JPH07503144A - 生物的変換によるメラニン色素の調製方法および生成色素の化粧品への利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物的変換によるメラニン色素の調製方法、生成色素およびその化粧 品分野への利用に関する。

化粧品分野において、着色用色素の利用は既知である。色素には、本来は無機色 素、またはその代わりに染料から直接合成された色素が用いられており、黒色色 素の場合には、純粋な炭素が用いられる。

特に、５−ヒドロキノインドールの酸化により、黄−茶色染料を製造する方法が 知られている。また更に、５．６−７メトキシインドール、または５．６−メチ レシンオキ／インドール等の５．６−７ヒドロキシインド一ル誘導体の酸化的重 合により、酵素的にメラニン色素を調製する方法が知られている。

本発明は、単純な物質の生物的変換、とりわけ常法により試験管内で培養した植 物細胞を用いてメラニン色素を迅速に得る方法を見いだした。

実際、前記の方法では、メラニン生合成に常用する前駆物質を使用するため、費 用がかさむ。

これに対し、本発明において使用する材料は、適性価格で、容易に利用できる、 普通の前駆物質および生物的化合物である。本発明における酵素による生物的変 換の手法では、ポリフェノールオキシダーゼ類を使用しない。

従って、本発明は、メラニン前駆体基質および植物細胞を使用し、酵素による生 物的変換によってメラニン色素を調製する方法を提供するものである。

本発明では、 ａ）あらかじめ培養した、ケン（パパハ・ソムニフェラム（Ｐａｐａｖｅｒ　ｓ ｏｍｎｉｆｅｒｕＩｎ））植物細胞を培地から分離し、１０〜１００ｇ／ｒの範 囲の濃度で培地に植継ぎし、 ｂ）潜伏期の前または最後に、細胞を少なくとも部分的に粉砕し、Ｃ）少なくと も部分的に粉砕した細胞を、生物変換媒体中で、インドール、インドリン、ノヒ ドロキシフェニルアラニン、チラミン、チロシンより選ばれるメラニン前駆体基 質中に入れて接触させ、ｄ）沈澱したメラニン色素を回収する。

第１のステップては、未分化ケシ細胞を、標準培地を用いて、試験管中で培養す る。十分な増殖時間の後、濾過等により細胞を該培地より分離する。細胞の増殖 時間の長さは、本方法においては重要ではなく、特に所望の質の細胞が得られる ことが重要である。

標準培地としては、ヘラー製（Ｈｅｌｌｅｒ’　ｓ）培地を用いてもよい。この 培地には、所望により、ビタミン類および／またはホルモン類を添加してもよい 。

未分化ケ／細胞とは、植物全体の断片から得られ、汚染除去され、そして細胞が 有機的な組織形成をすることなく増殖てきるように選ばれた固形培地上に置かれ たる細胞培養物を意味する。その後これらの細胞を液体培地へ移し、該培地中で 、単純細胞増殖により細胞が増殖する。これらの細胞培養は、細菌の培養と同様 である。

第２のステップでは、得られた細胞を１０〜１００ｇ／＋７の新鮮な細胞物質濃 度で、標準培地に植継ぐ。植継ぎ用の培地には、新しいものを用いる。植継ぎに 、ヘラー製培地を、所望によりビタミンおよび／またはホルモンを含有させて用 いてもよい。潜伏期を超えない時間、細胞を培地中に維持する。

潜伏期とは、新しく植継いだ細胞が培地に適合するのに要する時間であり、増殖 が始まる前の細胞濃度が一定に保たれる間である。定期的にサンプルを採取する ことにより、細胞濃度がその初期濃度と実質的に等しく保たれる時間を確定する ことができる。その間、細胞は潜伏期にあり、その後、潜伏期が終わると、濃度 がかなり増加して、細胞は増殖ステップを経る。用いる株によって、潜伏期は６ 時間から７日間の間で変化する。

細胞の植継ぎは、２０〜５０ｇ／ｊの新鮮な細胞物質濃度で行うことが好ましい 。

第３ステツプでは、潜伏期の前、または最後に、好ましくは細胞を粉砕して、粉 砕細胞調製物を得る。

細胞の粉砕は、培地中で行ってもよいが、粉砕前に細胞を濾過等によって単離し ておくことが好ましい。粉砕細胞調製物を得るために、ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ ）またはウルトラ・ツラソクス（Ｕｌｔｒａ　Ｔｕｒｒａｘ）ミル等の標準的な 手段を用いてもよい。

粉砕は、低温、特に０〜１５℃の間で行うことが好ましい。

第４ステツプでは、生物的変換を行うために、粉砕細胞調製物を、インドール、 インドリン、ンヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）　、チラミンおよびチ ロノンより選ばれるメラニン前駆体基質と接触させる。１０’Ｃ〜７０℃の間で 接触させることが好ましい。

生物的変換媒体が、粉砕細胞調製物のみからなっていてもよい。また、粉砕細胞 調製物を脱イオン水中あるいはバッファー溶液中に含有させてもよい。この場合 、ｐ＋（は、３〜９の間から選択されることが好ましい。

反応は、基質および粉砕細胞調製物を好ましくはバッファー媒体中で接触させる ことにより行う。バッファーを用いることにより、基質濃度を広い範囲内で変え ることができ、その濃度は、水性媒体への基質の溶解性に依存する。

反応は、撹拌しながら行うのが好ましい。

基質濃度は、一般に、新鮮な細胞物質を２Ｃ〜２００ｇ含有するバッファー溶液 １リツトル当たり、１０ｍｇ〜２ｇの間である。基質濃度は、エタノール等の水 混和性溶剤中に基質を溶かすことにより増やしてもよい。

この生物的変換ステップにおいて、反応時間は様々であるが、特に基質、反応温 度および媒体のｐＨに依存する。

一般には、３０分から２４時間後に黒色沈殿物が現れる。沈澱した色素をデカン テーション、濾過または遠心分離、または分離するのに適したその他の手段によ って回収してもよい。ａＭを回収して、上記の条件下、再び基質を加えることに より反応を始めてもよい。特に色素から蛋白質系残渣を取り除くために、媒体は ５μｍより小さいメンツユサイズのふるいを通してａ遇することが好ましい。

本色素のＥＰＲ（電子常磁性体共鳴）による分析は、プルツカ−・イーアール２ ００　ティー（ＢＲＬＩＣＫＥＲＥＲ２００Ｄ）分光計ヲ用イ、９．５２ＧＨ， で、１００ＫＨ。

の場変調周波数（ｆｉｅｌｄ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）お よび１．９ｍｗのマイクロ波出力（ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｐｏｗｅｒ）にて行い 、その分析値は、メラニン類特有で、約３４７０ガウスにおいて、最大吸収を示 す。

得られたメラニン色素は、エタノールで洗浄後、水にて洗浄し、メラニン前駆体 を除去する。

得られた色素で、適切に洗浄および乾燥させたものは、特に化粧品分野において 、メイクアップ用製品、日焼は用組成物またはその代わりに髪染め用組成物等に 有用である。

上記のように利用するために、水、および／または水／有機溶剤混合物、または １以上の溶剤に基づいた、化粧品用に認可されている媒体中に該色素を組み入れ てもよ（、また所望により、化粧品においてよ（用いるその他の添加剤、例えば 界面活性剤類、ノックチー類および保存料類を含有させてもよい。

本発明においては、メラニン色素を、これらの担体には標準的な、例えば２０μ ｍより小さい粒径、および好ましくは１ｏμｍの粒径を有する不活性粒子からな る無機充填剤の上に沈澱させてもよい。

既知の方法で、ラメラ型または非ラメラ型の無機粒子、ラメラまたは非ラメラ有 機粒子、それらは彩色、またはその他の手段を施されていてもよく、その上に色 素を沈澱および／または吸収させてもよい。これらの粒子は、０．０１〜２゜０ ８ｍの平均粒径を有する。

こうして、化粧品に利用可能な彩色されたパウダーが得られる。

この彩色パウダーは、メラニン前駆体および上記の生物的変換をおこなった粉砕 細胞調製物の溶液に無機または有機粒子を分散させることにより調製してもよい 。色素を含むパウダーを、メラニン色素の形成に必要な反応時間後に、濾過等に より分離し、水で洗浄して乾燥させる。

これらのパウダーは、本発明に従い調製したメラニン色素を、上記の無機または 有機粒子の上または中に吸収させることにより調製してもよい。

この応用として、あらかじめ形成させたメラニン色素を、粒子が溶解せず、上記 の粒子を含有する媒体中に分散させ、色素が吸収された後に、着色粒子を乾燥さ せることにより、この工程を行うことも可能である。

上記で定義した粒径を有する炭酸カルシウム、酸化ンリカまたは酸化チタン粒子 を無機充填剤として用いてもよい。

有機充填剤としては、所望により変性させたケラチン誘導体ポリマー、所望によ り脱アセチル化したキチン誘導体ポリマー、絹フィブロイン、架橋ポリ（メチル メタクリレート）および架橋ポリ−βアラニンから選択される合成ポリマー、塩 化ビニリデンおよびアクリロニトリル共重合体の中空ミクロスフェア類、または ポリアミド−１２、ポリアミド−６またはコポリアミド−６／１２の多孔性ミク ロスフェアの粒子を用いるのが好ましく、ガム類、樹脂、有機ポリシロキサンエ ラストマーからなるパウダーも同様に使用てきる。

これらの粒子は、好ましくは０１μｍより大きい粒径を有する。

ラメラ状粒子は、ラメラを形成し、所望により層をなした無機または有機粒子で ある。これらのラメラは、最大寸法よりも小さい厚みに特徴がある。最大寸法の 厚みに対する割合は、２〜１００の間であることが好ましい。最大寸法は、一般 には、１００μｍよりも小さい。

以下の実施例で、本発明を更に詳細に説明するが、例示であり、本発明を制限す るものではない。

インドールからのメラニン色素の調製の実施例未分化のケン培養物から得た異な る株を用いる。これらの株を寒天上のカルスから液体培地に採って、以下のステ ップを行う。

第１ステツプ 未分化ケン細胞を試ＶＡ管内で、２６℃にて培養する。培地の組成は、以下の通 ＫＣＩ　０．７５０ｇ／′ｒ　ヘラ−１７り０栄養素ＮａＮＯ３０，６００ｇ／ ｎ　ヘラー製マクロ栄養素Ｎ１ｇＳＯ４・７Ｈ２００，２５０ｇ／Ｅ　ヘラー製 マクロ栄養素ＮａＨ２ＰＯ＋・２Ｈ２００，１４１ｇ／Ｒヘラー製マクロ栄養素 ＣａＣ］２’２Ｈ２００，０７５ｇ／Ｎ　ヘラー製マクロ栄養素Ｚｎ５Ｏ＜・７ Ｈ２０１ｍｇ／１２　ヘラー製ミクロ栄養素Ｈ３Ｂ　０３　１　ｍ　ｇ　／　ｌ 　ヘラー製ミクロ栄養素Ｍｎ５ｏ４−ＩＨ２００，０７６ｍｇ／ｆ　ヘラー製ミ クロ栄養素ＣｕＳ　Ｏ＜・５　Ｈ２Ｏ０，０３ｍ　ｇ／　ｌ　ヘラー製ミクロ栄 養素、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２００，０５ｍｇ／ｌ’　ヘラー製ミクロ栄養素Ｋｌ　 Ｏ，０１ｍｇ／ｌ　ヘラー製ミクロ栄養素Ｎ１Ｃｈ’６Ｈ２００，０３ｍｇ／ｎ 　ヘラー製ミクロ栄養素ＦｅＣ１５・６Ｈ２０１，００ｍｇ／ｉ’モレル製（Ｍ ｏｒｅｌ’　ｓ）ビタミン　２ｍ１２．４−ツク００７ｘ／キノ１ｉＩＯ−’Ｍ 　１　ｍ　ｌカイ不チ：／１０−３Ｍ　１　ｍ　ｌ ブドウ糖　３０ｇ／ｒ 撞捜１ ＫＣＩ　０．７５０ｇ／ｆ　ヘラー製マクロ栄養素ＮａＮＯ３０，６００ｇ／　 ｆ！　ヘラー製マクｏ栄養素ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２５０ｇ／ｌ　ヘラー製 マクロ栄養素ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２００，１４１ｇ／ｌ　ヘラー製マクロ栄養 素ＣａＣ］　２・２Ｈ２００，０７５ｇ／　ｊ！　ヘラー製マクロ栄養素ＺｎＳ Ｏ４４Ｈ２０１ｍｇ／ｌ　ヘラー製ミクロ栄養素Ｈ３Ｂ０３　１ｍｇ／Ｅ　ヘラ ー製ミクロ栄養素Ｍｎ５Ｏ＋・ｌＨ２Ｏ０，０７６ｍｇ／ｌ　ヘラー製ミクロ栄 養素ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０ｏ、０３ｍｇ／ｎ　ヘラー製ミクロ栄養素ＡｌＣｌ３ −６Ｈ２００，０５ｍｇ／ｆ　ヘラ−製ミクロ栄養素Ｋ　Ｉ　Ｏ，Ｏ１ｍｇ／ｆ ｆ　ヘラ−４ミクロ栄養素ＮｉＣｌ２・６ＨｚＯ０，０３ｍｇ／　ｌ　ヘラ−４ ミクロ栄養素ＦｅＣｌ３　・６Ｈ２０１，００ｍｇ／ｊ’ブドウ糖　３０ｇ／７ ！ 培地３ ＫＣＩ　１．５００ｇ／ｊ！ ＫＮＯ３１，４５０ｇ＃ （ＮＨＩ）２Ｓ０１　０．１３４ｇ／ＮＫＨ２ＰＯ４０，１５０ｇ＃ Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，５００ｇ＃ＣａＣ］２−２Ｈ２００，１５０ｇ、 ＱＺｎＳ０４・７Ｈ２０１ｍｇ／ｌ　ヘラ−４ミクロ栄養素８３Ｂ０３　１ｍｇ ／ｎ　ヘラ−４ミクロ栄養素ＭｎＳＯ４・ｌＨ２Ｏ０，０７６ｍｇ／ｌ　ヘラ− ４ミクロ栄養素ＣｕＳ○４・５Ｈ２００，０３ｍｇ／　７！　ヘラ−４ミクロ栄 養素ＡｌＣｌ３・６８２０　０．０５ｍｇ／ｆ　ヘラ−４ミクロ栄養素Ｋｌ　０ ．０１ｍｇ／ｆｆ　ヘラ−４ミクロ栄養素ＮｉＣｌ２・６Ｈ２０ｏ、０３ｍｇ／ ｊ！　ヘラ−４ミクロ栄養素ＦｅＣ１＋　・６Ｈ２０１，００ｍｇ／ｌ、モレル 製ビタミン　２ｍ１ ２．４−ツク０口フェノキノ酢１１０−’Ｍ　１　ｍ　ｌカイネチンＩＦ３Ｍ　 １　ｍ　ｌ ブドウ糖　３０ｇｚＱ モレル製ビタミンは、以下の物質の混合物を意味する。１００ｍ１あたりの含有 量は、以下の通りである パントテン酸カルシウム　０．０５０ｇニコチン酸　０．０５０ｇ メソ−イノシトール　５．０００ｇ ピリドキシン（Ｂａ）　０．０５０ｇ チアミン（Ｂ、）　０．０５０ｇ ビオチン　０．５ｍｇ ８種の株の試験の内、４種を培地１で、３種を培地２で、１種を培地３で培養し た。

細胞濃度が培地の４００ｇ／ｌに達するための増殖時間の後、細胞を５０μｍで 濾過して回収する。

第２ステツプ 第１ステツプで得られた細胞を、上記と同様の培地に４℃で、５０ｇ／ｊ！の濃 度になるように植継ぐ。１〜２日の潜伏期の後、細胞を濾過して除いた。

第３ステツプ 細胞をボッターにて、４℃て粉砕する。粉砕調製物を６．５〜７のｐＨを有する バッファー媒体中に、バッファー液ＩＱｍ１当たり細胞的１ｇの濃度で採る。

第４ステツプ 第３ステツプで得られた溶液に１リツトル当たり５０ｍｇのインドールを、室温 で撹拌しながら加える。はじめの１５分が経過した時点て桃色の着色が見られる 。この着色はやがて藤色になり、最終的に２時間経過後には黒色になる。この督 濁液を５ミクロンより小さいメッシュサイズのふるいを通して濾過する。この沈 澱物を水で洗浄し、乾燥させる。

上記の３種の培地それぞれでの培養後の８種の株の試験から、色素が得られた。

なお、これら３種の培地は、細胞培養の前においても後においても前駆体とは反 ＥＰＲスペクトルは、３４７０ガウスにおいて最大吸収を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．メラニン前駆体基質および植物細胞を使用し、酵素による生物的変換によっ てメラニン色素を製造する方法であって、ａ）あらかじめ培養した、ケシ（パパ バ・ソムニフェラム）植物細胞を培地から分離し、１０〜１００ｇ／ｌの範囲の 濃度で培地に植継ぎし、ｂ）潜伏期の前または最後に、細胞を少なくとも部分的 に粉砕し、ｃ）少なくとも部分的に粉砕した細胞を、生物変換媒体中でインドー ル、インドリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、チラミン、およびチロシンよ り選ばれるメラニン前駆体基質と接触させ、 ｄ）沈澱したメラニン色素を回収することを特徴とする、メラニン色素の製造方 法。 ２．あらかじめ培養した細胞を植継ぐ時の培地が、２０〜５０ｇ／ｌの間の濃度 であることを特徴とする請求項１記載の方法３．基質を粉砕細胞調製物と接触さ せることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 ４．あらかじめ培地から分離させた細胞を、０〜１５℃の間の温度で粉砕するこ とにより粉砕細胞調製物を得ることを特徴とする請求項３記載の方法。 ５．少なくとも部分的に粉砕した細胞と基質との接触が、撹拌下で行われること を特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。 ６．少なくとも部分的に粉砕した細胞と基質との接触が、１０〜７０℃の間の温 度で行われることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。 ７．細胞と基質との接触が、ｐＨが３〜９の間で変化するバッファー溶液中で行 われることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。 ８．沈澱色素を濾過、デカンテーションまたは遠心分離によって回収することを 特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。 ９．５μｍより小さいメッシュサイズのふるいを通して生物的変換媒体を濾過す ることにより、沈澱色素を回収することを特徴とする請求項８記載の方法。 １０．請求項１から９のいずれかに記載の方法によって得られた色素の、化粧品 組成物の調製への使用。