JPH07506049A - 神経症および精神病の診断用免疫吸着剤およびその実際的用途 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 神経症および精神病の診断用免疫吸着剤およびその実際的用途技術分野 本発明は、概して、薬剤に関し、更に詳しくは、診断薬、すなわち、神経症およ び精神病の診断用免疫吸着剤およびその実際的使用に関する。

背景技術 平均して集団の約５％に影響を与える神経精神病質は、極めて広範囲に、特に、 開発途上国に広がっており、それらの発生率はますます増大する傾向にある。

現在、このような疾患は、概して、患者の入念な臨床検査結果にしたがって診断 されており、それらとしては、電気生理学的方法、血管造影法、Ｘ線透視法、核 磁気共鳴法、陽電子放射横断断層撮影法および他の測定器アプローチの使用があ る。診断をより正確にするために、往々にしてその使用は、神経媒介物質および 神経ペプチドまたはそれらの代謝を刺激し且つ阻害する含有物（すなわち、グル タミン酸塩、ガンマ−アミノ酪酸、セロトニン、ドパミン、モノアミノオキシダ ーゼ、ベーターエンドルフィンおよびメチレン−エンケファリン）に関する血液 および他の体液の臨床生化学的分析から成る。

しかしながら、脳および生体の機能的状態を全体として評価するための前記の生 化学的判定基準の使用は常に望ましい結果を生じるとは限らない、すなわち、治 療法の計画を決定するのに最も重要である病原におけるある種の媒介物質および ペプチド作動系の関与の程度を明白に判断できるようにすることはできないし； それは実験室分析用に時間的浪費および材料費を必要とし；前記の判定基準では 、それぞれの疾病分類学的状態に適切な水準の特異性を与えることができないし 、事実上、疾患（危険群）に対する素因を検出することも疾患の初期段階での神 経精神病質の診断を行なうこともできない。

若干の証拠により、神経精神病質の患者の血液が神経組織の破壊産物による生体 の自己免疫化の様々な徴候を示し、同時に、その共通の脳抗体力価がしばしば精 神神経学的症状の苛酷さの程度に対応するということが示される。

しかしながら、古典的な免疫学的方法および技術（補体結合反応、受動血液凝集 反応および脳抗体に対する好中球変性反応）は、疾患のそれぞれの疾病分類学的 状態に特異的な神経組織抗原の検出が複雑なために、更には、多クローン性抗血 清を用いるために、神経精神病質の臨床的実践における広範な用途は未だに発見 されていない。後者は、用いられる方法および技術の規格化を妨げ、高度な非特 異的抗体結合性を示し、大脳組織の機能不全の徴候あるいは発症の原因である抗 原またはそのフラグメントの識別ができない。

技術の一つの現状である神経精神病質（すなわち、精神分裂病、てんかんおよび 振せん麻痺）の診断法は、担体、例えば、ポリスチレンと、哺乳動物の脳から単 離され且つ該担体上に固定された５−ｉｏｏタンパク質群のフラグメントとから 成る免疫吸着剤を用いることが知られている（Ａ、Ｂ、ポルタヴ（ｐｏｌｅｔａ ｅｖ）らによる「酵素結合イムノソルベント分析を用いる神経精神病質における 自己免疫法の研究（Ｓｔｕｄｙ　ｉｎｔ。

ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　１ｎｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐａ ｔｈｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ ｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ、１９８５．４巻、２ 号、７５〜７６頁（ロシア語）を参照されたい）。

その方法は、分析中の血清および対照血清を免疫吸着剤に対して適用し且つ神経 精神病質患者の血清中のＳ−１００タンパク質群に対する自己抗体を検出するこ とである。

しかしながら、抗原として選択されたＳ−１００タンパク質群は、前述の神経精 神病質に対して特異的ではないので、その方法では、患者の状態を偏りなく評価 することも、それぞれの疾患の危険群を決定することもできない。更に、陽性の 結果は、内分泌障害およびアルコール患者の血清を分析した場合にも得られる。

結果として、神経精神病質の検出百分率は６５程度に低い。

発明の開示 本発明の主要な目的は、神経精神病質の診断用のこのような免疫吸着剤および、 ある種の特異的タンパク質フラグメントの選択によって更に高い百分率で疾患の 検出を達成し、患者の状態を偏りなく評価し、そして患者の危険群を検出するこ とができるその実際的用途を提供することである。

前述の目的は、担体およびその上に固定されたタンパク質フラグメントから成る 神経精神病質診断用免疫吸着剤の提供によって達成さね、そこにおいて、本発明 により、該免疫吸着剤はタンパク質フラグメントとして哺乳動物の脳のセンサー タンパク質を含み、該タンパク質は分子質量が２〜４５ｋＤであり且つ２〜５０ ｎＭの量で得られる。

てんかんの診断用タンパク質フラグメントとして分子質量が２〜１７ｋＤのキス カレート結合性膜タンパク質を用いることが推薦される。

振せん麻痺の診断用には、タンパク質フラグメントとして分子質量が１０〜２８ ｋＤのメチルスコポラミン結合性膜タンパク質を用いるのが好都合である。

薬剤嗜癖の診断用には、タンパク質フラグメントとして分子質量が２９〜４５ｋ Ｄのダラージン（ｄａｌａｒｇｉｎ）結合性膜タンパク質を用いることが推薦さ れる。

精神分裂病の診断用には、タンパク質フラグメントとして分子質量がそれぞれ１ ０〜１８ｋＤおよび２４〜３５ｋＤのアポモルフインまたはスビペロン結合性膜 タンパク質を用いることができる。

アルツハイマー病の診断用には、タンパク質フラグメントとして分子質量が３０ 〜４２ｋＤのＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート結合性膜タンパク質を用いること ができる。

前述の目的は、更に、分析中のヒト血清および健康な個体の対照血清を、本明細 書中において提案された免疫吸着剤に対して適用し、そしである与えられた神経 精神病質に関する自己抗体の存在を検出することである神経精神病質の診断法の 提供によって達成さね、そこにおいて、本発明により、免疫吸着剤として用いら れるのは、担体と、その上に固定された哺乳動物の脳のセンサータンＩくり質の フラグメントとから成るものであり、該免疫吸着剤に対して適用された分子質量 が２〜４５ｋＤであり且つ２〜５０ｎＭの量で得られる該タンｌ＜り質は、更に 、検査システムを作るための該センサータンパク質に対する単クローン性抗体で ある。

本明細書中において提案された免疫吸着剤は、神経精神病質の診断用およびその 危険群（すなわち、てんかん、振せん麻痺、薬剤嗜癖、精神分裂病およびアルツ ハイマー病）を検出するための新規の検査システムを作ることを可能にし、それ は検査結果の明白な解釈および患者の選別を可能にするし、しかも精神神経科診 療所および病院での広範囲の使用に経済的且つ好都合である。更に、このような 検査システムは、治療処置中の患者の状態を監視するのに有用でありうる。

発明を実施する最良の方法 提案された免疫吸着剤およびこのようにして作られた検査システムに基く神経精 神病質の診断法の実際的用途は、それぞれの疾病分類学的状態に対応し且っ哺乳 動物の脳から単離されたセンサータンパク質のフラグメントに対する特異的自己 抗体の患者血清中における異常に高い含有量を検出することにある。−Ｃんかん の原因である脳センサータンパク質の特異的フラグメントはキスカレート結合性 膜タンパク質であり、振せん麻痺の原因はメチルスコポラミン結合性膜タンパク 質であり、アヘン剤依存嗜癖に対してはグラ−ジン結合性膜タンパク質、精神分 裂病に対してはアポモルフイン結合性膜タンパク質およびスビベロン結合性膜タ ンパク質、そしてアルツハイマー病にはＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート結合性 膜タンパク質であることが分かった。センサータンパク質のそれぞれのフラグメ ントに対する自己抗体数は、健全な提供者のそれの２〜６倍であり、具体的な疾 患またはそれに対する素因が診断される（危険群）。

本発明の免疫吸着剤は以下のように製造される。診断される疾患に対応する哺乳 動物の脳のセンサータンパク質のフラグメントを、ポリスチレンまたはニトロセ ルロースを用いることができる能力をもった担体上に共有結合またはイオン結合 によって固定する。ポリスチレン担体の場合、免疫学的検査用の標準的なポリス チレントレーでニトロ化法を行ない、それによってトレー表面上に遊離ニトロ基 を生成した後、アミノ基に還元し且つリンカ−として役立つグルタル酸ジアルデ ヒドで活性化する。次に、このように活性化されたトレーを、哺乳動物の脳のセ ンサータンパク質のそれぞれの免疫原性フラグメントを化学的に固定する目的で 、２〜５０ｎＮの量で得られた分子質量が２〜４５ｋＤのセンサータンパク質の それぞれの予め単離されたフラグメントとのインキュベーションに供し、インキ ュベーション工程は４℃で１６時間行なう。

２ｎＭ未満の量のタンパク質は検査結果の信頼性に悪影響を与えるが、その量が ５０ｎＭを越えることは、自己抗体と免疫吸着剤との非特異的結合の増加ゆえに 不適当である。

次に、トレーをホウ水素化ナトリウム水溶液および塩化ナトリウム水溶液で洗浄 し、真空乾燥させ、気密封止パッケージ中に密封し、そして４℃の貯蔵下に置く 。

センサータンパク質のそれぞれのフラグメントをイオン相互作用によってニトロ セルロースストリップ上に固定することによって免疫吸着剤を製造することも実 用的である。哺乳動物の脳から単離されたセンサータンパク質のそれぞれのフラ グメントをニトロセルロースに適用し且つ３７℃で１５分間インキュベートする 。次に、ニトロセルロースをトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０の０．　５％溶液 で洗浄し、得られた免疫吸着剤を室温で乾燥させ且つ乾燥した所で１年間貯蔵す る。

センサータンパク質の７ラグメントを以下のように単離する。センサータンパク 質を哺乳動物、例えば、ヒトまたはブタの脳のシナプス膜から単離して一７０℃ の温度で貯蔵する。大脳組織を、フッ化フェニルメチルスルホニルを含むサッカ ロース溶液中でホモジネートし且つ遠心分離する。次に、上澄み膜部分を濾過し 、そして最初に水冷２回蒸留水中で、続いてそれだけで遠心分離する。次に、上 澄み液と固まっていない沈殿層とを分離し、そして上記方法２回繰り返す。得ら れた膜部分（シナプス膜）をデオキシコール酸ナトリウムなどの洗剤またはジギ トニン中に懸濁させる。不溶性膜を遠心分離沈殿させる。センサータンパク質の 単離に関して、上澄み液を予め製造された吸着剤、例えば、グルタメート−セフ ァロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ％メチルスコポラミンーセファロース４Ｂ １ダラージンーω−アミノヘキシル−セファロース４Ｂ、アポモルフイン−若し くはスピペロンーセファロース４ＢまたはＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート−ω −アミノヘキシル−セファロースと混合する。

センサータンパク質対吸着剤結合処理は４℃で１５時間行なう。吸着剤を６倍容 量の洗剤含有緩衝液で洗浄したら、センサータンパク質を同一緩衝液中において 塩化ナトリウムで溶離し且つ限外濾過濃縮する。

前述の疾患それぞれの実験室診断法は、多数の段階、すなわち、患者の血液を採 取し、哺乳動物の脳のそれぞれのセンサータンパク質に対する自己抗体を同定し 、その検査結果を定量的に処理し、そしてそれらを臨床事例と比較することから 成る。

０．５ｍｌの量の血液を患者の指から採取し、採取直後に４℃で遠心分離し、そ の血清は検査前に深冷凍上で（−７０℃で）貯蔵される。

自己抗体の決定は、以下の二つの技法のどちらかによって実施することができる 。

自己抗体の固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）は以下のように行なう。

すなわち、活性化のために１０％酢酸溶液をクーカー（Ｃｏｏｋｅｒ）微量滴定 マイクロプレート（ダイナチク・カンパニー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｃｏ、）、米 国から入手可能）に１分間加え、そこで分析中の血清（１，：４０に希釈された ）０．１ｍｌをマイクロプレートに加え且つ２５℃で４時間インキュベーション を行なう。次に、マイクロプレートを、０．１４Ｍ塩化ナトリウム溶液および１ ２５Ｉで標識された哺乳動物の脳タンパク質のそれぞれのフラグメントと非標識 のものとの混合物０．１ｍｌで洗浄する。プレートを４℃で２０時間インキュベ ートする。インキュベーションを完了したら、マイクロプレートを０．１４Ｍ塩 化ナトリウム溶液で洗浄した後、マイクロプレートの各細胞を切離し且っガンマ 計数用バイアル中に入れる。

自己抗体の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＺＡ）は以下のように行な う。すなわち、１：４０または１：５０に希釈された血清試料をそれぞれの免疫 吸着剤に対して適用する。次に、免疫吸着剤を有するトレーを３７℃で３０分間 インキュベートし、そこでトレーのウェルを、０．０５％のトウイーン−２０を 含む０．０５Ｍリン酸緩衝液で洗浄する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼで 標識されたヒト免疫グロブリンに対するウサギ抗体（複合体）をそれに加え、そ してトレーを３７℃で３５分間再度インキュベートした後、前述の緩衝液および 蒸留水で洗浄する。次に、色素原、すなわち、オルトフェニレンジアミンの存在 下において３０％化酸化水素を加えることによって結合可能な複合体を決定する 。陽性反応は、マルチスカン（Ｍｕｌ　ｔ　ｉ　５ｋａｎ）測定器を用いて、４ ９２ｎｍの波長での吸収に対して強度が評価されている褐色の発色に対して認め られる。

自己抗体と血清中のセンサータンパク質のフラグメントとの結合の程度は、セン サータンパク質の各フラグメントとそれに対する単クローン性抗体との結合との 比較において決定される。センサータンパク質の各フラグメントに対する単クロ ーン性抗体は、標準的なハイブリドーマ技術によって製造される。

哺乳動物の脳のセンサータンパク質のそれぞれの７ラグメントに対する単クロー ン性抗体の選択性は、５ＰＲＩＡまたはＥＬＩＳＡ技術によって交差反応を研究 した場合の各抗原の９５％に等しい。他の脳組織抗原（例えば、ガングリオシド 、セレブロシドおよび５−ｉｏｏタンパク質）に関して、交差反応は単クローン 性抗体の全特異性の２〜４％未満である。

推定の対照（「ゼロ」）水準は、ラットの脳から単離された金膜検体上で消耗さ れたドナー血清試料の分析結果にしたがって選択される。

得られたデータを任意の単位（ＡＵ）によって示す。

提案された免疫吸着剤を、２３００人を越える患者の血清試料で検査し、その診 断は以下の通り、すなわち、てんかん（１６５０人）、未知の病因のてんかん様 症候群（１８７人）、振せん麻痺（１４８人）、精神分裂病憤彎病、循環気質、 １４７人）、アルツハイマー病（４４人）、アヘン剤依存嗜癖（１１７人）並び に交差分析を含む健康なドナー２１５０人である。

疾患のそれぞれの状態に関して選択された哺乳動物の脳のセンサータンパク質の フラグメント基準でこのように実施された大規模な臨床検査は、それらの高い特 異性および感受性が、それぞれの疾患の、更には該疾患の素因が作られた患者に おける危険群の選択的診断を可能にすることを確証した。

てんかんの診断は、実際に、分子質量が２〜１７ｋＤのキスカレート結合性膜タ ンパク質に対する自己抗体およびそれに対する単クローン性抗体を検出するため の免疫吸着剤である検査システムの助けによって行なわれる。

キスカレート結合性膜タンパク質のフラグメントに対する自己抗体の増加濃度は 、てんかんおよび未知の病因のてんかん様症候群の診断による患者の血液中にお いて検出された。この場合、検定によって患者の８９〜９０％を検出することを 可能にした。振せん麻痺およびてんかん以外の他のＣＮＳ疾患におけるキス力レ ート結合性膜タンパク質に対する自己抗体の検出濃度は、存在しない場合、対照 とは異なる。若干の場合において（全検査数の５％）、他のＣＮＳ疾患（例えば 、多発性硬化症、精神分裂病）に冒された患者の検査で過敏性が観察された。

概して、このような場合、脳波（ＥＥＧ）での増加した発作活性が注目された。

このような患者は、てんかんに関して危険群に分類された。

キス力レート結合性膜タンパク質に対する自己抗体の検出可能な濃度と、てんか んの時間依存変化、状態および期間との相関は、１６才〜５０才のてんかん患な わち、１群一平均のドナー水準の１２０〜２００％；ＩＩ群−２２０〜３２０％ ；およびその水準の２３０％以上のＩＩＩ群に再分した。下記の表１は、大脳発 作の再発率に応じた患者の分布を示す。自己抗体濃度の最小限の増加は散発性（ 年に１回程度にまれ）発作の患者において見出され、最大限の増加は毎日の発作 に冒された患者において見出された。

表１ １．散発性発作　８３．０　１１．７　５．３２．４〜２８回／月　−　８１． ３　１８．７３．毎日又は連続発作　−　１１．８　８８．２血液中の自己抗体 量の時間依存性変化の研究は、２回の連続発作の間の期間中にそれが漸増するこ とを実証した。発作の８〜１０日前に顕著な効果を観察することができ、最大レ ベルは痙撃の直後に生ずる。その後の期間には、患者の血液中の自己抗体レベル は漸減して、発作の１カ月乃至２カ月後には初期レベルに達した。

脳への損傷、腫瘍及び神経感染症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）よる影響を 受け、クィスクアレート結合膜（ｑｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　＋ｏ ｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質に対して高力価の自己抗体を示す患者は、散発性発 作を付随して、又は癲闇発作に襲われないとしても、癲痛発病の高危険性にある と考えられる。

以下では、被験患者の幾つかの具体的な病歴を述べる。

男性患者Ｋ．４５歳、推定診断：癲燗．この疾患は頭部損傷の続発症である。

この損傷の２年後に、外見上健康であった患者は頭痛の絶頂時に嘔吐を伴う頭痛 と、一時的な意識喪失に襲われた。脳波検査と陽電子射出断層撮影（ｐｏｓｆｔ ｒｏｎ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｔｒａｎｓａｘｉａｌ　ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）は 、この患者の癲燗存在に関する明白な結果を生じなかった。痙撃は見られなかっ た。クィスクアレート結合膜タンパク質に対する自己抗体量は健康な個体の血液 中の自己抗体量の３倍であった。癲燗の診断は実験室方法によって確認された。

■．の家族、男性患者ｖ．５４歳、診断：頭部損傷に続発する癲燗、ＥＥＧは広 汎なｌｍ周活動を示した。結合レベルの分析はドナー血液の自己抗体含量に比べ て、５倍過剰なクィスクアレート結合膜タンパク質に対する自己抗体量を実証し た。患者自身の２人の姉妹（臨床的に健康）の血液を検査した。姉妹の１人では 、自己抗体レベルが正常であったが、姉妹の他方は健康なドナーに比べて前記レ ベルの２倍の増加を示した。後者の姉妹のこの疾患に対する素質と必要時の予防 治療の適用が結論された。患者Ｖ．の妻、５０歳、は健康であり、正常な血液自 己抗体含量を示した。患者の娘、２５歳．健康、彼女の血液中の自己抗体値は正 常であった。患者の妻と娘の血液の実験室分析の結果は癲燗素質を示さなかった 。

Ａ．の家族、女性患者Ａ．７８歳、診断；癲燗。この患者は小児期から罹患して いた。ＥＥＧは広汎な癲周活動を示した。薬物療法は殆ど役に立たなかった。

自己抗体値は対照の自己抗体レベルの６倍を越える。患者の娘、４５歳、は臨床 的に健康であったが、頻繁に頭痛を訴えた。彼女には癲同発作が生じなかった。

自己抗体値は正常値に比べて２倍に上昇した。実験室分析の結果によると、癲痛 素質が検出された。

実際に、約１０〜２８ｋＤの分子量を有するメチルスコポラミン結合膜タンパク 質のフラグメントに対する自己抗体を検出するためのイムノソルベントと、それ に対するモノクローナル抗体とである試験系を用いて、振せん麻痺の診断を行う 。

振せん麻痺、小脳変性、併発した皮質下運動九進症、大脳循環不全に続発する病 的イベントに罹患した全体で１４８人の患者。メチルスコポラミン結合膜タンパ ク質に対する自己抗体レベル上昇は、運動不能一硬直形と硬直一振せん形（Ｉ■ 〜ＩＶ期）の振せん麻痺に罹患した患者においてのみ認められた。この場合には 、分析は患者の８５％の検出を可能にした。患者の血液の自己抗体値はこの疾患 の症状に相関し、疾患の段階及び採られた治療手段に依存した（表２）。他の形 態の運動障害病（小脳変性、併発症の皮質下運動元進、大脳循環不全）を有する 磨者では、メチルスコポラミン結合膜タンパク質に対する自己抗体レベルは治療 手段に依存せず、対照レベルに留まった。癲痛と精神分裂病の場合には、メチル スコポラミン結合膜タンパク質に対する自己抗体レベルは対照から全く異ならな かった（表２）。

高危険性群に属する患者群を振せん麻痺の発病に関して検査した、患者の血液中 にはメチルスコポラミン結合膜タンパク質に対する高力価の自己抗体が検出され た。

表２ 被験患者群に対する結果の分布 Ｎｏ．被験患者群　種々な患者群のメチルスコボラミン結合膜タン１　健康なド ナー　４７８±１６　− ２．小脳変性に罹患した 患者　４６９±２１　４５７±１８ ３．併発した皮質下運動 光進症に罹患した患者　４７６±２７　４８９±１４４．大脳循環不全に罹患 した患者　４５６±１２　５８９±３３５．振せん麻痺の 運動不能一硬直形と 硬直一振せん形患者： ＩＩ期　９３９±１３　７４５±１３ ＩＩＩ期　１２３４±３４　９８７±２３ＩＶ期　２０１３±３６　１７６８± ２４６．癲痛患者　０ ７，精神分裂病患者 （繰―病に罹患）　０ 以下では、被験患者の幾つかの具体的な病歴を述べる。

女性患者Ａ，６１歳、推定診断：運動不能一硬直形の振せん麻痺。臨床症状が軽 度に発現。患者の既往歴では、早朝の運動障害（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　＋ｍ ｏｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅｍｏｒｎｉｎｇ）が最も注目された。患者の血液 血清分析は健康なドナーの血液血清の自己抗体値に比べて、メチルスコポラミン 結合膜タンパク質に対する自己抗体レベルの２倍過剰を示した。振せん麻痺の診 断は実験室方法によって確認された。

Ｌ、の家族、母親、５３歳、診断：振せん一硬直形の振せん麻痺、ＩＩＩ〜ＩＶ 期。患者の両親の振せん麻痺に関する情報は彼女の既往歴に含まれた。薬物療法 は殆ど役に立たなかった。患者は以前に脳の深層構造中の長期間電極の移植を含 む定位脳固定手術を受け、治療による電気刺激操作を施され、良好な効果を得た ことがあった。電気刺激前のメチルスコポラミン結合膜タンパク質に対する自己 抗体値はドナーの血液の自己抗体含量の４倍程度であった。自己抗体の力価は治 療による電気刺激操作の過程で顕著に低下することが発見されたが、健康なドナ ーに比べるとまだ２倍程度高く留まり、これは患者の状態の臨床的改善に相関し た。患者の息子、３０歳、見かけは健康であったが、彼の血液血清の検査はメチ ルスコポラミン結合膜タンパク質に対する自己抗体レベルの５０％上昇を示した 。問題の疾患に対する患者の息子の素質が結論された。

実際に、約２９〜４５ｋＤの分子量を有するダラルギン（ｄａｌａｒｇｉｎ）結 合膜タンパク質のフラグメントに対する自己抗体と、前記タンパク質に対するモ ノクローナル抗体とを検出するためのイムノソルベントである試験系を用いて、 モルヒネ、コカイン及びハシッシュ嗜癖の診断を実施する。

下記診断を有する２６７患者から採取した血液血清サンプルに対して提案された イムノソルベントを臨床的に試験した：モルヒネ依存症患者５０人、ノ１シツシ ュ中毒３５人、及びコカイン依存症患者３２人を含む薬物中毒（１１７人）。さ らに、催眠薬を投与された患者（５０人）並びにアルコール中毒者（５０人）か ら採取した血液サンプルを検査した。健康なドナー（２００人）の血液を対照と して用いた。

モルヒネ常用者（ｍｏｒｐｈｉｎｉｓｔ）及びコカイン常用者（ｃｏｃａｉｎｉ ｓｔ）と診断された患者の血液では、ダラルギン結合膜タンパク質に対する自己 抗体レベル上昇が検出された。この場合に、分析は患者の８５〜８９％を検出す ることができた。ノ１シツシニ常用者の疾患検出率は約６５であったが、鎮静薬 、催眠薬又はアルコールを乱用した患者の血液中のダラルギン結合膜タンパク質 に対する結合自己抗体レベルは、対照の血液サンプル中の自己抗体結合レベルを 越えないことが判明した。

ダラルギン結合膜タンパク質に対する自己抗体の検出可能なレベルと、薬物乱用 の種類及び期間との関係を、薬物常用に罹患した患者１１７人（１５〜４０歳） の群で研究した。全患者を分析の結果として疾患の種類（すなわち、モルヒネ常 用、コカイン常用及びハシッシュ常用）に応じて３群に分けた（表３）。

表３ １、モルヒネ常用　８５±４．５ ２、コカイン常用　８３±３．２ ３、ハシッシュ常用　５９±３．３ ４、鎮静薬及び催眠薬 ５、アルコール中毒患者　０ ｘ）３力月から１年までの薬物常用期間モルヒネ常用者とコカイン常用者では、 自己抗体値の殆ど同じ上昇が認められ、ハシッシュ常用者では低い（１，６倍ま で）上昇が認められた。

表４は、ダラルギン結合膜タンパク質に対する患者（５０人）の血液血清中の自 己抗体力価の、麻酔性物質の最後の摂取口に依存する変化の研究結果を示す。

モルヒネ常用及びコカイン常用に罹患した患者（各２５人）では、麻酔性物質の 最後の摂取口から３年間前れた場合に、顕著な効果を認めることができた。最後 の薬物摂取時からさらに長期間経過した場合には（５年間を越えて）、患者の血 液中の自己抗体レベルは軽度にのみ低下すること判明したが、まだ対照に比べる と異常に高く残留した（表４）。

表４ 最後の薬物摂取口に依存する、患者の血液血清の検査結果Ｎｏ、薬物常用　麻酔 性物質の最後の摂取口に関するの種類　免疫診断データ、ＡＵ” １年未満　３年未満　５年未満 １、モルヒネ常用　３４．２±２．２　３０．０±１．９　２３．１±２．９２ 、コカイン常用　２９．９±１．８　２８．７±２．２　１９．９±２．４Ｘ） ドナーの血液抗体レベル７．２ＡＵ妊娠したモルヒネ常用者（患者１０人、妊娠 期間１４〜１８週）の血液血清の検査は、ドナー血液におけるよりも２倍〜４倍 高い、ダラルギン結合膜タンパク質に対する自己抗体含量を明らかにすることが できた（表５）。前記女性患者の新生児７人（生後１〜１．５力月）中の５人の 血液血清は、異常に（５０〜７５％）高いダラルギン結合膜タンパク質に対する 自己抗体含量を示した。

従って、モルヒネ、コカイン及びハシッシュ常用の診断への提案されたイムノソ ルベント適用の効率に関する推論を引き出すことができる。

表５ 妊娠患者とかれらの新生児における血液血清の検査結果Ｎｏ、被験者群　モルヒ ネに対する抗体レベル、ＡＵ”１、妊娠患者（１４週）　２１．６±２．５２、 妊娠患者（１６週）　２５．２±３．１３、妊娠患者（１８週）２０．２±２． ９４、新生児（１〜１．５力月）　１１．５±１．１Ｘ）ドナーの血液抗体レベ ル７．２ＡＵ本質的に、分子量１０〜１８ｋＤの分子量を有するアポモルヒネ結 合膜タンノ（り質のフラグメントと、分子量２４〜３５ｋＤの分子量を有するス ピペロン結合膜タンパク質のフラグメントとに対する自己抗体を検出するための イムノソルベントと前記タンパク質に対するモノクローナル抗体からなる試験系 を用いて一精神分裂症の診断を確認する。

試験系を用いて実施する精神分裂病患者の血液血清の分析は、患者の８３％まで の検出を可能にする。上記種類の精神分裂病以外の振せん麻痺又は他のＣＮＳ疾 患の場合には、膜タンパク質の前記フラグメントに対する自己抗体の検出レベル は、対照から全く異ならない。若干の例（検査総数の５％）では、例えば精神病 、すなわち情動障害（ａｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ）のような、他の ＣＮＳ疾患を有する患者に対するこの試験の超高感度が認められる。一般に、こ のような場合には、ＥＥＧに睡眠の“迅速眼球運動”　（ＲＥＭ）の迅速な発現 が認められる。このような患者は精神分裂病に関して危険性群に属すると見なさ れる。

アポモルヒネ結合膜タンパク質とスピペロン結合膜タンパク質とに対する自己抗 体の検出可能なレベルと精神分裂病の種類との相関関係を、１４７人の精神分裂 病患者（１６〜５０歳）の群において研究した。分析結果に従って、全患者を３ 群二群Ｉ、繰曽病】群Ｉ１．単極性（ｕｎｉｐｏＬａｒ）１１病一群１１１．双 極性精神病又はｓｉｔ病プロパー（ｐｒｏｐｅｒ）に分けた。表６は疾患の種類 に依存する群への患者の分布を示す。

“ｌｓｗ病”の診断を有する患者は健康なドナーの血液血清中の自己抗体値に比 べて、アポモルヒネ結合膜タンパク質に対する自己抗体の２倍〜４倍高い含量を 示した（表６）、然るにスピペロン結合膜タンパク質に対する自己抗体含量は対 照における含量の１．５〜２倍であつた。これはセロトニンレセプターのフラグ メントに対する自己抗体の割合よりも、繰響病患者の血液中のドーパミンレセプ ターのフラグメントに対する自己抗体の割合が大きいことを実証する。

単極性−病患者の血液血清中のスビペロン結合膜タンパク質に対する自己抗体値 は、健康な個人の血液中の前記タンパク質に対する自己抗体値の３〜４倍である （表６）。セロトニンレセプターのフラグメントに対する自己抗体値がドーパミ ンレセプターのフラグメントに対する自己抗体含量の約２倍を越えることは、本 発明の研究者（ａｕｔｈｅｒ）によって確認されている（表６）。

“ａｍ病”の診断を有する患者の血液中ではアポモルヒネ結合膜タンノくり質と スビペロン結合膜タンパク質とに対する自己抗体レベルの上昇が検出された。繰 響病患者の血液中の前記膜タンパク質に対する自己抗体力価の変化の研究は、健 康な個人の身体中の前記タンパク質に対する自己抗体の力価に比べてそのレベル が上昇（１，５〜２倍）することを実証した（表６）。

薬物療法後の期間では、繰響病患者及び単極性１病患者の血液中の自己抗体レベ ルが、患者の改善された臨床状態を背景として減少することが判明したが（表６ ）、健康な人々の血液血清の自己抗体含量に比べるとまだ１．５〜２倍高く留ま る。！ｌＩ−病の治療に広範に用いられる方法を適用すると、すなわち電気ショ ック療法（ＥＳＴ）の過程では、２〜３日間で、患者の情緒（ｍｏｏｄ）の急激 かつ迅速な改善と、着実な緩解が達成され、アポモルヒネ結合膜タンパク質とス ピベロン結合膜タンパク質とに対する自己抗体レベルは本質的に対照レベルに低 下した（表６）。

表６ 精神分裂病の種類に依存する、群への結果の分布Ｎｏ、疾壱の種類　血液血清自 己抗体レベル、ＡＵアポモルヒネ結合膜　スピベロン結合膜タンパク質に対して 　タンパク質に対して１、健康なドナー　２０５±１０　１８５±１５２、繰− 病（１）。

治療前　７３０±３４　４３０±２１ 治療後（レゼルピン 療法を含む）　４５４土９　４２０±１３３、単極性−病（１１）： 治療前　３０１±１８　５３２±１３ 抗−剤による治療後　２８７±２３　３０３±１１４、双極性繰−病（ＩＩＩ） 治療前　４４２±２９　４９３±８ ＥＳＴによる治療後　２３４±１８　２０１±２５　（ｐ＜０．０１）家族の血 族メンバー、すなわちその血液中にアポモルヒネ結合膜タンパク質とスビペロン 結合膜タンパク質とに対する高い力価の自己抗体が検出される患者は、精神分裂 病の発病の高危険性群に割り当てられ、疾患の臨床像の発現を伴うと考えられる 。

以下では、被験患者の幾つかの具体的な病歴を述べる。

Ｓ、の家族、母親、５５歳、診断；精神分裂病（ＪｌｌＩｗ病症候群）。患者の 既往歴−二の疾患の初期症状が４５歳の時に被害妄想として現れ、自殺を試みた 。ＥＥＧには短期間（５０分間）のＬＥＭ睡眠が記録された。アポモルヒネ結合 膜タンパク質とスピペロン結合膜タンパク質とに対する自己抗体値は、ドナー血 液中の自己抗体レベルの３倍であった。患者の娘、３３歳、完全に健康、自己抗 体レベル。患者の息子、３０歳、アポモルヒネ結合膜タンパク質とスビペロン結 合膜タンパク質とに対する自己抗体値は、健康なドナーよりも５８〜６０％高い 。患者の息子のこの疾患に対する素質と必要に応じた予防治療の適用が推論され た。

男性患者Ｍ、４３歳、診断：精神分裂病（推定では、単極性曽病）。患者の既往 歴：両親健康、患者の祖母が精神分裂病に罹患。この疾患の初期症状は情緒反応 の一過性喪失と思考障害として２５歳の時に現れる。ＥＥＧにおいてＲＥＭ段階 の発現正常。結合レベルの分析は、健康なドナーの血液の自己抗体含量に比べて 、アポモルヒネ結合膜タンパク質に対する自己抗体値の３倍の上昇と、スビペロ ン結合膜タンパク質に対する自己抗体値の１．５倍の上昇を実証した。この診断 は実験室分析の結果によって確認された。

本質的に、約３０〜４２ｋＤの分子量を有するＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート 結合膜タンパク質のフラグメントに対する自己抗体とを検出するためのイムノソ ルベントと前記タンパク質に対するモノクローナル抗体からなる試験系を用いて 、アルツハイマー病の診断を確立する。

アルツハイマー病、再発性急性大脳循環障害（脳血管アクシデント、患者１５人 ）及び全身麻痺（７人）を有する患者全体で４４人。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパル テート結合膜タンパク質に対する自己抗体レベル上昇は、アルツハイマー病罹患 者にのみ認められた。この場合には、この分析は患者の８５％を検出することが できた。患者の血液中の自己抗体値は、疾患の症状と相関し、疾患の段階に依存 する（表７）。他の形態の組織的脳症状（すなわち、再発性急性大脳循環障害、 全身麻痺）を示した患者では、Ｎ−メチル−〇−アスパルテート結合膜タンパク 質に対する自己抗体レベルは対照レベルに留まった。薬物常用の場合には、Ｎ− メチル−Ｄ−アスパルテート結合膜タンパク質に対する自己抗体レベルは対照か ら全く異ならなかった（表７）。

表７ 被験徹者群へに結果の分布 ＮＯ被験患者群　種々な群におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート結合膜タン パク質に対する自己抗体レベルＵ １、健康なドナー　１７８±６ ２、アルツハイマー病患者　５５７±１８３、脳血管アクシデント患者　１７６ ±２７４、全身麻痺患者　１８９±３３ ５、阿片依存症常用者　１６９±１２ アルツハイマ一病発病の高危険性群に分類される患者群を検査した、前記患者の 血液は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート結合膜タンノ（り質に対する高力価の 自己抗体を示した。

以下では、被験患者の幾つかの具体的な病歴を述べる。

男性患者Ｎ、５０歳、推定診断：アルツハイマー病の老年性痴呆。患者の既往歴 ：損傷（脳振とう）の２年後に、進行性外傷後の側頭域失見当識（ｔｅｍｐｏｒ ｏｓｐａｔｉａｌ　ｄｉｓｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と無気力（ｔｏｒｐｉｄｉ ｔｙ）が発現した。患者の血液血清の分析は健康なドナーの血液血清中の自己抗 体値に比べて、３倍過剰な、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート結合膜タンパク質 に対する自己抗体レベルを検出した。アル゛ンハイマー病の診断は、実験室方法 によって確認された。

女性患者り、５８歳、推定診断：アルツハイマー病の老年性痴呆。患者の既往歴 は、一過性記憶喪失といらだち（ｐｅｔｕｌａｎｃｅ）を含んだ。この疾患の症 状は疑似神経感染症に続発して発現した。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート結合 膜タンノくり質に対する自己抗体値は、ドナーの血液自己抗体含量よりも１．５ 倍高かった。

を検出した。患者のこの疾患に対する素質が推論された。

本発明をより良好に理解するために、提案するイムノソルベントの製造方法を説 明する幾つかの特定の例を次に述べる。

実施例１ キスカル酸結合膜タンパク質は、−７０℃に保存されたヒト脳皮質から単離され る。脳組織１４０ｇを、フェニルメチルスルホニルフルオリド（０，１１ｍＭ） を含有する０、３２Ｍサッカロース溶液５００Ｑ１１中でホモジナイズし、８０ ０×ｇで１０分間遠心する。次に上清を４層のナイロンガーゼで濾過し、２００ ００Ｘｇで３０分間遠心する。生じる沈殿を水冷蒸留水５００１６１に再懸濁し 、３，０００ｘｇで３０分間遠心する。上清とゆるい沈殿層とを分離し、同じ操 作を２回繰り返し、その後上清を４８０００ｇで３０分間遠心する。得られる膜 フラクションを、３０ｍ）ｌ）リス−塩酸（ｐｆｌ＝７．　４）中の１％洗剤（ デオキシコール酸ナトリウム）溶液中に、４℃で１時間懸濁させる。次に、不溶 性の膜成分を１１０００００Ｘ、１，５時間の遠心で沈殿させて除去する。さら に精製するため、上清を予め調製した吸着剤、即ち３０ａＩＭトリスー塩酸（ｐ Ｈ＝７．　４）に懸濁したグルタタームセフ７０−ス４Ｂ（アフィニティークロ マトグラフィー）と混合する。

このタンパク質と吸着剤の混合工程は、４℃で１６時間行われる。吸着剤をデオ キシコール酸ナトリウム０，５％を含む６倍量のバッファーで洗浄した後、キス カル酸結合膜タンパク質を同じバッファー中の１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶 出し、限外溶解で濃縮する。キスカル酸結合膜タンノくり質の収率は、出発組織 １層当たり約２μｇである。

キスカル酸結合膜タンパク質の免疫原性フラグメントを製造するため、予備的に 単離および精製したタンパク質２００μｇを、２閣１容量中で、トリプシン（米 国シグマ社タイプ■、キスカル酸結合膜タンノくり質１層ｇ当たり酵素１■ｇ） と３７℃で３時間インキュベートする。当量のトリプシンインヒビターを添加し て反応を停止し、反応混合物を、Ｃ−１８を詰めたカラム（４，６Ｘ２５０ｕ＋ ）に通過させる。溶出はアセトニトリルの直線勾配により行う（２０−６８％） 。次に、フラクションをＵＶ−ディテクターによってまとめて、キスカル酸結合 タンノくり質様−免疫反応性の存在を、キスカル酸結合膜タンパク質に対するモ ノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法で調べる。分子量２〜１７ｋＤのキス カル酸結合膜タンパク質の免疫原性フラグメントを含むフラクションを、目的の 免疫吸着剤を製造するために用いる。

次に、免疫検査用の標準的ポリスチレン性トレーをグルタルアルデヒドで活性化 し、上記製造されたタンパク質（６ないし５０ｎＭ）と、４℃で１６時間インキ ュベートする。未結合の活性基を０．　１％水素化ホウ素ナトリウム水溶液で還 元し１、トレーのウェルを０．　９％塩化ナトリウム水溶液とインキュベートし た後、トレーを防腐剤とインキュベートし、真空乾燥する。得られた免疫吸着剤 を癲燗の診断に用いる。

実施例２ メチルスコポラミン結合膜タンパク質は、ブタの脳皮質から単離される。方法は 実施例１に記載したのと同様にして行われるが、１％ＣＨＡＰＳ溶液を界面活性 剤として使用し、アフィニティークロマトグラフィーにはメチルスコポラミン− セファ０−ス４Ｂを使用する。

メチルスコポラミン結合膜タンパク質の収率は、出発組１１１ｇ当たり約２μｇ である。

メチルスコポラミン結合膜タンパク質の免疫原性フラグメントは、実施例１と同 様にして製造される。メチルスコポラミン結合膜タンパク質様免疫反応性の存在 の試験は、ＥＬＩＳＡ法により、メチルスコポラミン結合膜タンパク質の該フラ グメントに対するモノクローナル抗体を用いて行われる。メチルスコポラミン結 合膜タンパク質の免疫原性フラグメントを含むフラクションは、３〜１０ｎＭの 量で、実施例１に記載されたように免疫吸着剤を製造するために用いられ、それ は実際には共有結合でポリスチレントレーに固定された分子量１０ないし２８ｋ Ｄのメチルスコポラミン結合膜タンパク質のフラグメントである。

こうして製造された免疫吸着剤は、パーキンソン疾患の診断に用いる。

実施例３ ダラーギン（ｄａｌａｒｇｉｎ）結合膜タンパク質は、実施例１に記載したよう にして、界面活性剤としてはジギトニンを用い、そしてアフィニティークロマト グラフィーにはグラ−ジン−ω−アミノヘキシル−セファロース４Ｂを用いて、 脳シナプス膜から単離される。

ダラージン結合膜タンパク質の免疫原性フラグメントは、実施例１に記載したの と同様にして製造される。オビエイト（ｏｐｉａｔｅ）結合性タンパク質様免疫 反応性の存在は、ＥＬＩＳＡ法により、グラ−ジン結合性膜タンパク質に対する モノクローナル抗体を用いて、テストする。ダラージン結合性膜タンパク質の分 子量２９ないし４５ｋｌ）の免疫原性フラグメントを含むフラクションを、２〜 ４ｎＭ用いて、免疫吸着剤を製造する（これは実質上、ダラージン結合性膜タン パク質の分子量２９ないし４５ｋＤのフラグメントが実施例１の記載と同様に共 有結合によってポリスチレンに固定されたものである）。

この様にして製造した免疫吸着剤は麻薬中毒の診断に使用する。

実施例４ アポモルフイン−およびスピベロン（ｓｐｉｐｅｒｏｎｅ）−結合膜タンパク質 は、実施例１に記載したようにして、ジギトニンを界面活性剤として使用し、そ してアポモルフイン−およびスビペロンーセファロース４Ｂをアフィニティーク ロマトグラフィーに用いて、ブタ脳のシナプス膜から単離される。アポモルフイ ン−およびスピベロンー結合膜タンパク質の収率は出発組織１ｇ当たり約１．５ μｇである。

アポモルフイン−またはスピペロンー結合膜タンパク質の免疫原性フラグメント は、実施例１に記載したようにして製造される。アポモルフイン−またはスピベ ロンー結合タンパク質様の免疫反応性の存在の試験は、ＥＬＩＳＡ法を用いて、 それぞれの膜タンパク質の反応性フラグメントに対するモノクローナル抗体を用 いて行われる。アポモルフイン−またはスピペロンー結合膜タンパク質の免疫原 性フラグメントを含むフラクションを３ないしｌＱｎＭの量で用いて、免疫吸着 剤を製造するが、これはニトロセルロースに固定された、それぞれアポモルフイ ン−またはスピペロンー結合膜タンパク質の１０ないし１８および２４ないし３ ５ｋＤの分子量のフラグメントである。得られた免疫吸着剤は、精神分裂症（Ｓ ｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）の診断に用いられる。

実施例５ Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート−結合膜タンパク質はブタの脳皮質から、実施 例１に記載したようにして、デオキシコール酸ナトリウムを界面活性剤とじて使 用し、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート−ω−アミノヘキシル−セファロース４ Ｂをアフィニティークロマトグラフィーに用いて、単離される。

Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート−結合膜タンパク質の収率は、出発組織１ｇ当 たり約２μｇである。

Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート−結合膜タンパク質は、実施例１の記載に従っ て製造される。その結果、免疫吸着剤が得られ、これは実質的に２．５なＩ、Ｘ シ３゜５ｎＭの量のＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート−結合膜タンノ（り質の３ ０ないし４２ｋＤの分子量のフラグメントを、実施例１に記載したようにして共 有結合でポリスチレントレーに固定したものである。こうして製造された免疫吸 着剤をアルツハイマー症の診断に用いる。

産業上の利用性 本発明は、医務室および診療所において、神経精神病質の患者のスクリーニング のための診断を行うのに有用である。

手　続　補　正　書

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．担体と該担体上に固定したタンパク質フラグメントからなる、神経精神病質 の診断のための免疫吸着剤において、タンパク質フラグメントが２〜５０ｎＭの 量の２〜４５ｋＤの分子量の哺乳類脳の感覚ニューロンタンパク質のフラグメン トであることを特徴とする、上記吸着剤。
2. ２．タンパク質フラグメントとして、分子量２〜１７ｋＤのキスカル酸結合膜タ ンパク質を含む、請求項１の吸着剤。
3. ３．タンパク質フラグメントとして、分子量１０〜２８ｋＤのメチルスコポラミ ン結合膜タンパク質を含む、請求項１の吸着剤。
4. ４．タンパク質フラグメントとして、分子量２９〜４５ｋＤのダラージン結合膜 タンパク質を含む、請求項１の吸着剤。
5. ５．タンパク質フラグメントとして、分子量１１０〜１８ｋＤのアポモルフィン 結合膜タンパク質を含む、請求項１の吸着剤。
6. ６．タンパク質フラグメントとして、分子量２４〜３０ｋＤのスピペロン結合腹 タンパク質を含む、請求項１の吸着剤。
7. ７．タンパク質フラグメントとして、分子量３０〜４２ｋＤのＮ−メチル−Ｄ− アスパラギン酸結合膜タンパク質を食む、請求項１の吸着剤。
8. ８．試験すべきヒト血清および健康なヒトのコントロール血清を請求項１記載の 免疫吸着剤に適用して、各神経精神病の自己抗体の存在を検出することよりなる 神経精神病質の診断方柱において 免疫吸着剤とし、て、担体および該担体に２〜５０ｎＭの量で固定した分子量２ 〜４５ｋＤの哺乳類脳の感覚ニューロンタンパク質のフラグメントを用いること 、および該感覚ニューロン膜タンパク質に対すモノクローナル抗体を該免疫吸着 に適用して試験システムを構成すること、を特徴とする上記診断方法。
9. ９．担体および該担体に２〜５０ｎＭの量で固定した分子量２〜４５ｋＤの哺乳 類脳の感覚ニューロンタンパク質のフラグメントを、神経精神病質の診断に用い る試験系の確率のために使用する方法。