＮＴ６０ＸＢ）で誘導されたＣＴＬ の特異性。

エフェクターＣＴＬを、未処理（Ｏ（））、ＰＨ１−感染（＠−＠）、ＮＴ６０ 感染（口普コ）　、ｐｅｐ９（ＰＨ１）コーティング（■→■）　、Ｉ）ｅｐ９ （ＮＴ６０）　−ｙ−ティング（Δイ９のＥＬ４細胞に対して試験した。

図５ 肝ウィルスおよびペプチドでブライミングされ再刺激されたＣＴＬ応答。マウス をＲＰ８肝ウィルス（Ａ、　Ｂ）またはｐｅｐ９（ＯＲ８）（Ｃ，Ｄ）でｉｎ　 ｖｉｖｏブライミングし、ＰＲ３感染牌細胞（Ａ、　Ｃ）または照射肺細胞で０ ．０５ａｌｌ　ｐｅｐ９（ＰＨ１）の存在下（Ｂ、　Ｄ）再刺激した。標的細胞 は未処理（Ｏ（ｌ）　、ＰＨ１−感染（＄−＠）　、ｐｅｐ９（ＰＨ１）　：＋ −ティング（口Ｉコ）とした。

図６ ｐｅｐ９（ＰＨ１）の単回皮下注射により誘導されたＣＴＬ活性の動態。マウス を１００ｎ　ｐｅｐ９（ＰＨ１）でｉｎ　ｖｉｖｏブライミングし、ブライミン グ後、２．７．１０．２０および３０日に５　ｐＨｐｅｐ９（ＰＨ１）でｉｎ　 ｖｉｔｒｏ再刺激した。発生したＣＴＬを未処理（〇−〇）およびｐｅｐ９（Ｐ ＲＹ）コーティング（ｅ（）のＨＭＡに対して試験した。エフェクター：標的比 ６ｏ：１゜ 隘ユ ペプチド誘導細胞障害性はＣＤ８“およびｎ−２Ｄｂ拘束Ｔ細胞により媒介され る。ａ：ＣＴＬはｐｅｐ９（ＰＨ１）により誘導された。次に等しい数のＣＴＬ をＤｙｎａｂｅａｄｓシステムを用いてＣ４４およびＣＤ８’Ｔ細胞を欠失させ た。次に残りの細胞のｐｅｐ９　（ＰＨ１）コーティングＥＬ−４細胞に対する 溶解活性を試験した。未処理のＣＴＬ　（Ｏ（））　、ＣＤ４”欠失（■）およ びＣＤ８　’欠失（口用コ）のｐｅｐ９（ＰＨ１）コーティングＥＬ４細胞に対 する溶解活性を試験した。ｌ）　：　ｐｅｐ９（ＰＨ１）で誘導されたＣＴＬを ＰＲＩＩ！感染ＥＬ４（〇−〇）　、ＰＲ８感染感染１５　（）・）およびｌ’ Ｒ８感染Ｌ９２９　（口用コ）に対して試験した。

」冬 ペプチド媒介Ｉ＋　−２Ｄ　ｂ上方調節はクロロキンにより抑制できる。

ＨＭＡ−３細胞を６時間クロロキンの存在下および非存在下で、インフルエンザ Ａ（ＰＨ１）ヘブチＦＮＰ３６６−３７４　（５０ｕＭ）とともにインキュベー トした。インキュベートした後、細胞を洗浄し、抗Ｄｈ（２８−１４−８３）モ ノクローナル抗体で水上３０分間染色し、洗浄し、ウサギ抗マウス（Ｆ（ａｂ’ ）２０ＦＩＴＣ（Ｆ３１３．　Ｄａｋｏ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ　Ｄｅｒ＋ｍ ａｒｋ）とともに３０分間インキュベートした。染色された細胞を１％ホルムア ルデヒドで固定し、ＦＡＣ３ｃａｎ　７　ｏ−サイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　 Ｄｊｃｋｉｎｓｏｎ　；翼ｏｕｎＬａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃ＾）で分析した。

」旦 グリコペプチド（ＡおよびＣ）の合成。グリコペプチドは、２−プロモエチル４ −０−　（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合 物２８）をチオール基を含有するペプチドに結合させることにより合成した。シ スティン部分をＮ末端で天然のペプチド配列に付加した。プロモーターとして炭 酸セシウムを用いながら、システィンのイオウ原子の親核性を利用してペプチド と、炭水化物部分にグリコシド結合した親電子性のスペーサーアームとの間のチ オエステル結合を作成した。Ｇａ１２結合反応はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド 中で行った。結合反応はＩＩＰＬｃでモニターＬ、０．１％トリフルオロ酢酸を 含有する水を添加することによりクエンチングした。得られたグリコペプチド（ コンジュゲー）２９（Ａ）および３１（Ｃ））を調製用１１ＰＬＣで精製し、生 成物の分子量をＦＡＢ　ＩＩｓで確認した。

ＣＴＬ検定。（ＢおよびＤ）。Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバント中１００μ９ のグリコペプチドを用いて尾部基底部においてマウスを皮下免疫化した。プライ ミングの１０日後、肺細胞を、２５Ｘ１．Ｏ’個の照射（２５００ｒａｄ）した 同系間の肺細胞とともに共存培養した２５Ｘ１０’個の応答細胞を用いてｉｎ　 ｖｉｔｒｏで再刺激した。再刺激は５日間３７℃でＲＰＭＩ／１０％ＦＣ３とと もに５０寓１容の組織培養フラスコ中０．０５ｇＭのグリコペプチドの存在下で 行った。ＨＭＡ−８標的細胞を３７℃で１時間５ｈＭペプチドでコーティングし 洗浄した。細胞を３７℃で１時間１００ｐＣｉノＮａｌ　”Ｃｒｙ。

で標識し、２回洗浄した。エフェクターのリンパ球をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ遠心 分離により分離し、Ｖ型マイクロウェル中１５０ｊＺ／ウェルを用いて５０００ 　”Ｃｒ−襟識標的細胞を用いて種々の比率で試験した。マイクロプレートを３ ００Ｇで遠心分離し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベートした 後、プレートを再度遠心分離し、５０ａＩの上澄みをガンマシンチレーションカ ウノターで分析した。

」昶 パネルＡ　：　ＨＭＡ−３細胞を細胞表面上の空のＤｂＩＩＩＩＣ−１鎖の発現 を誘導するために２６℃でそして３７℃で２４時間インキュベートし、染色して Ｄｂ発現を調べた。パネルＢ：２６℃で予備インキュベートしたＨＭＡ−３細胞 のプロナーゼ処理によるＤｂ発現の除去。プロナーゼ処理は２時間と４時間。Ｄ ｂ除去は４時間で完了した。パネルＣおよびＥ：２６℃誘導ＲＭ＾−８細胞に３ ７℃で２時間、３０ｈＭのグリコペプチドＧａ１．Ｃ３Ｇ１１　（パネルＣ）ま たはＧａ　１　ｚｃＡｓ　１０　（パネルＥ）を投与し、洗浄し、染色してＧａ ｌ□発現を調べた。パネルＤおよびＦ：パネルＣおよびＥの場合のようにグリコ ペプチドを投与したＲＩＩＡ−３細胞をプロナーゼ処理してＤｈおよびグリコペ プチドの発現を除去し、洗浄し、更に３７℃でインキュベートしてグリコペプチ ドの再発現を起こさせ、染色してＧａ１２発現を調べた。

辺り 特異的ＣＴＬにより検知されたプロナーゼ処理後のＥＬ４　（Δ）およびＨＭＡ −３（Ｂ）細胞上のＤｂ結合ペプチドの再発現。ＥＬ４　（Ａ　）およびＨＭＡ −８（Ｂ）細胞ヲ１．５時間ペプチドＮＰ３６６−３７４（１０ｈＭ）　テ処理 シタ。洗浄後、細胞をプロナーゼＥ’（ＰｒｏＥ、　ＲＰＭＩ　１６４０中４ｕ ／Ｉ／）で処理し、洗浄し、０、■および３時間３７℃で培養し、４時間５１（ 、放出試験により検定した。Ｃ且の調製は以前に報告されている（Ｚｈｏｕ等、 　１９９２　ｂ）。

簡単に説明すると、Ｃ５７Ｂ６／Ｊ雌性マウスをＰＢＳ中に希釈したインフルエ ンザＡ　／ＰＲ／　８　／３４ウィルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ　ｆｏｒ　ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｌｏｎｄｏｎ）の＾、　Ｄｏｕ ｇｌａｓ博士より入手）２０＋１＾Ｕを単回静脈内注射することにより免疫化し た。免疫化ｉ！１〜４週間に免疫牌細胞を照射ウィルス感染させた同系間の肺細 胞で５日間再刺激した。

図１２ 炭水化物特異的ＣＴＬ応答の発生のために用いたグリコペプチド５ＧＶＩ２−Ｇ ａ１４　（カンジューゲート３０）（実施例４参照）。

図１３ ＳＧＶ１２−Ｇａ１２発生ＣＴＬ細胞をパネルに示したとおりペプチド／グリコ ペプチドでコーティングされたＥＬ−４細胞に対して試験した。Ｅ／Ｔ、エフェ クター・標的比。

図１４（Ａ）および（Ｂ） ＲＧＹ８０４ｈ−Ｇａｌ　、発生ＣＴＬ細胞を、指定のペプチド／グリコペプチ ドでコーティングされたＥＬ−４細胞に対して試験した。Ｅ／Ｔ、エフェクター ：標的比。

参考文献 ＾１ｃｈｅｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　）ｌｅｄ、 　１７１．１８１５−＾ｎ５ａｒｉ、＾、＾−Ｔ、　Ｆｒｅｊｄ　ａｎｄ　Ｇ、 　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　（１９８７）、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ。

Ｒｅｓ、　１６１．２２５−２３３゜ Ｂｒｏｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ 　４２．１８５−１９４゜Ｃａｔｅｌａｎｉ、　Ｇ、　（１９８ｇ）、　Ｃａｒ ｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１８２．２９７−３００゜Ｃｒｏｗｌｅ　（１９８ ８）、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｎｕｓｕ口、５６．　２７６９−２７７３゜Ｄａｈｍ６ ｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３ａ）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、１１３ ．　２１９−２２４゜Ｄａｈｍ（：ｎ、　Ｊ、、　Ｔ、　Ｆｒｅｉｄ、　Ｇ、　 ＧｒＯｎｂｅｒｇ、　Ｔ、　Ｌａｖｅ、　Ｇ、　ｌｌａｇｎｕｓｓｏｎａｎｄ　 Ｇ、　Ｎｏｏｒｉ　（１９８３ｂ）、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１１ ６．３０３−３０７゜Ｄａｈ＋＊６ｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）、 　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１２７．１５−２５゜ＤａＳｇＵｐｔａ、 　Ｆ、　ａｎｄ　Ｐ、Ｊ、　Ｇａｒｅｇｇ　（１９８８）、　Ｃａｒｂｏｈｙｄ ｒ、　Ｒｅｓ、　１７７゜Ｃ１３−Ｃ１７゜ Ｄｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　 ５７．６９３−７００゜Ｅｌｏｆｓｓｏｎ、　Ｍ、、　ｆａｌｓｅ、　Ｂ、　ａ ｎｄ　Ｋｉｈｌｂｅｒｇ、　Ｊ、　（１９９１）、　Ｔｅｔｒａ−ｈｅｄｒｏｎ 　Ｌｅｔｔ、　３２．７６１３−７６１６゜Ｆａｌｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９ １）、　Ｎａｔｕｒｅ　３５１．２９０−２９６゜Ｆｒｅｍｏｎｔ　ｅｔ　ａｌ 　（１９９２）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５７．９１９−９２７゜Ｆｕｎｇ　ｅｔ 　ａｌ、　（１９９０）、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５０．４３０８ −４３１４゜１１ａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏ ｌ、　６４．２８３３−２８４４゜Ｈａｋｏ＋ａｏｒｉ（１９９１）、　Ｃｕｒ ｒｅｎｔ　０ｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　３．６４６−６５３ ゜１１ａｒｄｉｎｇ　（１９９２）、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２ ２．１８６５−１８６９゜Ｈｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７ ）、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．　ｌｌｌｌ１１ｕｎｏｔｈｅｒ、　２ ５゜２３１−２４１゜ Ｈｏｃｈ＋ａａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 １４６．１８６２−１８６７゜ｌ５ｈｉｏｋａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９２）、 　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４８．２４４６−２４５１゜Ｊａｎｅｗａｙ　（１ ９９１）、　Ｎａｔｕｒｅ　３５３．７９２゜Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ　ｅｔ　ａｌ 、（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ　３５３．　３２６−３２９゜Ｊｏｎｄａｌ　＆ 　Ｐｒｏｓｓ　（１９７５）、Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　１５．５９６−Ｊ ｏｒｇｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ、（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ　３５５．２２４ −２３０゜Ｌａｔｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９２）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５ ７．９６４−９６７゜１１ａｄｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）、Ｎａｔｕｒ ｅ　３５３．　３２１−３２５．１１ａｒｒａ、＾、　ａｎｄ　Ｐ、　５ｉｎａ Ｙ（１９８９）、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、１８７．　３５−４２゜） Ｉａｓａｚｕｎｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９９２）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５７．　 ９２７−９３４゜Ｍｏ１ｌ　ｅｔ　ａｔ、（１９８９）、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍ ｕｎ、　５７．３３４９−３３５６゜１１ｏｒｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４ ）、Ｎａｔｕｒｅ　３０８．　４５７−４６０゜Ｎｏｒｅｓ　ｅｔ　ａｌ、（１ ９８７）、Ｊ、Ｉｍｕｎｏｌ、１３９．　３１７１−３１７６゜０１ｄｓｔｏｎ ｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ｇ）、Ｊ、Ｅｘｐ、ｌ１ｅｄ、１６８．　５５９−５ ７０゜Ｏｒｔｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９２）、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、　１４８．１４４５−１４５０゜０ｔｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９２）、Ｊ 、Ｉ＋Ｉ１ｍｕｎｏ１．　１４８．３７２３−３７３２゜Ｐｏｒｔｕｋａｌａｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９４．　１９− ２３゜Ｒａｙ、＾、ｅｔ　ａｔ、（１９９２）、Ｊ、八ｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ 、１１４．　２２５６−２２５７゜Ｒｅｎａｕｄ、Ｐ、ａｎｄ　Ｄ、５ｅｅｂａ ｃｈ　（１９８６）、１ｌｅｌｖ、ＣｈｉＩｌｌ、＾ｃｔａ　６９．　１７０４ −１７１０゜ Ｒｏｂｅｒｔｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ 、３７．　７３７−７４８゜ＲＱｔｚｓｃｈｋｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）、 Ｎａｔｕｒｅ　３４８．　２５２−２５４゜ＲＱｔｚｓｃｈｋｅ　＆　Ｆａｌｋ 　（１９９１）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　１２．　４４７−４５５ ゜Ｓａｌｌｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｌｅ ｔｔ、　３０．５９−３ｔａｕｓｓ　（１９９１）、　Ｃｕｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ　１．　３２８−３３０゜Ｔｈｕｒｉｎ、１ｌａｃｋｅｔｔ、０ｔｖｏｓ 　＆　Ｌｏｉｂｎｅｒ、ｉｎ　Ｔｈｕｒｉｎ：　＾ｂｂｅｒａｎｔＧｌｙｃｏｓ ｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｉｌｕｍａｎ　Ｍｅｌａｎｏｍａ　ａｎｄ　Ｃａｒｃｉ ｎｏｍａ　（Ｄｏｃｔｏｒａｔｅ　ｉｎｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、１９９１．　ｌ５ＢＮ−９１ −６２８−０３８９−１）。

Ｔｏｗｎｓｅｎｄ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、Ｃｅ１ｌ　４２．　４５７−Ｔ ｏｖｎｓｅｎｄ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、Ｃｅ１ｌ　４４．　９５９−Ｔｓ ｏｍｉｄｅｓ　＆　Ｅｉｓｅｎ　（１９９１）　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｌｌ 、　２６６、３３５７−３３６０゜Ｖａｎ　Ｂｌｅｅｋ　＆　Ｎａｔｈｅｎｓｏ ｎ　（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ　３４ｇ、２１３−２１６゜ｆｉｅｆｓ　ｅｔ 　ａｌ、（１９８１）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７８． 　６４８５−Ｙａｎｇ、Ｃ，Ｃ，、）ｌａｒｌｏｖａ、Ｃ，に、＆　Ｋａｎｉａ 、Ｒ，（１９９１）　Ｊ、＾＋ｏ、ＣｈｅＩｌｌ。

５ａｏｃ、１１３．　３１７７−３１７８゜Ｚｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ、（１９９２ ａ）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１５３．　１９３−２００゜（Ｐ ｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　Ａｕｇｕｓｔ　１９９２．）Ｚｈｏｕ　ｃｔ　ａｌ、 （１９９２ｂ）、Ｅｕｒ、Ｊ、ｌｍｆｆ１ｕｎｏ１．　２２．　３０８５−３０ ９０゜（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９９２．）配列表 （１）一般的情報： （ｉ）　出願人： （Ａ）名称：＾Ｂ　ＡＳＴＲ＾ （Ｂ）番地：　Ｋｖａｒｎｂｅｒｇａｇａｔａｎ　１６（Ｃ）市：　５ｏｄｅｒ ｔａｌｊｅ （Ｅ）国：スエーデン （Ｆ）郵便番号：　Ｓ−１５１８５ （Ｇ）電話番号・＋４６−８−５５３２６０００（ｎ）ファクシミリ番号：　４ ４６−８−５５３２８８２０（Ｉ）テレックス番号＋　１９２３７　ａｓｔｒａ 　５（ｉｆ）　発明の名称：新しい活性化合物（ｉｉ）　配列数＝２７ （ｔｖ）　コンピュータ読み取り可能な形態：（＾）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＮ　ＰＣ互換機（Ｃ）　Ｏ３：　ＰＣ−ＤＯ３／ ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：Ｐａｔｅｎｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１ ．Ｏ，Ｖｅｒ、１１．２５（ＥＰＯ） （ｖｉ）　出願のデータ： （＾）出願番号：　ＳＥ　９２０１３３８−２（Ｂ）出願臼：　１９９２年４月 ２８日（ｖｉ）　出願のデータ： （＾）出願番号：　ＳＥ　９２０２５５３−５（Ｂ）出願臼：　１９９２年９月 ７日 （ｖｉ）　出願のデータ： （＾）出願番号：　ＳＥ　９２０３８９７−５（Ｂ）出願口＋　１９９２年１２ 月２３日（ｖｉ）　出願のデータ： （＾）出願番号：　ＳＥ　９３０１１４１−９（Ｂ）出願口：　１９９３年４月 ６日 （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌの情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状二線状 （ｉｆ）　分子の種類；ペプチド （ＸＩ）　配列の状態：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：＾１ａ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ ・２の情報口→　配列の特徴： （Ａ）長さ＝ｌＯアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状二線状 （ｉｔ）　分子の種類：ペプチド （ｙＪ）　配列の状態：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２：Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ｓｃｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｉｌｃ（２）　ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ＋３の情報（＋）　配列の特徴： （＾）長さ＝９アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状二線状 （ｉｔ）　分子の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列の状態：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：４の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：１８アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （Ｌｉ）　分子の種類：ペプチド （ＸＩ）　配列の状態：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４：（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎ Ｏ：５の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：１３アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状二線状 （ｉｆ）　分子の種類；ペプチド （ｘｉ）　配列の状態：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５＋（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：６の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：１３アミノ酸 （Ｂ）種類・アミノ酸 （Ｄ）形状二線状 （Ｕ）　分子の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列の状態：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋１２：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ＋１３の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｔ）　分子の種類：ペプチド （対）配列の状態：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３：（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ ：１４の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 ＣＤ）形状二線状 （Ｕ）　分子の種類：ペプチド （Ｘｌ）　配列の状態：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：１５の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：１３アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状；線状 （ｉｆ）　分子の種類：ペプチド （尤）配列の状態：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１５：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１６の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ、１６アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状二線状 （■）分子の種類：ペプチド （Ｘｆ）　配列の状態：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：１７の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状二線状 （ｉｔ）　分子の種類：ペプチド （ＸＩ）　配列の状態、　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１７：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ・１８の情報（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２３の情報（ｉ）　配列の特徴 ： （＾）長さ＝ＩＯアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （０）形状二線状 （ｉｉ）　分子の種類：ペプチド （江）特徴： （＾）名称／キー：修飾部位 （Ｂ）位置＋　６．、７ （Ｄ）その他の情報：／ラベル＝　Ｘａａ／ノート＝「ホモシスティン」 （ｘｌ）　配列の状態：　ＳＥＱ　ＩＩＩ　Ｎｏ；２３：（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ 　ＮＯ：２４の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：ｌＯアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （ロ）形状：線状 （ｉｊ）　分子の種類：ペプチド （ｉｘ）　特徴： （＾）名称／キー・修飾部位 （Ｂ）位置、４５ （Ｄ）その池の情報：／ラベルーＸａａ／ノート＝「ホモシスティン」 （ＸＩ）　配列の状＠：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ；２４：Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ｌ１ｅ（２）　ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２５の情報（ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）形状二線状 （ｉｆ）　分子の種類；ペプチド （Ｌｘ）　特徴： （Ａ）名称／キー；修飾部位 （Ｂ）位置：４．．５ （Ｄ）その他の情報：／ラベル＝　Ｘａａ／ノート＝「ホモシスティン」 （Ｘｉ）配列の状態：　ＳＥＱ　ＩｏＮＯ：２５：＾ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｘ ａａ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ（２）　ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２６の情報 （ｉ）　配列の特徴： （＾）長さ一９アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｉｌ）形状：線状 （ｉｆ）　分子の種類：ペプチド （ｉＸ）　特徴： （＾）名称／キー：修飾部位 （Ｂ）位置：５．．６ （Ｄ）その池の情報；／ラベル＝　Ｘａａ／ノート＝「ホモシスティンコ （ｘｉ）　配列の状態：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２６：Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｔｙｒ　＋’ｒｏ＾ｌａ　Ｌｅｕ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２７の情報（１）　配列の特徴・ （＾）長さ：８アミノ酸 ＣＢ）種類・アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｔ）　分子の種類：ペプチド （ｘＪ）　配列の状態：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ；２７：＾ｒｄ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ 　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ１３　Ｒ＝　ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ　； 　Ｒ’　＝Ｂｚ　；　Ｒ２，Ｒ３＝Ｈ３：　Ｒ＝ＣＨ２Ｃｔ（２Ｓｉ［ＣＨ３１ ３；　Ｒ１，Ｒ２＝Ｂｚ１１２：　Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ；Ｒ１，Ｒ２＝Ｈ７、 Ｒ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３＝Ａｃ；Ｒ４＝ＣＨ３エフエクター二標的比 ＰＥＰ９（ＰＨ１）によるｉｎ　ｖｉｖｏブライミング後の日数クロロキンの濃 度（８Ｍ） エフェクター二標的比 Ｇａ１２−ＣＡＳｌｏ Ｅ／Ｔ 平均蛍光強度（ＬＯＧＩＯ） 標的細胞 標的細胞 ＧａＬ−ＧａＬ−Ｓ［：ｉＶ−１２

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子を結合することのできるペプチド成分；および（ ｉｉ）炭化水素構造体の免疫原的特異性を有する炭水化物成分よりなる、炭水化 物構造体に対してＴ細胞免疫を発生させることのできるペプチド／炭水化物コン ジュゲート。
2. ２．（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子を結合することのできるペプチド成分；および（ ｉｉ）腫瘍関連炭化水素構造体の免疫原的特異性を有する炭水化物成分よりなる 、腫瘍関連炭水化物構造体に対してＴ細胞免疫を発生させることのできる請求項 １記載のコンジュゲート。
3. ３．（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子を結合することのできるペプチド成分；および（ ｉｉ）感染性の病原体および／または感染した宿主細胞上に発現した炭水化物構 造体の免疫原的特異性を有する炭水化物成分よりなる、感染性の病原体および／ または感染した宿主細胞上に発現した炭水化物構造体に対してＴ細胞免疫を発生 させることのできる請求項１記載のコンジュゲート。
4. ４．ペプチド成分がアミノ酸５〜２５個よりなる請求項１〜１３の何れか１項記 載のコンジュゲート。
5. ５．ペプチド成分がアミノ酸８〜１２個よりなる請求項１〜４の何れか１項記載 のコンジュゲート。
6. ６．ペプチド成分がアミノ酸９個よりなる請求項１〜５の何れか１項記載のコン ジュゲート。
7. ７．ペプチド成分がヒトＭＨＣクラスＩ分子を結合することのできる請求項１〜 ６の何れか１項記載のコンジュゲート。
8. ８．ペプチド成分がアミノ酸Ｖ、Ｉ、ＬまたはＴを６位に有する前記請求項の何 れか１項記載のコンジュゲート。
9. ９．ペプチド成分がアミノ酸Ｖを６位に有する請求項８記載のコンジュゲート。
10. １０．ペプチド成分がアミノ酸ＶまたはＬをＣ末端の位置に有する請求項１〜９ の何れか１項記載のコンジュゲート。
11. １１．ペプチド成分がアミノ酸しをＣ末端の位置に有する請求項１〜１０の何れ か１項記載のコンジュゲート。
12. １２．ペプチド成分が配列ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列リスト中ＳＥＯ　ＩＤＮＯ ：３）を有する請求項１〜１１の何れか１項記載のコンジュゲート。
13. １３．Ｔ細胞受容体の高変異性領域に結合する位置で炭水化物がペプチド成分に コンジュゲートしている請求項１〜１２の何れか１項記載のコンジュゲート。
14. １４．Ｔ細胞受容体が炭水化物構造体の抗原決定基を含むことができるように炭 水化物成分がサイズ決定されている請求項１〜１３の何れか１項記載のコンジュ ゲート。
15. １５．炭水化物成分が明細書の表１に記載のものの何れかである請求項１〜１４ の何れか１項記載のコンジュゲート。
16. １６．活性成分として請求項１〜１５の何れか１項記載のコンジュゲートを含有 する製剤。
17. １７．治療に用いるための請求項１〜１５の何れか１項記載のコンジュゲート。
18. １８．請求項１〜１５の何れか１項記載のコンジュゲート有効量を患者に投与す ることからなる、特徴的な疾患関連炭水化物構造体を提示する細胞を破壊または 減衰させる能力を有する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の発生を刺激する方法。
19. １９．細胞集団を請求項１〜１５の何れか１項記載のコンジュゲートに接触させ ることよりなる、特徴的な疾患関連炭水化物構造体を提示する疾患関連細胞を破 壊または減衰させる能力を有する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を発生する方法で あって、上記細胞集団が（ａ）コンジュゲートのペプチド成分に結合できるＭＨ ＣクラスＩ分子を有する細胞、および（ｂ）ＭＨＣクラスＩ分子に結合した上記 コンジュゲートを有する細胞（ａ）との相互作用において上記能力を有するＣＴ Ｌに変換することのできる細胞を含有する、上記方法。
20. ２０．細胞集団が動物の身体から分離または単離された細胞よりなる請求項１９ 記載の方法。
21. ２１．上記疾患関連細胞を有する動物の身体に上記したとおり生産されたＣＴＬ を導入する段階を包含する請求項２０記載の方法。
22. ２２．細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が特徴的な疾患関連炭水化物構造体を提示す る細胞を破壊または減衰させる能力を有する、患者におけるＣＴＬの生産を促進 する医薬組成物の製造における請求項１〜１５のいずれか１項記載のコンジュゲ ートの使用。
23. ２３．細胞集団をコンジュゲートに接触させることよりなる手法による、特徴的 な疾患関連炭水化物構造体を提示する疾患関連細胞を破壊または減衰させる能力 を有する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生産するための医薬組成物の製造におけ る請求項１〜１５の何れか１項記載のコンジュゲートの使用であって、上記細胞 集団が（ａ）上記コンジュゲートのペプチド成分に結合することのできるＭＨＣ クラスＩ分子を有する細胞、および（ｂ）ＭＨＣクラスＩ分子に結合した上記コ ンジュゲートを有する細胞（ａ）との相互作用において上記能力を有するＣＴＬ に変換することのできる細胞を含有する、上記方法。
24. ２４．細胞集団が動物の身体から分離または単離された細胞を含有する請求項２ ３記載の使用。
25. ２５．上記疾患関連細胞を有する動物の身体に上記したとおり生産されたＣＴＬ を導入する段階を包含する請求項２４記載の使用。
26. ２６．患者に所望の免疫状態を誘導するための医薬組成物の製造のための請求項 １〜１５の何れか１項記載のコンジュゲートの使用であって、上記免疫状態が上 記コンジュゲートとＭＨＣクラスＩ分子との間の相互作用により生じたものであ り、これにより免疫系の細胞成分を刺激して上記炭水化物構造体に特異的に関連 する応答を誘導する、上記使用。
27. ２７．請求項１〜１５の何れか１項記載のコンジュゲート有効量を投与すること からなる、患者に所望の免疫状態を誘導する方法であって、上記免疫状態が上記 コンジュゲートとＭＨＣクラスＩ分子との間の相互作用により生じたものであり 、これにより免疫系の細胞成分を刺激して上記炭水化物構造体に特異的に関連す る応答を融導する、上記方法。
28. ２８．悪性疾患の治療のための医薬の製造における請求項１〜１５の何れか１項 記載のコンジュゲートの使用。
29. ２９．黒色色素細胞腫、乳癌、肺癌または胃腸癌の治療のための医薬の製造にお ける請求項２８記載の使用。
30. ３０．感染性疾患の治療のための医薬の製造における請求項１〜１５の何れか１ 項記載のコンジュゲートの使用。
31. ３１．寄生性病原体により誘発された感染性疾患の治療のための医薬の製造にお ける請求項３０記載の使用。
32. ３２．細胞内病原体により誘発された感染性疾患の治療のための医薬の製造にお ける請求項３１記載の使用。
33. ３３．請求項１〜１５の何れか１項記載のコンジュゲートの治療有効量を悪性疾 患の治療の必要な宿主に投与することによる上記疾患の治療のための方法。
34. ３４．黒色色素細胞腫瘍、乳癌、肺癌または胃腸癌の治療のための請求項３３記 載の方法。
35. ３５．請求項１〜１５の何れか１項記載のコンジュゲートの治療有効量を感染性 疾患の治療の必要な宿主に投与することによる上記疾患の治療のための方法。
36. ３６．寄生性病原体により誘発された感染性疾患の治療のための請求項３５記載 の方法。
37. ３７．細胞内病原体により誘発された感染性疾患の治療のための請求項３５記載 の方法。
38. ３８．下記段階： （ａ）ペプチド合成の知られた方法でコンジュゲートのペプチド成分を合成する 、 （ｂ）炭水化物合成の知られた方法でコンジュゲートの炭水化物成分を合成する 、 （ｃ）ペプチド成分の−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２または−ＳＨ基の１つ以上 を保護した後に、ペプチド成分を炭水化物成分に共有結合させる、 （ｄ）炭水化物成分の−ＯＨ、−Ｃ００Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＨ０または＝ＣＯ基 の１つ以上を保護した後に、炭水化物成分をペプチド成分に共有結合させる、 （ｅ）炭水化物成分の未保護の−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯまたは ＝ＣＯ基を活性化する、 （ｆ）ペプチド成分の未保護の−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２または−ＳＨ基を 活性化する、 （ｇ）炭水化物成分およびペプチド成分の少なくとも１つを２官能性の連結試薬 と反応させる、 （ｈ）所望のコンジュゲートを形成させるために、適当に保護、活性化および／ または２官能性試薬と反応している炭水化物成分とペプチド成分を共有結合的に 反応させる、（ｉ）中間体の保護されたペプチド／炭水化物コンジュゲートを脱 保護操作に付す の１つ以上からなる、請求項１〜１５の何れか１項記載のペプチド／炭水化物コ ンジュゲートの製造方法。