PT675733E - Conjugados peptido-carbohidrato que geram imunidade de celulas t - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"CONJUGADOS PÉPTIDO-CAKBOHIDRATO QUE GERAM IMUNIDADE DE CÉLULAS T"

CAMPO TÉCNICO t A presente invenção refere-se a uma nova classe de compostos biologicamente activos, a processos para a sua produção e sua utilização em terapia. Mais particularmente a invenção proporciona conjugados imunogénicos úteis para gerar imunidade de células T contra estruturas de carbohidratos associados a tumores ou contra estruturas de carbohidrato expressas em agentes infecciosos e/ou células hospedeiro infectadas.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Imunidade Mediada por Células 0 sistema imunitário dos vertebrados está constantemente activo contra micróbios invasores e células malignas. É bem conhecido que o sistema imunitário adaptativo apresenta uma resposta muito mais forte ao segundo encontro com um antigénio do que ao primeiro. Este facto é explorado na vacinação, que funciona induzindo um estado de imunidade duradoura conhecido como memória imunológica. A memória imunológica requer a activação dos linfócitos T, específica para o agente infeccioso. Os linfócitos T detectam a infecção nas células pelo reconhecimento - através do receptor da célula T (TCR) - de fragmentos de péptidos derivados do patogénio. No entanto, a maior parte dos linfócitos T são "restritos a MHC", isto é, reconhecem apenas complexos de péptidos ligados a proteínas de membrana altamente polimórficas, codificadas por genes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e classe II, e presentes na superfície de uma célula acessória (designada como célula 1 I— apresentadora de antigénio ou APC), na qual o antigénio foi processado.

Os linfócitos T podem ser classificados como CD4+ ou CD8+, dependendo da especificidade de uma molécula receptora de aderência. 0 receptor de aderência CD4 reconhece moléculas MHC classe II, enquanto CD8 liga classe I. Adicionalmente, a restrição a MHC é ainda dependente da ligação directa da molécula MHC a certas partes do TCR (Jorgensen et al.r 1992).

As células T CD4+ (células T Auxiliares) activam macrófagos e células B produtoras de anticorpos, enquanto células T CD8+ (células citotóxicas, CTL) matam células infectadas por virus e bactérias intracelulares. Os antigénios podem ser processados por uma de duas vias, dependendo da sua origem. Na primeira via, material estranho do exterior da célula é rodeado por uma célula apresentadora de antigénio especializada (frequentemente um macrófago ou célula B) , que cliva o material e liga o antigénio processado a moléculas MHC classe II. Os complexos são transportados para a superfície celular e apresentados às células T auxiliares. A segunda via está geralmente relacionada com processamento de proteínas no interior de células infectadas com vírus ou malignas. Estas proteínas são processadas nas células, isto é, são sujeitas a proteólise parcial de modo a formar fragmentos peptídicos. Estes fragmentos então associam-se com moléculas MHC classe I e são transportados para a superfície da célula para apresentação às células T citotóxicas. 0 processamento de antigénios por vias separadas faz biologicamente sentido. A33im antigénio3 trazidos dos arredores eventualmente estimulam as células B a produzir anticorpos que serão capazes de proteger o organismo contra um subsequente ataque do antigénio exógeno. Por outro lado, no caso de antigénios na forma de estruturas anormais feitas numa célula anormal ou errante (por exemplo, um vírus infectado ou célula 2 í~ -fr y maligna), é vantajoso para o sistema imunitário ser activado com um resultado que leva eventualmente à morte da célula errante.

Péptidos que se ligam a MHC

Nos anos mais recentes tem havido progresso considerável na análise de péptidos ligados a moléculas MHC classe I e II (Para revisão ver por exemplo, Janeway, 1991; Rõtzschke & Falk, 1991; Stauss, 1991; Tsomides & Eisen, 1991). Assim verificou-se que moléculas MHC classe I se ligam a péptidos curtos de apenas 8-12 aminoácidos e que moléculas MHC classe II se ligam a péptidos de cerca de 10-17 aminoácidos.

Além disso, foi verificado que os fragmentos peptidicos resultantes do processamento de antigénios são transportados para a superfície da célula ligados a um sulco na parte extracelular da molécula de MHC. Para as moléculas MHC classe I foi verificado que cadeias laterais individuais de aminoácidos, localizadas em posições precisas ao longo do péptido, se ligam no sulco de ligação ao péptido (Madden et ai., 1991). A posição destas bolsas e os aminoácidos que as alinham podem ser diferentes para diferentes variantes alélicas. Consequentemente, diferentes moléculas MHC classe I podem ligar diferentes conjuntos de péptidos e podem ser encontrados vários motivos específicos dos alelos para vários alelos MHC (Van Bleek & Nathenson, 1990; Falk et al.r 1991; Jardetzky et ai., 1991). Por exemplo, péptidos que ligam HLA-A2.1 possuem preferencialmente L ou M na posição 2 e V ou L na posição 9, isto é, na posição do terminal C (Rõtzschke & Falk, 1991).

Exemplos de péptidos capazes de se ligarem a moléculas MHC classe I no sistema de murina são ASNENMETM eSGPSN T P P E I, (SEQ ID NOS: 1 e 2), que são ambos apresentados por moléculas H-2-Db. Um exemplo de um péptido capaz de ligar uma molécula MHC de classe I no sistema humano éGILGFVFTL, 3 \ 1)

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(SEQ ID N0:3), que é apresentado por moléculas HLA-A2.1 (Falk et al., 1991) . A conjugação de um péptido que se liga a MHC (classe II), D Y G I L Q I N S R, (SEQ ID N0:19), a um carbohidrato, 4-0-a-D-galacLupiranosil-p-D-galactopiranose, é descrita em Elofsson et al., (1991). LASZLO OTVOS ET AL.: TETRAHEDRON LETTERS, Volume 31, n° 41, 1990, páginas 5889-5892: "Automated solid-phase synthesis of glycopeptides. Incorporation of unprotected mono- and disaccharide units of N-glicoprotein antennae into cell epitopic peptides" proporciona um método para a síntese em fase sólida automatizada de N-glicopéptidos que contêm os primeiros dois açúcares encontrados como uma estrutura início comum em N-glicoproteínas. No entanto, não são apresentadas ou discutidas experiências funcionais em termos de imunogenicidade das N-glicoproteínas sintetizadas. WO 89/07448 revela composições para modular a resposta imunitária de um hospedeiro, empregando péptidos possuindo péptidos com homologia com péptidos que se ligam a moléculas MHC classe I.

Péptidos sintéticos como veículos para os epitopos específicos de células T

As CTL:s podem ser obtidas de baços de murganhos pintados com trinitroclorobenzeno (TNP), e seleccionadas para matarem as células alvo singénicas revestidas com TNP. Algumas CTL:s obtidas deste modo mostraram reconhecer péptidos curtos que se ligam a moléculas MHC classe I (Kb) de 10 aminoácidos, com o TNP ligado a um resíduo de lisina interno (posição 6) . Além disso, algumas CTL:s matam células alvo singénicas que processaram e apresentaram TNP ligado a diferentes proteínas veículo (MSA, BSA 4 t e KLH) e também células alvo alogénicas revestidas com TNP (Ortmann et al., 1992).

Antigénios associados a tumores A possibilidade de que os tumores podem ser reconhecidos como estranhos pelo sistema imunitário (com base no carácter anormal das células tumorais) ofereceria uma oportunidade valiosa para o desenvolvimento efectivo de terapias do cancro. Em sistemas experimentais, tumores mostraram ser altamente imunogénicos e as respostas imunitárias desencadeadas foram suficientes para eliminar as células tumorais’. Na situação clinica, no entanto, um tumor, sendo um produto de múltiplas alterações de genética e adaptativas, possui pouca imunogenicidade na altura em que se torna um problema médico. Do mesmo modo, foram encontrados poucos antigénios proteicos verdadeiramente associados a tumores, isto é, antigénios sendo expressos apenas em células tumorais.

Em contraste com a ausência de tumores associados a antigénios proteicos, uma variedade de estruturas carbohidrato aberrantes (CHO) estão presentes em células tumorais (para uma revisão ver Hakomori, 1991). Estas são formadas como consequências de anormalidades nos sistemas enzimáticos responsáveis pela montagem das cadeias CHO. As cadeias são frequentemente truncadas com o resultado de que epitopos CHO (que estão ausentes ou mascarados nas células normais) são expressos nas células tumorais.

As estruturas CHO aberrantes em células tumorais podem existir na forma de glicoproteina, glicolipido ou um complexo de ambao estas duas formas. As glicoproteinas são frequentemente excretadas nos fluidos biológicos enquanto os glicolipidos estão em grande parte ligados à membrana. 5

Exemplos de antigénios carbohidratos associados a tumores são o gangliósido GM3, que foi identificado nas células B16 de melanoma de rato (Nores et al., 1987), gangliósido GD3 associado com células de melanoma humano (Portoukalian et al., 1979) e gangliósido Gb3 que é expresso em células de linfoma de Burkitt (Wiels et al., 1901; Brodin et al., 1988).

Carbohidratos associados com doenças infecciosas

Carbohidratos associados com doenças infecciosas podem ser expressos em agentes infecciosos, em material destes secretado ou perdido, ou na superfície de células hospedeiras infectadas.

Existem alguns exemplos de respostas de células T especificas para carbohidratos, verificados ou putativos, associadas com doenças causadas por agentes infecciosos como Salmonella typhimurium (Robertsson et al., 1982), Leishmania major (Moll et al., 1989), Candida albicans (Domer et al., 1989) e Mycobacteria (Crowle et al., 1988).

Antigénios carbohidrato associados com infecção de HIV são descritos em Hansen et al. (1990).

Imunoterapia contra tumores A imunoterapia contra tumores possui uma longa história médica e foi tentada por meios específicos e não específicos. Em manipulações não específicas, o sistema imunitário foi activado por vários factores tais como BCG, IL-2, etc. de modo a aumentar a imunidade já existente contra o tumor. Em manipulações específicas, as vacinas foram construídas utilizando células tumorais ou material derivado destas.

As respostas imunitárias mediadas por células T desempenham papeis cruciais na imunidade anti-tumor. Enquanto os mecanismos de activação das respostas das células T contra proteínas estão 6 t d- U κ caracterizadas até certo ponto (ver acima), são essencialmente desconhecidas para carbohidratos. Os antigénios carbohidrato são candidatos pobres para apresentação a moléculas MHC, devido às restrições estruturais impostas pelo sulco de ligação de péptidos nas proteínas MHC. No entanto, Ishioka et al., (1992) mostrou que a parte CIIO pode ser uma parte importante do determinante antigénico reconhecido pelas células T, e sugeriu que apesar de existirem limitações à geração de respostas de células T específicas para carbohidratos, tais respostas podem ser geradas por colocação judiciosa do carbohidrato num péptido que se liga a MHC.

Longenecker e colaboradores (WO 88/00053; Henningson et al., 1987) descrevem a utilização de "Glicoconjugados Sintéticos Associados a Tumores" (S-TAGs) para estimulação de imunidade de células T anti-cancro. Nestas experiências, antigénios sintéticos Thomsen-Friedenreich (TF) e Tn, carbohidratos expressos na maior parte dos adenocarcinomas humanos, foram conjugados com uma proteína transportadora e utilizados para demonstrar que células efectoras de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) podem reconhecer e responder aos determinantes carbohidrato. Um S-TAG composto de um antigénio TF acoplado a um transportador (hemocianina de lapa) e emulsificado em adjuvante de Ribi foi administrado a murganhos com adenocarcinoma TA3-Ha. Quando a administração foi precedida por tratamento com ciclofosfamida, foi observada uma sobrevivência de longo termo dos hospedeiros de 50-90% (Fung et al., 1990).

Thurin et al. (1990) descreve um conjugado compreendendo (i) um hapteno carbohidrato associado a tumor; (ii) um péptido contendo um epitopo virai de células auxiliares T de ratinho; (iii) um adjuvante baseado no glicósido Quil-A. Murganhos imunizados com o conjugado apresentaram respostas IgM específicas para o 7 hapteno conjuntamente com uma reactividade de células T auxiliares contra o epitopo virai.

OBJECTIVO DA INVENÇÃO

Um objectivo principal da invenção é proporcionar um meio para gerar imunidade de células T contra uma estrutura de carbohidrato, em particular imunidade antitumoral contra antigénios carbohidrato.

Apesar de técnicas anteriores sugerirem que a imunidade antitumoral contra antigénios carbohidrato pode ser criada com uma vacina sintética, na prática o alcançar deste objecto permaneceu ilusivo. Por exemplo S-TAGs de Longernecker (descritas na secção acima) utilizam a proteina convencional como transportadora da estrutura de carbohidrato. Tal glicoproteina tem de ser clivada proteoliticamente antes de ser apresentada à superfície da célula, o que significa que não existe controlo sobre o que é de facto apresentado às TCR. Adicionalmente, uma grande proteina transportadora contém vários epitopos diferentes, competindo para as células T.

Além disso, apesar de maior investigação, esforços de técnicas anteriores para desenvolver terapias imunológicas para o cancro tiveram resultados desanimadores. Também, procedimentos de técnicas anteriores para estimular respostas imunológicas contra antigénios associados a carbohidrato tiveram sucesso limitado, especialmente em casos em que se deseja estimular uma resposta imunitária contra uma estrutura de carbohidrato associada a doença, por exemplo uma expressa em células tumorais, mas não em células normais. A presente invenção ultrapassa as técnicas anteriores proporcionando uma nova classe de conjugados compreendendo péptidos que se ligam a MHC classe I, conjuntamente com uma 8 estrutura de carbohidrato que pode ser utilizada, inter alia, no desenvolvimento de vacinas sintéticas para estimular imunidade anti-tumoral. Para além disso, os conjugados de acordo com a invenção são capazes de gerar respostas de células T citotóxicas, em vez de células T auxiliares, contra tais estruturas carbohidrato. Adicionalmente, os conjugados de acordo com a invenção permitem um elevado grau de controlo (1) sobre a identidade do epitopo apresentado e (2) sobre quais os clones de células T a expandir.

Um outro objectivo da presente invenção é permitir a produção de células T especificas para carbohidratos, isto é, células T citotóxicas originadas pela utilização de péptidos que se ligam a MHC classe I. As células T especificas para carbohidrato originadas de acordo com a invenção não necessitam de ser restringidas a MHC. Do mesmo modo, as células originadas num indivíduo podem reagir com células de outro indivíduo, da mesma ou mesmo de outra espécie. A geração de células T específicas para carbohidrato de acordo com a invenção, é assim bastante diferente de experiências de técnicas anteriores em que a resposta de células T auxiliares é dirigida contra um epitopo peptídico, em que haptenos estão conjugados com proteínas transportadoras de modo a obter resposta de anticorpos contra o hapteno ou em que Thurin et al. estenderam este conceito à utilização de péptidos definidos que se ligam a MHC classe II.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO

Como indicado, o propósito da invenção foi conseguido por conjugação de um péptido adequado capaz de se ligar a uma molécula MHC classe I com uma estrutura adequada de carbohidrato. Conjugando o carbohidrato com o péptido numa posição óptima, o antigénio carbohidrato pode ter uma alta 9 afinidade para TCR, o que pode tornar a resposta independente de receptores de aderência, isto é, a célula T não será restrita para MHC. Isto criará respostas especificas para CHO de ambas as células T, citotóxicas assim como as auxiliares.

Campo de utilização

Os conjugados de acordo com a invenção podem ser utilizados no tratamento de doenças malignas, incluindo melanoma, cancro da mama, cancro do pulmão e cancro gastrointestinal. Eles podem assim ser utilizados para tratar doenças por agentes infecciosos que causem a expressão da molécula carbohidrato alvo.

Os conjugados da invenção podem ser utilizados para induzir respostas de células T in vivo de modo a eliminar tumores e/ou infecções. Estes podem ser utilizados também para induzir respostas de células T in vitro, utilizando um procedimento de estimulação extra-corporal para re-infusão posterior de células T activadas nos doentes.

Dependendo do tipo de resposta imunitária conseguida, os conjugados podem ser administrados uma vez ou, se necessário, por imunizações continuas, regulares.

DECLARAÇÕES DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da invenção são proporcionados conjugados capazes de gerarem imunidade de células T contra uma estrutura de carbohidrato, compreendendo o referido conjugado (i) um componente péptido capaz de se ligar a uma molécula MHC classe I; e (ii) um componente carbohidrato possuindo a copccificidadc imunogcnica da referida eatrutura de carbohidrato.

Num segundo aspecto, a invenção proporciona uma formulação farmacêutica contendo tal conjugado como ingrediente activo. A invenção proporciona também os referidos conjugados para utilização em terapia. A invenção proporciona ainda a utilização dos referidos conjugados no fabrico de uma composição farmacêutica para estimular a produção de células T citotóxicas (CTLs) num doente, em que as referidas CTLs possuem o potencial para destruir ou atenuar as células que apresentam uma estrutura de carbohidrato associada a doença característica.

Também fornecido de acordo com a invenção é um método de produzir células T citotóxicas (CTLs) que têm o potencial para destruir ou atenuar células associadas a doença que apresentem uma estrutura de carbohidrato associada a doença característica, que compreende contactar uma população de células que foi removida ou isolada de um corpo animal com um conjugado como aqui definido, em que a referida população de células inclui (a) células possuindo moléculas MHC classe I capazes de se ligar ao componente péptido do referido conjugado e (b) células capazes de serem convertidas em CTLs possuindo o referido potencial de interacção com células (a) possuindo o referido conjugado ligado a uma molécula MHC classe I.

Assim, as CTLs podem ser produzidas in vitro por contacto com células que foram removidas do corpo do animal com o conjugado péptido/carbohidrato. As CTLs assim produzidas podem ser administradas (por exemplo, por introdução no mesmo animal ou num diferente) como parte de um regime terapêutico. A invenção proporciona ainda a utilização dos conjugados péptido/carbohidrato aqui descritos para o fabrico de composições farmacêuticas.

Mais especificamente, é fornecida a utilização dos conjugados para o fabrico de uma composição farmacêutica para indução de um 11

t estado imunológico desejado num doente, em que o referido estado imunológico resulta de uma interacção entre o referido conjugado e uma molécula de MHC classe I pela qual um componente celular do sistema imunitário é estimulado para induzir uma resposta especificamente associada com a referida estrutura de carbohidrato.

Também é proporcionada a utilização dos referidos conjugados no fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças malignas incluindo melanoma, cancro da mama, cancro do pulmão, e cancro gastrointestinal; doenças infecciosas, incluindo as causadas por agentes parasitas e as causadas por patogénios intracelulares.

Preferencialmente, o componente péptido e o componente carbohidrato e os carbohidratos de acordo com a invenção possuem as caracteristicas apresentadas nos seguintes parágrafos. 0 componente péptido

Uma importante caracteristica dos conjugados péptido/carbohidrato da invenção é que o componente péptido destes deve ser capaz de se ligar a uma molécula MHC classe I.

Para um dado péptido, a capacidade de se ligar a uma molécula MHC classe I pode ser determinada de várias formas. Assim, por exemplo, o péptido pode ter certas caracteristicas estruturais seleccionadas tais como o tamanho ou presença de resíduos de aminoácido particulares em posições específicas.

Alternativamente ou adicionalmente, a capacidade de um polipéptido candidato se ligar a uma molécula MHC classe I pode ser avaliada empiricamente efectuando um ou mais ensaios imunológicos. Como uma outra alternativa, o componente péptido dos conjugados péptido/carbohidrato da invenção podem ter uma sequência ou motivo que é substancialmente idêntico à sequência de um péptido que tenha sido isolado por dissociação de um complexo que ocorre naturalmente entre um péptido e uma molécula MHC classe I. Cada um destes indicadores da capacidade de um 12 I será descrito péptido se ligar a uma molécula MHC classe abaixo em mais detalhe. É feita referência a três artigos (Fremont et ai., 1992; Matsamura et ai., 1992 e Lantron et ai.) que apareceram em Science, Col. 257, 14 de Agosto de 1992.

Estes artigos descrevem as caracteristicas dos motivos do péptido que são capazes de se ligar a moléculas MHC classe I com particular referência à molécula MHC classe I de murina H-2Kb e à molécula MHC classe I humana HLA-A2 (estando a última presente em aproximadamente 40% na população humana).

Uma caracteristica das moléculas MHC classe I que está associada com a sua capacidade de se ligar a uma gama de péptidos caracteristicamente reconhecidos é a presença de um péptido que se liga ao sulco que define uma série de geralmente seis "bolsas" que acomodam ou ancoram elementos estruturais dos péptidos que são capazes de serem ligados. 0 sulco de ligação dos péptidos ou fenda é limitada lateralmente por duas hélices α enquanto a base é definida por uma folha β pregueada.

Das seis bolsas (normalmente designadas A, B, C, D, E e F), geralmente duas estão arranjadas para acomodar os terminais -NH2 e -C00H do péptido, respectivamente. 0 componente péptido do conjugado é preferencialmente escolhido de péptidos possuindo o número óptimo de aminoácidos para ligar moléculas MHC classe I, isto é, 5-25 aminoácidos, especialmente 8-12 aminoácido3, sendo o tamanho seleccionado para permitir a ligação adequada no sulco de ligação do péptido. O tamanho óptimo do péptido para favorecer a ligação eficiente no sulco da molécula MHC classe I é 8 ou 9 aminoácidos, sendo especialmente preferido 9 aminoácidos. Γ u

Mais preferencialmente, o componente péptido dos conjugados da invenção possui um aminoácido hidrofóbico na posição C terminal para facilitar a ligação à bolsa F. Outros aminoácidos do componente péptido são preferencialmente seleccionados de modo a encaixar nas outras bolsas na fenda de ligação do péptido. A selecção de resíduos de aminoácido adequados e preferidos pode ser ajudada por técnicas de modelação molecular por computador como descrito por exemplo por Masazumi (1992). 0 péptido pode ser sintetizado por métodos conhecidos. A imunogenicidade da parte péptido do conjugado pode ainda ser aumentada por modificações químicas. Conjugados compreendendo tais péptidos modificados são parte da invenção.

Os péptidos a ser sintetizados podem ser escolhidos a partir da literatura ou a partir daqueles cuja imunogenicidade é determinada por métodos conhecidos. No último caso, os péptidos podem ser isolados a partir de lisados de células inteiras ou a partir de moléculas MHC purificadas e separadas por, por exemplo, cromatografia líquida de elevado desempenho. A ligação óptima do péptido à molécula MHC é reflectida como estabilidade elevada do complexo péptido-MHC na superfície de células apresentadoras de antigénio. A invenção proporciona ainda um processo para produzir um conjugado péptido/carbohidrato como definido acima que compreende um ou mais dos seguintes passos de procedimento: (a) sintetizar o componente péptido do conjugado por uma técnica conhecida de síntese de péptidos. (b) sintetizar o componente carbohidrato do conjugado por uma técnica conhecida de síntese de carbohidratos, (c) proteger um ou mais grupos -COOH, -OH, -NH2 ou -SH do componente péptido antes de acoplar o componente péptido covalentemente ao componente carbohidrato, 14 (d) proteger um ou mais grupos -OH, -COOH, -NH2 ou -CHO ou =C0 do componente carbohidrato antes de acoplar o componente carbohidrato covalentemente ao componente péptido, (e) activar um grupo não protegido -OH, -COOH, -NH2, -CHO, ou =CO do componente carbohidrato, (f) activação de um grupo não protegido -OH, -COOH, -NH2, ou -SH do componente péptido, (g) reacção de pelo menos um dos componentes carbohidrato e componente péptido com um reagente de ligação bifuncional, (h) reacção do componente carbohidrato e do componente péptido covalentemente de modo a formar o conjugado desejado, sendo os referidos componentes adequadamente protegidos, activados e/ou reagidos com um reagente de ligação bifuncional, (i) sujeitar um intermediário protegido conjugado péptido/ carbohidrato a um procedimento de desprotecção.

No presente contexto, um péptido "capaz de se ligar a uma molécula MHC classe I", pode consequentemente ser ainda definido como um péptido cujo complexo com uma molécula MHC classe I será estável na superfície de células apresentadoras de antigénio. A estabilidade do complexo acima mencionado pode ser medido por ensaios in vitro familiares para um especialista na técnica. Pode ser medido como expressão alongo termo na superfície da célula, devido a uma lenta decomposição do complexo. Outra característica que reflecte a alta estabilidade é a sensibilização das células alvo para correspondentes CTL3 a concentração muito baixa do péptido. A estabilidade pode também ser reflectida como a capacidade dos péptidos para regular também a expressão da correspondente molécula classe I em certas células alvo in vitro a concentrações de baixa molaridade. 15

U A estabilidade está também relacionada com a alta imunogenicidade in vivo, quando péptidos curtos são directamente injectados em murganhos. A capacidade de um glicopéptido estar ligado a uma molécula MHC classe I pode ser avaliada efectuando ensaios imunológicos concebidos para detectar uma ou mais das seguintes caracteristicas (1) ligação do glicopéptido a MHC-I solúvel levando à formação de complexos que podem, por exemplo, ser detectados por anticorpos monoclonais dependentes da configuração, ou por associação com p2-microglobulina marcada, utilizando técnicas bioquímicas convencionais; (2) expressão da parte CHO depois dos glicopéptidos se terem ligado a moléculas MHC-I na superfície de células hospedeiras mutantes (tais como células RMA_S ou T2). A parte CHO pode então ser detectada por anticorpos monoclonais específicos para CHO tais como MC2102 (específicos para Gal2) . (3) regulação do elemento de restrição de MHC-I correspondente por glicopéptidos, utilizando anticorpos monoclonais específicos para MHC-I. (4) capacidade de reciclagem dos glicopéptidos (ver secção 3 abaixo -"PÉPTIDOS EXTERNOS QUE SE LIGAM A MHC-I SÃO RECICLADOS PARA A SUPERFÍCIE CELULAR APÓS INTERNALIZAÇÃO")

De modo a efectuar estes ensaios podem ser utilizados anticorpos monoclonais disponíveis que são capazes de detectar moléculas MHC de classe I assim como anticorpos que são capazes de detectar carbohidratos específicos. Um exemplo particular dos últimos é o anticorpo monoclonal comercialmente disponível MC2102 (New Biocarb. Lund, Suécia) que é capaz de detectar o carbohidrato Gal2. 16

Estes procedimentos podem ser utilizados para avaliar a capacidade um dado péptido ser ligado a moléculas MHC classe I da seguinte forma.

Primeiro é sintetizado um glicopéptido no qual Gal2 está covalentemente ligado a um péptido. O glicopéptido pode então ser testado quanto à sua capacidade para se ligar a moléculas MHC classe I em células alvo apresentadoras de antigénio, e para a parte carbohidrato ser expressa, isto é, ligada numa configuração na qual o epitopo Gal2 está localizado numa posição na qual pode ser detectado por um anticorpo especifico. Adicionalmente, a regulação do elemento de restrição da molécula MHC-I pode ser avaliada determinando a capacidade das células apresentadoras de antigénio interagirem com anticorpos anti-MHC classe I. A capacidade do conjugado ser reciclado pode ser avaliada por incubação das células (com o conjugado ligado) a 37°C durante o qual o glicopéptido se internaliza. A temperatura pode então ser diminuída e as células tratadas com uma enzima proteolítica (por exemplo, Pronase) para retirar o conjugado péptido/carbohidrato exposto. No reaquecimento, o conjugado reciclado pode ser detectado por pesquisa do epitopo Gal2 utilizando o anticorpo anti-Gal2.

Num teste adicional, o conjugado pode ser testado em experiências de imunização e avaliadas quanto à sua capacidade de estimular a formação de CTLs. Em experiências de controlo as CTLs originadas podem ser testadas contra o componente péptido (sem o componente carbohidrato) para demonstrar que a estimulação de CTL observada está associada com o carbohidrato (ver '"'Sistema de Teste Experimental1' abaixo). 17 r — L-li ^ 0 componente carbohidrato A parte carbohidrato do conjugado pode ser sintetizada por métodos conhecidos e é preferencialmente escolhida a partir das estruturas carbohidrato que: (a) são expressas de forma estável na célula alvo de modo que a mesma parte está sempre exposta para fora do receptor da célula T; (b) possuem uma elevada densidade na célula alvo de modo que o receptor da célula T pode ser activado independentemente da restrição MHC e receptores de aderência; e (c) possui uma elevada associação à membrana de modo que a secreção na circulação geral é evitada. Os carbohidratos solúveis são, em contraste, capazes de criar problemas devido à indução de células T supressoras periféricas e de bloquear o desencadear da imunidade protectora.

Uma vantagem adicional da escolha de um carbohidrato de elevada expressão em células alvo é que tal expressão elevada leva a modificações secundárias na membrana que aumenta a especificidade da célula alvo para os epitopos CHO expostos. 0 carbohidrato deve ser dimensionado para permitir ao receptor da célula T incluir um epitopo CHO. Um tamanho preferido, a que no entanto a invenção não está restrita, é metade do tamanho do péptido.

Embora não estejam excluídas partes de açúcar simples, preferencialmente o componente carbohidrato dos conjugados da invenção incluirá pelo menos duas partes de açúcar ligadas, isto é, será um dissacárido ou oligossacárido. O número exacto estará dependente da especificidade imunogénica da estrutura carbohidrato, mas 3, 4, 5 ou mais partes de açúcar ligadas podem estar presentes.

Preferencialmente, o limite superior no tamanho do componente carbohidrato será ditado pelo requisito de que deve ser dimensionado para permitir a um receptor de célula T incluir 18 L-C, }==^=>- simultaneamente um epitopo da estrutura carbohidrato e também o elemento de restrição de Classe 1. Os limites superiores típicos são não mais do que 10 partes de açúcar, preferencialmente não mais do que 8 e mais preferencialmente não mais do que 5. Os intervalos preferidos são assim de 1 a 10, mais preferencialmente de 1 a 8 c mais ainda preferencialmente de 1 a 5 partes de açúcar. Para cada um destes intervalos, o limite inferior de 1 pode ser aumentado para 2, 3, 4 ou 5, se desejado.

As partes individuais de açúcar são preferencialmente seleccionadas de aldopentoses, cetopentoses, aldohexoses e cetohexoses. Estas podem estar na forma linear ou cíclica e se desejado, derivados por oxidação, redução, aminação, acetilação ou qualquer combinação destas. A oxidação pode incluir a conversão de um ou mais grupos -CH2OH a grupos -CHO ou COOH, assim como a conversão de um grupo -CHOH num grupo -CH2-. A redução pode incluir qualquer uma das conversões reversas. As aldopentoses incluem D-ribose, D-arabinose, D-xilose e D-lixose, assim como outros estereoisómeros destes, isto é, os isómeros L. as aldohexoses incluem D-alose, D-altrose, D-glucose, D-manose, D-gulose, D-idose, G-galactose e D-talose, assim como outros estereoisómeros destes, isto é, os isómeros L. As cetohexoses incluem D-psicose, D-frutose, D-sorbose e D-tagatose, assim como outros estereoisómeros destes, isto é, os isómeros L. Quando cíclicas, as partes de açúcar podem estar na configuração a- ou β- e (se apropriado) nas formas de piranose ou furanose.

Mais preferencialmente o componente carbohidrato contém uma ou mais partes de açúcar seleccionadas das normalmente encontradas nas porções carbohidrato de glicolípidos e glicoproteínas. Estas incluem β-L-fucose (Fuc), β-D-galactose (Gal), β-ϋ-Ν-acetilgalactosamina (Gal NAC), β-D-N-acetilglucosamina (Glc NAC) , β-D-manose (Man), ácido neuramínico (Neu) e ácido siálico (Sia). 19 Γ L-Cj }=^=· t

Os componentes carbohidrato correspondentes às porções CHO das séries de glicolípidos globo/gânglio são exemplos adicionais de alvos adequados para tumores (ver Oettgen, 1989; Chapter 6 "General Concept of Tumor-associated Antigens: Their Chemical, Physical and Enzymatic Basic"). O modo de ligar partes de açúcar adjacentes não é crítico, isto é, as ligações podem ser efectuadas utilizando qualquer dos átomos de carbono 1 a 5 das pentoses e qualquer dos átomos de carbono 1 a 6 das hexoses. Adicionalmente as ligações podem ser α ou β. Mais preferencialmente as ligações envolvem os átomos de carbono 3 e 4 com a configuração β sendo preferida. 0 componente carbohidrato e o componente péptido podem ser conjugados (ou ligados covalentemente um com o outro) por qualquer meio conveniente. Quando o péptido inclui um aminoácido contendo um grupo hidroxilo (isto é, como na serina, treonina ou tirosina) a ligação pode ser através de uma ligação O-glicósido. Quando o componente péptido inclui um aminoácido contendo uma cadeia lateral -NH2 (como na asparagina) a ligação pode ser através de uma ligação N-glicósido.

Alternativamente a ligação pode envolver a introdução de um denominado "braço espaçador" entre o componente carbohidrato e o componente péptido. Assim, por exemplo, onde o componente péptido inclui um aminoácido (cisteína) possuindo uma cadeia lateral -SH, o componente carbohidrato pode ser ligado à cadeia lateral -SH através de uma ligação - (CnH2n)-0- em que n é >2, preferencialmente 2 a 4. A localização do componente carbohidrato no conjugado péptido/carbohidrato é preferencialmente escolhida de modo a que quando ligado a uma molécula MHC classe I, o componente carbohidrato ocupa uma localização geralmente central na fenda de ligação do péptido, com pelo menos parte do componente carbohidrato a sobressair da fenda de uma forma que permita ser apresentado a uma CTL. 20 í- U, ^

Exemplos de Carbohidratos adequados para conjugação Exemplos de estruturas carbohidrato, associadas com tumores ou doenças infecciosas, e adequadas para conjugação são dadas na Tabela 1. Os tumores indicados exemplificam tipos de cancro susceptíveis ao tratamento com os conjugados da presente invenção. Para o propósito desta descrição, o termo "estruturas carbohidrato1' deve ser entendido como compreendendo derivados dos carbohidratos exemplificados, como por exemplo lactonas e lactamas. 21

L-Cj TABELA 1 1. CARBOHIPRATOS ASSOCIADOS COM TUMORES HUMANOS; 1.1 Á maior parte dos tumores: Gaip4GlcPCer 1.2 Melanoma; NeuAcoc8NeuAca3Gaip4GlcPCer 9-0-AC-GD3 NeuAca8NeuAca3 (GalNAcp4) Gaip4GlcpCer 9-0-AC-GD2 Formas lactonizadas destes 1.3 Cancro do cólon e outros tipos de

Lactosilceramida GD3 GD2 cancro:

Antigénio Tn Antigénio Tn-sialilo Cadeia tipo 1 Lewis a-sialilo Lewis a-di-sialilo Dímero Lewis a Lewis x-sialilo Dímero Lewis x Trímero Lewis x

GalNAca-Ser(Thr)(glicoproteína) NeuAca6GalNAca-Ser(Thr)

Galp3GlcNAc

NeuAca3Gaip3(Fuca4)GlcNAcP NeuAca3Galp3(Fuca4)[NeuAca6]GlcNAcp Gaip3(Fuca4)GlcNAcPGaip3(Fuca4)GlcNAP NeuAca3Galp4(Fuca4)GlcNAP Galp4(Fuca3)GlcNAp3Galp4(Fuca3)GlcNAcp Galp4(Fuca3)GlcNAP3Gaip4(Fuca3)GlcNAcP3Gaip 4(Fuca3)GlcNAcp

NeuAca3-Dímero Lewis x NeuAca3-Trímero Lewis x NeuAca6-0ligómero Lewis x

Formas lactonizadas destes no caso do ácido siálico 1.4 Cancro do pulmão e outros tipos de cancro:

Gaip4GlcNAcP3GaipGlcNAcP Antigénio I (rep.

Lactosamina)

Lewis a-Lewis x

Gaip3(Fuca4)GlcNAcP4Gaip4(Fuca3)GlcNAcQ 22

Fuc-GMl

Fuca2Gaip3GalNAcP4(NeuAca3)Galp4Glcpcer Formas lactonizadas de Fuc-GMl 1.5 Linfoma de Burkitt:

Gala4Gaip4GlcPCer GB3 1.6 Cancro da mama:

Fuca2Gaip3Galp3GalNAcP3 Gala4GaipGlcP4Cer Fuc-Globopenta Antigénio Tn Antigénio Tn-sialilo 1.7 Teratocarcinoma:

NeuAca3Gaip3GalNAcP3Gala4Gaip4GlcPCer Globopenta-sialilo

Formas lactonizadas do acima 2. CARBOHIPRATOS ASSOCIADOS COM TUMORES EXPERIMENTAIS: 2.1 Melanoma (Hamster)

NeuAca3Galp4GlcPCer GM3 GD3 9-0-AC-GD3 GD2

Formas lactonizadas destes 2.2 Melanoma (Murganho) GM3 GM3 lactonizado

3. CARBOHIDRATOS ASSOCIADOS COM AGENTES INFECCIOSOS

Manano de Candida albicans

Polissacáridos isolados de Mycobacterium bovis estirpe BCG Lipofosfoglicano de Leishmania major

Polissacáridos antigénicos 0 de Salmonella typhimurium

4. CARBOHIDRATOS ASSOCIADOS COM HIV

Lewis y Grupo de sangue A2 Antigénio Tn-sialilo Antigénio Tn_

Fuca2gaip4(Fuca3)GlcNAcP GalNAca3(Fuca3)Galp3GlcNAcP NeuAca6GalNAca-Ser(Thr) GalNAca-Ser(Thr) 23

Caracteristicas preferidas do conjugado 0 carbohidrato pode ser acoplado ao péptido transportador aminoterminalmente, carboxiterminalmente, ou pode ser acoplado a aminoácidos internos. Como indicado, é preferido o acoplamento interno.

Também, como descrito acima, têm sido definidos na literatura aminoácidos específicos de ancoragem, que se ligam às bolsas da molécula MHC, para vários péptidos que se ligam a moléculas MHC. Estes aminoácidos de ancoragem não devem ser preferencialmente utilizados para conjugação à estrutura carbohidrato. O carbohidrato sintético deve ter um alto grau de estabilidade molecular quando conjugado com o péptido transportador, de modo a expor os epitopos do carbohidrato com elevada especificidade. A posição do carbohidrato no conjugado deve ser tal que o receptor da célula T pode reconhecer um epitopo CHO, de modo a gerar uma activação óptima das células T.

Adicionalmente, o tamanho e a posição de CHO deve ser óptimo para reconhecimento por TCR, especialmente pela terceira região determinante da complementaridade (CDR3). Uma posição preferida, a que a invenção não está restrita, é centralmente no glicopéptido. 0 CHO e péptido pode ser conjugado por elementos de ligação opcionais. Tais elementos de ligação podem ser aminoácidos adicionais, por exemplo, cisteína, ou outros compostos químicos adequados.

Sistema de teste experimental A imunogonicidade dos conjugados da invenção pode ser testada em experiências de imunização conhecidas de um especialista na técnica. A especificidade de CHO pode ser analisada por experiências "vai-vem cruzado": as células T que respondem ao conjugado "CHO-A", em que A designa um péptido, são testadas com CHO-A; péptido A apenas; CHO-B, em que B designa um péptido 24 Γ

U t diferente de A; e péptido b apenas. Se, por exemplo, CTL que respondem a CHO-A também matam células apresentadoras de CHO-B, mas não células apresentadoras de péptidos apenas, a resposta pode ser considerada como sendo especifica para CHO. Adicionalmente, as células T podem ser testadas contra células alvo que expressam a parte CHO na forma de um glicolipido.

Formulações farmacêuticas

Os conjugados de acordo com a invenção podem ser administrados em formas de dosagem convencionais. Quando administrados na forma de vacinas é preferido que incluam um ou mais adjuvantes adequados.

Verificou-se que a administração de conjugados péptido/carbohidrato podem resultar na ligação dos conjugados a moléculas MHC vazias na superfície da célula. Tal ligação é possível uma vez que o glicopéptido foi, de facto, pré-processado sinteticamente, isto é, não entrou no citossol para ser processado.

Alternativamente, os conjugados podem ser incorporados numa estrutura capaz de facilitar o transporte no citossol, de modo a obter ligação precoce à molécula MHC. Tais estruturas podem ser lipossomas ou "complexos imunoestimuladores" (iscoms) (Morein et al., 1984) .

Os seguintes exemplos ilustram a síntese de conjugados de acordo com a invenção.

EXEMPLOS 1. PREPARAÇÃO DE GLICOCONJUGADOS 1.1 Síntese de glicopéptidos 25

Os glicopéptidos podem ser sintetizados por exemplo, acoplamento de braços espaçadores glicósidos a péptidos contendo uma função tiol.

Assim, uma parte de cisteína foi introduzida na sequência do péptido e as propriedades nucleofílicas do átomo de enxofre da cisteína foram utilizadas para criar uma ligação tioéter entre o péptido e um braço espaçador glicosidicamente ligado à parte carbohidrato. Os braços espaçadores utilizados foram os grupos 3-bromo-2-bromoetilpro-l-ilo (DIB) (Magnusson et al., 1982) e 2-bromoetilo (Dahmén et al., 1983b). por esta estratégia foi possível acoplar carbohidratos representando vários epitopos e determinantes antigénicos à mesma sequência de péptido. O último pode por sua vez ser obtido por técnicas de síntese de péptidos convencionais e ensaiado quanto à actividade biológica antes da conjugação. Assim, o tempo necessário para a síntese de péptidos foi mantido num mínimo.

As reacçóes de acoplamento foram realizadas em sulfóxido de dimetilo ou Ν,Ν-dimetilformamida.

Previamente ao acoplamento, o brometo de hidrogénio foi eliminado do grupo DIB utilizando fluoreto de Ν,Ν,Ν,Ν-tetrabutilamónio (Magnusson et al., 1982). 0 brometo alílico obtido foi então feito reagir com o péptido contendo a cisteína. Devido a reacções laterais, tais como a formação de fluoretos alílicos não reactivos, este método não permitiu que o excesso do derivado carbohidrato utilizado fosse recuperado.

Foi utilizado carbonato de césio como um promotor quando foram empregues glicósidos de 2-bromoetilo (Dahmén et al., 1983 b) . A quantidade de fluoreto de N, N, N, N-tetrabutilamónio ou carbonato de césio necessária para o acoplamento era dependente do ácido trifluoroacético incluído nos péptidos utilizados. A quantidade de ácido trifluoroacético incluída variou dependendo do grupo e estrutura do péptido. A escolha e quantidade de 26 p L·, —ç* solvente foi determinada pelas propriedades de solubilidade do péptido.

As reacções de acoplamento foram monitorizadas por HPLC e foram interrompidas pela adição de água contendo ácido trifluoroacético a 0,1%. Os glicopéptidos resultantes foram purificados por HPLC preparativa e os pesos moleculares foram confirmados por FAB MS.

Foi relatado que brometos saturados e alílicos reagiam ambos com tióis em péptidos não protegidos para produzir, como produtos principais, péptidos S-alquilados.

Yang et al.(1991) prepararam péptidos farnesilados fazendo reagir octa- e pentadecapéptidos com brometo de farnesilo a pH 6-9 em misturas de Ν,Ν-dimetilformamida/sulf óxido de dimetilo/acetonitrilo. Ν,Ν-diisopropiletilamina foi utilizada como promotor. A S-alquilação exclusiva foi relatada mesmo a pH 10-12.

Foram também realizadas S-alquilações selectivas de péptidos contendo cisteína (Or et al., 1991) em amónia metanólica ou etanólica utilizando vários agentes de alquilação, por exemplo, um derivado primário bromopropilo. 1.2 Síntese dos braços espaçadores glicósidos (Figuras 1 e 2).

Os braços espaçadores glicósidos utilizados para acoplamento são exemplificados pelo ΌΙΒ-β-glicósido e o 2-bromoetil-p-glicósido de NeuNAca3Gaip4Glc (3''-sialil-lactose), os 2-bromoetil~P-glicósidos de Gala4Gal e Gala4Gaip4Glc e o 2-bromoetilglicósido de s'Lactama GM31' (Compostos 9, 15, 28,48 e 55 respectivameiite) . DIB-p-glicósido de 311-sialil-lactose (9) foi sintetizado em onze passos a partir de 2-trimetilsililetil 2,3,6-tri-O-acetil-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-acetil-p-D-galactopiranosil)-β-D- glicopiranósido (1) (Jansson et al., 1988). A desacetilação de 27.

V

t (1) produziu (2) que foi isopropilado e benzilatado para produzir o derivado 3'-4'-O-isopropilidenolactose protegido com benzilo (3). A hidrólise do 3'-4'-acetal produziu o aceitador glicosilo (4) num rendimento global de 51%. A glicosilação (Marra e Sinay, 1990) do derivado da lactose (4) em acetonitrilo a -23°C utilizando o α-xantato protegido com acetilo (5) (Marra e Sinay, 1989) de éster metílico de ácido siálico como dador de glicosilo e trifluorometanossulfonato de dimetil(metiltio)sulfónio (DMTST) como promotor produziu, após desbenzilação e acetilação, o derivado trissacárido (6) num rendimento de 17,5%. A facilidade de purificação e o rendimento de (6) foram ligeiramente melhorados quando foi efectuada a acetilação das funções hidroxilo não reagidas nos produtos de reacção antes da hidrogenólise dos ésteres benzílicos. Os 2-trimetilsililetilglicósido (6) foi convertido (Jansson et ai., 1988) no Ι-β-acetato correspondente (7) que foi utilizado como um dador de glicosilo numa glicosilação catalisada por um ácido de Lewis de 3-bromo-2-bromometilpropano-l-ol produzindo ο β-glicósido protegido (8) num rendimento de 46%. A desprotecção de (8) por metóxido de sódio metanolico seguido por hidróxido de sódio metanólico aquoso produziu o DIB^-glicósido de 3''-siali-lactose (9) que, após eliminação de HBr para produzir o correspondente 2-bromometilprop-2-en-l-il glicósido foi utilizado para acoplamento a péptidos. O 2-bromoetil^-glucósido de 31 '-sialil-lactose (15) foi por sua vez sintetizado a partir do 2-bromoetilglicósido de lactose (10) (Magnusson et al., 1982) por uma sequência de cinco passos. A desacetilação de 810) produziu (11) que foi isopropilidenado (Catelani, 1988) para produzir o derivado 31,41-O-isopropilideno (12) num rendimento de 86%. A benzoilação parcial (Murase et al., 1989) a -60°C seguida por hidrólise do 3,,4'-acetal produziu o 2,6,61-tri-O-benzoato (13) com 13% de rendimento. 0 derivado de lactose (13) foi glicosilado a -60°C (Lõnn e Stenvall, 1992) utilizando o xantato (5) como dador de glicosilo e trifluorometanossulfonato de metilsulfónio (MTS) como um 28 tt promotor para produzir o derivado protegido trissacárido (14) num rendimento de 75%. A desprotecção como para 8 produziu o 2-bromoetilglucósido (15) com 96% de rendimento. 1.3 Experiências

Os espectros *11- e “C-RMN foram registados em CDC13 a 300 e 75 MHz respectivamente num espectrómetro Varian Gemini 300 salvo referência em contrário. Os sinais de solvente não deuterado a 7,25 e 77,0 ppm respectivamente foram utilizados como sinais internos de referência.

As rotações ópticas foram medidas utilizando um polarímetro Perkin Elmer 241.

Foi realizada cromatografia de camada fina em Merck DC-Fertigplatten (Silica gel 60 F254 0,25 mm) e as manchas foram visualizadas por aspersão de ácido sulfúrico a 10% seguido por cozimento a temperatura elevada e/ou aspergindo com ácido molibdatofosfórico/ce0/H2S04 diluído seguido por aquecimento (Renaud e Seebach, 1986). Foi utilizada para cromatografia preparativa MatrexTMSilica Si 0,35-0,70 μ.

Foi efectuada HPLC utilizando um sistema cromatográfico Beckman System Gold numa coluna Beckman Ultrasphere C-18 (4,6 x 150 mm) com misturas de acetonitrilo-água contendo ácido trifluoroacético a 0,1%. Para separações preparativas foi utilizada uma coluna Beckman Ultrapep C-18 (10μ, 21,2 x 150 mm) . Os cromatogramas foram monitorizados a 214 nm. 2-Trimetilsililetil 4-0-3-D-qalactopiranosil-p-D-qlucopiranósido (2)

Foi agitado 2-Trimetilsililetil 2,3,6-tri-0-acetil-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-p-D-galactopiranosil)-β-D-glucopiranósido (1) (Jansson et al., 1988) (29,4 g, 40 mmol) em metóxido de sódio metanólico (5,8 mM, 515 mL) durante 15 h. A neutralização com 29

ácido acético, evaporação e cristalização a partir do etanol produziu (2) (14,6 g, 82%). p.f. 175-177°C

[a]D22: + 18,5°C (c 1,0, água) ^-RMN (DzO, (CH3) 3Si (CD2) 2COONa) δ: 4,51 (d, 1H, J=8 Hz, H-l/H- 1'), 4,46 (d, 1H, J=7,5Hz, H-l/H-1'), 4,10-3,50 (13H), 3,30 (t, 1H, J=8,5 Hz), 1,09 (td, 1H, J=13, 13 e 6 Hz, CH2Si) , 0,98 (td, 1H, J=13, 13 e 5,5 Hz, CH2Si), 0,04 (s, (CH3)3Si) ppm. 13C-RMN (D20, (CH3)3Si(CD2)2COONa) δ: 105,7 (C-l/C-1' ) , 104,2 (C- 1/C-l'), 81,2, 78,2, 77,6, 77,4, 75,7, 75,4, 73,8, 71,4, 71,2, 63,8, 62, 9, 20,4 (CH2Si) , 0,4 ( (CH3) 3Si) ppm. 2-Trimetilsililetil 2,3, 6-tri-Q-benzil-4-0-(2,6-di-Q-benzil-3,4-O-isopropilideno-P-D-qalactopiranosil)-β-D-qlucopiranósido (3)

Ao composto 2 (14,5 g, 32,9 mmol) em 2,2-dimetoxi-propano (250 mL) foi adicionado ácido p-toluenossulfónico monohidratado (1,6 g) . A mistura foi agitada durante 165 minutos. Foi então adicionado trietilamina (9 mL) e a mistura foi evaporada. O resíduo (contendo uma mistura de acetais) foi tratada com ácido acético a 5% (100 mL) durante 50 min e foi evaporado para produzir, de acordo com TLC, um produto principal e traços de um segundo componente (presumivelmente o 4',6'-acetal).

Uma parte (11,9 g, 25,3 mmol) do produto bruto (15,5 g) foi dissolvida em Ν,Ν-dimetilformamida seca sob azoto. Foi adicionado hidreto de sódio (60%, 6,16 g, 154 mmol) e a mistura foi agitada durante 1 h. Foi então adicionado brometo de benzilo (21 mL, 177 mmol) durante 15 min e a agitação foi continuada durante 14 h. A mistura foi trabalhada por adição de metanol seguido de água e foi então partilhada entre diclometano e água. A fase aquosa foi extraída uma vez com diclorometano e as fases orgânicas combinadas foram secas (Na2S04) , filtradas e vaporadas. 30 A cromatografia (tolueno-acetato de etilo) produziu o composto 3 (15 g, 73%) como um xarope.

[a]D22: + 16,5° (c 1,2, clorofórmio). 1H-RMN δ: 7,45-7,25 (25H, Ar-H), 5,0-4,3 (12H, sinais anoméricos e benzilicos) , 4,15-3,90 (4H), 3,85-3,30 (10H), 1,42 (s, 3H, CH3), 1,37 (s, 3H, CH3), 1,14-0,97 (m, 2H, CH2Si) , 0,05 (s, (CH3)3Si) ppm. 13C-RMN δ: 139,3, 139,0, 138,8, 138,7, 138,6, 128,5-127,4, 109,9 ((CH30)2C), 103,3 (C-l/C-1'), 102,0 (C-l/C-1'), 83,1, 82,0, 80,7, 79,9, 75,4, 75,1, 74,9, 73,6, 73,4, 73,2, 72,0, 68,9, 68,34, 67,3, 27,8, 26,2, 18,3 (CH2Si) , -1,7 ((CH3)3Si) ppm. 2-Trimetilsililetil 2,3,6-tri-0-benzil-4-0-(2, 6-di-0-benzil-p-D-galactopiranosil)-β-D-glucopiranósido (4) 0 composto 3 (14,9 g, 15,9 mmol) em 80% de ácido acético aquoso (110 mL) foi agitado a 80°C durante 35 min. e foi então evaporado. A cromatografia (tolueno-acetato de etilo, 4:1) produziu o composto 4 (12,3 g, 86%). Uma amostra analítica foi cristalizada a partir do heptano. p.f. 98,8-100,1°C.

[a] D22: + 15,6° (c 1,4, clorofórmio). XH-RMN δ: 7,45-20 (25H, Ar-H), 5,05-4,56 (7H) , 4,50-4,35 (5H) , 4,10-3,30 (14H) , 2,53 (bs, 1H, OH), 2,45 (bs, 1H, OH), 1,13-0,97 (m, 2H, CH2Si), 0,04 (s, (CH3)3Si) ppm. 13C-RMN δ: 139,4, 139,0, 138,6, 138,5, 128,7-127,4, 103,3 (C-l/C-1'), 102,7 (C-l/C-1'), 82,9, 82, 6, 80, 1, 76,7, 75,2, 74,9, 73,5, 73,46, 73,2, 72,8, 68,8, 68,6, 68,4, 67,4, 18,3 (CH2Si), -1,7 ((CH3)3Si) ppm. 2-Trimetilsililetil 2,3,6-tri-0-acetil-4-0-{2,6-di-O-aceti1-3-0-[metil(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-0-acetil-3,5-didesoxi-D-qlicero 31 L-c, -g-D-qalacto-3-nonulopiranosil)onato]-β-D-qalactopiranosil)}-β-D-glucopiranósido (6) O composto 4 (8,8 g, 9,9 mmol) , 5 (2,93 g, 4,9 mmol) e peneiras moleculares em pó (3A, 12 g) em acetonitrilo seco (114 mL) foi arrefecido sob azoto até -23°C. A esta mistura foi adicionado, com agitação, uma solução (50 mL) trifluorometanos sulfonato de dimetil(metiltio)sulfónio (Marra e Sinay, 1990) (25,7 mmol) e acetonitrilo (50 mL) . A mistura de reacção foi agitada a -23°C durante 2 h. e foi então filtrada através de celite e partilhada entre hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado e diclorometano. A fase aquosa foi extraida uma vez com diclorometano e as fases orgânicas combinadas foram secas (Na2S04), filtradas e evaporadas. A cromatografia (tolueno-acetato de etilo-metanol, 35:35:1) produziu uma fracção (1,96 g) contendo um componente principal e dois menores. A acetilação em anidrido acético-piridina (1:1) durante 12 h produziu, após evaporação, um produto bruto que foi sujeito a hidrogenólise a 35 psi durante 4,5 h em ácido acético glacial utilizando paládio a 10% em carvão activado como catalisador (50 mL de ácido acético, 0,75 g de Pd a 10%/C por g de substrato). A filtração, evaporação e cromatografia (tolueno-etanol 6:1) produziram uma fracção principal que foi acetilada como acima. A cromatografia (tolueno-etanol, 18:1—>10:1) produziu o composto amorfo 6 (1,0 g, 17,5%).

[a]D22: - 8,8° (c 1,2, clorofórmio). 1H-RMN δ: 5,54 (ddd, 1H, J=9,5, 5,0 e 2,5 Hz, H-8''), 5,38 (dd, 1H, J=9,5 e 2,8 Hz, H-7"), 5,17 (t, 1H, J=9,5 Hz, H-3) , 5,08 (d, 1H, J=10,5 Hz, NH), 4,97-4,82 (4H, H2, H-2', H-4', H-4"), 4,G2 (d, 1H, J=0 Hz, H-l') , 4,54-4,37 (4H, inter alia H-l, H- 3'), 4,18 (dd, 1H, J=12 e 5,5 Hz), 4,1-3,8 (10H), 3,83 (s, CH30) , 3,65-3,49 (3H) , 2,58 (dd, 1H,J=12,5 e 4,5 Hz, H-3"ekv.), 2,23, 2,15, 2,07, 2,05, 2,03, 2,02, 2,0 e 1,84 (simpletos, 3H cada, 32

CH3CO), 2,06 (s, 6H, 2xCH3CO), 1,67 (t, 1H, J=12,5 Hz, H-3"ax.), 1,01-0,81 (m, 2H, CH2Si), -0,015 (s, (CH3)3Si) ppm. 13C-RMN δ: 171,2, 170,9, (2C), 170,8, 170,7, 170,5, 170,1, 170,0, 169, 94, 169,88, 168,3 (C-l'') , 101,1 (C-l/C-1'), 100,0 (C-l/C- 1'), 96,8 (C-2"), 76,4, 73,6, 72,5, 72,0, 71,9, 71,4, 69,9, 69.3, 67,7, 67,4, 67,3, 66,9, 62,3, 62,2, 61,4, 53,0 (CH30) , 49,0 (C-5"), 37,2 (C-3"), 23,0, 21,3, 20,7-20,4, 17,7 (CH2Si) , -1,8 ((CH3) 3Si) ppm.

Anal. Cale. para C49H72N029Si: C, 50,4, H, 6,2; N, 1,2.

Encontrada: C, 50,3; H, 6,4; N, 1,2. 1.2.3, 6-Tetra-Q-acetil-4-Q-{2,4,6-tri-0-acetil-3-[metil(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-0-acetil-3,5-didesoxi-D-qlicero-g-D-qalacto-2-nonulopiranosil)onato]-β-D-qalactopiranosil)}-β-Ρ-qlucopiranósido (7) 0 composto 6 (840 mg, 0,72 mmol) foi dissolvido numa mistura de tolueno (5,6 mL) e anidrido acético (1,06 mL) . A esta solução foi adicionada uma solução (1,45 mL) de borotrifluoreto de eterato (0,36 mL, 2,91 mmol) em tolueno (2,04 mL). A mistura de reacção foi agitada durante 140 min. e foi então trabalhada por partição entre diclorometano e hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado. A fase aquosa foi extraída uma vez com diclorometano e as fases orgânicas combinadas foram secas (NaSOí) , filtradas e evaporadas para produzir (7) bruto (815 mg). A cristalização a partir de metanol produziu o composto 7 (586 mg) . A cromatografia (tolueno-etanol 20:1 -► 10:1) do líquido mãe produziu (7) adicional (154 mg) . O rendimento total de (7) foi 740 mg (92%) .

De acordo com RMN, o composto 7 continha metanol da cristalização numa razão molar de 0,5 mole de metanol por mole de (7) . Menos de 5% do epímero 1-ot estava presente como detectado por RMN. 33 [a]D22: -0,2° (c 1,9, clorofórmio). 1H-RMN Ô: 5,67 (d, 1H, J=8,5 Hz, H-l), 5,51 (ddd, 1H, J=9,5, 4,5 e 2,5 Hz, H-8"), 5,40 (dd, 1H, J=9,5 e 2,5 Hz, H-7' ' ) , 5,22 (t, 1H, J=9 Hz, H-3) , 5,08 (d, 1H, J=10,5 Hz, NH) , 5,04 (dd, 1H, J=9,5 e 8,5 Hz, H-2) , 4,96-4,83 (3H, H-2', H-4' e H-4"), 4,65 (d, 1H, J=8 Hz, H-l'), 4,50 (dd, 1H, J=10,5 e 3,5 Hz, H-3'), 4,42 (dd, 1H, J=12,5 e 2,5 Hz, H-9' ' ) , 4,42 (dd, 1H, J-12,5 e <2 Hz, H-6/H-6') , 4,20 (dd, 1H, J=12 e 5 Hz, H-9"), 4,08-3,80 (9H) , 3,84 (s, CH30), 3,75 (ddd, 1H, J=10, 5 e 2 Hz, H-5/H-5' ), 3,62 (dd, 1H, J=ll e 3 Hz, H-6/H-6' ) , 3,45 (d, 1,5 H, J=5,5 Hz, CH3OH) , 2,57 (dd, 1H, J=12,5 e 5 Hz, H-3"ekv.), 2,24-1-83, (sinais CH3CO) , 1,67 (t, 1H, J=12,5 Hz, H-3"ax.), 1,09 (q, 0,5H, J=5,5 Hz, CH3OH) ppm. 13C-RMN (medido em material cromatografado isento de metanol) δ: 171,2, 170,9, 170,7, 170 ', 66, 170,61, 170,5, 169 ,94 / 169,9, 169,8, 169,2, 168,2, 101, 0 (c- 1'), 96,8 (C-2" ), 91, 6 (C-l), 75,7, 73,5, 73,1, 71,9, 71, 3, 70,6, 70 ,4, 69,8, 69, 2, 67,7, 67,2, 66,7, 62, 0, 61,8, 61, 5, 53 ,2 (CH30), 49,0 (C-57 ' ) , 37 ,2 (C- 3" ) , 22,9, 21, 3, 20,7, 20, 6, 20, f5, 20/5/ 20,4 ppm. 3-Bromo-2-bromometilprop-l- il 2, 3,6-tri-0 -acetil-4-0 -{2 ,4, 6-tri- O-acetil-3-O-[metil(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-0-acetil-3,5-didesoxi-D-qlicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil)onato]-β-Ρ-qalactopiranosil}-β-D-qlucopiranósido (8) 0 composto 7 (0,96 g, 0,86 mmol) e 3-bromo-2-bromometilpropan-l- 01 (Ansari et ai., 1987) (1,5 g, 6,5 mmol) foram dissolvidos em diclorometano seco (30 mL) e foi então arrefecido até 0°C. Foi adicionado trifluoreto de eterato de boro (1,9 mL, 15 mmol) e a mistura foi agitada a 0°C durante 40 min. O banho de arrefecimento foi removido e a agitação foi continuada durante 5 h. A mistura foi então diluída com diclorometano e lavada com solução de hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado arrefecido em gelo. A fase do diclorometano foi seca (Na2S04) , I i

filtrada e evaporada. A cromatografia (tolueno-etanol, 20:1->12:1) produziu o composto amorfo (512 mg, 46%).

[a] D22:-0,5 (ç 2,6, clorofórmio) 1H-RMN δ: 5,54 (ddd, 1H, J=9,5, 5 e 2,5 Hz, H-8" ) , 5,40 (dd, 1H, J=9,5 e 3 Hz, H-7"), 5,19 (t, 1H, .J=9,5 Hz, H-3) , 5,04 (d, 1H, J=10 Hz, NH), 4, 97-4,82 (4H), 4,67 (d, 1H, J=8 Hz, H-l'), 4,54-4,37 (4H) , 4,19 (dd, 1H, J=12 e 5,5 Hz, H-9''), 4,10-3,80 (10H), 3,84 (s, CH30) , 3, 66-3,42 (8H), 2,58 (dd, 1H, J=12,5 e 4,5 Hz, H-3 ekv. ) , 2,38-2,22 (m, CH(CH2Br)2), 2,24 (s, 3H) , 2,16 (s, 3H) , 2,10 (s, 3H) , 2,08 (s, 6H), 2,07 (s, 3H) , 2,06 (s, 6H), 2,04 (s, 3H) , 2,00 (s, 3H), 1,85 (s, 3H) , 1,85 (s, 3H) , 1,68 (t, 1H, J=12,5 Hz, H-3''ax.) ppm. 13C-RMN δ: 171, 1, 170,94, 170,, 9, 170,7, 170,6, 170, 6, 170,5, 170,0, 169, 97, 169,7, 169,8, 166,2 (C-l" ) , 101,1, 100,8, 96,8 (C-2"), 76,2, 73,1, 72,7, 72,0, 71, 6, 71,3, 70,4, 70,4, 69, 6, 69,2, 69, 1, 67,7, 67,2, 66, 8, 62,1, 61,4, 53,2 (CH30) , 47,0 (C- 5"), 42,4 (CH(CH2Br)2) , 37,2 (C-3' ' ) , 31,6 (CH2Br) , 22,9, 21,3, 20,7, 20,5, 20,5, 20,4, 20,4 ppm. 3-Bromo-2-bromometilpropil_4-0-(3-0- [sódio (5-acetamido-3,5- didesoxi-D-glicero-a-D-qalacto-2-nonulopiranosil)onato]-β-Ρ-qalactopiranosil}-β-D-glucopiranósido (9) O composto 8 (384 mg, 0,30 mmol) foi dissolvido em metóxido de sódio metanólico (0,03 M, 60 mL) e agitado durante a noite. Foi adicionada água (100 pL) e a mistura foi neutralizada com sílica, filtrada e concentrada. A cromatografia (clorofórmio- metanol-água, 65:53:6) produziu o composto amorfo 9 (189 mg, 74%.

[a]D22: -3,4° (c 0,3, metanol). 1H-RMN (CD3OD) δ: 4,44 (dd, 1H, J=8 Hz, H-l/H-1' ) , 4,31 (d, 1H, J=8 Hz, H-l/H-1'), 2,86 (dd, 1H, J=12,5 e 3,5 Hz, H-3"ekv., 35 virtualmente acoplados), 3,43-2,31 (m, 1H, CH(CH2Br)2), 2,02 (s, 3H, NCOCH3), 1,73 (bt, 1H, J=12,5 Hz, H-3"ax., virtualmente acoplados) ppm. 13C-RMN (CD3OD) δ: 175,5, 174, 9, 105,1 (C-l/C-1'), 104,6 (C-l/C-1'), 101,1 (C-2' ' ) , 54,0 (0-5' ' ) , 44,4 (CH (CH2Br) 2) , 42,1 (C- 3"), 33,9 (CH2Br) , 33,7 (CH2Br) , 22,7 (NCOCH3) ppm. 2-Bromoetil 4-0-p-D-galactopiranosil-P-D-glucopiranósido (11) 2-Bromoetil 4-0-(2,3,4,6—tetra-O-acetil-p-D-galactopiranosil)-

2,3,6-tri-0-acetil-p-D-glucopiranósido (0,17 mmol) foi preparado de acordo com Dahmén et al., (1983b). O produto bruto foi dissolvido em metóxido de sódio metanóico (0,01 M, 1L) e agitado durante 3 h. A mistura foi neutralizada com sílica, filtrada e concentrada. A cromatografia (diclorometano-metanol-água, 65:20:3) e cristalização a partir do etanol produziu o composto 11 (37 g, 51%) . p.f. 151-152°C 1H-RMN (D20, acetona) δ: 4,57 (d, 1H, J=8 Hz, H-l), 4,45 (d, 1H, J=8 Hz, H-l'), 4,26-4,19 (m, 1H, OCH2CH2Br), 3,98 (dd, 1H, J=12,5 e 1 Hz, H-6/H-6'), 3,93 (d, 1H, H-2) ppm. 13C-RMN (D20, acetona) δ: 105,7 (C-l'), 104,9 (C-l),75,5 (C-2'), 73,7 (C-2), 71,3 (C-4'), 63,8 (C-6/C-6' ) , 62,9 (C-6/C6' ) , 33,9 (CH2Br) ppm. 2-Bromoetil 4-0-(3,4-Q-isopropilideno-P-D-galactopiranosil)-β-glucopiranósido (12)

Uma mistura do composto 11 (35 g, 78 mmol) e ácido p-toluenossulfónico (1,5 g, 8 mmol) em 2,2-dimetóxipropano (800 mL) foi agitada a 50°C durante lhe depois toda a noite à temperatura ambiente. Foi adicionada trimetilamina (12 mL, 80 mmol) e a mistura foi agitada durante 30 minutos, concentrada e evaporada com tolueno para remover o excesso de trietilamina. 0 produto bruto foi dissolvido em metanol-água (10:1, 900 mL) e fervido sob refluxo durante 2 h. Foi adicionada solução de

hidrogenocarbonato de sódio aquosa saturada (20 mL) e a mistura foi concentrada. A cromatografia "flash" (clorofórmio-metanol-trietilamina, 10: 1: 0,01) e cristalização a partir do etanol

produziu o composto 12 (32,7 g, 86%). p.f. 171-172°C

[a]D22: +11,1° (c 0,7, metanol). 1H-RMN (D20, acetona) δ: 4,56 (d, 1H, J=8 Hz, H-l), 4,49, (d, 1H, J=8,5 Hz, H-l'), 4,37 (dd, 1H, J=5,5 e 1,5 Hz, H-4'), 3,51 (dd, 1H, J=8 e 8,0 Hz, H-2'), 3,36 (dd, 1H, J=9,0 e 8 Hz, H-2), 1,55 (s, 3H, CH3) ppm. 13C-RMN (D20, acetona) δ: 113,7, ( (CH3) 2C) , 104,9 (C-l/C-1'), 81,4 (C-5) , 81,3 (C-3' ) , 77,5 (CH2CH2Br) , 77,0 (C-3) , 76,5 (C-4') , 76,2 (C-5'), 75,5 (C-2/C-2') , 63,5 (C-6/C-6') , 62,8 (C-6/C-6'), 33,8 (CH2CH2Br) , 29,9 (CH3C) , 28,1 (CH3C) ppm. 2-Bromoetil 2,6-di-0-benzoil-4-(6-0-benzoil-P-D-galactopirano-sil) -3-D-qlucopiranósido (13) O composto 12 (9,0 g, 18,4 mmol) foi dissolvido numa mistura de piridina seca (60 mL) e diclorometano (150 mL) e arrefecido a -50°C. Foi adicionado cloreto de benzoilo (10,5 mL, 90,6 mmol) em diclorometano seco (150 mL) gota a gota, durante 3 h e a mistura foi agitada por mais 1 h. Foi então adicionado metanol e a solução foi concentrada. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (500 mL) e lavado com cloreto de hidrogénio aquoso (2 M, 250 mL), hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (250 mL) , cloreto de sódio aquoso saturado (250 mL), seco (Na2SC>4) e concentrado. 0 produto bruto foi dissolvido em ácido acético aquoso a 80% (250 mL) , agitado a 80°C durante 30 min. e então concentrado. A cromatografia (diclorometano-metanol 30:1) produziu o composto amorfo 13 (4,3 g, 31%).

[a] D22: +15,8° (c 1,0, clorofórmio). 37 Γ

U 1H-RMN δ: 8,24-8,02 (m, 15H, Ar-H), 5,19 (dd, 1H, J=9,5 e 8 Hz, H-2) , 4,84 (dd, 5H, J=12,0 e 1,5 Hz, H-6/H-6" ) , 4,66 (dd, 1H, J=12,0 e 3,5 Hz, H-6/H-6' ' ) , 4,64 (dd, 1H, J=8 Hz, H-l, 4,48 (dd, 1H, J=12,0 e 6 Hz, H-6/H-6" ) , 4,37 (dd, 1H, J=12,0 e 9 Hz, H-6/H-6"), 4,35 (d, 1H, J=8 Hz, H-l) ppm. 13C-RMN δ: 166,8, 166,6, 165,5, 104,1 (C-l'), 101,0 (C-l) , 81,7, 73,5, 73,2, 73,1, 73,02, 72,96, 70,8, 69,6, 68,9, 64,1 (C-6/C- 6' ' ) , 29,6 (OCH2CH2Br) ppm.

Anal. Cale. para C35H37BrOi4: C, 55,2; H, 4,9. Encontrado: C, 55,2; H, 4,9. 2-Bromoetil_2,6-di-Q-benzoil-4-0-{6-0-benzoil-3-0- [metil (5- acetamido-4,7,8,9-tetra-Q-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-qalacto-2-nonulopiranosil)onato]-β-D-qalactopiranosil}-β-Ρ-qlucopiranósido (14) O composto 13 (200 mg, 0,26 mmol), 5 (263 mg, 0,44 mmol) e peneiras moleculares em pó (3A, 300 mg) numa mistura de acetonitrilo e diclorometano (9:4, 8 mL) foi agitado durante 1 h sob argon. Foi adicionado trifluorometanossulfonato de prata (118 mg, 0,45 mmol) e a mistura de reacção foi arrefecida a -60°C. Foi adicionado brometo de metilsulfonilo (Dasgupta e Garegg, 1988) em diclorometano (3,48 M, 126 pL, 0,44 mmol) gota a gota durante 5 min. e a mistura foi então agitada durante 1 h. Foi adicionada diisoprolpilamina (0,7 mL, 2,6 mmol) e a agitação foi continuada durante 0,5 h. A mistura foi deixada arrefecer até aos 0°C, filtrada e concentrada. A cromatografia (clorofórmio-metanol, 50:1) produziu o composto amorfo 14 (244 mg, 75%).

[a]D22: +14,9° (c 1,0, metanol). XH-RMN δ: 5,33 (m, 1H, H-8"), 5,28 (dd, 1H, J=8,0 Hz, H-7''), 5,26 (dd, 1H, J=9, 5 Hz, H-2), 5,03-4,93 (m, 2H, H- 4", H-6/H- 6'), 4,74 (dd, 1H, J=12 e3,5 Hz , H-6/H-6') , 4, 70 (d. 1H, J=8 Hz, 38 I— L-i ^ H-l), 4,59 (d, 1H, J=8 Hz, H-l'), 4,50 (dd, 1H, J=12 e 6 Hz, H-6/H-6'), 2,70 (dd, 1H, J=13,0 e 4,5 Hz, H-3"ekv.) ppm. H-3, H-2' e H-4' foram deslocados para o campo abaixo após acetilação de 14). 13C-RMN (CD3OD) δ: 170,7, 170,4, 170,3, 170, 1, 170,1, 168,1 (Ο Ι", JC-1''-H-3''αχ =6,1 Hz), 166,6, 166,1, 165,4, 104,4 (C-'), 101,1 (C-l), 97,6 (C-2"), 82,2, 76,4, 73, 4, 73, 0, 72,9, 63, 7, 63,4, 62,4 (C-6, C-6', C-6") , 53,2 (CH30) , 49, 6 (C-5"), 37,6 (C-3"), 29,6 (OCH2CH2Br), 23,1 (NCOCH3) , 21,0, 20, 7, 20, 6, 20,5 ppm.

Anal. Cale. para C5sH64BrN026: C, 53,5; H, 5,2. Encontrado: C, 53,5; H, 5,5. 2-Bromoetil 4-0-(3-0-[sódio(5-acetamido-3, 5-didesoxi-D-qlicero-g-D-qalacto-2-nonulopiranosil)onato]-β-D-qalactopiranosil}-β-Ρ-qlucopiranósido (15) O composto 14 (200 mg, 0,16 mmol), foi dissolvido em metóxido de sódio metanólico (0,03M, 50 mL) e agitado durante 6 h. Foi adicionada água (50 mL) e a mistura foi agitada durante 5 min., neutralizada com silica, filtrada e concentrada. A cromatografia (clorofórmio-metanol-água, 6:4:1) produziu o composto amorfo 15 (118 mg, 96%).

[a] D22: -0,9° (c 1,0, água). 1H-RMN (D20, acetona) δ: 4,57 (d, 1H, J=8 Hz, H-l/H-1')/ 4,54 (d, 1H, J=8,5 Hz, H-l ou H-l'), 2,77 (dd, 1H, J=12,2 e 4,3 Hz, H-3e"), 2,03 (s, 3H, NCOCH3) , 1,81 (bt, 1H, H-3a'' ) . 13C-RMN (D20, acetona) δ: 177,0, 176,7, 105,6 (C-l'), 105,1 (ΟΙ), 102,0 (C-2"), 54,7 (C-5"), 42,7 (C-3"), 34,0 (OCH2CH2Br) , 25,0 (NC0CH3) ppm. 2-Bromoetil 4-0-(oc-D-galactopiranosil)-β-D-qlucopiranósido (28) 39

1 i \l 2-Bromoetil 2,3,6-tri-0-acetil-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-galactopiranosil-p-D-glucopiranósido (27) (Dahmén et al., (1983 a) p.116) foi preparada por glicosidação catalisada por trifluoreto de boro do octa-acetato correspondente (Dahmén et al., (1983 a) p.113) (1,25 g, mistura anomérica). 0 produto bruto foi suspendido em metanol (20mL) e foi adicionado metóxido de sódio metanólico (0,2 M, 4 mL) . Foi obtida uma solução límpida após 30 min. A mistura reaccional foi agitada durante mais 30 min e depois foi neutralizada utilizando sílica. A filtração, evaporação e cromatografia (clorofórmio-metanol-água, 65:35:6) produziu o composto 28 (335 mg, 41%).

[a] D22: +69° (c 1,0, metanol) 1H-RMN (CD3OD) δ: inter alia 4,76 (d, 1H, J=2 Hz, H-l'), 4,15 (d, 1H, J=7 Hz, H-l), 4,09 (bt, Hz)ppm. 1H, J=6 Hz), 3, 92 (dt, J=ll,5 e 6, 13C-RMN (CD3OD) δ: 105,2, 102 ,5, 79,2, 76,2, 74,6, 72,7, 71,3 71,1, 70,7, 62,7, 61,1, 30,9 ppm 13C-RMN (D2O, ref. acetona a 33, 19 ppm): Ô: 105,9, 103,2, 80,0 78,1, 75,2, 73,8, 73,7, 73,1, 72,1, 72,0, 71,6, 63,5, 63,0, 34,1 ppm.

Anal. Cale. Para Ci^sBrOn: C, 37,4; H, 5,6. Encontrado: C, 37,1; H, 59. 2-Bromoetil 4-0-(4-0-g-D-galactopiranosil-P-D qalactopiranosil) P-D-glicopiranósido (48) 2-Bromoetil 2,3, 6-tri-0-acetil-4-0-[2,3,6-tri-0-acetil-4-0- (2, 3,4,6-tetra-o-acetil-a-D-galactopiranosil)-p-D-galactopiranosil]-p-D-glicopiranósido (53) (Dahmén et al. 1984) (35 mg) foi desacetilado por agitação em 10 mL de metóxido de sódio metanólico a 0,1 M durante 16 h. A neutralização utilizando gel de sílica, filtração, evaporação e cromatografia 40 t Γ (clorofórmio-metanol-água; 65:35:6) seguidas por microfiltração e liofilização produziram 48 (18,6 mg, 90%) [a] D22: +51° (c 1,0, água). 1H—RMN (D20, ref. acetona a 2,24 ppm) δ: 4,96 (d, 1H, J=4 Hz, H- 1"), 4,57 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-l/H-1' ) , 4,52 (d, 1H, J=7,5 Hz, H-l/H-1) , 4,37 (bt, 1H) , 4,27-4,19 (m, 1H, CH2CH2Br) , 4,09- 3,55 (19H), 3,36 (bt, 1H) ppm 13C-RMN (D20, ref. acetona a 33,19 ppm) δ: 106,2 (C-l/C-1), 105,1 (C-l/C-1'), 103,3 (C-l"), 81, 6, 80,3, 78,4, 77,8, 77,3, 75, 7, 75,1, 73,9, 73,8, 73,0, 72,1, 71,9, 71,5, 63,5, 63,3, 63,0, 33,9 (CH2Br) ppm. 2-Bromoetil qlicósido de "Lactama GM3" (55) O deca-acetato correspondente do composto do titulo (Ray et ai., 1992) (40 mg, 1α/1β 1:2,2) foi O-desacetilado em metóxido de sódio metanólico 9,5 mM à temperatura ambiente durante 7 h. A neutralização com gel de sílica, evaporação e cromatografia (clorofórmio-metanol-água, 65:35:6) produziu 55 (26 mg. quant.) ^-RMN (D20, (CH3) 3Si (CD2) 2COONa) δ: inter alia 3,37 (bt, 1H) , 2,61 (dd, 1H, J=13 e 6 Hz, H-3"e), 2,05 (s, 3H, NCOCH3) , 1,71 (dd, 1H, J=ll e 13 Hz, H-3"a) ppm.

Os péptidos O-glicosilados na cadeia lateral da serina foram sintetizados utilizando a técnica de síntese de péptidos em fase sólida. A glicosilação da serina (protegida como um derivado 9-fluorenilmetoxicarbonil- e pentafluorifenil nos grupos amino- e carboxi- respectivamente) com β-tioglucósidos O-acetilados de Gala4Ga^ produz derivados de serina o-glicosilados. Estes derivados foram utilizados na síntese de péptidos em. fase 41 sólida. Após clivagem da resina e purificação por HPLC, foram obtidos glicopéptidos que ainda estavam protegidos na parte carbohidrato como derivados acilo. Foram efectuadas desprotecções completas utilizando catálise por base e os produtos foram purificados por HPLC. Os dados FAB-MS dos produtos estavam de acordo com os valores teóricos. SEQ ID NO: Péptidos utilizados para Comp conjugação são: .No. 4 KIASNENMDAMESSTLEC (16) (Db-restrito) 5 KIASNENMETME (17) (Db-restrito) 6 KASNENMETMC (18) (Db-restrito) 7 CASNENMETM (19) (Db-restrito) 8 CSGPSNTPPEI (20) (Db-restrito) 9 SGVENPGGYCLT (26) (Db-restrito) 21 ASNENhETM (32) (Db-restrito) 22 ASNhNMETM (33) (Db-restrito) 23 SGPSNhPPEI (34) (Dh-restrito) 24 SGPhNTPPEI (35) (Db-restrito) 13 CRGYVYQGL (36) (Kb-restrito) 14 CAPGNYPAL (37) (Kb-restrito) 25 RGYhYQGL (38) (Kb-restrito) 26 FAPGhYPAL (39) (Kb-restrito) SEQ ID NO: Outros exemplos de péptidos adequados para conjugação são: 10 KQIASNENMETMESC (Db-restrito) 11 KGPSNTPPEIC (Db-restrito) 12 KSGPSNTPPEIHC (Db-restrito) 3 GILGFVFTT, (HLA-A2-restrito) 15 MWKLGE FYNQMM (HLA-A2-restrito) 16 CPTNQQVVLEGTNKTD (HLA-A2-restrito) 17 MQIRGFVYFVET (HLA-A2-restrito) 18 LSPGMMMGMFNM (HLA-A2-restrito) (H= HOMOCISTEÍNA) 42 y

U t Métodos utilizados para preparação de qlicopéptidos Método A: Conjugação via espaçador 2-bromometilprop-2-en-ilo Um sedimento de 3-bromo-2-bromometilprop-l-il glicósido (10 μιηοΐ) θ fluoreto de N,N,N,N-tetrabutilamónio (40-100 pmol) em N,N-dimetilformamida (100 pL) foi agitado durante 10 min sob argon. 0 péptido (8 pmol) dissolvido em N,N-dimetilformamida (DMF) ou sulfóxido de dimetilo (DMSO) (200-1000 μΐι) foi adicionado e a mistura foi sonicada durante 5 min. e depois agitada durante 1,5-2,5 h. A reacção foi monitorizada por HPLC. A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizada. HPLC preparativa (acetonitrilo-água-ácido trifluoroacético a 0,1%) produziu os glicopéptidos esperados (ver Tabela 2). Método B; conjugação via espaçador 2-bromoetilo: 0 péptido (5 pmol) foi adicionado a um sedimento de 2-bromoetilglucósido (10 pmol) e carbonato de césio (20-100 pmol) em N,N-dimetilformamida (400 pL) sob argon. A mistura foi sonicada durante 5 min. e depois agitada durante 1-5 h. A reacção foi monitorizada por HPLC, diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizada. HPLC preparativa (acetonitrilo-água-ácido trifluoroacético a 0,1%) produziu os glicopéptidos esperados (ver Tabela 2).

Os péptidos e os glicopéptidos sintetizados estão presentes como sais trifluorometanossulfonato.

Adicionalmente ao método utilizando carbonato de césio como promotor, o péptido conjugado 24 foi também preparado de acordo com o método de Or et al., e as análises de HPLC de ambas as misturas de reacção revelaram um pico principal de um produto possuindo o mesmo tempo de retenção. No entanto, uma reacção 43 U ^—ξ· mais limpa e um produto mais facilmente purificado foi obtido com carbonato de césio como promotor.

Preparação de glicopéptidos, exemplos:

Conjugado 21

Um sedimento de 9 (2,9 mg, 3,4 μιηοΐ) e fluoreto de Ν,Ν,Ν,Ν-tetrabutilamónio (9,8 mg, 30,6 μπιοί) em N,N-dimetilformamida (35 μΐ) foi agitado durante 10 min sob argon. O péptido 16 (8,1 mg, 2,7 μπιοί) dissolvido em sulfóxido de dimetilo (350 μί) foi adicionado e a mistura foi sonicada durante 5 min. e depois agitada durante 1,5 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 40% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 20 min.). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizada. HPLC preparativa (acetonitrilo a 17% em ácido trifluoroacético a 0,1%) produziu o composto 21 (1 mg, 11%).

Tempos de retenção (separações analíticas): brometo alílico (de 9): 10,7 min.; 21; 14,2 min; 16:15,8 min.

Conjugado 22

Um sedimento de 9 (11 mg, 12,9 μπιοί) e fluoreto de Ν,Ν,Ν,Ν- tetrabutilamónio (37 mg, 116 μπιοί) em NN-dimetilformamida (130 μΐ) foi agitado durante 10 min sob argon. O péptido 17 (20 mg, 10,2 μπιοί) dissolvido em sulfóxido de dimetilo (750 μL) foi adicionado e a mistura foi sonicada durante 5 min. e depois agitada durante 2,5 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 40% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 20 min.). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizada. HPLC preparativa (acetonitrilo a 14% em ácido trifluoroacético a 0,1%) produziu o composto 22 (3 mg, 10%). 44

Tempos de retenção (separações analíticas): brometo alílico (de 9): 10,7 min.; 22: 13,0 min; 17:14,3 min.

Conjugado 23 0 composto 9 (13 mg, 15,5 μπιοί) foi tratado com fluoreto de N, N, N, N-tetrabutilamónio (39 mg, 124,0 μιηοΐ) em N,N- dimetilformamida (150 μΐ) e foi adicionado o péptido 18 (20 mg,

12,0 μπιοί) em sulfóxido de dimetilo (600 μΐί) e a mistura foi sonicada durante 5 min. e depois agitada durante 2,5 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 40% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 20 min.). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aguoso a 0,1% e liofilizada. HPLC preparativa (acetonitrilo a 12% em ácido trifluoroacético a 0,1%) produziu o composto 23 (8 mg, 29%).

Tempos de retenção (separações analíticas): 23: 12,2 min; 18: 13,5 min.

Conjugado 24 O péptido 19 (10 mg, 6,8 μπιοί) foi adicionado a um sedimento do composto 15 (10 mg, 13,6 μπιοί) e carbonato de césio (11,5, 35,2 μπιοί) em N,N-dimetilformamida (550 μΐ) sob argon. A mistura foi sonicada durante 5 min. e depois agitada durante 5 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aguoso a 0,1%, 30 min.). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aguoso a 0,1% e liofilizada. HPLC preparativa (gradiente de acetonitrilo de 12 a 15% em ácido trifluoroacético a 0,1%, 30 min.) produziu o conjugado 24 (8,5 mg, 59%) .

Tempos de retenção (separações analíticas): 15: 8,5 min; 24: 18 min.; 19: 19,3 min. 45

Preparação do conjugado 24 de acordo com o método de Or et al. (1991) : 0 composto 15 (8 mg, 10,5 μιηοΐ) e o péptido 19 (2 mg, 1,4 μπιοί) foram dissolvidos em Ν,Ν-dimetilformamida seca (400 pL) sob argon. A solução foi saturada com amónia e agitada durante 1.5 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min.) e mostrou um pico principal (52%) com o mesmo tempo de retenção (18 min) que o composto 24 preparado de acordo com o método B.

Conjugado 25

Foi adicionado péptido 20 (10 mg, 6,0 μπιοί) a um sedimento de composto 15 (9 mg, 12,0 μιηοΐ) e carbonato de césio (39 mg, 120 μπιοί) em Ν,Ν-dimetilformamida (500 pL) em árgon. A mistura foi sonicada durante 5 min e depois agitada durante 1 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizado. HPLC preparativa (gradiente de 13 a 18% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o composto 25 (14 mg, 60%) .

Tempos de retenção (preparações analíticas): 15: 8,7 min; 25: 20.5 min; 20: 21,7 min.

Conjugado 29 0 péptido 20 (20,5 mg, 12,3 pmol) foi adicionado a um sedimento do composto 28 (31,6 mg, 70,3 pmol) e carbonato de césio (110,3 mg, 338 pmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (1,6 mL) em árgon. A mistura foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizada. HPT.C preparativa (gradiente de 13 a 18% de acetonitrilo em ácido 46

trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o composto 29 (17,6 mg, 70%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,2 min; 29: 20,8 min; 20: 21,8 min.

Conjugado 30 O péptido 26 (10 mg, 6,5 μιηοΐ) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (800 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (11,7 mg, 26 pmol) e carbonato de césio (21,2 mg, 65 pmol). A mistura foi sonicada durante 5 min e depois agitada durante 2 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizada. HPLC preparativa (gradiente de 13 a 18% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o composto 30 (11,2 mg, 90%).

Tempos de retenção (preparações analíticas, gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 50 min): 28: 6,2 min; 30: 21,5 min; 26: 24,4 min.

Conjugado 31 0 péptido 19 (15 mg, 10 μτποί) foi dissolvido em N, N- dimetilformamida (1,2 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (18 mg, 40 μιηοΐ) e carbonato de césio (76,2 mg, 234 μπιοί) . A mistura foi sonicada durante 5 min e depois agitada durante 3 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min). A mi3tura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizada. HPLC preparativa (gradiente de 13 a 18% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o composto 31 (13,8 mg, 75%). 47

I

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,2 min; 31: 11.7 min; 19: 19,1 min.

Conjugado 40 0 péptido 38 (10 mg, 7,6 μπιοί) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (0,8 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (13,7 mg, 30,5 μπιοί) e carbonato de césio (24,8 mg, 76 μπιοί) . A mistura foi sonicada durante 30 min e depois agitada durante 1 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 40% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (16 mL) e liofilizada. HPLC preparativa (gradiente de 16 a 21% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o 40 (16,6 mg, 52%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,7 min; 40: 18.8 min, 38: 21 min.

Conjugado 41 0 péptido 39 (10 mg, 8 μπιοί) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (0,8 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (14,3 mg, 32 μπιοί) e carbonato de césio (27,6 mg, 85 μπιοί). A mistura foi sonicada durante 15 min e depois agitada durante 65 min. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 40% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) . A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (16 mL) e liofilizada. 0 produto bruto foi reunido com dois lotes adicionais preparados de forma análoga, a partir de 5 e 6 mg de péptido, respectivamente. A HPLC preparativa do material reunido (gradiente de 19 a 24% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o 41 (23,7 mg, 85%) . 48

U t

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,7 min; 41: 22,2 min; 39: 24,3 min.

Conjugado 42 0 péptido 36 (5 mg, 3,6 μιηοΐ) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (0,4 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (6,4 mg, 14,3 μιηοΐ) e carbonato de césio (11,6 mg, 35,7 μιηοΐ) . A mistura foi sonicada durante 5 min e depois agitada durante 2 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 17 a 22% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (8 mL) e liofilizada. HPLC preparativa (gradiente de 17 a 22% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o 42 (7,1 mg, 85%, pureza: 85%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,2 min; 42: 26.4 min; 36: 27,6 min.

Conjugado 43 O péptido 37 (10 mg, 7,35 pmol) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (0,8 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (13,2 mg, 29,4 pmol) e carbonato de césio (23,9 mg, 73.4 μιηοΐ) . A mistura foi monitorizada por HPLC (gradiente de 5 a 35% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (16 mL) e liofilizada. HPLC preparativa (gradiente de 17 a 22% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o conjugado 43 (9,3 mg, 73%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,2 min; 43: 24,6 min; 37: 25,9 min. 49

Conjugado 44 0 péptido 32 (10 mg, 8 μπιοί) foi dissolvido em N, N- dimetilformamida (0,8 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (14,5 mg, 32 μπιοί) e carbonato de césio (26 mg, 80 μπιοί) . A mistura foi sonicada durante 10 min e depois agitada durante 1 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aguoso a 0,1%, 30 min). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (16 mL) e liofilizada. 0 produto bruto foi reunido com um lote adicional, preparado de modo análogo, a partir de 10 mg de péptido. A HPLC preparativa do material reunido (gradiente de 7 a 12% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o 44 (14 mg, 54%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,2 min; 42: 14,6 min; 32: 16,8 min.

Conjugado 45 0 péptido 34 (10 mg, 6,8 μπιοί) foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (0,8 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (11,2 mg, 25 μπιοί) e carbonato de césio (20,2 mg, 62 μπιοί) . A mistura foi sonicada durante 10 min e depois agitada durante 2 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (16 mL) e liofilizada. HPLC preparativa (gradiente de 13 a 18% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o 45 (7,9 mg, 63%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,2 min; 45: 20,5 min; 34: 25,2 min. 50

I

Conjugado 4 6 0 péptido 35 (10 mg, 6,7 μιηοΐ) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (0,8 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (12,1 mg, 27 μιηοΐ) e carbonato de césio (43,7 mg, 134 μιηοΐ) . A mistura foi sonicada durante 20 min e depois agitada durante 4 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min). A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (16 mL) e liofilizada. HPLC preparativa (gradiente de 13 a 18% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o 46 (17,4 mg, 56%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,2 min; 46: 21,0 min; 35: 23,8 min.

Conjugado 47

0 péptido 33 (10 mg, 8 μιηοΐ) foi dissolvido em N, N-dimetilformamida (0,8 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 28 (14,5 mg, 32 pmol) e carbonato de césio (26 mg, 80 pmol). A mistura foi sonicada durante 10 min e depois agitada durante 1 h 55 min. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) . A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (16 mL) e liofilizada. O produto bruto foi reunido com dois lotes adicionais preparados de modo análogo, a partir de 5 e 10 mg de péptido, respectivamente. A HPLC preparativa do material reunido (gradiente de 10 a 15% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o conjugado 47 (18, 9 mg, 59%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 28: 6,2 min; 47: 18,3 min, 33:20,6 min. 51

Conjugado 4 9 0 péptido 26 (15 mg, 9,8 μπιοί) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (1,2 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 48 (23,8 mg, 39 jimol) e carbonato de césio (31,9 mg, 98 μπιοί) . A mistura foi sonicada durante 10 min e depois agitada durante 1 h 50 min. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) . A mistura foi diluida com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (24 mL) e liofilizada. A HPLC preparativa (gradiente de 13 a 18% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o conjugado 49 (17,8 mg, 88%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 48: 10,1 min; 49: 21,9 min, 26:14,4 min.

Conjugado 50 0 péptido 32 (15 mg, 21,1 pmol) foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (0,6 mL) e N,N-dimetilformamida (0,6 mL) em árgon. A mistura foi sonicada durante 1 min. Foram adicionados o composto 48 (29, 6 mg, 48 μπιοί) e carbonato de césio (39,4 mg, 121 μπιοί) . A mistura foi sonicada durante 15 min e depois agitada durante 1 h 50 min. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) . A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (24 mL) e liofilizada. 0 produto bruto foi reunido com um lote adicional preparado de modo análogo, a partir de 5 mg de péptido. A HPLC preparativa do material reunido (gradiente de 7 a 12% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o conjugado 50 (14,3 mg, 74%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 48: 10,1 min; 50: 15,2 min, 26: 16,8 min. I ^

Conjugado 51 0 péptido 19 (15 mg, 10 μπιοί) foi dissolvido em N,N- dimetilformamida (0,4 mL) em árgon. Foram adicionados o composto 55 (6 mg, 8,3 μπιοί) e carbonato de césio (56 mg, 172 μιηοΐ) . A mistura foi sonicada durante 10 min e depois agitada durante 2 h. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) . A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e liofilizada. A HPLC preparativa (gradiente de 10 a 14% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o conjugado 51 (8,2 mg, 45%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 55: 13,0 min; 52: 20,3 min, 19:21,3 min.

Conjugado 52 0 péptido 20 (5 mg, 3 μπιοί) foi dissolvido em N, N- dimetilformamida (0,4 mL) em árgon. Foram adicionados o composto

55 (4,3 mg, 6 μιηοΐ) e carbonato de césio (37 mg, 114 μπιοί) . A mistura foi sonicada durante 5 min e depois agitada durante 3 h 45 min. A reacção foi monitorizada por HPLC (gradiente de 0 a 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) . A mistura foi diluída com ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% (8 mL) e liofilizada. 0 produto bruto foi reunido com um lote adicional preparado de modo análogo, a partir de 5 mg de péptido. A HPLC preparativa do material reunido (gradiente de 13 a 18% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%, 30 min) produziu o conjugado 52 (9,3 mg, 65%).

Tempos de retenção (preparações analíticas): 55: 13,0 min; 52: 22,7 min, 20: 23,6 min. 53 ►

TABELA 2

Material de partida (Nos) Método Condições de reacção Produto isolado (No) Rendimento (%) Análise 9 + 15 A DMSO 1000 pL *, 1,5 h 21 11 HPLCc 9 + 17 A DMSO 750 μΐ· *, 2,5 h 22 10 HPLCc 9 + 18 A DMSO 500 pL a, 2,5 h 23 29 HPLC1·, [M+H]+1943“ 15 + 19 B DMF, 400 pi “· 5 # 24 59 HPLC", [M+HJ +1788“ 15 + 20 B DMF, 400 pl "Ί h 25 60 HPLCc, [M+H]+1761“ 28 + 20 B DMF, 1300 pL 3 h 29 70 HPLCc, [M+H]+1649° 28 + 26 B DMF, 615 pL 2 h 30 90 "hplcV [M+H]+1564“ 28 + 19 B DMF, 600 pL 3 h 31 75 HPLC“, [M+H]+1497u 28 + 38 B DMF, 525 pL " 1,5 h 40 52 HPLCc, [M+H]+1342“ 28 + 39 B DMF, 500 pL 1,3 h 41 86 HPLC“, [M+H]+1320“ 28 + 36 B DMF, 560 pL "'2,1 h 42 95 HPLCc, [M+H]+1416“ 28 + 37 B DMF, 545 pL 1,75 h 43 73 HPLCc, [M+H]+1273“ 28 + 32 B DMSO, 500 pL “, 1,2 h 44 54 HPLCc, [M+H]+1380“ 28 + 34 B DMF, 590 pL \ 2,2 h 45 63 HPLCc, [M+H]+1382“ 28 + 35 B DMF, 600 pL *, 4,3 h 46 56 HPLCc, [M+H]+1396“ 28 + 33 B DMSO, 500 pL “'2,1 h 47 59 HPLC“, [M+H]+1382“ 48 + 26 B DMF, 612 pL 2 h 49 88 HPLC“, [M+H]+1726“ 48 + 32 B DMSO + DMF (1:1), 495 pL b' 2,1 h 50 74 HPLC“, [M+H]+1542“ 55 + 19 DMF, 200 pL “, 2,2 h 51 45 HPLC“, [M+H]+1769“ 55 + 20 B DMF, 665 pL “· 3,8 h 52 65 HPLC“, [M+H]+1741“ a μL/10 mmol de péptido b μί/5 μmol de péptido c 0 produto apresentou, em todos os casos, movimento mais rápido do que o material de partida peptidico e movimento mais lento do que o material de partida carbohidrato. d Os resultados de FAB-EM estão de acordo com os valores teóricos. • 54 ΰ U,

2. INDUÇÃO PRIMÁRIA IN VIVO DE CTL ESPECÍFICOS PARA O VÍRUS, POR IMUNIZAÇÃO COM PÉPTIDOS SINTÉTICOS DE 9-MEROS 2.1 Métodos A indução primária in vivo de linfócitos T citotóxicos (CTL) por imunização com os novos conjugados da presente invenção pode ser realizada através de metodologia análoga à descrita abaixo para indução primária in vivo de CTL específicos para vírus, através de imunização com péptidos sintéticos de 9-meros. A vacinação de murganhos com péptidos sintéticos pré-processados, correspondendo a 9-meros endógenos produzidos em células infectadas pelo vírus da gripe A, resultou em respostas de CTL primárias forte. Os CTL gerados mataram eficazmente células alvo infectadas com o vírus, com preferência para estirpes virais possuindo as sequências de aminoácidos idênticas às dos péptidos utilizados para imunização. As condições óptimas para uma resposta de CTL primária in vivo foi obtida com 100 pg de péptido dissolvido em IFA e injectado s.c. na base da cauda. As células do baço que tinham sido iniciadas 7-10 dias antes foram re-estimuladas durante 5 dias in vitro, utilizando uma concentração de péptido óptima baixa (0,05 μΜ) e testadas contra células alvo infectadas com o vírus e tratadas com o péptido. Os CTL induzidos pelo péptido foram de classe I MHC e CD8 positivos. Péptidos O péptido ASNENMETM (designado como pep 9(PR8); SEQ ID NO:l) e asnenmdam (designado como pep 9(NT60); Resíduos 3-11 de SEQ ID NO: 4) são das estirpes do vírus da gripe A NP366-374, A/PR/8/34 e A/NT/60/68, respectivamente. Pep 9(PR8) foi sintetizado utilizando um sintetizador de péptidos Applied Biosystems 430A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Pep 9(NT60) foi 55 t Γ sintetizado através do "saco de chá" de fase sólida (Houghten, 1985; Sállberg, 1991). Todos os péptidos foram purificados através de HPLC de fase reversa e analisados guanto à sua composição em aminoácidos através de espectrometria de massa de desabsorção de plasma. As soluções de armazenamento dos péptidos foram preparadas em PBS e armazenadas a -20°C.

Imunização

Os murganhos foram imunizados através de uma injecção s.c. de 100 μς de cada um dos péptidos sintéticos dissolvidos em IFA, na base da cauda, ou através de uma injecção intravenosa de 20 HAU de virus da gripe A, diluido em PBS e utilizado entre 1-2 semanas após a administração.

Geração in vitro de CTL específicos para o virus da gripe A Foram preparadas numa suspensão celular células imunes do baço. Os glóbulos vermelhos foram lisados utilizando tampão de lise consistindo em NH4CI 8,29 g, KHCO3 1,0 g, EDTA 0,0372 g, por 1 L de água destilada (pH 7,4). Foram co-cultivadas 25 x 106 células do baço, de resposta, de murganhos iniciados in vivo, com 25 x 106 células do baço singeneicas irradiadas (2000 rad), ou infectadas pelo virus da gripe A, ou na presença de péptidos a 0,05, 0,5 e 5 μΜ, em frascos de cultura de 50 mL (Costar, Cambridge, MA), com 10 mL de meio completo durante 5 dias a 37°C em ar humidificado com C02 a 5,3%.

Ensaio de citotoxicidade

Como previamente descrito (Jondal, 1975), as células alvo infectadas com vírus ou revestidas com péptido, foram preparadas infectando 2 x 106 células coui virus 320 HAU, durante 1,5 h ou incubadas com péptidos a 50 μΜ, durante 1,5 h a 37°C, respectivamente. Após lavagem, as células foram marcadas com 100-200 μΟϊ de Na251Cr04 durante 1 h. As células foram lavadas duas vezes e foram adicionadas 104 células alvo em 50 pL, a 100 56 μί de números variáveis de células efectoras, que tinham sido lavadas três vezes antes do ensaio, em 150 μί de meio completo, em placas de 96 poços de fundo em V e foram incubadas durante 4 h a 37°C, CO2 a 5,3%. Após incubação, os 50 μΐ, de sobrenadante foram recolhidos e a percentagem de libertação de 51Cr específico foi calculada através da fórmula: % de libertação específica=(experimental-espontânea)/(máxima- espontânea) cpm. A libertação espontânea foi sempre menor que 15%. 2.2. Resultados

Indução primária in vivo de CTL específicos para o vírus da anti-gripe A, com 9-meros.

Como previamente relatado (Townsend et ai., 1985,1986), CTL induzidos com vírus da gripe A vivos, em murganhos H-2b são principalmente dirigidos contra o epitopo imunodominante NP365-380. Inicialmente tentámos imunizar murganhos com o péptido NP365-380, derivado de ambas as estirpes PR8 e NT60, para induzir respostas de CTL, de acordo com um protocolo descrito por Alchele et al, (1990) . Contudo, foi observado um nível insignificante da actividade de matar tanto contra as células revestidas com péptido como as infectadas com vírus apesar de reforços repetidos. Em vez disso, quando foram utilizados 100 μg do pep 9(PR8) mais pequeno para injecção s.c. e as células do baço foram re-estimuladas com pep 9(PR8) a 5 μΜ in vitro, surgiu uma resposta de CTL forte, contra RMA revestido com pep 9(PR8) (não apresentado) e células EL4, embora as células alvo infectadas com vírus não tenham sido mortas (Tabela 3) . Quando foi utilizada uma concentração mais baixa de pep 9(PR8) para re-estimulação in vitro, os CTL gerados possuíam uma actividade para matar mais elevada contra células alvo revestidas com pep 9(PR8) e as células infectadas com vírus também foram lisadas (Tabela 3) . Como apresentado na Tabela 3, a dose óptima para .imunização foi de 100 μg e para re-est.imulaç.ão foi de 5 ou 0,05 L· μΜ. A imunização com 10 pg e 1 μ9 geraram uma resposta menor, ou nenhuma resposta, de CTL. 0 péptido dissolvido em adjuvante completo de Freunds (CFA) ou PBS não produziu resposta. A injecção intravenosa de péptidos também não gerou uma resposta primária de CTL in vivo (não apresentado).

Outro 9-mero derivado de NT 60 originou respostas anti-péptido e anti-viral mais fortes, como apresentado na Fig. 3.

Especificidade de CTL induzidos por pep 9(PR8) e pep 9(NT60) À luz destes resultados investigámos a especificidade fina dos CTL gerados em relação a pep 9(PR8) e pep (NT60). Os CTL mataram preferencialmente as suas células correspondentes revestidas por péptido e infectadas por virus (Fig. 4). Os CTL apresentaram uma reactividade cruzada mais elevada com células revestidas com péptido do que com células alvo infectadas por virus.

Respostas de CTL a virus vivos ou péptidos

Foram iniciados murganhos com virus PR8 vivos e as células imunes do baço foram re-estimuladas ou com células estimuladoras infectadas por virus (Fig. 5A) ou células do baço singeneicas normais, na presença de pep 9(PR8) a 0,05 μΜ (Fig. 5B) . Os CTL iniciados in vivo com virus vivo e re-estimulados com baixa concentração de pep 9(PR8) possuíam uma capacidade notável para reconhecer tanto células infectadas por virus como células revestidas por péptido (Fig 5B) . Deve notar-se que a quantidade baixa de péptido de re-estimulação foi suficiente para estimular CTL iniciados por vírus in vitro e possuía a mesma potência que a de células infectadas por vírus.

Quando foi utilizado pep 9(PR8) para iniciação in vivo e células infectadas por vírus ou pep 9(PR8) para re-estimulação in vitro (Fig 5C e D), as respostas de CTL foram geradas contra ambas as células, revestidas por péptido e infectadas por vírus. O vírus 58

I (

V vivo possuía uma eficiência mais elevada para iniciar CTL do que o péptido livre.

Curso de tempo de actividade de CTL após imunização com pep 9(PR8)

De modo a determinar a cinética da actividade de CTL após imunização com pep 9(PR8), os murganhos foram iniciados uma vez com pep 9(PR8). As células do baço de animais imunizados foram re-estimuladas in vitro 2-30 dias após imunização com pep 9(PR8) e ensaiadas quanto a actividade de CTL. A actividade de CTL contra células alvo RMA revestidas com pep 9(PR8) alcançou um pico 7 dias após a imunização e a actividade baixou gradualmente posteriormente (Fig. 6). No dia 30 após a iniciação, podia ainda ser detectado um nível mais baixo de actividade de CTL.

A citotoxicidade induzida por péptido in vivo é mediada por CD8* e classe I-restringida de MHC

Como apresentado na Fig. 7a, CTL induzidos por pep 9(PR8) empobrecidos em células T CD8+ não conseguiram lisar células EL4 revestidas com pep 9(PR8). Por outro lado, o empobrecimento de células T CD4+ não afectou a actividade citolítica contra células alvo revestidas com pep 9(PR8). Assim, CTL específico para pep 9(PR8) expressam o fenótipo CD4” CD8+.

Os CTL iniciados por péptido in vivo de origem C57B6/J (H-2b) foram testados em células alvo EL4 (H-2b) singeneicas, P815 (H- 2d) e L929 (H-2k) alogeneicas, infectadas com a estirpe PR8 da gripe. Como a Fig. 7b demonstra, existe uma especificidade de restrição clara para células alvo H-2b. TABELA 3

Actividade de CTL induzida por doses diferentes de péptidos para iniciação in vivo e re-estimulação in vitro. 59 í l - u Dose de iniciação (ng> Dose de re-estimulação (μΜ) Não tratado Lise de EL4 alvo (%) 40:1' 20:1 Infectada PR8 Revestida pep 9(PR8) 40:1 20:1 40:1 20:1 100 5,00 4,61 4,21 7,00 8,50 43,68 34,73 0,05 0,12 0,51 30,76 30,07 59, 42 50,73 10 5,00 5,63 4,19 15,04 13,98 23,54 22,09 0,05 5,74 4,14 31,19 23,75 45,52 34,60 1 5,00 3,34 2,66 6,88 5,54 11,85 9,28 0,05 4,08 3,32 12,43 10,50 16,44 15,54

Taxa de efector:alvo

3. PÉPTIDOS DE LIGAÇÃO A MHC-1 EXTERNOS SÃO RECICLADOS PARA A SUPERFÍCIE CELULAR APÓS INTERNALIZAÇÃO

Os péptidos externos que se ligam a MHC-1 são conhecidos como regulando positivamente a expressão do elemento de restrição correspondente, na presença de B2-M (Otten et al., 1992). Esta resposta de regulação in vitro correlaciona-se com a imunogenicidade de péptidos, in vivo. Como verificámos que o inibidor endossomal cloroquina inibe esta regulação (Figura 8), é possível que este processo requeira internalização do péptido e reciclagem da membrana. Em apoio a este modelo, um número de estudos mais recentes verificaram a internalização de MHC-1, através de buracos revestidos com quelatrina, e também reciclagem de MHC-1.

Para estudar a possível reciclagem de péptidos externos de ligação a MHC-1 são sintetizados dois péptidos de ligação a Db, que representaram epitopos imunodominantes na proteína EIA de adenovírus (sequência SGPSNTPPEI; SEQ ID NO:2) e na nucleoproteína do vírus da gripe A (PR8) (sequência ASNENMETM; SEQ ID N0:1). Foi adicionada cisteína ao terminal amino ou carboxilo, como um sítio de acoplamento bioquímico para o 60 1 .

\ι marcador molecular galabios (Gal-Gal), para o qual estava disponível um anticorpo monoclonal (MC2101) (Brodin et al. 1988). Como relatado anteriormente, a adição de cisteína ao terminal amino não repeliu a capacidade de regulação de Db, ou a imunogenicidade in vivo do péptido (Zhou et al., 1992b). A adição de galabios no mesmo sítio, gerou glicopéptidos que eram fortemente reconhecidos pelo anticorpo monoclonal específico contra galabios MC2101 num teste de ELISA (Tabela 4). 0 péptido Gal2-CSG11 (conjugado 29) reagiu de modo mais forte do que o péptido GAL2-CAS10. Para verificar que o galabios adicional não alterou a capacidade de ligação a Db ou a imunogenicidade in vivo, ambos os glicopéptidos foram testados quanto à regulação de Db in vitro e quanto à imunogenicidade in vivo. A regulação Db foi semelhante com glicopéptidos, em comparação aos péptidos isoladamente (resultados não apresentados). Os CTLs gerados por injecção in vivo e re-estimulação in vitro com glicopéptidos foram estritamente específicos para o péptido e não reconheceram Gal2 quando apresentados por outro péptido de um modo cruzado (Figura 9) . Destes resultados concluímos que Gal2, nos glicopéptidos, actuaram como um marcador inerte.

Para permitir uma ligação máxima de glicopéptidos externos a moléculas Db de membrana, foram utilizadas células RMA-S mutantes. Estas células são inerentemente deficientes no transporte de péptidos processados do citossol para o compartimento do RE, pela perda do sistema transportador do péptido Tap-2. Como uma consequência, as células RMA-S expressam uma fracção mais elevada de moléculas sem Db, do que células não mutantes, na superfície celular. A expressão destas moléculas sem Db pode ser ainda aumentada através de temperatura baixa (26°C) e estabilizada através da adição de péptidos de ligação a Db a 37°C (Figura 3) . Assim, através do tratamento de células RMA-S induzidas com temperatura baixa, com uma concentração elevada de glicopéptidos, na presença de B2-M, uma fracção grande 61 ϊ\ι I . L—Ό

t de moléculas Db de membrana ficaram saturadas com o mesmo, glicopéptido idêntico. As células RMA-S tratadas deste modo são claramente coradas com o anticorpo MC2101 (Figura 10) , demonstrando expressão de membrana do epitopo Gal2, presumivelmente sob a forma de glicopéptido ligado a MHC-1.

Através de tratamento com pronase, toda a expressão de Db e de Gal2 é removida destas células (Figura 10) . Se estas células forem então transferidas para 37°C e incubadas durante 1 hora, tanto a expressão de Db como de Gal2 regressam à superfície celular (Figura 10) . 0 regresso do epitopo Gal2 foi inibido por cloroquina (dados não apresentados). Como a via de apresentação convencional de MHC-1 não é funcional em células RMA-S e consequentemente os péptidos citossólicos não são transportados para o compartimento do RE, os resultados indicam fortemente reciclagem endossomal dos glicopéptidos de ligação a Db. Foram obtidos resultados semelhantes com o glicopéptido Gal2-CAS10 (não apresentados).

Para verificar estes resultados, a um nível funcional, foram criados CTLs específicos para (PR8) da gripe A, e testados contra células alvo RMA-S e EL-4 tratadas com um péptido (ASNENMETM) correspondente ao epitopo alvo no glicopéptido Gal-2-CAS10 (conjugado 31) . Ambas as células alvo foram severamente mortas, como relatado anteriormente (Rõtzshke et al., 1990) (Figura 11) . 0 tratamento com pronase destas células alvo tratadas com péptido, removeu a maior parte da expressão de Db e a maior parte da sensibilidade a CTLs específicos (Figura 11). A incubação de células tratadas com pronase a 37°C, para permitir a re-expressão de ambos os Db e péptidos associados, resultou num reaparecimento da sensibilidade à morte de CTL. Este reaparecimento foi mais rápido e mais extenso com células RMA-S, em comparação com células EL-4, e foi bloqueado por anticorpos monoclonais anti-Db e por cloroquina (resultados não apresentados). 62 Γ u

Interpretamos estes resultados como significando que péptidos ligados a MHC-1 se reciclam através de um compartimento intracelular semelhante a endossomas precoces em células T. Possivelmente, este mecanismo pode permitir que ocorra troca de péptidos, de modo a optimizar a expressão de péptidos de membrana. Hochman et al. (1991) demonstraram que as moléculas de MHC de classe I sofrem modificações conformacionais num compartimento endossomal, indicando que B2-M entra e sai da cadeia pesada. Assim, o pH baixo que provoca este efeito, pode também permitir que esta troca de péptido ocorra. Em apoio a esta noção, Harding (1992) relatou recentemente que a apresentação de MHC-1 pode ser bloqueada através de hipotermia e aminas básicas fracas, utilizando electroporação de antigénio exógeno.

As moléculas MHC-1 são conhecidas por se ligarem a péptidos de comprimento óptimo, com uma afinidade muito mais elevada, em comparação com péptidos ligeiramente mais compridos, um fenómeno que se reflecte num número de ensaios in vitro. Estes incluem regulação de MHC-1, sensibilização de células alvo a CTL específicos, ligação directa de péptido a cadeias de classe I vazias, em células mutantes, associação de MHC-1 induzida pelo péptido em lisados de células mutantes e medições de taxas de péptidos ligados de MHC-1. Esta afinidade mais elevada de péptidos de comprimento óptimo pode estar relacionada com um encaixe perfeito na ranhura de ligação ao péptido das cadeias de classe I, já que esta ranhura está fechada em ambas as extremidades (Madden et al., 1991). Assim, o péptido de tamanho óptimo pode formar um complexo trimérico péptido-cadeia pesada B2-M, que c maio provável que 3eja reciclado em endossomas, em comparação com complexos consistindo em péptidos mais compridos.

Em células T alvo, a reciclagem de péptidos óptimos ligados a MHC-1, pode permitir um reconhecimento mais eficiente através de 63 f u CTLs correspondentes, específicos, como no presente trabalho. Até agora, a maior parte das demonstrações para a reciclagem de MHC-1 têm sido obtidas em células T. Contudo, se mecanismos semelhantes operarem em certas células apresentando antigénio, a construção de péptidos óptimos, a nível de membrana, pode também ser importante no braço aferente da resposta imune. Em particular, células dendríticas, conhecidas como sendo cruciais para a criação de CTL, tanto in vivo como in vitro, deviam ser investigadas neste aspecto. A correlação existente entre a capacidade dos péptidos em regular a expressão de MHC-1 in vitro e a sua imunogenicidade in vivo sugere que este possa ser um mecanismo importante na resposta celular. TABELA 4

Reconhecimento de glicopéptidos Gal2 pelo anticorpo monoclonal MC2101 em ensaio ELISA. índice de absorvância Anticorpo Especificidade G3l2- CSG11 CSG-11 Gcll2 — CASIO CAS-10 MC2101 Galabios Gal-Gal 1,86 0,01 0,41 0,02 Pk002 Globotriaosil Gal-Gal-Glc (CD77) 0,04 0,08 0,04 0,01

Os péptidos (50 pg/mL) foram diluídos em tampão carbonato a 0,05 M (pH 9,6) e foi adicionado 100 pL/poço a microplacas Costar de fundo achatado (cat. No 3590) para incubação durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas uma vez com PBS, pré-incubadas com PBS a 0,5% durante 30 minutos à temperatura ambiente e lavadas duas vezes com tampão PBS/Tween a 0,05%. Os anticorpos monoclonais foram diluídos em gelatina a 0,5%/PBS/Tween a 0,05%, adicionados a microplacas e incubados durante 2 horas à temperatura ambiente e lavados com PBS/Tween através de pequenas pancadas na microplaca. Imunoglobulinas de coelho anti-murganho conjugadas com fosfatase alcalina (Dakopatts, código No S 414) 64

foram diluídas 1/1000 em PBS/Tween e adicionadas a 100 pL/poço. Após 2 horas de incubação à temperatura ambiente e 4 lavagens com PBS/Tween, foram adicionados 100 μΐ, de solução de substrato de fosfatase alcalina. As placas foram medidas após 2 horas à temperatura ambiente, utilizando um Multiskan System (Lab eystems), para densidade óptica a 405 nm. 4. CRIAÇÃO DE UMA RESPOSTA DE CTL ESPECÍFICA PARA CARBOHIDRATO ATRAVÉS DE VACINAÇÃO COM UM GLICOPÉPTIDO QUE POSSUI A PARTE DE CARBOHIDRATO NUMA POSIÇÃO IMUNOGÉNICA INTERNA. O carbohidrato galabiose (Gal-a-4Gal também referido como Gal2> foi acoplado a uma cisteína interna (posição 10) no péptido de 12-meros SGVENPGGYCLT (SEQ ID NO:9), que representa um epitopo de CTL imunodominante restrito a H2-Db no vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV) (Oldstone et ai., 1988). O glicopéptido foi denominado SGV12-Gal2 (conjugado 30; Figura 12) . O acoplamento foi realizado a um grupo tiol, utilizando ligação S, como descrito no Exemplo 1.

Os murganhos foram imunizados com o glicopéptido SGV12-Gal2, como descrito no Exemplo 2 e em Zhou et al. (1992a) . Após re-estimulação in vitro com o mesmo glicopéptido SGV12-Gal2, as células T citotóxicas criadas foram testadas contra células EL-4 positivas para H2-Db e Kb, revestidas com os seguintes péptidos e glicopéptidos: 1. SGVENPGGYCLT (SGV12; SEQ ID NO:9) 2. SGV12-Gal2 3. ASNENSETM (ASN9; SEQ ID NO:l) com Gal2 ligado a S na posição 6. (ASN9-6S-Gal2)

4. ASN9-6S 5. CSG11-Gal2 (ver Exemplo 3 e Figura 9) 6. CSGPSNTPPEI (CSG11; SEQ ID NO:8) 65 ί ^ )^·-Ç» 7. CRG9 com Gal2 ligado a C na posição 1 (CRG-Gal2) 8. CRGYVYQGL (CRG9; SEQ ID NO:13)

Os péptidos 1-6 são conhecidos, modificados os epitopos de células T ligados a Db, e ligam-se a células RMA-S, como medido por regulação de Db in vitro (rceultado3 não apresentados) . Os péptidos 7-8 representam um epitopo Kb conhecido (RGYVYQGL; SEQ ID NO:27), e ambos os péptidos regulam Kb em células RMA-S (resultados não apresentados). A expressão do epitopo Gal2 foi medido por FACS na superfície de células que têm glicopéptidos ligados. Verificou-se uma expressão de Gal2 elevada com os glicopéptidos 2, 5 e 7 (resultados não apresentados). 0 glicopéptido 3 não foi reconhecido pelos anticorpos monoclonais anti-Gal2, quando ligados a células RMA-S. A conclusão foi de que os glicopéptidos 5 e 7 expressaram o mesmo epitopo Gal2 como o imunogénio SGV12-Gal2 em diferentes péptidos transportadores. 0 glicopéptido CSG11-Gal2 foi ligado a Db e o glicopéptido CRG9-Gal2 a Kb. Assim, o único epitopo que é partilhado entre os glicopéptidos 2, 5 e 7 é Gal2.

Quando as células CTL geradas por SGV12-Gal2 foram testadas contra células EL-4 revestidas com os péptidos e glicopéptidos acima descritos, verificou-se que as células alvo revestidas com os glicopéptidos 2 e 5 foram mortas, e também, a um nível mais baixo, as células alvo revestidas com o glicopéptido 7 (Figura 13) . Assim, as células CTL geradas não reconheceram o péptido transportador isolado (SGV12), ou os outros péptidos controlo, incluindo o glicopéptido 3 (que não expressa o epitopo Gal2 ao nível da superfície celular).

Dos resultados acima, conclui-se que a imunização com o glicopéptido SGV12-Gal2, gera uma resposta de. células T específica para Gal2. A razão para isto pode ser devida à parte de carbohidrato de Gal2 estar orientada numa posição óptima para 66 I" li ' 0 reconhecimento de células T. A morte mais elevada de células alvo revestidas com o glicopéptido 5, em comparação com as células alvo revestidas com o glicopéptido 7, pode ser devida ao facto de o glicopéptido 5 ser apresentado por cadeias de classe 1 Db e o glicopéptido 7 por cadeias de classe I Kb.

Noutro conjunto de experiências (adoptando o mesmo protocolo que o descrito acima) foram imunizados murganhos com o glicopéptido RGY8-4h-Gal2 ("RGY8" representa o octapéptido RGYVYQGL; 4h indica que V na posição 4 é substituída por homoserina; Gal2 indica a conjugação do Gal2 do açúcar com o hidroxilo da homoserina). Como nas experiências descritas em referência à Figura 13, as células CTL geradas por RGY8-4h-Gal2 resultantes, foram testadas contra células EL-4 revestidas com RGY8-4h-Gal2 e RGY8-4h.

Dos resultados apresentados na Figura 14(A) pode ser observado que são geradas células CTL específicas tanto para o péptido como para o glicopéptido.

Quando esta população heterogénea de células efectoras foi testada contra células EL-4 revestidas com Gal2 noutro péptido transportador (SGV12-Gal2) e no péptido SGV12 per se (Figura 14(B)), apenas foram mortas as células revestidas com glicopéptido.

Este efeito prova que as CTLs possuem especificidade para Gal2 por testes cruzados (ver a secção denominada "Sistema de Teste Experimental", acima).

Os resultados aqui apresentados podem ser sumarizados nas seguintes Tabelas 5 e 6. 67 L· t TABELA 5

Análise de péptidos e gli copéptidos de ligação a Kb Péptido ELISA Reg Expressão Imunogénico Especificidade MHC- na P G GP 1 membrana Gal2-CAP9 l + “ + + FAP9-5h-Gal2 + + + + Gal2-CRG9 + - + + + RGY8-4h-Gal2 + + + + + + Péptido Imunogénico Comentários CAP9 (SEQ ID NO:14) + FAP9 (SEQ ID NO:20) + Forte, com reactividade elevada a FAP9-5h FAP9-5h (SEQ ID NO:26) + Mais fraco, baixa reactividade a FAP9 CEG9 (SEQ ID NO:13) + RGY8 (SEQ ID NO:27) RGY8-4h (SEQ ID NO:25) + + Alguma reactividade a RGY8-4h Forte, com reactividade a RGY8 68 \

TABELA 6

Análise de glicopéptidos e péptidos de ligação a Dd Péptido ELISA Reg. Membrana Imuno- Especificidade 7,4 9,6 MHC-1 Expressão reciclagem génico P G GP Gal2-CAS10 + + + + + + GM3-CAS10 - GM3-lactamo-CASlU tóx ASN9-6h-Gal2 + - + + + + + ASN9-6S-Gal2 - + - - ASN9-4S-Gal2 ( + ) - - Gal2-CSG11 + + + + + + GM3-CSG11 - GM3-lactarao-CSGll + + SGP10-6h-Gal2 + + + + + - SGP10-6S-Gal2 - + - - SGP10-4S-Gal2 ( + ) - - - SGV12-Gal2 + + + + + Péptido Iraunogénico CASIO (SEQ ID NO: 7) + ASN9 (SEQ ID NO: 1) + ASN9-6h ASN9-6S ASN9-4S (SEQ ID NO:21) - CSG11 (SEQ ID NO: 8) + SGP10 (SEQ ID NO: 2) + SGP10-6h SGP10-6S SGP10-4S (SEQ ID NO:23) + 69

Nota sobre os ensaios (Tabelas 5 e 6):

ELISA 0 ensaio de ELISA foi realizado como descrito em relação à Tabela 4.

Regulação de MHC-1

Como acima descrito em relação à Fig 8 e à Fig 10A, o principio é de que os péptidos se podem ligar a cadeias pesadas de MHC-1 vazias, na superfície celular nas células que apresentam antigénio, e isto conduz a uma estabilização e regulação da cadeia de MHC-1 correspondente.

Expressão de membrana

Quando o glicopéptido se liga a MHC-1, na superfície da célula, a expressão (e acessibilidade) da parte CHO correspondente pode ser detectada através de coloração do anticorpo em FACS, como acima descrito em relação às Fig 10C e E.

Reciclagem de membrana Descrito nas Fig 10D e F.

Imunogenicidade

Os murganhos são imunizados com glicopéptidos e aqui descritos e células CTL re-estimuladas in vitro são testadas em relação à morte de células alvo revestidas com glicopéptidos e péptidos diferentes. A especificidade P significa que as células CTL reconhecem apenas a parte do péptido, G apenas a parte CHO e GP apenas a combinação. 70

/= BREVE DESCRIÇAO DAS FIGURAS Figura 1

Estrutura química dos compostos 1-15, descritos na secção "Síntese dos glicósidos braços de espaçador"

Figura 2

Estrutura química de produtos de glicopéptidos 21-25, descritos na secção "Síntese de glicopéptidos".

Figura 3 CTL induzidas por pep9(NT60) lisaram mais eficientemente células EL4 específicas para o vírus e revestidas com péptido com pep9(NT60) a 0,05 μΜ utilizado para re-estimulação do que com 5 μΜ e 0,5 μΜ. Foram geradas CTL através de uma injecção s.c. de 100 μg de pep 9(NT60). As células imunes do baço foram re-estimuladas com células do baço singeneicas irradiadas, na presença de pep 9(NT60) (A), 5 μΜ; (B) , 0,5 μΜ e (C) , 0,05 μΜ durante 5 dias e testadas contra EL4 não tratadas (O-O), infectadas com NT60 (·—·), revestidas com pep 9(NT60) (J—J) .

Figura 4

Especificidade de CTL induzidas por pep 9(PR8) (A) e pep 9(NT60) (B) . As CTL efectoras foram testadas contra EL4 não tratadas (0-0), infectadas com PR8 (·—·), infectadas com NT-60 (J—J) , revestidas com pep 9(PR8) ('-'), revestidas com pep 9(NT60) (Δ-Δ) .

Figura 5

Respostas de CTL iniciadas e re-estimuladas com vírus vivo e péptidos. Foram iniciados murganhos in vivo com vírus PR8 vivo (A,B) ou pep 9(PR8) (C,D) e re-estimulados com células do baço infectadas com PR8 (A,C) ou células de baço irradiadas, na presença de pep 9(PR8) a 0,05 μΜ (B, D) . As células alvo foram 71

EL4 não tratadas (0-0), infectadas com PR8 (·—·), revestidas com pep 9 (PR8) {)-)).

Figura 6

Cinética de actividade de CTL induzida por uma injecção s.c. de pep 9(PR8) . 03 murganhos foram iniciados com 100 de pep 9(PR8) in vivo e re-estimulados in vitro com pep 9(PR8) a 5 μΜ aos dias 2, 7, 10, 20 e 30 após iniciação. As CTL geradas foram testadas contra RMA não tratadas (0-0) e revestidas com pep 9(PR8) (·-·). Taxa efector:alvo, 60:1. •

Figura 7 A citotoxicidade induzida por péptido é mediada por células T restritas a CD8+ e H-2Db, a: as CTL foram induzidas por pep 9(PR8). Números iguais de CTL foram então empobrecidos em relação a células T CD4+ e CD8+, utilizando o sistema Dynabeads. As células restantes foram então testadas quanto à actividade litica contra células EL4 revestidas com pep 9(PR8). Foram testadas CTL não tratadas (0-0), empobrecidas em CD4+ (·—·) e empobrecidas em CD8+ (J—J) quanto à actividade litica contra células EL4 revestidas com pep 9(PR8). b: foram testadas CTL induzidas por pep 9(PR8) contra EL4 infectadas com PR8 (O-O), P815 infectadas com PR8 (·—·) e L929 infectadas com PR8(J—J) .

Figura 8 A regulação de H-2Db mediada por péptido pode ser inibida por cloroquina. As células de RMA-S foram incubadas com o péptido da gripe A (PR8) NP366-374 (50 μΜ) na presença ou ausência de cloroquina durante 6 h. Após incubação, as células foram lavadas, coradas com anticorpo monoclonal anti-Db (28-14-8S) em gelo durante 30 minutos, lavadas e incubadas com (F(ab')2-FITC anti-murganho de coelho (F313, Dako, Copenhaga, Dinamarca) durante 30 minutos. As células coradas foram fixadas com 72

formaldeído a 1% e analisadas num citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson; Mountain View, CA).

Figura 9 Síntese de glicoproteínas (A e C) . As glicoproteínas foram sintetizadas acoplando 2-bromoetil 4-0-(a-D-galactopiranosil)-β-D galactopiranósido (composto 28) com péptidos contendo uma função tiol. Foi adicionada uma parte cisteína à sequência peptídica nativa no terminal amino. Utilizando carbonato de césio como um promotor, a propriedade nucleofílica do átomo de enxofre da cisteína foi utilizada para criar uma ligação tioéter entre o péptido e o braço do espaçador electrofílico ligado por glicosilação à parte de carbohidrato. As reacções de acoplamento de Gal2 foram realizadas em Ν,Ν-dimetilformamida. As reacções de acoplamento foram monitorizadas por HPLC e foram interrompidas através da adição de água contendo ácido trifluoroacético a 0,1%. Os glicopéptidos resultantes (conjugados 29 (A) e 31(0) foram purificados através de HPLC preparativa e os pesos moleculares dos produtos foram confirmados por EM FAB.

Ensaio de CTL. (B e D). Os murganhos foram imunizados s.c. na base da cauda com 100 μq de glicopéptido em Adjuvante incompleto de Freund. Dez dias após a iniciação as células do baço foram re-estimuladas in vitro utilizando 25 x 106 células de resposta co-cultivadas com 25 x 106 células de baço singeneicas irradiadas (2500 rad). A re-estimulação foi realizada na presença de glicopéptidos a 0,05 μΜ em frascos de cultura de tecidos de 50 mL com RPMI/FCS a 10% a 37°C durante cinco dias. As células alvo RMA-S foram revestidas com péptido a 50 μΜ durante 1 hora a 37°C e lavadas. As células foram marcadas com 100 μοί de Na251crc>4 durante uma hora a 37 °C e lavadas duas vezes. Os linfócitos efectores foram separados por centrifugação Lymphoprep e testados à diferentes taxas com 5000 células alvo marcadas com 51Cr, utilizando Ί 50 pL/poço em poços de microtitulação em forma 73 Γ u de v. As microplacas foram centrifugadas a 300 g e incubadas durante 4 horas a 37°C. Após incubação as placas foram centrifugadas novamente e foram ensaiados sobrenadantes de 50 μΙ> num contador de cintilações gama.

Figura 10

Painel A: Foram incubadas células RMA-s durante 24 horas a 26°C para induzir expressão de cadeias de MHC-1 Db vazias na superfície da célula e a 37°C, e coradas para expressão de Db. Painel B: Remoção de expressão de Db por tratamento de pronase de células RMA-S, pré-incubadas a 26°C. Tratamento com pronase durante 2 h e 4 h. A remoção de Db está completa às 4 h. Painéis C e E: as células RMA-S induzidas a 26°C foram tratadas com os glicopéptidos Gal2-CSG11 (painel C) ou GalaCASlO (painel E) , a 300 μΜ durante 2 h a 37°C, lavadas e coradas para expressão de Gal2. Painéis D e F: As células RMA-S tratadas com glicopéptido como nos painéis C e E foram tratadas com pronase para remover Db e a expressão de glicopéptido, lavadas e depois incubadas a 37 °C para permitir a re-expressão de glicopéptidos e coradas para expressão de Gal2.

Figura 11

Re-expressão de péptido ligado a Db em células EL4 (A) e RMA-S (B) após tratamento com pronase como detectado por CTL específicas. As células EL(4) e RMA-S (B) foram tratadas com o péptido NP366-374 (100 μΜ) durante 1,5 horas. Após lavagem, as células foram tratadas com Pronase E (ProE, 4 mg/mL em RPMI1640), lavadas e cultivadas a 37°C durante 0, 1 e 3 horas e ensaiadas num ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas. A preparação de CTL foi descrita anteriormente (Zhou et al., 1882 b). Resumindo. Murganhos fêmeas C57B6/J foram imunizados através de uma injecção i.v. de 20 HAU de vírus da gripe A/PR/8/34 (uma oferta do Dr. A. Douglas, National Institute for Medicai Research, Londres) diluído em PBS. 1-4 semanas apÓ3 a imunização 74 Γ as células de baço foram re-estimuladas com células de baço singeneicas irradiadas, infectadas com vírus, durante 5 dias.

Figura 12 0 glicopéptido SGV12-Gal2 (conjugado 30), utilizado para gerar uma resposta de CTL específica para carbohidrato (cf. Exemplo 4) .

Figura 13 Células CTL geradas por SGV12-Gal2 foram testadas contra células EL-4 revestidas com péptidos/glicopéptidos, como indicado no painel. E/T, taxa efector:alvo.

Figura 14(A) e (B)

As células CTL geradas por RGY8-4h-Gal2 foram testadas contra células EL-4 revestidas com os péptidos/glicopéptidos indicados. E/T, taxa efector:alvo. 75

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Zhou et al (1992 b), Eur. J. Immunol. 22, 3085-3090. (Publicado em Novembro de 1992). 79 tf L-Cj t LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL) (i) REQUERENTE: (A) NOME: AB ASTRA (B) RUA: Kvarnbergagatan 16 (C) CIDADE: Sodertalje (E) PAÍS: Suécia (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): S-151 85 (G) TELEFONE: +46-8-55 32 60 00 (H) TELEFAX: +46-8-55 32 88 20 (I) TELEX: 19237 astra s (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Novos Compostos Activos (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 27 (iv) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1,0, Versão #1,25 (EPO)

(vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR (A) NÚMERO DE PEDIDO: SE 9201338-2 (B) DATA DE DEPÓSITO: 28 de Abril de 1992

(Vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR (A) NÚMERO DE PEDIDO: SE 9202553-5 (B) DATA DE DEPÓSITO: 7 de Setembro de 1992

(vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR 80 t

Lc, (A) NÚMERO DE PEDIDO: SE 9203897-5 (B) DATA DE DEPÓSITO: 23 de Dezembro de 1992

(vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR (A) NÚMERO DE PEDIDO: SE 9201141-9 (B) DATA DE DEPÓSITO: 6 de Abril de 1993 INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile 15 10 81

V

L-Cj ^ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Gly Ile Leu Gly Phe Vai Phe Thr Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Lys Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met Glu Ser Ser Thr Leu 15 10 15

Glu Cys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 82 t Γ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Lys Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Cys 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Lys Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met Cys 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO 83 Γ u

Cys Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Cys Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

Ser Gly Vai Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: 84 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO

Lys Gin Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Cys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

Lys Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile Cys 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 85 f (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Lys Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile His Cys 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13:

Cys Arg Gly Tyr Vai Tyr Gin Gly Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID

Cys Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: 86

u (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15:

Met Vai Vai Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gin Met Met 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido φ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

Cys Pro Thr Asn Gin Gin Vai Vai Leu Glu Gly Thr Asn Lys Thr Asp 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 87

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Met Gin Ile Arg Gly Phe Vai Tyr Phe Vai Glu Thr 1 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

Leu Ser Pro Gly Met Met Gly Met Phe Asn Met 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19:

Asp Tyr Gly Ile Leu Gin Ile Asn Ser Arg 15 10 88

ϊ INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20:

Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: Sítio modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6..7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marcação= Xaa /note= "homocisteína" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21:

Ala Ser Asn Glu Asn Xaa Glu Thr Met 1 5 89 u Γ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: φ (A) NOME/CHAVE: Sitio modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4..5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marcação= Xaa /note= "homocisteina" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22:

Ala Ser Asn Xaa Asn Met Glu Thr Met 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 23: φ (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: Sitio modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6..7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marcação= Xaa /note= "homocisteina" 90 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23:

Ser Gly Pro Ser Asn Xaa Pro Pro Glu Ile 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido ‘ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: Sítio modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4..5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marcação= Xaa /note= "homocisteína" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24:

Ser Gly Pro Xaa Asn Thr Pro Pro Glu Ile 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 91 t Γ (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: Sítio modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4..5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marcação = Xaa /note= "homocisteína" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25:

Arg Gly Tyr Xaa Tyr Gin Gly Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: Sítio modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5..6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marcação= Xaa /note= "homocisteína" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26:

Phe Ala Pro Gly Xaa Tyr Pro Ala Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 27: 92 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO

Arg Gly Tyr Vai Tyr Gin Gly Leu 1 5

Lisboa, 6 de Março de 2001

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

93

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado de péptido/carbohidrato capaz de gerar imunidade de célula T contra uma estrutura de carbohidrato, compreendendo o referido conjugado (i) um componente péptido capaz de se ligar a uma molécula MHC classe I; e (ii) um componente carbohidrato possuindo a especificidade imunogénica da referida estrutura de carbohidrato. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, gerando imunidade de célula T contra uma estrutura de carbohidrato associada a tumor, compreendendo o referido conjugado (i) um componente péptido capaz de se ligar a uma molécula MHC classe I; e (ii) um componente carbohidrato possuindo a especificidade imunogénica da referida estrutura de carbohidrato associada a tumor. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, gerando imunidade de célula T contra uma estrutura de carbohidrato expressa em agentes infecciosos e/ou células hospedeiras infectadas, compreendendo o referido conjugado (i) um componente péptido capaz de se ligar a uma molécula MHC classe I; e (ii) um componente carbohidrato possuindo a especificidade imunogénica da referida estrutura de carbohidrato expressa em agentes infecciosos e/ou células hospedeiras infectadas.
2. 4. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, em que o componente péptido consiste em 5-25 aminoácidos.
3. 5. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, em que o péptido consiste em 8-12 aminoácidos. 1 I—^ ^ V Γ
4. 6. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que o componente péptido consiste em 9 aminoácidos.
5. 7. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, em que o componente péptido é capaz de se ligar a uma molécula de mhc humana classe I.
6. 8. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o componente péptido possui o aminoácido V, I, L, ou T na posição 6.
7. 9. Conjugado de acordo com a reivindicação 8, em que o componente péptido possui o aminoácido V na posição 6.
8. 10. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-9, em que o componente péptido possui o aminoácido V ou L na posição do terminal C.
9. 11. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-10, em que o componente péptido possui o aminoácido L na posição do terminal C.
10. 12. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-11, em que o componente péptido possui a sequência G I L G F V F T L {SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequências).
11. 13. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-12, em que o componente carbohidrato está conjugado com o componente péptido numa posição que se liga a uma região hipervariável do receptor de célula T.
12. 14. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-13, em que o componente carbohidrato é de um tamanho que 2 V t Γ permite que o receptor de célula T compreenda um epitopo da referida estrutura de carbohidrato.
13. 15. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-14, em que o componente carbohidrato é qualquer um dos definidos na seguinte Tabela:

    3 TABELA 1. CARBOHIDRATOS ASSOCIADOS A TUMORES HUMANOS: 1.1 A maioria dos tumores: Galp4GlcPCer Lactosilceramida 1.2 Melanoma: NeuAca8NeuAcoc3Gaip4GlcPCer GD3 9-0-AC-GD3 NeuAca8NeuAca3 (GalNAcp4) Galp4GlcpCer GD2 9-0-AC-GD2 Formas lactonizadas destes 1.3 Cancro do cólon e outros tipos de cancro: Antigénio Tn Antigénio sialil-Tn Cadeia tipo 1 Sialil-Lewis a Disialil-Lewis a Dimero Lewis a Sialil-Lewis x GalNAca-Ser(Thr)(glicoproteína) NeuAca6GalNAca-Ser(Thr) Galp3GlcNAc NeuAca3Gaip3(Fuca4)GlcNAcP NeuAca3Gaip3(Fuca4)[NeuAca6]GlcNAcP Gaip3(Fuca4)GlcNAcPGaip3(Fuca4)GlcNAP NeuAca3Galp4(Fuca3)GlcNAP Gaip4(Fuca3)GlcNAcP3Gaip4(Fuca3)GlcNAcP Dlmero Lewis x Gaip4(Fuca3)GlcNAP3Gaip4(Fuca3)GlcNAcP3Gaip4(Fuca3)GlcNAcP Trimero Lewis x NeuAca3-Dímero Lewis x NeuAca3-Trímero Lewis x NeuAca6-01igómero Lewis x Formas lactonizadas destes no caso de ácido siálico 4 Γ U t 1.4 Cancro do pulmão e outros tipos de cancro: Gaip4GlcNAcp3Gal4GlcNAcP antigénio i (rep.lactosamina) Gaip3(Fuca4)GlcNAcpGaip4(Fuca3)GlcNAcP Lewis a - Lewis x Fuca2Galp3GalNAcP4 (NeuAca3) Gaip4GlcpCer Fuc-GMl Formas lactonizadas de Fuc-GMl 1.5 Linfoma de Burkitt: Gala4Gaip4GlcpCer Gb3 1.6 Cancro da mama: Fuca2Gaip3GalNAcp3Gala4Gaip4GlcpCer Fuc-Globopenta Tn-Antigénio Sialil-Tn-Antigénio 1.7 Teratocarcinoma: NeuAca3Gaip3GalNAcP3Gala4Gaip4GlcpCer Sialil-Globopenta Formas lactonizadas do acima referido 1.4 CARBOHIPRATOS ASSOCIADOS A TUMORES EXPERIMENTAIS: 1.5 Melanoma (Hamster): NeuAca3Gaip4GlcpCer GM3 GD3 9-0-AC-GD3 GD2 Formas lactonizadas destes 1.6 Melanoma (Murganho): GM3 GM3 lactonizado 5 Γ 2. CARBOHIPRATOS ASSOCIADOS A AGENTES INFECCIOSOS Manano de Candida albicans Isolados de polissacárido de Mycobacterium bovis estirpe BCG Lipofosfoglicano de Leishmania major Polissacáridos antigénicos O de Salmonella typhimurium 4. CARBOHIPRATOS ASSOCIADOS AO VIH Fuca2gaip4(Fuca3)GlcNAcp GalNAca3(Fuca2)Gaip3GlcNAcp NeuAca6GalNAca-Ser(Thr) GalNAca-Ser(Thr) Lewis y Grupo sanguíneo Ai Sialil antigénio Tn Antigénio Tn
14. 16. Formulação farmacêutica contendo um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-15 como ingrediente activo.
15. 17. Conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-15 para utilização em terapia.
16. 18. Método para gerar células T citotóxicas (CTLs), que possuem o potencial para destruir ou atenuar células associadas à doença apresentando uma estrutura de carbohidrato associada à doença característica, que compreende colocar em contacto uma população de células que foi removida ou isolada do corpo de um animal, com um conjugado como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-15, em que a referida população de células inclui (a) células possuindo moléculas de MHC classe I capazes de se ligarem a um componente péptido do referido conjugado e (b) células capazes de ser convertidas em CTLs, possuindo o referido potencial ou 6 (— L·. -Λ. \í ' interacção com células (a) possuindo o referido conjugado ligado a uma molécula MHC classe I.
17. 19. Utilização de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-15, no fabrico de uma composição farmacêutica, para estimular a produção de células T citotóxicas (CTLs) num doente, em que as referidas CTLs possuem o potencial para destruir ou atenuar células apresentando uma estrutura de carbohidrato associada a doença, caracteristica.

    Utilização de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-15, no fabrico de uma composição farmacêutica para produzir células T citotóxicas (CTLs), que possuem o potencial para destruir ou atenuar células apresentando uma estrutura de carbohidrato associada a doença, caracteristica, através de um procedimento que compreende colocar em contacto uma população de células que foi removida ou isolada do corpo de um animal, com o referido conjugado, em que a referida população de células inclui (a) células possuindo moléculas de MHC classe I capazes de se ligarem ao componente péptido do referido conjugado e (b) células capazes de ser convertidas em CTLs, possuindo o referido potencial ou interacção com células (a) possuindo o referido conjugado ligado a uma molécula MHC classe I.
18. 21. Utilização de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-15, para o fabrico de uma composição farmacêutica para induzir um estado imunológico desejado num doente, em que o referido estado imunológico resulta de uma interacção entre o referido conjugado e uma molécula MHC classe I, em que um componente celular do sistema imunitário é estimulado para induzir uma resposta 7 r U t especificamente associada à referida estrutura de carbohidrato.
19. 22. Utilização de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-15, no fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças malignas.
20. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 22, no fabrico de um medicamento para o tratamento de melanoma, cancro da mama, cancro do pulmão ou cancro gastrointestinal.
21. 24. Utilização de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1-15, no fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças infecciosas.
22. 25. Utilização de acordo com a reivindicação 24, no fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças infecciosas provocadas por agentes parasitas.
23. 26. Utilização de acordo com a reivindicação 25, no fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças infecciosas provocadas por patogénicos intracelulares.
24. 27. Processo para produzir um conjugado de péptido/carbohidrato, como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 15, que compreende os seguintes passos de procedimento: (a) sintetizar o componente através de uma técnica péptidos, (b) sintetizar o componente através de uma técnica carbohidratos, péptido de um conjugado, conhecida de síntese de carbohidrato do conjugado conhecida de síntese de 8 (c) proteger um ou mais grupos -COOH, OH, -NH2 ou -SH do componente péptido, antes de acoplar covalentemente o componente péptido ao componente carbohidrato, (d) proteger um ou mais grupos -OH, -COOH, -NH2, -CHO ou =C0 do componente péptido, antes de acoplar covalentemente o componente carbohidrato ao componente péptido, (e) activar um grupo não protegido -OH, -COOH, -NH2, -CHO, ou =C0, do componente carbohidrato, (f) activar um grupo não protegido -OH, -COOH, -NH2, ou -SH, do componente péptido, (g) fazer reagir pelo menos um dos componentes de carbohidrato e o componente péptido com um reagente de ligação bifuncional, (h) fazer reagir o componente carbohidrato e o componente péptido covalentemente, de modo a formar o conjugado desejado, estando os referidos componentes adequadamente protegidos, activados e/ou feitos reagir com um reagente de ligação bifuncional, (i) sujeitar um conjugado intermediário de péptido protegido/carbohidrato, a um procedimento de desprotecção. Lisboa, 6 de Março de 2001 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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