CN1078476A - C-反应性蛋白质片断的部分改性的和逆转化的四肽类似物 - Google Patents

C-反应性蛋白质片断的部分改性的和逆转化的四肽类似物 Download PDF

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Abstract

C-反应性蛋白质片断的部分改性的和逆转化的 四肽类似物。
具有免疫调节活性的C-反应性蛋白质片断的 逆转化的四肽类似物。

Description

本发明涉及C-反应性蛋白质片断（以下称CRP）的逆转化的四肽类似物。
CRP是一种通常具有很低血液浓度的蛋白质。炎症出现后它的血液浓度可上升到2000倍〔J.J.Morley  and  I.Kushner，Am.N.Y.Acad.Sci.，389，406-418（1989）〕。F.A.Robey等在J.Biol.Chem.，262，No.15，7053-7057（1987）中披露了三种非常类似于tuftsin序列的CRP四肽序列。化学合成的四肽以一种定性和定量上类似tuftsin的方式显示以下特性：刺激吞噬细胞的白血球，产生超氧化物和诱导单核细胞产生interleukin  1。象tuftsin一样，这三种CRP四肽应在体内迅速地被蛋白酶新陈代谢，并产生能有力地抑制母体肽的生物活性的肽代谢物。我们惊奇地发现，上述CRP四肽片断的部分改性和N-末端逆转化的类似物不仅显示了在保持tuftsin的免疫调节活性的同时具有相当大的抗酶降解的稳定性（见EP-A-0253  190），而且特别的是它们能决定不同的取决于结构和使用剂量的生物效应（特别是在败血症的休克治疗中）。所以本发明涉及结构式Ⅰ的逆转化的四肽：
Figure 931044499_IMG2
其中R是一个氢原子或苏氨酸的侧链;R1是精氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺的侧链;R2是一个氢原子或一种代谢上不经久的酰基;当R1是精氨酸的侧链时，R不可能是苏氨酸的侧链。本发明还涉及四肽的非对映立体异构体的形式和药理上可接受的盐类、酯类和酰胺类。
本发明特别地涉及逆转化的四肽gGly-（R，S）mLys-Pro-Arg，gThr-（R，S）mLys-Pro-Leu，gThr-（R，S）mLys-Pro-Gln，其中前缀g和m表示氨基酸分别是一种偕二胺和丙二酰残基。
本发明的逆转化的四肽按与已知方法一致的方法合成。本技术领域的熟练人员可根据需要逆转化的氨基酸种类选择这些方法。
例如，当偕二胺残基是1，1-二氨基甲烷基团（gGly）时，逆转化的四肽可按如下制备：首先在一种硅烷化试剂，例如，N，O-双（三甲基甲硅烷基）乙酰胺（TSMAc），三甲基甲硅烷基氯（TMS-Cl）或三甲基甲硅烷基氰化物（TMSCN）存在下使Meldrum氏酸的衍生物C-mLys（Z）（即5-〔4-苯甲氧基羰基〕-2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮）和H-Gly-NH2反应（M.J.O.Anteunis & Chr.Becu，Bull.Soc.Chim.Belg。，96，119-139，1986）。如此得到的准肽OH-（R，S）mLys（Z）-Gly-NH2（Z为苯甲氧基羰基）的丙二酰残基上的第二个基团在二环己基碳化二亚胺（DCC）和1-羟基苯并三唑（HOBT）存在下与脯氨酸叔丁酯缩合，得到准肽〔（R，S）mLys（Z）-Gly-NH2〕-Pro-H。这种准肽的脯氨酸羰基团DCC和N-羟基琥珀酸亚胺（HOSu）活化，然后与未保护的精氨酸反应〔Gott lieb，P.等，Ann.N.Y.Acad.，419，12（1983）〕，得到逆转化的四肽〔（R.S）mLys（Z）-Gly-NH2〕-Pro-Arg-OH。提纯可通过RP-DC顶替（deplacement）色谱法进行，如果希望的话，通过这种方法还可能分离非对映立体异构体。纯化了的产品在钯存在下用HCOOH催化氢化，除掉剩余的保护基团，然后用〔I，I-双（三氟乙酰氧基）碘代〕苯（TIB）处理使甘氨酰胺变为gGly的N-末端残基。用离子交换色谱的最后一次纯化能得到以乙酸酯形式的最终产物。
另一个例子是苏氨酸为偕二胺残基。逆转化的四肽的合成从一种C-末端二肽开始。这种C-末端二肽是通过Z-Pro-OH与H-Y-OtBu缩合，其中Y代表与结构式Ⅰ所定义的一致的氨基酸Leu和Gln（任选适当地加以保护），和接着通过催化氢化除去苯甲氧基羰基基团而得到。然后将这种二肽与N-末端逆转化的二肽反应，该N-末端逆转化的二肽的制备，例如，意大利专利申请No.21349A/90中有描述。
用二苯基磷叠氮化合物处理在适当的羰基活化试剂存在下，用MNP-COOH酰化预先已被硅烷化的H-Thr（t  Bu）-OH所得到的NMP-Thr（t  Bu）-OH，从而得到相应的叠氮化合物。这种叠氮化合物通过加热而得到异氰酸酯。在催化量的胺，优选一种叔胺和三乙胺或二异丙胺存在下用苯硫酚处理这种叠氮化合物，得到苯硫代羰基衍生物MNP-gThr（t  Bu）-PTC。然后胺残基被去保护，例如，通过用稀释的氢氧化钠处理，得到MNP-gThr（t  Bu）-H。该MNP-gThr（t  Bu）-H与c-mLys（Boc）缩合得到N-末端准二肽MNP-gThr（t  Bu）-（R，S）mLys（Boc），它接着在DCC/HOBT存在下与H-Pro-Y-OtBu（其中Y如上所定义）缩合，得到被保护的结构式Ⅰ的逆转化的四肽（其中R是1-羟基乙基）。通过用酸处理，所有保护基团（除偕二胺残基外）都被除去。如果需要的话，有可能在通过RP-DC提纯的同时分离两种非对映立体异构体。MNP基团可通过催化氢化除去，例如，通过使用吸附于海绵状钯上的甲酸铵。逆转化的四肽用合适的色谱方法进行最后的提纯。
这里我们提供了一些代表我们所要求的逆转化四肽的制备实施例。这些实施例决不是用来限制本发明。
氨基酸衍生物，被保护片断和逆转化的四肽的HPLC分析在下列实验条件下进行：
柱：Lichrosorb  RP-18;
流量：1.5ml/min;
检测器：Merck  L-4200  UV-VIS（230或254nm）;
洗脱液A：水90%，乙腈10%，三氟乙酸（TFA）0.1%;
洗脱液B：乙腈，TFA0.1%;
洗脱液C：水，TFA0.1%;
梯度：（Ⅰ）：从0至40%B在A中（20′），到80%B在A中（10′）
（Ⅱ）：从37至80%B在A中（20′）
（Ⅲ）：从0至50%A在C中（20′），到100%A（3′），到40%B在A中（20′）
（Ⅳ）：从10至40%A在C中（8′），到100%A（2′），到40%B在A中（20′）
在离子交换提纯中，使用装备有LKB  UVICORD  S  Ⅱ检测器（带有226nm的过滤器），Pharmacia记录仪（记录速度为0.1厘米/分钟）和Pharmacia  FRAC200级分收集器的Pharmacia  HPLC系统。
各种逆转化的肽的氨基酸和NH3组成和比率（作为偕二胺残基的具体数据）在用6MHCl于110℃水解22小时后用Beckman SYSTEM GOLD自动氨基酸分析仪测定。
一些化合物名称后的括号中的字母数字码是一种识别内码。
实施例1
H-gGly-（R，S）mLys-Pro-Arg-OH·2AcOH（ITF1127）
A）往一种H-Gly-NH2·HCl（3.32g，30mmoles）于THF中形成的乳浊液中依次加入TMSAc（19.6ml，80mmoles）和TMSACl（2.54ml，20mmoles）。30分钟后加入c-mLys（Z）（6.98g，20mmoles），反应混合物于室温下再搅拌3小时。真空蒸发掉溶剂，残留物用水（200ml）溶解，并用0.1NHCl把PH值调至3。室温下搅拌1小时后，形成的固体过滤出来，用水洗，然后溶于热的乙醇中。冷却后得到的固体过滤出来，用乙醚洗，干燥，得到3.8g（R，S）mLys（Z）-Gly-NH2（产率：51%）。HPLC〔梯度（Ⅰ）（254nm）〕：r.t（保留时间）13.5分钟;纯度：98%;熔点：161℃（dec.）
1H-NMR证实了产物的结构。
B）水浴冷却下往A）中产物（3.65g，10mmoles）溶于DMF（15ml）形成的溶液中依次加入HOBT（1.43g，10.5mmoles）。搅拌30分钟后，过滤混合物，将滤液加到HCl·H-Pro-OtBu（2.49g，12mmoles）和TEA（1.67ml，12mmoles）的DMF（10ml）溶液中。混合物搅拌3小时，然后真空蒸发掉溶剂。残留物用乙酸乙酯（50ml）溶解，有机相用2%硫酸氢钾，5%碳酸氢钠洗涤，用水中和，然后用硫酸钠脱水。将得到的4.2g轻油（产率82%）溶于DMC和TFA的混合物（1：1V/V，16ml）中，搅拌1小时。真空蒸发溶剂，残留物用乙酸乙酯和乙醚研磨，得到3.6g〔（R，S）mLys（Z）-gly-NH2〕-Pro-OH白色固体（产率：79%）。
HPLC〔梯度（Ⅰ）（254nm）〕：r.t.14.6和15.7分钟（两个非对映立体异构体）;纯度97%。
1H-NMR证实了产物的结构。
C）往B）中产物（3.36g，7.5mmoles）溶于THF（50ml）形成的溶液中加入HOSu（0.95g，8.25mmoles），冷却到-10℃后，加入DCC（1.54g，7.5mmoles）。于室温搅拌4小时后，过滤反应混合物，将滤液加到含H-Arg-OH（1.74g，10mmoles）和KCl（0.74g，10mmoles）的DMF/水（7：3V/V，125ml）溶液中。反应混合物于室温搅拌保持90分钟，然后真空蒸发掉溶剂，残留物用乙醚洗几次，干燥。将得到的固体溶于TFA水溶液（0.16V/V，30ml）中，分三等份通过RP-DC提纯。每次提纯时，把10ml溶液以2.7ml/min的流量注入Dynamax 300 C18（21.4×300mm）柱中，这种柱子预先用含TFA（0.1%V/V）的水稳定。加完料后，用含TFA（0.1% V/V）的氯化十六烷基苄基二甲基铵（BOHA-Cl）水溶液（50mM）仍以2.7ml/min洗脱柱子。洗脱约1小时后，收集到2.7ml级分。级分用HPLC〔梯度（Ⅰ）〕分析。含杂质的级分被除掉，而其它级分各自独立地按三组收集。这三组级分分别包含化合物〔mLys（Z）-Gly-NH2〕-Pro-Arg-OH的异构体A，两种异构体的混合物和异构体B。在三次色谱分离完后，冻干这三组级分得到1.9g异构体A，0.45g异构体混合物和1.8g异构体B（总产率：89%）。
HPLC〔梯度（Ⅰ）（220nm）〕：r.t.13.6分钟（异构体A），纯度：96%;r.t.14.7分钟（异构体B）;异构体A纯度93%+4%。FAB-MS：m/z＝619amu（原子质量单位）〔M+H〕+;m/z＝485amu〔M-Z+H〕+（两种异构体的识别谱）。
D）把新鲜的海绵状钯（约0.1g）加到C）中异构体混合物（0.31g，0.5mmoles）的甲酸（85%，5ml）溶液中，混合物于室温下缓慢搅拌90分钟。滤除催化剂后，真空蒸除溶剂。残留物用水溶解并冻干。将所得固体溶于DMF/水（3：1V/V，5ml）的混合物中，加入TIB（0.43g，1mmoles）。反应混合物于室温下避光搅拌16小时。真空蒸除溶剂，将残留物溶于水，用乙醚洗涤并冻干。将所得固体溶于pH值为6的水中。然后注入（流量为1ml/min）一个填充有CM-52羰甲基纤维素并预先用pH值为6的乙酸铵溶液（15mM）稳定的柱中（6×200mm）。加完料后，用0.15mM到150mM成线性梯度的乙酸铵洗脱分离柱。洗脱时间为6小时，流量为1ml/min，并维持PH值为6。收集到3ml级分，并用HPLC〔梯度（Ⅲ）〕分析：收集含标题产物（ITF  1127）的级分并多次冻干。将得到的固体溶于无水乙醇，加入乙醚沉淀得到0.085g产物（产率：30%。
HPLC：〔梯度（Ⅲ）〕r.t.8.8分钟（异构体A）和10.2分钟(异构体B）;纯度：99%。
FAB-MS：m/z＝457amu〔M+H〕+。
按相似方法得到0.425g（产率：30%）异构体A（ITF  1357）。
1H-NMR（200MHz;DMSO）
按异构体A的方法得到0.45g异构体B（ITF  1358）（产率：32%）和0.1g混合物（ITF  1127）。
HPLC：〔梯度（Ⅲ）〕：10.2分钟;纯度96%+异构体A
FAB-MS：m/z＝457amu〔M+H〕
1H-NMR（200MHz;DMSO）
t（1H;NGH）8.30;d（0.4H;NHR）7.57;d（0.6H;NHR）7.47;m（1H;CαP）4.43;m（3H;αG;αR）3.97÷3.82;m（4H;δP;δK）3.63÷3.33;m（2H;δR）3.06;m（2H;εK）2.72;s（6H CH3COO-）1.76;m（14H;β，τP;β，τ，δK;β，τR）1.21÷1.15.
实施例2
H-gTHr-（R，S）mLys-Pro-Leu-OH·AcOH（ITF  1192）
A）在0℃往碳酸双（三氯甲基）酯（3.71g，12.5mmoles）二氯甲烷（125ml）形成的溶液中加入溶于80ml二氯甲烷的1-甲基咪唑（5.96ml，75mmoles）。5分钟后，加入溶于二氯甲烷（80ml）的MNP-OH（5.63g，25mmoles），再过5分钟后，加入预先用TMSCN（11，3ml，90mmoles）硅烷化的H-THr（tBu）-OH（5.26g，30mmoles）并再加入200ml二氯甲烷。10分钟后，用酸化到pH3.5的水相缓冲液洗涤反应混合物，脱水蒸发至干燥。用5%碳酸钠溶液（300ml）溶解的残留物用二氯甲烷洗涤。再加200ml乙酸乙酯到水相中，并将pH值调到5.7。分离有机相并脱水，蒸除溶剂得到油状MNP-Thr（tBu）-OH（6.5g，产率68%）。HPLC〔梯度（Ⅰ）（254nm）〕：r.t.25.1分钟;纯度88%。
B）在0℃往A）中化合物（5.2g，13.6mmoles）溶于无水甲苯（50ml）形成的溶液中加入DPPA（3.22ml，14.9mmoles）和TEA（2.09ml，14.9mmoles）。4小时后反应混合物用碳酸氢钠饱和溶液和氯化钠饱和溶液（各自预先冷却到0℃）洗三次，然后脱水。将含叠氮化合物的溶液加热到80℃，并在此温度下保持40分钟。在室温下往形成的异氰酸酯中加入苯硫酚（1.39ml，13.6mmoles）和催化量的TEA（191μl，1.36mmoles）。一夜以后，用乙酸乙酯和水处理混合物，有机相用2%硫酸氢钾，5%碳酸氢钠洗涤，并用水中和，然后用硫酸钠脱水，蒸发至干燥，得到的油用石油醚研磨。得到4.7gMNP-gTHr（tBu）-PCT（产率：71.2%）。HPLC〔梯度（Ⅱ）（254nm）〕：r.t.14.9分钟;纯度：95%。
C）往处于0℃的氢氧化钠（1M，26ml）和水（877ml）的混合物中缓慢加入B）中产物（4.7g，9.6mmoles）溶于THF（64ml）形成的溶液。加料结束5分钟后，用HCl（1M，26ml）中和反应混合物。蒸发除掉THF，加入氯仿（80ml）并用1M氢氧化钠将两相混合物pH值调至9.0。分离有机相。用氯仿处理水相三次，每次都把pH值调至9.0。收集有机相，蒸发干燥。往重新悬浮于乙醚的残留物中加水（50ml），用1MHCl把混合物滴至pH3.5，直到pH值恒定。分离水相，并将这种处理过程重复两次。冻干收集的水相得到2.8gMNP-gTHr（tBu）-H·HCl（产率：85%）。
HPLC〔梯度（Ⅰ）（254nm）〕：r.t.16.43分钟;纯度：99.9%。
D）往C）中化合物（2.6g，6.6mmoles）和c-mLys（Boc（2.4g，8mmoles）溶于THF（120ml）形成的溶液中缓慢加入TMSAc（4.6ml，20mmoles）。20小时后蒸发反应混合物，用水溶解残留物并在乙酰乙酯存在下用1MHCl把pH值调至3.5。水相用乙酸乙酯萃取三次。使收集的有机相脱水，使之减少到较小体积，加入二异丙醚，得到3.4gMNP-gThr（tBu）-（R，S）mLys（Boc）-OH（产率：85%）。
HPLC〔梯度（Ⅱ）（230nm）〕：r.t.9.9分钟和10.2分钟（两种非对映立体异构体）;纯度：93%。
E）往Z-Pro-OH（2.4g，10mmoles）和H-Leu-OtBu·HCl（2.7g，12mmoles）溶于二氯甲烷（50ml）形成的溶液中加入TEA（3ml，22mmoles），然后加入BOP（4.4g，10mmoles）和HOBT（1.35g，10mmoles）。5小时后反应混合物用饱和氯化钠溶液处理一次，然后蒸发干燥。残留物在乙酸乙酯和水之间分配。有机相用2%硫酸氢钾，5%碳酸氢钠洗涤，用水中和并在硫酸钠中脱水，然后干燥。通过添加石油醚，从溶于二异丙醚的残留物得到3.8gZ-Pro-Leu-OtBu（产率92.7%）。
HPLC〔梯度（Ⅰ）（230nm）〕：r.t.28.6分钟;纯度100%。
F）让E）中二肽（1.5g，3.5mmoles）溶于甲醇（70ml），在氮气中把Pd/c催化剂（100mg）加到这种溶液中，然后缓缓地加入三乙基硅烷（2.9ml，18mmoles）。3小时后过滤反应混合物，蒸发除掉溶剂，得到1g  H-Pro-Leu-OtBu（产率：100%）。HPLC〔梯度（Ⅰ）（230nm）〕：r.t.15.9分钟;纯度93%。
G）往D）中准二肽（1.1g，1.9mmoles）溶于二氯甲烷（15ml）形成的溶液中加入溶于200mlDMF的HOBT（320mg，2.3mmoles）。将温度调至0℃并加入DCCI（392mg，1.9mmoles）。15分钟后，将混合物滤入一个含E）中C-末端二肽（540mg，1.9mmoles）的烧瓶中，并放置使之反应一夜。蒸发除掉溶剂后，残留物在乙酸乙酸和水之间分配，有机相用2%硫酸氢钾，5%碳酸氢钠洗涤，并用水中和，然后在硫酸钠中脱水。通过用二异丙醚研磨残留物从干燥的有机相中得到12.3gMNP-gThr（tBu-（R，S）mLys（Boc）-Pro-Leu-OtBu（产率：77%）。
HPLC：isocratic  从65%的B（230和254nm）：r.t.8.2和8.6分钟;纯度：100%。
H）在水溶中用浓HCl（5ml）处理一等分部分G）中化合物（1.4g，1.3mmoles）8分钟。将反应混合物蒸至干燥，然后用水溶解，并冻干，得到910mg粗产品。这种粗产品使用溴化干二烷基苄基二甲基铵（BDDA-Br，50mM于90%水，10%乙腈和0.1%TFA中）作为置换剂，以2.7ml/min的流量在一种Dynamax柱（300AC18，12μm，21×250mm）上通过RP-DC提纯。这样回收3种级分的NMP-gThr-mLys-Pro-Leu-OH：320mg异构体A，320mg异构体B和160mg非对映立体异构体混合物。
HPLC〔梯度（Ⅰ）（230nm）〕：r.t.16.1和18分钟;纯度：99.9%。
Ⅰ）将H）中异构体A（315mg，0.4mmoles）溶于甲醇（15ml）中，加入用甲酸活化的海绵状钯和甲酸铵（120mg）溶于甲酸（5ml）形成的溶液。2小时后滤除催化剂，蒸除溶剂后用水溶解残留物。水相用乙醚洗涤，冻干得到200mg粗产品。这种粗产品在一种S-Sepharose  Fast  Flow的Pharmacia  XK16柱（16×20mm）上通过离子交换提纯。用0.015M，PH6.0的乙酸铵（A）和0.3M，PH6.0的乙酸铵（B）作为洗脱液，以0-25%B在A中的线性梯度洗脱（30′），然后于isocratic中40分钟，以3ml/min的流量洗脱。用HPLC分析每2分钟收集的级分并将含标题产物的级分冻干。
HPLC〔梯度（Ⅲ）（230nm）〕：r.t.12.8分钟;纯度97%。
氨基酸组成：Pro（1）1.0;Leu（1）1.0;NH3（2）1.9;肽含量：77μmoles（40mg;产率：20%）。
1H-NMR（200MHz;1H-DMSO;30℃）（异构体A-ITF1432）：
d（1H;NH-gT）7.79;d（1H;NH-L）6.93;m（2H;Cα-P，Cα-gT）4.31÷4.21;q（1H;Cα-L）3.84;m（1H;Cδ-P）3.74;m（3H;Cδ2P;CB-gT;Cα-mK）3.63÷3.37;m（2H;Cε-mK）2.75;m（4H;Cβ，Cτ-P）2.19÷1.74;m（9H;Cβ，Cτ，Cδ-mK;Cβ，Cτ-L）1.73÷1.13;d（3H;Cτ-gT）1.06;d（3H;Cδ1L）0.88;d（3H;Cδ2L）0.87.
按与异构体A相同的方法得到异构体B（ITF1443）：
1H-NMR（200MHz;1H-DMSO;30℃）
d（0.9H;NAH-gT）8.13;d（0.1H;NBH-gT）8.03;d（0.1H;NBH-L）7.45;d（0.9H;NAH-L）7.36;m（2H;Cα-P，Cα-gT）4.37÷4.24;m（1H;Cα-L）3.86;m（3H;Cδ-P;Cβ-gT）3.56÷3.38;m（1H;Cα-mK）3.16;m（2H;Cε-mK）2.76;m（13H;Cβ，Cτ-P;Cβ，Cτ，Cδ-mK;Cβ，Cτ-L）2.23÷1.15;d.（3H;Cτ-gT）1.03;d（6H;Cδ-L）0.88.
例3
H-gThr-（R，S）mLys-Pro-Gln-OH·AcOH（ITF1193）
A）将Z-Gln-OH（5.6g，20mmoles）溶于冰乙酸（60ml）中，加入Trt-OH（Trt＝三苯甲游基）10.4g，40mmoles），Ac2O（3.77ml，40mmoles）和硫酸。将反应混合物加热到50℃并在此温度下保持90分钟，然后冷却到室温并用水处理。将得到的沉淀过滤，使之悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取三次。通过浓缩和加入正已烷从收集到的并脱水了的有机相中沉淀出8.12gZ-Gln（Trt）-OH（产率：77%）。
HPLC〔梯度（Ⅱ）（230nm）〕：r.t.11.3分钟;纯度：100%。
B）往在A）中得到的产物（4g，7.6mmoles）溶于二氯甲烷（50ml）形成的溶液中加入三氟化硼合乙醚（153ul）和N-叔丁基-2，2，2-三氯乙酰亚胺TBTA;4.2g，15mmoles）。10分钟后用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤一次反应混合物，然后脱水蒸发至干燥。所得残留物溶于甲醇（60ml），通过加入水而沉淀出3.5gZ-Gln（Trt）-OtBu（产率：81%）。
HPLC〔梯度（Ⅱ）（230nm）〕：r.t.17.7分钟;纯度：100%。
C）B）中化合物（2.5g，4.3mmoles）溶于200ml甲醇，用N2保护，加入用甲酸活化的海绵状钯和一种甲酸铵溶液（200mg于5ml中）。3小时后滤除催化剂，蒸发甲醇溶液至干燥。残留物用乙酸乙酯溶解，用5%碳酸氢钠洗一次，然后用水中和。使有机相脱水浓缩到较小体积，然后冷却至0℃，用一当量HCl（于乙酸乙酯中）（4M，1.08ml）处理。连续添加石油醚沉淀出2gHCl·H-Gln（Trt）-OtBu）产率：100%）。
HPLC〔梯度（Ⅱ）（230nm）〕：r.t.7.4分钟;纯度：100%。
D）将Z-Pro-OH（1.15g，46mmoles）溶于二氯甲烷（15ml）中，加入溶于DMF（250ml）的HOTB（0.7g，5.5mmoles）。在水溶中往这种溶液中加入DCCI（0.95g，4.6mmoles）。15分钟后将反应混合物滤入一个含C）中化合扔（2g，4.1mmoles）的烧瓶中，并用TEA（587ul，41mmoles）中和。18小时后蒸除溶剂，残留物在乙酸乙酯和水之间分配，有机相用2%硫酸氢钾，5%碳酸氢钠洗涤，用水中和，然后在硫酸钠中脱水。通过添加正己烷从已浓缩到小体积的有机溶液中得到2.6gZ-Pro-Gln（Trt）-OtBu（产率：93%。
PHLC〔梯度（Ⅱ）（230nm）〕：r.t.16.8分钟;纯度：100%。
E）象在C）中一样，用海绵状钯和甲酸在100ml甲醇中氢化D）中被护的二肽（2.4g，3.5mmoles）。滤除催化剂并蒸除甲醇后，残留物用乙酸乙酯溶解，用5%碳酸氢钠洗一次并脱水。在0℃，浓缩的有机相用HCl（于乙酸乙酯中，4M，875ul）处理，通过添加石油醚得到2gHCl·H-Pro-Gln（Trt）-OtBu（产率：100%）。
HPLC〔梯度（Ⅱ）（230nm）〕：r.t.7.8分钟;纯度：100%。
F）住例2D）中得到的准三肽（1.38g，2.26mmol）溶于二氯甲烷（15ml）形成的溶液中加入溶于200ulDMF的HOBT（382mg，2.82mmoles）。将温度调至0℃，加入DCCI（466mg，2.26mmoles）。15分钟后将混合物直接滤进一个含E）中二肽（1.31g，2.26mmoles）的烧瓶中，用TEA（318ul，2.26mmoles）中和并放置应过夜。蒸除溶剂后残留物在乙酸乙酯和水之间分配，有机相用2%硫酸氢钾，5%碳酸氢钠洗涤，用水中和，然后在硫酸钠中脱水。蒸发有机相至干燥，然后用乙酸乙酯/正已烷（1：1V/V，15ml）溶解，通过加入正已烷得到23gMNP-gThr（tBu）-（R，S）mLys（Boc）-Pro-Gln（Trt）-OtBu（产率：92%）。
HPLC〔梯度（Ⅱ）（230nm）〕：r.t.21.5和22.0分钟（两个非对映立体异构体）;纯度：92.5%。
G）将F）中逆转化的四肽（2.13g，1.87mmoles）在室温下溶于二氯甲烷/TFA（1：1V/V，40ml）中。90分钟后蒸除溶剂，加入乙醚粗产物沉淀出来。这样得到1.416gMNP-gThr-（R，S）mLys-Pro-Gln-OH（产率：95%）。
HPLC〔梯度（Ⅰ）（230mn）〕：r.t.12.4分钟;纯度：91.5%。
氨基酸组成：Pro（1）ho;Gln（1）1.0;NH3（3）2.9;肽含量：92.7%。被保护的逆转化的二肽在一个Dynamax柱（300
Figure 931044499_IMG4
C18，12um，21.4×300mm）上通过RP-DC提纯。以BDDA-Br（50mM于水中，0.1%TFA）作置换剂，流量为2.7ml/min。这样得到1.04g产物（产率：81%）。
HPLC〔梯度（Ⅰ）（230nm）〕：r.t.12.4分钟;纯度：100%。
在A的0～20%梯度（20分钟）中：r.t.17.5和17.8分钟（两个非对映立体异构体）;纯度：100%。
H）将G）中被保护的逆转化的四肽溶于15ml甲酸铵的水溶液（0.25M，PH3.0）中，加入用甲酸铵（0.5M，PH3.0）活化的海绵状钯，在60℃放置反应15分钟。重复这种处理四次，升高反应温度到70℃，直到HPLC显示起始化合物消失。然后滤除催化剂，用乙醚洗涤水相，冻干。粗产物在一个CM-SephadexC-25的PharmaciaXK26柱（26×300mm）上通过离子交换提纯。以0.015M，PH6.0乙酸铵（A）和0.3M，PH6.0乙酸铵（B）作洗脱液，以0-100%B的线性梯度（360分钟），以4ml/min的流量洗脱。收集到3.7ml级分。冻干那些显示含有标题产物的级分。
HPLC〔梯度（Ⅳ）（230nm）〕：r.t.6.5和7.7分钟（比率为1∶1的两个非对映立体异构体）;纯度：99%。氨基酸组成：Pro（1）1.0;Gln（1）1.0;NH3（3）2.9;肽含量：966umoles（515mg）;产率：88%。
1H-NMR（200MHz;DMSO）
d（0.5H;NHT）8.26;d（0.5H;NHT）7.99;d（0.5H;NHQ）7.49;s（1H;N Q）7.31;d（0.5H;NαQ）7.04;s（1H;NαQ）6.67;m（1H;CαT）4.31;m（1H;CαP）4.22;m（2H;CαQ;CδP）3.83÷3.70;m（3H;CβT;CαK;Cδ′P）3.64÷3.34;m（2H;CεK）2.74;m（8H;CβP;CβK;Cβ e CτQ）2.17÷1.66;s（6H CH3COOH）1.85;m（6H;CτP;Cτe CδK）1.64÷1.12;t（3H;CτT）1.04.
我们测试了代表本专利的一些化合物的生物活性。
在玻璃试管内老鼠脾细胞对IFN-t产生的刺激
脾细胞以单一细胞悬浮液形式从BALB/C老鼠脾脏中获得。如此得到的脾细胞重新悬浮于RPMI1640培养基中（FLow Lab.，Hertz，UK）。这种培养基含5%的最终浓度为107个细胞/ml的胎儿小牛血清（Hyclone，ST，Utah，USA）。在所示浓度的被测试化合物存在下于37℃将这些脾细胞在96腔培养皿中培养24小时。培养完后收集上层清液，用22um过滤器过滤，冰冻至-80℃直到用ELISA商用仪器（Genzyme，Boston，MA，USA）进行测试。
结果陈述于表1。
表1
剂量(μg/ml)  U/ml(刺激指数)
Ex.1  Ex.2  Ex.3
0(基准)  31  31  41
0.1  33(1.1)  57(1.8)  60(1.5)
1.0  60(1.9)  52(1.7)  60(1.5)
10.0  49(1.6)  60(1.9)  68(1.7)
所得相对于基准（未处理细胞）的U/ml和刺激指数（IS）结果表明本发明的化合物能用老鼠脾细胞对IFN-τ产生依赖剂量地刺激。特别地，例1的化合物是本类化合物中最有效的：实际上它能以1.6μg/ml的剂量使已讨论过的胞质分裂翻一番。
老鼠腹膜巨噬细胞对IL-1产生的刺激
老鼠腹膜巨噬细胞按如下获得：在杀死动物前三天将水解淀粉溶液（BDH Chemicals，Poole，Dorset，UK）注入BALB/C鼠的腹腔中。然后用一种含10%FCS的RPMI1640溶液洗腹腔收集腹膜细胞，以106个细胞/ml的浓度重新悬浮于相同溶液中，置入96腔培养皿中。在所讨论的化合物存在下于37℃培养96小时。处理完后收集上层清液，将之用于通过一种合适的ELISA商用仪器（Genzyme，Boston，MA，USA）测定剂量胞质分裂。
结果陈述于表2。
表2
剂量(μg/ml)  U/ml(刺激指数)
Ex.1  Ex.2  Ex.3
0(基准)  15  15  15
0.01  6(0.4)  90(6.0)  150(10.0)
0.1  2(0.1)  60(4.0)  160(10.7)
1.0  2(0.1)  47(3.1)  155(10.3)
10.0  2(0.1)  50(3.3)  140(9.3)
所得相对于基准的U/ml和IS结果揭示实验化合物表现出显著的刺激效应。特别是例3的化合物在所有使用剂量下使IL-1的产生增加10倍（93＜IS＜10。7）。
老鼠腹膜细胞对氧化氮的刺激
腹膜细胞按以上所述实验方法获得，在所讨论合物和浓度为30μg/ml的脂多糖存在下于37℃培养96小时。处理完后收集上层清液，用Palmer  R.M.J.等在Nature，327，524（1987）中所描述的化学发光实验测定氧化氮含量。
结果陈述于表3。
表3
剂量(μg/ml)  nmol/ml(刺激指数)
Ex.1  Ex.2  Ex.3
0(基准)  20  20  20
0.01  43(2.2)  85(4.3)  50(2.5)
0.1  59(3.0)  61(3.1)  60(3.0)
1.0  77(3.9)  66(3.3)  66(3.3)
10.0  57(2.9)  79(4.0)  88(4.4)
所得相对于基准的nmol/ml和刺激指数结果表明：本发明的化合物在所有使用剂量下都能刺激氧化氮的产生。特别是例2的化合物在0.01ug/ml（IS＝4.3）表现出一个刺激峰。
老鼠腹膜巨噬细胞对利什曼原虫活性的影响
将按上法收集的腹膜细胞以105/100ul的浓度种入96腔圆底培养皿（Nune，Roskiled，DK）中，于37℃培养24小时，处理完后，分离并放出没有粘附于腔壁的细胞，而粘附的细胞用培养基冼三次，并和所讨论化合物一起培养24小时，然后通过用Leishmania major（Dr.Neal R.A.所提供的L.major，PVL49菌种，London School of Hygiene and Tropical medicine，London，UK）的promastigotes培养24小时而使细胞感染。感染处理完后往各腔中加入100ul0.01%的十二烷基硫酸钠的RPMI1640溶液，培养皿于37℃培养30分钟。加入含30%FCS的Schneider氏培养基（Sehneider Drosophila medium，GibcoLab.，Grand island，New York，USA）。各腔中加入1uCi3H-胸腺嘧啶脱氧核甙，于37℃培养72小时。由腹膜细胞里的活寄生菌引入的放射活性与感染程度有关，所以还与细胞的利什曼原虫活性有关。这种放射活性的引入量通过用细胞采集器收休细胞和用液体闪烁β-计数器测量放射活性而测定。
结果示于表4。
表4
剂量(μg/ml) CPm*(感染降低%)**
Ex.1  Ex.2  Ex.3
0(基准)  18,273  18,273  18,273
0.1  5,096(72)  17,568(4)  18,826(-3)
1.0  3,783(79)  11,991(34)  8,377(57)
10.0  4,292(77)  10,582(42)  7,842(57)
＊每分钟计数
＊＊＝100-〔 (处理的细胞cpm)/(基准细胞cpm) ×100〕
所得结果表时本发明的化合物能降低感染程度。特别地，例1的化合物是最有效的，它实际上以在实验中所用的最小剂量提供了超过70%的感染降低。
在体内对抵抗败血症休克的评价
把50mg/kg的LPS（-脂多糖）从腹膜内注入重20到25g的BALB/C鼠中（6个老鼠/组）。除基准外，其它各组在LPS注入后的0（即和LPS一起注入）或30分钟内被注入渐增量的本发明的化合物之一。这些化合物溶于生理溶液中，最终体积为0.5ml。老鼠被检查8天以测定其存活百分数。例1的化合物以6.2ug/鼠和0.62ug/鼠的剂量得到约65%的存活百分率，而它的异构体B以6.25ug/鼠的剂量得到约80%的存活百分率，以62.5ug/鼠的剂量得到的存活百分率为75%。
由以上所述的看来，本发明的化合物在所有病理和非病理情况下均有用。在这病理和非病理情况下，它能增强或恢复治病和预防中的免疫响应。所以作为本化合物用途的实例，在这里可以援引细菌感染，主要在败血症休克中;病毒感染（疱疹）;寄生虫病;由获得性免疫缺乏综合症、青老年预防、严重烧伤、透析、肿瘤和移植引起的感染。此外本发有的化合物可用作疫苗的辅助剂。
本发明还有一个目的是这种新的化合物（包括含本发明化合物的药物组合物）作为免疫刺激剂的使用以及与所说用途有关的所有工业方面应用。对于设想中的医疗用途，结构式Ⅰ的化合物可按“Remington′s  Pharmaceutical  Sciences  Handbook”，Mark  Pub.Co.，XVIIed.，N.Y.USA中所述以适当配制的药物组合物供给。显然剂量取决于几个方面，如被处理病例的种类和严重性以及患者的条件（重量、年龄、性别等）。

Claims (6)

1、结构式Ⅰ的逆转化的四肽，及它的非对映应体异构体形式和它的药理上
其中R是一个氢原子或苏氨酸的侧链；R1是精氨酸、亮氨酸或谷氨酸酰胺的侧链；R2是一个氢原子或一种代谢上不经久的酰基基团，当R1是精氨酸的侧链时，R不可能是苏氨酸的侧链。
2、根据权利要求1的四肽为gGly-（R，S）mLys-Pro-Arg和单个的非对映立体异构体形式。
3、根据权利要求1的四肽为gThr-（R，S）mLys-Pro-Leu和单个的非对映立体异构体形式。
4、根据权利要求1的四肽为gThr-（R，S）mLys-Pro-Gln和单个的非对映立体异构体形式。
5、根据权利要求1的逆转化的四肽作免疫调节物质，在预防中和治疗败血症休克中的有用的试剂。
6、药物组合物，它包括用于免疫调节和在预防及治疗败血症休克时的有效量的根据权利要求1的至少一种四肽。单独使用或与一种药理上可接受的赋形剂结合使用。
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