JPH07505640A - Ｃ反応性タンパク断片の部分修飾及び逆転置テトラペプチド類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ反応性タンパク断片の部分修飾及び逆転置テトラペプチド類似体 本発明は、Ｃ反応性タンパク（以降、ＣＲＰとする）断片の逆転置（ｒｅｔｒｏ −ｉｎｖｅｒｔｅｄ）テトラペプチド類似体に関する。

ＣＲＰは、その血中濃度が一般的には非常に低いが、炎症過程の後には２，００ ０倍にも上昇するタンパク質である［Ｊ、Ｊ、　Ｍｏｒｌｅｙ７０５３−７０５ ７　（１９８７）は、３種類のＣＲＰテトラペプチド配列が、タフトシンのそれ と非常に類似していることを開示している。化学的に合成されたテトラペプチド は、質的、量的にもタフトシンと同様の方法で、食作用を有する白血球を刺激し 、超酸化物（スーパーオキシド）を産生じ、単核細胞によるインターロイキン１ の産生を誘導することが示されている。これら３種のＣＲＰテトラペプチドは、 タフトシンと同様に、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてプロテアーゼにより速やかに代謝 されて、親ペプチドの生物学的活性を競合的に阻害するペプチド代謝物を産生す るはずである。現在では驚（べきことに、該ＣＲＰテトラペプチド断片の、部分 修飾され、Ｎ末端が逆転置された類似体が、タフトシンで既に認められているよ うな免疫調整活性を維持しながらも、酵素による分解に対してかなりの安定性を 示すばかりでなく　（ＥＰ−Ａ−０２５３１９０を参照）、特に、敗血症性ショ ックの治療において特異的に、その構造及び使用量に応じて異なる生物学的効果 を呈しうることが認められた。従って、本発明は、一般式（１）： ［式中、Ｒは水素原子又はスレオニンの側鎖；Ｒ１はアルギニン、ロイシン又は グルタミンの側鎖；及びＲ２は水素原子又は代謝により脱離されるアシル基；但 し、Ｒ１がアルギニンの側鎖である場合、Ｒはスレオニンの側鎖ではない］ で示される逆転置テトラペプチド及びそのジアステレオ異性体、ならびに薬理学 的に許容される塩、エステル及びアミドに関する。

特に、本発明は、逆転置テトラペプチドであるｇＧｌｙ−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ− Ｐｒｏ−Ａｒｇ、ｇＴｈｒ−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、ｇＴｈｒ− （Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ　［式中、接頭辞ｇ及びｍは、アミノ酸が それぞれｇｅｍ−ジアミン及びマロニル残基であることを意味する］、及びそれ らのジアステレオ異性体に関する。

本発明の逆転置テトラペプチドは、当業界の技術者が、逆転置させるアミノ酸の 種類に応じて選択することができる公知の方法により合成される。

例えば、ｇｅｍ−ジアミン残基が１，１−ジアミノメタン基（ｇＧ　１　ｙ）で ある場合、逆転置テトラペプチドは、まず、Ｎ、Ｏ−ビス（トリメチルシリル） アセトアミド（ＴＳＭＡｃ）、トリメチルシリルクロリド（ＴＭＳ−Ｃ１）又は トリメチルシリルシアニド（ＴＭＳＣＮ）などのシラン化剤の存在下で、メルド ラムの酸誘導体、ｃ−ｍＬｙｓ　（Ｚ）（つまり、５−［４−ベンジルオキシカ ルボニル］−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン）を、Ｈ −Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｎ　Ｈ＊と反応させることによって調製してもよい（Ｍ、Ｊ、 Ｏ，Ａｎｔｅｕｎｉｓ　＆　Ｃｈｒ、　Ｂｅｃｕ、　Ｂｕｌｌ、　Ｓｏｃ。

Ｃｈｉｍ、　Ｂｅ１ｇ、、　９６．１１９−１３９．１９８６）　、このように して得られたプソイドペプチド、ＯＨ−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ　（Ｚ）　−Ｇｌｙ −ＮＨ。

（２はベンジルオキシカルボニル）のマロニル残基上の第２の基を、ジシクロへ キシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯ ＢＴ）の存在下でｔ−プチルブロリネートと縮合させて、プソイドトリペプチド ［（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ（Ｚ）　−Ｇ　ｌ　ｙ−ＮＨａ　］　−Ｐ　ｒ　ｏ　Ｈが 得られる。そのプロリンのカルボキシル基は、ＤＣＣ及びＮ−ヒドロキシサクシ ンイミド（ＨＯＳｕ）により活性化させ、保護基を有していないアルギニンと反 応させて［Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　４１９゜１２　（１９８３）　）　、逆転置テトラペ プチド［（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ（Ｚ）−Ｇｌｙ−ＮＨｚ　］−］Ｐｒｏ−Ａｒｇ− Ｏが得られる０次いでその精製を、ＲＰ−ＤＣ置換クロマトグラフィによって行 い、この方法によって、所望であれば、ジアステレオ異性体の分離を行うことも 可能である。精製物は、残存する保護基を除去するために、パラジウムの存在下 でＨＣＯＯＨにより接触水素添加し、次いでグリシンカルボキサミドをｇＧｌｙ のＮ末端残基に変換するために、［Ｉ、Ｉ−ビス（トリフルオロアセトキシ）− ヨード］ベンゼン（ＴＩＢ）により処理するライオン交換クロマトグラフィによ る最終的精製により、最終生成物を酢酸塩として得ることができる。

別の例としては、スレオニンがｇｅｍ−ジアミン残基である例が挙げられる。逆 転置テトラペプチドの合成は、Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＨ及びＨ−Ｙ−ＯｔＢｕの縮合（ ここでＹは、式Ｉの定義における記載に従って、所望であれば適宜保護されてい てもよいアミノ酸Ｌｅｕ又はＧｉｎを表わす）と、続いて接触水素添加によるベ ンジルオキシカルボニル基の除去とによって得られる、Ｃ末端ジペプチドから始 まる。このようなジペプチドは、例えばイタリア国特許出願明細書第２１３４９ 　Ａ／９０号に記載されたように調製されたＮ末端逆転置ジペプチドと反応させ る。

適当なカルボキシ活性化剤の存在下で、予めシラン化されたＨ−Ｔｈｒ　（ｔＢ ｕ）−ＯＨをＭＮＰ−ＣＯＯＨによりアシル化することによって得られたＭＮＰ −Ｔｈｒ　（ｔＢｕ）−ＯＨを、ビフェニルフォスフォラシト（ＤＰＰＡ）で処 理することによって対応するアジドが得られ、これを加熱することによってイソ シアネートが得られる。これを、触媒量のアミン、好ましくはトリエチルアミン もしくはジイソプロピルアミン等の３級アミンの存在下で、チオフェノールで処 理することによって、フェニルチオカルボニル誘導体、ＭＮＰ−ｇＴｈｒ　（ｔ Ｂｕ）−ＰＴＣが得られる。その後、例えば希釈水酸化ナトリウムで処理するこ とによってアミン残基から保護基を除去して、ＭＮＰ−ｇＴｈｒ　（ｔＢｕ）− Ｈな得る。後者の物質とｃ−ｍＬｙｓ　（Ｂｏｃ）との縮合により、Ｎ−末端プ ソイドジペプチド、ＭＮＰ−ｇＴｈｒ　（ｔＢｕ）　−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ　（ Ｂｏｃ）を得、次にこれをＤＣＣ／ＨＯＢＴの存在下でＨ−Ｐｒｏ−Ｙ−ＯｔＢ ｕ　（ここでＹは上記で定義したとおりである）と縮合させて、保護基を有する 式１の逆転置テトラペプチド（ここでＲはｌ−ヒドロキシエチルである）を得る 。酸で処理することにより、ｇｅｍ−ジアミン残基の保護基以外のすべての保護 基が除去される。ＲＰ−ＤＣによる精製と同時に、所望であれば２種類のジアス テレオ異性体を分離することが可能である。

ＭＮＰ基は、例えばスポンジ状パラジウムにギ酸アンモニウムを用いることによ って、接触水素添加により除去してもよい。逆転置テトラペプチドは、適当なり ロフトグラフ法による最終精製に供せられる。

特許請求されているクラスを代表しているいくつかの逆転置テトラペプチドの調 製例をここに述べるが、これは如何なる方法においても本発明を制限することを 意図するものではない。

保護された断片及び逆転置テトラペプチドのアミノ酸誘導体のＨＰＬＣによる分 析は、以下の実験条件で行う：カラム：リクロソルブ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ） 　ＲＰ　−１８；流速：１．５ｍｌ／分； 検出器：メルクＤｌｅｒｃｋ　）　Ｌ−４２００ＵＶ−ＶＩＳ　（２３０又は２ ５４ｎｍ）； 溶離剤Ａ：水９０％、ＭｅＣＮ　１０％、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％ ； 溶離剤Ｂ：ＭｅＣＮ、ＴＦＡ　０．１％；溶離剤Ｃ：水、ＴＦＡｏ、１％； グラジェント：　（Ｉ）：Ａ中０〜４０％（７）Ｂ　（２０’　）　、Ａ中８０ ％までのＢ（１０°）、 （ＩＩ）：Ａ中３７〜８０％のＢ（２０°）、（Ｉｌｌ）：Ｃ中Ｏ〜５０％のＡ （２０°）、１００％までのＡ（３’）、Ａ中４０％までのＢ　（２０’　）、 （ＩＶ）：Ｃ９１０〜４０％のＡ（８°）、１００％までのＡ（２’）、Ａ中４ ０％までのＢ　（２０’　）。

イオン交換精製においては、２２６ｒ＋ｍのフィルターを有するＬＫＢ　ＵＶＩ Ｃ０ＲＤ　Ｓ　ＩＩ検出器、ファルマシア記録計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｒｅｃ ｏｒｄｅｒ）　（チャートスピード＝　０　、　１　ａｍ／分）及びファルマシ アＦＲＡＣ２００フラクションコレクター（ＰｈａｒｍａｃｉａＦＲＡＣ２００ ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ　）を装備したファルマシアＦＰＬＣシ ステム（ＦＰＬＣＳｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を採用する。

各種逆転置ペプチドのアミノ酸及びＮＨ，組成及び比率（ｇｅｍ−ジアミノ残基 の特異的データとして）を、１１０℃で２２時間の６ＭＨＣｌによる加水分解後 に、ベックマンシステムゴールド自動アミノ酸分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＳＹＳ ＴＥＭ　ＧＯＬＤ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ａｍｉｎｏａｃｉｄａｎａｌｙｚｅｒ ）により測定する。

化合物の名称の後ろの括弧内の英数字コードは内部の同定コードである。

実施例Ｉ Ｈ−Ｇｌ　−ＲＳ　ｍＬ　５−Ｐｒｏ−Ａｒ　−ＯＨ・２ＡｃＯＨ（ＩＴＦ　１ １２７） Ａ）　ＨＧｌｙ　ＮＨｚ　・ＨＣｌ　（３，３２ｇ、３０　ｍｍｏｌ）をＴＨＦ ２００ｍｌに懸濁した懸濁液に、ＴＭＳＡｃ　（１９，６ｍｌ、８０１１１１１ １０１）及びＴＭＳ−Ｃ１（２，５４ｍ１．２０ｍｍｏｌ）を連続して加えた。

３０分後、ｃ−ｍＬｙｓ　（Ｚ）（６，９８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、反応混 合物を室温で更に３時間撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、Ｏ，１ＮＨＣ１で ｐｉ（を３に調整しながら、残渣を水（２００ｍｌ）に取った。室温で１時間撹 拌した後、生成した固体をろ過し、水洗し、熱エタノールに溶解した。冷却後得 られた固体をろ過し、エチルエーテルで洗浄し、乾燥した。３．８ｇの（Ｒ，Ｓ ）ｍＬｙｓ　（Ｚ）−Ｇ１．ｙ−ＮＨ！が得られた（収率：５１％）、。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ）（２５４ｎｍ）］　：ｒ、ｔ、１３．５分：純度 ９８％；融点＋１６１”Ｃ（分解）。

’Ｈ−ＮＭＲにより、生成物の構造が確認された。

Ｂ）Ａ）で得られた生成物（３，６５ｇ、１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ） に溶解した溶液に、水浴で冷却しながら、ＨＯＢＴ（１，４３ｇ、１０．５ｍｍ ｏｌ）及びＤＣＣ（１，９６ｇ、９．５ｍｍｏ　ｌ　）を連続して加えた。３０ 分撹拌した後、混合物をろ過し、ＨＣＩ　・Ｈ−Ｐｒｏ−ＯｔＢｕ　（２，４９ ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ　（１，６７ｍ１．１２＋＋＋ｍｏｌ）のＤＭＦ 　（ｌ　０ｍ１）溶液にろ液を加えた。混合物を３時間撹拌した後、溶媒を真空 中で蒸発させ、残渣を酢酸エチル（５０ｍｌ）に取り、有機相を、２％重硫酸カ リウム及び５％炭酸水素ナトリウムにより洗浄し、水で中和し、次いで硫酸ナト リウムにより無水化した。得られた軽油状物質４．２ｇ（収率：８２％）をＤＭ Ｃ及びＴＦＡの混合物（容積比で１＝１．１６＋ｎｌ）に溶解し、１時間撹拌し た。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を酢酸エチル及びエチルエーテルと共に粉砕 し、３．６ｇの［（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ　（Ｚ）−Ｇｌｙ−ＮＨ，］　−Ｐｒｏ− ＯＨを白色固体として得た（収率ニア９％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ）（２５４ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、１４．６及び１ ５．７分（２種類のジアステレオ異性体）；純度９７％。

’Ｈ−ＮＭＲにより、生成物の構造が確認された。

Ｃ）Ｂ）で得られた生成物（３，３６ｇ、７．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ ）溶液に、ＨＯ５ｕ　（０，９５ｇ、８．２５１１ｍｏｌ）を加え、−１０℃に 冷却後にＤＣＣ（１，５４ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４時間撹拌後 、反応混合物をろ過し、Ｈ−Ａｒｇ−ＯＨ（１，７４ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びＫ ＣＩ　（０，７４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ／水（容積比で７：３，１２ ５ｍ１）溶液にろ液を加えた。反応混合物を室温で９０分間撹拌し続け、次いで 溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をエチルエーテルで数回洗浄し、乾燥した。得ら れた固体をＴＦＡ水溶液（容積比で０．１６．３０ｍ１）に溶解し、３回に分け てＲＰ−ＤＣにより精製した。各精製において、ＴＦＡを含む水（容積比で０． １％）により予め平衡化したダへナマックス３００八Ｃ＋ａ　（Ｄｙｎａｍａｘ 　３００人ｃ１．）カラム（２１４ｘ３００＋ｎｍ）に、溶液１０ｍ１を流速２ ．７ｍ１７分で充填した。充填の終了時にカラムを、２．７０１１／分の流速の ままで、５０ｍＭベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド（ＢＤＨ Ａ−Ｃ１）のＴＦＡ含有水溶液（容積比でＯ，１％）で溶離した。約１時間の溶 離後、２．７ｍｌずつのフラクションを集めた。これらのフラクションを、ＨＰ ＬＣ［グラジェント（Ｉ）］により０分して、不純物を含有するフラクションを 除去しながら、他のフラクションは、それぞれ化合物［ｍＬｙｓ　（Ｚ）−Ｇｌ ｙ−ＮＨｚ　］　−］Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯのアイソマーＡ、２種類のアイソマー の混合物、及びアイソマーＢを含有する３群として採取した。３回のクロマトグ ラフィの後に、３群のフラクションを凍結乾燥して、アイソマーＡを１．９ｇ、 アイソマーの（見合物を０．４５ｇ、アイソマーＢを１．８ｇ得た（合計収率： ８９％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ）（２２０ｎｍ）］　：ｒ、ｔ。

１３．６分（アイソマーＡ）、純度＝９６％；ｒ、ｔ、１４．７分（アイソマー Ｂ）；純度９３％＋４％のアイソマー八〇ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝６１９　ａ ｍｕ　［Ｍ＋Ｉｌ］”：　ｍ／ｚ：４８５　ａｍｕ　［Ｍ−Ｚ＋Ｈ］”　（２種 類のアイソマーについて同一のスペクトル）。

Ｄ）新しいスポンジ状パラジウム（約０．１ｇ）を、Ｃ）で得られたアイソマー 混合物（０，３１ｇ、　０．５ｍｍｏｌ’）のギ酸溶液（８５％、５ｍ１）に加 え、混合物を室温で９０分間緩やかに撹拌した。触媒をろ去した後、溶媒を真空 中で蒸発させ、残渣を水に取り、凍結乾燥した。得られた固形分を、ＤＭＦ／水 の混合物（容積比で３＝１．５ｍ１）に溶解し、ＴＩＢ　（０，４３ｇ、１ｍｍ ｏｌ）を加えた。反応混合物を、遮光しながら室温で１６時間撹拌した。溶媒を 真空中で蒸発させ、残渣を水に溶解し、エチルエーテルで洗浄し、凍結乾燥した 。得られた固形分をｐＨ６で水に溶解し、ＣＭ−５２カルボキシメチルセルロー スを充填してｐＨ６の１５＋ｎＭ酢酸アンモニウム溶液で予め平衡化したカラム （６Ｘ　２００ａ＋ｍ）に充填した（流速＝　１　ｍｌ／分）。充填後、カラム を、ｐＨを６に維持しながら、６時間以内で０．１５ｍＭから１５０ｍＭへ酢酸 アンモニウム濃度を変化させる直線状グラジェントにより、流速１　ｍｌ／分で 溶離した。

３ｍｌのフラクションを集め、ＨＰＬＣ［グラジェント（■）］による解析を行 った。標記の生成物（ＩＴＦ　１１２７）を含有するフラクションを集め、数回 凍結乾燥を行った。得られた固形分を無水エタノールに溶解し、エチルエーテル を加えることによって沈殿生成物０．０８５ｇを得た（収率：３０％）。

ＨＰＬＣ：　［グラジェント（ＩＩＩ）］　：　ｒ、ｔ、８．８分（アイソマー Ａ）及び１０．２分（アイソマーＢ）；純度９９％。

ＦＡＢ−ＭＳ＋　ｍ／ｚ＝４５７　ａｍｕ　［Ｍ＋ＩＩ］’同様の操作により、 ０．４２５ｇのアイソマーＡ（ＩＴＦ１３５７）を得た（収率：３０％）。

’　Ｈ−Ｎ　Ｍ　Ｒ（２００ＭＨｚ；　ＤＭＳＯ）ｔ　（ＩＨ；　ＮＨＧ　）　 ８．２５；　ｄ　（ＩＨ；　ＮＨ−Ｒ）　７．２０；　ｒａ　（ｌ）ｌ；　Ｃａ Ｐ　）４．３０；　ｍ　（４Ｈ；　ａＧ；　ａＲ；　δ、Ｐ）　３．９３÷３． ６４；　ｍ　（３Ｈ；δ８Ｐ；δＫ　）　３．６１÷３．３７．　ｔ　（２）１ ；ａＲ）　３．０４；　ｔ　（２Ｈ；εＫ）２．７４゜ｍ（６Ｈ；βＰ；　１’ Ｐ；　βＫ）　２．０９÷１．７９；　ｓ　（６ＨＣＨａＣＯＯｔ（）１．７５ ；　ｍ　（８Ｈ；δに；　γに；　βＲ；　ＴＲ）　１．７０÷１．１８゜アイ ソマーＡに関する操作により、アイソマーＢ　（ＩＴＦ１３５８）として０．４ ５ｇの生成物（収率：３２％）、及び０．１ｇの混合物（ＩＴＦ　１１２７）を 得た。

ＨＰＬＣ：　［グラジェント（ＩＩＩ）　］　：　１０．２分；純度９６％＋ア イソマー八〇 ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝４５７　ａｍｕ　［Ｍ十用’Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨ ｚＨＤＭＳＯ）ｔ　（ＩＨ；　ＮＧ）ｌ　）　８．３０；　ｄ（０，４Ｈ；　Ｎ ＯＲ）　７．５７；　ｄ　（０，６Ｈ；　ＮＯＲ７，４７；　ｒｎ　（ＩＨ；　 ＣａＰ　）　４．４３；　ｍ（３８；　ａＧ；　ａＲ）　３．９７　÷３．８２ ；　ｔｎ　（４Ｈ；　δＰ；　δＫ　）　３．６３−４−３．３３；　ｒａ　（ ２）１；　δＲ）　３．０６；ｍ　（２Ｈ；　ＥＫ　）　２．７２；　ｓ　（６ Ｈ０（−ＣＯＯ−）　１．７６；　ｍ　（１４Ｈ；　β　γＰ；β、　γ、δに ；　β　、γＲ）１．２１÷　１．１５゜実施例２ Ｈ−Ｔｈ　−ＲＳ　ｍＬ　５−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＨＡｃＯＨ（ＩＴＦ　１１９ ２） Ａ）ビス（トリクロロメチル）カーボネート（３，７１ｇ、１２、　５ｍｍｏｌ ｅ　）のメチレンクロリド（１２５ｍｌ）溶液に、メチレンクロリド（８０ｍｌ ）中の１−メチルイミダゾール（５，９６ｍ１．７５　ｍｍｏｌｅ　）を０℃で 加えた。５分後、メチレンクロリド（８０ｍｌ）に溶解したＭＮＰ−ＯＨ（５， ６３ｇ、２５ｍｍｏｌｅ　）を加え、更に５分後、ＴＭＳＣＮ　（１１，３ｍｌ 、９０ｍｍｏｌｅ　）により予めシラン化したＨ−Ｔｈｒ　（ｔＢｕ）−ＯＨ（ ５，２６ｇ、３０　ｍｍｏｌｅ　）を加え、更にメチレンクロリド２００ｍ１を 加えた。

１０分後、反応混合物を、ｐＨ３，５に酸性化した水性緩衝液で洗浄し、無水化 し、蒸発乾固させた。残渣を５％炭酸ナトリウム（３００ｍｌ）に取り、メチレ ンクロリドで洗浄した。水相に更に酢酸エチル２００ｍ１を加え、ｐＨを５．７ に調節した。有機相を分離・無水化し、溶媒を蒸発させ、ＭＮＰ−Ｔｈｒ　（ｔ Ｂｕ）−ＯＨを油として得た（６．５ｇ、収率：６８％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ）（２５４ｎｍ）］　：ｒ、ｔ、２５．１分；純度 二８８％。

Ｂ）Ａ）で得られた化合物（５，２ｇ、１３．６ｍｍｏｌｅ　）の無水トルエン （５０ｍｌ）溶液に、ＤＰＰＡ　（３，２２ｍ１，１４．９ａ＋ｍｏｌｅ）及び ＴＥＡ　（２，０９ｍ１．１４．９ｍｍｏｌｅ　）をＯ”Ｃで加えた。４時間後 、反応混合物を、いずれも予めＯ’Ｃに冷却しておいた炭酸水素ナトリウムの飽 和溶液で３回及び塩化ナトリウム飽和溶液で洗浄し、次いで無水化した。アジド を含む本溶液を８０”Ｃまで加熱し、その温度で４０分間保持した。生成するイ ンシアネートにチオフェノール（１、３９ｍ１．　１３．６ｍａ＋ｏｌｅ　）及 び触媒量のＴＥＡ（１９１ｕｌ　、１．３６ｍｍｏｌｅ　）を室温で添加した。

−夜の後、混合物を酢酸エチル及び水で処理し、有機相を、２％重硫酸カリウム 、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で中和し、次いで硫酸ナトリウムで無水 化し、蒸発乾固して、得られた油を石油エーテルと共に粉砕した。４．７ｇのＭ ＮＰ−ｇＴｈｒ　（ｔＢｕ）−ＰＣＴが得られた（収率ニア１．２％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（ＩＩ）（２５４ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、１４．９分； 純度：９５％。

Ｃ）０℃に保持した水酸化ナトリウム（ＬＭ、２６ｍ１＞及び水（８７７ｍｌ） の混合物に、Ｂ）で得られた化合物（４，７ｇ、９．６關ａｌｅ　）のＴＨＦ　 （６４＋ｎｌ）溶液を徐々に加えた。添加終了５分後に、反応混合物をＨＣＩ　 （ＩＭ、２６ｍ１）で中和した。

ＴＨＦを蒸発させ、クロロホルム（８０ｍｌ）を加え、この２相性混合物のｐＨ を、１Ｍ水酸化ナトリウムで９．０に調節した。有機相を分離し、水相をクロロ ホルムで３回、毎回ｐＨを９．０に調節しながら処理し、有機相を集め、蒸発乾 固させた。残渣をエチルエーテルに再懸濁させて水（５０ｍｌ）を加え、混合物 を、ＩＭＨｃＩでｐｏ３．ｓになるように一定のｐＨとなるまで滴定した。水相 を分離し、処理を２回繰り返した。水相を集め、凍結乾燥して、２．８ｇのＭＮ Ｐ−ｇＴｈｒ　（ｔＢｕ）−Ｈ−ＨＣｌを得た（収率：８５％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ）（２５４ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ。

１６．４３分；純度：９９．９％。

Ｄ）Ｃ）で得られた化合物（２，６ｇ、６．６ｍｍｏｌｅ　）及びＣ−ｍＬｙｓ 　（Ｂｏｃ）（２，４ｇ、８ｍｍｏｌｅ　）のＴＨＦ（１２０ｍｌ）溶液に、　 ＴＭＳＡｃ　（４，６ｍ１．２０ｍｍｏｌｅ　）を徐々に加えた。

２０時間後、反応混合物を蒸発させ、残渣を水に取り、酢酸エチルの存在下でＩ ＭＨＣＩによりｐＨを３．５に調節した。水相を酢酸エチルで３回抽出し、集め た有機相を無水化し、容積を減らし、ジイソプロピルエーテルを加えて、３．４ ｇ（７）ＭＮＰ−ｇＴｈｒ（ｔＢｕ）−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ　（Ｂｏｃ）−ＯＨ を得た（収率：８５％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（ＩＩ）（２３０ｎｍ）］　ｒ、ｔ、９．９分及び１０ ．２分（２種類のジアステレオ異性体）；純度９３％。

Ｅ）Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＨ（２，４ｇ、１０ｍｍｏｌｅ　）及びＨ−Ｌｅｕ−ＯｔＢ ｕ−ＨＣｌ　（２，７ｇ、１２ｍｍｏｌｅ　）のメチレンクロリド（５０ｍｌ） 溶液に、ＴＥＡ（３ｍｌ、２２　ｍｍｏｌｅ　）を加え、続いてＢＯＰ　（４， ４ｇ、１０＋＋＋ｍｏｌｅ　）及びＨＯＢＴ　（１，３５ｇ、１０ｍｍｏｌｅを 加えた。５時間後、反応混合物を塩化ナトリウム飽和溶液で１回処理し、ついで 蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチル及び水に分け、有機相を２％重硫酸カリウム 、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で中和し、硫酸ナトリウムで無水化し、 次いで乾燥し、残渣をジイソプロピルエーテルに溶解して、石油エーテルの添加 により、３．８ｇのＺ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕを得た（収率：９２．７％） 。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ）（２３０ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、２８．６分；純 度１００％。

Ｆ）Ｅ）で得られたジペプチド（１，５ｇ、３．５ＩＩ＋ｍｏｌｅ　）をメタノ ール（７０ｍｌ）に溶解し、窒素下で本溶液にＰｄ／Ｃ触媒（１００ｍｇ）を加 え、次いで非常に緩徐にトリエチルシラン（２，９ｍｌ、１８ｍｍｏｌｅ　）を 加えた。３時間後、反応混合物をろ過し、溶媒を蒸発させ、１ｇのＨ−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−ＯｔＢｕを得た（収率：１００％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ）（２３０ｎｍ）］　ｒ、ｔ、１５．９分：純度９ ３％。

−Ｇ）Ｄ）で得られたプソイドジペプチド（１，１ｇ、１　、９ｍｍｏｌｅ）の メチレンクロリド（１５ｍｌ）溶液に、ＤＭＦ　（２００ｍｌ）に溶解したＨＯ ＢＴ（３２０ｍｇ、２　、３ｍｍｏｌｅ　）を加えた。温度を０℃にし、ＤＣＣ Ｉ　（３９２ｍｇ、１　、９ｍｍｏｌｅ　）を加えた。１５分後、混合物を、Ｅ ）で得られたＣ末端ジペプチド（５４０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌｅ　）を含むフラ スコ中でろ過し、−夜反応させた。溶媒を蒸発させた後、残渣を酢酸エチル及び 水に分け、有機相を２％重硫酸カリウム、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水 で中和し、次いで硫酸ナトリウムで無水化した。残渣をジイソプロピルエーテル と共に粉砕することによって、乾燥した有機相から、１２．３ｇのＭＮＰ−ｇＴ ｈｒ　（ｔＢｕ）　−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ　（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｏｔ Ｂを得た（収率ニア７％）。

ＨＰＬＣ：　６５％のＢ　（２３０及び２５４　ｎ＋ａ）と同様：ｒ、ｔ。

８．２分及び８．６分；純度；１００％。

Ｈ）Ｇ）で得られた化合物の一部（１，４ｇ、１　、３ｍｍｏｌｅ　）を、氷浴 中、ｌｌ４ＨＣＩ　（５ｍｌ）で８分間処理した。反応混合物を蒸発乾固させ、 次いで水に取り、凍結乾燥した。９１０ｍｇの粗生成物を得、これを、ディスプ レーサ−として臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム（９０％水、１０％ アセトニトリル、及び０．１％ＴＦＡ中に溶解した５０ｍＭのＢＤＤＡ−Ｂｒ） を用い、流速２．７ｍｌ／分で、グイナマックス力ラム（Ｄｙｎａｍａｘ　ｃｏ ｌｕｍｎ）（３００人　０１８．１２μｍ、２１ＸｂＤＣにより精製した。この ようにして、ＭＮＰ−ｇＴｈｒ−ｍＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＨの３分画、つ まり３２０ｍｇのアイソマーＡ、３２０ｍｇのアイソマーＢ、及び１６０ｍｇの ジアステレオ異性体、見合物を回収した。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ＞（２３０ｎｍ）］　ｒ、ｔ、１６．１分及び１８ 分；純度９９．９％。

Ｉ）Ｈ）で得られたアイソマーＡ　（３１５ｍｇ、　０．４ｍｍｏｌｅ　）をメ タノール（１５ｍｌ）に溶解し、ギ酸で活性化されたスポンジ状Ｐｄ及びギ酸ア ンモニウム（１２０ｏ＋ｇ）のギ酸（５＋ｏｌ）溶液を加えた。

２時間後、触媒をろ去し、溶媒を蒸発させた後、残渣を水に取った。水相をエチ ルエーテルで洗浄し、凍結乾燥して、２００　ｍｇ＠粗生成物を得、これを、ｐ Ｈ６，０の０．０１５Ｍ酢酸アンモニウム（Ａ）及びｐＨ６，０の０．３Ｍ酢酸 アンモニウム（Ｂ）を溶離液として、Ａ中Ｂを０〜２５％に変化させる直線状グ ラジェント（３０’）により、Ｓ−セファロースファストフロー（Ｓ−３ｅｐｈ ａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　）のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　） 　Ｘ　Ｋ１６カラム（１６Ｘ２００ｍｍ）によるイオン交換により精製し、次い で流速３　ｍｌ／分で４０分間同様に精製した。２分ごとに採取したフラクショ ンをＨＰＬＣにより分析し、標記の生成物を含有するフラクションを凍結乾燥し た。

ＨＰＬＣ［グラジェント（ＩＩＩ）　（２３０ｎｍ）　］　ｒ、ｔ、１２．８分 ；純度９７％。

アミノ酸組成：Ｐｒｏ　（１）１．０毒Ｌｅｕ　（１）１．０；ＮＨ。

（２）１．９；ペプチド含有率：　７７　μｍｏｌｅ　（４０ｍｇ１収率：２０ ％）。

’Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ；　’Ｈ−ＤＭＳＯ；　３０”Ｃ）　（フィン？− Ａ−ＩＴＦ１４３２）　：ｄ　（ＩＨ；　ＮＨ−、Ｔ　）　７．７９；　ｄ　（ ＩＨ；　ＮＨ−Ｌ）　６．９３；　ｍ（２Ｈ；　Ｃａ−Ｐ、Ｃａ−、Ｔ　）　４ ．３１÷４．２１；　ｑ　（ｌ）ｌ；　Ｃａ−Ｌ）　３．８４；ｍ　（ＩＨ；　 Ｃａ−Ｐ）　３．７４；　ｍ　（３）１；　Ｃａ”ｐ、ｃβ−ｇＴ；　Ｃａ−ｍ Ｋ　）３．６３÷３．３７；　ｍ　（２Ｈ；　Ｃｔ−ｍＫ　）　２．７５；　ｍ （４Ｈ；　Ｃａ、　Ｃｙ−Ｐ）２．１９−４−１．７４；　ｍ　（９Ｈ；　Ｃａ 、ｃγ＋　ｃδ−ｍＫ；　Ｃａ、Ｃｙ−Ｌ）１．７３−１−１．１３；　ｄ　（ ３８；　Ｃｙ−、Ｔ　）　１．０６；　ｄ　（３Ｈ；　ＣＩ５’Ｌ）　０．８８ ；ｄ（３Ｈ；　Ｃａ２Ｌ）　０．８７゜ アイソマーについて行ったのと同様の操作を行い、アイソマーＢ（ＩＴＦ　１４ ４３）を得た。

’Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ；　’Ｈ−ＤＭＳＯ；　３０℃）ｄ　（０，９Ｈ； 　ＮＡＨ−、Ｔ）　８．１３；　ｄ　（０，ＩＨ，Ｎ’Ｈ−、Ｔ）　８．０３； 　ｄ　（０，１１（：Ｎ”Ｈ−Ｌ　）　？、４５；　ｄ　（０，９ｔ（；　Ｎ’ Ｈ−Ｌ　）　７．３６；　ｍ　（２Ｈ；　Ｃ（１−Ｐ。

Ｃａ−、Ｔ　４．３７÷４．２４：　ｍ　（ｉｔ（；　Ｃａ−Ｌ）　３．８６； 　ｍ（３Ｈ；　Ｃａ−Ｐ；Ｃａ−、Ｔ）　３．５６÷３．３８；　ｍ　（１ｔ＋ ；　Ｃａ−ｍＫ　）　３．１６；　ｍ（２Ｈ；Ｃｔ−ｍＫ　）　２．７６；　ｍ 　（１３ｔ（；　Ｃａ、ｃγ　Ｐ；　ｃβ、Ｃｙ、Ｃａ−畦；Ｃａ。

Ｃｙ−Ｌ）　２．２３÷１．＋５；　ｄ　（３ｔ＋；　Ｃｙ−、Ｔ　）　１．０ ３；　ｄ　（６）１；　Ｃａ−１，）０．８８゜ 実施例３ Ｈ−Ｔｈｒ−ＲＳ　ｍＬ　５−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−ＯＨ・ＡｃＯＨ（ＩＴＦ　１１ ９３） Ａ）Ｚ−Ｇｉｎ−ＯＨ（５，６ｇ、２０　ｍｍｏｌｅ　）を氷酢酸（６０ｍｌ） にｌ８解し、Ｔｒｔ−ＯＨ（Ｔｒｔはトリチル）（１０，４ｇ、４０ｍｍｏｌｅ 　）　、　ＡＣ２０（３，７７ｍ１．４０ｍｍｏｌｅ　）及び硫酸を加えた。反 応混合物を５０℃に加熱し、この温度に９０分間保持し、次いで室温に冷却し、 水で処理した。得られた沈殿物をろ過し、水に懸濁し、酢酸エチルで３回抽出し た。有機相を集め、無水化した後、濃縮及びｎ−ヘキサンの添加により、８．１ ２ｇのＺ−Ｇｉｎ　（Ｔｒｔ）−ＯＨ沈殿物を得た（収率ニア７％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（ＩＩ）　（２３０ｎｍ）　］　ｒ、　ｔ、１１．３分 ：純度１００％。

Ｂ）Ａ）で得られた生成物（４ｇ、７．６ｍｍｏｌｅ　）のメチレンクロリド（ ５０ｍｌ）溶液に、ボロントリフルオロエーテラート（１５３μｍ）及びｔ−ブ チル−２，２，２−トリクロロアセトイミデート（ＴＢＴＡ　；　４．　２　ｇ 、１５．３ｍｍｏｌｅ　）を加えた。１０分後、反応混合物を、炭酸水素ナトリ ウムの飽和溶液で１回、更に水で洗浄し、次いで無水化して、蒸発乾固させた。

得られた残渣をメタノール（６０ｍｌ）に溶解し、水の添加により、３．５ｇの Ｚ−Ｇｉｎ　（Ｔｒｔ）−０ｔＢｕの沈殿物を得た（収率：８１％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（ＩＩ）　（２３０ｎｍ）　］　ｒ、　ｔ、１７．　７ 分；純度１００％。

Ｃ）Ｂ）で得られた化合物（２，５ｇ、４．３ｍｍｏｌｅ　）をメタノール２０ ０ｍ１に溶解した溶液を窒素で飽和し、ギ酸で活性化されたスポンジ状Ｐｄ、及 びギ酸アンモニウム溶液（５＋ｏｌ中２００ｍｇ）を添加した。３時間後、触媒 をろ去し、メタノール溶液を蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチルに取り、５％炭 酸水素ナトリウムで１回洗浄し、次いで水で中和した。有機溶液を無水化し、少 量に濃縮し、次いで０℃に冷却し、酢酸エチル中１等量のＨＣｌで処理した（４ Ｍ、１．０８ｍ１）。次いで石油エーテルを添加することによって、２ｇのＨＣ Ｉ　−Ｇｌｎ　（Ｔｒｔ）−０ｔＢｕの沈殿物を得た（収率：１００％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（ＩＩ）（２３０ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、７．４分；純 度１００％。

Ｄ）Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１，１５ｇ、４．６ｍｍｏｌｅ　）をメチレンクロリド （１５ｍｌ）に溶解し、ＤＭＦ　（２５０μｌ　）に溶解したＨＯＢＴ　（０， ７ｇ、５．５ｍｍｏｌｅ　）を加えた。水浴中で本溶液にＤＣＣＩ　（０，９５ ｇ、４．６１℃１ｍｏｌｅ　）を加えた。１５分後、反応混合物を、Ｃ）で得ら れた化合物（２ｇ、４．　１ｍｍｏｌｅ　）を含むフラスコ中でろ過し、ＴＥＡ 　（５８７μｌ　、　４．　１ｍｍｏｌｅ　）で中和した。１８時間後、溶媒を 蒸発させ、残渣を酢酸エチル及び水に分け、有機相を２％重硫酸カリウム、５％ 炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で中和し、次いで硫酸ナトリウムにより無水化 した。少量に濃縮した有償溶液から、ｎ−ヘキサンの添加により２．６ｇのＺ− Ｐｒｏ−Ｇｉｎ　（Ｔｒｔ）−０ｔＢｕを得た（収率：９３％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（ＩＩ）（２３０ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、１６．８分； 純度１００％。

Ｅ）Ｄ）で得られた保護基を有するジペプチド（２，４ｇ、３、５ｍｍｏｌｅ　 ）を、Ｃ）におけるのと同様に、スポンジ状Ｐｄ及びギ酸によりメタノール１０ ０ｍ１中で水素添加した。触媒をろ去し、メタノールを蒸発させた後、残渣を酢 酸エチルに取り、５％炭酸水素ナトリウムで１回洗浄し、無水化した。濃縮した 有機相を、Ｏ’Ｃで酢酸エチル中ＨＣＩで処理しく４Ｍ、８７５μｌ）、石油エ ーテルを添加することによって２ｇのＨＣＩ・Ｈ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ（Ｔｒｔ）− ０ｔＢｕを得た（収率：１００％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（ＩＩ）（２３０ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、７．８分；純 度１００％。

Ｆ）実施例２、Ｄ）で得られたプソイドジペプチド（１，３８ｇ、２　、２６ｍ ｍｏｌｅ　）のメチレンクロリド（１５ｍｌ）溶液に、２００μｍのＤＭＦにン 容解したＨＯＢＴ　（３８２ｍｇ、２　、８２ｍｍｏｌｅ　）を加Ａ、ｆ、＝。

温度を０℃にし、ＤＣＣＩ　（４６６Ｂ、２　、２６ｍａ＋ｏｌｅ　）を添加し た。１５分後、混合物を直接、Ｅ）で得られたジペプチド（１、３１ｇ、　２． 　２６ｍＩＩＩｏｌｅ　）を含むフラスコ中でろ過し、ＴＥＡ　（３１８μｌ　 、２．２６ｍｍｏｌｅ　）で中和し、−後反応させた。溶媒を蒸発させた後、残 渣を酢酸エチル及び水に分け、有機相を２％重硫酸カリウム、５％炭酸水素ナト リウムで洗浄し、水で中和し、次いで硫酸ナトリウムにより無水化した。有機相 を蒸発乾固させ、次いで酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（容積比１：１．１５ｍ１） に取り、ｎ−ヘキサンの添加により２．３ｇのＭＰＮ−ｇＴｈｒ（ｔＢｕ）−（ Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ　（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ（Ｔｒｔ）−０ｔＢｕを得た（ 収率：９２％）。

ＨＰＬＣ［グラジェント（旧　（２３０ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、２１．５分及び ２２．０分く２種類のジアステレオ異性体）；純度９２．５％。

Ｇ）Ｆ）で得られた逆転置テトラペプチド（２，１３ｇ、１．８７ｍｍｏｌｅ　 ）を、室温でメチレンクロリド／ＴＦＡ（容積比１：１．４０ｍ１．）に溶解し た。９０分後、溶媒を蒸発させ、エチルエーテルの添加により粗沈殿物を得た。

このようにして１．４１６ｇのＭＰＮ−ｇＴｈｒ−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ−Ｐｒｏ −Ｇｉｎ−ＯＨを得た（収率：９５％）。

ＨＰＬＣ［グラジエンｔ・（Ｉ）（２３０ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、１２．４分； 純度９１．５％。

アミノ酸組成：Ｐｒｏ　（１）１．Ｏ；Ｇｌｙ　（１）１．Ｏ；ＮＨ。

（３）２．９；ペプチド含有率＝９２．７％。保護された逆転置テトラペプチド を、ディスプレーサ−としてＢＤＤＡ−Ｂｒ　（水中５０ｍＭ、ｏ、ｉ％ＴＦＡ ）を用いたダイナマックス（Ｄｙｎａｍａｘ　）（３００八　Ｃ１８，１２ｇｍ 　、２１．４Ｘ３００ｍｍ）カラムによるＲＰ−ＤＣにより流速２．７＋ｎｌ／ 分で精製した。このようにして１．０４ｇの生成物を回収した（収率：８１％） 。

ＨＰＬＣ［グラジェント（Ｉ）（２３０ｎｍ）］　：ｒ、ｔ、１２．４分；純度 １００％。Ａ中０〜２０％のグラジェント（２０分）＝ｒ、ｔ、１７．５分及び １７．８分（２種類のジアステレオ異性体）：純度：１００％。

Ｈ）Ｇ）で得られた保護基を有する逆転置テトラペプチド（８７５ｍｇ、１　、 　１　ｍｍｏｌｅ　）をギ酸アンモニウム水溶液（０，２５Ｍ　、　ｐｔ（３， ０）　１５ｍｌに溶解し、ギ酸アンモニウム（０，５Ｍ　、ｐＨ３，０）により 活性化されたスポンジ状Ｐｄに添加し、６０℃で１５分間反応させた。ＨＰＬＣ により出発化合物の消失が認められるまで、反応温度を７０℃に引き上げてこの 処理を４回繰り返した。触媒をろ去し、水相をエチルエーテルで洗浄し、凍結乾 燥した。粗生成物を、ｐｏｅ、ｏの０．０１５Ｍ酢酸アンモニウム（Ａ）及びｐ Ｈ６，０の０．３Ｍ酢酸アンモニウム（Ｂ）を溶離液として、Ｂを０〜１００％ へと変化させる直線状グラジェントにより、ＣＭ−セファデックス（ＣＭ−３ｅ ｐｈａｄｅｘ　）　Ｃ−２５のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　Ｘ　Ｋ 　２６カラム（２６Ｘ３００ｍｍ）によるイオン交換により精製した（３６０分 、流速４＋ｎｌ／分）。３．７ｍｌのフラクションを集め、標記の生成物を含む ことが認められたフラクションを凍結乾燥した。

ＨＰＬＣ［グラジェント（［Ｖ）（２３０ｎｍ）］　：　ｒ、ｔ、６．５分及び ７．７分（１：１の比率の２種類のジアステレオ異性体）；純度：９９％。

アミノ酸組成：Ｐｒｏ　（１）１．Ｏ；Ｇｉｎ　（１）１．Ｏ；ＮＨ。

（３）２．９；ペプチド含有率＝９６６μｍｏｌｅ　（５１５ｍｇ）　；収率８ ８％。　’Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ　；　ＤＭＳＯ）ｄ　（０，５Ｈ；　ＮＨ Ｔ）　８．２６；　ｄ　（０，５Ｈ；　ＮＨＴ　）　７．９９；　ｄ　（０，５ Ｈ；　ＮＨＱ　）７．４９：　５（ＩＨ；　ＮＱ）　７．３１；　ｄ（０，５Ｈ ；　ＮａＱ）　７．０４；　５（ＩＨ；ＮａＱ）　６．６７；ｍ（ＩＨ；　Ｃａ Ｔ）　４．３１；ｍ（ＩＨ；　ＣａＰ）　４．２２；ｍ　（２ｔｌ：　ＣａＱ； 　（：δＰ）３．８３÷３．７０；　ｍ　（３１（；　ＣａＴ；　ＣｃｚＫ；Ｃ δ’Ｐ）　３．６４÷３．３４；　ｍ　（２Ｈ；　ＣＥＫ　）　２．７４；　ｍ （８Ｈ；　Ｃｌ５Ｐ；ＣＢＫ：　Ｃａ　ｅＣγＱ　）　２．１７÷１．６６；　 ｓ　（６ＨＣＨｍＣＯＯＨ）　１．８５；ｒｎ　（６Ｈ；　ＣｙＰ；　Ｃｙｅ　 ＣδＫ）１．６４÷１．１２；　ｔ　（３Ｈ；　ＣｙＴ　）１．０４　。

本発明の代表的な化合物に関し、その生物学的活性の試験を行った。

マウス牌　によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおしるＩＦＮ−の１ＢＡＬＢ／Ｃマウスの 牌臓より牌細胞を採取し、単細胞懸濁液とした。このようにして得られた牌細胞 を、ウシ胎児血清（Ｆｅ２）（Ｉ（ｙｃｌｏｎｅ、　ＳＴ、　Ｕｔａｈ、　ＵＳ Ａ）を５％含むＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ、、　Ｈｅｒｔｚ、 　ＵＫ）に最終濃度が１０７細胞／ｍｌとなるように再ｇｌし、９６ウエルのプ レート中で、表示した濃度の試験化合物の存在下で３７℃で２４時間インキュベ ートした。インキュベーション終了時に上清を採取し、２２μｍのフィルターで ろ過し、ＥＬＩＳＡの市販キット（Ｇｅｎｚｙｍｅ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ、 　ＵＳＡ）により試験を行うまで一８０℃で凍結保存した。

結果を表１に示す。

表１ 用　量　Ｕ／ｍｌ　（刺激指標） ／ｍｌ　１　２　３ ０（対照）　３１　３１　４１ ０．１　３３（１，１）　５７（１，８）　６０（１，５）１．０　６０　（１ ，９）　５２　（１，７）　６０　（１，５）１０．０　４９　１．６　６０　 １．９　６８　１．７Ｕ／ｍｌ及び対照（非処理細胞）に関する刺激指標（Ｉｓ ）として得られた結果は、本発明の化合物が、マウスの牌細胞にょるＩ　ＦＮ− γの産生を投与量に依存して刺激する能力を有することを示した。

特に実施例１の化合物は、本りラス中最も強力な化合物であることが示された０ 本化合物は実際、既に１．０μｇ／ｍｌの用量で問題のサイトカインを倍増させ た。

マウス　マクロファージによるＩＬ−１の１加水分解デンプン（ＢＤＨＣｈｅｍ ｉｃａｌｓ、　Ｐｏｏｌｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ、　ＵＫ）溶液をＢＡＬＢ／Ｃマウ スの腹腔に接種し、３日後に屠殺することによって、マウス腹腔マクロファージ を得た。ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ　１６４０溶液で腹腔内を洗浄することに よって腹腔細胞を集め、９６ウエルのプレート中、同溶液中１０６細胞／ｍｌの １度に再懸濁した。本願化合物の存在下、３７℃で９６時間、インキニベーショ ンを行った。処理の終了時に上清を集め、適当なＥＬＩＳＡ市販キット（Ｇｅｎ ｚｙｍｅ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ、　ＵＳＡ）によるサイトカインの測定に上 清を用いた。

結果を、表２に示す。

表２ 用　量　Ｕ／ｍｌ　（刺激指標） ７ｍ１　１　チ２３ ０（対照）　１５　１５　１５ ０．０１　６　（０，４）　９０　（６，０）　１５０　（１０，０）０．１　 ２　（０，１）　６０　（４，０）　１６０　（１０，７）１．０　２（０，１ ）　４７　（３，１）　１５５　（１０，３）１０．０　２　０．１　５０　３ ．３　１４０　９．３Ｕ／ｍｌ及び対照に関するＩＳとして得られた結果は、被 験化合物が顕著な刺激効果を示すことを明らかにしている。特に実施例３の化合 物は、用いたいずれの用量においてもＩＬ−１の産生な約１０倍増加させた（９ ．３＜Ｉｓ＜１０．７）。

マウス　による　−のｌ 前記試験に記載したのと同様に腹腔細胞を得、本願化合物及び３０μｇ／ｍｌの 濃度のリボ多糖の存在下で、３７℃で９６時間インキュベートした。処理終了時 に上清を集め、酸化窒素含有量を。

Ｐａｌｍｅｒ　Ｒ，Ｍ、Ｊ、らによりＮａｔｕｒｅ、　３２７．５２４．１９８ ７に記載されている化学発光試験により測定した。

結果を表３に示す。

表３ 用　量　ｎｍｏｌ／ｍｌ　（刺激指標）／ｍｌ　１ｆｉ　１　夕１２　１３ ０（対照　２０　２０　’　２０ ｏ、０１　４３　（２，２）　８５　（４，３）　ｓＯ（２，５）０．１　５９ （３，０）　６１（３，１）　６０（３，０）１．０　７７　（３，９）　６６ 　（３，３）　６６　（３，３）１０．０　５７（２，９７９４，０）　８８（ ４，４Ｈｍｏｌ／ｍｌ及び対照に関する刺激指標として得られた結果は、本発明 の化合物が、使用したいずれの用量においても、酸化窒素の産生を刺激すること を示している。特に実施例２の化合物は、既に０．０１μｇ／ｍｌの濃度で刺激 ピークを示した（ＩＳ＝４．３）。

マウス　マクロファージの′リーシュマニア゛′　（こ・　る六上述したように 得た腹腔細胞を、９６ウエルの平底プレート（Ｎｕｎｃ、　Ｒｏｓｋｉｌｅｄ、 　ＤＫ）に１０　’／ＩＱＯＢ　ｌの１度で蒔き、３７℃で２４時間インキュベ ートした。処理終了時にウェルに接着していない細胞を分離して捨て、接着して いた細胞は、培地で３回洗浄し、本願化合物と共に２４時間インキュベートした 。次いで細胞を、リーシュマニア・メジャー（匡江匡弘ｎ」Ｕ肛、叶、　Ｎｅａ ｌ　Ｒ，Ａ、。

Ｌｏｎｄｏｎ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｈｙｇｉｅｎｅ　ａｎｄ　Ｔｒｏｐｉｃａ ｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫより供与されたＰＶＬ４９株）のプ ロマスティボートと共に２４時間インキュベートして感染させた。感染処理終了 時に、各ウェルに０．０１％ドデシル硫酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ　１６４０ 溶液を１００μｌずつ添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした 。ＦＣＳを３０％含むシュナイダー培地（５ｃｈｎｅｉｄｅｒＤｒｏｓｏｐｈｉ ｌａ　ｍｅｄｉｕｍ、　Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ、、　Ｇｒａｎｄ　１ｓｌａｎｄ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＵＳＡ）を添加し、各ウェルに、１ＬＬＣ１の３Ｈ−チ ミジンを添加し、３７℃で７２時間インキュベートした。腹腔細胞内に生存して いる寄生虫による放射活性の取り込みは、感染の程度と相関しており、したがっ て細胞の殺リーシュマニア活性と相関している。この取り込みを、細胞採取器（ ｃｅｌｌ−ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用いて細胞を採取し、液体シンチレーション β−カウンターにより放射活性を測定することによって測定した。

結果を表４に示す。

表４ 用　量　ｃｐｍ”　（感染減少％）°０（／ｍｌ　１　１２　３ （対照）　１ｇ、２７３　１８．２７３　１８．２７３０．１　５，０９６（７ ２）　１７，５６８（４）　１８，８２６（−３１１，０３，７８３（７９）　 １１，９９１（３４１８，３７７（５４）１０．０　４２９２（７７）１０．５ ８２４２）　７，８４２＜５７）１１分あたりのカウント数 得られた結果により、本発明の化合物は、感染程度を低下させる能力があること が示された。特に実施例１の化合物は、非常に強力であることが示され、事実、 本化合物は試験で用いた最少用量で既に７０％以上もの感染の低下をもたらした 。

暖ｌ匡１ｚ１旦るｉｎ　ｖｉｖｏでノ（；交−）計体重２０〜２５ｇのＢＡＬＢ ／Ｃマウス（１群６匹）の腹腔に、５０　Ｂ／ｋｇのＬＰＳ　（リボ多糖、Ｓｉ ｇｍａ　）を接種した。対照以外の群には、最終容量が０．５ｍｌになるように 生理食塩水に溶解した本発明の化合物のいずれかを、ＬＳＰ接種後０分（つまり ＬＰＳと同時）又は３０分後に、用量を増量しながら接種した。マウスは８日間 観察し、生存率をめた。実施例１の化合物は、６．２μｇ／マウス及び０．６２ μｇ／マウスの用量で約６５％の生存率を示し、そのアイソマーＢによる生存率 は、６．２５μｇ／マウスの用量で約８０％、６２．５μｇ／マウスの用量で７ ５％であった。

上述したことを考慮すると、本発明の化合物は、あらゆる病理学的及び非病理学 的状況において、治療及び予防の両方における免疫反応を増強又は回復させるの に有用である。したがって、本発明の化合物の使用例としては、細菌感染症、主 に敗血症性ショックの場合、ウィルス感染症（ヘルペス）、寄生虫症、後天性免 疫不全症候群に起因する感染症、若年者及び老人における疾患の予防、重度の火 傷、透析、腫瘍及び移植などが挙げられる。更に、本発明の化合物は、ワクチン のアジュバントとして用いてもよい。

本発明の別の目的は、本発明化合物を含む医薬組成物など、上記使用と関連した あらゆる産業的局面での新規化合物の使用の他、免疫刺激剤としての新規化合物 の使用である。治療を目的とした用途としては、式Ｉの化合物は、例えば、Ｒｅ ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　Ｈａｎ ｄｂｏｏｋ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ、　Ｃｏ、、　ＸＶＩＩ　Ｅｄ、、　Ｎ、Ｙ、 、　ＵＳＡに記載されているように、医薬組成物に配合して好適に投与してもよ い。

投与量は、治療すべき症例の種類及び重度、及び患者の状態（体重、年齢、性別 など）など幾つかの要素次第であるのは明らかである。

国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ。

ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、　ＮＯ，ＮＺ、ＰＬ 、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、　ＵＳ （７２）発明者　ピノリ、マッシーモ　１イタリア国、２００９９　セスト・エ ツセ・ジオヴアンニ（ミラノ）、ヴイア・ジ・カルドウッシ、１２５ （７２）発明者　力ペレッティ、シルヴアーナイタリア国、２００９９　セスト ・エツセ・ジオヴアンニ（ミラノ）、ヴイア・ジ・カルドウッシ、１２５ １７２）発明者　ガゼーロ、ラウラ イタリア国、２００９９　セスト・エツセ・ジオヴアンニ（ミラノ）、ヴイア・ ジ・カルドウッシ、１２５ ニア２）発明者　レオー二、フラビオ イタリア国、２００９９　セスト・エッセ・ジオヴアンニ（ミラノ）、ヴイア・ ジ・カルドウッシ、１２５

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中、Ｒは水素原子又はスレオニン の側鎖；Ｒ１はアルギニン、ロイシン又はグルタミンの側鎖；及びＲ２は水素原 子又は代謝により脱離されるアシル基；但し、Ｒ１がアルギニンの側鎖である場 合、Ｒはスレオニンの側鎖ではない］ で示される逆転置テトラペプチド及びそのジアステレオ異性体、ならびにそれら の薬理学的に許容される塩、エステル及びアミド。
2. ２．ｇＧｌｙ−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、単一のジアステレ オ異性体である、請求項１記載のテトラペプチド。
3. ３．ｇＴｈｒ−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕであり、単一のジアステレ オ異性体である、請求項１記載のテトラペプチド。
4. ４．ｇＴｈｒ−（Ｒ，Ｓ）ｍＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎであり、単一のジアステレ オ異性体である、請求項１記載のテトラペプチド。
5. ５．請求項１記載の逆転置テトラペプチドの、免疫調節物質及び敗血症性ショッ クの予防及び治療に有用な薬物としての用途。
6. ６．敗血症性ショックの予防及び治療において及び免疫調節物質として有効な量 の請求項１記載の少なくとも１のテトラペプチドを、単独で又は医薬的に許容さ れる賦形剤との組合せで含む医薬組成物。