SI9300223A - Immunogenic peptides/carbohydrate conjugates and process for their production - Google Patents

Description

IMUNOGENI KONJUGATI PEPTID/OGIJIKOV HIDRAT IN POSTOPKI ZA NJIHOVO PRIDOBIVANJE

IMUNOGENI KONJUGATI PEPTID/OGLJIKOV HIDRAT IN POSTOPKI ZA NJIHOVO PRIDOBIVANJE

TEHNIČNO PODROČJE

Ta izum se nanaša na novo vrsto biološko aktivnih spojin, postopke za njihovo proizvodnjo in njihovo uporabo v zdravljenju. Bolj natančno, ta izum omogoča imunogene konjugate, ki so koristni za povzročanje T celične imunosti proti ogljikohidratnim strukturam, povezanim s tumorji ali proti ogljikohidratnim strukturam, ki se eksprimirajo na povzročiteljih infekcij in/ali inficiranih celicah gostiteljih.

STANJE TEHNIKE

Celična imuniteta

Imuni sistem vretenčarjev je neprestano aktiven proti mikrobom, ki jih napadajo, ter malignim celicam. Dobro je znano, da adaptivni imuni sistem kaže veliko močnejši odgovor na drugo srečanje z antigenom, v primerjavi s prvim. To dejstvo izkoriščamo v cepljenju, ki deluje tako, da povzroči stanje trajajoče imunosti, znano kot imunološki spomin. Imunološki spomin zahteva aktivacijo T limfocitov, specifičnih za povzročitelja infekcije. T limfociti odkrijejo infekcijo znotraj celic tako, da prepoznajo - preko Tceličnih receptorjev (T-cell receptor, TCR) - dele peptidov, ki izhajajo iz patogena. Vendar je večina T limfocitov MHC omejenih, tj, oni identificirajo samo komplekse peptidov, vezanih na visoko polimorfne membranske proteine, ki jih kodirajo geni vrste I in vrste Π glavnega histokompatibilnega kompleksa (MHC - major histocompatibility complex) in so prisotni na površini celic pomagalk (označujejo celico, ki predstavi antigen, ali APC - antigen presentning celi), v kateri je bil antigen predelan.

T limfocite lahko razvrstimo v CD4⁺ ali CD8⁺, odvisno od specifičnosti molekule receptorja za adherenco. CD4 adherenčni receptor prepozna molekule MHC vrste II, CD8 pa vežejo vrsto I. Poleg tega je omejevanje MHC je odvisno od neposredne vezave molekule MHC na določene dele TCR (Jorgensen et al., 1992).

CD4 T celice (T celice pomagalke) aktivirajo makrofage in B celice, ki proizvajajo pro titelesa, medtem ko CD8⁺ celice (citotoksične T celice, CTL) ubijajo celice, inficirane z virusi in bakterijami znotraj celice. Antigeni se lahko predelajo po eni od dveh poti, odvisno od njihovega porekla. V prvi poti specializirane celice, ki predstavijo antigen (pogosto makrofaga ali B celica), pogoltnejo tuj material iz zunanje celične okolice, ga razčlenijo in vežejo predelan antigen na molkule MHC vrste Π. Kompleksi se prenesejo na celično površino in ponudijo T celicam pomagalkam. Druga pot je večinoma vezana za predelovanje proteinov (processing) v celicah inficiranih z virusi, ah v malignih celicah. Ti proteini se predelujejo v celicah, tj. oni so podvrženi delni proteolizi, tako da se tvorijo fragmetni peptidov. Ti fragmenti se nato povezujejo s molekulami MHC vrste I in prenašajo na celično površino, kjer so na raspolago citotoksičnim T celicam.

Predelovanje antigenov po dveh ločenih poteh ima biološki smisel. Tako antigeni, vzeti iz okolice, sčasoma izvabijo B celice, da proizvajajo protitelesa, ki bodo sposobna zaščite organizma proti kasnejšemu izzivu eksogenih antigenov. Po drugi strani je v primeru antigenov v obliki nenavadnih struktur, ki s tvorijo v patoloških ali iztirjenih celicah (na primer inficiranih z virusom ah malignih) koristno, da je imunski sistem aktiviran in da rezultat tega končno pripelje do uničenja iztirjene celice.

Peptidi, ki vežejo MHC

V zadnjih letih je prišlo do znatnega napredka v analizi peptidov, ki se vežejo na molekule MHC vrste I in II (za pregled videti npr. Janeway, 1991; Roetzschke & Falk, 1991; Stauss, 1991; Tsomides & Eisen, 1991). Tako so odkrili, da molekule MHC vrste I vežejo kratke peptide, ki vsebujejo samo 8-12 aminokislin in da molekule MHC vrste II vežejo peptide, ki vsebujejo 10-17 aminokislin. »

Nadalje so odkrili, da se fragmenti peptidov, ki so rezultat predelave antigenov, prenašajo do celične površine vezani v žlebu na izvenceličnem delu molekule MHC. Odkrili so, da se, v primeru molekule MHC vrste I, posamezne stranske verige aminokislin, ki se nahajajo na točno določenih položajih vzdolž peptida, vežejo v žleb za vezavo peptida (Madden et al., 1991). Položaj teh žepov in aminokislin, ki jih obkrožajo, je lahko različen za različne alelne variante. Potemtakem lahko različne molekule MHC vrste I vežejo različne serije peptidov; odkrili so alel-specifične motive za različne alele MHC (Van Bleek & Nathenson, 1990; Falk et al., 1991; Jardetzky et al., 1991). Na primer, peptidi, ki se vežejo nna HLA-A2.1 imajo na položaju 2 prednostno L ali M in V ah L na položaju 9, tj. na C-terminalnem položaju (Roetzschke & Falk, 1991).

Primeri peptidov sposobnih vezave molekul MHC vrste I v glodalskem sistemu so A S N ENMETM IN SGPSNTPPEI, (SEQ ID NOS:1 in 2); oba predstavljajo molekule H-2-D . Primer pepida, sposobnega vezave molekule MHC vrste I v človeškem sistemu, je G I L G F V F T L, (SEQ ID NO: 3), ki ga predstavljajo molekule HLAA2.1 (Falk et al., 1991).

Konjugacijo peptida, ki veže MHC (vrsta Π), DYGILQINSR, (SEQ ID NO: 19), z ogljikovimhidratom, 4-0- a-D-galaktopiranozil-B-D-galaktopiranozo so opisali Elofsson et al. (1991).

W0 89/07448 odkriva sestavke za moduliranje imunega odgovora gostitelja, s uporabo peptidov, ki imajo homologijo s peptidi, ki vežejo molekule MHC vrste I.

Sintetični peptidi, kot nosilci epitopov, specifičnih za T celice

CTL lahko pridobimo iz vranice miši, namazanih s trinitroklorobenzenom (TNP) in izbranih za uničenje singenskih ciljnih celic, prevlečenih s TNP. Za nekatere CTL, ki so tako nastale, so pokazali, da prepoznajo kratke peptide iz 10 aminokislin, vezane za MHC vrste I (id⁵), s TNP vezanim za notranji (položaj 6) lizinski ostanek. Razen tega, nekatere CTL uničujejo singenske ciljne celice, ki so predelale in predstavile TNP vezan za različne nosilne proteine (MSA, BSA and KHL), kakor tudi alogenske ciljne celice, prevlečene s TNP (Ortmann et al., 1992).

Antigeni, povezani s tumorji

Možnost, da imunski sistem prepozna tumoije kot tujke (na osnovi neobičajnega karakterja tumorskih celic), bi ponudila dragoceno priložnost za razvoj učinkovitega zdravljenja raka. Pokazali so, da so v eksperimentalnih sistemih tumorji zelo imunogeni in da so sproženi imuni odgovori bili zadostni za odstranitev tumorskih celic. Vendar ima tumor, ki je produkt mnogovrstnih genetskih in adaptivnih sprememb, malo imunogeničnosti v klinični situaciji, tj. takrat, ko postane medicinski problem. Potemtakem je odkrito malo pravih proteinskih antigenov, povezanih s tumoiji, tj. antigenov, ki se eksprimirajo samo v tumorskih celicah.

V nasprotju s pomanjkanjem proteinskih antigenov povezanih s tumoiji, so na tumorskih celicah prisotne spremenjene ogljikohidratne (CHO) strukture (za pregled videti Hakomori, 1991). Te se tvorijo kot posledica bolezenskih sprememb v encimskih sistemih, odgovornih za sestavljanje CHO verig. Verige so pogosto skrajšane in rezultat tega je, da se CHO epitopi (ki so odsotni ali pa skriti na normalnih celicah) eksprimirajo na tumorskih celicah.

Spremenjene CHO strukture na tumorskih celicah lahko obstajajo v obliki glikoproteina, glikolipida ali pa kompleksa obeh teh dveh oblik. Glikoproteini se velikokrat izločajo v telesne tekočine, medtem ko je veliki del glikolipidov vezanih za membrane.

Primeri gljikov hidratovih antigenov, povezanih s tumoiji so: GM3 gangliozid, ki so ga identificirali v celicah melanoma miša B16 (Nores et al., 1987), GD3 gangliozid, povezan s človeškimi celicami melanoma (Portoukalian et al., 1979) in Gb3 gangliozid, ki se eksprimira v celicah Burkitt limfoma (Wiels et al., 1981; Brodin et al., 1988).

Ogljikovi hidrati, vezani za nalezljive bolezni

Ogljikovi hidrati, vezani za nalezljive bolezni, se lahko eksprimirajo na povzročiteljih infekcije, na iz njih izločenem ali odvrženem materialu, ali pa na površini inficiranih celic gostiteljic.

Obstajajo neki primeri dokazanih, ali domnevnih, ogljikohidrat-specifičnih odgovorov T celic, vezanih za bolezni, ki jih povzročajo povzročitelji infekcij, kot Salmonella typhimurium (Robertson et al., 1982), Leishmania major (Moll et al., 1989), Candida albicans (Domer et al., 1989) in Mycobacteria (Crowle, 1988).

Ogljikohidratne antigene povezane s HIV infekcijo so opisali Hansen et al. 1990.

Imunoterapija proti tumorjem

Imunoterapija proti tumorjem ima dolgo medicinsko zgodovino in so jo preizkušali z nespecifičnimi specifičnimi sredstvi. V ne-specifičnih manipulacijah so imunski sistem aktivirali z različnimi činitelji, takimi kot BCG, IL-2, itn., da bi povečali obstoječo osnovno imunost proti tumoiju. V specifičnih manipulacijah so konstruirali cepiva, uporabljajoč tumorske celice ali materijal izpeljan iz njih.

Imuni odgovori, ki jih posredujejo T celice, imajo odločilno vlogo v protitumomi imunosti. Medtem ko so mehanizmi aktivacije odgovora T celic proti proteinom do določene mere karakteriziram (videti zgoraj), so za ogljikove hidrate v bistvu nepoznani. Ogljikohidratni antigeni so slabi kandidati za predstavitev molekulam MHC, zaradi strukturnih omejenosti, ki jih vsiljuje žleb proteinov MHC, kjer se vežejo peptidi. Ishioka et al., (1992) so vseeno pokazali, da je CHO skupina lahko pomemben del antigenske determinante, ki jo prepoznajo T celice in sugerirali, da lahko, čeprav je izvajanje CHO-specifičnih odgovorov T celic omejeno, take odgovore izzovemo s pametno namestitvijo ogljikovga hidrata znotraj peptida, ki se veže za MHC.

Longenecker in sodelavci (WO 88/00053; Henningson et al., 1987) opisujejo uporabo Sintetičnih glukokonjugatov povezanih s tumorjem za stimulacijo protirakave T celične imunitete. V teh eksperimentih so sintetične Thomsen-Friedenreich (TF) in Tn antigene, ogljikove hidrate, ki se eksprimirajo na večini človeških adenokarcinomov, konjugirali na nosilni protein in uporabili za prikazovanje dejstva, da celice izvršilci s preobčutljivostjo zapoznelega tipa (DTH - delayed-type hypersensitivity), lahko prepoznajo in odgovorijo na ogljikohidratne determinante. S-TAG, sestavljen od TF antigena združenega z nosilcem (hemocianin morskega polža) in emulgiran v Ribievem adjuvantu, so dali mišim, ki so imele TA3-Ha adenokarcinom. Kadar je temu dajanju predhodila obdelava s ciklofosfamidom je opaženo 50-90% dolgoročno preživetje gostiteljev (Fung et al., 1990).

Thurin et al (1991) opisujejo konjugat, ki vsebuje: (i) ogljikohidratni hapten povezan s tumorjem, (ii) peptid, ki vsebuje virusni epitop T celice pomagalke miša in (iii) adjuvant na osnovi Quil-A glikozida. Miši, ki so jih imunizirali s konjugatom, so kazale IgM odgovore specifične za hapten skupaj z reaktivnostjo pomagalk T celic na virusni epitop.

CILJ IZUMA

Glavni cilj izuma je omogočiti sredstva za povzročanje T-celične imunitete proti ogljikohidratni strukturi, zlasti protitumorske imunitete zoper ogljikohidratne antigene.

Čeprav stanje tehnike kaže na možnost povzročanja protitumorske imunitete zoper ogljikohidratne antigene s sintetičnim cepivom, se v praksi ta cilj izmika. Na primer, za Longeneckeijeve S-TAG (opisane v predhodnem oddelku) uporabljajo kot nosilca ogljikohidratne strukture običajen protein. Tak protein se mora proteolitično cepiti, preden se lahko pojavi na celični površini, kar pomeni, da ni kontrole nad tem, kar se na koncu predstavi TCR. Poleg tega, veliki nosilni protein vsebuje več različnih epitopov, ki konkurirajo za T celice.

Nadalje, ne glede na glavno raziskavo, imajo dosedanji napori stroke, da se razvije imunološko zdravljenje raka, razočaravajoče rezultate. Poleg tega so imeli prejšnji strokovni postopki za stimuliranje imunih odgovorov zoper antigene, vezane s ogljikovimi hidrati, omejen uspeh, zlasti v primerih kjer je zaželeno stimulirati imuni odgovor proti ogljikohidratni strukturi, ki je povezana z boleznijo, na primer taki, ki se eksprimira na tumorskih celicah, toda ne na normalnih celicah.

Ta izum se dviga nad dosedanjim stanjem na področju s tem, da omogoča novo vrsto konjugatov, ki vsebujejo peptide, vezujoče se na MHC vrste I, skupaj z ogljikohidratno strukturo, ki jo lahko uporabimo, inter aha, v razvoju sintetičnih cepiv za izvabljanje protitumorske imunitete. Nadalje so konjugati po izumu sposobni povzročiti odgovor citotoksičnih T celic, namesto pomagalk T celic, proti takim ogljikohidratnim strukturam. Nadalje, konjugati po izumu dopuščajo višjo stopnjo kontrole (1) identitete predstavljenega epitopa in (2) povzročitelja razvoja klonov T celic.

Nadaljni cilj tega izuma je omogočiti produkcijo T celic specifičnih za ogljikov hidrat, tj. citotoksičnih T celic, ki se pojavijo kot rezultat uporabe peptidov, ki se vežejo na MHC vrste I. Ni nujno, da so T celice, specifične za ogljikov hidrat, ki so razmnožene po izumu, MHC-omejene. Potemtakem lahko celice, ki so se razmnožile v enem posamezniku, reagirajo s celicami iz drugega posameznika, iste ali celo druge vrste.

Povzročanje pojave T celic, specifičnih za ogljikov hidrat, je torej po tem izumu popolnoma različno od predhodnih eksperimentov na tem področju, kjer je izzvani odgovor pomagalk T cehe usmerjen na peptidni epitop, kakor tudi tistih, kjer so hapteni konjugirani z nosilnimi proteini z namenom, da se doseže odgovor protiteles zoper hapten, ali kjer Thurin et al. širijo ta koncept na uporabo definiranih peptidov, ki se vežejo za MHC vrste Π.

ODKRITJE IZUMA

Kot smo naznačili je bil namen izuma s konjugacijo s ustrezno ogljikohidratno strukturo doseči primeren peptid, sposoben vezave molekule MHC vrste L S konjugacijo ogljikovega hidrata s peptidom v najboljšem položaju, lahko ogljikohidratni antigen pridobi visoko afiniteto za TCR; tako lahko odgovor postane neodvisen od receptorjev za adherence, tj. T celice ne bodo MHC omejene. To bo ustvarilo CHO-specifične odgovore obeh vrst T celic, tako citotoksičnih, kakor pomagalk.

Področje uporabe

Konjugate po izumu lahko uporabljamo za zdravljenje malignih obolenj, vključno melanoma, raka dojk, raka pljuč in gastrointestinalnega raka. Nadalje jih lahko uporabljamo za zdravljenje bolezni s povzročitelji infekcije povzročeno ekspresijo ogljikohidratne ciljne molekule.

Konjugate izuma lahko uporabljamo za indukcijo odgovorov T celic in vivo z namenom odprave tumoijev in/ali infekcij. Lahko jih uporabimo tudi za indukcijo odgovorov t celic in vitro s postopkom izven telesne stimulacije za kasnejšo reinfuzijo aktiviranih T celic v bolnike.

Odvisno od vrste doseženega imunega odgovora, lahko konjugate dajemo enkrat ali, če je nujno, s nenehnimi, rednimi imunizacijami.

POROČILO IZUMA

Po prvem vidiku izuma so omogočeni konjugati, sposobni povzročanja T celične imunosti proti ogljikohidratni strukturi; omenjeni konjugat vsebuje: (i) peptidno komponento, sposobno vezave molekule MHC vrste I in (ii) ogljikohidratno komponento, ki kaže imu nogeno specifičnost omenjene ogljikohidratne strukture.

Izum nadalje omogoča metodo stimuliranja produkcije citotoksičnih T celic (CTL) v bolniku, kjer imajo omenjene CTL potencial za uničenje ali razredčenje celic, ki predstavijo značilno ogljikohidratno stukturo povezano s obolenjem, ki obsega dajanje bolniku učinkovitega odmerka konjugata kot smo ga tu definirali.

Po izumu je tudi preskrbljena metoda produkcije citotoksičnih T celic (CTL), ki imajo potencial za uničenje ali razredčenje celic povezanih z obolenjem, ki predstavijo značilno, z boleznijo povezano ogljikohidratno strukturo; metoda obsega ustvarjanje stika celične populacije s konjugatom, kot je tu določen, kjer omenjena celična populacija vključuje (a) celice, ki imajo molekule MHC vrste I, sposobne vezave za peptidno komponento omenjenega konjugata in (b) celice, sposobne pretvorbe v CTL, ki imajo omenjeni potencial za interakcijo s celicami (a), pri katerih je omenjeni konjugat vezan na molekulo MHC vrste I.

CTL lahko proizvajamo na opisani način, z dajanjem konjugata peptid/ogljikov hidrat živali, s čimer se CTL proizvajajo in vivo. Alternativno lahko CTL proizvajamo in vitro z ostvaritvijo stikov celic, ki smo jih odstranili iz telesa živali, s konjugatom peptid/ogljikov hidrat. Na tak način proizvedene CTL lahko potem dajemo (npr. z njihovim uvajanjem v isto ali različno žival) kot del režima zdravljenja.

Izum nadalje omogoča uporabo konjugatov peptid/ogljikov hidrat, opisanih v tem besedilu, za izdelavo farmacevtskih sestavkov.

Bolj specifično, omogočena je uporaba konjugatov za izdelavo farmacevtskih sestavkov za indukcijo želenega imunološkega statusa pri bolniku, v katerem omenjeni imunološki status nastane v interakciji med omenjenim konjugatom in molekulo MHC vrste I, s čimer celično komponento imunološkega sistema stimuliramo na indukcijo odgovora specifično povezanega z omenjeno ogljkohidratno strukturo.

Priporočljivo je, da imajo peptidna komponenta in ogljikohidratna komponenta ter ogljikovi hidrati po izumu značilnosti objavljene v sledečih odstavkih.

Peptidna komponenta

Pomembna odlika konjugatov peptid/ogljikov hidrat tega izuma je, da mora biti njihova peptidna komponenta sposobna vezave molekule MHC vrste I. Za dani peptid lahko sposobnost, da veže molekulo MHC vrste I, določimo na več načinov. Tako ima na primer peptid lahko določene izbrane strukturne značilnosti, take kot velikost ali prisotnost posebnih aminokislinskih ostankov na specificiranih položajih. Alternativno ali dodatno lahko sposobnost kandidata polipeptida, da veže molekulo MHC vrste I, empirično ocenimo z izvajanjem enega ali več imunoloških preizkusov. Kot nadaljno alternativo imajo lahko peptidna komponenta ali konjugati peptid/ogljikovi hidrati izuma sekvenco ali motiv, ki je v bistvu identičen sekvenci peptida, ki smo ga izolirali z disociranjem naravnih kompleksov med peptidom in molekulo MHC vrste I. Vsakega od teh indikatoijev sposobnosti peptida, da veže molekulo MHC vrste I, bomo spodaj opisali v nadaljnih podrobnostih.

Posebno se sklicujemo na tri članke (Fremont et al., 1992, Matsamura et al., 1992 in Latron et al., 1992), ki so se pojavili v Science, Vol. 257, 14. avgust 1992.

Ti članki opisujejo značilnosti motivov peptidov, ki so sposobni vezave molekul MHC vrste I, s posebno referenco na molekulo MHC vrtse I H-2K*³ glodalcev in človeško molekulo HLA-A2 vrste I (zadnja je prisotna v približno 40 človeške populacije).

Značilnost molekul MHC vrste I, ki je povezana z njihovo kapaciteto, da vežejo vrsto karaktEristično prepoznanih peptidov, je prisotnost žleba, ki določa serijo na splošno šestih ti. žepov, ki spravijo ali usidrajo strukturne elemente peptidov, Id so sposobni za vezavo. Žleb ali razpoka, ki veže peptide, je stransko omejena z dvema a-vijačnicama, medtem ko je dno določeno z β -nagubano ravnino.

Od šestih žepov (navadno označenih A, B, C, D, E in F) sta običajno dva razmeščena tako, da spravita NH2, oziroma -COOH terminalni del peptida.

Peptidno komponento konjugata prednostno izberemo med peptidi, ki imajo najugodnejše število aminokislin za vezavo molekul MHC vrste I, tj. 5-25 aminokislin, zlasti 8-12 aminokislin; izbrali smo tako velikost, da omogoča pravilno vezavo v žlebu, ki veže peptide. Najboljša velikost peptida, ki omogoča učinkovito vezavo v Žlebu molekule MHC vrste I, je 8 ali 9 aminokislin, posebno priporočamo 9 aminokislin.

Najbolj prednostno ima peptidna komponenta konjugatov po izumu na C-teiminalnem položaju hidrofobno aminokislin, da je vezava v žepu F olajšana. Druge aminokisline peptidne komponente prednostno izberemo tako, da se prilagodijo v drugih žepih žleba, ki veže peptid. Selekciji ustreznih in prednostnih aminokislinskih ostankov lahko pomagajo tehnike molekulskega modeliranja na osnovi računalniških programov, kot je opisal npr. Masazumi (1992).

Peptid lahko sintetiziramo s znanimi metodami. Imunogeničnost peptidnega dela konjugata lahko nadalje povečamo s kemičnimi modifikacijami. Konjugati, ki vsebujejo take modificirane peptide, so del izuma.

Peptide, ki jih bomo sintetizirali, lahko izberemo med tistimi, ki jih poznamo iz literature, ali med tistimi, čigar imunogeničnost je določena s znanimi metodami. V zadnjem primeru lahko peptide izoliramo iz lizatov celih celic ali iz očiščenih molekul MHC in ločenih z npr. tekočo kromatografijo visokega učinka (HPLC). Najboljša vezava peptida na molekulo MHC se odraža v visoki stabilnosti kompleksa MHC-peptid na površini celic, ki predstavijo antigen.

Izum nadalje omogoča postopek pridobivanja konjugata peptid/ogljikov hidrat, kot smo ga zgoraj definirali, ki obsega eno ali več sledečih stopenj:

(a) sintezo peptične komponente konjugata s znanimi tehnikami peptične sinteze, (b) sintezo ogljikohičratne komponente konjugata s znanimi tehnikami sinteze ogljikovih hidratov, (c) zaščito ene ali več -COOH, -OH, -14¾ ali -SH skupin peptične komponente, prečen peptično komponento kovalentno vežemo za ogljikohidratno komponento, (d) zaščito ene ali več -OH, -COOH, -NH2» ‘CHO ali =CO skupin ogljikohidratne komponente, preden ogljkohidratno koponento kovalentno vežemo za peptidno komponento, (e) aktiviranje nezaščitene -OH, -COOH, -14¾. -CHO ali =CO skupine ogljikohidratne komponente, (f) aktiviranje nezaščitene -OH, -COOH, -14¾ ali -SH skupine peptične komponente, (g) pretvorbo najmanj ene od ogljikohidratnih komponent in peptične komponente z bifunkcionalnim povezujočim reagentom, (h) pretvorbo ogljikohidratne komponente in peptične komponente kovalentno, tako da tvorijo želene konjugate, omenjene komponente so pri tem primemo zaščitene, aktivirane in/ali pretvoijene z bifunkcionalnim povezujočim reagentom, (i) izpostavljanje vmesno zaščitenega konjugata peptid/ogljikov hidrat postopku odščite.

V tem kontekstu lahko potemtakem peptid sposoben vezave molekule MHC vrste I nadalje definiramo kot peptid, čigar kompleks z molekulo MHC vrste I bo stabilen na površini celice, ki predstavi antigen.

Stabilnost zgoraj omenjenega kompleksa lahko merimo s preizkusi in vitro, znanimi strokovnjakom. Lahko jo merimo kot dolgoročno ekspresijo na površini celice, zaradi počasnega razpada kompleksa. Druga karakteristika, ki odraža visoko stabilnost, je senzibilizacija ciljnih celic za ustrezne CTL pri zelo nizki koncentraciji peptida. Stabilnost se lahko odraža tudi kapaciteta peptidov, da regulirajo povečano ekspresijo ustreznih molekul vrste I na določenih ciljnih celicah in vitro, pri nizkih molskih koncentracijah.

Stabilnost je tudi v zvezi z visoko imunogeničnostjo in vivo, kadar kratke peptide injiciramo naravnost v miši.

Kapaciteto glikopeptida, da se veže na molekulo MHC vrste I, lahko ocenimo z izvajanjem imunoloških preizkusov, planiranih tako, da odkrijejo eno ali več naslednjih značilnosti:

(1) glikopeptid, ki se veže na topne MHC-I, kar pripelje do tvorbe kompleksov, ki jih lahko odkrijemo na primer z monoklonskimi protitelesi odvisnimi od konfiguracije, ali s priključitvijo označenega B2-tnikro-globulina, s uporabo običajnih biokemičnih tehnik;

(2) ekspresijo CHO dela potem, ko se je glikopeptid vezal na prazne molekule MHC-I na površini celice gostiteljice, ki je mutirala (take kot so RMA-S in T2 celice); CHO del lahko potem odkrijemo s CHO-specifičnimi monoklonskimi protitelesi, takimi kot MC2102 (Gal2 specifičnimi).

(3) povišano regulacijo ustreznih MHC-I restrikcijskih elementov z glikopeptidi, s uporabo MHC-I specifičnih protiteles.

(4) kapaciteto glikopeptidov da reciklizirajo (videti Oddelek 3 spodaj ZUNANJI MHC-1 VEZUJOČI PEPTIDI SE RECIKLIZIRAJO NA CELIČNO POVRŠINO, POTEM KO SO PREDHODNO PREŠLI V NOTRANJOST CELICE).

Da bi izvršili te preizkuse, lahko uporabimo razpoložljiva protitelesa, ki so sposobna detekcije specifičnih ogljikovih hidratov. Poseben primer za njih je tržno razpoložljivo monoklonsko protitelo MC2102 (New Biocarb, Lund. Švedska), ki je sposobno detekcije ogljikovega hidrata Ga^·

Te postopke lahko uporabimo, da bi ocenili kapaciteto danega peptida za vezavo na molekule MHC vrste I na sledeči način.

Najprej sintetiziramo glikopeptid, v katerem je Ga^ kovalentno vezan na peptid. Nato lahko preizkusimo kapaciteto glikopeptida, da veže molekule MHC vrste I na ciljni celici, ki predstavi antigen, ter ogljikohidratnega dela, da se eksprimira, tj. veže v konfiguraciji, v kateri se epitop Ga^ nahaja na položaju, na katerem ga lahko odkrijemo s specifičnim protitelesom. Dodatno lahko ocenimo povišano regulacijo ustreznih MHC-I restrikcijskih elementov z določanjem kapacitete celic, ki predstavijo antigen, da vzajemno delujejo na protitelesa proti-MHC vrste I.

Kapaciteto konjugata, da se reciklira, lahko ocenimo z inkubiranjem celic (z vezanim konjugatom) pri 37°C, nakar bo glikopeptid prešel v notranjost celic. Temperaturo lahko nato znižamo in celice obdelamo s proteolitičnim encimom (npr. pronazo), da bi odluščili izpostavljene konjugate peptid/ogljikov hidrat. Pri ponovnem segrevanju lahko reciklirani konjugat dokažemo s sondiranjem za Ga^ epitop, uporabljajoč proti-Ga^ protitelo.

V nadaljnem preizkusu lahko testiramo konjugat v imunizacijskih eksperimentih in ocenimo njegovo kapaciteto stimuliranja tvorbe CTL. V kontrolnih eksperimentih lahko testiramo razmnožene CTL proti peptidni komponenti (brez ogljikohidratne komponente), da dokažemo, da je opažena CTL-stimulacija povezana z ogljikovim hidratom (videti odstavek Eksperimentalni preizkusni sistem spodaj).

Ogljikohidratna komponenta

Ogljikohidratni del konjugata lahko sintetiziramo s znanimi metodami in ga prednostno izberemo med ogljikohidratnimi strukturami, ki:

(a) se stabilno eksprimirajo na ciljni celici, tako daje zmeraj isti del navzven izpostavljen receptorju T celice;

(b) so zelo gosto posejani na ciljni celici, tako da lahko sprožijo receptorje na T celicah neodvisno od MHC restrikcije in receptorjev za adherenco; in (c) se močno vežejo na membrano, tako da je odpravljeno izločanje v splošno cirkulacijo. Nasprotno je možno, da topni ogljikovi hidrati delajo probleme, zaradi indukcije perifernih supresorskih T celic in blokiranja izvajanja zaščitne imunosti.

Nadaljna prednost izbora ogljikovega hidrata z visoko ekspresijo na ciljnih celicah je, da taka visoka ekspresija lahko pripelje do sekundarnih modifikacij v membrani, kar poveča specifičnost izpostavljenih CHO epitopov pri ciljnih celicah.

Velikost ogljikovega hidrata mora biti taka, da omogoča T celičnemu receptorju, da obkroži CHO epitop. Priporočljiva velikost, na katero pa izum ni omejen, je polovica dolžine peptida.

Čeprav posamezne sladkorne skupine niso izključene, bo prednostno ogljikohidratna komponenta konjugata vključevala najmanj dve povezani sladkorni skupini, tj. ona bo disaharid ali oligosaharid. Precizno število povezanih sladkornih skupin bo odvisno od imunogenične specifičnosti ogljikohidratne strukture, toda prisotno je lahko 3,4, 5 ali več povezanih sladkornih skupin.

Prednostno bo zgornja meja velikosti ogljikohidratne komponente določena s zahtevo, da mora biti tako velika, da omogoči T celičnemu receptorju, da istočasno obkroži epitop ogljikohidratne strukture in tudi restrikcijski element skupine 1. Tipične zgornje meje so ne več kot 10 sladkornih skupin, prednostno ne več kot 8 in najbolj prednostno ne več kot 5. Zato so območja, ki jih priporočamo, od 1 do 10, bolj prednostno od 1 do 8 in najbolj prednostno od 1 do 5 sladkornih skupin. Za vsako od teh prednostnih območij se lahko spodnja meja 1 poveča na 2, 3, 4 ali 5, če je želeno.

Posamezne sladkorne skupine prednostno izberemo med aldopentozami, ketopentozami, aldoheksozami in ketoheksozami. Lahko so v linearni ali pa ciklični obliki in, če je želeno, derivatirane z oksidacijo, redukcijo, aminiranjem, acetiliranjem ali katerokoli njihovo kombinacijo. Oksidacija lahko vključi pretvorbo ene ali več -CH2OH skupin v -CHO ali COOH skupino, kakor tudi presnovo -CHOH- skupine v -CH2- skupino. Redukcija lahko vključi katerokoli od obratnih pretvorb. Aldopentoze vključujejo Dribozo, D-arabinozo, D-ksilozo in D-liksozo, kakor tudi njihove druge stereoizomere, tj. L-izomere. Aldoheksoze vključujejo D-alozo, D-altrozo, D-glukozo, D-manozo, D-gulozo, D-idozo, D-galaktozo in D-talozo, kakor tudi njihove druge stereoizomere. Ketopentoze vključujejo D-ribulozo in D-ksilulozo, kakor tudi njihove druge stereoizomere, tj. Lizomere. Ketoheksoze vključujejo D-psikozo, D-fruktozo, D-sorbozo in D-tagatozo, kakor tudi njihove druge stereoizomere, tj. L-izomere. Kadar so v ciklični obliki, so sladkorne skupine lahko v a- ali β-konfiguraciji in (če je primemo) v piranozni ali furanozni obliki.

Najbolj prednostno ogljikohidratna komponenta vsebuje eno ali več sladkornih skupin, izbranih med tistimi, ki se navadno nahajajo v ogljikohidratnih delih glikolipidov in glikoproteinov. Te vključujejo β-L-fukozo (Fuc), β-D-galaktozo (Gal), β-D-N-acetilgalaktozamin (Gal NAC), β-D-N-acetilglukozamin (Glc NAC), β-D-manozo (Man), nevraminsko kislino (Neu) in sialinsko kislino (Sia).

Nadaljni primeri ustreznih tumorskih tarč so ogljikohidratne komponente, prikladne za CHO dele globo/ganglio serij glikolipidov, ker so večinoma vezane na membrane in se ne izločajo (videti Oettgen, 1989; Poglavje 6 General Concept of Tumor associated Antigene: Their Chemical, Physical, and Enzymatic Basic).

Način povezave sosednjih sladkornih skupin ni kritičen, tj. povezovanje se lahko izpelje preko kateregakoli ogljikovega atoma 1 do 5 pentoz in kateregakoli od ogljikovih atomov 1 do 6 heksoz. Nadalje, povezava je lahko bodisi α, bodisi β.

Najbolj priporočamo povezavo, ki vključuje ogljikove atome 3 in 4, prednostno z β konfiguracijo.

Ogljikohidratno komponento in peptidno komponento lahko konjugiramo (ali kovalentno povežemo eno z drugo) s katerimkoli prikladnim sredstvom. V primeru, da peptidna komponenta vključuje aminokislino, ki nosi hidroksilno skupino (tj, kot v serinu, treoninu ali tirozinu), je lahko povezava izvršena preko O-glikozidne vezi. V primeru, da peptidna komponenta vključuje aminokislino, ki vsebuje -NH2 stransko verigo (kot pri asparaginu), je lahko povezava izvršena preko N-glikozidne vezi.

Alternativno lahko spojitev vključuje uvedbo t.i. vmesne skupine (spacer arm) med ogljikohidratno komponento in peptidno komponento. Tako na primer tam, kjer peptidna komponenta vključuje aminokislino (cistein), ki ima -SH stransko verigo, lahko ogljikohidratno komponento povežemo s -SH stransko verigo preko -(C_nH2_n)-O- povezave, v kateri je n >2, prednostno 2 do 4.

Položaj ogljikohidratne komponente na konjugatu peptid/ogljikov hidrat prednostno izberemo tako, da ko je vezana za molekulo MHC vrste I, ogljikohidratna komponenta zavzame na splošno osrednji položaj v žlebu, kjer se veže peptid; najmanj en del ogljikohidratne komponente štrli iz žleba tako, da se lahko predstavi citotoksičnim T celicam (CTL).

Primeri ogljikovih hidratov, primernih za konjugacijo

Primeri ogljikohidratnih struktur, povezanih s človeškimi tumorji ali nalezljivimi obolenji, ter primernih za konjugacijo, so podani spodaj, v tabeli 1. Naznačeni tumorji so primeri tipov raka, občutljivih na zdravljenje s konjugati tega izuma. Za namene tega opisa je potrebno termin ogljikohidratne strukture razumeti kot, da obsega derivate s primeri podanih ogljikovih hidratov, takih kot so npr. laktoni in laktami.

TABELA 1

1. OGLJIKOVI HIDRATI, POVEZANI S ČLOVEŠKIMI TUMORJI

1.1 Večina tumoijev:

Galp4GlcpCer Lactosilceramid

1.2 Melanom

NeuAca8NeuAca3Ga^4GlcpCer GD3

9-O-AC-GD3

NeuAca8NeuAca3(GalNAcp4)Gaip4GlcpCer GD2

9-O-Ac-GD£

Njihove laktonizirane oblike

1.3 Rak debelega čreva in drugi tipi raka:

GalNAca-SerfThr) (glycoprotein)	Tn-antigen
NeuAca6GalNAca-Ser(Thr)	Sial i l-Tn-antigen
Galp3GlcNAc	Tipe 1 veriga
NeuAca3Gaip3(Fuca4)GlcNAcp	Sial il-Lewis a
NeuAca3Gaip3(Fuca4)[NeuAca6]GlcNAcp	Disialii l-Lewis a
Gaip3(Fuca4)G1cNAcpGalp3(Fuca4)GlcNA£	' Dimer Lewis a
NeuAca3Galp4(Fuca3)G!cNAp	Sial i l-Lewis x
Galp4(Fuca3)GlcNAcp3Galp4(Fuca3)GlcNAcP	Dimer Lewis x
63ΐβ4(Ρυοα3)ΰΙοΝΑβ3θ3ΐβ4(Ρυοα3)6ΙοΝΑοβ3θ3ΐβ4(Ρυοα3)ΟΙοΝΑοβ
NeuAca3-Dimer Lewis x NeuAca3-Trimer Lewis x NeuAca6-Oligomer Lewis x	Trimer Lewis x

Njihove laktonizirane oblike v primeru stalinske kisline

1.4 Rak pljuč in drugi tipi raka Galp4GlcNAcp3Ga^4GlcNAcp

Gaip3(Fuca4)GlcNAc£Gaip4(Fuca3)GlcNAcp Fuca2Galp3GalNAcp4(NeuAca3)Galp4GlcpCer Laktonizirane oblike Fuc-GMI i-antigen (rep. laktozamin ) l_ewis a - Lewis x Fuc-GM1

1.5 Burkittov limfom

Gala4Gaip4GlcpCer Gb3

1.6 Rak dojk

Fuca2Gal^3GalNAcP3Gala4Gaip4Glc3Cer Fuc-Globopenta

Tn-antigen

Sialil-Tn-antigen

1.7 Teratokarcinom

ΝθυΑοα3β3ΐβ363ΐΝΑοβ363ΐα463ΐβ46ΙοβΟβΓ Sial i l-Globopenta Laktonizirana oblika zgornjega

2. OGLJIKOVI HIDRATI, POVEZANI Z EKPERIMENTALNIMI TUMORJI

2.1 Melanom (hrček)

NeuAca3Ga$4Gk#Cer * GM3

GD3

9-O-Ac-GD3

GD2

Njihove laktonizirane oblike

2.2 Melanom (miš) GM3

Laktonizirani GM3

3. OGLJIKOVI HIDRATI, POVEZANI S POVZROČITELJI NALEZLJIVIH BOLEZNI

Manan iz Candida albicans

Polisaharidni izolat iz Mycobacterium bovis sev BCG

Lipofosfoglikan iz Leishmania major

O-antigenski polisaharid! iz Salmonela typhimurium

4. OGLJIKOVI HIDRATI POVEZANI S HIV

Fuca2galp4(Fuca3)GlcNAcp

GalNAca3(Fuca2)Gaip3GlcNAcp

NeuAca6GalNAca-Ser(Thr)

GalNAca-Ser(Thr)

Lewis y Blood group A₁ Sialyl T_n antigen T_n antigen

Prednostne karakteristike konjugata

Ogljikov hidrat lahko združimo z nosilnim proteinom aminoterminalno, karboskiterminalno, ali pa ga lahko združimo z notranjimi aminokislinami. Kot je naznačeno, priporočamo notranjo združitev.

Poleg tega, kot smo zgoraj opisali, v literaturi je za peptide, ki se vežejo na različne molekule MHC, definirano specifično usidranje aminokislin, ki se vežejo v žepih na molekuli MHC. Te usidrane aminokisline ne priporočamo za konjugacijo z ogljikohidratno strukturo.

Sintetičen ogljikov hidrat mora imeti molekulsko stabilnost visoke stopnje, kadar je konjugiran z nosilnim proteinom, da bi izpostavil ogljikohidratni epitop z visoko specifičnostjo. Položaj ogljikovega hidrata v konjugatu bi moral biti taka, da T celični receptor lahko prepozna CHO epitop in tako povzroči najboljšo sprožitev T celic.

Nadalje, velikost in položaj CHO morata biti najboljša za prepoznavanje TCR, zlasti s trejim komplementarnim področjem (CDR3), ki določa komplementarnost (CD3). Prednostni položaj, s katerim pa izum ni omejen, je na sredi glikopeptida.

CHO in peptid lahko konjugiramo preko poljubnih povezujočih elementov. Taki povezujoči elementi so lahko dodatne aminokisline, npr. cistein ali druge primerne kemične spojine.

Eksperimentalni preizkusni sistem

Imunogeničnost konjugatov izuma lahko testiramo v imunizacijskih eksperimentih, znanih strokovnjaku. CHO specifičnost lahko analiziramo s criss-cross eksperimenti: T-celice, ko odgovarajajo konjugatu CHO-A, v katerem A označuje peptid, testiramo s CHO-A, samim peptidom, CHO-B, kjer B označuje peptid, različen od A, in peptidom B samim. Če, npr. CTL, ki odgovaija na CHO-A, uničuje tudi celice, ki predstavijo CHO-B, ne pa celic, ki predstavijo same peptide, lahko zaključimo, da je odgovor CHO-specifiČen. Poleg tega lahko T celice testiramo proti ciljnim celicam, ki eksprimirajo CHO del v obliki glikolipida.

Farmacevtski sestavki

Konjugate po izumu lahko dajemo v običajnih dozirnih oblikah. Kadar jih dajemo v obliki cepiv, priporočamo, da vsebujejo enega ali pa več primernih adjuvantov.

Odkrili so, da dajanje konjugatov peptid/ogljikov hidrat, po izumu, lahko povzroči vezavo konjugatov na prazne molekule MHC, ki se nahajajo na površini celice. Taka vezava je mogoča, če je glikopeptid bil sintetično pred-predelan, tj. ni moral vstopiti v citosol, da bi bil predelan.

Alternativno lahko konjugate vgradimo v strukture, sposobne olajšave premestitve v cito sol, da bi se tako dosegla zgodnja vezava na molekule MHC. Take strukture so lahko liposomi ali imunostimulirajoči kompkeksi (iskom) (Morein et al., 1984).

Naslednji primeri ilustrirajo sintezo konjugatov po izumu.

PRIMERI

1. PRIPRAVA GLIKOKONJUGATOV

1.1. Sinteza glikopeptidov

Glikopeptide lahko sintetiziramo na primer s združitvijo predhodno pripravljenih glikozidov, ki služijo kot vmesna skupina - razmikalnica, s peptidi, ki vsebujejo tiolno funkcijo.

Tako smo v peptično sekvenco uvedli cisteinsko skupino in nukleofilne lastnosti žveplovega atoma izkoristili, da smo tioetemo povezovanje med peptidom in elektrofilno vmesno skupino, povezano z glikozidno vezjo na ogljikohidratni del molekule. Kot vmesni skupini smo uporabili 3-bromo-2-bromometilprop-l-il (DIB) (Magnusson et al., 1982) in 2-bromoetil (Dahmen et al., 1983 b) skupini. S to strategijo je bilo mogoče združiti ogljikove hidrate, ki so predstavljali različne epitope in antigenske determinante, z isto peptidno sekvenco. To smo pa lahko pridobili s standardnimi tehnikami sinteze peptidov in pred konjugiranjem preizkusili, Če je biološko aktivna. Na ta način smo čas, potreben za sinteze peptida, obdržali na najmanjši meri.

Reakcije združitve smo izvedli v dimetilsulfoksidu ali N,N-dimetilformamidu.

Pred združitvijo smo iz DIB skupine odstranili bromovodik s uporabo Ν,Ν,Ν,Νtetrabutilamonijevega fluorida (Magnusson et al., 1982). Dobljeni alil bromid smo nato presnovili s peptidom, ki je vseboval cistein. Zaradi stranskih reakcij, takih kot tvorba nereaktivnih alilnih fluoridov, s to metodo nismo mogli dobiti nazaj presežek uporabljenega ogljikohidratnega derivata.

V primeru, da smo uporabljali 2-bromoetil glikozide, je kot pospeševalec služil cezijev karbonat (Dahmen et al., 1983 b).

Količina Ν,Ν,Ν,Ν-tetrabutilamonijevega fluorida ali cezijevega karbonata, ki smo ga potrebovali za združitev, je bila odvisna od vključene trifluoroocetne kisline v uporabljenih peptidih. Količina vključene trifluoroocetne kisline se je spreminjala, odvisno od serije in strukture peptida. Izbira in količina topila sta bili določeni z lastnostmi topnosti peptida.

Reakcije združitve smo spremljali s HPLC in jih ustavili z dodatkom vode, ki je vsebovala 0,1% trifluoroocetne kisline. Nastale glikopeptide smo očistili s preparativno HPLC ter molekulske mase produktov potrdili s FAB MS.

Tako za nasičene, kot za alilne bromide so objavili, da reagirajo s cisteinskimi tioli v nezaščitenih peptidih, tako da kot glavni produkti nastanejo S-alkilirani peptidi.

Yang et al., (1991) so pripravili famezilirane peptide s pretvorbo okta- in pentadekapeptidov, ki so vsebovali cistein, s famezil bromidom, pri pH 6-9, v zmeseh N.Ndimetilformamid/dimetilsulfoksid/acetonitril. Kot pospeševalca so uporabili N,Ndiizopropiletilamin. Objavili so, daje S-alldliranje bilo odlično celo pri pH 10-12.

Izvedli smo tudi selektivno S-alkiliranje peptidov, ki so vsebovali cistein (Or et al., 1991) v metanolni ali etanolni raztopini amoniaka, uporabljajoč različna sredstva za alkiliranje, npr. derivat primarnega brcenopropila.

1.2. Sinteza vmesnih razmikalnih glikozidov (slike 1 in 2)

Primeri glikozidov, ki smo jih kot vmesne skupine uporabljali za združitve, so DIB β-glukozidi in 2-bromoetil β-glukozidi iz NeuNAca3Gal B4Glc (3-silillaktoze), 2bromoetil β-glukozidi iz Gala4Gal in Gala4GalB4Glc ter 2-bromoetil glikozidi iz GM3 laktama (spojine 9, 15, 28, 48, oziroma 55).

DIB β-glukozide iz 3-sialillaktoze (9) smo sintetizirali v enajstih stopnjah iz 2trimetilsililetil 2,3,6-tri-O-acetil-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-B -D-galaktopiranozil)- β-Dglukopiranozida (1) (Jansson etal., 1988). Z deacetiliranjem (1) smo dobili (2), ki smo ga izopropilidenirali in benzilirali, da smo dobili z benzilom zaščiten derivat 3’,4’-Oizopropiliden laktoze (3). S hidrolizo 3’,4’-acetala smo dobili glikozilni akceptor (4), s celotnim dobitkom 51%. Z glikoziliranjem (Marra in Sinay, 1990) derivata laktoze (4) v acetonitrilu pri -23°C, ob uporabi z acetilom zaščitenega a-ksantata (5) (Marra in Sinay, 1989) metil estra stalinske kisline, kot donotja glikozila, ter dimetil(metiltio)sulfonijevega trifluorometansulfonata (DMTST), kot pospeševalca, smo dobili, po debenziliranju in acetiliranju, derivat trisaharida (6) z dobitkom 17,5%. Lahkoto očiščevanja in dobitek (6) smo rahlo izboljšali, ko smo acetiliranje nepresnovljenih hidroksi funkcionalnih skupin produktov reakcije izvedli pred hidrogenolizo benzil etrov. 2-trimetilsililetil glikozide (6) smo pretvorili (Jansson et al., 1988) v ustrezni 1 β-acetat (7), ki smo ga uporabili kot donor glikozila v glikoziliranju 3-bromo-2-bromometilpropan-l-ola, kataliziranega z Lewisovo kislino, da smo dobili zaščiten β-glikozid (8) z dobitkom 46%. Z odščito (8) z metanolno raztopino natrijevega metoksida, ki mu je sledila vodno metanolna raztopina natrijevega hidroksida, smo dobili DIB β-glikozid 3-sialillaktoze (9), ki smo ga, potem ko smo odstranili HBr, da smo dobili ustrezni 2-bromometilprop-2-en-l-il glikozid, uporabili za združitev peptidov.

2-bromoetil β-glikozid 3-sialillaktoze (15) smo sintetizirali iz z acetil zaščitenega 2bromoetil glikozida laktoze (10) (Magnusson et al., 1982) v zaporedju petih stopenj. Z odacetiliranjem (10) smo dobili (11), ki smo ga izopropilidenirali (Catelani, 1988), da smo dobili 3’,4’-O-izopropilidenski derivat (12) z dobitkom 86%. Z delnim benzoiliranjem (Murase et al., 1989) pri -60°C, ki mu je sledila hidroliza 3’,4’-acetala, smo dobili 2,6,6’-tri-0-bezoat (13) z dobitkom 31%. Derivat laktoze (13) smo glikozilirali pri -60°C (Lonn in Stenvall, 1992), uporabljajoč kot donor glikozila ksantat (5) in metilsulfonijev trifluorometansulfonat (MST) kot pospeševalec, da smo dobili zaščiteni trisaharidni derivat (14) z dobitkom 75%. Z odščito, kot v primeru 8, smo dobili 2-bromoetil glikozid (15) z 96% dobitkom.

1.3. Eksperimentalni del

Če nismo drugače navedli, smo ^H- in ^³C-NMR spektre posneli v CDCl^ pri 300, oziroma 75 MHz, na Varianovem Gemini 300 spektrometru. Notranji referenčni signali so bili signali iz nedevteriranega topila pri 7.25, oziroma 77.0 ppm.

Optične sučnosti smo merili s Perkin Elmerjevim 241 polarimetrom.

Tenkoplastno kromatografijo smo izvajali na Merckovih DC-Fertigplatten (silikagel 60 p254 q,25 _mm) ter vizualizirali s pršenjem z 10% žveplovo (VI) kislino in potem pri povišeni temperaturi in/ali pršenjem z molibdatofosforjevo kislino/CeSO^razbl. H2SO4 in segrevanjem (Renaud in Seebach, 1986). Za preparativno kromatografijo smo uporabljali MatreA³^ Silika Si 0,35-0,70 p.

HPLC smo izvedli z Beckmanovim kromatografski m sistemom System Gold, na Beckmanovi koloni Ultrasphere C-18 (4,6 x 150 mm), s zmesmi acetonitril-voda, ki so vsebovale 0,1% trifiuoroocetno kislino. Za preparativno izvedbo smo uporabljali Beckmanovo kolono Ultraprep C-18 (10 μ, 21,2 x 150 mm). Kromatograme smo kontrolirali pri

214 nm.

2-trimetilsililetil 4-0- ftDgalaktopiranozilb-D-glukopiranozid (2)

2-trimetilsililetil 2,3,6-tri-O-acetil-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil- β-D-galaktopiranozil)' βD-glukopiranozid (1) (Jansson et al., 1988) (29,4 g, 40 mmol) smo mešali v metanolni raztopini natrijevega metoksida (5,8 mM, 515 mL) tekom 15 ur. Z nevtralizacijo z ocetno kislino, uparevanjem in kristalizacijo iz etanola smo dobili (2) (14,6 g; 82%). tal. 175-177°C [a]D²²: ⁺18,5°(c 1,0; voda) ^-NMR (D₂O,(CH₃)₃Si(CD₂)₂COONa) δ : 4.51 (d,lH, J=8 Hz, H-l/H-1’), 4.46 (d, IH, J-7.5 Hz, H-l/H-1’), 4.10-3.50 (13H), 3.30 (t, IH, J=8,5 Hz), 1.09 (td, IH, J=13 13 in 6 Hz, CH₂Si), 0.98 (td, IH, J= 13, 13 in 5.5 Hz, CH₂Si), 0.04 (s, (CH₃)Si) ppm. ¹³C-NMR (D₂O, (CH₃)₃Si(CD₂)₂COONa) δ : 105.7 (C-l/C-1’), 104.2 (C-l/C-1’),

81.2, 78.2, 77.6, 77,4, 75.7, 75.4, 73.8, 71.4, 71.2, 63.8, 62.9, 20.4 (CH₂Si), 0.4 ((CH₃)₃Si) ppm.

2-trimetilsililetil 2,3,6-tri-0-benzil-4-0-(2,6-di-0-benzil-3,4-0-izopropiliden-ft-Dgalaktopiranozil)-ft-D glukopiranozid (3)

Spojini 2 (14,5 g, 32,9 mmol) v 2,2-dimetoksipropanu (250 mL) smo dodali ptoluensulfonsko kislino, monohidrat, (1,6 g). Zmes smo mešali 165 minut. Nato smo dodali trietil amin (9 mL) ter zmes uparili. Ostanek (ki je vseboval zmes acetalov) smo tekom 50 minut obdelali z 5% vodno raztopino ocetne kisline (100 mL) in potem uparili, da smo dobili, sodeč po TLC, eden glavni produkt in sledove druge komponente (verjetno 4’,6’-acetal).

Del (11.9 g; 25,3 mmol) surovega produkta (15,5 g) smo raztopili v suhem Ν,Νdimetilformamidu pod dušikom. Dodali smo natrijev hidrid (60%, 6,16 g; 154 mmol) in zmes mešali tekom 1 ure. Nato smo za časa 15 min. dodali benzil bromid (21 mL, 177 mmol) ter z mešanjem nadaljevali 14 ur. Zmes smo obdelali z dodatkom metanola in potem vode, nato smo jo pa porazdelili med diklorometanom in vodo. Vodno fazo smo enkrat ekstrahirali z diklorometanom in združene organske faze sušili (Na₂SC>4), filtrirali in uparili. S kromatografijo (toluen-etil acetat) smo dobili spojino 3 (15 g, 73%) kot sirup.

[a]D^ · +16,5° (c 1,2; kloroform) *H-NMR δ : 7,45-7,25 (25H, Ar-H), 5,0-4,3 (12H, anomemi in benzilni signali ), 4,153.90 (4H), 3,85-3.30 (10H), 1,42 s, 3H, CH₃, 1,37 (s,3H, CH₃), 1,14-1.97 (m,2H, CH2S1), 0,05 (s,(CH₃)₃Si) ppm.

¹³C-NMR δ : 139,3, 139,0, 138,8, 138,7, 138,6, 128,5-127,4, 109 ((CH₃0)₂C),

103,3 (C-l/C-1’), 102,0 (C-l/C-1’), 83,1, 82,0, 80,7, 70,9, 75,4, 75,1, 74,9, 73,6, 73,4, 73,2, 72,0, 68,9, 68,34, 67,3, 27,8, 26,2, 18,3, (CH₂Si), -1,7 ((CH₃)₃Si) ppm.

2-trimetilsililetil 2,3,6 tri O benzil 4 O (2,6 di O benzil β-D-galaktopiranozil)-6-D-glukopiranozid (4)

Spojino 3 (14,9 g; 15,9 mmol) v 80% vodni raztopini ocetne kisline (110 mL) smo mešali pri 80°C tekom 35 min. in nato uparili. S kromatografijo (toluen-etil acetat, 4:1) smo dobili spojino 4 (12,3 g; 86%). Analitični vzorec smo kristalizirali iz heptana. tal. 98,8-100,1°C [a]D^^: +15,6° (c 1,4; kloroform) ¹ H-NMR § : 7,45-7,20 (25H, Ar-H), 5,05-4,56 (7H), 4,50-4,35 (5H), 4,10-3,30 (14H), 2,53 (bs, IH, OH), 2,45 (bs, IH, OH), 1,13-0,97 (m, 2H, CH₂Si), 0,04 (s, (CH₃)₃Si) ppm.

¹³C-NMR δ : 139,4, 139,0, 138,6, 138,5, 138,2, 128,7-127,4, 103,3, (C-l/C-1’),

102,7, (C-l/C-1’), 82,9, 82,6, 80,1, 76,7, 75,2, 74,1, 74,9, 73,5, 73,46, 73,2, 72,8, 68,8, 68,6, 68,4, 67,4, 18,3 (CH₂Si), -1,7 ((CH₃)₃Si) ppm.

2-trimetilsililetil 2,3,6 tri-O-acetil-4-O- {2,4,6-tri-O-acetil-3_r4-O- [ metil(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5, dideoksi D glicero a D galakto-2 fionulopirano zil)onat]-6-D-galalttopiranozil$-Q-D-glukopiranozid (6)

Spojino 4 (8,8 g; 9,9 mmol), 5 (2,93 g; 4,9 mmol) in sprašena molekulska sita (3A, 12 g) v suhem acetonitrilu (114 mL) smo ohladili pod dušikom na -23°C. Tej zmesi smo dodali, med mešanjem, raztopino (50 mL) dimetil(metiltio)sulfonijevega trifluorometansulfonata (Marra in Sinay, 1990) (25,7 mmol) in acetonitrila (50 mL). Reakcijsko zmes smo mešali pri -23°C 2 uri in nato filtrirali skozi celit in porazdelili med nasičeno vodno raztopino natrijevega hidrogenkarbonata in diklorometanom. Vodno fazo smo enkrat ekstrahirali z diklorometanom ter združene organske faze sušili (Na₂SO^), filtrirali in uparili. S kromatografijo (toluen-etil acetat-metanol, 35:35:1) smo dobili frakcijo (1,96 g), ki je vsebovala eno glavno ter dve manjši komponenti. Z acetiliranjem v anhidridu ocetne kisline-piridin (1:1) v 12 urah smo dobili, po uparevanju, surov produkt, ki smo ga podvrgli hidrogenolizi pri 35 psi tekom 4,5 ur v ledocetu, uporabljajoč 10% paladij na oglju kot katalizator (50 mL ocetne kisline, 0,75 g 10% Pd/C na g substrata). S filtriranjem, uparevanjem in kromatografijo (toluen-etanol, 6:1) smo dobili glavno frakcijo, ki smo jo acetilirali, tako kot smo zgoraj opisali. S kromatografijo (toluen-etanol, 18:l-*10:l) smo dobili amorfno spojino 6 (1,0 g; 17,5%).

[ajD^: -8,8° (c 1,2; kloroform ^-NMR δ : 5,54 (ddd, IH, J=9.5, 5.0 in 2.5 Hz, H-8), 5.38 (dd, IH, J=9.5 in 2.8 Hz, H-7), 5.17 (t, IH, J=9.5Hz, H-3), 5.08 (d, IH, J=1.05Hz, NH), 4.97-4.82 (4H, H-2, H-2’, H-4’, H-4); 4.62 (d, IH, J=8 Hz, H-l’), 4.54-4,37 (4H, inter alia H-l, H-3’), 4.18 (dd, IH, >1.2 in 5,5 Hz), 4.1-3.8 (1.0H), 3.83 (s, CH₃O), 3.65-3,49 (3H), 2.58 (dd, IH, J=12.5 in 4.5 Hz, H-3 ekv.), 2.23, 2,15, 2.07, 2.05, 2.03, 2.02, 2.0 in 1.84 (singleti 3H vsak CH₃CO), 2.06 (s, 6H, 2xCH₃CO), 1.67 (t, IH, J=12.5 Hz, H-3 ax.), 1.01-0.81 (m, 2H, CH₂Si), - 0.015 (s, (CH₃)₃Si) ppm.

ⁿC-NMR δ : 171.2, 170.9 (2C), 170.8, 170.7, 170.5, 170.1, 170.0, 169.94, 169.88 in 168.3 (C-l), 101.1 (C-r/C-F), 100.0 (C-l/C-F), 96.8 (C-2), 76.4, 73.6, 72.5, 72.0, 71.9, 71.4, 70.4, 69.9, 69.3, 67.7, 67,4, 67.3, 66.9, 62.3, 62.2, 61.4, 53.0 (CH₃O), 49.0 (C-5), 37.2 (C-3), 23.0, 21.3 20.7-20.4, 17.7 (CH₂Si) - 1.8 ((CH₃)₃Si) ppm.

Analiza: izračunano za C^^-^NC^Si: C, 50.4; H, 6.2; N, 1.2; najdeno: C, 50.3; H, 6.4; N, 1.2.

l,2,3,6-tetra-O-acetil-4-O-i2,4,6-tri-O-acetil-3[metil(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-Oacetil-3, S, -dideoksi-D-glicero-a-D-galatoo-2-nonulopiranozil)onajf 0-D~galaktopi ranozilJ-O-D-glukopiranozid (7)

Spojino 6 (840 mg; 0,72 mmol) smo raztopili v zmesi toluena (5,6 mL) in acetanhidrid (1,06 mL). Tej raztopini smo dodali raztopino (1,45 mL) bortrifluorid eterata (0,36 mL; 2,91 mmol) v toluenu (2,04 mL). Reakcijsko zmes smo mešali 140 minut in jo nato obdelali s porazdelitvijo med diklorometanom in nasičeno vodno raztopino natrijevega hidrogenkarbonata. Vodno fazo smo enkrat ekstrahirali z diklorometanom in združene or25 organske faze sušili (^28()4), filtrirali in uparili, da smo dobili surov produkt (7) (815 mg). S kristalizacijo iz metanola smo dobili spojino 7 (586 mg). S kromatografijo (toluenetanol, 20:1-^10:1) matične tekočine smo dobili dodatno (7) (154 mg). Celoten dobitek je bil 740 mg (92%).

Glede na NMR je spojina 7 vsebovala metanol iz kristalizacij v molamem razmerju 0,5 mola metanola na 1 mol (7). Prisotno je bilo manj kot 5% l-α epimera, sodeč po detekciji z NMR.

[a]D²² :-θ,2° (e 1,9; kloroform).

^-NMR 5 : 5.67 (d, IH, J=8.5 Hz, H-l), 5.51 (ddd, IH, J=9.5, 4.5 in 2.5Hz, H-8), 5.40 (dd, IH, J=9.5 in 2.5 Hz, H-7), 5.22 (t, IH, J=9 Hz, H-3), 5.08 (d, IH, J=10.5 Hz, NH), 5.04 (dd, IH, J=9.5 in 8.5 Hz, H-2), 4.96-4.83 (3H, H-2’, H-4' in H-4), 4.65 (d, IH, J=8 Hz, H-l’), 4.50 (dd, IH, J=1.5 in 3.5 Hz, H-3’) 4.42 (dd, IH, J-12.5 in 2Hz, H9), 4.42 (dd, J=12.5 in <2 Hz, H-6/H-6’), 4.20 (dd, IH, J=12 in 5 Hz, H-9), 4.08-3.80 (9H), 3.84 (s, CH₃O), 3.75 (ddd, IH, J=10.5 in 2 Hz, H-5/H-5’), 3.62 (dd, IH, J=11 in 3 Hz, H-6/H-6’), 3.45 (d, 1.5H, J=5.5 Hz, CH₃OH), 2.57 (dd, IH, J-12.5 in 5 Hz, H-3 ekv.), 2.24-1.83 (CH3CO signali), 1.67 (t, IH, J=12.5 Hz, H-3, ax.), 1.09 (q, 0.5H, J=5.5 Hz, (CH3OH) ppm.

α

C-NMR (meijeno na kromatografiranem materialu prostem metanola) δ : 171.2, 170.9,

170.7, 170.66, 170.61, 170.5, 169.94, 169.8, 169.2, 168.2, 101.0 (C-Γ), 96.8 (C-2), 91.6 (C-l); 75.7, 73.5, 73.1, 71.9, 71.3, 70.6, 70.4, 69.8, 69.2, 67.7, 67.2, 66.7, 62.0, 61.8,

61.5, 53.2 (CH3O), 49.0 (C-5), 37.2 (C-3), 22.9, 21.3, 20.7, 20.6, 20.5, 20.5, 20.4 ppm.

3-brotno-2-bro/nometilprop-l-il 2,3,6triOacetil4O{2,4,6-tri-O-acetil-3-O[metil(5-acetamido-4_r7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-dideoksi-D-glicero a-D-galakto-2nonulopiranozil)onat]~ ^D-galaktopiranoziQ-R~D-glukopiranozid (8)

Spojino 7 (0,96 g; 0,86 mmol) in 3-bromo-2-bromometilpropan-l-ol (Ansari et al., 1987) (1,5 g; 6,5 mmol) smo raztopili v suhem diklorometanu (30 mL) in nato ohladili na 0°C. Dodali smo borontrifluorid eterat (1,9 mL; 15 mmol) in zmes mešali pri 0°C 40 min. Hladilno kopel smo odstranili in nadaljevali z mešanjem še 5 ur. Zmes smo potem razredčili z diklorometanom in sprali z ledeno-hladno nasičeno vodno raztopino natrijevega hiddrogenkarbonata. Diklorometansko fazo smo sušili (^28()4), filtrirali ter uparili. S kromatografijo (toluen-etanol, 20:1—»»12:1) smo dobili amorfno spojino 8 (512 mg, 46%).

[oc]d22 ;io,5 (c 2,6; kloroform).

'H-NMR δ : 5.54 (ddd, IH, >9.5 in 2.5 Hz, H-8), 5.40 (dd, IH, >9.5 in 3 Hz, H-7), 5.19 (t, IH, >9.5 Hz, H-3), 5.04 (d, IH, >1.0 Hz, NH), 4.97-4.82 (4H), 4.67 (d, IH J=8 Hz, Η-Γ), 4.54-4.37 (4H), 4.19 (dd, IH, >1.2 in 5.5 Hz, H-9), 4.10-3.80 (10H), 3.84 (s, CH₃O), 3.66-3.42 (OH), 2.58 (dd, IH, >12.5 in 4.5 Hz, H-3 ekv.), 2.38-2.22 (m, CH(CH₂Br)₂), 2.24 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.08 (s, 6H), 2.07 (s, 3H), 2.06 (s, 6H), 2.04 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.85 (s, 3H), 1.68 (t, IH, >12.5 Hz, H-3ax.) ppm. ¹³C-NMR δ : 171.1, 170.94, 170.9, 170.7, 170.6, 170.6, 170.5, 170.0, 169.97, 169.7,

169.8, 166.2 (C-l), 101.1, 100.8, 96.8 (C-2), 76.2, 73.1, 72.7, 72.0, 71.6, 71.3, 70.4,

69.6, 69.2, 69.1, 67.7, 67.2, 66.8, 62.1, 61.4, 53.0 (CH₃O), 47.0 (C-5), 42.4 (CH(CH₂Br)₂), 37.2 (C-3), 32.7 (CH₂Br), 31.6 (CH₂Br), 22.9, 21.3, 20.7, 20.5, 20.4, 20.4 ppm.

3-bromo-2-bromometUpropil 4-0- (-3 -O- [natrijev(5-acetamido-3,5-dideoksi-D-glicero- a-D-galakto-2-nonulopiranozil)onat]- β Dgalaktopiranoziljfi -D-glukopiranozid (9)

Spojino 8 (384 mg, 030 mmol) smo raztopili v metanolni raztopini natrijevega metoksida (0,03 M, 60 mL) in mešali čez noč. Dodali smo vodo (100 uL) in zmes nevtralizirali s silicijevim dioksidom, filtrirali in koncentrirali. S kromatografijo (kloroform-metanolvoda, 65:53:6) smo dobili amorfno spojino 9 (189 mg, 74%).

[ajD^ :-3,4° (e 0,3; metanol).

^lHNMR (CD₃OD) δ : 4.44 (d, IH, >8 Hz, H-l/H-1’), 4.31 (d, IH, J=8 Hz, H-l/H-1’), 2.86 (dd, IH, J=l2.5 in 3.5 Hz, H-3 ekv. dejansko sklopljeni), 3.43-2.31 (m, IH, CH(CH₂Br)₂), 2.02 (s, 3H, NCOCH₃), 1.73 (bt, IH, >12.5 Hz, H-3 ax. dejansko sklopljeni) ppm.

¹³C-NMR (CD₃OD) δ: 175.5, 174.9, 105.1 (C-l/C-1’), 104.6 (C-l/C-1’), 101.1 (C-2’), 54.0 (C-5), 44.4 (CH(CH₂Br)₂), 42.1 (C-3), 33.9 (CH₂Br), 33.7 (CH₂Br), 22,7 (NCOCH₃) ppm.

2-bromoetil 4~0-R-D~galaktopiranozil-f5-D-glukopiranozid (II)

2-bromoetil 4-0-(2,3,4,6-tetra~0-acetil-B-D-galaktopiranozil)-2,3,6-tri-0-acetil-B-D-glu27 kopiranozid (0,17 mol) smo pripravili po Dahmenu et al., (1983 b). Surov produkt smo raztopili v metanolni raztopini natrijevega metoksida (0,01 M, IL) in mešali 3 ure. Zmes smo nevtralizirali s silicijevim dioksidom, filtrirali in koncentrirali. S kromatografijo (diklorometan-metanol-voda, 65:20:2) in kristalizacijo iz etanola smo dobili spojino 11 (37 g, 51%).

tal. 151-152°C.

^!HNMR (D2O, aceton) δ : 4.57 (d, IH, J=8.0 Hz, H-l), 4.45 (d, IH, J=8 Hz, H-l’), 4.26-4.19 (m, IH, OCH2CH2Br), 3.98 (dd, IH, J=12.5 in 1 Hz, H-6/H-6’), 3.93 (d, IH, J=3.5 Hz, H-4’), 3.55 (dd, IH, J=1.0 in 8 Hz, H-2’), 3.40-3.30 (m, IH, H-2) ppm. ¹³C-NMR (D2O, aceton) δ : 105.7 (C-Γ), 104.9 (C-l), 75.5 (C-2’), 73.7 (C-2), 71.3 (C4’), 63.8 (C-6/C-6’), 62.9 (C-6/C-6’), 33.9 (CH₂Br) ppm.

2hromoetil 4-0-(3,4-0-izopropiliden-Q-D-galaktopiranozil)-B-glukopiranozid (12)

Zmes spojine 11 (35 g, 78 mmol) in p-toluensulfonske kisline (1,5 g, 8 mmol) v 2,2dimetoksipropanu (800 mL) smo mešali pri 50°C tekom 1 ure in potem pri sobni temperaturi čez noč. Dodali smo trietilamin (12 mL, 80 mmol) in zmes mešali 30 minut, koncentrirali in uparili s toluenom, da smo odstranili presežek trietilamina. Surov produkt smo raztopili v metanol-voda (10:1, 900 mL) in 2 uri kuhali pri refluksu. Dodali smo nasičeno vodno raztopino natrijevega hidrogenkarbonata (20 mL) in zmes koncentrirali. S flash kromatografijo (kloroform-metanol-trietilamin, 10:1:0,01) in kristalizacijo iz etanola smo dobili spojino 12 (32,7 g, 86%).

tal. 171-172°C [a]D22;+ll,l (e 0,7; metanol) ^-NMR (D₂O, aceton) δ : 4.56 (d, IH, J=8 Hz, H-l), 4.49 (d, IH, J=8.5 Hz, H-l’), 4.37 (dd, IH, J=5.5 in 1.5 Hz, H-4’), 3.51 (dd, IH, J=8 in 8.0 Hz, H-2’), 3.36 (dd, IH, J=9.0 in 8 Hz, H-2), 1.55 (s, 3H, CH₃), 1.40 (s, 3H, CH₃) ppm.

¹³C-NMR (D₂O, aceton) δ : 113.7 ((CH₃)₂C), 104.9 (C-l/C-1’), 81.4 (C-5), 81.3 (C-3’), 77.5 (CH₂CH₂Br), 77.0 (C-3), 76.5 (C-4’), 76.2 (C-5’), 75.5 (C-2/C-2’), 63.5 (C-6/C-6’), 62.8 (C-6/C-6’), 33.8 (CH₂CH₂Br), 29.9 (CH₃C), 28.1 (CH₃C) ppm.

Anal. izračunano za Cj^H^BrOjj: C, 41.7; H, 6.0. Najdeno: C, 41.5; H, 6.0.

2~bromoetil 2,6-di-0-benzoil-4-(6~0~benzoil-Q-D-galaktopiranozil)-R-D-glukopl· ranozid (13)

Spojino 12 (9,0 g; 18,4 mmol) smo raztopili v zmesi suhega piridina (60 mL) in diklorometana (150 mL) in ohladili na -50°C, Po kapljicah smo tekom 3 ur dodali benzoilklorid (10,5 mL; 90,6 mmol) v suhem diklorometanu (150 mL) in zmes dodatno mešali še 1 uro. Nato smo dodali metanol ter raztopino koncentrirali. Ostanek smo raztopili v diklorometanu (500 mL) in sprali z vodno raztopino klorovodika (2 M, 250 mL), nasičeno vodno raztopino natrijevega hidrogenkarbonata (250 mL), nasičeno vodno raztopino natrijevega klorida (250 mL), sušili (Na₂SO₄) in koncentrirali. Surovi produkt smo raztopili v 80% vodni raztopini ocetne kisline (250 mL), mešali pri 80°C tekom 30 min. in nato koncentrirali. S kromatografijo (diklorometan-metanol, 30:1) smo dobili amorfno spojino 13 (4,3 g; 31%).

[ajD^:+15,8° (e 1,0; kloroform).

^-NMR δ : 8.24-8.02 (m, 15H, Ar-H), 5.19 (dd, IH, J=9.5 in 8 Hz, H-2), 4.84 (dd, IH, J=12.0 in 1.5 Hz, H-6/H-6’), 4.66 (dd, IH, J=12 in 3.5 Hz, H-6/H-6’), 4.64 (d, IH, J=8 Hz, H-l), 4.48 (dd, IH, J=12.0 in 6 Hz, H-6/H-6’), 4.37 (dd, IH, J=12 in 9 Hz, H-6/H6’), 4.35 (d, IH, J<=8 Hz, H-l’) ppm.

¹³C-NMR δ : 166.8, 166.6, 165.5, 104.1 (C-Γ), 101.0 (C-l), 81.7, 73.5, 73.2, 73.1, 73,02, 72.96, 70.8, 69.6, 68.9, 64.1 (C-6/C-6’), 63.9 (C-6/C-6’), 29.6 (OCH₂CH₂Br) ppm.

Anal. izračunano za C-^H-^BrO j₄: C, 55.2; H, 4.9. Najdeno: C, 552; H, 4.9.

2-bromoetil 2,6 di 0 benzoil 4 0 [6 0 benzoil-3 0 jmetil(5-acetamido-4,7,8,9tetraOacetil3,5dideoksiD-gliceroaDgalakto2nonulopiranozil)onatjftD galaktopiranozilj-ft-D-glukopiranozid (14)

Spojino 13 (200 mg; 0,26 mmol), 5 (263 mg; 0,44 mmol) in sprašena molekulska sita (3A, 300 mg) v zmesi acetonitrila in diklorometana (9:4, 8 mL) smo mešali 1 uro pod argonom. Dodali smo srebro trifluorometansulfonat (118 mg, 0,45 mmol) in reakcijsko zmes ohladili na -60°C. Po kapljicah smo tekom 5 min. dodali metilsulfenil bromid (Dasgupta in Garegg, 1988) v diklorometanu (3,48 M, 126 uL, 0,44 mmol) in nato zmes mešali 1 uro. Dodali smo diizopropilamin (0,7 mL, 2,6 mmol) in nadaljevali z mešanjem 0,5 ure. Pustili smo, da se je zmes segrela na 0°C, jo filtrirali in koncentrirali. S kromato29 grafijo (kloroform-metanol, 50:1) smo dobili amorfno spojino 14 (244 mg, 75%). [a]D²²:+14,9° ι,θ. kloroform) ^-NMR δ : 5.33 (m, IH, H-8), 5.28 (dd, IH, J=8.0 Hz, H-7), 5.26 (dd, IH, >9.5 Hz, H-2), 5.03-4.93 (m, 2H, H-4, H-6/H-6’), 4.74 (dd, IH, >12 in 3.5 Hz, H-6/H-6’), 4.70 (d, IH, >8 Hz, H-l), 4.59 (d, IH, J=8 Hz, H-l’), 4.50 (dd, IH, >12 in 6 Hz, H-6/H-6’), 2.70 (dd, IH, >13.0 in 4.5 Hz, H-3 ekv.) ppm.

(H-3, H-2* in H-4’ so bili po acetiliranju 14 premaknjeni navzdol).

¹³C-NMR δ : 170.7, 170.4, 170.3, 170.1, 170.1, 168.1 (C-Γ, JC-l-H-3 ax=6.1 Hz),

166.6, 166.1, 165.4, 104.4 (C-Γ), 101.1 (C-l), 97.6 (C-2), 82.2, 76.4 73.4, 73.0, 72.9, 63.7, 63.4, 62.4 (C-6, C-6’, C-6), 53.2 (CH₃O), 49.6 (C-5), 37.6 (C-3), 29.6 (OCH₂CH₂Br), 23.1 (NCOCH₃), 21.0, 20.7, 20.6, 20.5 ppm.

Anal. izračunano za C^H^BrNO-^: C, 53.5; H, 5.2. Najdeno: C, 53.5; H, 5.5.

2-bromoetil 4 O [3 O [natrijev (5acetamido3,5dideoksiDglicero(lDgalakto 2-nonulopiranozil)onat]-ft-D-galaktopiranozil/ftDglukopiranozid (15)

Spojino 14 (200 mg; 0,16 mmol) smo raztopili v metanolni raztopini natrijevega metoksida (0,03 M, 50 mL) in mešali 6 ur. Dodali smo vodo (50 uL) in zmes mešali 5 min., jo nevtralizirali s silicijevim dioksidom, filtrirali in koncentrirali. S kromatografijo (kloroform-metanol-voda, 6:4:1) smo dobili amorfno spojino 15 (118 mg, 96%).

[a]D²²:-0,9 (c 1,0; voda) ^LNMR (D₂O, aceton) δ : 4.57 (d, IH, >8 HZ; Η-1/Η-Γ), 4.54 (d, IH, >8.5 Hz, H-l, ali H-l’), 2.77 (dd, IH, >12.2 in 4.3 Hz, H-3e), 2.03 (s, 3H, NCOCH₃), 1.81 (bt, IH, H-3a).

¹³C-NMR (D₂O, aceton) δ 177.0, 176.7, 105.6 (C-l’), 105.1 (C-l), 102.8 (C-2), 54.7 (C-5*), 42.7 (C-3), 34.0 (OCH₂CH₂Br), 25.0 (NCOCH₃) ppm.

2-bromoetil 4-0-(a-D-galatoopirano&l)-$-D-galaktopiranozid (28)

2-bromoetil 2,3,6-tri-0-acetil-4-0-(2,3,4,6~tetra-O-acetil-a.-D-galaktopiranozil-P-D-galaktopiranozid (27) (Dahmen et al., (1983 a) str. 116) smo pripravili z glikozidiranjem ustreznega oktaacetata (Dahmen et al., (1983 a) str. 113), kataliziranim z bortrifluorid eteratom (1,25 g; zmes anomerov). Surov produkt smo suspendirali v metanolu (20 mL) in dodali metanolno raztopino natrijevega metoksida (0,2 m; 4 mL). Po 30 min. smo dobili bistro raztopino. Reakcijsko zmes smo mešali dodatnih 30 min. in jo potem nevtralizirali s silicijevim dioksidom. S filtracijo, uparevanjem in kromatografijo (kloroform-metanolvoda, 65:35:6) smo dobili spojino 28 (335 mg, 41%).

[a]D^^:+69° (g 1,0; metanol) ^JH-NMR (CD₃OD) δ: inter ali 4.76 (d, IH, J=2 Hz, H-l’), 4,15 (d, IH, J=7 Hz, H-l), 4.09 (bt, IH, J=6 Hz), 3.92 (dt, J=11.5 in 6.5 Hz) ppm.

¹³C-NMR (CD₃OD) δ : 105.2, 102.5, 79.2, 76.2, 74.6, 72.7, 71.3, 71.1, 70.7, 62.7, 61.1,

30.9 ppm.

¹³C-NMR (D₂O ref. aceton pri 33.19 ppm); δ - 105.9, 103.2, 80.0, 78.1, 75.2, 73.8, 73.7, 73.1, 72.1, 72.0, 71.6, 63.5, 63.0, 34.1 ppm.

Anal. izračunano za C14H25B1O11: C, 37.4; H, 5.6. Najdeno: C, 37.1; H, 5.9.

bromoe.til 4-0-(4~0-a-D-galaktopiranozil-Q-D-galaktopiranozilj$ Dglukopira nozid (48)

2-bromoetil 2,3,6-tri-O-acetil-4-O- 2,3,6-tri-O-acetil-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-Dgalaktopiranozil)-p-D-galaktopiranozil - β -D-glukopiranozid (53) (Dahmen et al., 1984) (35 mg) smo odacetilirali z mešanjem v 10 mL 0,1 M metanolne raztopine natrijevega metoksida tekom 16 ur. Z nevtralizacijo, uporabljajoč silikagel, filtracijo, uparevanje in kromatografijo (kloroform-metanol-voda, 65:35:6) in nato mikrofiltracijo in liofilizacijo smo dobili 48 (18,6 mg; 90%) [a]D^:+5l° (c 1,0; voda) ^-NMR (D₂O ref. aceton pri 2.24 ppm) δ : 4.96 (d, IH, J=4 Hz, H-l), 4.57 (d, IH, J=8.0 Hz, Η-1/Η-Γ), 4.52 (d, IH, J=7.5 Hz, H-l/H-1’), 4.37 (bt, IH), 4.27-4.19 (m, IH, CH₂CJ₂Br), 4.09-3.55 (19H), 3.36 (bt, IH) ppm.

¹³C-NMR (D₂O ref. aceton pri 33.19 ppm) δ : 106.2 (C-l/C-1), 105.1 (C-l/C-1’), 103.3 (C-l), 81.6, 80.3, 78.4, 77.8, 77.3, 75.7, 75.1, 73.9, 73.8, 73.0, 72.1, 71.9, 71.5, 63.5,

63.3, 63.0, 33.9 (CH₂Br) ppm.

2-bromoetil glukozid GMj laktama (55)

Ustrezni dekaacetat naslovne spojine (Ray et al., 1992) (40 mg, 1 α/1 β 1:2,2) je bil de-Oacetiliran v 9,5 mM metanolni raztopini natrijevega metoksida pri sobni temperaturi tekom 7 ur. Z nevtralizacijo s slikagelom, uparevanjem in kromatografijo (kloroformmetanol-voda, 65:35:6) smo dobili 55 (26 mg, kvant.).

¹ H-NMR (D₂O(CH₃)₃Si(CD2)2COONa) δ: inter alia 3.37 (bt, IH), 2.61 (dd, IH, J=13 in 6 Hz, H-3*e), 2.05 (s, 3H, NCOCH₃), 1.71 (dd, IH, J=11 in 13 Hz, H-3a) ppm.

Peptide, ki so bili O-glikozilirani na serinovi bočni verigi, smo sintetizirali s uporabo tehnike peptidne sinteze na trdni fazi. Z glikoziliranjem serina (zaščitenega kot 9fluorenilmetoksikarbonil- in pentafluorofenilni derivat na amino-, oziroma karboksiskupinami) z O-acetiliranimi β-tioglikozidi iz Gal CZ4Gal smo dobili O-glikozilirane deri vate serina. Te derivate smo uporabili v sintezi na trdni fazi. Po odcepitvi s smole in očiščevanju s HPLC, smo pridobili glikopeptide, ki so še bili zaščiteni na ogljikohidratni skupini, kot acil derivati. Popolno odščito smo izpeljali z bazno katalizo, in produkte očistili s HPLC. FAB-MS podatki za produkte so se ujemali s teoretičnimi vrednostimi.

d' 'o' d' d' d d' g 2' 2' 2 2 'o' θ' 2 dfiflOCced Cl čl fl fl fl fl ‘u¹ 'u 'c? T ‘U¹ ‘S? T '57 'u* 'c ·«? I ‘57

E a e s a a e a s a s a s s ooodoooooopoo o

I t I · < < 1 ' * 1 I I I 1 d d d d d d ddddkTkTkTk:

S .i> δ u <^^'57 '4? 2 c o 2 a a S S Θ « .2, A ? ,° ? ? ?

'4? Έ¹ 57 A A A A A

J J -O _J _l —I _l -J doQiiit1

SEQ ID NO: Peptidi, uporabljeni za konjugacijo, so: Spojina št.

(ONtSOlOtOGJDM-iniDNCDCj)

T-i-r-r-cMcjnooonnon d

LU

I— ω

ω

LU

LU d

H _l < H d tu s 2 z z

UJ LU Z z ω ω < <

* kr

S	2	LU	d
H	H	CL	>	2	2	LU	LU	_j	_J		_l
LU	LU	CL	O	j—	A	CL	CL	O	<	_l	<
Z>	Σ	l—	O	UJ	LU	CL	CL	O	CL	O	CL
Z	Z	Z	CL	jz		.C	H	>	>	O	>
LU	LU	ω	Z	Z	Z	Z	Z	>	Z	>	JZ
Z	Z	CL	LU	UJ	JZ	w	JZ	>	0	.C	O
ω	w	0	>	z	Z	CL	CL	O	CL	>	Q_
<	<	ω	O	ω	cn	O	O	cc	<	0	<
kr	d	d	ω	<	<	ω	ω	d	d	CC	LL

in CD A 00 CD a co -v co Tt in co A A A T- T- A A

Λ

OC

S

Ή

-S

I

I «L l

'S.

s.

'C j υ oc>

s) d

ω

LU d

L— kr

O

LU ω

d I

O _ LU LU O. CL Dl CL H H Z z ω ώ CL £L o O ω sr kr kr >

_I _ > o 2

I>

O l·LU >

LL >

>

Oll 00 Σ 2 I O

I--CL

o. Ο _ω o 3> _J

A ςη m CD A co (h = homocistein)

Metode, uporabljene za pripravo glikopeptidov

Metoda A: konjugacija preko vmesne skupine 2 bromometilprop 2 in l ila

Suspenzijo 3-bromo-2-bromometilprop-l-il glukozida (10 pmol) in Ν,Ν,Ν,Νtetrabutilamonijevega fluorida (40-100 pmol) v N,N-dimetilformamidu (100 pL) smo 10 minut mešali pod argonom. Dodali smo peptid (8 pmol) raztopljen v N,Ndimetilformamidu (DMF) ali dimetilsulfoksidu (DMSO) (200-1000 pL) in zmes podvrgli sonikaciji tekom 5 min. ter nato mešali 1,5-2,5 ur. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC. Zmes smo razblažili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in jo liofilizirali. S preparativno HPLC (acetonitril-voda-0,1% trifluoroocetna kislina) smo dobili pričakovane glikopeptide (videti tabelo 2).

Metoda B: konjugacija preko vmesne skupine 2-bromoetila

Suspenziji 2-bromoetil glikozida (10 pl) in cezijevega karbonata (20-100 pmol) v N,Ndimetilformamidu (400 pL) smo pod argonom dodali peptid (5 pmol). Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 min. in jo nato mešali 1-5 ur. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC, razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (acetonitril-voda-0,l%trifluoroocetna kislina) smo dobili pričakovane glikopeptide (videti tabelo 2).

Peptidi in sintetizirani glikopeptidi so v obliki trifluorometansulfonatnih soli.

Poleg metode, po kateri se kot pospeševalec uporablja cezijev karbonat, smo peptidni konjugat 24 pripravili tudi po metodi Or-a et al., 1991. HPLC analize obeh reakcijskih zmesi so pokazale vrh glavnega produkta, ki ima isti retencijski čas. Vendar smo čistejšo reakcijo in produkt, ki ga lažje očistimo, dosegli s cezijevim karbonatom, kot pospeševalcem.

Priprava glikopeptidov, primeri:

Konjugat 21

Suspenzijo 9 (2,9 mg; 3,4 pmol) in Ν,Ν,Ν,Ν-tetrabutilamonijevega fluorida (9,8 mg; 30,6 pmol) v N,N-dimetilformamidu (35 pL) smo 10 minut mešali pod argonom. Dodali smo peptid 16 (8,1 mg; 2,7 pmol) raztopljen v dimetilsulfoksidu (350 pL) in zmes podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 1,5 ure. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradi34 ent od O do 40% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 20 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (17% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline) smo dobili spojino 21 (1 mg, 11%).

Retencijski časi (analitična izvedba): alilni bromid (iz 9): 10,7 min.; 21: 14,2 min,; 16: 15,8 min.

Konjugat 22

Suspenzijo 9 (11 mg; 12,9 pmol) in Ν,Ν,Ν,Ν-tetrabutilamonijevega fluorida (37mg, 116 pmol) v N,N-dimetilformamidu (130 pL) smo 10 minut mešali pod argonom. Dodali smo peptid 17 (20 mg; 10,2 pmol) raztopljen v dimetilsulfoksidu (750 pL) in zmes podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 2,5 ure. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 40% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 20 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (14% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline) smo dobili spojino 22 (3 mg, 10%).

Retencijski časi (analitična izvedba): alilni bromid (iz 9): 10,7 min.; 22: 13,0 min,; 17: 14,3 min.

Konjugat 23

Spojino 9 (13 mg; 15,5 pmol) smo obdelali z Ν,Ν,Ν,Ν-tetrabutilamonijevim fluoridom (39 mg; 124,0 pmol) v N,N-dimetilformamidu (150 pL) in dodali peptid 18 (20 mg; 12,0 pmol) v dimetilsulfoksidu (600 pL), zmes podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 2,5 ure. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 40% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 20 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (12% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline) smo dobili spojino 23 (8 mg, 29%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 23: 12,2 min,; 18: 13,5 min.

Konjugat 24

Peptid 19 (10 mg; 6,8 pmol) smo dodali suspenziji spojine 15 (10 mg, 13,6 pmol) in cezijevega karbonata (11,5 mg; 35,2 pmol) v Ν,Ν-riimetilformamidu (550 pL) pod argonom. Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 5 ur. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroo35 četne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 12 do 15% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline 30 minut) smo dobili 24 (8,5 mg, 59%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 15: 8,7 min.; 24: 18 min.; 19: 19,3 min.

Priprava knjugata 24 po metodi Or-a et aL (1991)

Spojino 15 (8 mg; 10,5 pmol) in peptid 19 (2 mg; 1,4 pmol) smo raztopili v suhem N,Ndimetilformamidu (400 pL) pod argonom. Raztopino smo nasitili z amoniakom in jo mešali 1,5 uro. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) in ugotovili, da ima glavni vrh (53%) isti retencijski čas (18 minut) kot spojina 24, pripravljena po metodi B.

Konjugat 25

Peptid 20 (10 mg; 6,0 pmol) smo dodali suspenziji spojine 15 (9 mg; 12,0 pmol) in cezijevega karbonata (39 mg; 120 pmol) v N,N-dimetilf0rmamidu (500 pL) pod argonom. Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 1 uro. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 13 do 18% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline 30 minut) smo dobili spojino 25 (14 mg, 60%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 15: 8,7 min.; 25: 20,5 min.; 20: 21,7 min.

Konjugat 29

Peptid 20 (20,5 mg; 12,3 pmol) smo dodali suspenziji spojine 28 (31,6 mg, 70,3 pmol) in cezijevega karbonata (110,35 mg; 338 pmol) v N,N-dimetilformamidu (1,6 mL) pod argonom. Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 3 ure. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 13 do 18% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline 30 minut) smo dobili 29 (17,6 mg, 70%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min.; 29: 20,8 min.; 20: 21,8 min.

Konjugat 30

Peptid 26 (10 mg; 6,5 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (800 mL) pod argo36 nom. Dodali smo spojino 28 (11,7 mg, 26 pmol) in cezijev karbonat (21,2 mg; 65 pmol) Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 2 uri. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 13 do 18% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline 30 minut) smo dobili 30 (11,2 mg, 90%).

Retencijski časi (analitična izvedba, gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1 % vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 50 minut): 28: 6,2 min., 30: 21,5 min., 26: 24,4 min.

Konjugat 31

Peptid 19 (15 mg; 10 pmol) smo raztopili v Ν,Ν-dimetilformamidu (1,2 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (18 mg, 40 pmol) in cezijev karbonat (76,2 mg; 234 pmol) Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 3 ure. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 13 do 18% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline 30 minut) smo dobili spojino 31 (13,8 mg, 75%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 31: 17,7 min., 19: 19,1 min.

Konjugat 40

Peptid 38 (10 mg; 7,6 pmol) smo raztopili v Ν,Ν-dimetilformamidu (0,8 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (13,7 mg, 30,5 pmol) in cezijev karbonat (24,8 mg; 76 pmol) Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 1 uro. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 40% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (16 mL) in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 16 do 21% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline 30 minut) smo dobili 40 (16,6 mg, 52%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 40: 18,8 min., 38: 21 min,

Konjugat 41

Peptid 39 (10 mg; 8 pmol) smo raztopili v Ν,Ν-dimetilformamidu (0,8 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (14,3 mg, 32 pmol) in cezijev karbonat (27,6 mg; 85 pmol) Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 15 minut in nato mešali 65 min. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 40% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroo37 četne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (16 mL) in liofilizirali. Surov produkt smo združili z dvema drugima, analogno pripravljenima serijama iz 5, oziroma 6 mg peptida. S preparativno HPLC združenega materiala (gradient od 19 do 24% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 41 (23,7 mg, 85%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 41: 22,2 min., 39: 24,3 min.

Konjugat 42

Peptid 36 (5 mg; 3,6 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (0,4 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (6,4 mg, 14,3 pmol) in cezijev karbonat (11,6 mg; 35,7 pmol) Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in nato mešali 2 uri. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 17 do 22% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (8 mL) in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 17 do 22% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 42 (7,1 mg, 95%, čistoča: 85%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 42: 26,4 min., 36: 27,6 min.

Konjugat 43

Peptid 37 (10 mg; 7,35 pmol) smo raztopili v N, N-dimetilformamidu (0,8 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (13,2 mg, 29,4 pmol) in cezijev karbonat (23,9 mg; 73,4 pmol). Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 5 do 35% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (16 mL) in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 17 do 22% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 43 (9,3 mg, 73%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 43: 24,6 min., 37: 25,9 min.

Konjugat 44

Peptid 32 (10 mg; 8 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (0,8 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (14,5 mg, 32 pmol) in cezijev karbonat (26 mg; 80 pmol) Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 10 minut in nato mešali 1 uro. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (16 mL) in liofilizirali. Surov produkt smo združili z dodatno serijo, analogno pripravljeno iz 10 mg peptida. S preparativno HPLC združenega materiala (gradient od 7 do 12% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 44 (14 mg, 54%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 42: 14,6 min., 32: 16,8 min.

Konjugat 45

Peptid 34 (10 mg; 6,8 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (0,8 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (11,2 mg, 25 pmol) in cezijev karbonat (20,2 mg; 62 pmol). Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 10 minut in nato mešali 2 uri. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (16 mL) in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 13 do 18% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline 30 minut) smo dobili 45 (7,9 mg, 63%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 45: 20,5 min., 34: 25,2 min.

Konjugat 46

Peptid 35 (10 mg; 6,7 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (0,8 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (12,1 mg, 27 pmol) in cezijev karbonat (43,7 mg; 134 pmol). Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 20 minut in jo nato mešali 4 ure. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (16 mL) in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 13 do 18% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 46 (17,4 mg, 56%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 46: 21,0 min., 35: 23,8 min.

Konjugat 47

Peptid 33 (10 mg; 8 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (0,8 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 28 (14,5 mg, 32 pmol) in cezijev karbonat (26 mg; 80 pmol). Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 10 minut in jo nato mešali 1 uro in 55 min. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (16 mL) in liofilizirali. Surov produkt smo združili z dvema dodatnima seri39 jama, analogno pripravljenima iz 5, oziroma 10 mg peptida. S preparativno HPLC (gradient od 10 do 15% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 47 (18,9 mg, 59%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 47: 18,3 min., 32: 20,6 min.

Konjugat 49

Peptid 26 (15 mg; 9,8 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (1,2 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 48 (23,8 mg, 39 pmol) in cezijev karbonat (31,9 mg; 98 pmol). Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 10 minut in jo nato mešali uro in 50 min. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (24 mL) in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 13 do 18% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 49 (17,8 mg, 88%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 28: 6,2 min., 49: 21,9 min., 26: 24,4 min.

Konjugat 50

Peptid 32 (15 mg; 21,1 pmol) smo raztopili v zmesi dimetilsulfoksida (0,6 mL) in N,Ndimetilformamidu (0,6 mL) pod argonom. Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 1 min. Dodali smo spojino 48 (29,6 mg, 48 pmol) in cezijev karbonat (39,4 mg; 121 pmol). Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 25 minut in jo nato mešali 1 uro in 50 min. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (24 mL) in liofilizirali. Surov produkt smo združili z dodatno serijo, analogno pripravljeno iz 5 mg peptida, S preparativno HPLC (gradient od 7 do 12% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 50 (14,3 mg, 74%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 48: 10,1 min., 50: 15,2 min., 26: 16,8 min.

Konjugat 51

Peptid 19 (15 mg; 10 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (0,4 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 55 (6 mg, 8,3 pmol) in cezijev karbonat (56 mg; 172 pmol). Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 10 minut in jo nato mešali 2 uri. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne ki40 sline in liofilizirali. S preparativno HPLC (gradient od 10 do 14% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 51 (8,2 mg, 45%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 55: 13,0 min., 52: 2O,3min., 19: 21,3 min.

Konjugat 52

Peptid 20 (5 mg; 3 pmol) smo raztopili v N,N-dimetilformamidu (0,4 mL) pod argonom. Dodali smo spojino 55 (4,3 mg, 6 pmol) in cezijev karbonat (37 mg; 114 pmol). Zmes smo podvrgli sonikaciji tekom 5 minut in jo nato mešali 3 ure in 45 min. Reakcijo smo kontrolirali s HPLC (gradient od 0 do 30% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut). Zmes smo razredčili z 0,1% vodno raztopino trifluoroocetne kisline (8 mL) in liofilizirali. Surov produkt smo združili z dodatno serijo, analogno pripravljeno iz 5 mg peptida. S preparativno HPLC zddruženega materiala (gradient od 13 do 18% acetonitrila v 0,1% vodni raztopini trifluoroocetne kisline, 30 minut) smo dobili 52 (9,3 mg, 65%).

Retencijski časi (analitična izvedba): 55: 13,0 min., 52: 22,7 min., 20: 23,6 min.

TABELA 2

Začetni material Metoda Pogoji reakcije Izolirani produkt Dobitek

počasi od ogljikohidratnega začetnega materiala.

' FAB-MS podatki so se skladali s teoretičnimi vredi

2. IN VIVO PRIMARNA INDUKCIJA VIRUS - SPECIFIČNIH CTL Z IMUNIZACIJO Z 9-MERNIMI SINTETIČNIMI PEPTIDI

2.1. Metode

In vivo primarno indukcijo citotoksičnih T limfocitov (CTL) z imunizacijo z novimi konjugati tega izuma lahko izvršimo z metodologijo analogno tisti, ki jo opisujemo spodaj za in vivo primarno indukcijo virus-specifičnih CTL z imunizacijo z 9-memimi sintetičnimi peptidi.

Rezultat cepljenja miši s pred-predelanimi sintetičnimi peptidi, ki ustrezajo endogenim 9merom proizvedenim v celicah, inficiranih z A virusom gripe, so močni primarni odgovori CTL. Nastale CTL učinkovito uničijo ciljne celice inficirane z virusom, prednostno tiste z virusnim sevom, ki ima aminokislinske sekvence identične peptidom, ki smo jih uporabili za imunizacijo. Najboljši pogoji za primarni in vivo CTL odgovor smo dobili z 100 pg peptida raztopljenega v IFA in injiciranega podkožno (s.c.) pri osnovi repa. Celice vranice, ki smo jih inštruirali 7-10 dni prej, smo restimulirali 5 dni in vitro, uporabljajoč najboljšo nizko koncentracijo peptida (0,05 pM) in testirali proti ciljnim celicam inficiranimi z virusom in obdelanimi z peptidom. CTL, inducirane s peptidom, so bile omejene z MHC vrste I in CD8 pozitivne.

Peptidi

Peptid ASNENMETM (označen kot pep 9(PR8); SEQ ID NO: 1) in ASNENMDAM (označen kot pep 9(NT60); ostanek 3-11 SEQ ID NO: 4) so iz NP366-374 sevov A virusa gripe A/PR/8/34, oziroma A/NT/60/60. Pep 9(PR8) smo sintetizirali z aparatom za sintezo peptidov Applied Biosystems 430A peptide synthesizer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Pep 9(NT60) smo sintetizirali s trdno fazo čajna vrečka (Houghten, 1985; Saellberg, 1991). Vse peptide smo očistili z reverzno-fazno HPLC in analizirali njihovo aminokislinsko sestavo s plazma desoprcijsko masno spektrometrijo. Pripravili smo raztopine peptidov v PBS, za zalogo, in jih hranili pri -20°C.

Imunizacija

Miši smo imunizirali z eno s.c. injekcijo 100 ug vsakega od prostih peptidov raztopljenih v IFA na osnovi repa, ali z eno intravenozno injekcijo 20 HAU A virusa gripe, razredčenega v PBS in uporabljenega med 1-2 tedni po imunizaciji.

In vitro razmnoževanje CTL, specifičnih na A virus

Pripravili smo suspenzijo imunskih vraničnih celic. Rdeče krvničke smo lizirali s puferjem za lizo, ki je vseboval 8,28 g NH4CI, 1,0 g KHCO3 in 0,0372 g EDTA na 1 liter destilirane vode (pH 7,4). 25x10^ vraničnih celic, ki dajejo odgovor iz in vivo prvotno cepljenih miši, smo gojili skupaj v kulturi z 25x10^ obsevanih (2000 rad) singenskih vraničnih celic, bodisi inficiranih z A virusom gripe, bodisi v prisotnosti 0,05, 0,5 in 5 pM peptidov v 50 ml posodi za kulturo (Costar, Cambridge, MA) z 10 ml kompletnega gojišča za 5 dni pri 37°C, v vlažnem zraku s 5,3% C^.

Preizkus citotoksičnosti

Kot smo prej opisali (Jondal, 1975), smo ciljne celice, inficirane z virusom ali obložene s peptidom, pripravili z inficiranjem 2x10^ celic s virusom tekom 1,5 ure, oziroma inkubirane s 50 μΜ peptidov 1,5 ure pri 37°C. Po spiranju smo celice označili z 100-200 pC na^^CrO^ tekom 1 ure.

Celice smo dvakrat sprali in dodali 10^ ciljnih celic v 50 pl v 100 pl različnega števila efektorskih celic, ki smo jih pred preizkusom trikrat sprali v 150 pl popolnega gojišča na plošči z dnom v obliki V in 96 vdolbin in jih inkubirali 4 ure pri 37^cC, 5,3 CO2. Po inkubaciji smo zbrali 50 ul supematanta in izračunali odstotek specifične sprostitve ³^Cr s formulo: % specifične sprostitve ~ (eksperimentalno-sponlano)/(največje-spontano) cpm. Spontana sprostitev je vedno bila manjša od 16%.

2.2 Rezultati

Primarna in vivo indukcija proti gripi A virus-specifičnih CTL s 9-meri

Kot so predhodno objavili (Townsend et al., 1985, 1986), CTL inducirane s živim A virusom gripe v H-2 miši so v glavnem usmeijene proti imunodominantnem NP365-380 epitopu. Mi smo začetno poskušali imunizirati miši s peptidom izvedenim iz obeh sevov, PR8 in NT60, da bi inducirali CTL odgovore po predpisu, ki so ga opisali Alchele et al. (1990). Vendar smo opazili nesignifikanten nivo uničevalne aktivnosti usmeijene proti obem vrstam celic, in tistim, prevlečenim s peptidom in tistim, inficiranim z virusom, kljub ponovljenemu pojačanju. Nasprotno smo, ko smo uporabili 100 ug krajšega pep 9(PR8) za s.c. injekcijo in vranične celice restimulirali s 5 pM pep 9(PR8) in vitro, izzvali močan odgovor CTL proti pep 9(PR8)-obloženim RAM (nismo prikazali) in EL4 celicam, Čeprav ciljne celice inficirane z virusom niso bile ubite (tabela 3). Ko smo uporabiti nižjo koncentracijo pep 9(PR8) za restimulacijo in vitro, so razmnožene CTL kazala večjo aktivnost uničenja s pep 9 (PR8) prevlečenih ciljnih celic, lizirane so bile tudi celice inficirane z virusom (tabela 3). Kakor smo prikazali v tabeli 3, najboljša doza za imunizacijo je bila 100 ug in za restimulacijo 5 ali 0,05 pM. Imunizacija z 10 ug in 1 pg je izzvala manj, ali pa sploh ne, CTL odgovora. Peptidi, ki smo jih raztopili v kompletnem Freundevem adjuvantu (CFA) ali PBS, niso dali odgovor. Intravenozna injekcija peptidov tudi ni izzvala primarnega in vivo odgovora CTL (ni prikazano).

Drugi 9-mer izveden iz NT 60 je dal močnejši proti-peptidni in protivirusni CTL odgvor, kot je prikazano na sliki 3.

Specifičnost CTL induciranih s pep 9(PR8) in pep 9(NT60)

V luči teh rezultatov smo raziskovali fino specifičnost izzvanih CTL, z ozirom na pep 9(PR8) in pep (NT60). CTL prednostno uničujejo njihove ustrezne celice obložene s peptidom in inficirane z virusom (slika 4). CTL kažejo višjo prečno reaktivnost s celicami obloženimi s peptidom kot pa s celicami, inficiranimi z virusom.

CTL odgovori na žive pepptide ali viruse

MSši smo predhodno inficirali z živim PR8 virusom in vranične celice restimulirali bodisi s stimulatorskimi celicami, inficiranimi z virusom (slika 5A), bodisi z normalnimi singenskimi vraničnimi celicami, v prisotnosti 0,05pM pep 9(PR8) (slika 5B). CTL, predhodno obdelane in vivo z živim virusom in restimulirane z nizko koncentracijo pep 9(PR8), imajo pomembno sposobnost prepoznavanja tako celic, inficiranih z virusom, kakor tudi celic, prevlečenih s peptidom (slika 5B). Treba je omeniti, da je mala količina restimulacijskega peptida bila zadostna za stimuliranje CTL, predhodno obdelanih z virusom in vitro in da ima iste zmožnosti kot celice, inficirane z virusom. Ko smo za in vivo primarno obdelavo uporabili pep 9(PR8) in za restimuliranje in vitro celice, inficirane z virusom, ali pep 9(PR8) (sliki 5C in D), smo izzvali CTL odgovore proti obem vrstam celic, tako obloženimi s peptidom, kakor tudi inficiranimi z virusom. Živ virus je bil bolj učinkovit v primarni indukciji CTL, kot pa prost peptid.

Časovni potek aktivnosti CTL po imunizaciji s pep 9(PR8)

Miši smo enkrat primarno imunizirali s pep 9(PR8), z namenom, da določimo kinetiko aktivnosti CTL po imunizaciji s pep 9(PR8). Vranične celice imuniziranih živali smo restimulirali in vitro 2-30 dni po imunizaciji s pep 9(PR8) in preizkusili na aktivnost CTL. Aktivnost CTL proti RAM ciljnim celicam obloženimi s pep 9(PR8) je dosegla vrh 7 dni po imunizaciji in je nato postopoma padala (slika 6). V 30 dnevu po primarni imunizaciji smo lahko še zmeraj dokazali nižji nivo aktivnosti.

In vivo s peptidom inducirana citotoksičnost je posredovana s CD8⁺ in MHC vrste I omejenimi

Kot smo pokazali na sliki 7a, CTL, inducirane s pep 9(PR8), brez CD8⁺ T celic, ne lizirajo EL4 celice, obložene s pep 9(PR8). Na drugi strani, odstranitev CD4⁺ ni imela učinka na citolitično aktivnost proti ciljnim celicam, obloženim s pep 9(PR8). Tako CTL, specifične za pep 9(PR8), eksprimirajo CD4 CD8⁺ fenotip.

CTL, po poreklu C57B6/J (H-2^), IN vivo primarno inducirane, smo testirali na singenske EL4 (H-2*³), alogenske P815 (H-2^) in L929 (H-2^) ciljne celice, inficirane s PR8 sevom virusa gripe. Kot kaže slika 7b, obstaja jasna restrikcijska specifičnost za H-2^ ciljne celice.

TABELA 3

Aktivnost CTL, inducirana z različlnimi dozami peptidov za primarno indukcijo (priming) in vivo in restimulacijo in vitro.

Priming* doza (pg)	Restimula cijska doza (pM)	Neobdelano	Liza ciljnih EL4 (%)
40:1*	20:1	- —I-: inficirane s PR8 obložene s pep9(PR8)
40:1	20:1	40:1	20:1
100	5.00	4.61	4.21	7.00	8.50	43.68	34.73
0.05	0.12	0.51	30.76	30.07	59.42	50.73
10	5.00	5.63	4.19	15.04	13.98	23.54	22.09
0.05	5.74	4.14	31.19	23.75	45.52	34.60
1	5.00	3.34	2.66	6.88	5.54	11.85	9.28
0.05	4.08	3.32	12.43	10.50	16.44	15.54

Razmerje efektor:cilj.

3. PEPTIDI, KI SE ZUNAJ CELIC VEŽEJO NA MHC-1, RECIKLIZIRAJO NA POVRŠINO CELIC PO PREDHODNEM VSTOPU V NJIH

Znano je, da zunanji peptidi, ki vežejo MHC-1, navzgor regulirajo ekspresijo ustreznih restrikcijskih elementov v prisotnosti B^M (Otten et al., 1992). Ta odgovor regulacije navzgor in vitro je v vzajemni zvezi z in vivo imunogeničnostjo peptidov. Ker smo odkrili, da endosomalni inhibitor klorokin inhibira to regulacijo navzgor (slika 8), je možno, da ta proces zahteva vstop peptidov v celice in reciklizacijo membran. V podporo tega modela, je večje število prejšnjih raziskav odkrilo ta vstop v celico preko invaginacij obloženih s klatrinom, kakor tudi recikliranje MHC-1.

Da bi raziskali možno recikliranje peptidov, ki se zunaj celic vežejo na MHC-1, smo sintetizirali dva peptida, ki se vežeta na d\ ki predstavljata imunodominantna epitopa na El A proteinu iz adenovirusa (sekvenca SGPSNTPPEI; SEQ ID NO:2) in na nukleoproteinu iz A virusa gripe (PR8) (sekvenca ASNENMETM; SEQ ID NO: 1). Na amino- ali kamboksi- terminalni del smo dodali cistein, kot biohemijski položaj za združitev z molekulskim markeijem galabios (Gal-Gal), za katerega je bilo raspoložljivo specifično monoklonsko protitelo (MC2101) (Brodin et al. 1988). Kot je prej objavljeno, adicija cis teina na amino- terminalni del ni ukinjala zmožnost navzgor regulacije D^ ali in vivo imunogeničnosti peptida (Zhou et al., 1992b). Dodatek galabiosa na isti položaj je povzročil glikopeptide, katere je močno prepoznalo galabios specifično monoklonsko protitelo MC2101 v ELISA testu (tabela 4). Ga^-CSGll peptid (konjugat 29) močneje reagira, kot pa GAL2-CASIO peptid. Da bi potrdili, da dodatni galabios ni spremenil zmožnost vezave na D° ali in vivo imunogeničnost, smo oba glikopeptida testirali na in vitro navzgor regulacijo in in vivo imunogeničnost. D⁸ navzgor regulacija je bila podobna z glikopeptidi, v primerjavi s samimi peptidi (podatke nismo prikazali). CTL, povzročene z in vivo injekcijo ter in vitro restimulacijo z glikopeptidi, so bile strogo peptid-specifične in niso prepoznale Ga^, kadar je bil vezan za drugi peptid, na prečno-prekrižan način (criss-cross) (slika 9). Na osnovi teh rezultatov smo zaključili, da Ga^ v glikopeptidih deluje kot inertni marker.

Da bi omogočili najboljšo vezavo zunanjih glikapeptidov na membranske molekule D , smo uporabili mutantne RMA-S celice. Te celice so po naravi deficitarne v transportu predelanih peptidov iz citosola na ER kompartiment, zaradi izgube Tap-2 peptidnega transportnega sistema. Posledica tega je, da RMA-S celice eksprimirajo večjo frakcijo praznih D^ molekul na celični površini, kot pa ne-mutantne celice. Ekspresijo teh praznih D^ molekul lahko nadalje povečamo z nizko temperaturo (26°C) in jo stabiliziramo z dodatkom peptidov, ki se vežejo na D⁸ pri 37°C /slika 3). Tako postane, z obdelavo z nizko temperaturo obdelanih RMA-S celic z visoko koncentracijo glikopeptidov, v prisotnosti B2-M, velik del membranskih D⁸ molekul nasičen z istim, identičnim glikopeptidom. RMA-S, ki smo jih obdelali na ta način, so jasno označene z MV2101 protitelesom (slika 10), kar kaže membransko ekspresijo Ga^ epitopa, veijetno v obliki glikopeptida,

V vezanega na MHC-1. Z obdelavo s pronazo smo s teh celic odstranili vso ekspresijo D^D in Gal2 (slika 10). Povratek Ga^ epitopa smo inhibirali s klorokinom (podatke nismo prikazali). Ker običajna pot pojave MHC-1 ni funkcionalna v RMA-S celicah, in se posledično citosolni peptidi ne transportirajo v ER kompartiment, ti rezultati močno nakazujejo endosomalno recikliranje glikopeptidov, vezanih na D^. Podobne rezultate smo dobili s Ga^-CASIO glikopeptidi (nismo prikazali).

Da bi potrdili te rezultate na funkcionalnem nivoju, smo izzvali CTL specifične za A (PR8) gripe in jih testirali proti RMA-S in EL-4 ciljnim celicam, obdelanimi s peptidom (ASNENMETM), ki ustreza ciljenmu epitopu v Ga^-CASIO glikopeptidu (konjugat 31). Obe ciljni celici sta bili močno uničeni, kot so objavili prej (Roetzshke et al., 1990) (slika 11). Obdelava s pronazo teh ciljnih celic, obdelanih s peptidi, je odstranila večino ekspresije in večino občutljivosti na specifične CTL (slika 11). Inkubacija celic, obdelanih s pronazo, pri 37°C, da bi omogočili reekspresijo obeh, D^ in pridruženih peptidov, je povzročila povratek občutljivosti na uničenje s CTL. Ta povratek je bil hitrejši in bolj ekstenziven pri RMA-S celicah, v primetjavi z EL-4 celicami, in je bil blokiran s proti-D^ monoklonskimi protitelesi in klorokinom (podatke nismo prikazali).

Te rezultate interpretiramo tako, da smatramo, da peptidi, vezani na MHC-1, reciklirajo skozi intra-celični kompartiment podoben zgodnjim endosomom v T celicah. Mogoče ta mehanizem omogoča peptidno izmenjavo, da bi se s tem optimizirala ekspresija membranskih peptidov. Hochman et al (1991) so pokazali, da MHC molekule vrste I v endosomalnem kompartimentu podležejo konformacijskim spremembam, kar pokazuje, da B2M gre iz in na teško verigo. Tako nizek pH, ki privede do tega učinka, lahko omogoči tudi peptidno izmenjavo. V potrdilu tej domnevi je Harding nedavno (1992) objavil, da pojavo MHC-1 lahko blokiramo s hipotermijo in slabo baznimi amini, uporabljajoč elektroporacijo eksogenih antigenov.

Znano je, da molekule MHC-1 vežejo peptide najboljše dolžine z veliko večjo afiniteto, v primetjavi z malo daljšimi peptidi, kar se je pokazalo v večjem številu in vitro preizkusov. Ti vključujejo MHC-1 membransko navzgor regulacijo, sensitacijo ciljnih celic na specifične CTL, neposredno vezavo peptidov na prazne verige vrste I na mutantnih celicah, zdržitev MHC-1 v lizatih mutantnih celic, povzročeno s peptidi in meritve hitrosti odcepitve vezanih peptidov z MHC-1. Ta večja afiniteta peptidov najboljše dolžine ja lahko v zvezi s točnim prilagajanjem v žleb verig vrste I, kjer se peptid veže, ker je ta žleb blizu obeh koncev (Madden et al., 1991). Tako lahko peptidi najboljše velikosti tvorijo kompleks trimemi peptid-teška veriga B -M, za katerega je bolj veijetno, da bo recikliral z endosomov, v primerjavi s kompleksi, ki se sestojijo iz daljših peptidov.

V ciljnih celicah lahko recikliranje peptidov najbolje vezanih na MHC-1 omogoči najbolj učinkovito prepoznavanje s uztreznimi specifičnimi CTL, kot je dogaja v tej raziskavi. Do sedaj je večina podatkov za MHC-1 recikliranje dobljeno s T celicami. Vendar, če podobni mehanizmi delujejo v določenih celicah, ki predstavijo antigen, je lahko izgradnja najbolj primernih peptidov, na nivoju membrane, tudi pomembna v dovajalni roki imunega odgovora. Zlasti bi s tega vidika morali raziskovati dendritične celice, za katere je znano, da so bistvene za razmnoževanje CTL, tako in vivo kakor in vitro. Obstoječa korelacija med kapaciteto peptidov, da navzgor regulirajo ekspresijo MHC-1 in vitro in njihovo imunogeničnostjo in vivo sugerira, da je to lahko pomemben mehanizem v celičnem odgovoru.

TABELA 4

Prepoznavanje Gal₂ glikopeptidov z monoklonskim protitelesom MC2101 v preizkusu ELISA

Protitelo	Specifičnost	Indeks absorbance
Gal2- CSG11	CSG-11	Gal2- CAS10	CAS-10
MC2101	Galabios Gal-Gal	1.86	0.01	0.41	0.02
Pk002	Globotriaosil Gal-Gal-Glc (CD77)	0.04	0.08	0.04	0.01

Peptide (50 pg/ml) smo razredčili v 0,05 M karbonatnem pufru (pH 9,6) in dodali 100 pl/vdolbino na Costar mikroplošče z ravnim dnom (kat. št. 3590), za inkubacijo čez noč, pri 4°C. Ploščice smo enkrat sprali z 0,5 % PBS tekom 30 minut pri sobni temperaturi in dvakrat s pufrom PBS/0,05% Tween. Monoklonska protitelesa smo razredčili v 0,5% želatina/PBS/0,05% Tween, dodali mikroploščicam in inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi ter sprali, tako da smo oplazili s curkom PBS/Tween. Zajčje proti-mišje imunoglobu50 line, konjugirane z alkalno fosfatazo (Dakopatts code No. S 414) smo razredčili 1/1000 v PBS/Tween in dodali kot 100 μϊ/vdolbino. Po 2 urah inkubacije pri sobni temperaturi in 4 spiranjih s PBS/Tween, smo dodali 100 μϊ raztopine substrata alkalne fosfataze. Ploščice smo pregledali po 2 urah pri sobni temperaturi, z Multiskan System (Lab system), za optično gostoto pri 405 nm.

4. POVZROČANJE ODGOVORA CTL, SPECIFIČNEGA NA OGLJIKOV HIDRAT, S CEPLJENJEM Z GLIKOPEPTIDOM, KI IMA OGLJIKOHIDRATNI DEL NA NOTRANJEM, IMUNOGENIČNEM POLOŽAJU

Ogljikov hidrat galabiozo (Gal-a-4Gal, sicer navajano kot Gal₂) smo združili preko notranjega cisteina (položaj 10) v 12-memem peptidu SGVENPGGYCLT (SEQ ID NO: 9), ki predstavlja H2-D^ omejen imunodominantni CTL epitop v limfocitičnem virusu koriomeningitisa (LCMV) (Oldstone et al., 1988). Glikopeptid smo poimenovali SGV12Gal₂ (konjugat 30; Slika 12). Združitev smo izvedli na tiolni skupini, uporabljajoč Svezavo, kot smo opisali v primeru 1.

Miši smo imunizirali s SGV12-Gal₂ glikopeptidom, kot je opisano v primeru 2 in v Zhou et al. (1992a). Po restimulaciji in vitro z istim SGV12-Gal₂ glikopeptidom, smo izvedene citotoksične T celice testirali proti H2-D° in K^D pozitivnim EL-4 celicam, obloženimi s sledečimi peptidi in glikopetidi:

1. SGVENPGGYCLT (SGV12; SEQ ID NO: 9)

2. SGV12-Fal₂

3. ASNENSETM (ASN9-6S-Hal₂ z Gal₂ vezanim na S na položaju 6 (ASN9-6S-Gal₂)

4. ASN9-6S

5. CSG11-Gal₂ (videti primer 3 in sliko 9)

6. CSGPSNTPPEI (CSG11; SEQ ID NO: 8)

7. CRG9 s Gal₂ vezanim na C v položaju 1 (CRG9-Gal₂)

8. CRGYVYQGL (CRG9; SEQ ID NO: 13)

Peptidi 1-6 so znani, modificirani T celični epitopi, ki vežejo D^, in se vežejo na RMA-S celice, kot so pokazale meritve z D^D navzgor regulacijo in vitro (podatki niso prikazani). Peptidi 7-8 predstavljajo znan epitop /RGYVYQGL; SEQ ID NO: 27) in oba peptida navzgor regulirata na RMA-S celicah (podatki niso prikazani). Ekspresijo Ga^ epitopa smo merili s FACS na površini celic, ki so vezale glikopeptide. Visoko Ga^ ekspresijo smo odkrili z glikopeptidi 2, 5 in 7 (podatke nismo prikazali). Glikopeptid 3 proti-Gal2 monoklonsko protitelo ni prepoznalo, ko je bil vezan na RMA-S celice. Zaključek je bil, da glikopeptidi 5 in 7 eksprimirajo isti Gal2 epitop kot imunogen SGV12Gal2 na različnih nosilnih peptidih. CSGll-Ga^ glikopeptid je bil vezan na D^, CRG9Ga^ glikopeptid pa na K^. Tako je Ga^ edini epitop, ki je skupen za glikopeptide 2, 5 in 7.

Ko smo s SGV12-Gal2 izzvane CTL celice testirali proti El-4 celicam, obloženimi s zgoraj opisanimi peptidi in glikopeptidi, smo odkrili, da so bile ciljne celice, obložene z glikopeptidi 2 in 5 ubite, kakor tudi, na nižjem nivoju, ciljne celice obložene z glikopeptidom 7 (slika 13). Tako izzvane CTL celice niso prepoznale nosilnega peptida samega (SGV12), ali pa kontrolnih peptidov, vključno glikpeptid 3 (ki ni eksprimiral epitopa Ga^ na nivoju celične površine).

Na osnovi teh rezultatov smo zaključili, da imunizacija z glikopeptidom SGV12-Gal2 povzroča pojavo Ga^ specifičnega T celičnega odgovora. Razlog je lahko ta, da je Ga^ ogljikov hidrat orientiran v najboljšem položaju za prepoznavanje T celic. Večja smrtnost ciljnih celic, obloženih z glikopeptidom 7, je lahko posledica dejstva, da glikopeptid 5 predstavijo D*⁵ in glikopeptid 7 K^ verige vrste I.

V nadaljni seriji eksperimentov (po istem predpisu, kot smo ga zgoraj opisali) smo miši imunizirali z glikopeptidom RGY8-4h-Gal2 (RGY8 pomeni oktapeptid RGYVYQGL; 4h kaže, da je V na položaju 4 zamenjan s homoserinom; Ga^ kaže konjugacijo sladkoija Ga^ na homoserinov hidroksil). Kot v eksperimentih, ki smo jih opisali s sklicevanjem na sliko 13, smo nastale RGY8-4h-Gal2 izzvane CTL celice testirali proti EL-4 celicam, obloženimi z RGY8-4h-Gal₂ in RGY8-4h.

Iz rezultatov prikazanih na sliki 14(A) lahko vidimo, da so nastale CTL celice specifične tako za peptid, kakor za glikopeptid.

Ko smo to heterogeno efektorsko populacijo testirali proti EL-4 celicam, obloženim z

Gal2 na drugem nosilnem peptidu (SGV 12-Gal2) in z SGV12 peptidom per se (slika

14(B)), so bile ubite samo celice, obložene z glikopeptidom.

Ta učinek dokazuje, da imajo CTLS Ga^ specifičnost z prečno-križnim testiranjem (videti oddelek z naslovom Eksperimentalni preizkusni sistem zgoraj).

Podatke, ki jih tukaj predstavljamo, lahko sumamo prikažemo v sledečih tabelah 5 in 6.

TABELA 5

Analiza vezujočih peptidov in glikopeptidov

Peptid	ELISA	MHC-1 pov.reg.	Membranska ekspresija	Imunoge- Specifičnost
pičen	P G GP
Gal2-CAP9	+	+	—	+	+
FAP9-5h-Gal2	+			+	+	+
Gal2-CRG9	+	-	+	+	+
RGY8-4h-Gal9	+	+	+	+	+	+

Peptid	Imunogeničen	Pripombe
CAP9	(SEQ ID NO: 14)
FAP9	(SEQ ID NO: 20)	+	Močno, s visoko FAP9-5h reaktivnostjo
FAP9-5h	(SEQ ID NO: 26)	+	Slabše, niška FAP9 reaktivnost
CRG9	(SEQ ID NO: 13)	+
RGY8	(SEQ ID NO: 27)	+	Mala RGY8-4h reaktivnost
RGY8-4h	(SEQ ID NO: 25)	+	Močno, z RGY8 reaktivnostjo

TABELA 5

Analiza vezujočih peptidov in glikopeptidov

Peptid	ELISA	MHC-1	Membranska	Imunoge-	Specifičnost
	7.4 9.6	pov.reg. ekspres, recikl.	ničen	P G GP
Gal2-CAS10	+	+	+ +	+	+
GM3-CAS10				-
GM3-laktam-CAS10				tox
ASN9-6h-Gal2	+ —	+	+ +	+	+
ASN9-6S-Gal2	-	+	-	-
ASN9-4S-Gal2	(+) -		-

Gal₂-CSG11

GM3-CSG11

GM3-laktam-CSG11

SGP10-6h-Gal₂ SGP10-6S-Gal₂ SGP10-4S-Gal₂ (+) SGV12-Gal2 + + + + +

Peptid Imunogeničen

CASIO	(SEQ ID NO: 7)	+
ASN9	(SEQ ID NO: 1)	+
ASN9-6h	(SEOIDNO: 21)
ASN9-6S		-
ASN9-4S
CSG11	(SEQ ID NO: 8)	+
SGP10	(SEQ ID NO: 2)	+
SGP10-6h	(SEQ ID NO: 23)
SGP10-6S		+
SGP10-4S

Pripombe na preizkuse (Tabele 5 in 6)

ELISA

Elisa preizkus smo izvedli, kot smo opisali v zvezi s tabelo 4.

MHC-1 navzgor regulacija

Kot smo zgoraj opisali, z ozirom, na sliko 8 in sliko 10A, načelno se peptidi lahko vežejo na prazne težke verige MHC-1 na celični površini celic, ki predstavijo antigen, to pa vodi stabilizaciji in navzgor regulaciji ustreznih MHC-1 verig.

Membranska ekspresija

Ko se glikopeptid veže na MHC-1, ki so na celični površini, ekspresijo (in dosegljivost) ustreznih delov CHO lahko ugotovimo z detekcijo z antitelesi v FACS, kot smo zgoraj opisali, glede na sliki 10C in E.

Recikliranje membrane Opisano je v alikah 10D in F.

Imunogeničnost

Miši imuniziramo z glikopeptidi kot smo tu opisali, in in vitro restimulirane CTL celice testiramo na usmrtitev ciljnih celic, obloženih z različnimi peptidi in glikopeptidi. Speci fičnost P pomeni, da CTL celice prepoznajo samo peptidni del, G pomeni, da prepoznajo samo CHO del in GP, samo njihovo kombinacijo.

KRATEK OPIS SLIK

Slika 1

Kemična struktura spojin 1-15, opisana v oddelku Sinteza vmesnih razmikalnih glikozidov.

Slika 2

Kemična struktura glikopeptidnih produktov 21-25, opisana v oddelku Sinteza glikopeptidov.

Slika 3

CTL, inducirane s pep 9(NT60) bolj učinkovito bzirajo tako EL4 celice specifične za virus, kakor obložene s peptidom, z 0,05 μΜ pep 9(NT60), ki smo ga uporabiti za «stimulacijo, kot pa s 5 μΜ in 0,5 μΜ. CTL so se razmnožile po eni s.c. injekciji 100 pg pep 9(NT60). Imunske vranične celice smo «stimulirali s singenskimi ozračenimi celicami v prisotnosti pep 9(NT60) (A), 5 μΜ; (B), 0,5 μΜ in (C), 0,05 μΜ 5 dni in ponovno testirati proti neobdelanim EL4 (O—O) , NT60-inficiranim (>—%}. pep 9(NT60)obloženim (□—□),

Slika 4

Specifičnost CTL, induciranih s pep 9(PR8) in pep 9(NT60) (B). Efektorske CTL smo testirati proti neobdelanim EL4(O—O). PR8-jnficiranim(·-·), NT-60 inficiranim (□-□), pep 9(PR8)-obloženim(·—B),pep 9 (NT60)- obloženim' (δ—δ).

Slika 5

CTL odgovori, primarno inducirani in «stimulirani z živim virusom in peptidi. Miši so bile primarno imunizirane in vivo s PR8 živim virusom (A, B) ati pep 9(PR8) (C, D), in «stimulirane s PR8-inficiranimi vraničnimi celicami v prisotnosti 0,05 pM pep 9(PR8) (B, D). Ciljne celice so bile EL4 neobdelane (O—O), PR8-inficirane(S—®),pep 9(PR8)obložene (□—□).

Slika 6

Kinetika aktivnosti CTL, inducirana z eno s.c. injekcijo pep 9(PR8). Miši smo primarno imunizirali z 100 fig pep 9(PR8) in vivo in restimulirali in vitro z 5 μΜ pep 9(PR8) v dnevih: 2, 7, 10, 20 in 30, po primarni imunizaciji. Izzvane CTL smo testirali proti RMA neobdelanim(OO)ift pep 9(PR8)-obloženim(·-·).Razmerje efektor:cilj, 60:1.

Slika 7

CD8⁺ in H-2D^ omejene T celice posredujejo citotoksičnost, inducirano s peptidom. a: CTL smo inducirali s pep 9(PR8). Nato smo pri enakem številu CTL odstranili CD4⁺ in CD8⁺ celice, z Dynabeads sistemom. Ostale celice smo nato testirali na litično aktivnost proti pep 9(PR8) obloženim EL4 celicam. Neobdelane CTL (O—O), brez CD4⁺(·—·) in brez CD8⁺ (□—□) smo testirali na litično aktivnost proti s pep 9(PR8)-obloženimi EL4 celicami. b·. CTL, inducirane s pep 9(PR8) smo testirali proti s PR8-inficiranimi ELA

PR8-inficiranimi P815(·—®)in PR8-inficiranimi L929 (□—□).

Slika 8

H-2D^ navzgor regulacija, ki jo posreduje peptid, se lahko inhibira s klorokinonom. RMA-S celice smo inkubirali s A (PR8) peptidom NP366-374 virusa gripe (50 μΜ) v

L prisotnosti ali pa brez klorokina, 6 ur. Po inkubaciji smo celice sprali, označili s protiTj (28-14-8S) monoklonskim protitelesom, na ledu tekom 30 minut, sprali in inkubirali s zajčjim proti-mišjim (F(ab’)2-FITC (F313. Dako, Copenhagen, Debmark) tekom 30 minut. Označene celice smo fiksirali z 1% formaldehidom in jih analizirali v pretočnem citometru FACScan (Becton Dickinson; Mountain View, CA).

Slika 9

Sinteza glikopeptidov (A in C). Glikopeptide smo sintetizirali z združitvijo 2-bromoetil 4O( a -D-galaktopiranozil)- β-D-galaktopiranozida (spojina 28) s peptidi, ki so vsebovali tiolno funkcijo. Nativni peptidni sekvenci smo na amino- koncu dodali cisteinski del. S cezijevim karbonatom kot pospeševalcem, smo nukleofilne lastnosti cisteinskega žveplovega atoma uporabili za gradnjo tioesterske vezi med peptidom in elektrofilno vmesno skupino, glikozidno vezano na ogljikohidratno skupino. Reakcije Gal₂ združitve smo izvršili v Ν,Ν-dimetilformamidu. Pretvorbe združitve smo spremljali s HPLC in jih ustavili z dodatkom vode, ki je vsebovala 0,1% trifluoroocetne kisline. Nastale glikopeptide (konjugati 29 (A) in 31 (C)) smo očistili s preparativno HPLC in molske mase produktov potrdili s FAB MS.

CTL preizkus. (B in D). Miši smo imunizirali s.c. na osnovi repa z 100 pg glikopeptida v nepopolnem Freundovem adjuvantu. Deset dni po primarni imunizaciji, smo vranične celice restimulirali in vitro, uporabljajoč 25 x 10^ celic, ki dajejo odgovor, gojenih skupaj v kulturi z 25 x 10^ ozračenimi (2500 rad) singenskimi vraničnimi celicami. Restimulacijo smo izvršili v prisotnosti glikopeptidov pri 0,05 μΜ v 50 ml stekleničkah za tkivno kulturo, z RPMI/10% FCS, pri 37°C tekom 5 dni. Ciljne celice RMA-S smo obložili s 50 pM peptida tekom 1 ure, pri 37°C in jih sprali. Celice smo označili z 100 pCi Na2^^CrO^ tekom 1 ure pri 37°C in dvakrat sprali. Efektorske limfocite smo ločili z Lymphoprep centrifugiranjem in testirali pri različnih razmerjih s 5000^^Cr-označenimi ciljnimi celicami, uporabljajoč 150 pl/vdolbino v V-oblikovanih mikrotitrskih ploščicah z vdolbinami. Mikroplošče smo vcentrifugirali pri 300 g in jih inkubirali 4 ure pri 37°C. Po inkubaciji smo ploščice zopet centrifugirali in 50 ul supematantov preiskali v gamma scintilacijskemu števcu.

Slika 10

Uokvirjen del A: celice RMA-S smo 24 ur inkubirali pri 26°C, da bi inducirali ekspresijo praznih verig D^ MHC-1 na celični površini in pri 37°C, ter označili za D^ ekspresijo. Uokvirjeni del B: Odstranitev D^ ekspresije z obdelavo celic RMA-S, predhodno inkubiranih pri 26°C, s pronazo. Obdelava s pronazo je trajala 2 uri in 4 ure. D^ odstranitev je popolna po 4 urah. Uokvirjena dela C in E: RMA-S celice inducirane z 26°C smo obdelali z glikopeptidi Gal2-CSG11 (uokviijen del C) ali GaUCASlO (uokvirjen del E), 300 μΜ tekom 2 ur pri 37°C, sprali in označili na ekspresijo Ga^· Uokvirjena dela D in F: RMA-S celice, obdelane z glikopeptidom, kot v uokvirjenih delih C in E, smo obdelali s pronazo, da bi odstranili ekspresijo D^ in glikopeptida, sprali in dalje inkubirali pri 37°C, da bi omogočili ponovno ekspresijo glikopeptidov in označili za Ga^ ekspresijo.

Slika 11

Ponovna ekspresija peptida vezanega na D*⁵ na EL4 (A) in RMA-S (B) celicah po obdedlavi s pronazo, kot smo jo ugotovili s specifičnimi CTL. EL4 (A) in RMA-S (B) celice smo obdelali s peptidom NP366-374 (100 μΜ) tekom 1,5 ure. Po spiranju smo celice obdelali s pronazo E (ProE, 4 mg/ml v RPMI 1640), sprali in gojili v kulturi pri 37°C tekom 0, 1 in 3 ur, ter preizkusili v testu sprostitve ^Cr, trajajočem 4 ure. Pripravke CTL so prej opisali (Zhou et al., 1992 b). Kratko, C57B6/J samice miši smo imunizirali z eno

i.v. (intravenozno) injekcijo 20 HAU A/PR/8/34 virusa gripe (dar Dr. A. Douglasa,

National Institute for Medical Research, London) razredčenega v PBS. 1-4 tedne po imunizaciji smo restimulirali imunske vranične celice z ozračenimi vraničnimi singens kitni celicami, inficiranimi z virusom, tekom 5 dni.

SUka 12

Glikopeptid SGV12-Gal₂ (konjugat 30), ki smo ga uporabili za povzročanje CTL odgovora, specifičnega na ogljikov hidrat (primeijati primer 4).

SUka 13

S SGV12-Gal₂ povzročene CTL celice smo testirali proti EL-4 celicam, obloženim s peptidi / glikopeptidi, kot je naznačeno v uokvirjenem delu. E/T, razmeije efektor:cilj.

Sliki 14(a) in (B)

S RGY8-4h-Gal₂ povzročene CTL celice smo testirali proti celicam ELA, obloženimi z naznačenimi peptidi / glikopeptidi. E/T, razmerje efektor.cilj.

REFERENCE

Alchele et al. (1990), J. Exp. Med. 171, 1815Ansari, A.A., T. Frejd and G. Magnusson (1987), Carbohydr. Res. 161, 225-233.

Brodin et al. (1988), Int. J. Cancer 42, 185-194.

Catelani, G. (1988), Carbohydr. Res. 182, 297-300.

Crowle (1988), Infect. Immun. 56, 2769-2773.

Dahmen et al. (1983 a), Carbohydrate Res. 113, 219-224.

Dahmen, J., T. Frejd, G. Gronberg, T. Lave, G. Magnusson and G. Noori (1983 b), Carbohydt. Res. 116, 303-307.

Dahmen et al. (1984a), Carbohydrate Res. 127, 15-27

Dasgupta, F. and P.J. Garegg (1988), Carbohydr. Res. 177, C13-C17. Domer et al. (1989), Infect. Immun. 57, 693-700.

Elofsson, M., Walse, B. and Kihlberg, J. (1991), Tetrahedron Lett. 32, 7613-7616.

Falk etal. (1991), Nature 351, 290-296.

Fremont et al (1992), Science 257, 919-927.

Fung et al. (1990), Cancer Research 50, 4308-4314.

Hansen et al. (1990), J. Virol. 64, 2833-2844

Hakomori (1991), Current Opinion in lmmunology 3, 646-653.

Harding (1992), Eur. J. Immunol. 22, 1865-1869.

Henningsson etal. (1987), Cancer Immunol. Immunother. 25, 231-241. Hochman et al. (1991), J. Immunol. 146, 1862-1867.

Ishioka et al. (1992), J. Immunol. 148, 2446-2451.

Janeway (1991), Nature 353, 792.

Jansson, K., S. Ahlfors, T. Frejd, J. Kihlberg and G. Magnusson (1988),

J. Org. Chem. 53, 5629-5647.

Jardetzky et al. (1991), Nature 353, 326-329.

Jondal & Pross (1975), Int. J. Cancer 15, 596Jorgensen et al. (1992), Nature 355, 224-230.

Latron et a/.(1992), Science 257, 964-967.

Lonn, H. and K. Stenvall (1992), Tetrahedron Lett. 33, 115-116.

Magnusson, G., S. Ahlfors, J. Dahmen, K. Jansson, U. Nilsson, G. Noori,

K. Stenvall and A. Tjornebo (1982), J. Org. Chem. 55, 3932-3946. Madden et al. (1991), Nature 353, 321-325.

Marra, A. and P. Sinay (1990), Carbohydr.Res. 195, 303-308.

Marra, A. and P. Sinay (1989), Carbohydr. Res. 187, 35-42.

Masazuni et al. (1992), Science 257, 927-934.

Moll et al. (1989), Infect. Immun. 57, 3349-3356

Morein et al. (1984), Nature 308, 457-460.

Murase, T., H. Ishida, M. Kiso and A. Hasegavva (1989), Carbohydr.

Res. 188, 71-80.

Nores et al. (1987), J. Immunol. 139, 3171-3176.

Oettgen, H.F., Ed. (1989). Gangliosides and Cancer. pub. VCH. Oldstone et al. (1988), J. Exp. Med. 168, 559-570.

Or, Y.S„ Clark, R.F. & Luly, J.R. (1991) J. Org. Chem. 56, 3146-3149. Ortmann et al. (1992), J. Immunol. 148, 1445-1450.

Otten et al. (1992), J. Immunol. 148, 3723-3732.

Portukalain etal. (1979), Eur. J. Biochem. 94, 19-.23.

Ray 6t al. 1992) J. Am. Chem. Soc. 114, 2256-2257 Renaud, P. and D. Seebach (1986), Helv. Chim. Acta 69, 1704-1710. Robertsson et al. (1982), Infect. Immun. 37, 737-748

Rotzschke et al. (1990), Nature 348, 252-254.

Rotzschke & Falk (1991), lmmunology Today 12, 447-455.

Sallberg et al. (1991), Immunol. Lett. 30, 59Stauss (1991), Current Biology 1, 328-330.

Thurin, Hackett, Otvos & Loibner, In Thurin: Abberant Glycosylation in Human Melanoma and Carcinoma (Doctorate in medical Science, University of Gothenburg, 1991, ISBN-91-628-0389-1).

Townsend et al. (1985), Celi 42, 457Tovvnsend et al. (1986), Celi 44, 959Tsomides & Eisen (1991) J. Biol. Chem. 266, 3357-3360.

Van Bleek & Nathenson (1990), Nature 348, 213-216.

Wiels et al. (1981) Proč. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6485Yang, C.C., Marlowe, C.K. & Kania, R. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113 3177-3178.

Zhou et al. (1992 a), J. Immunol. Methods 153, 193-200.

(Published in August 1992.)

Zhou et al. (1992 b), Eur. J. Immunol. 22, 3085-3090.

(Published in November 1992.)

SEZNAM SEKVENC (1) SPLOŠNE INFORMACIJE (i) PRIJAVITELJ (A) IME: AB ASTRA (B) ULICA: Kvambergagatan 16 (C) KRAJ: Sodertalje (E) DRŽAVA: Švedska (F) POŠTNI PREDAL (zip): S-151 85 (G) TELEFON: +46-8-55 32 60 00 (H) TELEFAX: +46-8-55 32 88 20 (I) TELEX: 19237 astra ab (ii) NAZIV IZUMA: Nove aktivne spojine (iii) ŠTEVILO SEKVENC: 27 (iv) RAČUNALNIŠKO ČITLJIVA OBLIKA:

(A) TIP PRIPOMOČKA: floppy disk (B) RAČUNALNIK: IBM PC kompatibilen (C) OPERATIVNI SISTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release #1.0,

VersicMi #1.25 (EPO) (vi) PODATKI O PRIJAVI PRIORITETE (A) ŠTEVILKA PRUAVE: SE 9201338-2 (B) DATUM VLOGE: 28. april 1992 (vi) PODATKI O PRIJAVI PRIORITETE (A) ŠTEVILKA PRUAVE: SE 9202553-5 (B) DATUM VLOGE: 7. september 1992 (vi) PODATKI O PRIJAVI PRIORITETE (A) ŠTEVILKA PRUAVE: SE 9203897-5 (B) DATUM VLOGE: 23. december 1992 (vi) PODATKI O PRUAVI PRIORITETE (A) ŠTEVILKA PRIJAVE: SE 9301141-9 (B) DATUM VLOGE: 6. april 1993 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 1:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 9 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met 1 5 (2) INFORMACUA ZA SEQ ID NO: 2:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 10 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile 1 5 10

2) INFORMACUA ZA SEQ ID NO: 3:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 9 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 4:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 18 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Lys Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Cys 15 10 15 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 5:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 13 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

Lys Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Cas 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 6:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 11 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

Lys Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met Cys 1 5 10 (2) INFORMACUA ZA SEQ ID NO: 7:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 10 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

Cys Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met 1 5 10 (2) INFORMACUA ZA SEQ ID NO: 8:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 11 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGUA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

Cys Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 9:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 12 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

Ser Gly Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: lo:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 15 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) IIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

Lys Gin ile Ala Ser asn Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Cys 15 10 15 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 11:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE: (A) DOLŽINA: 11 aminokislin (Β) ΊΊΡ: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Lys Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile Cys 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 12:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 13 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

Lys Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile His Cys 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 13:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 9 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

Cys Arg Gly Tyr Val Tyr Gin Gly Leu 1 5 (2) INFORMACIJA ΖΛ SEQ ID NO: 14:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 9 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

Cys Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu 1 5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 15:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 15 aminokislin (B) IIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gin Met Met 1 5 15 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 16:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 16 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGUA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

Cys Pro Thr Asn Gin Gin Val Val Leu Glu Gly Thr Asn Lys Thr Asp 15 10 15 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 17:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 12aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

Met Gin Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu Thr 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 18:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 12 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) ΊΊΡ MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 19:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 10 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGUA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

Asp Tyr Gly De Leu Gin De Asn Ser Arg 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 20:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 9 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGUA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:

Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu 1 5 (2) INFORMACUA ZA SEQ ID NO: 21:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 9 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGUA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (ix) POSEBNOST:

(A) IME/KLJUČ: modificiran položaj (B) POLOŽAJ: 6..7 (D) DRUGE INFORMACIJE: /oznaka= Xaa /opomba = homocistein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:

Ala Ser Asn Glu Asn Xaa Glu Thr Met 1 5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 22:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 9 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (ix) POSEBNOST:

(A) IME/KLJUČ: modificiran položaj (B) POLOŽAJ: 4..5 (D) DRUGE INFORMACIJE: /oznaka= Xaa /opomba = homocistein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:

Ala Ser Asn Xaa Asn Met Glu Thr Met 1 5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 23:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 10 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (ix) POSEBNOST:

(A) IME/KLJUČ: modificiran položaj (B) POLOŽAJ: 6..7 (D) DRUGE INFORMACIJE: /oznaka= Xaa /opomba = homocistein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:

Sef Gly Pro Ser Asn Xaa Pro Pro Glu Ile 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 24:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 10 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (ix) POSEBNOST:

(A) IME/KLJUČ: modificiran položaj (B) POLOŽAJ: 4..5 (D) DRUGE INFORMACIJE: /oznaka= Xaa /opomba = homocistein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:

Ser Gly Pro Xaa Asn Thr Pro Pro Glu Ile 1 5 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 25:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 8 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGUA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (ix) POSEBNOST:

(A) IME/KLJUČ: modificiran položaj (B) POLOŽAJ: 4..5 (D) DRUGE INFORMACIJE: /oznaka= Xaa /opomba = homocistein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:

Arg Gly Tyr Xaa Tyr Gin Gly Leu 1 5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 26:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 9 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (ix) POSEBNOST:

(A) IME/KUUČ: modificiran položaj (B) POLOŽAJ: 5..6 (D) DRUGE INFORMACIJE: /oznaka= Xaa /opomba = homocistein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:

Phe Ala Pro Gly Xaa Tyr Pro Ala Leu

5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 27:

(i) ZNAČILNOSTI SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 8 aminokislin (B) TIP: aminokislina (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: peptid (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 27:

Arg Gly Tyr Val Tyr Gin Gly Leu 1 5

Za

Aktiebolaget Astra:

OitiriJiO, F

LJUBU) At’A

Claims (28)

1. Konjugat peptid/ogljikov hidrat, sposoben povzročanja T celične imunosti proti ogljikohidratni strukturi, označen s tem, da vsebuje: (i) peptidno komponento, sposobno vezati molekulo MHC vrste I in (ii) ogljikohidratno komponento, ki ima imunogeno specifičnost omenjene ogljikohidratne strukture.

2. Konjugat po zahtevku 1, ki povzroča T celično imunost proti ogljikohidratni strukturi povezani s tumorji, označen s tem, da vsebuje: (i) peptidno komponento, sposobno vezave na molekule MHC vrste I in (ii) ogljikohidratno komponento, ki ima imunogeno specifičnost omenjene ogljikohidratne strukture, povezane s tumorji.

3. Konjugat po zahtevku 1, ki povzroča T celično imunost proti ogljikohidratni strukturi, ki se eksprimira na povzročiteljih infekcije in/ali inficiranih celicah gostiteljih, označen s tem, da vsebuje: (i) peptidno komponento, sposobno vezave na molekule MHC vrste I in (ii) ogljikohidratno komponento, ki ima imunogeno specifičnost omenjene ogljikohidratne strukture, ki se eksprimira na povzročiteljih infekcije in/ali inficiranih celicah.

4. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-3, označen s tem, da se peptidna komponenta sestoji iz 5-25 aminokislin.

5. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-4, označen s tem, da se peptidna komponenta sestoji iz 8-12 aminokislin.

6. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-5, označen s tem, da se peptidna komponenta sestoji iz 9 aminokislin.

7. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-6, označen s tem, da je v njemu peptidna komponenta sposobna vezave na molekule človeške MHC vrste I.

8. Konjugat po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, da ima peptidna komponenta na položaju 6 aminokisline V, I, L, ali T.

9. Konjugat po zahtevku 8, označen s tem, da ima peptidna komponenta na položaju 6 aminokislino V.

10. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-9, označen s tem, da ima peptidna komponenta na C-terminalnem položaju aminokisline V ali L.

11. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-10, označen s tem, da ima peptidna komponenta na C-terminalnem položaju aminokislino L.

12. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-11, označen s tem, da ima peptidna komponenta sekvenco GILGFVFTL (SEQ ID NO: 3 v seznamu sekvenc).

13. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-12, označen s tem, da je ogljikohidratna komponenta združena s peptidno komponento na takem položaju, da veže hipervariabilni del receptorja T celic.

14. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-13, označen s tem, da je velikost ogljikohidratne komponente taka, da omogoča receptorju T celic, da obkroži epitop omenjene ogljikohidratne strukture.

15. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-14, označen s tem, da je ogljikohidratna komponenta katerakoli od tistih, ki so definirane v tabeli 1 opisa patenta.

16. Farmacevtski sestavek, označen s tem, da vsebuje kot aktivno sestavino konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-15.

17. Konjugat po kateremkoli od zahtevkov 1-15, označen s tem, da se uporablja pri zdravljenju.

18. Uporaba konjugata, po kateremkoli od zahtevkov 1-15, v izdelovanju farmacevtskega sestavka za stimuliranje produkcije citotoksičnih T celic (CTL) v bolniku, kjer imajo omenjene CTL potencial za uničenje ali razredčenje celic, ki predstavijo značilno ogljikohidratno stukturo povezano z obolenjem.

19. Uporaba konjugata, po kateremkoli od zahtevkov 1-15, v izdelavi sestavka za produkcijo citotoksičnih T celic (CTL), ki imajo potencial za uničenje ali razredčenje celic povezanih z obolenjem, ki predstavijo značilno, z boleznijo povezano ogljikohidratno strukturo, s postopkom, ki obsega ustvaijanje stika celične populacije z omenjenim konjugatom, pri katerem omenjena celična populacija vključuje (a) celice, ki imajo molekule MHC vrste I, sposobne vezave na peptidno komponento omenjenega konjugata in (b) celice, sposobne pretvorbe v CTL, ki imajo omenjeni potencial za interakcijo s celicami (a), pri katerih je omenjeni konjugat vezan na molekulo MHC vrste I.

20. Uporaba po zahtevku 19, pri kateri omenjena celična populacija vse buje celice, ki so bile odstranjene ali izolirane iz živalskega telesa.

21. Uporaba po zahtevku 20, ki vključuje stopnjo vpeljave na tak način proizvedenih celic v telo živali, ki ima omenjene celice, povezane z boleznijo.

22. Uporaba konjugata, po kateremkoli od zahtevkov 1-15, za izdelavo farmacevtskega sestavka za indukcijo želenega imunološkega statusa pri bolniku, v katerem omenjeni imunološki status nastane v interakciji med omenjenim konjugatom in molekulo MHC vrste I, s čimer celično komponento imunološkega sistema stimuliramo na indukcijo odgovora specifično povezanega z omenjeno ogljikohidratno strukturo.

23. Uporaba konjugata, po kateremkoli od zahtevkov 1-15, v proizvodnji zdravila za zdravljenje malignih bolezni.

24. Uporaba po zahtevku 23, v proizvodnji zdravila za zdravljenje mela noma, raka dojk, raka pljuč ali gastrointestinalnega raka.

25. Uporaba konjugata, po kateremkoli od zahtevkov 1-15, v proizvodnji zdravila za zdravljenje nalezljivih bolezni.

26. Uporaba po zahtevku 25, v proizvodnji zdravila za zdravljenje nalezljivih bolezni, Id jih povzročijo paraziti.

27. Uporaba po zahtevku 25, v proizvodnji zdravila za zdravljenje nalezljivih bolezni, ki jih povzročijo intracelični patogeni.

28. Postopek proizvodnje konjugata peptid/ogljikov hidrat, po kateremkoli od zahtevkov 1 do 15, označen s tem, da vsebuje eno ali več od naslednjih stopenj:

(a) sintezo peptidne komponente konjugata s znanimi tehnikami peptidne sinteze, (b) sintezo ogljikohidratne komponente konjugata s znanimi tehnikami sinteze ogljikovih hidratov, (c) zaščito ene ali več -COOH, -OH, -NH2 ali -SH skupin peptidne komponente, preden peptidno komponento kovalentno vežemo na ogljikohidratno komponento, (d) zaščito ene ali več -OH, -COOH, -NH2, -CHO ali =CO skupin ogljikohidratne komponente, preden ogljkohidratno koponento kovalentno vežemo na peptidno komponento, (e) aktiviranje nezaščitene -OH, -COOH, -NH2, -CHO ali =CO skupine ogljikohidratne komponente, (f) aktiviranje nezaščitene -OH, -COOH, -NH2 ali -SH skupine peptidne komponente, (g) pretvorbo najmanj ene od ogljikohidratnih komponent in peptidne komponente z bifunkcionalnim povezujočim reagentom, (h) pretvorbo ogljikohidratne komponente in peptidne komponente kovalentno, tako da tvorijo želene konjugate, omenjene komponente so pri tem primemo zaščitene, aktivirane in/ali pretvorjene z bifunkcionalnim povezujočim reagentopm, (i) izpostavljanje vmesno zaščitenega konjugata peptid/ogljikov hidrat postopku odščite.