WO1994012653A1 - Procede de preparation de pigments melaniques par bioconversion et utilisation des pigments obtenus en cosmetique - Google Patents

Procede de preparation de pigments melaniques par bioconversion et utilisation des pigments obtenus en cosmetique Download PDF

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WO1994012653A1
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bioconversion
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Pascal Hilaire
Richard Martin
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    • A61K2800/42—Colour properties
    • A61K2800/43—Pigments; Dyes

Definitions

  • the present invention relates to a process for preparing melanin pigments by bioconversion, the pigments obtained and their use in the field of cosmetics.
  • colored pigments are essentially mineral pigments or else pigments derived from direct synthetic dyes and, in the case of black pigments, from pure carbon.
  • the present invention relates to a process for the preparation of melanin pigments by enzymatic bioconversion, using a melanin precursor substrate and plant cells.
  • poppy plant cells Paper somniferum
  • a culture medium at a concentration ranging from 10 to 100 g 1
  • the cells are ground less partially, before or at the end latency time
  • c) the at least partially crushed cells are brought into contact, in a bioconversion medium, with a melanin precursor substrate chosen from indole, indoline, dihydroxyphenylalanine, tyramine and tyrosine, d ) the precipitated melanin pigment is recovered.
  • undifferentiated poppy cells are cultured in vitro in a usual culture medium. After a sufficient growth time, the cells are separated from their medium, for example by filtration. The duration of the cell growth time is of no importance on the process and depends in particular on the quantity of cells which it is desired to obtain.
  • Heller's medium can be used. This medium may optionally also contain vitamins and / or hormones.
  • undifferentiated poppy cells cell cultures derived from whole plant fragments, decontaminated and placed on solid culture media chosen so that the cells multiply there without giving rise to organized tissue forms. These cells are then transferred to liquid media where their growth takes place by simple cell multiplication. These cultures are comparable to those of bacteria.
  • the cells obtained are subcultured in a usual culture medium, at a concentration of cellular fresh material of 10 to 100 g / l.
  • a usual culture medium As culture medium for transplanting, a new culture medium is used. Heller's medium can also be used for transplanting, possibly containing vitamins and / or hormones.
  • the cells are maintained in this medium for a duration less than or equal to the latency time.
  • the latency time is the time necessary for a freshly transplanted cell to adapt to the environment and during which the cell concentration remains constant before growing in it.
  • the latency time is the time necessary for a freshly transplanted cell to adapt to the environment and during which the cell concentration remains constant before growing in it.
  • the concentration remains substantially identical to the initial concentration - the cells are in the latency period - then the concentration increases significantly when the lag time is over; the cells are then passed to the growth stage. Depending on the strain used, this lag time can vary between 6 hours and 7 days.
  • the cells are preferably ground to obtain a ground cell.
  • Cell crushing can be carried out in the culture medium itself, but it is preferable beforehand to isolate the cells, by filtration, for example.
  • To obtain the cell ground material it is possible to use conventional means such as a Potter or Ultra Turrax grinder.
  • the grinding takes place at low temperature, and in particular between 0 and 15 ° C.
  • the cell ground material is brought into contact with the melanin precursor substrate chosen from indole, indoline, dihydroxyphenylalanine (DOPA), tyramine and tyrosine.
  • DOPA dihydroxyphenylalanine
  • tyramine tyramine
  • tyrosine Preferably, the contact takes place at a temperature between 10 and 70 ° C.
  • the bioconversion medium can consist of the cell ground material.
  • the cell ground material can also be taken up in demineralized water or in a buffered solution. In this case, the pH is preferably chosen between 3 and 9.
  • the reaction is carried out by bringing the substrate and the cell ground material into contact, preferably in a buffered medium, the concentration of substrate being able to vary within wide limits and being a function of its solubility in the aqueous medium.
  • the reaction is preferably carried out with stirring.
  • the concentration of substrate is generally between 10 mg and 2 g per liter of buffered solution containing 20 to 200 g of fresh cellular matter.
  • the concentration of substrate can be increased by dissolving it in an organic solvent miscible with water, such as ethanol.
  • the reaction time is variable and depends in particular on the substrate, the temperature of reaction and pH of the medium.
  • a black precipitate appears after 30 minutes to 24 hours.
  • the precipitated pigment can be recovered by decantation, filtration or centrifugation or any other suitable means of separation.
  • the filtrate can be recovered and the operation repeated by adding substrate to it, under the conditions described above.
  • it is filtered through a screen whose meshes have a dimension of less than 5 ⁇ , in particular in order to rid the pigments of protein residues.
  • the melanin pigment obtained can then be washed with ethanol and then with water in order to remove the melanin precursor.
  • the pigments obtained, optionally washed and dried, are particularly useful in the field of cosmetics, for the preparation of makeup products, of sun composition or even of hair coloring composition. They can be introduced for these applications in a cosmetically acceptable medium based on water and / or a mixture of water and organic solvent or of one or more solvent (s), and optionally comprising other usual additives in cosmetics. , for example surfactants, thickeners, preservatives.
  • the melanin pigment can be deposited on an inorganic filler made up of inert particles, having a usual particle size for these supports, for example a particle size less than 20 ⁇ m, and preferably 10 ⁇ m.
  • the pigment can be deposited and / or absorbed on mineral particles in lamellar or non-lamellar form, organic lamellar or non-lamellar form, colored or not. These particles have an average particle size of between 0.01 and 200 ⁇ m.
  • Colored powders are thus obtained which can be used in cosmetics.
  • This colored powder can be prepared by dispersing the inorganic or organic particles in the solution of melanic precursor and of cell ground material where the above bioconversion takes place.
  • the powder containing the pigment is separated, for example by filtration, after the reaction time necessary for the formation of the melanin pigments, and it is washed with water and dried.
  • These powders can also be prepared by absorption of the melanin pigment prepared according to the invention on and / or in the mineral or organic particles defined above.
  • mineral fillers particles of calcium carbonate, silica or titanium oxide having the particle size defined above.
  • particles of polymers derived from keratin, optionally modified, polymers derived from chitin, optionally deacetylated, from silk fibroin, from synthetic polymers chosen from crosslinked polymethyl methacrylate, poly- ⁇ are preferably used.
  • These particles have a particle size preferably greater than 0.1 ⁇ m.
  • the lamellar particles are mineral or organic particles in the form of sheets, possibly laminated. These sheets are characterized by a smaller thickness than the largest dimension. Preferably, the ratio between the largest dimension and the thickness is between 2 and 100. The largest dimension is generally less than 100 ⁇ m.
  • Undifferentiated poppy cells are cultured in vitro at 26 ° C in the following media defined below:
  • Morel vitamins is meant a mixture comprising, per 100 ml:
  • Nicotinic acid 0.050 g
  • the cells After a growth time allowing the concentration of cells to reach 400 g / l of the medium, the cells are recovered by filtration over 50 ⁇ m.
  • the cells obtained in the first stage are subcultured in an identical culture medium at 4 ° C. at a rate of 50 g 1. After a lag time varying between 1 to 2 days, the cells are filtered.
  • the cells are crushed at 4 ° C. in a Potter.
  • the ground material is taken up in a buffered medium with a pH between 6.5 and 7, at a rate of approximately 1 g of cell per 10 ml of buffer solution.
  • the RPE spectrum reveals a maximum absorption at 3470 Gauss.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un pigment mélanique par bioconversion enzymatique, mettant en ÷uvre un substrat précurseur de mélanine et de cellules végétales, caractérisé en ce que: (a) des cellules végétales de pavot (Papaver somniferum) préalablement cultivées sont séparées de leur milieu de culture et repiquées dans un milieu de culture à une concentration allant de 10 à 100 g/l, (b) on broye les cellules au moins partiellement, avant ou à la fin du temps de latence, (c) on met en présence les cellules au moins partiellement broyées, dans un milieu de bioconversion, avec un substrat précurseur de mélanine choisi parmi l'indole, l'indoline, la dihydroxyphénylalanine, la tyramine et la tyrosine, (d) on récupère le pigment mélanique précipité. Elle concerne également l'utilisation de pigments obtenus pour la préparation de compositions cosmétiques.

Description

Procédé de préparation de pigments melaniques par bioconversion et utilisation des pigments obtenus en cosmétique.
La présente invention concerne un procédé de préparation de pigments melaniques par bioconversion, les pigments obtenus ainsi que leur utilisation dans le domaine de la cosmétique.
Il est connu d'utiliser des pigments colorés dans le domaine cosmétique, et il s'agit essentiellement de pigments minéraux ou encore de pigments issus de colorants directs de synthèse et, dans le cas des pigments noirs, de carbone pur.
Il est notamment connu de produire des colorants jaune-brun par oxydation du 5-hydroxyindole. Il est connu par ailleurs de préparer des pigments melaniques par voie enzymatique, par polymérisation oxydative de dérivés du 5,6-dihydroxyindole tels que le 5,6- diméthoxyindole ou le 5,6-méthylènedioxyindole.
La demanderesse a maintenant découvert que l'on pouvait obtenir, rapidement, des pigments melaniques par bioconversion de substrats simples, notamment à l'aide de cellules végétales cultivées in vitro de façon usuelle.
En effet, les procédés proposés jusqu'à présent mettent en oeuvre des précurseurs conventionnels de biosynthèse des mélanines qui s'avèrent chers.
Au contraire, selon l'invention, il s'agit de précurseurs et de composés biologiques courants, au prix modique et d'emploi facile. Le mécanisme de bioconversion enzymatique selon l'invention ne met pas en oeuvre de polyphénoloxydases.
Ainsi, la présente invention concerne un procédé de préparation de pigments melaniques par bioconversion enzymatique, mettant en oeuvre un substrat précurseur de mélanine et des cellules végétales. Selon l'invention : a) des cellules végétales de pavot (Papaver somniferum) préalablement cultivées sont séparées de leur milieu de culture et repiquées dans un milieu de culture à une concentration allant de 10 à 100 g 1, b) on broyé les cellules au moins partiellement, avant ou à la fin du temps de latence, c) on met en présence les cellules au moins partiellement broyées, dans un milieu de bioconversion, avec un substrat précurseur de mélanine choisi parmi l'indole, l'indoline, la dihydroxyphénylalanine, la tyramine et la tyrosine, d) on récupère le pigment mélanique précipité.
Dans une première étape, des cellules indifférenciées de pavot sont cultivées in vitro dans un milieu de culture usuel. Après un temps de croissance suffisant, les cellules sont séparées de leur milieu, par exemple par filtration. La durée du temps de croissance des cellules est sans importance sur le procédé et dépend notamment de la quantité de cellules que l'on souhaite obtenir.
Comme milieu de culture usuel, on peut utiliser le milieu de Heller. Ce milieu peut éventuellement contenir en outre des vitamines et/ou des hormones.
Par cellules indifférenciées de pavot, on entend des cultures cellulaires issues de fragments de plante entière, décontaminées et placées sur des milieux de culture solides choisis de telle sorte que les cellules s'y multiplient sans donner naissance à des formes tissulaires organisées. Ces cellules sont ensuite transférées dans des milieux liquides où leur croissance s'effectue par simple multiplication cellulaire. Ces cultures sont comparables à celles de bactéries.
Dans une seconde étape, les cellules obtenues sont repiquées dans un milieu de culture usuel, à une concentration en matière fraîche cellulaire de 10 à 100 g/1. Comme milieu de culture pour le repiquage, on utilise un milieu de culture neuf. On peut utiliser pour le repiquage également un milieu de Heller, contenant éventuellement des vitamines et/ou des hormones. Les cellules sont maintenues dans ce milieu pendant une durée inférieure ou égale au temps de latence. Le temps de latence est le temps nécessaire à une cellule fraîchement repiquée pour s'adapter au milieu et durant lequel la concentration en cellule reste constante avant d'y croître. Lors de prélèvements périodiques, on peut ainsi constater que la concentration en cellule reste sensiblement identique à la concentration initiale - les cellules sont dans la période de latence - puis la concentration croît significativement lorsque le temps de latence est terminé; les cellules sont alors passées à l'étape de croissance. Selon la souche utilisée, ce temps de latence peut varier entre 6 heures et 7 jours.
On préfère repiquer les cellules à une concentration en matière fraîche cellulaire de 20 à 50 g/1.
Dans une troisième étape, avant ou à la fin du temps de latence, les cellules sont de préférence broyées pour obtenir un broyât cellulaire.'
Le broyage cellulaire peut s'effectuer dans le milieu de culture lui-même, mais on préfère, auparavant, isoler les cellules, par filtration, par exemple. Pour obtenir le broyât cellulaire, on peut utiliser des moyens usuels comme un broyeur Potter ou Ultra Turrax. De préférence, le broyage a lieu à basse température, et en particulier entre 0 et 15°C. Dans une quatrième étape, pour réaliser la bioconversion, le broyât cellulaire est mis en contact avec le substrat précurseur de mélanine choisi parmi l'indole, l'indoline, la dihydroxyphénylalanine (DOPA), la tyramine et la tyrosine. De préféfence, la mise en présence a lieu à une température comprise entre 10 et 70°C. Le milieu de bioconversion peut être constitué par le broyât cellulaire. On peut aussi reprendre le broyât cellulaire dans de l'eau déminéralisée ou dans une solution tamponnée. Dans ce cas, le pH est de préférence choisi entre 3 et 9.
La réaction s'effectue en mettant en présence le substrat et le broyât cellulaire, de préférence dans un milieu tamponné, la concentration en substrat pouvant varier dans de larges limites et étant fonction de sa solubilité dans le milieu aqueux.
La réaction est de préférence mise en oeuvre sous agitation.
La concentration en substrat est généralement comprise entre 10 mg et 2 g par litre de solution tamponnée contenant de 20 à 200 g de matière fraîche cellulaire. On peut augmenter la concentration en substrat en dissolvant celui-ci dans un solvant organique miscible à l'eau, tel que l'éthanol.
Dans cette étape de bioconversion, le temps de réaction est variable et dépend notamment du substrat, de la température de réaction et du pH du milieu.
De façon générale, un précipité noir apparaît après 30 minutes à 24 heures. On peut récupérer le pigment précipité par décantation, filtration ou centrifugation ou tout autre moyen de séparation adapté. On peut récupérer le filtrat et recommencer l'opération en y ajoutant du substrat, dans les conditions décrites ci-dessus. De préférence, on filtre sur crible dont les mailles ont une dimension inférieure à 5 μ , afin notamment de débarrasser les pigments des résidus protéiques.
L'analyse de ce pigment par RPE (résonance paramagnétique électronique) effectuée à l'aide d'un spectromètre ER 200 D
BRUCKER à 9,52 GHz avec une fréquence de modulation de champ de
100 KHz et une puissance de micro-onde de 1,9 mw, révèle une absorption maximale vers 3470 Gauss, caractéristique des mélanines.
Le pigment mélanique obtenu peut ensuite être lavé à l'éthanol puis à l'eau afin d'éliminer le précurseur de mélanine.
Les pigments obtenus, éventuellement lavés et séchés, sont particulièrement utiles dans le domaine de la cosmétique, pour la préparation de produits de maquillage, de composition solaire ou encore de composition de coloration capillaire. Us peuvent être introduits en vue de ces applications dans un milieu cosmétiquement acceptable à base d'eau et/ou de mélange eau- solvant organique ou d'un ou plusieurs solvant(s), et éventuellement comportant encore d'autres additifs usuels en cosmétique, par exemple des agents tensio-actifs, des épaississants, des conservateurs. Selon une variante de l'invention, le pigment mélanique peut être déposé sur une charge minérale constituée de particules inertes, ayant une granulométrie usuelle pour ces supports, par exemple une granulométrie inférieure à 20 μm, et de préférence 10 μm.
De façon connue, le pigment peut être déposé et/ou absorbé sur des particules minérales sous forme lamellaire ou non lamellaire, organiques lamellaires ou non lamellaires, colorées ou non. Ces particules ont une granulométrie moyenne comprise entre 0,01 et 200 μm.
On obtient ainsi des poudres colorées pouvant être utilisées en cosmétique. Cette poudre colorée peut être préparée en dispersant les particules minérales ou organiques dans la solution de précurseur mélanique et de broyât cellulaire où a lieu la bioconversion ci-dessus. La poudre contenant le pigment est séparée, par exemple par filtration, après le temps de réaction nécessaire à la formation des pigments melaniques, et on la lave à l'eau et on la sèche.
Ces poudres peuvent également être préparées par absorption du pigment mélanique préparé selon l'invention sur et/ou dans les particules minérales ou organiques définies ci-dessus. Dans cette variante, on peut procéder en dispersant le pigment mélanique préalablement formé dans un milieu où les particules sont insolubles et contenant lesdites particules, et, après absorption du pigment, on sèche les particules pigmentées.
On peut utiliser, comme charges minérales, des particules de carbonate de calcium, de silice ou d'oxyde de titane ayant la granulométrie définie ci-dessus.
Comme charges organiques, on utilise de préférence des particules de polymères dérivés de la kératine, éventuellement modifiées, de polymères dérivés de la chitine, éventuellement désacétylés, de fibroïne de soie, de polymères synthétiques choisis parmi le polyméthacrylate de méthyle réticulé, la poly-β-alanine réticulée, des microsphères creuses de copolymeres chlorure de vinylidène et acrylonitrile ou encore des microsphères poreuses de polyamide- 12, polyamide-6 ou de copolyamide-6/12, ainsi que des poudres de silicone constituées par des gommes, des résines, des élastomères d'organopolysiloxane.
Ces particules ont une granulométrie de préférence supérieure à 0,lμm.
Les particules lamellaires sont des particules minérales ou organiques se présentant sous forme de feuillets, éventuellement stratifiés. Ces feuillets se caractérisent par une épaisseur plus faible que la plus grande dimension. De préférence, le rapport entre la plus grande dimension et l'épaisseur est compris entre 2 et 100. La dimension la plus grande est généralement inférieure à 100 μm. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant présenter un caractère limitatif.
Exemples de préparation d'un pigment mélanique à partir d'indole.
On utilise différentes souches issues de cultures indifférenciées de pavot, ces souches ayant été reprises en milieu liquide à partir de cals sur gélose, et l'on réalise les étapes suivates.
1ère éta e
Les cellules indifférenciées de pavot sont cultivées in vitro à 26°C dans les milieux suivants définis ci-après :
Figure imgf000008_0001
MILIEU 2
KC1 0,750 g/1 Macro-éléments de Heller
NaN03 0,600 g/1 Macro-éléments de Heller
MgS04,7H20 0,250 g/1 Macro-éléments de Heller
NaH2P04,2H20 0,141 g/1 Macro-éléments de Heller
CaCl2,2H20 0,075 g/1 Macro-éléments de Heller
ZnS04,7H20 1 mg/1 Micro-éléments de Heller
H3B03 1 mg/1 Micro-éléments de Heller
MnS04,lH20 0,076 mg/1 Micro-éléments de Heller
CuS04,5H20 0,03 mg/1 Micro-éléments de Heller
A1C13,6H20 0,05 mg/1 Micro-éléments de Heller
Kl 0,01 mg/1 Micro-éléments de Heller
NiCl2,6H20 0,Q3 mg/1 Micro-éléments de Heller
FeCl3,6H20 1,00 mg/1
Glucose 30 g/1
Figure imgf000010_0001
Par vitamines de Morel, on entend un mélange comportant, pour 100 ml :
Panthoténate de Ca 0,050 g
Acide nicotinique 0,050 g
Méso inositol 5,000 g
Pyridoxine (B6) 0,050 g
Thiamine (B l) 0,050 g
Biotine 0,5 mg Sur huit souches testées, quatre ont été cultivées dans le miUeu 1, trois dans le milieu 2 et une dans le milieu 3.
Après un temps de croisance permettant à la concentration en ceUules d'atteindre 400 g/1 du milieu, on récupère les cellules par filtration sur 50 μm.
2ème étape
Les ceUules obtenues à la première étape sont repiquées dans un miUeu de culture identique à 4°C à raison de 50 g 1. Après un temps de latence variant entre 1 à 2 jours, les cellules sont filtrées.
3ème étape
Les cellules sont broyées à 4°C dans un Potter. Le broyât est repris dans un milieu tamponné de pH compris entre 6,5 et 7, à raison d'environ 1 g de cellule pour 10 ml de solution tampon.
4ème étape
On ajoute 50 mg d'indole par litre de solution obtenue à la troisième étape, sous agitation et à température ambiante. Dès les quinze premières minutes, une coloration rose apparaît, cette coloration devient mauve pour se terminer par du noir au bout de deux heures. On filtre alors cette suspension sur un crible dont les maUles ont une dimension inférieure à 5 microns. Le précipité est ensuite lavé à l'eau puis séché. A partir des huit souches testées après culture dans chacun des trois milieux décrits, des pigments ont été obtenus alors que ces trois miUeux de culture ne donnent aucune réaction avec le même précurseur, que ce soit avant ou après la culture des ceUules.
Analyse RPE des pigments obtenus :
Le spectre RPE révèle une absorption maximum à 3470 Gauss.
EXEMPLES D'APPLICATION
EXEMPLE A : MASCARA CREME
- Pigment noir obtenu selon l'exemple 1 - Stéarate de triéthanolamine
- Cire de CandeUUa
- Cire de Carnauba
- Hydroxyéthylcellulose
- Hydrolysat de kératine (exprimé en matière sèche)
- Conservateurs qs
- Eau qsp
Figure imgf000013_0001
EXEMPLE B : GEL CAPILLAIRE
- Pigment noir obtenu selon l'exemple 1 0,5 g
- Copolymère de vinylpyrrolidone/acétate de vinyle, vendu sous la dénomination
"PVP/VA S 630" par la Société GAF
- Alcool éthylique
- "Carbopol 940" (GOODRICH CHEMICAL)
Figure imgf000013_0002
- Triéthanolamine qs pH = 7,5
- Conservateurs qs
- Eau qsp 100 g

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un pigment mélanique par bioconversion enzymatique, mettant en oeuvre un substrat précurseur de mélanine et des ceUules végétales, caractérisé en ce que : a) des ceUules végétales de pavot (Papaver somniferum) préalablement cultivées sont séparées de leur mUieu de culture et repiquées dans un mUieu de culture à une concentration allant de 10 à 100 g/1, b) on broyé les cellules au moins partiellement, avant ou à la fin du temps de latence, c) on met en présence les cellules au moins partiellement broyées, dans un milieu de bioconversion, avec un substrat précurseur de mélanine choisi parmi l'indole, l'indoline, la dihydroxyphénylalanine, la tyramine et la tyrosine, d) on récupère le pigment mélanique précipité.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le milieu de culture où l'on repique les cellules préalablement cultivées, a une concentration comprise entre 20 et 50 g/1.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le substrat est mis en présence avec un broyât ceUulaire.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le broyât ceUulaire est obtenu par broyage des ceUules préalablement séparées de leur milieu de culture, à une température comprise entre 0 et 15°C.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la mise en présence des cellules au moins partiellement broyées avec le substrat est mise en oeuvre sous agitation.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la mise en présence des ceUules au moins partiellement broyées avec le substrat a Ueu à une température comprise entre 10 et 70°C.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la mise en présence desdites ceUules avec ledit substrat est réalisée dans une solution tamponnée dont le pH varie entre 3 et 9.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on récupère le pigment précipité par filtration, décantation ou centrifugation.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on récupère le pigment précipité par filtration du miUeu de bioconversion sur un crible dont les maiUes ont une dimension inférieure à 5 μm.
10. Utilisation des pigments obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9, pour la préparation de compositions cosmétiques.
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